liberacion controlada de polipeptidos macromoleculares.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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ES 2 039 437
kInt. Cl. : A61K 9/22
11 N.◦ de publicación:
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ESPAÑA
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A61K 9/26
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 87304570.2
kFecha de presentación : 22.05.87
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 251 476
kFecha de publicación de la solicitud: 07.01.88
T3
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54 Tı́tulo: Liberación controlada de polipéptidos macromoleculares.
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73 Titular/es: Syntex (U.S.A.) Inc.
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72 Inventor/es: Eppstein, Deborah Ann y
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74 Agente: Lehmann Novo, Marı́a Isabel
30 Prioridad: 23.05.86 US 866625
3401 Hillview Avenue
Palo Alto, California 94303, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.10.93
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.10.93
Aviso:
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k
Schryver, Brian Bloor
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Este invento se refiere a un sistema de suministro de agentes activos para administrar agentes
activos de polipéptidos macromoleculares que tienen pesos moleculares de aproximadamente 1.000
o mayores, particularmente interferones, a un
régimen controlado durante un perı́odo de tiempo
prolongado.
El método tradicional y más ampliamente utilizado para administrar agentes terapéuticos se
realiza por vı́a oral. Sin embargo, en el caso de
grandes polipéptidos, dicho suministro no es factible debido a la hidrólisis de los péptidos por enzimas digestivas. Los métodos más comúnmente
utilizados para la administración de agentes terapéuticos de polipéptidos consisten en infusión
por inyección repetida, intramuscular (i.m.), subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.). Estos métodos
son aceptables en situaciones en las que se requiere un número muy limitado de inyecciones,
pero son indeseables para administración crónica
(tal como ocurre, por ejemplo, con la terapia con
insulina). La naturaleza de muchas de las enfermedades, afecciones y condiciones susceptibles
de mejorı́a por administración de polipéptidos es
crónica en vez de aguda, necesitando por consiguiente frecuentes inyecciones durante un perı́odo
de tiempo prolongado.
Por lo tanto, existe una necesidad de un sistema eficaz y económico de suministro de agentes
de polipéptidos grandes. Se han usado matrices
polı́meras biodegradables formadas de poli (ácido
láctico) o copolı́meros de poli (ácido láctico)
con otros comonómeros tales como ácido poli glicólico como sistemas de suministro de liberación prolongada para una variedad de agentes
activos, debido a su actividad de biodegradarse
in situ. Véanse, por ejemplo, las patentes de los
Estados Unidos de América U.S. N◦ 4.293.539 y
4.419.340. El uso de estos polı́meros en implantes para suministro de varios agentes terapéuticos
se ha descrito en publicaciones cientı́ficas y en
la bibliografı́a de patentes. Véanse, por ejemplo, los artı́culos de Anderson, L.C. et al, (1.976),
“An injectable sustained release fertility control
system”, (un sistema de control de la fertilidad
con liberación retardada, inyectable) Contraception 13: 375 - 384; Beck et al. (1.979), “New
long - acting injectable microcapsule contraceptive system” (nuevo sistema anticonceptivo con
microcápsulas inyectables de acción prolongada),
Am. J. Obstet. Gynecol. 140: 799 - 806; Yolles et
al. (1.978) “Timed release depot for anti - cancer
agents II” (depósito de liberación programada en
el tiempo para agentes anticancerosos II), Acta
Pharm. Svec. 15: 382 - 388, documento de patente U.S. 3.773.919 y la solicitud de patente de
los Estados Unidos U.S. N◦ de serie 699.715 presentada el 8 de Febrero de 1.985. Se ha informado
acerca del suministro prolongado de péptidos a
partir de sistemas de poli (lactida - co - glicolida) por Kent et al. (1.982), “In vivo controlled
release of an LHRH analog from injected polymeric microcapsules” (liberación controlada in vivo
de un compuesto análogo a LHRH a partir de
microcápsulas polı́meras inyectadas), Contracept.
Deliv. Syst. 3: 58; por Sanders et al. (1.984),
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“Controlled release of a luteinizing hormone - releasing hormone analogue from poly (d,l - lactide co - glycolide) - microspheres” (liberación controlada de un análogo a la hormona de liberación de
hormona luteinizante a partir de microesferas de
poli (d,l - lactida - co - glicolida) (véase también
el documento de patente europea EP 0.052.510),
J.Pharmaceut. Sci. 73: 1294 - 1297, de T.
Chang, “Biodegradable semipermeable microcapsules containing enzymes, hormones, vaccines and
other biologicals” (microcápsulas semipermeables
biodegradables que contienen enzimas, hormonas,
vacunas y otros productos biológicos), J. Bioengineering, 1, 25 - 32 (1.976), y en la solicitud de patente europea EPO N◦ 82300416.3, presentada el
27 de enero de 1.982, ahora documento de patente
europea N◦ 0.058.481). También el documento
EP 134.318 describe la liberación controlada de
insulina mediante la formación de canales acuosos
a partir de una composición de matriz polı́mera
biodegradable. Sin embargo, el suministro de polipéptidos grandes a partir de matrices de poli lactida ha resultado difı́cil de conseguir, por razones que se debatirán más adelante con mayor
detalle. De las publicaciones antes citadas, solamente las dos últimas describen dispositivos que
contienen polipéptidos que poseen pesos moleculares de 2.500 o mayores.
