Manual CLART HPV 2 v9 Dic 2010 castellano

CLART PAPILLOMAVIRUS HUMANO 2
GENOTIPADO DE
PAPILLOMAVIRUS HUMANO
MEDIANTE
IDENTIFICACIÓN GENÓMICA
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
1
CLART PAPILLOMAVIRUS HUMANO 2
Extracción-Purificación y Amplificación
24 determinaciones
Ref: AT-1104-24-MT
48 determinaciones
Ref: AT-1104-48-MT
Ref: AS-0108-48-PL
96 determinaciones
Ref: AS-0108-96-PL
CLART PAPILLOMAVIRUS HUMANO 2
Genotipado
24 determinaciones
Ref: AT-1204-24
48 determinaciones
Ref: AT-1204-48
Ref: CS-0208-48
96 determinaciones
Ref: CS-0208-96
Solicitud de patente internacional nº PCT/6132006/05031 y solicitudes
nacionales correspondientes.
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain
Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
www.genomica.es
Versión 9
Diciembre 2010
2
ÍNDICE:
1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
2. INTRODUCCIÓN
3. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
4. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
4.1. Reactivos de extracción, purificación y amplificación
4.2. Reactivos de visualización
4.3. Otros componentes
5. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
5.1. Reactivos y material
5.2. Equipos
6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
6.1. Recomendaciones generales
6.2. Precauciones para la visualización
7. TOMA DE MUESTRAS
7.1. Frotis
7.2. Suspensiones celulares
7.3. Tejido fijado en formol e incluido en parafina
8. PROTOCOLO DE TRABAJO
8.1. Extracción del ADN de PVH
8.1.1. Extracción manual
8.1.2 Extracción automática
8.2. Reacción de amplificación
8.3. Visualización del producto amplificado
8.3.1. Visualización en Array Tubes (AT)
8.3.2. Visualización en CLART® Strips (CS)
9. LECTURA DE RESULTADOS
10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
12. BIBLIOGRAFÍA
13. TABLAS
3
1.
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Atención, ver instrucciones de uso
Fecha de caducidad
Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar a temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4 ºC y 8 ºC
4ºC
-18ºC
Conservar entre –30 ºC y –18 ºC
30ºC
4
2.
INTRODUCCIÓN
El objetivo de esta nueva versión de CLART Papillomavirus humano 2 es el
aumento significativo de la sensibilidad y especificidad de la técnica, para dotar al
facultativo de una herramienta de precisión a la hora de diagnosticar el
Papillomavirus humano (PVH).
La eficacia del tipado previo de VPH como herramienta de diagnóstico y
prevención para la detección de cáncer cervical y neoplasia intraepitelial ha
quedado sobradamente demostrada en recientes y masivos ensayos clínicos
(Ronco et al, 2010).
Como resultado, GENOMICA ha diseñado un producto cuya especificidad y
sensiblidad diagnóstica alcanza el 98 y el 100% respectivamente.
En los últimos años se ha determinado que la infección con el virus del Papilloma
Humano es la principal causa de cáncer de cuello de útero y de neoplasia
cervical intraepitelial (Walboomers et al. 1999, Bosch et al. 2002, Kjaer et al,
2010). 50 de los 100 tipos de PVH que han sido descritos hasta la fecha, se han
encontrado en la mucosa anogenital.
Los tipos anogenitales, virus de tramisión sexual, se han clasificado en dos
grupos de riesgo según su asociación con el cáncer de cuello de útero (Dunne et
al., 2007):
·
·
Tipos de bajo riesgo oncogénico: incluyen los tipos 6, 11, 32, 40, 42, 44,
54, 55, 61, 62, 64, 71, 72, 74, 81, 83, 84, 87, 89 y 91.
Tipos de alto riesgo oncogénico: incluyen los tipos 16, 18, 26, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82 y 85.
Esta clasificación epidemiológica resalta la relevancia de identificar los tipos de
PVH causantes de la infección, para poder determinar el tratamiento médico
adecuado.
Figura 1: JAMA, Dunne et al., 2007
5
El kit está basado en la amplificación de fragmentos específicos del genoma
vírico y su posterior hibridación con sondas específicas para cada tipo de PVH.
CLART Papillomavirus humano 2 es capaz de detectar infecciones y
coinfecciones de hasta 35 genotipos en un único tubo, lo que conlleva un amplio
número de ventajas:
1
2
3
4
3.
Su alta sensibilidad permite la detección de cantidades mínimas de ADN
vírico.
La elevada especificidad, al utilizar una secuencia correspondiente a una
región altamente conservada dentro del genoma vírico y sondas de
captura específicas para cada tipo de PVH.
Fácil de estandarizar en un laboratorio hospitalario.
Rapidez, se obtienen los resultados de los análisis en 8 h.
DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
CLART Papillomavirus humano 2 detecta la presencia de los 35 virus de PVH
(6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61,
62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89) con mayor importancia clínica
(ver Fig. 1) en distintos tipos de muestras humanas (frotis, suspensiones
celulares y tejido fijado en formol e incluido en parafina).
La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de
unos 450 pb dentro de la región L1 del virus por tratarse de una secuencia
que está altamente conservada entre los distintos tipos de PVH. Sin embargo,
esta región presenta suficientes variaciones como para poder diferenciar cada
tipo de virus con sondas específicas. De esta manera, se asegura la
especificidad de la detección.
La detección del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante una
nueva plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART®
(Clinical Array Technology). La plataforma se fundamenta en un principio muy
sencillo pero a la vez muy cómodo y eficaz que consiste en incluir un microarray
en la parte inferior de un tubo de 2 ml (Array TubeTM-AT) o en el fondo de un
pocillo de placa microtiter (CLART® Strip-CS) (Figura 2), lo que simplifica todo el
proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de arrays clásicos.
Figura 2. Plataforma CLART® Strip-CS en forma de tira de 8 pocillos.
