Estudio de la duración del efecto inhibitorio de la administración de

UNIVERSIDAD DE CHILE
Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos
Efecto del Consumo de Prebióticos sobre
la Biodisponibilidad de Hierro
Valerie Weinborn Astudillo
Tesista
Fernando Pizarro Aguirre
Director de Tesis
Tesis para optar al grado de Magíster en Nutrición y Alimentos Mención
Alimentos Saludables
1
Comisión de Tesis
Sr. Fernando Pizarro – Tutor
Sra. Eva Hertrampf – Profesora INTA
Sr. Martín Gotteland – Profesor INTA
Sr. Tulio Nuñez – Profesor Facultad de Ciencias
Fecha de Examen de Grado: ______________
Calificación Final: ________________
2
Dedicatoria
A mis padres…
3
Agradecimientos
A todos quienes facilitaron este proceso, en especial a mi profesor guía Fernando Pizarro y
al Sr. Ricardo Weill, quien fue el responsable del financiamiento de este proyecto. Además
a Angélica Letelier, a Sebastián Flores, a Daniel López de Romaña, a Carolina Valenzuela y
a Constanza Miranda.
4
Financiamiento
Este proyecto fue financiado por el Instituto Danone del Conosur y su investigador
responsable es el profesor Fernando Pizarro Aguirre.
5
Índice
Resumen
1
Summary
2
Introducción
3
Revisión Bibliográfica
4
Hipótesis
14
Objetivo General
14
Objetivos Específicos
14
Materiales y Métodos
15
Resultados
24
Discusión
30
Conclusión
35
Bibliografía
36
Anexo 1: Consentimiento de participación en el Proyecto “ Efecto de los prebióticos
sobre la biodisponibilidad de hierro hem y no hem en humanos”
44
Anexo 2: Técnica de doble marcaje isotópico de Eakins y Brown
48
6
Resumen
Antecedentes: El hierro (Fe) es un elemento esencial para el ser humano, pero en exceso
puede ser tóxico. La homeostasis de Fe es regulada por su absorción a través del
enterocito. En la dieta el hierro se encuentra de dos formas: el hierro no hemínico (Fe-no
hem) y el hierro hemínico (Fe-hem). La forma en que se encuentra el hierro en la dieta
determina de cómo será absorbido. La absorción de Fe-no hem es influenciada por
componentes intraluminales y dietarios: los taninos, fitatos y calcio disminuyen la
absorción de hierro y la carne y el ácido ascórbico la favorecen. En cambio la absorción
del Fe-hem sólo es inhibida por calcio y favorecida por la carne de vacuno. Por otro lado,
existe evidencia que los prebióticos presentan múltiples y variados beneficios por su
consumo en el humano. Estudios previos in vitro y en animales han demostrado tener
efectos positivos sobre la absorción de hierro, pero éstos no han concordado con los
pocos estudios que se han realizado en humanos.
Objetivo: Establecer el efecto del consumo de prebióticos sobre la biodisponibilidad de Fe.
Sujetos y Métodos: Participaron 24 mujeres (35 a 45 años) sanas. Los sujetos fueron
aleatorizados en dos grupos. Un grupo consumió un yogurt diario por 12 días con una
mezcla de prebióticos y el otro grupo recibió el mismo yogurt pero sin prebióticos. Previo
y posterior a la ingesta los sujetos participaron en estudios de absorción de hierro. En los
estudios de absorción se utilizaron isótopos radiactivos de hierro (55Fe y
59
Fe). Se aplicó
ANOVA de dos vías como prueba de comparación.
Resultados: La biodisponibilidad de Fe-hem y Fe-no hem del grupo control no mostraron
diferencias significativas (16.5/17.3% pre/post Fe-hem y 29.6/29.8% pre/post Fe-no hem).
La biodisponibilidad del grupo que consumió prebiótico mostro un incremento
significativo en Fe-hem (11.7/18.2% pre/post, p=0.007). Sin embargo, para Fe-no hem no
hubo diferencias (20.7/19.8% pre/post).
Conclusiones: El consumo crónico de yogurt con agregado de prebióticos aumenta la
biodisponibilidad de Fe-hem, y no produce cambios en la absorción del Fe-no hem.
1
Summary
Background: Iron (Fe) is an essential element for humans; however in excess it could be
toxic. The Fe homeostasis is regulated by its absorption through the enterocyte. In the
diet, Fe comes into of two forms: non heme Fe and heme Fe. The way that iron comes in
the diet can determine how it will be absorbed. The non heme Fe absorption is influenced
by intraluminal and dietary components. While tannins, phytate, and calcium decrease the
iron absorption, ascorbic acid and meat enhance it. In contrast, heme Fe absorption is
inhibited only by calcium and enhanced by meat. On the other hand, there is evidence
that prebiotics have multiples and varied benefits to the humans beings by its
consumption. Studies performed in vitro and in animals have demonstrated positive
effects on iron absorption. However there is no consensus about the results shown by
studies done in humans.
Objective: To establish the effect of consumption of prebiotics on iron bioavailability.
Subjects and Methods: 24 healthy women (35-45 years old). Subjects were randomized
into of two groups. One group ate one yogurt per day for 12 days with a prebiotic mix and
the other group received the same yogurt but without prebiotics. Before and after the
intake period, subjects participated in iron absorption studies. These studies used iron
radioactive isotopes (55Fe and 59Fe). Two-way ANOVA was applied as comparison test.
Results: There were no significant differences in heme and non heme Fe bioavailability in
the control group (16.5/17.3% pre/post heme Fe and 29.6/29.8% pre/post non hem Fe).
Fe bioavailability of the group who consumed prebiotics increased significantly
(11.7/18.2% pre/post, p=0.007).However, there were no significant differences in non
heme Fe bioavailability in the same group (20.7/19.8% pre/post).
Conclusions: Chronic consumption of yogurt with added prebiotics increases heme Fe
bioavailability and does not change non heme Fe absorption.
2
Introducción
Uno de los grandes problemas a nivel nutricional en humanos es la deficiencia de
microminerales, y dentro de éstos el hierro es el más importante. La principal
manifestación de la deficiencia de hierro es la anemia.
El hierro es un mineral esencial para la vida y participa en diversos procesos biológicos
indispensables. Existen dos tipos de hierro, el hemínico (Fe-hem) y el no hemínico (Fe-no
hem), que se diferencian, además de su forma química, en el proceso de absorción. Se
describe una mayor estabilidad y biodisponibilidad del hierro hem, ya que su absorción es
poco afectada por factores de la dieta e intraluminales, por lo tanto, podría llegar a ser
una mejor fuente de para la suplementación con hierro.
En términos generales, el hierro se absorbe principalmente en duodeno, es transportado a
través del torrente sanguíneo y líquido extracelular unido a la transferrina y se almacena
predominantemente dentro de la célula en forma de ferritina. Los mecanismos de
absorción y factores que la afectan dependen del tipo de hierro ingerido. Uno de los
factores en que no se ha podido llegar a un consenso de cómo afecta dicha absorción son
los prebióticos; moléculas fermentables añadidas a distintos alimentos que producen un
efecto favorable sobre la flora intestinal del huésped.
Basados en estudios previos in vitro e in vivo, donde no se observan resultados decidores
respecto a la absorción de hierro y su interacción con prebióticos, hemos decidido realizar
la siguiente tesis que tiene como propósito aclarar la interacción que se genera entre
hierro y prebióticos a nivel de tubo digestivo. Hipotetizamos que la biodisponibilidad de
hierro es amplificada por la acción de prebióticos. Como metodología, se planificaron
protocolos de absorción en humanos que incluyen la marcación intrínseca de hierro
hemínico con 55Fe y 59Fe.
3
Revisión Bibliográfica
La anemia y el hierro
La malnutrición continúa siendo hasta el día de hoy un importante problema de salud
pública a nivel mundial (Schofield y Ashworth, 1996). Es así, como las dietas en las
poblaciones humanas son frecuentemente deficientes en macronutrientes (proteínas,
carbohidratos y grasas), llevándonos a una malnutrición proteico-energética, y también en
micronutrientes (electrolitos, vitaminas y minerales) (Millward y Jackson, 2004). Dentro
del concepto de malnutrición, se encuentran las deficiencias de micronutrientes. Estas
deficiencias se han convertido durante los últimos años, en un importante problema de
salud pública, comparativamente con la deficiencia de macronutrientes (Ferraz et al.,
2005; Darnton-Hill et al., 2005). Dentro de ellas, destacan la deficiencia de hierro, yodo,
vitamina A y zinc (Díaz et al., 2003).
El hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre (de Duve, 1990).
Puede existir en estados de oxidación cuyo rango va de -2 a +6. En sistemas biológicos,
estos estados de oxidación están principalmente limitados a los estados ferroso (+2) y
férrico (+3) (Beard y Piñero, 1997). Este mineral es indispensable para la vida; actúa como
cofactor de muchas enzimas, hemoproteínas y proteínas no hem que cumplen funciones
biológicas cruciales como síntesis de ADN, síntesis de ARN, transporte de oxígeno
(hemoglobina y mioglobina), metabolismo del oxígeno (oxidasas, peroxidasas, catalasas e
hidroxilasas) y transporte de electrones (citocromos) (Palomo et al., 2005).
En el humano, cerca del 70% del contenido total de hierro se encuentra como
hemoglobina, proteína que transporta oxígeno. Otro 25% de encuentra como reserva
(ferritina y hemosiderina), un 4% como mioglobina y un 1% unido a la transferrina y como
componentes de diferentes enzimas (Bothwell et al., 1979).