Los polı́meros y copolı́meros de poli - lactidas y poli (lactida - co - glicolidas) (citados
genéricamente en lo que sigue como polı́meros de
poli - lactidas o PLGA) no son solubles en agua.
En contraste con ello, la mayor parte de los polipéptidos son solubles en agua pero no en disolventes orgánicos. Por esta razón, la preparación
de dispositivos de poli - lactida en los que están
dispersadas partı́culas de polipéptidos ha seguido,
hasta el momento actual, una de dos técnicas
básicas.
Una de estas técnicas implica mezclar los componentes con la poli - lactida en el estado fundido,
seguido por extrusión en caliente, prensado en caliente, o colada.
La segunda técnica implica la creación de
una solución/suspensión del polı́mero y del polipéptido en un disolvente orgánico, que luego es
moldeado por colada para formar una pelı́cula o
plancha y el disolvente se evapora. Este último
método requiere usualmente una agitación extensa o rápida de la solución/suspensión con el
fin de conseguir un grado aceptable de uniformidad de las partı́culas de polipéptido y una homogeneidad de la matriz de polipéptido/poli - lactida después de solidificación. La evaporación del
disolvente tiene lugar durante un perı́odo desde
varias horas hasta varios dı́as, a menos que la
pelı́cula o plancha sea secada bajo vacı́o, en cuyo
caso se crean invariablemente burbujas al secarse
el material sólido. Adicionalmente, las formulaciones de poli - lactidas preparadas de esta manera no son suficientemente uniformes para la mayor parte de las aplicaciones terapéuticas; debido
a la coalescencia de la fase de partı́culas solubles
en agua, el polipéptido está distribuido irregularmente dentro de la poli - lactida en forma de grandes agregados de partı́culas. Por lo tanto, las formulaciones preparadas de esta manera se deben
someter a procesos de homogeneización adicional,
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tales como trituración de la formulación para dar
un polvo y reformación de la misma bajo calor,
o compresión o extrusión de la formulación bajo
calor. La temperatura requerida para estas manipulaciones es usualmente de al menos 70◦ C.
Es también sabido preparar microcápsulas
inyectables de un fármaco en una poli - lactida. Tales microcápsulas se pueden preparar por
técnicas fundamentales tales como la expuesta en
la patente U.S. N◦ 3.773.919 y en la solicitud
de patente U.S. N◦ 699.715 ası́ como en la patente europea N◦ 0.052.510. Este último método
implica disolver el polı́mero en un disolvente del
tipo de hidrocarburo halogenado, dispersar la solución acuosa que contiene un polipéptido mediante rápida agitación dentro de la solución de
polı́mero y disolvente, y añadir un agente de coacervación no disolvente, que da lugar a que el excipiente de carácter polı́mero se separe por precipitación del disolvente del tipo de hidrocarbonado
halogenado sobre las gotitas de agua que contienen el polipéptido dispersado, encapsulando de
esta manera al polipéptido. Las microcápsulas
resultantes son luego secadas mediante lavados repetidos con un disolvente orgánico.
Sin embargo, los grandes polipéptidos son
particularmente susceptibles a desnaturalización
fı́sica y quı́mica y a una consiguiente pérdida de
potencia biológica por causa de la exposición a excesivo calor, disolventes y fuerzas de cizalladura.
Por esta razón, la incorporación de grandes polipéptidos en polı́meros de poli - lactida ha requerido hasta ahora un compromiso en el grado
de uniformidad de la dispersión de polipéptido
y polı́mero, o bien ha dado como resultado una
pérdida sustancial de la potencia biológica del polipéptido, o ambas cosas. Las formulaciones resultantes son en general dispersiones no uniformes que contienen partı́culas grandes de tamaños
irregulares de polipéptido con potencia reducida.
La incorporación de partı́culas grandes e irregulares de un polipéptido causa un régimen desigual
de suministro de un fármaco, y tiende a exacerbar los perfiles de liberación multifásicos generalmente asociados con los preparados farmacéuticos
de poli - lactidas.
La preparación de formulaciones monolı́ticas
más homogéneas por técnicas conocidas, tales
como mezcladura de los componentes fundidos,
trituración, y técnicas de homogeneización en caliente, tales como compresión y extrusión, pueden
dar como resultado una pérdida sustancial, con
frecuencia casi completa, de actividad biológica
del polipéptido. Por ejemplo, una formulación de
PLGA e interferón formada por mezcladura y extrusión en caliente bajo condiciones suaves retiene
menos de 1 % de la actividad biológica original del
interferón. (Véase el Ejemplo 7 siguiente). Para
compensar la pérdida de actividad biológica durante procesos de fabricación de este tipo, debe
incorporarse en la formulación un gran exceso de
un polipéptido.
Otra desventaja adicional de las formulaciones que contienen polipéptidos desnaturalizados
es la inmunogenicidad aumentada que éstas exhiben. La formación de anticuerpos como respuesta
al polipéptido desnaturalizado puede contrarrestar parcial o enteramente el efecto terapéutico de-
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seado.
Correspondientemente, existe una necesidad
de un dispositivo homogéneo con poli - lactida
que proporcione suministro controlado y regular de polipéptidos macromoleculares, y que se
pueda fabricar sin pérdida importante de actividad biológica.