6
El sistema de detección con CLART Papillomavirus humano 2 se basa en la
precipitación de un producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las
que se produce la hibridación de los productos amplificados con las sondas
específicas. Durante la PCR, los productos amplificados se marcan con biotina.
Después de la amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas
sondas específicas que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del
microarray, tras lo que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa.
El conjugado se une a través de la estreptavidina con la biotina presente en los
productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas
específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto
insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas
del microarray en las que ocurre la hibridación (Figura 3).
Sondas sobre array
Producto marcado
biotina
Hibridación
Incubación
con el conjugado
Conjugado
Reacción de revelado
Precipitación
del sustrato
Figura 3: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la
superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A
través de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de
rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la acción de la HRP, produce
un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación.
7
La sensibilidad obtenida combinando la amplificación genómica y la visualización
en el microarray con el kit CLART Papillomavirus humano 2 es tan alta, que no
es necesario hacer dobles amplificaciones (nested) evitando el riesgo de
contaminación que éstas conllevan.
4. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
El kit CLART Papillomavirus humano 2 contiene suficientes reactivos para
la extracción y análisis del ADN de 24, 48 ó 96 muestras clínicas. Los reactivos
incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la
temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en
las condiciones indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad indicada.
4.1. Reactivos de extracción, purificación y amplificación
1
El kit de Extracción y Purificación CLART Papillomavirus humano 2 se
envía a 4ºC o a temperatura ambiente. La proteinasa K una vez
resuspendida debe conservarse a 4 ºC.
Sus componentes son:
1 Columnas de purificación acopladas a tubos de 2 ml
2 Tubos de 2 ml
3 Buffer T1
4 Buffer B1
5 Buffer B2
6 Buffer B5
7 Buffer BE
8 Buffer BW
9 Etiqueta para Buffer B3
10 Proteinasa K liofilizada
11 Buffer PB
• Los reactivos de amplificación se envían a -20 ºC. Son los siguientes:
Tubos de Amplificación contienen 45 µl de mezcla de reacción. Están
listos para su uso y deben mantenerse a -20ºC. Sólo se deben descongelar
sobre hielo el número preciso de tubos de amplificación que se vayan a
procesar, conservando el resto de los tubos a la temperatura indicada.
En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de
temperatura; la aparición de un color rojizo en la ventana de
visualización indica que en algún momento los productos han
sobrepasado la temperatura de conservación de –20oC y no deben
utilizarse.
4.2. Reactivos de visualización
Se envían a 4 ºC. Son los siguientes:
8
1. Microarrays: Tubos AT o Tiras CS (sondas específicas incluidas). Se
suministran en un sobre termosellado. Conservarlos siempre cerrados,
a temperatura ambiente y protegidos de la luz.
2. SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4 ºC.
3. DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC.
4. CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes
de usar.
5. RE (Solución de Revelado). Conservar a 4 ºC.
6. TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4 ºC.
7. Soporte y tapa para tiras de 8 pocillos.
¡ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, los microarrrays deben
conservarse a temperatura ambiente.
4.3. Otros componentes
Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesita un
equipo o lector, un adaptador, y un software, capaces de generar de
manera automática un informe por cada muestra analizada:
•
Lector CAR (Clinical Array Reader) (figura 4): permite la lectura e
interpretación automática de hasta 12 CS, es decir, de hasta un
máximo de 96 muestras. En este lector también pueden leerse ATs.
Está fabricado y distribuido por GENOMICA para su uso exclusivo con
los kits de diagnóstico.
•
Soporte adaptador que se coloca sobre la bandeja del CAR, sobre el
cual se acopla la placa antes de la lectura.
•
Software: específico para CLART® HPV2, diseñado y validado por
GENOMICA.
CAR
(Clinical Array Reader)
9
Figura 4. CAR
5.
MATERIAL REQUERIDO, NO SUMINISTRADO
5.1. Reactivos y material
1
2
3
4
5
6
7
8
Agua destilada.
Etanol 96%
Guantes desechables.
Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo.
Recipiente con hielo picado.
Tubos Eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
Gradillas para tubos de 1,5 ml.
Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
5.2. Equipos
2
3
4
5
6
7
8
Microcentrífuga.
Termociclador.
Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl
para el laboratorio de extracción.
Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl
para el laboratorio de visualización.
Termomixer con agitación ajustable a 37, 55, 60 y 100ºC.
Compatible con tubos tipo Eppendorf y con tiras de 8 pocillos.
Vortex.
Sistema de vacío (opcional).
6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
¡Muy importante para evitar contaminaciones! Leer detenidamente antes de
comenzar la técnica.
10
6.1. Recomendaciones generales:
1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para
evitar la contaminación de las muestras con el producto amplificado
anteriormente. Cada una de las áreas debe tener su propio material de trabajo
identificado (pipetas, puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de
cada una de ellas.
1
Área pre-PCR: En esta área se hace la extracción del ADN y preparación
de las muestras.
1
Área post-PCR: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la
visualización del producto amplificado. El material de esta área nunca ha
de entrar en contacto con el del área de extracción. Evitar ir al área de
pre-PCR después de haber estado trabajando en el área de visualización.
2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes
con cierta frecuencia.
3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas,
termociclador) en profundidad con lejía diluida al 10% cada vez que se procese
una tanda de muestras, y obligatoriamente después de una contaminación.
4. Emplear siempre puntas con filtro o pipetas de desplazamiento positivo
para evitar contaminaciones debidas a la micropipeta.
5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado.
6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes aunque sean del mismo
lote.
7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para
evitar contaminaciones.
8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo.
9. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el
kit si se emplean otras muestras distintas a las indicadas o ADN extraído
por un protocolo distinto al indicado.
6.2. Precauciones para la visualización
1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del tubo,
ya que podría dañarse el micro-array situado en el fondo.
2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del tubo AT/CS, nunca
directamente sobre el fondo.
3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los
11
productos desnaturalizados de PCR.
4. En el caso de procesar AT es muy importante eliminar completamente todo
resto de solución antes de añadir la siguiente.
