toxinas lipofílicas por LCMSMS

DETERMINACIÓN DE BIOTOXINAS MARINAS
LIPOFÍLICAS EN MOLUSCOS POR LC/MSMS
Basado en EU-Harmonised SOP for
determination of Lipophilic marine biotoxins in
molluscs by LC/MSMS Version 5, January 2015
ME-711.04-251
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
1.
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08-07-2015
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OBJETIVO
Determinar biotoxinas marinas lipofílicas de los grupos de ácido okadaico (AO), Pectenotoxina
(PTX), Azaspiracido (AZA) y Yessotoxina (YTX) utilizando metodología basada en el uso de
LC/MSMS.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Este método es aplicable a la determinación de biotoxinas marinas lipofílicas en diferentes
matrices de moluscos, tanto frescos como cocidos tales como mejillones, almejas, navajuelas,
y ostiones. La aplicación de este procedimiento permite la determinación cuantitativa directa del
AO, PTX2, AZA1 y YTX por medio de los estándares de referencia disponibles comercialmente.
Asumiendo un factor de respuesta equivalente, el procedimiento permite la cuantificación
indirecta de Dinofisistoxina-1 (DTX1) y DTX2 por medio del uso de AO; de la misma forma
PTX2 es usada para la cuantificación indirecta de PTX1, AZA1 es usada para la cuantificación
indirecta de AZA2 y AZA3; y YTX es usada para la cuantificación indirecta de Homo YTX, 45
OH YTX y 45 oh Homo YTX. También se puede realizar la cuantificación directa de las toxinas
mencionadas anteriormente si se dispone de los estándares certificados correspondientes.
3.
FUNDAMENTO
El método está basado en la extracción de los grupos de toxinas del AO, PTX, AZA y YTX con
100% de metanol aplicado al tejido homogenizado. Los extractos son luego filtrados y
directamente analizados por cromatografía líquida con detector de espectrometría de masas en
tándem (LC/MSMS) con el objetivo de investigar la presencia de AO libre, DTX1 libre, DTX2
libre, PTX1, PTX2, AZA1, AZA2, AZA3, YTX, Homo YTX, 45 OH YTX y 45 OH Homo YTX.
Para determinar el contenido total del grupo de toxinas del AO, una hidrólisis alcalina del
extracto de metanol es necesaria antes del análisis por LC/MSMS con el objetivo de convertir
cualquier ester acetilado de AO y/o DTXs a AO y/o DTX1 o DTX2. Luego de la hidrólisis, los
extractos son filtrados y analizados por LC/MSMS. La separación cromatográfica es realizada
por elución en gradiente.
4.
4.1
DOCUMENTOS DE REFERENCIAS
EU-Harmonised Standard Operating Procedure for determination of Lipophilic marine
biotoxins in molluscs by LC/MSMS Version 5, January 2015.
DUEÑO DE PROCESO:
Encargada de Laboratorio
de Toxinas Marinas y
Micotoxinas
APROBADO:
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO”
SE CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
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TERMINOLOGÍA
5.1
Grupo de las toxinas del Ácido Okadaico (AO): AO, DTX1, DTX2.
5.2
Grupo de Pectenotoxinas (PTX): PTX1, PTX2.
5.3
Grupo de Azaspirázido (AZA): AZA1, AZA2, AZA3.
5.4
Grupo de Yessotoxina (YTX): YTX, Homo YTX, 45 OH YTX y 45 OH Homo YTX.
6.
REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS
Utilizar sólo reactivos de grado analítico reconocido. Los solventes deben ser de calidad HPLC,
a menos que otra cosa sea especificada. El agua debe ser ultra pura (Milli-Q o similar).
NOTA: Dado que el uso de este método involucra reactivos dañinos para la salud, se deben
seguir medidas de prevención adecuadas para evitar la inhalación o contacto con la piel. Usar
delantal en todo momento, y cuando sea necesario guantes y/o antiparras. El trabajo debe ser
realizado utilizando una campana de extracción.
6.1
REACTIVOS
6.1.1
Acetonitrilo grado HPLC o hipergrado para LCMS.
6.1.2
Metanol grado HPLC.
6.1.3
Ácido clorhídrico (37% pureza).
6.1.4
Ácido clorhídrico 2.5M. Ver preparación en punto 7.2.1
6.1.5
Hidróxido de Sodio (≥ 99% pureza).
6.1.6
Hidróxido de Sodio 2.5M. Ver preparación en punto 7.2.2
6.1.7
Bicarbonato de Amonio (≥ 98% pureza).
6.1.8
Solución de Hidróxido amónico (≥ 25% o más de pureza).
6.1.9
Acetato amónico (≥99% pureza)
Materiales de Referencia: Los materiales de referencia certificados y las soluciones estándar
pueden ser adquiridas a través del National Research Council Canada (NRC), Institute for
Marine Biosciences, Halifax.
6.1.10
Material de referencia certificado conteniendo ácido okadaico y Dinofisistoxina 1
(CRM-DSP-MUS-b) Homogenizado de molusco (Mytillus edulis) de la glándula
digestiva con ácido okadaico y Dinofisistoxina.