El presente invento crea un nuevo sistema de
suministro de agentes activos, para la administración controlada de un polipéptido macromolecular soluble en agua a un mamı́fero. El sistema
comprende una matriz polı́mera que no contiene
más de aproximadamente 30 por ciento en peso
de partı́culas de un polipéptido macromolecular
y otros componentes solubles en agua, opcionales, dispersados en una matriz de poli - lactida,
en donde sustancialmente todas las partı́culas del
polipéptido y otros componentes solubles en agua
tienen diámetros de 10 µm o menos y están dispersados uniforme y discretamente por toda la
matriz, y en donde el polipéptido retiene por lo
menos 50 por ciento de la actividad biológica que
poseı́a antes de la fabricación de la matriz.
Este dispositivo proporciona un método
económico y confiable de suministrar cantidades
controladas y regulares de polipéptidos macromoleculares biológicamente activos a sitios del
cuerpo, que son capaces de poner a disposición
fluidos intracelulares y/o extracelulares para su
transferencia al dispositivo. El sistema se puede
diseñar para suministrar el agente activo a un
régimen apropiado durante perı́odos de tiempo
prolongados que varı́an desde menos de un dı́a
hasta varios meses. Generalmente, se consideran
perı́odos de liberación de los agentes activos de
aproximadamente una semana hasta tres meses.
Una ventaja importante de este dispositivo de
liberación controlada estriba en el hecho de que
se puede fabricar con una pérdida solo secundaria de actividad biológica del agente activo de polipéptido. El mantenimiento de una alta actividad biológica permite que el dispositivo que se ha
de fabricar contenga cantidades iniciales relativamente bajas de polipéptido.
Como resultado del hecho de mantener una
alta actividad biológica del polipéptido durante la
fabricación, se consiguen varias ventajas adicionales. En primer lugar, hay una ventaja económica
importante para el fabricante en lo que se refiere
al costo del agente activo incorporado en cada
forma de dosificación o sistema de suministro. En
segundo término, debido al porcentaje relativamente bajo de polipéptido y otros componentes
solubles en agua en el dispositivo, la contribución
de estos componentes a la hidratación del sistema
in vivo se minimiza, proporcionando de esta manera un régimen más constante de liberación del
polipéptido a lo largo de toda la vida útil de funcionamiento del dispositivo que el que se puede
obtener con los sistemas biodegradables conocidos con anterioridad. En tercer lugar, la ausencia
de cantidades importantes de polipéptido desnaturalizado reduce la probabilidad de que se produzcan respuestas inmunes indeseables en el sitio
de suministro del polipéptido.
Otra ventaja más de este dispositivo consiste
en que se puede fabricar con poca pérdida de ingrediente activo. Esto, desde luego, es útil para
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reducir el desperdicio de ingrediente activo. Inicialmente, con la fabricación se obtiene una incorporación de 80 % de material de partida de
ingrediente activo dentro del dispositivo, preferiblemente al menos de 90 %, y lo más preferiblemente en lo sustancial de 100 %.
Otra importante ventaja del dispositivo de liberación controlada de este invento se encuentra en la nueva estructura fı́sica de la matriz de
polı́mero y polipéptido. La matriz comprende
una dispersión, o microsuspensión, muy fina de
componentes solubles en agua en un polı́mero de
poli - lactida, en que sustancialmente todas las
partı́culas de agente activo y cualesquiera otros
componentes solubles en agua opcionalmente presentes tienen diámetros de 10 µm o menores.
Estas partı́culas están dispersadas uniforme y
discretamente a lo largo de todo el polı́mero,
proporcionando un dispositivo esencialmente homogéneo y monolı́tico. Igual a como ocurre con
los sistemas conocidos con anterioridad, el polipéptido biológicamente activo es liberado mediante una combinación de mecanismos de difusión y disolución según se va hidratando y posteriormente desgastando el dispositivo. No obstante, a diferencia de los conocidos sistemas de
matrices de carácter polı́mero que suministran
macromoléculas, el sistema de este invento no recurre a la formación de canales acuosos, o macroporos, en la matriz para la liberación de las
macromoléculas desde el sistema. Se sabe que el
requisito de que se formen macroporos, para que
se produzca la liberación del fármaco, da como
resultado un perfil de liberación trifásico caracterizado por una fase inactiva central, durante la
cual se libera poco o nada de fármaco. Puede haber también un perı́odo “muerto”, o inactivo, antes de la fase inicial de liberación del fármaco. En
contraste, puesto que el polipéptido y otros componentes solubles en agua de este invento están
presentes como partı́culas muy pequeñas y discretas dentro de la matriz de poli - lactida, no
se forman canales acuosos, y sólo se forman, caso
de que se formen, hasta relativamente tarde en
el perı́odo de liberación. Como resultado de ello,
se consigue un perfil de liberación muy regular,
que se puede hacer comenzar con un tiempo de
desfase inicial muy pequeño, y que es continuo
durante toda la vida del sistema.
Otro aspecto del invento reside en el uso de
un dispositivo dimensionado y conformado apropiadamente de las descripciones anteriores en un
método de administrar un agente activo de polipéptido macromolecular en un sitio del cuerpo
que es capaz de poner a disposición sus fluidos intracelulares y/o extracelulares para su absorción
por el implante. Otros aspectos del invento implican nuevos métodos de preparar los dispositivos
descritos y reivindicados en la presente memoria.