En el caso de procesar CS se dejará un ligero remanente de volumen de manera
que el array en ningún momento quede seco.
5. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el tubo
AT/CS y la tapa del tubo para evitar que queden restos de éste y que reaccionen
con la solución RE, produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar
a interpretaciones erróneas del resultado.
6. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las
distintas soluciones.
7. Mantener limpia la base del tubo AT/CS para evitar posibles interferencias en
la lectura de resultados.
8. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores
de posición y de que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura.
En caso contrario, limpiar el fondo del tubo por fuera con un papel de celulosa o
golpear suavemente el tubo con el dedo.
7. TOMA DE MUESTRAS
7.1. Frotis
Tomar la muestra con una torunda seca y estéril, de algodón o alginato, lo
suficientemente grande como para obtener una buena cantidad de muestra. No
utilizar dispositivos que produzcan el sangrado de la lesión. Volver a introducir la
torunda en su tubo sin ningún tipo de medio. Conservar la muestra a 4ºC si se va
a procesar antes de 7 días o a –20ºC si se va procesar después.
7.2. Suspensiones celulares
Estas suspensiones celulares son del tipo de las utilizadas para realizar citologías
cervicovaginales de capa fina por filtración a través de membranas (ThinPrep®,
Cytyc). Tomar la muestra con un cepillo o espátula. Resuspender la muestra
agitando el dispositivo utilizado en un vial con medio de transporte. Desechar el
dispositivo utilizado y conservar la muestra a 4ºC hasta su procesamiento.
7.3. Tejido fijado en formol e incluido en parafina
Fijar las muestras en formol tamponado durante el menor tiempo posible (nunca
más de 24 horas). El empleo de formol no tamponado o la fijación durante más
de 24 horas puede degradar el ADN de la muestra. Es importante limpiar
cuidadosamente la cuchilla con xileno, antes y después de cortar la muestra,
para evitar arrastrar restos de otra muestra cortada anteriormente. Quitar con una
12
cuchilla la parafina sobrante alrededor de la pieza. Hacer con el microtomo 2-3
cortes de 5 µm y ponerlos en un tubo estéril de 1,5 ml.
8. PROTOCOLO DE TRABAJO
8.1.1. Extracción manual del ADN de PVH
Recomendaciones específicas antes de comenzar la extracción:
1
Preparar la solución B3: añadir el Buffer B1 al Buffer B2 y agitar. El Buffer
resultante B3, ha de almacenarse protegido de la luz y a temperatura
ambiente; en estas condiciones, es estable durante 5 meses.
2
Disolver la proteinasa K en PB antes de usar (la cantidad de PB está
indicada en el bote de proteinasa K), para alcanzar una concentración de
20 mg/ml. La proteinasa K, una vez disuelta, debe almacenarse a 4°C.
3
Añadir etanol (96-100 %) al Buffer B5 antes de usar. El volumen de etanol
está indicado en el bote Buffer B5.
4
Calentar la Solución BE a 70°C antes de usar.
5
Todas las centrifugaciones del proceso se realizarán a temperatura
ambiente, a no ser que se especifique otra cosa.
Atención: Las Soluciones B3 y BW contienen hidrocloruro de guanidino. Se
recomienda el uso de guantes, gafas y bata de laboratorio para su manejo.
Extracción del ADN de PVH.
1. Preparación de la muestra
Frotis:
•
Añadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9%) al tubo que
contiene la torunda y agitar vigorosamente en un vortex durante 1
minuto.
•
Decantar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml estéril.
•
Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a
12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de líquido,
cuidando de no llevarse el precipitado.
•
Resuspender en 180 µl de Solución T1. Continuar con el paso 2.
Tejido fijado en formol e incluido en parafina:
13
•
Introducir 4 o 5 cortes de tejido de unos 5 µm en un tubo estéril de
microcentrífuga de 1,5 ml y añadirles 180 µl de Solución T1.
•
Tras machacar el tejido con la punta de la pipeta, mezclar en el vortex
para facilitar la lisis. Continuar con el paso 2.
Suspensiones celulares:
•
Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que está
contenida y pasar 1 ml a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml.
•
Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a
12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de líquido,
cuidando de no arrastrar el precipitado.
•
Resuspender el precipitado con 1 ml de agua destilada estéril.
•
Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a
12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de líquido,
cuidando de no llevarse el precipitado.
•
Resuspender en 180 µl de Solución T1.
•
Transferir a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml.
A partir de este paso, todas las muestras serán tratadas de la misma manera, de
acuerdo con el siguiente protocolo:
2. Añadir 25 µl de la solución de Proteinasa K.
•
Mezclar en vortex.
•
Incubar a 56°C, 1-3 horas, (toda la noche en el ca so de las muestras
en parafina), en un baño o un Termomixer con agitación, hasta que la
muestra esté totalmente lisada. Para acelerar esta lisis, se
recomienda agitar las muestras en un vortex cada 15 minutos.
3. Una vez lisada la muestra, añadir 200 µl de Solución B3 a cada muestra.
Mezclar en vortex e incubar a 70°C durante 10 min.
14
4. Añadir 210 µl de etanol
inmediatamente.
96% a cada muestra y agitar en vortex
Nota: No descartar ningún precipitado blanquecino que se pueda haber formado
tras la adición del etanol; este precipitado debe añadirse con el resto de la
solución a la columna de purificación en el siguiente paso.
5. Preparar una columna de purificación por muestra y colocarla en un tubo de
recogida de 2 ml. Añadir la muestra y centrifugar durante 1 minuto a 12.000
r.p.m.
Si el líquido no ha atravesado completamente la membrana, repetir la
centrifugación. Descartar el fluído filtrado y el tubo de recogida de 2 ml.
6. Colocar la columna en otro tubo colector y añadir 500 µl de la Solución BW a la
columna. Centrifugar a 12000 r.p.m.
durante 1 min. Descartar el fluido filtrado y el tubo colector.
7. Colocar la columna en otro tubo colector y añadir 600 µl de Solución B5 a la
columna. Centrifugar a 12000 r.p.m.
durante 1 min. Descartar el fluido filtrado.