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6.1.11
Solución estándar de ácido Okadaico en metanol (CRM-OA-c).
6.1.12
Solución estándar de Pectenotoxina-2 en metanol (CRM PTX2).
6.1.13
Solución estándar de Azaspiracido 1 en metanol (CRM AZA1).
6.1.14
Solución estándar de Yessotoxina en metanol (CRM YTX).
6.1.15
Solución estándar de Homo-Yessotoxina (CRM-hYTX).
6.1.16
Solución estándar de Azaspiracido 2 en metanol (CRM AZA2).
6.1.17
Solución estándar de Azaspiracido 3 en metanol (CRM AZA3).
6.1.18
Solución estándar Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-DTX1).
6.1.19
Solución estándar Dinofisistoxina 2 en metanol (CRM-DTX2).
6.2
INSUMOS
6.2.1
Instrumentos para la preparación de la muestra como cuchillos, espátulas, tijeras,
tamiz de acero inoxidable, pocillos plásticos.
6.2.2
Matraces aforados de 20 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL y 1000 mL.
6.2.3
Micro y macropipetas y probetas.
6.2.4
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL.
6.2.5
Filtros de membrana para jeringas tamaño de poro 0.45 µm.
6.2.6
Viales de autosampler para HPLC
6.2.7
Jeringas para sistema de filtración de muestras.
6.2.8
Filtros de membrana para jeringas tamaño de poro 0.2 µm.
6.2.9
Columna HPLC en fase reversa Waters XTerra MS C18 3.5 µm 3.0*150mm
6.3
EQUIPOS
6.3.1
Balanza analítica de sensibilidad 0.0001.
6.3.2
Balanza de sensibilidad 0.01g.
6.3.3
Blender de alta velocidad.
6.3.4
Shaker o Vortex.
6.3.5
Ultra turrax.
6.3.6
Centrífuga capaz de alcanzar los 5000 RPM.
6.3.7
Bloque calefactor o baño termoregulado capaz de alcanzar los 76°C.
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6.3.8
HPLC con sistema capaz de analizar en modo gradiente.
6.3.9
Espectrómetro de masas equipado con interfase ESI y capaz de analizar en tándem
MS/MS.
7.
DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado
en punto materiales, insumos y reactivos esté disponible. Leer completo este
procedimiento antes de comenzar a trabajar.
Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad
7.1



MUESTREO/MUESTRA
Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los
rotulados en la muestra. Registrar la recepción de la muestra en la planilla Excel
“Registro de análisis de toxinas marinas y micotoxinas” RG-025.711-00
Almacenar la muestra refrigerada si será procesada de manera inmediata, de lo
contrario congelar hasta su procesamiento.
Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo permite,
almacenar aproximadamente 10g de contramuestra y eliminar lo restante en bolsa de
residuos biológicos.
7.2
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
7.2.1
Ácido clorhídrico 2.5M: Agregar 20 mL de ácido clorhídrico (6.1.5) a un matraz
aforado de 100 mL al que se le adicionan previamente aproximadamente 20 mL de
agua. Completar hasta el aforo con agua. Esta solución puede ser almacenada a
temperatura ambiente y puede ser usada hasta por 3 meses.
7.2.2
Hidróxido de Sodio 2.5M: En un vaso de precipitado de 100 mL pesar 10g de
hidróxido de sodio (6.1.7) y disolver en 75 mL de agua. Trasvasijar el hidróxido de
sodio disuelto a un matraz aforado de 100 mL y aforar con agua. Esta solución
puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada hasta por 3
meses.
7.2.3
Fase móvil A: 100% Agua + 2 mM Acetato Amónico, pH 9.5: Preparación 1000
mL: Disolver 0.154 g de Acetato Amónico en 60 mL de Agua y agregar a un matraz
aforado de 1000 mL; agregar 8 mL de Hidróxido de Amónico (>25% pureza) y llevar
al aforo con Agua. Comprobar el pH. Esta solución puede ser almacenada a
temperatura ambiente y puede ser usada durante 48 horas de su preparación.
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7.2.4
Fase Móvil B: 90% Acetonitrilo / 10% Agua + 2 mM Acetato Amónico, pH 9.5:
Preparación 2000 mL: Disolver 0.308 g de Acetato Amónico en 132 mL de Agua y
agregar a un matraz aforado de 2000 mL; agregar 48 mL de Hidróxido Amónico y
llevar al aforo con Acetonitrilo. Esta solución puede ser almacenada a temperatura
ambiente y puede ser usada durante 48 horas de su preparación.
7.2.5
Solución estándar stock:
Un volumen específico de los estándares de referencia (6.1.13 al 6.1.21) es diluido en metanol
(6.1.2) al volumen especificado en la Tabla N°1 para obtener la solución estándar stock
multitoxina. La Tabla 1 muestra un ejemplo de preparación de una solución estándar stock
multitoxina derivada de los materiales de referencia disponibles comercialmente.
Tabla 1. Ejemplo de preparación de solución estándar stock con un nivel de concentración de
200 ng/mL de AO, PTX-2 y AZA y de 500 ng/mL de YTX.