La Figura I es un gráfico de los datos obtenidos del ensayo descrito en el Ejemplo 3 y muestra
los perfiles de liberación de β - interferón a partir de sistemas de suministro de agentes activos,
implantados subcutáneamente en ratones durante
un perı́odo de tiempo de 60 a 100 dı́as. Los sistemas se prepararon de acuerdo con el invento, tal
como se describe en los Ejemplos 1 y 2.
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Definiciones
La expresión “polipéptido macromolecular activo biológicamente” se refiere a cualquier polipéptido que tenga un peso molecular no menor que aproximadamente 1.000 daltones, preferiblemente no menor que aproximadamente 2.500
daltones, que posea una útil actividad biológica
cuando se administre a un mamı́fero.
La frase “en que el polipéptido retiene por
lo menos aproximadamente 50 % de su actividad biológica” significa que quedará por lo menos
aproximadamente 50 % del potencial de actividad
biológica del polipéptido al terminarse la fabricación, según se determina dentro de la precisión
de un ensayo biológico para el polipéptido particular, tal como el descrito en el Ejemplo 5. Generalmente, el ensayo implicará reunir el material
original de polipéptido con una concentración de
polipéptido marcado radiactivamente, extraer el
polipéptido desde el sistema fabricado bajo condiciones suaves, y determinar tanto la radiactividad
relativa (cómputos por minuto y por ml) como las
unidades relativas por ml de actividad biológica,
del material original y del polipéptido extraı́do
en un ensayo biológico normalizado para el polipéptido. El ensayo biológico se realiza frente a
un patrón de referencia en pocillos de ensayo de
diluciones en serie de las muestras de polipéptidos
que se han de ensayar. Se establece un punto final
arbitrario para calificar los pocillos de ensayo, y
se utiliza el mismo punto final para calificar las
muestras de referencia. La actividad de las muestras de interferón se calcula basándose en el logaritmo de base 10 (log10 ) de las unidades por ml
de actividad biológica del equivalente de material
original para cada muestra extraı́da. Los sistemas
que caigan dentro del alcance de este invento demostrarán valores relativos de log10 de actividad
de polipéptidos que son la mitad, o mayores, que
las unidades de log10 por ml del material original
de polipéptido correspondiente. Las realizaciones
preferidas de este invento retienen por lo menos
aproximadamente 70 % del potencial biológico del
polipéptido después de la fabricación, más preferiblemente por lo menos 90 %, y lo más preferiblemente sustancialmente la totalidad del potencial
biológico.
La expresión “sustancialmente la totalidad de
las partı́culas de polipéptido y otros componentes
solubles en agua” se refiere a una cantidad de por
lo menos aproximadamente 75 % de las partı́culas
de componentes ası́ identificados, más apropiadamente por lo menos alrededor de 90 %.
La expresión “soluble en agua” se utiliza en
esta memoria para referirse a polipéptidos macromoleculares y otros componentes opcionales farmacéuticamente aceptables, que son por lo menos “muy ligeramente solubles” según la definición dada en la United States Pharmacopeia,
XX, página 1.121, es decir que tienen solubilidades en agua de al menos 0,1 - 1,0 mg/ml.
La expresión “micro - suspensión” se utiliza en
esta memoria descriptiva para describir partı́culas
de un polipéptido y otros componentes sólidos solubles en agua, sustancialmente todos los cuales
tienen diámetros de 10 µm o menores, que son dispersados uniforme y discretamente de modo sus-
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tancial por todo el polı́mero. La expresión “dispersado uniforme y discretamente” se utiliza para
indicar que las partı́culas no se tocan unas con
otras, sino que en vez de ello están rodeadas individualmente por el polı́mero y están espaciadas
de manera aproximadamente equidistante. La determinación del tamaño y de la distribución de las
partı́culas del polipéptido y de otros componentes
solubles en agua se puede hacer por un examen
en microscopio clásico tal como el descrito en el
Ejemplo 4, seguidamente. Con preferencia, todas
las partı́culas tendrán diámetros de 5 µm o menores, y más preferiblemente de 1 µm o menores.
La expresión “poli - lactida” se utiliza aquı́ en
un sentido genérico para describir tanto homopolı́meros como también copolı́meros derivados
de ácidos alfa - hidroxi - carboxı́licos, particularmente los ácidos α - hidroxi - acético (láctico) y
ácido α - hidroxi - propiónico (glicólico). Usualmente, se preparan a partir de los ésteres cı́clicos
de ácidos lácticos.
El presente invento consiste en la creación de
una matriz homogénea de una poli - lactida en la
que se ha incorporado una microsuspensión sustancialmente uniforme de un polipéptido macromolecular biológicamente activo. La matriz libera el polipéptido biológicamente activo cuando
se coloca en un sitio del cuerpo que puede poner a
disposición su fluido intracelular y/o extracelular
para la transferencia del mismo dentro del dispositivo. Según se vuelve hidratada la matriz, el polipéptido se libera por mecanismos de difusión y
desgaste. Puesto que los polipéptidos son solubles
en agua, el régimen de liberación está gobernado
por los regı́menes de hidratación y desgaste del
polı́mero, que posee el dispositivo.
El uso de copolı́meros de poli - lactidas proporciona la oportunidad de variar los regı́menes
de hidratación y desgaste de la matriz de polı́mero
mediante elección apropiada del tipo y de la
cantidad relativa de comonómero que se utiliza.