15
8. Reinsertar la columna en el tubo de recogida. Centrifugar a 12000 r.p.m.
durante 1 min para eliminar cualquier resto de la Solución B5.
Nota: El etanol residual que pueda quedar de la Solución B5 inhibe
reacciones enzimáticas, por lo que se debe eliminar completamente
mediante esta centrifugación.
9. Colocar la columna en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir el
ADN con 100 µl de la Solución BE (previamente calentada a 70°C). Incubar esta
Solución caliente en la columna a temperatura ambiente durante 1 min.
Centrifugar a 12.000 r.p.m. durante 1 min.
10. Recuperar el filtrado (aproximadamente 100 µl) en el tubo de microcentrífuga
de 1,5 ml. Utilizar 5 µl para la reacción de amplificación y guardar el resto a –
20°C.
8.1.2. Extracción automática del ADN de PVH
8.1.2.1. Equipo easyMAG de Biomérieux
Se recomienda realizar el método siguiente:
1. Preparación de la muestra para la lisis interna (se realiza dentro del equipo).
Frotis:
•
Añadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9%) al tubo que
contiene la torunda y agitar vigorosamente en un vortex durante 1
16
minuto.
•
Decantar el sobrenadante en un tubo estéril de 1,5 ml.
•
Transferir 1 ml a un pocillo de la cubeta (cada cubeta tiene 8 pocillos).
Suspensiones celulares (volúmenes inferiores a 3 ml):
•
Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que está
contenida. Transferir 1 ml a un pocillo de la cubeta.
Medio de Captura de híbridos:
•
Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que está
contenida. Transferir 0.5 ml a un pocillo de la cubeta.
2. Lisis interna y extracción del ADN: seguir la guía de usuario del equipo. Hay
que identificar en el programa que el volumen de elucción es 110 µl.
3. Una vez finalizada la extracción se toman con pipeta los 110 µl de ADN eluido
y se introducen en tubos eppendorf de 1,5 ml. Utilizar 5 µl para la reacción de
amplificación y guardar el resto a –20°C.
8.1.2.2. Equipo BioSprint 96 de Qiagen.
Se recomienda realizar el método siguiente:
PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES
Asegúrese de que las soluciones estén preparadas antes de comenzar el
proceso de extracción.
1. La proteasa se encuentra liofilizada, antes de su uso añadir 4.4 ml del buffer
indicado en la etiqueta, a partir de este momento conservar a 4º C, hasta 2
meses.
2. Preparación Buffer AW1
Volumen AW1
Volumen de Etanol 96%
Volumen Final (ml)
concentrado (ml)
a añadir
19
25
44
27
35
62
98
130
228
Nota: guardar a Tª ambiente. Antes de utilizar agitar la botella unas 5 veces.
3. Preparación Buffer AW2
Volumen AW2
Volumen de Etanol 96%
concentrado (ml)
a añadir
Volumen Final (ml)
17
17
40
57
68
160
228
Nota: guardar a Tª ambiente. Antes de utilizar agitar la botella unas 5 veces.
4. Preparación de Tween 20 al 0.0002%.
H2O RNasa free
30 ml
Tween 20
6µl
Nota: Una vez hecha la mezcla se guarda a 4º C.
250 ml
50 µl
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1. ¡Importante, encender el Termomixer a 70ºC para la lisis con Proteasa!.
Frotis:
•
Cortar e introducir el bastoncillo en un microtubo de 1.5 ml. Añadir:
- 400 µl de buffer ATL
- 20 µl de Proteasa
Suspensiones celulares (volúmenes inferiores a 3 ml):
•
Citologías líquidas: agitar previamente en vortex y añadir a la placa
(S-Block).
-200 µl de muestra
-20 µl de Proteasa
2. Incubar en el Termomixer 10 min. a 70ºC. Si la incubación se realiza en la
placa, cubrir ésta con un film transparente y colocar una placa metálica
previamente calentada a 70ºC encima. De esta manera se evita la
condensación de la muestra y por tanto una posible contaminación.
3. Preparación de la master mix. Preparar volumen para una muestra extra por
cada serie de 10.
Añadir los siguientes volúmenes:
Componentes
Buffer AL
Isopropanol
MagAttract Suspension G
Volumen por muestra (µl)
200
200
20
4. Dispensar las soluciones en las placas.
Se van a necesitar 6 S-Block y 2 Microplate MP.
18
En la tabla 1 aparece el orden de carga de las placas en el equipo y los distintos
volúmenes que hay que añadir a las placas.
Posición en el
equipo
8
Placa
A añadir…
Microplate MP
7
Microplate MP
6
S-Block
5
4
3
2
1
S-Block
S-Block
S-Block
S-Block
S-Block
Situar el soporte con el
cobertor encima.
Buffer AE (Buffer de
Elución)
H2O RNasa free +
Tween 20
Buffer AW2(2)
Buffer AW2(1)
Buffer AW1(2)
Buffer AW1(1)
Muestras lisadas +
Master mix (*)
Volumen por
pocillo (µl)
-----100 ó 200
500
500
500
500
500
200 + 420
(*)En el caso de frotis, antes de añadir el lisado, se da un pequeño spin a las
muestras. Añadir primero los 200 µl de muestra lisada y sobre ella los 420 µl de
la master mix por pocillo. En el caso de haber lisado en placa, añadimos
directamente los 420 µl de master mix a cada pocillo. En ambos casos, se
mezcla con la pipeta.
5. Extracción.
• Una vez que están todas las placas preparadas con el volumen
correspondiente, encender el equipo con el botón de encendido.
• Abrir la ventana protectora.
• Seleccionar mediante las flechas superior e inferior el programa ADN
Swab y se pulsa START.
Aparece un mensaje en el LCD pidiendo que se introduzca la placa de la
posición 8 (ver tabla 1). Después de cargar la placa 8 presionar “Star”. El
carrusel gira y aparece un mensaje pidiendo que se introduzca la placa de
elusión en la posición 7. Después de cargar la placa 7 presionar “Star”.