Estándar de
referencia
Concentración
certificada (ug/mL)
Volumen
(uL)
Ácido okadaico
NRC CRM-OA-c
14.3
14
Pectenotoxina-2
NRC CRM-PTX2
8.6
23.3
Azaspiracido-1
NRC CRM-AZA 1
1.24
161
Azaspiracido-2
NRC CRM-AZA 2
1.28
156
Azaspiracido-3
1.04
192
Volumen
total (uL)
Concentración
final (ng/mL)
200
NRC CRM-AZA 3
Dinofisistoxina 1
Solvente
(uL)
15.154
13.2
12.05
16.6
Yessotoxina
NRC CRM-YTX
5.5
91
Homo-Yessotoxina
5.787
86.4
246.5
1000
NRC CRM-DTX1
Dinofisistoxina 2
NRC CRM-DTX2
500
NRC CRM-hYTX
NOTA: Se debe chequear la concentración de los diferentes lotes de estándares de referencia
ya que la concentración certificada puede cambiar.
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PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN
Diluir un volumen determinado de la solución estándar stock multitoxina (7.2.5) en metanol
(6.1.2) al volumen indicado en la Tabla N°2 para obtener una solución estándar de trabajo
multitoxina para la curva de calibración. Estas soluciones pueden ser usadas por una semana,
y deben ser almacenadas en congelador (˂ -20°C) cuando no estén en uso. Un periodo de
almacenamiento mayor es permitido si se prueba su estabilidad por parte del laboratorio. La
Tabla N°2 muestra un ejemplo de la preparación de las soluciones estándares de trabajo para
la curva de calibración.
Tabla 2 Ejemplo de preparación de soluciones estándares de trabajo con concentraciones en un
rango de 3ng/mL a 40 ng/mL para AO, PTX2 y AZA-1, y de 5 ng/mL a 100 ng/mL para YTX
Volumen de
Volumen de solvente Concentración de AO,DTX1, DTX2,
Concentración de
solución estándar
Metanol (uL)
PTX2 , AZA1, AZA 2, AZA 3
YTX, hYTX (ng/mL)
stock (uL)
(ng/mL)
15
985
3
7.5
30
970
6
15
50
950
10
25
100
900
20
50
150
850
30
75
200
800
40
100
NOTA: Se debe chequear la concentración de los diferentes lotes de estándares de referencia ya
que la concentración certificada puede cambiar.
7.4
PREPARACIÓN DE CONTROLES
Se recomienda preparar un fortificado a partir de una muestra o un material de referencia cada
día de análisis. En el caso de que se utilice un Material de referencia como el indicado en el
punto 6.1.10 de este método, revisar la preparación del material respecto de su factor de
dilución en el punto 7.7.3
7.5
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA
MEDICIÓN.
7.5.1
Preparación de la muestra
Limpiar las muestras por fuera con abundante agua.
Abrir el molusco cortando el aductor.
Lavar el interior del molusco y remover la arena y otros materiales con abundante
agua.
Sacar la carne de la concha por medio de la separación del músculo aductor y el
tejido conectado a la bisagra. No utilizar calor ni anestésicos para abrir el molusco.
Drenar los tejidos removidos en un tamiz para remover el agua salada.
Tomar 100 a 150g del tejido removido y homogenizar en un blender para obtener
una muestra representativa. Sub muestras de este homogenizado pueden ser
7.5.1.1
7.5.1.2
7.5.1.3
7.5.1.4
7.5.1.5
7.5.1.6
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tomadas inmediatamente después de realizado el mezclado, mientras aún esté
mezclado, o luego de mezclar nuevamente.
7.5.2
7.5.2.1
7.5.2.2
7.5.2.3
7.5.2.4
7.5.2.5
7.5.2.6
Procedimiento de Extracción
Pesar 2.00g + 0.05g del tejido homogenizado en un tubo de centrífuga de 50 mL.
Agregar 9.0 mL de metanol y homogenizar la muestra por medio de mezclado en
vortex por 3 minutos al máximo nivel de velocidad.
Centrifugar a 5000 RPM o más por 10 minutos a 20°C y transferir el sobrenadante a
un matraz aforado de 20 mL.
Repetir la extracción del residuo del tejido con 9 mL más de metanol y homogenizar
por 1 minuto en ultraturrax.
Centrifugar a 5000 RPM o más por 10 minutos a 20°C y combinar el sobrenadante
con el primer extracto en el matraz.
Aforar el matraz a 20 mL con metanol.
7.5.3
Análisis de los grupos de toxinas AO, PTX, AZA y YTX libres
La determinación de los grupos de toxinas libres de AO, PTX, AZA y YTX es realizada luego de
filtrar una alícuota del extracto metanólico a través de un filtro de jeringa compatible con
metanol de 0.45 µm o 0.2 µm e inyectando entre 5 µL y 20 µL dependiendo de la sensibilidad
del instrumento, al sistema LC/MSMS
7.5.4
Hidrólisis
Para detectar y cuantificar el contenido total de toxinas AO y DTX es necesaria una hidrólisis
alcalina antes del análisis por LC/MSMS.