4
Diariamente, un adulto sano pierde alrededor del 0,025% de su hierro total (equivalente a
1 mg), el cual debe ser reemplazado desde la dieta. Estas pérdidas son producidas
principalmente por la descamación de las células epiteliales del tracto gastrointestinal y
por el micro sangrado fisiológico intestinal; en el caso de las mujeres las pérdidas
aumentan debido al sangrado menstrual. Los requerimientos en el ser humano son muy
bajos, diariamente se requieren absorber 1-2 mg desde la dieta (Conrad y Umbreit, 2002).
La deficiencia de hierro es uno de los principales problemas de salud pública, aún en los
países desarrollados. Durante los primeros años de vida, esta deficiencia nutricional afecta
el desarrollo cognitivo de los individuos y en la edad adulta disminuye la capacidad
productiva (Darnton-Hill et al., 2005). En las mujeres embarazadas se ha asociado la
deficiencia de este mineral con el aumento en los riesgos de muerte materna durante el
parto y el puerperio, además, los hijos de madres deficientes en hierro tienen mayor
riesgo de bajo peso al nacer, lo cual condiciona el desarrollo de enfermedades crónicas
asociadas a la nutrición (Singh et al., 2004).
La manifestación más común de la deficiencia de hierro es la anemia, y ésta ocurre cuando
los niveles del micronutriente son tan bajos que la concentración de hemoglobina cae por
debajo de los valores de corte específicos para la edad y sexo (Dallman et al., 1980; Cook
et al., 1994). Alrededor de 2 mil millones de personas y más del 30% de la población
mundial, son anémicos y la mayoría de ellos es debido a la deficiencia de hierro (WHO,
2007). Cerca del 46% de los niños entre 5 y 14 años padecen anemia y la mayoría de ellos
viven en países en vías de desarrollo. En Estados Unidos, el 3% de los preescolares y el 2 a
5% de las adolescentes, presentan anemia por deficiencia de hierro. A nivel mundial, el
48% de las embarazadas están afectadas, y esta cifra aumenta si nos enfocamos al Tercer
Mundo, con un 56% de mujeres gestantes que padecen esta enfermedad (Muñoz y
Molina, 2005).
5
La deficiencia de hierro se puede prevenir mediante modificaciones de la dieta,
fortificación de los alimentos y suplementación con hierro medicinal. Ninguna de estas
estrategias es excluyente. La forma ideal de prevenir la carencia de hierro es mediante
una dieta adecuada, lo que no siempre es posible de lograr por limitaciones económicas o
hábitos muy arraigados. Las modificaciones de la dieta incluyen aumentar el consumo de
alimentos ricos en sustancias que favorecen la absorción del hierro no hemínico (ácido
ascórbico, carne), disminuir el consumo de inhibidores de la absorción y aumentar el
consumo de hierro hemínico (Olivares y Walter, 2003). La fortificación de los alimentos
con hierro es la forma más práctica de prevenir la carencia de hierro (INACG, 1977). Su
principal ventaja es que el consumo de estos productos no requiere de una conducta
activa del sujeto (Olivares y Walter, 2003). Cuando no se está consumiendo alimentos
fortificados con hierro o se requiere proveer una gran cantidad de hierro en un período
corto, se recomienda la suplementación con hierro medicinal (Hurrell, 2002).
En los alimentos el hierro se encuentra, principalmente, como Fe-no hem y Fe-hem o
asociado a hemoproteínas. El Fe-no hem está representado por fracciones de Fe+2 o Fe+3.
Esta forma de hierro se encuentra en cantidades apreciables en los alimentos de origen
vegetal y en los derivados lácteos (Yip, 2003). El Fe-hem se encuentra en todo tipo de
carnes, vísceras y en la sangre de animales, aunque también existe un contenido muy bajo
de Fe-hem en las semillas de las plantas, asociado a los anillos tetrapirrólicos de la
clorofila (Santana et al., 1998).
El metabolismo del hierro está regulado principalmente a través de su absorción. Ésta se
lleva a cabo en el duodeno proximal. El enterocito regula la absorción de hierro según las
necesidades del organismo: altos niveles corporales de hierro bloquean su absorción y
bajos niveles la incrementan (Flanagan, 1989). Además de esto, la absorción de hierro es
controlada por factores intraluminales, de la mucosa intestinal y sistémicos. Los factores
intraluminales reguladores más importantes son la forma química del hierro y la presencia
6
de factores favorecedores o inhibidores. Los factores que intervienen en la absorción de
hierro a nivel de la mucosa intestinal son la extensión de la superficie y motilidad
intestinal, y entre los factores sistémicos se incluyen el estado de los depósitos de hierro,
la velocidad de la eritropoyesis y la hipoxia (Cook, 1990). A pesar del alto contenido de Feno hem de los alimentos, su biodisponibilidad varía desde menos del 1% hasta el 20%,
esto se debe a que otros nutrientes de la dieta pueden aumentar o disminuir su tasa de
absorción (Hallberg, 1981; Lynch, 1997; Miret et al., 2003; Sandstrom, 2001), tales como
ácido ascórbico, ácidos orgánicos y tejidos animales, que la facilitan; y fitatos, polifenoles,
productos de digestión proteica, calcio, fibra y hierro hemínico, que la inhiben (Beard y
Piñero, 1997). En cambio, la biodisponibilidad del Fe-hem, varía desde un 10% hasta un
30%, y al parecer sólo es afectada por las proteínas animales, como potenciador; y por el
calcio como inhibidor (Hallberg et al., 1991; Hallberg y Sölvell, 1967; Layrisse y MartinezTorres, 1972).
Se describe que el enterocito diferencia químicamente a los dos tipos de hierro para su
absorción (Pizarro et al., 2005). El Fe-no hem es reducido desde el estado férrico (Fe+3) al
ferroso (Fe+2) (Miret et al., 2003). La reducción ocurre en el borde en cepillo del enterocito
por acción de la reductasa férrica duodenal (Dcytb) (Fleming y Bacon, 2005). Luego, el Fe+2
es transportado a través de la membrana plasmática del enterocito por un transportador
de metales divalentes (DMT1) al interior de la célula (Beard y Piñero, 1997). El hierro
absorbido puede pasar a ser parte de la reserva intracelular como ferritina o enviado a
circulación (Fleming y Bacon, 2005). El transporte del Fe+2 desde el citosol hacia la
circulación es realizado por una ferroportina IREG1 e inmediatamente es oxidado a su
estado férrico por la hefestina, ferroxidasa que permite la unión del hierro a la
transferrina, proteína transportadora de hierro (Muñoz y Molina, 2005).
Se describe que el Fe-hem es solubilizado en la cámara gástrica y, sin ser modificado, se
transporta en compañía del anillo de protoporfirina hacia el duodeno donde es absorbido
7
(Beard y Piñero, 1997), para lo que se requiere que previamente el anillo porfirínico sea
separado de la globina en el lumen intestinal (Miret et al., 2003). Recientemente se ha
descrito una proteína transportadora intestinal para el Fe-hem, la HCP-1 (Hem Carrier
Protein) (Shayeghi et al., 2005) que internaliza al hierro hemínico hacia el enterocito por
un mecanismo de endocitosis (Arredondo et al., 2008). Luego de que el Fe-hem ingresa al
citoplasma del enterocito, la enzima hemoxigenasa libera los iones del metal,
separándolos de la bilirrubina (Raffin et al., 1974) y los hace indistinguibles del Fe-no hem
(Pizarro et al., 2005). Además se conoce que la absorción del Fe-hem es saturable (Pizarro
et al., 2003).
Figura 1: Esquema de la absorción intestinal de los distintos tipos de hierro.
En los últimos años, se estableció una nueva vía de absorción de hierro, a través de la
ferritina, que es una proteína de gran tamaño (12 nm de diámetro y 480.000 Da),
constituida por 24 subunidades que forman una cubierta esférica, alrededor de un
conglomerado de hasta 4500 átomos de hierro. Su función es almacenar grandes
cantidades de hierro en su interior, en una forma biodisponible. (Theil, 2004). La ferritina
es medianamente estable a la proteólisis (Crichton, 1971) y su absorción se realiza a través
8
de endocitosis mediante un receptor de alta afinidad, el cual aún no ha sido identificado
(Theil, 2011). Una vez dentro del enterocito, el complejo proteico es degradado y los
átomos de hierro pasan a ser parte del pool común de la célula (San Martín et al., 2008).
Recientemente se comprobó que no existe competencia ni con la absorción de Fe-hem ni
con la de Fe-no hem, lo que refuerza la teoría de una vía de absorción independiente
(Theil et al., enviado a publicar a JNutr).
La mayor parte del hierro administrado vía oral se absorbe durante las primeras dos horas
(Fawwaz et al., 1966; Wheby y Crosby, 1963). Esto ha sido denominado como la fase
rápida de la absorción intestinal de hierro y se correlaciona con el paso del bolo de hierro
a través del lumen del duodeno y el yeyuno (Fawwaz et al., 1966). Durante las siguientes
24-48 horas, una cantidad adicional de hierro es absorbida. A esto se ha denominado
como la fase lenta de la absorción intestinal de hierro y se correlaciona con la presencia
de hierro en el lumen del intestino delgado distal y colon. Por otra parte, se ha sugerido
que el hierro absorbido en la fase lenta se debe a hierro retenido en la parte proximal del
intestino delgado (Wheby y Crosby, 1963).Además, en ratas ha sido demostrada la
expresión de transportadores de hierro no hemínico a nivel colónico y que esta expresión
aumenta en situaciones de deficiencia de hierro (Johnston et al., 2006; Takeuchi et al.,
2005).En 1963, Ohkawara et al., logró demostrar que el intestino grueso humano era
capaz de absorber pequeñas cantidades de hierro no hemínico.