Continuar el proceso hasta tener todas las posiciones cubiertas.
La tabla 1 muestra la posición que debe ocupar cada una de las placas.
Todas las placas deben quedar con las etiquetas hacia el interior.
• Una vez colocadas todas las placas se cierra la ventana protectora del
Biosprint 96.
• El proceso de extracción durará unos 20 minutos. El ADN extraído se
puede almacenar en la placa de elución (posición 7) a -20ºC, tapando los
pocillos con un film transparente. Si no se utiliza la placa entera, tomar el
ADN extraído mediante pipeta e introducirlo en un microtubo de 1,5 ml para
el posterior almacenamiento a -20ºC.
19
8.2. Reacción de amplificación
1. Descongelar un Tubo de Reacción por cada muestra que se va a
estudiar y mantenerlos en hielo. No usar temperaturas superiores a
37ºC para la descongelación.
2. Centrifugar unos segundos los Tubos de Reacción en la
microcentrífuga para que quede todo el líquido en el fondo del tubo (si
no se dispone de adaptadores de microcentrífuga para los Tubos de
Reacción, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamaño mayor a
los que se les haya cortado la tapa).
3. Si el ADN ha sido obtenido de muestras incluidas en parafina, añadir
1,5 µl de Cloruro de Magnesio 25mM en los tubos de amplificación.
4. Añadir 5 µl del ADN extraído de las muestras a los Tubos de Reacción
y resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el
hielo.
5. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas:
- Para Tubos de Reacción de 0,2 ml:
1 ciclo
40 ciclos
95ºC 5 min
94ºC 30 seg
55ºC 60 seg
72ºC 90 seg
1 ciclo
72ºC 8 min
20ºC continuo hasta la recogida de tubos (opcional)
6. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reacción en el
termociclador cuando el bloque haya sobrepasado los 90 ºC. De este
modo se minimizan las posibles amplificaciones inespecíficas debidas a
incubación por debajo de la temperatura de hibridación. La duración de la
amplificación es de unas 4 horas, aunque puede variar ligeramente
dependiendo del termociclador.
8.3. Visualización del producto amplificado
8.3.1. Visualización en Array Tubes (AT)
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
20
EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR
SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO
AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR.
1. Encender el lector de ATs al comienzo del proceso, la autocalibración
del equipo tarda unos minutos y debe estar listo en el momento de la
lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de
revelado.
2. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de
poner en marcha el programa de desnaturalización. Colocar los tubos
de amplificación separados en el termociclador durante el proceso y
nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización.
3. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro. Salvo
en la adición de amplificados al tubo AT donde sí es necesario.
4. Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente.
Asegurarse de que no tiene cristales antes de su uso.
5. Asegurarse de que los termomixers han alcanzado la temperatura
adecuada antes de introducir los tubos AT.
6. En caso de fallo de lectura, escribir el número que aparece en el tubo
AT especificado como Assay ID.
Visualización
1.
Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los
productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en
el termociclador e incubar a 95 ºC durante 10 minutos. Programar en
el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10
minutos los amplificados sigan a 95 ºC. Sacar los tubos de la
incubación a 95 ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con
hielo.
2. Preparación de la Solución TL diluida:
• Para 24 muestras, añadir 3 ml de Solución TL a 27 ml de agua
destilada.
• Para 48 muestras, añadir 6 ml de Solución TL a 54 ml de agua
destilada.
3.
Pre-lavado del tubo AT: antes de empezar el ensayo es necesario
lavar los tubos AT añadiendo 300 µl de Solución TL diluida a cada AT
e invertiendo el tubo 4 ó 5 veces. Desechar la Solución TL diluida con
pipeta o preferiblemente con vacío. Se debe dejar el tubo sin restos
de la solución de lavado, para ello también secamos las tapas, pero
21
en ningún momento se deben dejar los tubos secos. Añadir la
siguiente solución inmediatamente.
4.
Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª
ambiente y sin cristales. Una vez desnaturalizados los productos de
PCR, añadir 100 µl de Solución SH (evitar que se forme espuma) a
cada tubo AT. Añadir 5 µl de producto de PCR desnaturalizado al
tubo AT, resuspender varias veces para que se mezcle con la
solución de hibridación, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar en
el termomixer durante 1 hora a 55ºC, agitando a 550 rpm.
Tras esta incubación, sacar los tubos y desechar la Solución SH con
pipeta o vacío. (Dejamos programado el termomixer a 30ºC y en
movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar
la tapa para que baje antes la temperatura).
5.
Lavado: añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir
los tubos de 5 a 10 veces. Desechar la Solución TL diluida si se usa
vacío con una pipeta pasteur diferente en cada AT, o si se usa la
pipeta manual con una punta distinta. Si llegado a este paso, el
termomixer no hubiera llegado a los 30ºC se dejan los tubos con
Solución TL diluida hasta que el termomixer alcance la temperatura.
6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridación, se
debe preparar la solución CJ diluida y mantener en hielo. Se
recomienda centrifugar la solución CJ durante 10 segundos antes de
usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Para ello,
mezclar en un tubo 100 µl de Solución DC y 1 µl de Solución CJ por
cada AT (preparar mezcla para un AT extra por cada serie de diez,
para compensar los errores de pipeteo). Se debe dar un vórtex a la
solución una vez diluida para homogenizar.
Desechar la Solución TL diluida y añadir al tubo AT 100 µl de
Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos a 30ºC,
agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, desechar la solución del
tubo AT con pipeta o vacío inmediatamente.
Bajamos la temperatura del termomixer a 25 ºC para su utilización en
el paso 8.
7. Doble Lavado: Añadir inmediatamente 300 µl de Solución TL
diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 5 a 10 veces, desechar
la solución con la pipeta o vacío. Repetir la operación.
Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que
ésta reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal
inespecífica. No es necesario el cambio de punta para cada tubo,
pero sí es importante no tocar al cristal.