En un vial de HPLC, traspasar 1.0 mL del extracto metanólico y agregar a este 125µl
de NaOH 2.5M, homogenizar utilizando vortex por 0.5 minutos y calentar la mezcla
utilizando bloque calefactor o baño de agua a 76°C por 40 minutos. Enfriar a
temperatura ambiente, neutralizar con 125 µL de HCl 2.5 M y homogenizar en vortex
por 0.5 minutos. Filtrar el extracto por medio de un filtro para jeringa compatible con
metanol de 0.45 µm o 0.2 µm e inyectar a la columna HPLC.
NOTA: Durante la hidrólisis los viales deben ser firmemente cerrados (El punto de ebullición del metanol
es 65°C). Pesando el vial antes y después de su calentamiento se puede chequear si hubo una
evaporación del metanol durante el proceso. También se puede chequear de manera visual marcando el
vial antes de ponerlo a calentar y luego revisándolo. Si se observa evaporación del metanol, el volumen
debe ser completado con metanol hasta el peso original antes de continuar con el proceso.
7.5.5
Etapa de concentración
Si es necesario, se puede utilizar una etapa de concentración con el fin de alcanzar
un límite de cuantificación más bajo (con una relación señal ruido de 10:1) de 40
µg/kg para AO y AZA1, y de 50 µg/kg para PTX2 y 60 µg/kg para YTX.
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Limpieza
Puede ser usada, si es necesario, para eliminar los efectos de la matriz. Posibles
opciones son extracción líquido-líquido, SPE, etc. Si esta etapa es utilizada, la
recuperación de esta etapa debe ser evaluada individualmente y reportada por el
laboratorio.
7.5.7
Curva de calibración e inyección de muestra
Se debe inyectar una curva de calibración cada día de análisis.
La siguiente secuencia de inyecciones debe ser usada para el análisis de muestras:
A. Una inyección de cada nivel de la curva de calibración (primer set) comenzando
desde la concentración más baja hasta la más alta.
B. Una inyección de un testigo reactivo preparado durante la extracción de muestras.
C. Extractos de las muestras inyectados en duplicado si es posible, incluyendo un
control de calidad positivo (Ejemplos: solución estándar de calibración intermedia,
extracto fortificado, material de referencia certificado).
D. Una inyección del testigo reactivo.
E. Una segunda inyección de cada nivel de la curva de calibración (segundo set).
La respuesta de la deriva intra lote, definida aquí como la variación entre las pendientes de las
curvas de calibración del primer y el segundo set de estándares no debe ser ≥ 25%.
NOTA: Aunque este procedimiento ha sido validado utilizando inyecciones en duplicado de las
muestras, esto puede no ser práctico para análisis de rutina donde un gran número de muestras deben
ser analizadas. Cada laboratorio debe chequear la repetibilidad intralaboratorio si se decide utilizar sólo
una inyección por muestra.
Para realizar la determinación de las toxinas, se debe graficar el área del pico contra la
concentración de la solución de calibración inyectada. Se debe asegurar que la pendiente de la
curva de calibración muestra una regresión lineal. El coeficiente de correlación, r2, debe ser ≥
0.98. Se debe integrar las áreas de los picos de cada toxina detectada en cada inyección de
muestra y con ello determinar el promedio de las áreas de pico para cada muestra.
El testigo reactivo corresponde a metanol para el caso de los grupos de toxinas del AO, PTX,
AZA y YTX que se presentan al estado libre; y metanol luego de la hidrólisis descrita en 7.5.4
para el análisis del grupo total de AO. En este testigo reactivo no se deben detectar toxinas (˂
LOD o ˂ 10% del punto de calibración más pequeño).
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7.6
ANÁLISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES
INSTRUMENTALES.
7.6.1
Condiciones cromatográficas básicas (I)
Tabla 3. Condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas.
Columna
X-Terra® MS C18, 150 mm largo * 3 mm
diámetro, 3.5 µm tamaño de partícula
Flujo
0.6 mL/min
Volumen de
Inyección
10 µL
Temperatura de
la columna
40°C
Gradiente
Tiempo
(minutos)
Fase móvil A
(%)
Fase móvil B (%)
Inicial
70
30
6.5
0
100
20.0
0
100
Fase móvil A: 100% Agua + 2 mM acetato amónico, pH 9.5. Ver preparación en
punto 7.2.3 del método
Fase Movil B: A 90% acetonitrilo;10% agua + 2 mM acetato amónico, pH 9.5. Ver
preparación en punto 7.2.4 del método
NOTA: Las condiciones cromatográficas descritas anteriormente son para el equipo MS/MS
Agilent 6430 Triple Cuadrupolo (medio alcalino). Si se dispone otro equipo las condiciones
cromatográficas deben ser ajustadas según las condiciones de cada laboratorio. Los analitos
que no puedan ser distinguidos por la espectrometría de masas, deben ser separados por
medio de la cromatografía (AO y DTX-2).
7.6.2
Detección por medio del Espectrómetro de Masas.
Si no se dispone de estándares individuales, los parámetros del MS deben ser
basados en aquellos optimizados para los
estándares disponibles.
Consecuentemente, los mismos valores de DP[V], CE[eV] y dwell time deben ser
usados para la detección de cada grupo de toxinas (AO, PTX, AZA y YTX) dado que
cada grupo tiene el mismo patrón de fragmentación.