Algunos ejemplos ilustrativos de comonómeros
apropiados incluyen glicolida, β - propio - lactona,
tetra - metil - glicolida, β - butiro - lactona, 4 butiro - lactona, pivalo - lactona y ésteres cı́clicos
intermoleculares de ácido α - hidroxi - butı́rico,
ácido α - hidroxi - isobutı́rico, ácido α - hidroxi
- valérico, ácido α - hidroxi - isovalérico, ácido α
- hidroxi - caproico, ácido α - hidroxi - α - etil butı́rico, ácido α - hidroxi - isocaproico, ácido α
- hidroxi - 3 - metil - valérico, ácido α - hidroxi heptanoico, ácido α - hidroxi - octanoico, ácido α
- hidroxi - decanoico, ácido α - hidroxi - mirı́stico,
ácido α - hidroxi - esteárico y ácido α - hidroxi lignocérico.
Cualquiera de estos compuestos se puede utilizar en calidad de comonómero en la preparación
de polı́meros aceptables. Se puede utilizar la β butiro - lactona como el único monómero o como
el monómero principal junto con un apropiado
comonómero. No obstante, lo más preferido es
utilizar ácido láctico como el único monómero, o
como un copolı́mero con ácido glicólico en calidad de comonómero. La expresión poli - lactida
se utiliza en la presente memoria descriptiva para
referirse tanto a los polı́meros que se preparan
exclusivamente a partir del monómero de ácido
láctico como también a los que se preparan como
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copolı́meros con otros comonómeros del tipo antes enumerado. Las expresiones poli (lactida co - glicolida) y PLGA se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a
polı́meros que se preparan como copolı́meros de
ácido láctico y ácido glicólico.
Las unidades de α - hidroxi - ácido a partir
de las cuales se preparan los polı́meros preferidos
pueden ser las formas ópticamente activas (D y L)
o la forma ópticamente inactiva (DL, racémica).
Por ejemplo, el ácido láctico, independientemente
de que sea el único monómero o un componente
de comonómero, puede estar presente como ácido
D - láctico, ácido L - láctico, ácido DL - láctico, o
cualquier mezcla de los ácidos D - y L - lácticos.
Las combinaciones de monómeros y comonómeros preferidos que se pueden preparar
son numerosas, pero son máximamente útiles los
polı́meros preparados a partir de ácido láctico a
solas o a partir de ácido láctico y ácido glicólico
en donde el ácido glicólico está presente como un
comonómero en una relación molar de unidades
de lactida a glicolida de 100:0 a 30:70, preferiblemente de 100:0 a 40:60, por ejemplo de 75:25
a 40:60. Es sumamente preferido utilizar un copolı́mero de poli (lactida - co - glicolida) que tenga
una relación molar de lactida a glicolida entre
aproximadamente 75:25 y 50:50.
Los polı́meros de poli (lactida - co - glicolida)
variarán preferiblemente en cuanto al peso molecular desde aproximadamente 20.000 hasta aproximadamente 100.000 daltones, expresado como
un promedio. El peso molecular de un copolı́mero
particular es independiente de su constitución de
monómeros. Por ejemplo, el copolı́mero 50:50
preferido puede tener un peso molecular que caiga
en cualquier lugar dentro de este margen.
El invento comprende el uso de polı́meros que
se hacen variar tanto en cuanto a su composición
de monómeros como en cuanto a su peso molecular, incluyendo los que están fuera de las composiciones y márgenes preferidos que se dan con
anterioridad, con tal de que el polı́mero sea capaz
de formarse como un material sólido.
Para las finalidades de este invento, el peso
molecular de un polı́mero particular se determina
en función de su viscosidad intrı́nseca, medida en
un viscosı́metro capilar utilizando cloroformo o
hexa - fluoro - isopropanol a 30◦C. Las viscosidades intrı́nsecas de las poli - lactidas apropiadas
para utilizarse en este invento varı́an entre aproximadamente 0,2 dl/g y aproximadamente 1,5 dl/g,
y están preferiblemente en el margen de aproximadamente 0,33 a 1,0 dl/g. (Todas las viscosidades dadas seguidamente en esta memoria se midieron en hexa - fluoro - isopropanol).
Los métodos para preparar poli - lactidas
están bien probados documentalmente en la bibliografı́a cientı́fica y de patentes. Las siguientes patentes proporcionan descripciones detalladas de poli - lactidas apropiadas, sus propiedades
fı́sicas y métodos para prepararlas: documentos
de patente U.S. 3.773.919, U.S. 4.293.539, U.S.
3.435.008, U.S. 3.442.871, U.S. 3.468.853, U.S.
3.597.450, U.S. 3.781.349, U.S. 3.736.646 y de patente europea N◦ 0.052.510.
Los polipéptidos macromoleculares que se
pueden incorporar en el dispositivo de este in5
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vento son moléculas biológicamente activas que
tienen pesos moleculares mayores que aproximadamente 1.000, apropiadamente mayores que
aproximadamente 2.500, preferiblemente situados entre aproximadamente 6.000 y 500.000, y
más preferiblemente mayores que aproximadamente 10.000, los más preferiblemente mayores
que aproximadamente 15.000. La elección de
los polipéptidos que se pueden suministrar de
acuerdo con la práctica de este invento está limitada solamente por el requisito de que étos
han de ser por lo menos muy ligeramente solubles en un medio fisiológico acuoso tal como un
plasma, un fluido intersticial y los fluidos intracelulares y extracelulares del espacio subcutáneo
y de los tejidos de mucosas. La expresión “muy
ligeramente soluble” se refiere a una solubilidad
en agua de por lo menos aproximadamente 0,1 1,0 mg/ml, como se define anteriormente en esta
memoria descriptiva.