8. Revelado con Solución RE: Se recomienda trabajar en tandas
de 12 tubos AT. Quitar la solución TL, añadir 100 µl de solución RE
al tubo AT e incubar 10 minutos a 25 ºC en el Termomixer sin
agitación.
22
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el Termomixer sin agitación
y leer las muestras inmediatamente después de la incubación.
9. Leer en forma “Análisis seriados” en la que se toman las imágenes
de todos los tubos para posteriormente ser analizadas
automáticamente.
8.3.2. Visualización en CLART® Strip (CS)
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR
SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO
AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR.
1. Encender el CAR (Clinical Arrays Reader) al comienzo del proceso. La
autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario además
introducir el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes
de la lectura. El aparato debe estar listo en el momento de la lectura para
evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado.
2. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de
placas ha estado a 65ºC al menos durante 30 min. o 1 hora.
3. Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente.
4. PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO,
NO REUTILIZAR SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON
ANTERIORIDAD.
5. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de
poner en marcha el programa de desnaturalización. Colocar los tubos de
amplificación separados en el termociclador durante el proceso y nunca
sobrepasar los 10 min. de desnaturalización.
6. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro pero sí es
necesario usar una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez
que se añada un reactivo, aunque se trate de TL. Sí es necesario utilizar
puntas con filtro durante la adición de amplificados al tubo CS.
7. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas
para aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o
descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada
ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja
restos en el fondo del pocillo.
8. Aspirar completamente las diferentes soluciones dentro de los pocillos sin
tocar el array.
23
VISUALIZACIÓN:
1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los
productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el
termociclador e incubar a 95ºC durante 10 minutos. Programar en el
termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos
los amplificados sigan a 95ºC. Sacar los tubos de la incubación a 95ºC y
colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo.
2. Preparación de la Solución TL diluida:
Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado
diluida, añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada.
3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los
tubos AT añadiendo 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS,
resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta
que no se debe tocar la superficie del array. Desechar la Solución TL
diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío.
El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe
permanecer seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución
inmediatamente.
4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª ambiente.
Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de
solución SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS.
Añadir 5 µl de producto de PCR desnaturalizado a cada pocillo de los CS,
resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de
hibridación, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar la tira cubierta con
la tapa de plástico transparente en el termomixer de placa tapado durante
1 hora a 65º C, agitando a 550 rpm.
Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH con
pipeta o bomba de vacío. (Dejamos programado el termomixer de placa a
30º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos
quitar la tapa para que baje antes la temperatura).
5. Doble Lavado: usar puntas diferentes para cada pocillo en ambos
lavados. Añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS,
resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la
Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío
multicanal. Repetir la operación. Si llegado a este paso, el termomixer
no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los pocillos con esta solución
hasta que el termomixer alcance la temperatura.
6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridación, se debe
preparar la solución CJ diluida y mantener en hielo. Se recomienda
centrifugar la solución CJ durante 10 segundos antes de usarla. A
continuación, preparar la solución CJ diluida. Por cada CS, se añade 1 ml
de solución DC y 7.5 µl de Solución CJ. Se debe dar un vórtex a la
solución una vez diluida para homogenizar.
24
Desechar la Solución TL diluida sin dejar seco el array y añadir a cada
pocillo del CS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos
exactos en el termomixer de placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta
incubación, sacar la placa y desechar la solución rápidamente con pipeta
o bomba de vacío multicanal. (Dejar programado el termomixer de placa a
25º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 8. Podemos
quitar la tapa para que baje antes la temperatura).
7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a
cada pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta
multicanal y desechar la solución con la pipeta o vacío sin dejar seco el
array. Repetir la operación dos veces más.
Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta
reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica.
8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida sin dejar seco el
array, añadir 100 µl de solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10
minutos a 25 º C en el termomixer de placa sin agitación.
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación
9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array
debe quedar seco
10. CAR (Clinical Arrays Reader): Se coloca un adaptador especial sobre la
bandeja del CAR y a continuación se colocará la placa en el CAR para
tomar las imágenes de todos los pocillos para posteriormente ser
analizadas automáticamente.
9. LECTURA DE RESULTADOS
El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se
realiza de forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe
en el que se indican los resultados.
10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los
falsos negativos debidos, bien a una calidad inadecuada del ADN de la muestra
(por toma de cantidad insuficiente de muestra, por degradación del ADN debida a
una incorrecta conservación o por pérdida del ADN de la muestra durante su
extracción), o bien a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las
muestras en las que se quiere analizar la presencia del virus (hemoglobina,
restos de parafina, sales, etc). Con el kit CLART Papillomavirus humano 2 se
han eliminado estos falsos negativos gracias a la introducción de dos controles
internos en el mismo tubo de reacción donde se analiza la muestra.
Cada tubo de amplificación contiene los siguientes oligos:
25
•
•
•
Un par de oligonucleótidos que amplifican un fragmento del gen CFRT
humano. Éste es el control de extracción de ADN genómico o control del
ADN del paciente.
Un par de oligonucleótidos que amplifican un plásmido modificado incluido
en el tubo de amplificación y que se usa como control de amplificación de
la reacción de PCR.
Oligonucleótidos específicos de PVH.
El tubo de PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de PVH frente a la
de los dos controles. En relación a estos últimos, la amplificación del control de
ADN genómico prima sobre la del control de la reacción de amplificación.
La razón de este diseño es:
El control interno de ADN genómico es necesario para la confirmación de
un verdadero resultado negativo, ya que nos informa de la presencia de ADN
del paciente en la muestra, aunque no haya habido amplificación de ningún tipo
de VPH.
El control interno de amplificación nos permitirá distinguir entre los casos de
inhibición de la reacción de PCR y aquéllos en los que no se encontró ADN en la
muestra.
En ciertas condiciones (ej. cuando hay un elevado número copias de un virus de
PVH o cuando la muestra presenta varios tipos de PVH a la vez) puede suceder
que no se amplifiquen los dos controles o alguno de ellos y aparezca una lectura
de: SIN SEÑAL.