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La detección MS debe ser realizada utilizando dos transiciones por toxina. La
transición de mayor intensidad es la utilizada para la cuantificación, mientras que la
transición de menor intensidad es utilizada con fines confirmatorios.
En las tablas 4, 5 y 6 se describen las condiciones del Espectrómetro de Masas.
Tabla 4. Condicions MS (Agilent)
Intrumento
1260/6430
Fuente de Ionización ESI
Vcap
Positivo 4500 V/ Negativo 4000 V
Drying gas Flow
12 L/min
Drying gas Temp.
350 °C
Nebulizer
55 psi
Delta EMV
Positivo 300V/ Negativo 600V
Tabla 5. Condiciones MRM
Segmento Tiempo
inicial (min)
1
0
2
5
3
15
Tipo de Válvula
Scan
Diverter
MRM
To Waste
MRM
To MS
MRM
To Waste
Delta EMV
(Pos/Neg)
0
300/600
0
Tabla 6. Condiciones de Adquisición por espectrometría de masas
Compuesto
Ion
Ion
Dwell
Frag
CE(V) Cell Acc
precursor
Producto
(V)
(V)
polaridad
OA
OA
DTX2
DTX2
DTX1
DTX1
YTX
YTX
homo YTX
homo YTX
AZA1
AZA1
AZA2
AZA2
AZA3
AZA3
PTX2
PTX2
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
803.5
803.5
803.5
803.5
817.5
817.5
1141.5
1141.5
1155.5
1155.5
842.5
842.5
856.5
856.5
828.5
828.5
876.5
876.5
255.3
113
255.3
113
255
133
1061.7
713.2
1075.5
727.2
824.5
806.5
838.5
820.5
810.4
792.5
823.4
213.2
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
212
212
200
200
200
200
230
230
52
46
52
46
62
62
28
40
32
40
30
30
34
34
30
30
51
34
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
DETERMINACIÓN DE BIOTOXINAS MARINAS
LIPOFÍLICAS EN MOLUSCOS POR LC/MSMS
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7.7
CÁLCULO DE RESULTADOS:
7.7.1
Identificación y confirmación
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Identificar la presencia de cada toxina, con los estándares de referencia disponibles,
comparando el tiempo de retención de los analitos en la muestra con aquellos de los
estándares. Un analito es detectado cuando la desviación entre el tiempo de retención del
analito y del estándar no excede el 3%.
Para una correcta identificación, una buena línea base de separación entre el AO y su isómero
DTX2 debe ser asegurada. Una resolución aceptable entre dos picos es considerada ˃ 1.5. Si
la resolución es ˂ 1.0 las condiciones cromatográficas deben ser ajustadas.
Para propósitos confirmatorios para cada toxina identificada, la señal ruido del ion producto
con la menor intensidad debe ser ≥ 3.
Para cuantificar, la transición con mayor intensidad es usada.
La relación entre los dos iones (cuantificador y cualitativo) debe ser registrada.
7.7.2
Cuantificación
La cuantificación de cada toxina es determinada usando el método de estándar externo de
calibración. De acuerdo al enfoque seguido en el estudio de validación interlaboratorio del
método y asumiendo una respuesta equi-molar, la curva de calibración construida para el AO
es también usada para la cuantificación de DTX1 y DTX2; la curva de calibración construida
para PTX2 es también usada para PTX1, la curva para AZA1 es también usada para la
cuantificación de AZA2 y AZA3, y la curva de calibración para YTX es también usada para la
cuantificación de homo YTX, 45 OH YTX y 45 OH homo YTX. Este enfoque puede ser
cambiado cuando nuevos estándares de referencia certificados estén disponibles.
La evaluación es basada en la ecuación lineal de la línea de regresión de las toxinas
individuales con estándares disponibles. Cuando la señal de una toxina en una muestra
analizada sea mayor que la señal del nivel más alto en la curva de calibración, el extracto
deberá ser diluido con metanol para obtener una señal dentro de la curva de calibración y el
factor de dilución (D) deberá ser tomado en cuanto en los cálculos.
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Por lo tanto, a partir de la curva de calibración, la concentración de las toxinas de manera
individual en cada muestra analizada es calculada siguiendo la siguiente ecuación:
Donde:
y = Área del pico cromatográfico
b= Intercepto de la regresión lineal
a = Pendiente de la curva de calibración
VT = Volumen total del extracto crudo (20 mL)
VH = Volumen del extracto usado para realizar la hidrólisis
VF = Volumen final del extracto luego de la hidrólisis (y limpieza/concentración)
W = Peso de la muestra de tejido (2g)
D = Factor de dilución (Si el extracto fue diluido para entrar en la curva de calibración)
7.7.3
Corrección por la recuperación y corrección por la matriz
Con la finalidad de evaluar los efectos del procedimiento y de la matriz, un material de
referencia o un extracto fortificado pueden ser usados para la corrección de la recuperación o
de la matriz.