Los prebióticos
Los prebióticos se definen como ingredientes, principalmente carbohidratos no
digestibles,
que afectan beneficiosamente al organismo mediante la estimulación
selectiva del crecimiento y actividad de una o varias poblaciones bacterianas de la flora
normal del colon. Para que un ingrediente alimentario sea clasificado como prebiótico se
debe cumplir que no sea hidrolizado ni absorbido en la parte superior del tracto
9
gastrointestinal, ser un sustrato selectivo para una o un número limitado de bacterias
comensales beneficiosas del colon y, por consiguiente, ser capaz de alterar la flora
colónica en favor de una composición más saludable, y así, inducir los efectos sistémicos
que son beneficiosos para la salud del huésped. Comparados con probióticos, que
introducen bacterias exógenas hacia el lumen, los prebióticos estimulan el crecimiento
preferencial de un número limitado de bacterias, especialmente, aunque no
exclusivamente, Lactobacillus y Bifidobacterium (Van Loo, 2004).
El consumo de productos lácteos fermentados (fuente de probióticos) se ha asociado
históricamente con beneficios para la salud, como por ejemplo efectos contra
enfermedades causadas por el desbalance de la flora intestinal (Sanders, 1994). Además
se sabe de sus efectos positivos en múltiples trastornos del sistema digestivo
(constipación, diarrea, deficiencia de microflora, indigestión, acidez, ente otras) y de otros
sistemas o multisistémicos (diabetes, hipercolesterolemia, obesidad, osteoporosis,
desordenes de hígado y riñón, entre otras) (Hitchins y Mcdonough, 1989).
Entre los ingredientes alimentarios candidatos a prebióticos se encuentran, hidratos de
carbono no digestibles (oligo y polisacáridos), algunos péptidos y proteínas, y ciertos
lípidos (Gibson y Roberfroid, 1995). Se encuentran comúnmente en trigo, vegetales como
cebolla, achicoria, ajo, puerros y alcachofas y frutas como el plátano (Quera et al., 2005)
Al llegar al colon, los prebióticos son fermentados por bacterias endógenas lo que da lugar
a la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) como el butírico, el acético, el
láctico y el propiónico (Macfarlane et al., 2007; Nicholson et al., 2005). También se
producen H 2 , CO 2 y una disminución del pH intestinal a <5.0. Esto último, previene el
crecimiento de patógenos y promueve la proliferación de Lactobacillus y Bifidobacterium,
bacterias pertenecientes a la flora benéfica (Forchielli y Walker, 2005). Los AGCC se
absorben en el intestino, contribuyendo a la homeostasis del NaCl y del agua en el colon.
10
Posteriormente pasan a la vena porta para ser metabolizados en el hígado (Macfarlane et
al., 2007).
Ha sido sugerido que los prebióticos podrían aumentar la biodisponibilidad del hierro
dietario. A pesar de que los mecanismos involucrados no han sido completamente
dilucidados, la fermentación mibrobiana de estos compuestos en el intestino grueso
podría jugar un rol fundamental (Yeung et al., 2005). Respecto a prebióticos y el efecto
que producen en la absorción de hierro existen muy pocos estudios, no concordantes
entre sí y casi no existen en humanos.
Estudios in vitro
En estudios in vitro con células Caco-2 se estimó la biodisponibilidad de Fe como
producción de ferritina. La inulina en cantidades de 40 g por kilo de porotos no aumentó
significativamente la disponibilidad de hierro de los porotos (Laparra et al., 2009). Otro
estudio evaluó el efecto de la inulina sobre la captación de hierro por parte de células
Caco-2 desde soluciones de sulfato ferroso (FeSO 4 ) y FeEDTA. Los autores concluyeron
que la inulina aumentaba la absorción de hierro desde la solución de FeEDTA, pero no
desde FeSO 4 . Los autores atribuyeron esta diferencia a que la inulina, probablemente,
formó complejos inulina-Fe, disminuyendo la difusión del hierro por la membrana apical
de los enterocitos (Laparra et al., 2008). En ambos estudios, el efecto de la inulina no se
midió en presencia de bacterias que pudieran fermentarla, por lo tanto no se está
evaluando el efecto prebiótico, sino que solamente el efecto de la inulina sobre el hierro.
Estudios en modelos animales
En ratas, se logró establecer que la adición de prebióticos galactooligosacáridos (GOS) y
simbióticos (mezcla de prebióticos y probióticos) a una fórmula infantil, ingeridos por 30
11
días, aumentaba la absorción de hierro cuando éstos se encontraban en una
concentración del 10%. En este estudio se determinó, además, que la principal porción del
intestino involucrada en la estimulación de la absorción de hierro era el colon. La cantidad
de hierro absorbido se determinó por la diferencia entre el hierro ofrecido a ratas en las
dietas y la cantidad de hierro en las heces medido por espectrometría de absorción
atómica (Pérez-Conesa et al., 2007). Validando la tesis de que los prebióticos mejoran la
absorción de hierro se encuentra el trabajo de Sakai et al., el cual probó en ratas al efecto
de fructooligosacáridos (FOS) de cadena corta en ratas anémicas. Sakai pudo demostrar
que la adición de estos FOS a la dieta prevenía la caída del hematocrito y hemoglobina
producida en ratas gastroectomizadas (Sakai et al., 2000). Sin embargo, no se ha podido
encontrar un incremento en el hierro sérico y capacidad de unión a hierro (Ohtaet al.,
1998). En cerdos deficientes en hierro, se determinó que la suplementación con inulina no
promovía la absorción colónica de este micromineral (Patterson et al., 2009).
Estudios en humanos
Existen en la literatura sólo dos estudios en humanos. Uno, mediante el método de
balance mineral con recolección de heces y orina, mostró el no efecto de la inulinasobre la
absorción de hierro en adultos sanos (Coudray et al., 1997). Un segundo estudio,
mediante la técnica doble isotópica con isótopos estables, investigó el efecto de
prebióticos como inulina, oligofructosa y GOS. Ninguno de los compuestos testeados
mostró efectos sobre la absorción de hierro (Van Den Heuvel et al., 1998).
Respecto al hierro hemínico no existen estudios que hayan evaluado el posible efecto que
tendrían los prebióticos sobre su absorción.
Existen algunos estudios que determinaron que los prebióticos aumentaban la absorción
de otros minerales como el calcio y magnesio (Coudray et al., 2003; Scholz-Ahrens et al.,
12
2007; Scholz-Ahrens y Schrezenmeir, 2007; Wang et al., 2010). La principal explicación
que se propone en estos estudios es que las fibras utilizadas contrarrestan el efecto de los
fitatos, potente inhibidor de la absorción de estos minerales, ya que se podrían unir a ellos
(Wang et al., 2010). Los fitatos también afectan en forma negativa la absorción de hierro
(Beard y Piñero, 1997), por lo que este mismo mecanismo de acción podría estar
involucrado. Otros mecanismos propuestos son el aumento de solubilidad de los
minerales, aumento de la superficie de absorción promoviendo la proliferación de
enterocitos mediada por los productos de fermentación bacteriana, aumento de la
expresión de proteínas involucradas en la absorción del calcio y degradación del complejo
mineral-ácido fítico (Scholz et al., 2007).
Problema de investigación: ¿Cuál es el efecto de los prebióticos sobre la biodisponibilidad
de hierro hem y no hem?
13
Hipótesis
Hipótesis: El consumo de prebióticos aumenta la biodisponibilidad de hierro en el
humano.
Hipótesis Nula: El consumo de prebióticos no promueve la absorción de hierro.
Objetivo general
Determinar el efecto del consumo de prebióticos sobre la biodisponibilidad de hierro.
Objetivos específicos
1.
Determinar el efecto del consumo de un yogurt más mix de prebióticos sobre la
biodisponibilidad de Fe-no hem.
2.
Determinar el efecto del consumo de un yogurt más mix de prebióticos sobre la
biodisponibilidad de Fe-hem.
Para alcanzar estos objetivos se realizó un protocolo de absorción de hierro en humanos.
En este protocolo se determinó el efecto del yogurt + mix de prebióticos sobre los dos
tipos de hierro (objetivos 1 y 2). También se estudió un grupo control para comparación.
Los porcentajes de biodisponibilidad de Fe fueron sometidos a análisis de varianzas de dos
vías para muestras repetidas.
14
Materiales y Métodos
El estudio fue realizado en el Laboratorio de Micronutrientes del Instituto de Nutrición y
Tecnología de los Alimentos (INTA), de la Universidad de Chile.