26
Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes
interpretaciones de los resultados de lectura:
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
√
CONTROL
GENÓMICO
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
√
POSITIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO
Control Genómico
Control de amplificación
VPH

AT-array tube / CLART strip
MUESTRA
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
√
√
√
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
POSITIVO
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque el control de amplificación
se muestre SIN SEÑAL. Esto se debe al efecto de la competencia entre los tres
tipos de ADN.
Control Genómico
VPH

AT-array tube / CLART strip
27
MUESTRA
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
√
√
SIN
SEÑAL
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
SIN SEÑAL
POSITIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque ambos controles se
muestren SIN SEÑAL. Esto se debe, bien a que hay una gran cantidad de copias
de virus, o a un elevado número de genotipos de VPH presentes en la muestra.
VPH

AT-array tube/ CLART strip
MUESTRA
POSITIVO
para algún
genotipo
√
CONTROL
GENÓMICO
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
NEGATIVO
√
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO. En este caso podemos decir que
se trata de un verdadero resultado negativo.
Control de amplificación
Control Genómico

AT-array tube/ CLART strip
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
√
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
SIN SEÑAL
NEGATIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque no haya aparecido la señal
del control de amplificación, debido a una elevada concentración de ADN
genómico.
28
Control Genómico

AT-array tube/ CLART strip
MUESTRA
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
NEGATIVO
SIN SEÑAL
AGUA
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO, ya que en este caso se trata de
una “muestra blanco” (en vez de muestra, ponemos agua destilada en los tubos
de PCR), donde sólo debe aparecer el control de amplificación, porque no hay
ADN en la muestra que se pueda amplificar.
Control de amplificación

AT-array tube/ CLART strip
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
SIN SEÑAL
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
NO HAY ADN
Éste se considera un RESULTADO NO VÁLIDO. Se debe a que no hay ADN en
la muestra, por distintas razones:
1. Insuficiente material celular en la toma de muestra.
2. Pérdida de ADN durante el proceso de extracción.
La solución en estos casos es repetir la técnica desde la extracción o bien pedir
al facultativo una nueva toma de muestra al paciente.
29
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
SIN SEÑAL
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
SIN SEÑAL
PCR INHIBIDA
Éste se considera un RESULTADO NO VÁLIDO. Esto se debe a que algunas
sustancias pueden inhibir la reacción de PCR al perjudicar la actividad de la
enzima ADN polimerasa.
La solución es verificar que en las muestras o en el material genético extraído no
hay presencia de ninguna de estas sustancias. En la mayoría de los casos se
recomienda repetir la extracción o, si esto no es posible, pedir al facultativo una
nueva toma de muestra al paciente.
Marcadores

AT-array tube/ CLART strip
Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de Virus No
Concluyente:
•
En aquellos casos en que las tres réplicas de una sonda sean muy
distintas entre sí.
•
En coinfecciones para aquellos virus que se encuentren en el límite de
detección de la técnica.
11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
Control de interferencias conocidas:
Existen sustancias que pueden interferir en funcionamiento del kit CLART
Papillomavirus humano 2. Principalmente, son sustancias que inhiben la ADN
polimerasa y, por tanto, la reacción de amplificación. Las interferencias más
conocidas son:
1
Presencia de hemoglobina o parafina. Tanto el ADN extraído a partir de
frotis cervicovaginales como el obtenido a partir de muestras de tejidos
30
incluidos en parafina puede contener restos de hemoglobina. No obstante, el
kit de Extracción-Purificación de GENOMICA minimiza estos efectos.
2
Presencia de ácido acético o iodina en la muestra a analizar. Si la toma de
muestra para el análisis con el kit CLART Papillomavirus humano 2 se
realiza después de una colposcopia, esta muestra puede contener ácido
acético o iodina, que inhiben la PCR. Para evitar esto, realizar la toma de
muestra para el análisis con CLART Papillomavirus humano 2 previamente a
la colposcopia.
3
Utilización de muestras no adecuadas. El análisis de cualquier otro tipo de
muestra clínica distinta a las indicadas en el manual del kit CLART
Papillomavirus humano 2, así como una toma incorrecta de las muestras,
puede conllevar que el resultado del análisis no sea concluyente. Por
ejemplo, si la torunda ha sido incluida en algún tipo de medio, la PCR puede
resultar inhibida. Si el tiempo de fijación de un tejido en formol es excesivo, el
ADN puede degradarse, resultando la muestra inhibida por falta de
amplificación del control del ADN de la muestra.
4
Actividad residual de la Proteinasa K. En el proceso de extracción de
ADN, se tiene que inactivar la Proteinasa K mediante incubación a 70 ºC
durante 10 minutos. Bajo estas condiciones, la inactivación se produce de
forma completa. Si este paso fuera omitido o las condiciones se suavizaran
significativamente, podría ocurrir que permaneciese una actividad residual de
la Proteinasa K, lo que podría resultar en una degradación de la ADN
polimerasa y, por tanto, inhibición de la PCR.
5
La conservación inadecuada de las muestras puede influir en el resultado
del análisis. Si las muestras se someten a condiciones que puedan provocar
una degradación del ADN que contienen, el resultado del análisis será de
muestra inhibida por falta de amplificación del control del ADN de la muestra.
Especificaciones técnicas:
1. Parámetros Analíticos:
• Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se determinó mediante la
amplificación de los fragmentos específica de la región L1 para los diferentes
genotipos de VPH clonados en plásmidos recombinantes. La sensibilidad para
los tipos 16 y 18 también fue determinada a partir de la detección de muestras
del programa de evaluación de herramientas de laboratorio para el tipado del
VPH, de la organización mundial de la salud OMS (2010 WHO HPV LabNet
Proficiency Study of HPV DNA Typing).