Clases ilustrativas de polipéptidos incluyen,
entre otros, proteı́nas, enzimas, nucleoproteı́nas,
glicoproteı́nas, lipoproteı́nas, polipéptidos hormonalmente activos, y compuestos análogos
sintéticos que incluyen agonistas y antagonistas
de estas moléculas.
Las clases de proteı́nas que son apropiadas
para utilizarse en este invento son numerosas,
incluyendo inmunomoduladores, linfoquinas, monoquinas, citoquinas, enzimas, anticuerpos, promotores del crecimiento, factores inhibidores del
crecimiento, proteı́nas sanguı́neas, hormonas, vacunas (incluyendo antı́genos vı́ricos, bacterianos,
parásitos y ricketsianos), factores de coagulación
de la sangre y similares, incluyendo diversas formas de proteı́nas precursoras, muteı́nas y otros
compuestos análogos. Asimismo se incluyen los
anticuerpos.
Ejemplos especı́ficos de polipéptidos apropiados para su incorporación en el sistema de suministro de este invento incluyen las siguientes macromoléculas biológicamente activas y muteı́nas
y otros análogos de las mismas: interferones
(α -, β -, γ - interferones y muteı́nas de los mismos tal como β ser17 ), factores estimuladores de
colonias (1, 2, 3, GM, α, β, γ y similares, interleuquinas (IL - 1, IL - 1α , IL - 1β , IL - 2,
IL - 3, IL - 4, IL - 5 y similares), factores activadores de macrófagos, péptidos de macrófagos,
factores de células B (factor de crecimiento de
células B y similares), factores de células T,
proteı́na A, factor supresor de alergia, factores
supresores, glicoproteı́na citotóxica, agentes inmunocitotóxicos, inmunotoxinas, polipéptidos inmunoterapéuticos, linfotoxinas, factores de necrosis de tumores (α -, β - y similares) caquectina, oncostatinas, factores inhibidores de tumores, factores de crecimiento transformadores tales como TGF - α y TGF - β), albúmina, alfa
- 1 - anti - tripsina, apolipoproteı́na - , factores potenciadores de eritroides, eritropoyetina,
factor VII, factor VIII (c), factor IX, agente fibrinolı́tico, hemopoyetina - 1, activador de plasminógeno de riñones, activador de plasminógeno
de tejidos, uroquinasa, pro - uroquinasa, estreptoquinasa, lipocortina, lipomodulina, macrocortina, proteı́na tensioactiva de pulmones, proteı́na
C, proteı́na 5, proteı́na C - reactiva, inhibidores
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de renina, inhibidores de colagenasa, superóxido dismutasa, factor de crecimiento epidérmico, hormona de crecimiento, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento osteogénicos, factor naturético atrial, auriculina,
atriopeptina, proteı́na morfogénica de huesos, calcitonina, precursor de calcitonina, péptido relacionado con genes de calcitonina, factor inductor de cartı́lagos, proteı́na de activador de tejido
conjuntivo, hormonas de fertilidad (hormona estimuladora de folı́culos, hormona luteinizante, gonadotropina coriónica humana), factor de liberación de hormona de crecimiento, proteı́na osteogénica, insulina, proinsulina, factor de crecimiento de los nervios, hormona paratiroides, inhibidores de hormona paratiroides, relaxina, secretina, somatomedina C, factores de crecimiento similares a insulina, inhibina, hormona adrenocorticotrópica, glucagón, polipéptido intestinal vasoactivo, péptido inhibidor gástrico, motilina, colecistoquinina, polipéptido pancreático, péptido
liberador de gastrina, factor de liberación de corticotropina, hormona estimuladora de tiroides,
antı́genos de vacunas incluyendo antı́genos de
HTLV - I, II, virus de SIDA tales como HTLV
- III/LAV/HIV y HIV - 2, citomegalovirus, virus de hepatitis A, B y no - A/no - B, virus de
herpes simplex - I, virus de herpes simplex - II,
malaria, pseudorrabia, retrovirus, virus de leucemia de felino, virus de leucemia de bovino, virus
de gastroenteritis transmisible, renotraqueı́tis de
bovino infecciosa, parainfluenza, influenza, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus de varicela zoster, virus de Epstein - Barr, pertussis y
anticuerpos anti - infecciosos que incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales para bacterias gram - negativas, pseudomonas, endotoxina,
toxina de tétano, y otros organismos bacteriales
o virales o infecciosos de otro tipo. También se
incluye el inhibidor de proteasa.
Las listas de polipéptidos macromoleculares
citadasanteriormente se proporcionan solamente
para ilustrar los tipos de agentes activos que son
apropiados para utilizarse en la práctica del invento, y no se pretende que sean exclusivas.