Métodos
Como trazadores de la absorción de hierro se utilizaron isótopos de hierro
55
Fe y
59
Fe
(NEN, Life Science Products, Inc., Boston, MA). Las dosis de isótopos administradas fueron
autorizadas por la Comisión Chilena de Energía Nuclear. Las ingestas se realizaron los días
1, 2, 15 y 16; y los días 15 y 29 se extrajeron 30 y 20 ml de sangre respectivamente. Con 10
ml de sangre del día 15 se determinó el estado de nutrición de hierro de los voluntarios:
hemoglobina y VCM (Contador electrónico de células CELL-DYN 1700, ABBOTT
Diagnostics, Abbott Park, IL), Fe sérico, TIBC y % de saturación de la transferrina (Fischer y
Price, 1964), protoporfirina libre eritrocitaria (Hematofluorímetro ZP-M206D, AVIV
Biomedical Inc., Lakewood, NJ), ferritina sérica por ELISA (INACG, 1985) y receptor de
transferrina por ELISA (Human sTrF, BioVendor, Laboratorní Medicína AS, Modrice,
República Checa). Con 20 ml de sangre de los día 15 y 29 se medió la radiactividad
circulante (cpm/ml) según técnica doble isotópica de Eakins y Brown (Eakins y Brown,
1966). Para el cálculo de la radiactividad ingerida se contaron cuadruplicados de los
compuestos marcados con
55
Fe o
59
Fe. La biodisponibilidad del Fe se calculó a partir de
duplicados de sangre de los voluntarios, asumiendo que el 80% del hierro absorbido es
destinado a la síntesis de hemoglobina de los eritrocitos circulantes y este 80% se alcanza
a los 14 días post ingesta(Bothwell et al., 1979). La volemia se estimó desde las tablas de
Tulane (Nadler et al., 1962). Las muestras fueron contadas el tiempo necesario hasta
obtener un error menor al 3% en un contador de centelleo líquido (Packard 1600TR TriCarb Scintillation Counter System, Meriden CT). La muestra de sangre y las ingestas de los
compuestos se efectuaron luego de ayuno nocturno. Sólo después de 3 horas de
15
administrada los compuestos estuvo permitida la ingesta de alimentos. Desde el día 3 al
14, los sujetos consumieron diariamente un yogurt, con o sin agregado de prebióticos,
según correspondiera. Este yogurt era entregado diariamente en el domicilio de los
sujetos y era consumido en presencia de los trabajadores de terreno.
Prebióticos
Los prebióticos fueron entregados a través de un yogurt líquido sabor frutilla en botellitas
de 200 ml elaborado por Danone Argentina. Se utilizó polidextrosa, inulina, goma arábiga
y goma guar como fuente de prebióticos en una cantidad de 2 gramos en total.
Marcación isotópica del hierro hemínico
Para obtener hierro hemínico marcado intrínsecamente y no marcado se utilizaron
terneros Holstein-Fresian de tres meses de edad y corderos adultos Hampshire Down.
Hem marcado con
55
Fe: En un trabajo previo se obtuvo hem marcado intrínsecamente
con 55Fe desde sangre de los terneros (Valenzuela, 2007).
Hem no marcado (hem frío): Tres corderos fueron exsanguinados para obtener sangre sin
marca isotópica, la cual fue utilizada para completar las dosis de hierro isotópico.
Este protocolo se encuentra aprobado por el Comité de Bioética para la experimentación
en Animales del INTA. Todas las intervenciones fueron realizadas por un Médico
Veterinario. Las dosis de radioisótopos indicadas no provocaron ninguna sintomatología a
los animales y al momento de su exsanguinación fueron previamente tranquilizados con
anestésicos inyectables. La muerte se produjo por anemia aguda y sin dolor para el
animal. Los cuerpos de los corderos y los restos del ternero fueron cubiertos con cal y
16
guardados en el depósito de desechos radiactivos, que dispone el INTA de acuerdo a las
normas relativas al manejo de material radiactivo, para su posterior eliminación por la
Comisión Chilena de Energía Nuclear.
Extracción de hem
De sangre de vacuno y ovino se extrajo el hem mediante la técnica de Labbé y Nishida
(Labbé y Nishida, 1957). La sangre fue recibida en recipientes con anticoagulante. La
hemina, marcada y no marcada, fue separada de la hemoglobina mezclando la sangre con
acetona y cloruro de estroncio al 2% en ácido acético glacial y llevada a punto de
ebullición, con el fin de solubilizar la hemina y precipitar proteínas; las que fueron
filtradas. Una vez hecha la filtración, la muestra se calentó a 100°C para evaporar la
acetona y el agua; y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Luego se centrifugó por 10
minutos a 2500 RPM, en tubos de 100ml. Se eliminó el sobrenadante y finalmente los
tubos se llevaron a secado en estufa con lo que se obtuvo hemina en forma de polvo. En
todos los procedimientos se utilizaron reactivos de alta pureza (Merck).
Estudios de Biodisponibilidad en Humanos
Análisis estadístico
Muestra: las causas de las variabilidades fisiológicas y variación día a día que presenta la
absorción de hierro, en un mismo individuo (intra sujeto), no han sido plenamente
identificadas, pero presumiblemente se asocian con cambios en la motilidad
gastrointestinal y las secreciones gástrica, pancreática o biliar (Layrisse y Martínez-Torres,
1972); sin embargo, es adecuado realizar protocolos de absorción de hierro, incluyendo
grupos de entre 12 y 13 sujetos con un mínimo de 8 por protocolo de absorción (Cook y
17
Lipschild, 1977), por otra parte, en un modelo de ANOVA, 9 sujetos son suficientes para
determinar diferencias de ±1 desviación estándar (DS) de la misma variable (absorción de
hierro), con un error α = 0,05 y un poder = 80%. Basado en lo anterior, se decidió trabajar
con 12 sujetos teniendo en cuenta las posibles pérdidas durante el protocolo
experimental, ya sea por rechazo a la ingesta o efectos laterales no deseados después de
la ingesta.
Análisis: Se realizó estadística descriptiva a cada una de las variables y se describieron
como promedio y desviación estándar (DS). Dado que los valores de absorción y
biodisponibilidad de hierro presentan una distribución asimétrica en la población normal,
éstas fueron transformadas a sus logaritmos naturales (ln) antes de realizar las
comparaciones para demostrar la hipótesis y posteriormente se retransformaron estos
resultados mediante el uso del antilogaritmo, con el fin de reportarlos como promedios
geométricos y rangos de ±1 DS en las unidades originales. Para medir el efecto de los
prebióticos, los lnde las variables de absorción de Fe se sometieron a la prueba ANOVA de
dos vías para muestras repetidas. Las variables hematológicas y bioquímicas que miden
estado de nutrición de hierro fueron comparadas con la prueba t de Student.
Sujetos experimentales
Se seleccionaron 12 mujeres en edad fértil (entre 35 a 45 años) para cada protocolo de
absorción (tratamiento y control), las cuales estaban aparentemente sanas, no
presentaron patologías del tracto gastrointestinal y no consumieron fármacos ni
suplementos de minerales o multivitamínicos durante los 6 meses anteriores ni durante el
estudio. Dado que se utilizaron isótopos radioactivos, sólo se permitió la participación a
mujeres que usaban un método anticonceptivo (dispositivo intrauterino, anticonceptivos
orales, ligadura de trompas) y previo a los protocolos de biodisponibilidad de hierro se les
realizó una prueba de embarazo (hCG Combo Cassetteforurine, serum and plasma,
18
inmunoensayocromatográfico, sensibilidad del test: 25 mIUhCG/mL orina), en donde la
muestra correspondió a tres gotas de orina de primera micción. Todas las participantes
asistieron a una reunión informativa en la cual se les explicó, en lenguaje simple y en
detalle, exactamente en qué consistía el estudio al cual se iban a someter y las
precauciones que debían tomar para obtener un resultado satisfactorio. Luego de
aclaradas sus dudas, procedieron a firmar un consentimiento aprobado por el Comité de
Ética del INTA (Anexo 1). Al momento de empezar el estudio todas cumplieron con los
requisitos de ingreso.
Protocolo experimental
Las mujeres seleccionadas asistieron al Laboratorio de Micronutrientes del INTA los días 1,
2, 15, 16 y 29 del protocolo, luego de un ayuno nocturno de 8 horas. En el día 1, se
obtuvieron los pesos (báscula de plataforma marca SECA con una precisión de 50 g) y las
tallas (tallímetro metálico de pared con una precisión de 0,1 cm) de cada uno de los
sujetos, con el fin de calcular su volemia utilizando la tabla de Tulane (Nadler et al., 1962).
Posteriormente, con los sujetos en ayunas, se realizaron dos protocolos de estudio de
biodisponibilidad de hierro.
Diseño estudio de biodisponibilidad grupo tratamiento (A)
Día 1: Previo al tratamiento, la mitad de los sujetos ingirió 50 mL de una solución acuosa
que contiene 3 mg de Fe-no hem como sulfato ferroso marcado con 1 uCi del
isótopo 59FeCl 3 . La otra mitad ingirió 2 cápsulas que contienen glóbulos rojos de ternero
desecados que contiene 3 mg de hierro hemínico marcado intrínsecamente con 3 uCi
de 55Fe.
19
Día 2: Los sujetos que consumieron Fe-no hem recibieron las 2 cápsulas de Fe-hem y los
que consumieron Fe-hem recibieron Fe-no hem. Todos los compuestos marcados de la
misma forma que el día anterior.
Día 3-14: Los sujetos consumieron diariamente una ración del producto en estudio (yogurt
+ mix de 2 g prebióticos).
Día 15: Se tomó una muestra de 30 mL de sangre con el fin de medir la biodisponibilidad
de hierro basal y el estado nutricional de hierro de los sujetos. Posteriormente, la mitad
de los sujetos ingirió 50 mL de una solución acuosa que contiene 3 mg de Fe-no hem como
sulfato ferroso marcado con 1 uCi del isótopo 59FeCl 3 . La otra mitad ingirió 2 cápsulas que
contienen glóbulos rojos de ternero desecados que contiene 3 mg de hierro hemínico
marcado intrínsecamente con 3 uCi de 55Fe.