GENOTIPO
VPH
6
11
16
18
2
10 copias
100%
100%
100%
50 copias*
100%
100%
10 copias
40%
60%
80%
31
26
31
33
35
39
45
51
52
53
56
58
59
66
68
82
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
80%
80%
80%
100%
100%
60%
80%
80%
80%
100%
100%
80%
100%
80%
100%
N=95 * Datos expresados en equivalents genómicos..
®
Tabla 1. Sensibilidad analítica del kit CLART VPH 2 kit
Dado el significado clínico de los genotipos de VPH 16 y 18, se ha incluido los
datos de sensibilidad para esos tipos obtenidos a partir de la detección de
muestras del programa de evaluación de herramientas de laboratorio para el
tipado del VPH de la organización mundial de la salud OMS. Este programa
compara y evalúa las diferentes metodologías de detección de VPH comerciales
disponibles para una efectiva implementación y monitorización de los programas
de vacunación para VPH. Basado en este programa, se considera una
herramienta como apta para el diagnóstico si detecta al menos 50 unidades
internacionales (equivalentes genómicos o copias) de los tipos de VPH 16 y 18,
hecho demostrado con CLART® VPH 2.
•
Especificidad analítica. La especificidad analítica es de un 100%. Con el
kit CLART Papillomavirus humano 2 no se produce detección
inespecífica de otros virus patógenos habituales de muestras
cervicovaginales, como son los herpesvirus.
2. Parámetros de utilidad diagnóstica.
Para determinar los parámetros de utilidad diagnóstica del nuevo kit CLART®
Papillomavirus humano 2, se han realizado estudios comparativos frente a la
versión antigua del mismo producto.
Dichos estudios se realizaron en colaboración con dos hospitales españoles y
uno portugués.
•
•
•
Servicio de Microbiología del Hospital Universitari Germans Trías i
Pujol de Badalona.
Unidad de Virología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.
Departamento de enfermedades infecciosas. Instituto Nacional de
Salud Ricardo Jorge, I. P. Lisboa (Portugal).
32
Se analizaron 386 muestras de las cuales 9 fueron torundas, 25 tejidos
incluidos en parafina y 352 citologías líquidas.
En la siguiente tabla se ilustran los datos de sensibilidad y especificidad
diagnósticas para los tipos de VPH detectados por el kit CLART®
Papillomavirus humano 2:
Tipo HPV
6
11
16
18
26
31
33
35
39
42
43
44
45
51
52
54
Sensibilidad
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
Especificidad
100,00
100,00
99,70
100,00
100,00
100,00
99,73
99,74
100,00
99,47
99,50
100,00
99,74
100,00
100,00
100,00
Tipo HPV
56
58
59
61
62
66
68
70
71
73
81
82
83
84
85
Sensibilidad
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
94,44
100,00
100,00
100,00
Especificidad
100,00
100,00
99,73
100,00
99,47
100,00
98,35
100,00
100,00
99,74
100,00
99,48
100,00
100,00
100,00
®
Tabla 2. Parámetros diagnósticos de la técnica CLART VPH2.
Los parámetros diagnósticos anteriormente descritos fueron determinados en la
plataforma CLART® Strip-Cs. Para validar los resultados en formato AT (Array
Tube) se ha efectuado una validación comparando los resultados de visualización
de 232 tubos de amplificación CLARTVPH2 en paralelo en las plataformas CS y
AT, con la siguiente distribución respecto a los tipos virales.
Virus
6
11
16
18
26
31
33
35
39
42
43
44
Muestras
Resultado Resultado
analizadas en CS
en AT
8
2
25
7
1
14
12
4
6
9
0
1
8
2
25
7
1
14
11
4
6
9
0
1
8
2
25
7
1
14
12
4
6
9
0
1
33
45
51
52
53
54
56
58
59
61
62
66
68
70
71
72
73
81
82
83
84
85
5
13
14
14
2
6
13
8
8
9
19
5
8
0
1
4
5
1
1
8
1
5
13
14
14
2
6
13
8
8
9
19
5
8
0
1
4
5
1
1
8
1
5
13
14
14
1
6
13
7
8
8
19
5
8
0
1
3
5
1
1
8
1
®
Tabla 3. Análisis comparativo del kit CLART VPH2 para cada tipo viral en las plataformas de
visualización CS/AT.
La concordancia a nivel de resultados de visualización entre las dos plataformas
es de 98.27%, hecho que no modifica los parámetros diagnósticos descritos
anteriormente
12. BIBLIOGRAFÍA
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36
13. TABLAS
TABLA 4. En la siguiente tabla se indica el riesgo oncogénico de los PVH que se detectan
en este kit.
TIPO
RIESGO
TIPO
ONCOGÉNICO *
RIESGO
ONCOGÉNICO *
PVH 6
Bajo Riesgo
PVH 56
Alto Riesgo
PVH 11
Bajo Riesgo
PVH 58
Alto Riesgo
PVH 16
Alto Riesgo
PVH 59
Alto Riesgo
PVH 18
Alto Riesgo
PVH 61
Bajo Riesgo
PVH 26
Alto Riesgo
PVH 62
Bajo Riesgo
PVH 31
Alto Riesgo
PVH 66
Alto Riesgo
PVH 33
Alto Riesgo
PVH 68
Alto Riesgo
PVH 35
Alto Riesgo
PVH 70
Alto Riesgo
PVH 39
Alto Riesgo
PVH 71
Bajo Riesgo
PVH 40
Bajo Riesgo
PVH 72
Bajo Riesgo
PVH 42
Bajo Riesgo
PVH 73
Alto Riesgo
PVH 43
Bajo Riesgo
PVH 81
Bajo Riesgo
PVH 44
Bajo Riesgo
PVH 82
Alto Riesgo
PVH 45
Alto Riesgo
PVH 83
Bajo Riesgo
PVH 51
Alto Riesgo
PVH 84
Bajo Riesgo
PVH 52
Alto Riesgo
PVH 85
Alto Riesgo
PVH 53
Alto Riesgo
PVH 89
Bajo Riesgo
PVH 54
Bajo Riesgo
* Clasificación riesgo oncogénico según Dunne et al. (2007).
37