NOTA: El procedimiento operativo estándar al que hace referencia este método ha sido validado por
medio de un estudio interlaboratorios utilizando resultados no corregidos y corregidos. Para la
determinación de las toxinas del grupo del AO, la corrección utilizando material de referencia certificado
por lo general mejora las características de rendimiento. La referencia indica que cada laboratorio debe
determinar los efectos de la matriz en su instrumentación y determinar si la corrección es necesaria.
Para la determinación del grupo del AO, el material de referencia CRM-DSP-Mus-b puede ser
usado para la corrección de la recuperación. Se encontró que la siguiente preparación del
material de referencia certificado (MRC) fue apropiada:
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A.
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Transferir 1.9g del homogenizado de MRC a un tubo de centrífuga de 50 mL (Esta
cantidad debe ser pesada exactamente luego de mezclar completamente el
contenido total de la botella)
B.
Extraer dos veces con metanol siguiendo el mismo procedimiento indicado en 7.5.2
C.
Diluir (1/50) el extracto crudo de MRC utilizando una micropipeta, transfiriendo 400
uL del extracto crudo a un matraz aforado de 20 mL y llevar al aforo con metanol
D.
Diluir (1/6) del extracto crudo de MRC utilizando una micropipeta, transfiriendo 3300
uL del extracto crudo a otro matraz aforado de 20 mL y llevar al aforo con metanol.
Tabla 7. Concentración del MRC Mus-b para el grupo del AO para la corrección de la recuperación.
NRC CRM-DSPMUS-b Lote 200304
OA
DTX-1
Concentración esperada
(ng/mL) utilizando un factor de
dilución de 1/6
No aplica
20.4 (equivalente a 204 ug/Kg)
Concentración esperada (ng/mL)
utilizando un factor de dilución
de 1/50
19.2 (equivalente a 192 ug/Kg)
No aplica
NOTA: Se debe chequear la concentración de los diferentes lotes de MRC ya que la
concentración certificada puede cambiar.
Cuando un MRC (recuperación respecto del procedimiento) o un extracto fortificado (efecto de
la matriz) es utilizado para corregir, los valores de recuperación obtenidos en el análisis del
MRC o del extracto fortificado deben ser usados de acuerdo a la siguiente expresión:
Concentración corregida:
µg toxina/kg = (µg/kg)CALIBRACIÓN EXTERNA * ______100_________
%R CRM o extracto fortificado
Donde:
(µg/kg)CALIBRACIÓN EXTERNA = Concentración calculada por medio de calibración externa de
acuerdo al punto 7.7.2
%R CRM o extracto fortificado
= Recuperación obtenida del análisis de un MRC o de un extracto
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Fortificado ► %R
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= __(ng/mL)CALCULADO_ * 100
(ng/mL)TEORICO
7.8
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO.
La Tabla N°8 resume los criterios que se deben cumplir por parte de los parámetros de control
de calidad del procedimiento para el análisis cuantitativo de biotoxinas marinas lipofílicas.
Tabla 8. Criterios de control de calidad para la aceptación del analisis cuantitativo de biotoxinas marinas
lipofílicas.
Parámetro de control de calidad
Resolución cromatográfica
Sensibilidad
Curva de calibración
Deriva de la respuesta
Testigo reactivo
Deriva del tiempo de retención
7.9
Criterio
La resolución entre AO y DTX2 ≥ 1.0
La señal ruido del product ion con la menor
intensidad debe ser ≥ 3
El factor de correlación r2 derivado de una curva
de al menos 5 niveles debe ser ≥ 0.98
Variación entre las pendientes de los dos set de
curvas de calibración ≤ 25%
Debe ser inyectado luego de la concentración
más alta de la curva de calibración y luego de
los sets de muestras como se describe en 7.5.7
No se debe observar señales para toxinas
lipofílicas (˂ LOD o ˂ 10% del punto de menor
concentración en la curva de calibración)
˂ 3%
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS.
Para expresar los resultados de un grupo de toxinas en µg equivalentes/kg o mg
equivalentes/kg, es requerido el uso de factores de equivalencia de toxicidad (FET) indicados
en la Tabla N°9. Estos FET fueron adoptados por el Panel científico de contaminantes en la
cadena alimentaria de la Autoridad Europea de Inocuidad Alimentaria (EFSA)
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Tabla 9. FET adoptados por EFSA para las biotoxinas marinas lipofílicas reguladas
Grupo de Toxinas
Grupo AO
Grupo PTX
Grupo AZA
Grupo YTX
Análogo
AO
DTX1
DTX2
PTX2
PTX1
AZA1
AZA2
AZA3
YTX
homo YTX
45 OH YTX
45 OH homo YTX
FET
1
1
0.6
1
1
1
1.8
1.4
1
1
1
0.5
Expresión del resultado
µg AO equivalentes/kg
µg PTX equivalentes/kg
µg AZA equivalentes/kg
mg YTX equivalentes/kg
Por lo tanto, luego de calcular el contenido individual de cada toxina/análogo,
se debe
multiplicar el valor obtenido por el FET antes de sumar el total de equivalentes para el
respectivo grupo de toxinas.
8.
CONTROL DE REGISTROS
No aplica
9.