Dia 16: Los sujetos que consumieron Fe-no hem recibieron las 2 cápsulas de Fe-hem y los
que consumieron Fe-hem recibieron Fe-no hem. Todos los compuestos marcados de la
misma forma que el día anterior.
Día 29: Se realizó una toma de muestra de 20 mL de sangre para medir biodisponibilidad
de hierro post tratamiento.
Diseño estudio de biodisponibilidad grupo control (B)
Día 1: Previo al tratamiento, la mitad de los sujetos ingirió 50 mL de una solución acuosa
que contiene 3 mg de Fe-no hem como sulfato ferroso marcado con 1 uCi del
isótopo 59FeCl 3 . La otra mitad ingirió 2 cápsulas que contienen glóbulos rojos de ternero
desecados que contiene 3 mg de hierro hemínico marcado intrínsecamente con 3 uCi
de 55Fe.
Día 2: Los sujetos que consumieron Fe-no hem recibieron las 2 cápsulas de Fe-hem y los
que consumieron Fe-hem recibieron Fe-no hem. Todos los compuestos marcados de la
misma forma que el día anterior.
20
Día 3-14: Los sujetos consumieron diariamente una ración de un yogurt de las mismas
características del que consumió el grupo tratamiento pero sin el agregado de prebióticos.
Día 15: Se tomó una muestra de 30 mL de sangre con el fin de medir la biodisponibilidad
de hierro basal y el estado nutricional de hierro de los sujetos. Posteriormente, la mitad
de los sujetos ingirió 50 mL de una solución acuosa que contiene 3 mg de Fe-no hem como
sulfato ferroso marcado con 1 uCi del isótopo 59FeCl 3 . La otra mitad ingirió 2 cápsulas que
contienen glóbulos rojos de ternero desecados que contiene 3 mg de hierro hemínico
marcado intrínsecamente con 3 uCi de 55Fe.
Dia 16: Los sujetos que consumieron Fe-no hem recibieron las 2 cápsulas de Fe-hem y los
que consumieron Fe-hem recibieron Fe-no hem. Todos los compuestos marcados de la
misma forma que el día anterior.
Día 29: Se realizó una toma de muestra de 20 mL de sangre para medir biodisponibilidad
de hierro post tratamiento.
Evaluación del estado nutricional de hierro
La determinación de las variables bioquímicas del estado nutricional de hierro, se pudo
llevar a cabo a través de las siguientes pruebas:
Hemoglobina (Hb) y volumen corpuscular medio (VCM): determinadas en un contador
electrónico de células (CELL-DYN 1700, ABBOTT Diagnostics, Abbott Park, IL).
Ferritina sérica (FS): se realizó mediante una prueba de ELISA en sándwich, para lo cual, se
utilizó como anticuerpo primario anti-ferritina (Ref: A0362) y como secundario antiferritina conjugado con peroxidasa (Ref: A0031), ambos de marca Dako Corporation.
Hierro sérico: se realizó mediante fotocolorimetría, utilizando el cromógeno TPTZ.
21
Capacidad total de unión a hierro (TIBC): según la metodología propuesta por Fischer y
Price, 1964.
Porcentaje de saturación de la transferrina (% Sat): se calculó mediante la fórmula de
hierro en suero / TIBC (Fischer y Price, 1964).
Protoporfirina libre eritrocitaria: (ZP Hematofluorímetro Modelo 206D, AVIV Biomedical
Inc., Lakewood, NJ).
Biodisponibilidad
Para el cálculo de la biodisponibilidad se utilizó la técnica de doble marcaje isotópico
descrita por Eakins y Brown, 1966, utilizando como trazadores los isótopos
radioactivos
55
Fe y
59
Fe (NEN, Life Science Products, Inc., Boston, MA). En términos
generales, cada una de las muestras se digirió en medio ácido y se precipitó el contenido
total de hierro. Luego, se determinó la radioactividad emitida en un contador de centelleo
líquido LS 5000 TD, para lo cual se utilizaron 2 muestras blanco, cuadruplicados de dos
estándares (55Fe y
59
Fe) y sextuplicados de las muestras de cada sujeto. Las muestras
permanecieron en el contador el tiempo necesario para tener un error menor al 3%; el
equipo reportó las cuentas por minuto (cpm) de radioactividad emitida de 55Fe (carril A) y
de 59Fe (carril B). En el Anexo 2 (Técnica de doble marcaje isotópico de Eakins y Brown) se
describe en forma detallada los pasos que se siguieron para desarrollar esta técnica.
Debido a que existe un traslape de las cuentas en cada uno de los carriles del contador de
centelleo, se hizo necesario determinar la magnitud de este traslape y calcular a partir de
esto la biodisponibilidad de hierro de la siguiente manera: 1) corrección de las cpm totales
en cada carril por las muestras blanco; 2) corrección de las cpm para cada uno de los
isótopos según el traslape; 3) cálculo de las cpm por mL de sangre para cada isótopo; 4)
22
cálculo de las cpm de cada isótopo por mg de solución ingerida; 5) cálculo del total de
cpmcirculantes de cada uno de los isótopos; 6) cálculo del total de cuentas ingeridas de
cada isótopo; 7) cálculo del porcentaje de absorción de cada isótopo y 8) cálculo de la
biodisponibilidad de los isótopos. La tabla 1 muestra las fórmulas utilizadas en cada uno
de los pasos mencionados anteriormente.
Pasos
1
2
3
4
5
6
7
8
Ecuación
cpm A = cpm en A – Promedio de los blancos en A
cpm B = cpm en B – Promedio de los blancos en B
cpm55Fe = cpm en A – cpm de traslape de B a A
cpm59Fe = cpm en B – cpm de traslape de A a B
cpm55Fe/mL sangre = cpm55Fe/ mL sangre analizada
cpm59Fe/mL sangre = cpm59Fe/ mL sangre analizada
cpm55Fe/mg solución = cpm Standard 55Fe/mg solución analizados
cpm59Fe/mg solución = cpm Standard 59Fe/mg solución analizados
cpm circulantes 55Fe = cpm55Fe/mL sangre* volemia
cpm circulantes 59Fe = cpm59Fe/mL sangre* volemia
cpm ingeridas 55Fe = mg de solución ingeridos * cpm55Fe/mg de solución
cpm ingeridas 59Fe = mg de solución ingeridos * cpm59Fe/mg de solución
% 55Fe absorbidas = cpm ingeridas 55Fe/cpm circulantes 55Fe*100
%59Fe absorbidas = cpm ingeridas 59Fe/cpm circulantes 59Fe*100
Biodisponibilidad de 55Fe = % 55Fe absorbido * 0,81
Biodisponibilidad de 59Fe = % 59Fe absorbido * 0,81
Tabla 1: Fórmulas utilizadas para el cálculo de la biodisponibilidad de Fe mediante la utilización de
los isótopos 55Fe y 59Fe.
1
Corrección de Bothwell (80% del hierro ingerido se destina a eritropoyesis)
Para los cálculos de biodisponibilidad de los días 15 y 16 se les restó la radiactividad
contada de los días 1 y 2, para evitar sobreposición de ésta.
23
Resultados
Los 24 sujetos que aceptaron participar en el estudio terminaron los protocolos.
El estado de nutrición de hierro de los sujetos estudiados fue relativamente normal
(Tablas 2 y 3). No hubo sujetos con anemia por deficiencia de hierro (Hb<120 g/L más dos
de los parámetros de nutrición de hierro alterados: VCM<80 fL y/o Zpp>80 ug/dL GR y/o
Sat<15% y/o FS<12 ug/dL). Tampoco se observó la presencia de deficiencia de hierro sin
anemia (Hb normal más dos de los parámetros de nutrición de hierro alterados) ni de
depósitos de hierro depletados (Ferritina sérica <12 ug/L).
ARC
AVP
BCA
CMS
KMD
MAR
MCR
MMS
RGR
RLP
TAR
WWE
Media
DS
Edad
(a)
IMC
(Kg/m2)
Hb
(g/L)
VCM
(fL)
Zpp
(ug/dL GR)
Fe
(ug/dl)
TIBC
(ug/dL)
Sat
(%)*
FS
(ug/L)*
39
34
34
35
36
40
42
37
35
46
34
36
29.0
23.3
22.3
23.8
29.8
29.8
24.9
27.0
25.0
27.4
25.1
22.9
13.8
14.0
13.5
13.3
12.8
13.8
12.5
13.9
14.9
13.7
13.9
13.0
88
86
86
89
86
85
92
87
92
92
92
96
59
57
57
74
74
59
59
53
53
74
93
70
285
311
302
349
320
323
277
314
349
225
300
297
32
30
41
27
14
11
36
39
29
17
30
55
22.2
20.6
34.6
8.1
11.6
11.3
11.9
26.4
26.3
16.4
21.4
30.5
92
92
125
93
45
34
100
122
102
37
89
163
37
25.9
13.6
89
65
304
30
18.4
82.6
4
2.7
0.6
4
12
33
12
11.6-29.1 50.3-135.7
Tabla 2: Antropometría y estado nutricional de hierro de sujetos del grupo tratamiento (A).
*Promedio Geométrico y rango ±1DE.
Con respecto al Grupo A (tratamiento), el promedio de edad de las 12 participantes fue 37
± 4 años. El índice de masa corporal (IMC) promedio fue de 25.9 ± 2.7 Kg/m2 y el estado
24
nutricional de la muestra, valorado por este índice, fue 5 normales (IMC 18.5 – 24.9) y 7
con sobrepeso (IMC entre 25 a 29.9).