Una clase particularmente preferida de polipéptidos la constituyen los interferones presentes en la naturaleza y los sintéticos. Los interferones son polipéptidos que tienen pesos moleculares
de monómeros en el intervalo aproximadamente
15.000 a aproximadamente 28.000. Son proteı́nas
que son sintetizadas por células de mamı́feros
como respuesta a una infección por virus, una estimulación inmune y otros factores. Actualmente
son designados como miembros de una de tres
clases principales: interferón alfa o de leucocitos
(IFN - α), interferón beta o de fibroblastos (IFN
- β), e interferón gamma o inmune (IFN - γ).
Sus propiedades biológicas incluyen actividades
antivı́ricas, anti - proliferativas e inmunomoduladoras que han conducido a su uso clı́nico como
agentes terapéuticos para el tratamiento de infecciones vı́ricas y enfermedades malignas.
Los interferones se pueden obtener a partir de
fuentes naturales tales como leucocitos, células
linfoblastoides en suspensión o cultivo continuos,
y cultivos de fibroblastos. Los linfocitos T se pueden estimular para producir interferón gamma.
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El interferón β se deriva de células de mamı́feros
tales como células de fibroblastos. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “β - interferón” o “IFN - β” incluye β - interferón derivado
tanto de fuentes naturales incluyendo las de seres humanos, animales bovinos, caninos, felinos,
porcinos y equinos, y por técnicas de ADN recombinante. Incluye también formas modificadas de
β - interferón; por ejemplo por glicosilación, metilación, sustitución y/o deleción de un número
limitado de aminoácidos. Tal como se utiliza en
esta memoria descriptiva, “HuIFN - β” se refiere
a β - interferón humano y “rHuIFN - β” se refiere
a un HuIFN - β producido utilizando técnicas recombinantes. El IFN - β ser−17 se refiere a un β
- interferón en que el aminoácido decimoséptimo
ha sido reemplazado por serina.
Las concentraciones de los interferones se expresan comúnmente como “unidades normalizadas” que están aceptadas y documentadas internacionalmente, y se refieren a la potencia de una
cantidad dada de interferón que inhibe la replicación de los virus bajo condiciones normalizadas.
El IFN - β ser−17 , que es un compuesto conocido, se produce óptimamente modificando secuencias de ADN que codifican IFN - β, y luego
manipulando microorganismos para expresar el
ADN modificado como una proteı́na. Cuando la
primera base del codón 17 (timina) de la cadena
de sentido de la secuencia de ADN que codifica el
IFN - β maduro es reemplazada por adenina, el
residuo de cisteı́na en la posición 17 de la secuencia de aminoácidos de IFN - β es reemplazado por
serina. Cambiando la T por otras bases, y cambiando por otras bases en el codón 17, la cisteı́na
puede ser reemplazada por otros aminoácidos. La
mutagénesis especı́fica de un sitio es inducida utilizando un iniciador de nucleótido 17 sintético
que tiene la secuencia GCAATTTTCAGAGTCAG que es idéntico a una secuencia de nucleótido decimoséptimo de la cadena de sentido
de IFN - β en la región del codón 17, excepto
una falta de apareamiento de una única base en
la primera base del codón 17. (Como se utiliza en
este contexto en la presente memoria descriptiva,
C es desoxicitidina, T es desoxitimidina, A es desoxiadenosina y G es desoxiguanosina). La falta
de apareamiento se encuentra en el nucleótido 12
en el iniciador. El 17 - mero es hibridado con un
ADN de fago M13 monocatenario que lleva la cadena antisentido del gen de IFN - β. El iniciador
de oligonucleótido es luego prolongado en el ADN
utilizando el fragmento Klenow de polimerasa I de
ADN (un fragmento de polimerasa I de ADN que
carece de la subunidad de 5’ - exonucleasa) y el
ADN bicatenario (dsADN) resultante es convertido en ADN circular cerrado con ligasa de T4 .
La replicación del heteroduplex mutacional resultante proporciona clones procedentes de la cadena
de ADN que contiene la falta de apareamiento.
Los clones mutantes se pueden identificar y explorar en cuanto a la aparición o desaparición de
sitios de restricción especı́ficos, resistencia a antibióticos o sensibilidad a antibióticos, o por otros
métodos conocidos en la técnica. Cuando se reemplaza la cisteı́na por serina, la sustitución de T
por A da como resultado la creación de un nuevo
sitio de restricción con Hinf1 en el gen estructu-
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ral. (Un sitio de restricción es un lugar en una
secuencia de ADN que es reconocido y disociado
por una enzima de restricción particular. Un sitio de restricción por Hinf1 es un sitio de restricción reconocido por la endonucleasa Hinf1). El
clon mutante es identificado utilizando el iniciador de oligonucleótidos como una sonda en una
exploración por hibridación de las placas de fagos mutadas. El iniciador tendrá una única falta
de apareamiento cuando se hibride con el ADN
de fago progenitor, pero tendrá un apareamiento
perfecto cuando se hibride con el ADN de fago
mutado. Se pueden desarrollar entonces condiciones de hibridación en las que el iniciador de
oligonucleótido se hibridará preferentemente con
el ADN mutado pero no con el ADN progenitor.
El sitio Hinf1 acabado de generar sirve también
como un medio de confirmar la mutación de una
única base en el gen de IFN - β.
El ADN de fago M13 que lleva el gen mutado
es aislado y empalmado dentro de un vector de
expresión apropiado tal como el plásmido pTrp3,
y un hospedante, tal como E. coli cepa MM294,
es transformado a continuación con el vector.
