Susana Córdoba Introducción Hasta hace dos décadas las pruebas

SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO
Susana Córdoba
Introducción
Hasta hace dos décadas las pruebas de sensibilidad para levaduras no eran consideradas
necesarias ya que la mayoría de las levaduras de importancia clínica eran sensibles a la
anfotericina B, el antifúngico de elección para el tratamiento de las micosis invasoras.
El aumento registrado en el número de infecciones fúngicas debido al incremento de la población
infectada por el HIV, el número de pacientes hospitalizados y de otro tipo de pacientes
inmunocomprometidos, generó la necesidad de desarrollar agentes alternativos, más eficaces y
menos tóxicos, motivos éstos, por los que la detección de la resistencia de los hongos a los
antifúngicos, es en la actualidad, un tema prioritario.
Uno de los métodos que permiten diferenciar entre microorganismos sensibles y resistentes, es la
determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) que no es más que aquella
concentración del antifúngico capaz de inhibir el crecimiento del hongo ensayado. Si bien,
existen otros métodos para conocer si un microorganismo es sensible o resistente a un
antimicrobiano, la determinación de la CIM es uno de los más sencillos y factible de realizar en
los laboratorios clínicos.
El objetivo principal de estos métodos es que puedan ser utilizados como una guía en la selección
del tratamiento adecuado. Sin embargo, hay que considerar que la infección clínica es un sistema
complejo y dinámico y que los resultados obtenidos in vitro, en forma relativamente simple, a
veces tienen poca correlación.
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Método de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos.
Documento M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) antes “National
Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)”.
El método que describe este estándar está pensado para evaluar levaduras que causan infecciones
invasoras. Estas levaduras abarcan todas las especies de Candida y Cryptococcus neoformans.
Este método no se aplica para evaluar la fase levaduriforme de los hongos dimórficos como
Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis, Coccidiodes spp., Sporothrix spp. o
Histoplasma capsulatum var. capsulatum.
Las pruebas de susceptibilidad para los hongos miceliales están descriptas en el documento M38A2 del CLSI.
El documento M27-A3 es un “ESTÁNDAR DE REFERENCIA”. Se desarrolló a través de un
proceso de consenso con la intención de facilitar un acuerdo entre laboratorios sobre la forma de
evaluar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos. Un objetivo primordial de un estándar
de referencia es sentar las bases para que se puedan desarrollar otros métodos más accesibles pero
que obtengan resultados similares al estándar.
Las condiciones más adecuadas del estándar quedan resumidas en la Tabla 1.
Tabla 1: Principales condiciones del estándar aprobado por el CLSI
Variable
Medio de Cultivo
pH
Tampón
Tamaño del inóculo
Preparación del inóculo
Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
CIM
Estándar
RPMI 1640
7,0 ±0.1 a 25C
ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS) 0,165 mol/L,
pH 6,9-7,1
0,5-2,5 x 103 cel/mL
0,5 McFarland.
35ºC
24-48 h para la mayoría de las levaduras del Género
Candida.
70-74 h para Cryptococcus neoformans
Anfotericina B: Ausencia de turbidez
Flucitosina/Azoles/Equinocandinas: 50% de inhibición
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Inconvenientes del método de referencia
A pesar de la importancia que significa contar con un método estandarizado todavía hay una serie
de inconvenientes. En primer lugar, la concentración de glucosa en el RPMI 1640 es tan sólo del
0,2%, lo que da lugar a un escaso crecimiento de las levaduras, incluidas las especies menos
exigentes como C. albicans. Este retardo en el crecimiento, hace que no siempre se pueda realizar
la lectura a las 24 h, motivo por el que debe prolongarse la incubación otras 24 h.
Sin embargo, el punto más conflictivo, es tal vez, que la determinación de la CIM queda sujeta a
la subjetividad de la lectura visual.
Para la anfotericina B la elección de la CIM no ofrece ningún problema, ya que al ser un fármaco
fungicida, in vitro produce una inhibición completa del crecimiento. No ocurre lo mismo con los
azoles, las equinocandinas y en ocasiones, tampoco con la flucitosina. Con estos compuestos,
cuya actividad es fungistática, se observa una inhibición parcial del crecimiento y como
consecuencia, la aparición de cierta turbidez en todas las concentraciones del antifúngico. Debido
a este hecho, la elección de la CIM es un ejercicio absolutamente subjetivo y ha sido la causa
principal de la poca reproducibilidad intra e interlaboratorio de estas técnicas. En el caso de
utilizar un macrométodo, el problema se resolvió parcialmente de una forma más objetiva, que
consistió en diluir el tubo control de crecimiento 1:2, lo que equivale al 50% de inhibición. De
esta forma se compara la turbidez resultante de las diluciones con toda la batería de tubos y se
elige visualmente el primer tubo que muestre una turbidez similar o menor a la del tubo diluido.
Sin embargo, en el caso del micrométodo la lectura del 50% de inhibición es totalmente
subjetiva.