CONTROL DE CAMBIOS
No aplica
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CUADRO DE RESPONSABILIDADES
Responsabilidades con la ejecución del Método
Ejecuta el método
Elabora el informe de
resultados
Evalúa resultado
del informe
Aprueba el informe de
resultados
Técnico de Laboratorio
Profesional Encargado
de Laboratorio
Profesional
encargado del
Laboratorio
Jefatura de
Sección Química
de Alimentos
Jefatura de Sub
departamento
Alimentos y Nutrición
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ANEXOS
ANEXO A:
Otras opciones de condiciones cromatográficas según el equipamiento del
laboratorio.
11.1
Condiciones LC
Las condiciones cromatográficas deben ser ajustadas según las condiciones de cada
laboratorio. Los analitos que no puedan ser distinguidos por la espectrometría de masas, deben
ser separados por medio de la cromatografía (Ejemplo AO y DTX-2)
A continuación se presentan ejemplos de las posibles condiciones cromatográficas para este
procedimiento. Sin embargo, el operador puede usar las condiciones que estime convenientes
A. Condiciones cromatográficas ácidas
Fase móvil A: 100% agua con 2mM formato de amonio + 50 mM de ácido fórmico: Preparación
de 1000 mL: Disolver 128 mg de formato de amonio (6.1.4) en agua y transferir a un matraz
volumétrico de 1000 mL; agregar 1.9 mL de ácido fórmico (6.1.3) y aforar con agua. Esta
solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y utilizada por una semana.
Fase móvil B: 95% acetonitrilo: 5% agua con 2 mM de formato de amonio + 50 mM de ácido
fórmico: Preparación de 500 mL: Disolver 64 mg de formato de amonio (6.1.4) en 24.06 mL de
agua en un matraz aforado de 500 mL; agregar 944 uL de ácido fórmico (6.1.3) y aforar con
acetonitrilo. Esta solución es almacenada a temperatura ambiente y puede ser utilizada por una
semana.
Las Tablas 1-A y 2-A muestran condiciones cromatográficas probadas como adecuadas para
condiciones ácidas
Tabla 1-A: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C8 bajo
condiciones ácidas.
Columna
BDS-Hypersil C8, 50 mm largo * 2 mm diámetro, 3 um tamaño de partícula
Flujo
0.2 mL/min
Volumen de Inyección
5 uL – 10 uL (Dependiendo de la sensibilidad del MS)
Temperatura de la columna
25- 40°C
Gradiente
Tiempo (minutos)
Fase móvil A (%)
Fase móvil B (%)
0
70
30
8
10
90
11
10
90
11.5
70
30
17
70
30
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Tabla 2-A: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C18
bajo condiciones ácidas.
Columna
X-Bridge C18, 50 mm largo * 2.1 mm diámetro, 2.5 um tamaño de partícula
Flujo
0.3 mL/min
Volumen de Inyección
5 uL – 20 uL (Dependiendo de la sensibilidad del MS)
Temperatura de la
columna
25°C
Gradiente
Tiempo (minutos)
Fase móvil A (%)
Fase móvil B (%)
0
90
10
4
20
80
6
20
80
6.5
90
10
9
90
10
B. Condiciones cromatográficas básicas (I)
Fase móvil A: 0.05 % v/v amoniaco en agua (pH = 11): Preparación 1000 mL: Agregar con una
pipeta 0.5 mL de amoniaco a 1000 mL de agua y mezclar. Esta solución puede ser
almacenada a temperatura ambiente y puede ser utilizada por un mes.
Fase móvil B: 0.05% v/v amoniaco en 90% de acetonitrilo: Preparación 1000 mL: Agregar con
la ayuda de probetas 900 mL de acetonitrilo y 100 mL de agua en una botella de 1000 mL;
agregar con una pipeta 0.5 mL de amoniaco y mezclar. Esta solución puede ser almacenada a
temperatura ambiente y puede ser usada por un mes.
Tabla 1-B: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C18
bajo condiciones básicas I.
Columna
X-Bridge C18, 150 mm largo * 3 mm diámetro, 5 o 3.5 um tamaño de
partícula
Flujo
0.4 mL/min
Volumen de Inyección
10 uL
Temperatura de la
columna
40°C
Tiempo (minutos)
Fase móvil A (%)
Fase móvil B (%)
0
90
10
Gradiente
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1
90
10
10
10
90
13
10
90
15
90
10
19
90
10
C. Condiciones cromatográficas básicas (II)
Fase móvil A: 100% agua + 2 mM bicarbonato de amonio, pH 11: Preparación 500 mL:
Disolver 79 mg de bicarbonato de amonio en 30 mL de agua y agregar a un matraz aforado de
500 mL; agregar 7.5 mL de hidróxido de amonio y llevar al aforo con agua. Chequear el pH.
Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada hasta 48
horas luego de su preparación.
Fase móvil B: 90% acetonitrilo: 10% agua + 2 mM bicarbonato de amonio, pH 11: Preparación
500 mL: Disolver 79 mg de bicarbonato de amonio en 33 mL de agua y agregar a un matraz
aforado de 500 mL; agregar 17.5 mL de hidróxido de amonio y llevar al aforo con acetonitrilo.
Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente y puede ser usada luego de 48
horas de su preparación.