ACG
CHR
GME
GBS
GCG
ICM
JPC
JCR
JAV
MGF
MJA
POG
Media
DS
Edad
(años)
IMC
(Kg/m2)
Hb
(g/L)
VCM
(fL)
Zpp
(ug/dL GR)
Fe
(ug/dl)
TIBC
(ug/dL)
Sat
(%)*
FS
(ug/L)*
47
40
44
36
48
42
35
40
43
42
40
39
22.9
29.4
27.2
25.5
27.9
29.6
25.6
26.2
23.8
19.2
22.8
19.1
14.3
12.2
12.0
12.5
12.7
13.9
13.7
14.3
13.5
13.9
13.2
14.2
89
85
81
81
89
83
84
92
82
88
89
91
49
73
76
51
50
61
67
52
74
77
61
57
294
438
380
259
259
325
400
288
366
403
343
262
30
10
7
31
41
27
20
26
19
13
39
32
23.8
5.4
4.5
24.9
35
20.9
16.9
18.9
3.5
4.5
11.5
20.8
89
43
27
79
107
89
80
75
68
53
133
83
41
24.9
13.3
86
62
335
25
12.4
71.7
4
3.5
0.8
4
11
63
11
5.5-27.7 46.9-109.8
Tabla 3: Antropometría y estado nutricional de hierro de sujetos del grupo control (B).
*Promedio Geométrico y rango ±1DE.
En el Grupo B (control), el promedio de edad de las 12 participantes fue 41 ± 4 años. El
índice de masa corporal (IMC) promedio fue de 24.9 ± 3.5 Kg/m2 y el estado nutricional de
la muestra, valorado por este índice, fue 5 normales y 7 con sobrepeso. No se observaron
diferencias estadísticamente significativas en estos parámetros entre ambos grupos (t de
Student>0.05).
Los promedios de los parámetros que miden estado de nutrición de hierro [hemoglobina
(Hb), volumen corpuscular medio (VCM), Protoporfirina libre eritrocitaria (FEP), Saturación
de la transferrina (%Sat) y ferritina sérica (FS)] no presentaron diferencias significativas. En
resumen, los dos grupos presentaron su estado de nutrición general de hierro
comparable.
25
Análisis de los datos de biodisponibilidad de hierro: los valores de biodisponibilidad de
hierro se distribuyen asimétricamente, por lo tanto los datos individuales se
transformaron a su ln y se calculó el promedio geométrico. Las curvas de los promedios
geométricos de absorción de hierro se expresaron en % de biodisponibilidad.
Biodiosponibilidad de hierro del grupo en tratamiento: la tabla 4 muestra las
biodisponibilidades individuales del grupo tratamiento (A).
Biodisponibilidad de Fe (%)
55
Hem
59
Fe
55
59
Hem
Post-ingesta
Fe
Post-ingesta
Índice de absorción
C/A
D/B
ARC
AVP
BCA
CMS
KMD
MAR
MCR
MMS
RGR
RLP
TAR
WWE
A
15.6
19.6
12.8
25.3
32.1
5.7
11.6
8.4
16.8
9.2
7.7
3.1
B
21.4
18.9
37.9
35.3
28.7
12.5
24.7
12.8
36.5
18.2
20.1
7.5
C
33.1
25.8
13.8
31.2
19.6
11.8
20.7
10.2
21.8
11.9
18.6
14.9
D
40.2
27.0
17.7
17.3
5.8
8.4
28.2
11.5
26.8
25.2
39.1
26.8
2.1194
1.3158
1.0787
1.2337
0.6087
2.0621
1.7942
1.2049
1.2933
1.2825
2.4041
4.7494
1.8745
1.4307
0.4662
0.4897
0.2027
0.6694
1.1404
0.8995
0.7357
1.3858
1.9452
3.5638
PG*
- 1 DS
11.7
6.1
20.7
12.7
18.2
12.3
19.8
10.9
1.55
0.93
0.96
0.44
+1 DS
22.5
33.8
26.7
36.2
2.58
Tabla 4: Absorciones individuales del Grupo Tratamiento (A).
* Promedio Geométrico y rango de 1 ±DE
2.08
Los promedios geométricos de biodisponibilidad de este grupo fueron de 11.7 y20.7%
para Fe-hem y Fe-no hem pre-ingesta de yogurt con prebióticos; y de18.2 y 19.8% para Fehem y Fe-no hem post-ingesta de yogurt con prebióticos. Al calcular las razones de las
26
biodisponibilidades respecto a basal, los promedios geométricos resultaron ser de 1.55
para Fe-hem y de 0.96 para Fe-no hem.
Biodiosponibilidad de hierro del grupo control: la tabla 5 muestra las biodisponibilidades
individuales del grupo control (B).
Biodisponibilidad de Fe (%)
55
Hem
59
Fe
55
59
Hem
Post-ingesta
Fe
Post-ingesta
Índice de absorción
C/A
D/B
ACG
CHR
GME
GBS
GCG
ICM
JPC
JCR
JAV
MGF
MJA
POG
A
19.2
21.1
27.7
12.7
12.3
20.6
12.5
10.0
41.6
17.1
13.4
9.2
B
32.9
88.8
76.3
17.7
15.2
17.0
18.3
27.1
38.4
42.2
20.6
27.0
C
22.5
27.8
21.7
11.2
13.5
21.3
9.6
13.1
32.6
23.5
11.2
14.8
D
30.1
92.5
90.3
13.8
12.9
13.4
21.6
24.3
55.3
33.2
31.5
26.7
1.17
1.32
0.78
0.88
1.10
1.03
0.77
1.31
0.78
1.38
0.84
1.61
0.91
1.04
1.18
0.78
0.85
0.78
1.18
0.90
1.44
0.79
1.53
0.99
PG*
- 1 DS
16.5
10.6
29.6
16.6
17.3
11.6
29.8
15.2
1.05
0.81
1.00
0.80
+1 DS
25.6
52.9
25.8
58.5
1.36
Tabla 5: Absorciones individuales del Grupo Control (B).
* Promedio Geométrico y rango de 1 ±DE
1.27
Los promedios geométricos de biodisponibilidad de este grupo fueron de 16.5 y29.6%
para Fe-hem y Fe-no hem pre-ingesta de yogurt sin prebióticos; y de17.3 y 29.8% para Fehem y Fe-no hem post-ingesta de yogurt sin prebióticos. Al calcular las razones de las
biodisponibilidades respecto a basal, los promedios geométricos resultaron ser de 1.05
para Fe-hem y de 1.00 para Fe-no hem.
27
Al aplicar la prueba de ANOVA de dos vías para muestras repetidas al efecto de
prebióticos sobre la biodisponibilidad de hierro según tipo de hierro se observó; para Feno hem un F=3.28 (N.S.) para efecto tratamiento, F=0,02 (N.S.) para efecto tiempo y un
F=0.04 (N.S.) para la interacción tratamiento-tiempo (Figura 2).
Figura 2: Efecto del prebiótico sobre la absorción de hierro no hemínico.
Para Fe-hem un F=0.65 (N.S.) para efecto tratamiento, un F=8.69 (p<0.007) para efecto
tiempo y un F=5.57 (p<0.028) para la interacción tratamiento-tiempo (Figura 3).
28
Figura 3: Efecto del prebiótico sobre la absorción de hierro hemínico.
29
Discusión
Los prebióticos, como inulina, goma guar, polidextrosa y goma arábiga, utilizados en el
presente estudio pasan a través del estómago y el intestino delgado sin ser mayormente
digeridos (Gibson y Roberfroid, 1995) y se retienen en el intestino grueso. Los
prebióticosactúan como sustrato para la flora bacteriana benéfica provocando un
crecimiento selectivo de bacterias como bifidobacterias y lactobacilos, a expensas de
poblaciones patógenas como clostridia, enterobacteria, entre otras (Gibson et al., 2004;
Rastal et al., 2005). Esta proliferación de flora benéfica genera un incremento en la
producción de ácido grasos de cadena corta (AGCC) que proveen de energía a la mucosa
colónica, y como consecuencia producen una acidificación del pH a nivel colónico
(Macfarlane et al., 2007; Nicholson et al., 2005).
Se ha sugerido que los prebióticos podrían aumentar la biodisponibilidad del hierro
dietario posiblemente por acción de la fermentación microbiana de estos compuestos en
el intestino grueso (Yeung et al., 2005). Respecto a prebióticos y el efecto que producen
en la absorción de hierro existen muy pocos estudios y sólo existen dos en humanos.
El hierro es un elemento esencial requerido por los seres vivos para un amplio espectro de
funciones. Sin embargo, el exceso de hierro puede producir la generación de radicales
libres que pueden ser tóxicos para los componentes celulares. Debido a esto, la cantidad
de hierro debe ser estrictamente regulada para prevenir su deficiencia o exceso (Takeuchi
et al., 2005). Al no existir un sistema de excreción de este mineral, dicha regulación se
realiza a nivel de absorción intestinal. El duodeno es la principal región intestinal donde se
absorbe el hierro dietario. La dieta occidental ofrece aproximadamente 10 mg de Fe
diarios de los cuales se estima que sólo el 10% se absorbe en el duodeno y que el 90%
restante del hierro consumido pasa sin ser absorbido hacia el intestino delgado distal y
colon. Se presume que este exceso de hierro es simplemente excretado en las
30
heces. Curiosamente, la evidencia reciente sugiere que el colon proximal, específicamente
el ciego en ratas, puede tener cierta capacidad de captación y absorción de Fe-no hem
(Bougle et al., 2002; Campos et al., 1996), aunque la naturaleza de esta vía de transporte
es desconocida. Otros estudios, que también utilizaron ratas como modelo, han sugerido
que el íleon podría absorber parte del Fe-no hem, pero a un nivel mucho menor que el
duodeno (Chowromootoo et al., 1992a; Chowromootoo et al., 1992b).