Puntos de corte
Este es un aspecto muy controvertido debido a que existen una multitud de factores que influyen
en la evolución clínica del paciente y la CIM no es más que uno de ellos. Sin embargo, es muy
útil disponer de un valor de CIM que identifique aquellos pacientes que tienen pocas
posibilidades de evolucionar adecuadamente si se trata la infección con dicho antimicrobiano y
viceversa. Rex et al, han propuesto puntos de corte tentativos para fluconazol e itraconazol frente
a especies pertenecientes al género Candida. La metodología empleada siguió el documento
M27-A del CLSI.
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En la Tabla 2 se muestran los puntos de corte propuestos por el CLSI para fluconazol, itraconazol
y flucitosina. Se incluyen además, los puntos de corte sugeridos para voriconazol y las
equinocandinas.
Tabla 2: Puntos de corte (mg/L) recomendados por el CLSI. Documento M27-A3
Antifúngico
Sensible
Sensible dependiente de
la dosis
Intermedio
Resistente
Fluconazol
≤8
16-32
-----
≥64
Itraconazol
≤0,125
0,25-0,5
-----
≥1
5-fluorocitosina
≤4
-----
8-16
≥32
Voriconazol
≤1
2
-----
≥4
Equinocandinas
≤2
-----
-----
-----
Intervalo de concentraciones
El intervalo de concentraciones elegidos para cada antimicrobiano debe incluir los puntos
críticos, si estos están definidos, y los resultados esperados para las cepas de Control de Calidad.
Basados en estudios previos, se recomiendan las siguientes concentraciones de antifúngicos que
están recogidas en la Tabla 3.
Tabla 3. Intervalo de concentraciones recomendadas para cada antifúngico
Antifúngico
Intervalo (µg/ml)
Anfotericina B
16-0,0313
5-fluorocitosina
64-0,125
Ketoconazol
16-0,0313
Fluconazol
64-0,125
Itraconazol
16-0,0313
Voriconazol
16-0,0313
Posaconazol
16-0,0313
Ravuconazol
16-0,0313
Anidulafungina
16-0,0313
Caspofungina
16-0,0313
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Documento EDef 7.1 European Committee on Antimicrobial Suceptibility Testing
(EUCAST). Método de microdilución para la determinación de la CIM para levaduras
fermentadoras.
Este método se basa en el documento M27-A del CLSI, sin embargo, fue desarrollado
únicamente para levaduras fermentadoras y además le incorpora algunas modificaciones con la
intención de mejorar la técnica.
Una diferencia importante es que utiliza RPMI más 1.8% de glucosa, de modo de obtener
concentración final del 2%, esta modificación permitiría una mejor determinación de la CIM.
Debido a que las levaduras asimilan la glucosa como fuente de carbono, parece razonable que la
adición de glucosa al medio permita un mejor desarrollo de estos microorganismos. La excepción
a este punto la forman la mayoría de las levaduras no fermentadoras (Cryptococcus neoformans,
Trichosporon spp., Rhodotorula spp. etc.), en las que el agregado de este compuesto no produce
mejoría significativa del crecimiento.
Otra modificación fue el tamaño del inóculo. La elección de un inóculo más elevado (0,5-2,5 x
105 UFC/mL) favorece el desarrollo y permite la lectura a las 24 h.
Por último, se consideró la CIM, para este método, como la inhibición del 50% del crecimiento.
Dicha lectura se realiza en forma automatizada mediante un lector de microplacas, que mide la
turbidez de cada pocillo y permite determinar objetivamente el punto de corte establecido.
En la Tabla 2. se muestran las principales características de los métodos de referencia propuestos
por el CLSI y EUCAST.
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Tabla 2. Principales características de los métodos de referencia (CLSI y EUCAST)
CLSI / M27-A3
Levaduras
Macro y Microdilución
EUCAST / E.Def 7.1
Levaduras
Microdilución
CLSI / M38-A2
Filamentosos
Microdilución
Medio
Pocillo
microplaca
Inóculo /ml
Espectrof.
Incubación
RPMI
Fondo redondo
RPMI + 2% glucosa
Fondo plano
RPMI
Fondo redondo
Formato
0,5 – 2,5 x 103 UFC/ml 0,5 – 2,5 x 105 UFC/ml
0,4 – 5 x 104 UFC/ml
24-48h Candida spp
72h Cryptococcus
24h Candida spp
24h Rhizopus spp.
48h Aspergillus spp y
Fusarium spp.
72h Scedosporium spp
Lectura
Espectrofotométrica
Espectrofotométrica
Visual (0,1,3,4)
CIM /
Inhibición
Azoles, equinocandinas Azoles y 5FC: 50%
y 5FC: 50%
Anfotericina B: 90%
Anfotericina B: 100%
Azoles y 5FC: 50%
Anfotericina B: 100%
En síntesis, tanto el micro o macrométodo de referencia (CLSI o EUCAST) son los
recomendados como métodos estandarizados, aunque todavía existen algunas limitaciones como
son la detección de resistencia a la anfotericina B y para Cryptococcus neoformans.