Tabla 1-C: Posibles condiciones LC para el análisis de toxinas lipofílicas en una columna C18
bajo condiciones básicas II
Columna
X-Bridge C18, 150 mm largo * 2.0 mm diámetro, 3.5 um tamaño de
partícula
Flujo
0.3 mL/min
Volumen de Inyección
5uL - 10 uL
Temperatura de la
columna
30°C
Gradiente
Tiempo (minutos)
Fase móvil A (%)
Fase móvil B (%)
0
75
25
1
75
25
11.4
0
100
16.7
0
100
17
75
25
22.5
75
25
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Detección por medio del Espectrómetro de masas
Antes del análisis de las muestras, los parámetros del espectrómetro de masas (MS) deben ser
previamente optimizados con los estándares de las toxinas con el objetivo de alcanzar el
máximo nivel de sensibilidad en el análisis. Estos parámetros dependen del modelo del
instrumento.
Si no se dispone de estándares individuales, los parámetros del MS deben ser basados en
aquellos optimizados para los estándares disponibles. Consecuentemente, los mismos valores
de DP[V], CE[eV] y dwell time deben ser usados para la detección de cada grupo de toxinas
(AO, PTX, AZA y YTX) dado que cada grupo tiene el mismo patrón de fragmentación.
Cada pico cromatográfico debe ser definido por un rango de al menos 10 a 15 puntos de datos
por pico para obtener una descripción lo más precisa del pico.
La detección MS debe ser realizada utilizando dos transiciones por toxina. La transición de
mayor intensidad es la utilizada para la cuantificación, mientras que la transición de menor
intensidad es utilizada con fines confirmatorios.
Tabla 10. Ejemplo de parámetros para un sistema 3200 Qtrap LC/MSMS (Aplied Biosystem/SCIEX)
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Tabla 11. Ejemplo de condiciones de fragmentación MS/MS para un sistema 3200 Qtrap LC/MSMS (applied
biosystem/MDS SCIEX)
*= Si no existe la toxina individual disponible, los valores deben ser basados en aquellos optimizados
para los estándares disponibles (usualmente PTX2 para el grupo de PTX y AZA1 para el grupo AZA)
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ANEXO B
Procedimiento para la extracción de toxinas lipofílicas a partir de mejillones procesados*
Durante el procesamiento de los moluscos existe una pérdida de agua, por ejemplo cuando se
producen moluscos al vapor o en autoclave (conservas). El proceso al vapor en general
resultará en una pérdida del 30% de agua y el autoclave en un 50%. Con el fin de corregir esta
pérdida de agua y facilitar las etapas de homogenización y extracción, esta agua debe ser
agregada al molusco procesado antes de aplicar el método analítico. Esto es necesario si la
concentración de toxina determinada está relacionada con el límite regulatorio establecido para
moluscos bivalvos frescos.
1.Mejillones en conserva
a. Envasados en aceite, salsa, caldo y agua:
Seguir el método oficial AOAC 937.07. Si la proporción sólido/líquido es alta (Ejemplo mayor a
50/50) y/o si se obtiene una mezcla heterogénea, agregar agua. Tomar este factor de dilución
en cuenta cuando se calcule la concentración total del producto. Realizar la extracción como lo
indica el método (7.5.2) y luego de esta aplicar procedimientos adecuados de limpieza como
SPE. Se deben incluir controles de calidad adecuados como por ejemplo determinar la
recuperación y/o corregir el efecto de la matriz, si se hace necesario.
b. Envasados en salmuera ( u otra salsa no comestible)
Separar la carne del mejillón del líquido. Lavar el tejido del mejillón con agua, permitir que el
mejillón se drene. Pesar el mejillón drenado. Reconstituir el tejido del mejillón a 50/50
tejido/agua con agua desionizada. Homogenizar el tejido y agua en conjunto. Realizar la
extracción de acuerdo al método (7.5.2)
Ejemplo: Para 100g de mejillón agregar 100g de agua
Fórmula: Agua pesada = Mejillón pesado * 50/50
2.Mejillones cocidos al vapor
Pesar el tejido de molusco. Reconstituir el tejido de molusco en 70/30 tejido/agua con agua
desionizada. Homogenizar el tejido con el agua. Realizar la extracción de acuerdo al método
(7.5.2).
Ejemplo: Para 100g de molusco al vapor agregar 42.5g de agua
Fórmula: Agua pesada = Molusco pesado * 30/70
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23
3.Mejillones procesados (envasados en bolsas de vacío)
Cuando se indique que no hay agua o salsa agregada, todo el líquido presente en la bolsa de
vacío debe ser incluido en la muestra. Cuando los moluscos estén en su concha, el líquido
debe ser guardado, los moluscos desconchados y se debe agregar el líquido antes de
homogenizar. Realizar la extracción como lo indica el método (7.5.2)
*Los procedimientos recién descritos pueden ser aplicados a especies de moluscos diferentes
a mejillones, tomando en cuenta que se debe conocer la cantidad de agua perdida durante el
procesamiento. En la actualidad, las pérdidas de agua durante el proceso de vapor y conserva
para las otras especies de moluscos consideradas en el alcance de este método no están
descritas.