La absorción de cada tipo de hierro es independiente entre sí. El hierro no hemínico es
reducido de ferroso (Fe+3) a férrico (Fe+2) por una reductasa férrica citocromo b ubicada en
el borde apical del enterocito (McKie et al., 2001). El hierro férrico es transportado hacia
el interior del enterocito por el transportador de metales divalentes DMT1 (Beard y
Piñero, 1997). Por otro lado, el hierro hemínico parece ser transportado intacto (junto a su
anillo protoporfirínico) desde el lumen intestinal hacia el enterocito a través de la
actividad de la proteína transportadora de hierro heme HCP1 (Shayeghi et al., 2005) que
internaliza al hierro hemínico hacia el enterocito por un mecanismo de endocitosis
(Arredondo et al., 2008). Luego, por la acción de la enzima hemoxigenasa, el hierro
hemínico es desamblado y el hierro liberado entra a las mismas vías que las tomadas por
el hierro no hemínico (Pizarro et al., 2005). Dentro del enterocito el hierro puede tener
dos destinos, uno como reserva en forma de ferritina y otro ser exportado a través de la
membrana basolateral del enterocito por acción de la ferroportina IREG1 siendo
inmediatamente oxidado a su estado férrico por la hefestina que permite la unión del
hierro a la transferrina, proteína transportadora de hierro a nivel sanguíneo (Muñoz y
Molina, 2005). Curiosamente DMT1, IREG1, Dcytb y hefestina han sido detectados en
células colónicas de modelos animales (Gunshin et al., 1997; McKie et al., 2000; Frazer et
al., 2001; Takeuchi et al., 2005), lo que siguiere que a este nivel existiría un mecanismo
similar de captación y absorción de Fe-no hem. Por otro lado, no hay información en la
literatura que describa la presencia de HCP1, u otra vía de captación de Fe-hem en el
colon.
31
Dados nuestros resultados, es decir, que solamente la absorción de Fe-hem fue favorecida
por el consumo de prebióticos, podemos establecer que este efecto toma lugar en algún
punto previo a que este hierro se haga indistinguible del hierro no-hem, ya sea a nivel
luminal o de transporte trans-epitelial por medio de la HCP1.
Resulta lógico pensar que si existe absorción de hierro no hemínico a nivel colónico,
sumado al efecto acificador de pH que tienen los prebióticos a este nivel, debería haber
habido un aumento en la biodisponibilidad de Fe-no hem. Sin embargo, esto no sucedió,
lo que podría ser explicado porque en el presente estudio, los sujetos experimentales se
encontraban en un adecuado estado de nutrición de hierro, no presentando depósitos
depletados ni anemia por deficiencia este elemento, lo cual no sucedió en los trabajos
presentados anteriormente, en modelos animales, donde la expresión de los genes de los
transportadores de hierro se evidenciaba en situaciones experimentales de deficiencia de
hierro (Johnston et al., 2006; Takeuchi et al., 2005). Por tanto presumimos que de haber
absorción de hierro a nivel colónico en el humano este se daría solo en estados de
deficiencia de hierro y/o con cantidades de prebióticos más altos que los entregados en el
yogurt de este estudio. Lamentablemente no pudimos confirmar la disminución del pH en
las deposiciones de nuestros sujetos para confirmar la efectividad de los prebióticos
consumidos.
Por otro lado, nuestros resultados coinciden con lo reportado por distintos autores en
modelo porcino y estudios en humanos, donde no se encontró un efecto de los
prebióticos sobre la absorción de Fe-no hem a nivel del intestino grueso, ni tampoco se
evidenció un aumento a nivel general en su biodisponibilidad (Coudray et al., 1997;
Patterson et al., 2009; Van Den Heuvel et al., 1998).
32
La absorción a nivel de duodeno está mediada también por variados factores que la
afectan. Como agentes dietarios favorecedores de la absorción del Fe-no hem están las
proteínas de la carne, alimentos fermentados (Layrisse et al., 1984) y ácido ascórbico
(Stekel et al., 1985), el cual posee el efecto más notable. Entre los factores inhibidores de
la absorción se encuentran los fitatos (Hallberg et al., 1987), fibra soluble (Simpson et al.,
1981; Hallberg et al., 1987), caseína (Hurrel et al., 1989), soya (Cook et al., 1981) y taninos
(Pizarro et al., 1994; Disler et al., 1975). La información disponible acerca de la absorción
de Fe-hem es escasa y en contraposición a la del Fe-no hem, es poco afectada por factores
intraluminales y de la dieta, entre los cuales se ha descrito que el calcio disminuye su
absorción (Hallberg et al., 1991) y las proteínas la favorecen (Layrisse y Martinez-Torres,
1972), sin embargo, esta conclusión se basó en el aumento de la absorción de Fe-hem por
parte de los individuos, después de ingerir una dosis de hemoglobina marcada con
isótopos de Fe, junto a una porción de carne de vacuno y maíz, si bien la proporción de
proteínas en estos alimentos es bastante alta, no se pueden descartar otros componentes
de la matriz alimentaria que podrían estar afectando la absorción de Fe-hem. Un estudio
realizado por García et al. (1996), sugirió que la carne ejercía un efecto favorecedor de la
absorción de Fe-hem, lo que denominaron como factor carne. En estudios más actuales se
logró determinar que es el estroma de eritrocito el responsable del aumento de la
absorción de Fe-hem (Pizarro, 2008).Recientemente se ha demostrado en células Caco-2
que las proteínas de origen vegetal y animal que forman parte de una comida disminuyen
la captación de Fe-hem, pero al estar de manera purificada aumentan la captación de Fehem (Villarroel et al., 2011), pero este efecto no se corroboró en estudios de absorción en
humanos, donde las proteínas purificadas no ejercieron efecto alguno sobre la absorción
de Fe-hem, excepto la proteína de la soya, que al entregarse como concentrado proteico,
disminuyó la absorción de Fe-hem (Weinborn, 2008).
Una posible explicación al aumento de la absorción y biodisponibilidad de Fe-hem sería
que los prebióticos o sus productos de fermentación como lo son los AGCC, aumentaran
33
cualquiera de los compuestos favorecedores de la absorción de Fe-hem, o disminuyeran
algunos de los inhibidores. Otra posibilidad es que de alguna forma los prebióticos
aumentaran la expresión del receptor y transportador del Fe-hem, HCP1, como sucede
con los transportadores de Fe-no hem en modelos animales. Una tercera explicación
podría basarse en la utilización de Fe-no hem por parte de las bacterias, las cuales al
aumentar en número estarían haciendo menos biodisponible al Fe-no hem y al no tener
estas bacterias receptores de Fe-hem lo dejaría disponible para la absorción a nivel
colónico.
Con este diseño de estudio no es posible determinar por cuál de estos mecanismos (u otro
no nombrado) o en qué lugar específicamente, se vio favorecida la absorción y
biodisponibilidad de Fe-hem, por lo tanto se necesita más investigación para responder
estas interrogantes.
34
Conclusión
Se acepta parcialmente la hipótesis ya que por los resultados obtenidos se demuestra que
el consumo habitual de yogurt con agregado de prebióticos aumenta en 55% la
biodisponibilidad de hierro hemínico, y no produce cambios en la absorción del Fe nohem.
35
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43
Anexo 1: Consentimiento de participación en el Proyecto “El efecto del
consumo de prebióticos sobre la biodisponibilidad de hierro”
INFORMACIÓN SOBRE EL ESTUDIO DE INVESTIGACIÓN
¿Cuál es el propósito del estudio?
Se quiere conocer qué efecto podría tener el consumo de un alimento funcional sobre la absorción
del hierro.
¿Quién puede participar en este estudio?
Pueden participar mujeres sanas cuya edad sea entre 35 y 45 años de edad, que no hayan
recibido ningún suplemento mineral en los últimos 6 meses ni antibióticos en el último mes. No
debe estar embarazada ni querer embarazarse. En el periodo del estudio, debe estar usando un
método anticonceptivo (DIU, anticonceptivos orales o ligadura de trompas).
¿Por qué debiera yo considerar mi participación como sujeto de investigación en este estudio?
Para colaborar en conocer cuál es el rol que tienen los prebióticos en la absorción de hierro. Este
conocimiento permitirá mejorar las recomendaciones de ingesta de ciertos tipos de alimentos.
¿Tengo necesariamente que participar en este estudio? ¿Si acepto participar, puedo cambiar de
opinión o retirarme?
Usted no tiene ninguna obligación de participar en el estudio. Si acepta participar puede retirarse
en cualquier momento del estudio.
¿Si decido participar en el estudio, en qué consisten precisamente las evaluaciones, y que tipo
de tratamientos o procedimientos me van a practicar?
Usted será citada al INTA para participar en una charla donde se le explicará en detalle de que se
trata el estudio. Si usted decide aceptar participar, deberá concurrir en ayunas al INTA durante 5
mañanas (días 1, 2, 15, 16 y 29 del estudio). Los días 1, 2, 15 y 16 usted recibirá una solución
acuosa o 2 cápsulas que contienen hierro que contiene una pequeña cantidad de un isótopo de
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hierro radioactivo. Después de ingerir el hierro usted deberá permanecer 3 horas sin recibir
ningún alimento. En dos oportunidades (día 15 y 29 del estudio) se le extraerá una muestra de
sangre de una vena del brazo: una de 30 ml (6 cucharaditas de té), el día 15, para medir la
absorción de hierro y para saber su nutrición de hierro y el día 29 una muestra de 20 ml (4
cucharaditas de té) para medir la absorción de hierro. Además, desde el día 3 al 14 del estudio,
usted deberá consumir un yogurt todas las mañanas, el cual le será entregado en su domicilio.