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TÉCNICAS DE DIFUSIÓN
En las dos últimas décadas, se desarrollaron y realizaron numerosos trabajos con el fin de mejorar
las pruebas de susceptibilidad de los antifúngicos in vitro. En la actualidad existen técnicas de
referencia disponibles para levaduras y hongos filamentosos.
No obstante, distintos grupos de trabajo en todo el mundo comenzaron a desarrollar pruebas de
susceptibilidad en medio sólido, en la intención de obtener técnicas que pudieran llevarse a cabo
en el laboratorio clínico de rutina.
En el 2004 el CLSI publicó su documento M44-A que sienta las bases para realizar las pruebas de
sensibilidad de los antifúngicos en medio sólido con discos de papel.
Además de la difusión en agar con discos de papel, la aparición de las tiras de E-test en el
mercado, constituye una herramienta potencial al momento de realizar pruebas de susceptibilidad
en los laboratorios de rutina, que por otra parte, cuenta con el aval de numerosos trabajos.
Sin embargo, es conveniente recordar que el E-test nunca formará parte de un estándar ya que su
origen es comercial.
Discos de antimicrobianos
Por el momento, el CLSI, en el documento M44 A, estandarizó el método de difusión en agar con
discos para levaduras del Género Candida. En el documento se incluyen los puntos de corte de
fluconazol y voriconazol para el Género Candida, que permiten clasificar a los aislamientos en 3
categorías:
•
Sensible.
•
Sensible dependiente de dosis.
•
Resistentes.
En la Tabla 4. se muestran los puntos de corte del CLSI de los documentos M44-A y M27-A.
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Tabla 4. Diámetro de inhibición de crecimiento y correlación con Concentración Inhibitoria
Mínima para Candida spp.
Antifúngico
Concentración en
el disco
Halo de inhibición
(mm)
R*
S-DD*
S*
CIM (µg/ml)
R*
S-DD*
S*
Fluconazol
25 µg
≤ 14
15-18
≥ 19
≥ 64
16-32
≤8
Voriconazol
1 µg
≤ 13
14-16
≥ 17
≥4
2
≤1
*Susceptible: S *Susceptible-dependiente de dosis: S-DD *Resistente: R
Las pruebas en medio sólido y en especial las de difusión con disco son simples de realizar y los
resultados se obtienen de forma rápida, siendo, en teoría, muy fáciles de interpretar. Sin embargo,
en este punto hay que ser muy estrictos, pues si las técnicas no se realizan siguiendo
rigurosamente las instrucciones sugeridas por los fabricantes, es posible que se obtengan
resultados erróneos.
Otras técnicas de difusión
Existen varias técnicas estandarizadas que se utilizan en otros países. Las diferencias principales
entre las distintas técnicas residen en la elección del medio, concentración del antimicrobiano en
el disco, inóculo y puntos de corte. De todas ellas, las tabletas de antibióticos Neo-Sensitabs TM
Rosco y las tiras de Etest (AB Biodisk) son los más utilizados en los laboratorios de rutina.
Tabletas
El antifúngico, en forma cristalina, se mezcla con una sustancia inerte sin actividad
antimicrobiana que tampoco interfiere con ningún aspecto del
proceso. La principal ventaja de este procedimiento es la
estabilidad de las tabletas ya que duran 4 años a 37ºC. Se
garantiza que la concentración del antimicrobiano en la tableta
es del 90 al 110%. El procedimiento debe seguirse según las
indicaciones del fabricante. Permite la valoración cualitativa de
la sensibilidad a los antifúngicos evaluados.
Candida krusei ATCC 6258. Halo de
inhibición frente a anfotericina B.
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Etest (AB Biodisk)
Es una técnica cuantitativa. Consiste en la
utilización de una tira de plástico que, en una de
sus caras, lleva un gradiente de concentración del
Tras la incubación, la intersección entre el
crecimiento del microorganismo y la zona de
Antifúngico
antimicrobiano.
inhibición en forma de elipse indican la CIM.
Candida tropicalis. Halo de inhibición (CIM) frente a
fluconazol y anfotericina B.
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Referencias:
ƒ
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Reference method for broth
dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard Third Edition. CLSI
document M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania
19087-1898 USA, 2008.
ƒ
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2008). Reference method for broth
dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved standard Second
Edition. CLSI document M38-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898 USA, 2008.
ƒ
EUCAST Definitive Document EDef 7.1: method for the determination of broth dilution
MICs of antifungal agents for fermentative yeasts. Subcommittee on Antifungal
Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial
Susceptibility Testing (EUCAST) Clin Microbiol Infect 2008; 14: 398–405.
ƒ
National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2004). Method Antifungal Disk
Diffusion Suceptibility Testing of yeast. Approved standard M44-A. National Committe
for Clinical Laboratory Standards,Villanova, Pennsylvania.
ƒ
User’s Guide NEO-SENSITABS
TM
Suceptibility testing, 18th Ed. 2005/2006. Rosco
Diagnostica A/S.
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