¿Qué peligros podría experimentar en este estudio, y que harán los investigadores para reducir
el riesgo de que éstos se presenten?
Usted no corre ningún peligro. Las dosis de radioactividad que recibirá es menor a la que recibe al
tomarse una radiografía de tórax. Además, para participar, a usted se le exigirá que esté con algún
método anticonceptivo y para confirmar que no esté embarazada se le realizará el test de
embarazo cada vez que concurra a ingerir hierro. En caso de fallar el método anticonceptivo y
usted quede embarazada, las dosis utilizadas no constituyen ningún riesgo para el feto ni la madre.
Tampoco es de riesgo para el entorno familiar ni laboral.
Una posible molestia es que en el sitio de punción de la vena pudiera aparecer en algún caso un
moretón. Esto se tratará de evitar, un Tecnólogo Médico de mucha experiencia será el que tome
las muestras de sangre con material desechable.
¿Qué harán los investigadores para asegurar que la información que recolectarán sobre mí, no
caerá en manos equivocadas?
Usted será identificado con un código, siendo su identidad sólo conocida por el investigador
responsable del proyecto. En la comunicación de los resultados no figurará su identidad.
¿Qué beneficios personales puedo yo esperar al participar en este estudio?
A través de la muestra de sangre le haremos varios exámenes de laboratorio que nos permitirá
saber si Ud. tiene anemia por deficiencia de hierro. En el caso de presentar anemia se le derivará a
su centro de salud o médico personal para su tratamiento.
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¿En qué podría este estudio beneficiar a otros?
Los resultados del estudio podrán contribuir a conocer los efectos benéficos del consumo de
prebióticos, y así mejorar la recomendación de consumo de alimentos, lo que contribuirá a una
mejor salud de nuestra población.
¿Qué harán los investigadores si sufro algún daño durante el estudio?
No se espera que usted sufra daño.
¿Recibiré algún pago por participar en este estudio?
Usted recibirá una compensación por los gastos de locomoción y tiempo ocupado en el proyecto al
completar el estudio. Ésta se pagará al final del estudio y corresponde a $60.000
¿Se cobrará a mí, a mi Isapre o FONASA el costo de algunos de estos estudios?
Este estudio no tiene ningún costo para usted o su sistema de salud.
¿Una vez que yo haya ingresado como sujeto de estudio, a quien tendría que dirigirme para
averiguar más acerca del estudio o para hacer llegar algún reclamo respecto al trato que hubiese
recibido?
Usted se podrá dirigir a TM Fernando Pizarro (fono 9781522) o a la Alumna de Magíster Valerie
Weinborn (fono 9781513), en INTA, El Líbano 5542.
¿Qué sucede si decido no participar en este estudio?
Nada.
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Documentación del Consentimiento
¿Después que firme el documento, quien lo guardará?
El investigador responsable del proyecto.
Declaro haber leído la información descrita y mis preguntas acerca del estudio han sido
respondidas satisfactoriamente. Al firmar esta copia, indico que tengo un entendimiento claro del
proyecto
Nombre
del
participante :
Firma:
Fecha:
Consentimiento del investigador
Al sujeto de investigación he entregado información sobre el estudio, y en mi opinión esta
información es precisa y suficiente para que el sujeto entienda completamente la naturaleza, los
riesgos y beneficios del estudio, y los derechos que tiene en tanto sujeto de investigación. No ha
existido coerción ni ha actuado bajo influencia alguna. He sido testigo que el sujeto firmó el
documento.
Nombre
Investigador
del Fernando Pizarro Aguirre
Firma:
Fecha:
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Anexo 2: Técnica de doble marcaje isotópico de Eakins y Brown
I.
Etapa: Digestión
a) Estándares: los estándares con que trabajamos en los estudios consistieron en triplicados de las
cápsulas usadas en cada uno de ellos. Así, la primera semana del estudio se obtenían seis cápsulas
estándares, tres que correspondían a 55Fe y tres a 59Fe, y de esta misma forma ocurría en la
segunda semana de estudio.
b) Blancos y muestras: ambos ítems se trabajaron en duplicados. Las muestras blanco
correspondieron a 5 mL de sangre de banco de sangre del Instituto de Salud Pública (ISP). Las
muestras como tal, correspondieron a 8 mL de sangre de cada sujeto participante del estudio.
Cada estándar, blanco y muestra, se puso en un tubo de digestión y se colocaron 6 a 8 perlas de
vidrio de 5 mm de diámetro y se le agregó primero 3 mL de ácido sulfúrico al 95-97% p.a. (Merck,
Germany) y luego 2 mL de ácido nítrico al 65% p.a. (Merck, Germany) y se dejó reposar al menos
una noche, idealmente todo el fin de semana.
Ya transcurrido este tiempo, se colocaron los tubos de digestión en un digestor marca Quimis
distintos tiempos a distintas temperaturas:
-
95°C por 10 minutos
-
135°C por 5 minutos
-
150°C por 5 minutos
-
200°C por 10 minutos
-
250°C por 10 minutos
-
290°C por 15 minutos y se apagó (muestra color petróleo).
Luego, se agregó 1 mL de ácido perclórico al 70-72% p.a. (Merck, Germany) a cada tubo y se siguió
con la digestión a:
-
220°C por 10 minutos
-
250°C por 5 minutos
-
290°C hasta que la muestra quede color amarillo pálido (aproximadamente 60 minutos).
Luego, los matraces se sacaron del digestor y cuando ya estaban fríos, se les agregó 10 mL de
ácido clorhídrico fumarante 37% p.a. (Merck, Germany).
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II.
Etapa: Precipitación 1
En tubos de fondo redondo de 100 mL siliconados, se agregó cantidad necesaria de carrier según
la siguiente fórmula:
mg de Fe que tiene la muestra =
mL de carrier =
Hb × 3,39 × volumen de sangre
100
5 − mg de Fe de la muestra
5 mg de Fe/mL (concentración Carrier )
Se trasvasijó la muestra completa desde el tubo de digestión al tubo de 100 mL incluyendo las
perlas de vidrio. Se lavó cinco veces el matraz con 4 mL de agua desionizada enjuagando las
paredes del cuello del matraz y vortexeando en cada lavado.
Se adicionó hidróxido de amonio 10 M enérgicamente con pizeta la cantidad necesaria para
formar un precipitado de color café e insoluble en agua. Se dejó decantar el precipitado y luego se
centrifugó a 1.800 rpm durante 30 minutos a 22°C. Terminado el proceso, se descartó el
sobrenadante sin perder el precipitado, y se agregó 1 mL de ácido clorhídrico 1 N.
III.
Etapa: Precipitación 2
Se trasvasijó el contenido completo del tubo de 100 mL a tubos de 15 mL y se realizaron 4 lavados
en vortex con 2,5 mL de agua desionizada.
Se adicionó hidróxido de amonio 10 M enérgicamente con pizeta la cantidad necesaria para
formar un precipitado de color café. Esta precipitación en particular, se hace en vortex cuidando
que la formación de precipitado llegue hasta el fondo del tubo. Se dejó decantar el precipitado y
luego se centrifugó a 2.500 rpm durante 20 minutos a 22°C. Después, se eliminó el sobrenadante y
se agregaron 10 mL de agua desionizada, se agitó en vortex hasta que se levantó el precipitado y
se lavaron las paredes con 5 mL más de agua desionizada. Se repitió la centrifugación a 2.500 rpm
durante 20 minutos a 22°C. Luego, se eliminó el sobrenadante y se agregó 0,5 mL de ácido
ortofosfórico al 85% p.a. (Merck, Germany) (la muestra queda transparente) y después se
precipitó en vortex con 10 mL de cloruro de amonio en etanol 0,05 M, más 5 mL de la misma
solución sin vortexear. Se repitió la centrifugación a 2500 rpm durante 20 minutos a 22°C.
Después, se eliminó el sobrenadante y se agregaron 4 mL de etanol absoluto (Merck, Germany), se
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agitó en vortex hasta que se levantó el precipitado y se lavaron las paredes con 8 mL más de
etanol absoluto (Merck, Germany). Se repitió la centrifugación a 2.500 rpm durante 20 minutos a
22°C y se eliminó el sobrenadante.
IV.
A
Etapa: Conteo
cada
tubo,
se
agregó
4
mL
de
Ultrafluor
(Complete
liquidscintillationcountingsolutionforaqueousradioactivesamples; Nacional Diagnostics, USA) y se
agitó en vortex. Luego, el contenido de los tubos fue trasvasijado a viales de conteo que fueron
previamente llenados a tres cuartos de su capacidad con CAB-O-SIL (Thixotropicgellingpowder,
scintillation grade; Nacional Diagnostics, USA). Los tubos, fueron lavados posteriormente dos
veces con 4 mL de Ultrafluor y agitados en vortex para luego ser trasvasijados al vial. Finalmente,
cada vial fue agitado en vortex aproximadamente 30 segundos hasta homogenizar el gel y se
guardó en cajas en un lugar oscuro durante 48 a 36 horas. Cumplido este tiempo, las muestras
estuvieron aptas para su lectura en el contador de centelleo líquido.
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