Métodos de crecimiento apropiados para cultivar
los transformantes y su progenie son conocidos
para los expertos en la técnica. La muteı́na expresada (proteı́na que se deriva de un gen mutado)
de IFN - β se aı́sla, purifica y caracteriza.
Una descripción adicional de este método para
sintetizar IFN - β puede hallarse en el documento
de patente U.S. n◦ 4.518.814. El documento
de patente U.S. n◦ 4.518.584 describe también
muteı́nas de IFN - β e interleuquina - 2, y enseña
métodos para prepararlas.
Las técnicas de ADN recombinante para producir interferones de las clases α y γ, ası́ como
muteı́nas de interferones, son también conocidas.
Nagata et al., en Nature 284: 316 - 320 (1.980),
enseñan un método para preparar bacterias que
expresan α - interferón. Se puede producir γ - interferón por el método descrito en el documento
de patente europea EP - A 0.138.087 y la correspondiente solicitud de patente U.S. n◦ de serie
534.04, presentada el 20 de Septiembre de 1.983,
cuyas enseñanzas se incorporan a la presente memoria como referencia.
Además de incorporar uno o más polipéptidos
macromoleculares biológicamente activos, el dispositivo de liberación controlada de este invento puede contener otros componentes farmacéuticamente aceptables, que sean solubles en
agua. Los componentes solubles en agua opcionales, que se pueden incorporar en la matriz de poli
- lactida, están presentes como partı́culas que tienen diámetros de aproximadamente 10 µm o menores. Si están presentes, son ı́ntimamente mezclados con los polipéptidos macromoleculares, y
están dispersados uniforme y discretamente a lo
largo de todo el polı́mero.
La mayor parte de los polipéptidos macromoleculares se benefician de la presencia de pequeñas cantidades de estabilizadores, tamponadores, sales y similares. Componentes solubles
en agua, que pueden ser útiles en la práctica de
este invento, incluyen, pero no están limitados a,
otros agentes activos, otras proteı́nas u otros polipéptidos, estabilizadores, hidratos de carbono,
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tamponadores, sales, agentes tensioactivos y plastificantes. Ejemplos de estabilizadores apropiados
incluyen albúmina de suero humano (HSA), gelatina, dextrosa y otros hidratos de carbono. Ejemplos de otros hidratos de carbono apropiados para
su incorporación en este invento incluyen sacarosa, maltosa, manosa, glucosa, fructosa, lactosa,
sorbitol y glicerol. Apropiados agentes tensioactivos incluyen los Tween (por ejemplo Tween 20, Tween - 80), polioles Pluronic(R) tales como
Pluronic(R) L101, L121 y F127 (veánse las obras
clásicas tales como el Merck Index 10a
¯ edición
para más detalles acerca de estos agentes tensioactivos bien conocidos). Entre los apropiados plastificantes están los poli - etilenglicoles,
glicéridos y etil - celulosa.
Las proporciones relativas de polipéptido macromolecular y otros componentes solubles en
agua a poli - lactida y componentes insolubles en
agua dentro de la matriz, se pueden hacer variar
dependiendo del polipéptido que tenga que ser administrado y del régimen y de la duración de liberación que se deseen. El agente activo macromolecular y otros componentes solubles en agua
pueden constituir hasta aproximadamente 30 por
ciento en peso del sistema. La cantidad exacta
dependerá de factores tales como la potencia del
agente activo particular, de su comportamiento
fı́sico - quı́mico y farmacocinético, de su estabilidad y de la duración deseada de liberación.
Una composición preferida para la matriz de
poli - lactida comprende, en peso:
(a) 97,47 por ciento de poli (lactida - co - glicolida) que tiene una relación molar de 50:50
y una viscosidad intrı́nseca de aproximadamente 0,64 dl/g;
5
El presente invento es bien idóneo para el suministro controlado de interferones. La cantidad
de interferón incorporado en la matriz de poli
- lactida será preferiblemente de 20 %, o menos, dependiendo del interferón particular y de
los otros factores que se enumeran con anterioridad. Una composición actualmente preferida
comprende, en peso:
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(a) de 90 a 99,999 % de poli - lactida; y
(b) de 0,001 a 2 % de HuIFN - β
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y puede incluir hasta aproximadamente 10 % de
otros componentes solubles en agua.
Una composición más preferida comprende, en
peso
(a) de 95 a 99,9 por ciento en peso de poli lactida,
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(b) de 0,01 a 0,1 por ciento de HuIFN - β
y puede incluir hasta aproximadamente 5 % de
otros componentes solubles en agua.
Una composición particularmente preferida
comprende, en peso:
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(b) 0,03 por ciento de HuIFN - β;
(c) 1,25 por ciento de albúmina de suero humano; y
(a) de 80 a 99,9999 % de poli - lactida; y
(b) de 0,0001 a 20 % de un polipéptido macromolecular biológicamente activo y otros
componentes solubles en agua opcionales.
Para polipéptidos muy activos, la cantidad
total de polipéptido y otros componentes solubles en agua puede ser tan reducida como
10 %, 5 %, 2 % o menos del peso total de la
matriz.
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65
(d) 1,25 por ciento de dextrosa.
El interferón preferido para su incorporación
en los precedentes sistemas es rHuIFN - β ser17 .
Métodos de preparación
Los sistemas de suministro de este invento se
pueden fabricar por cualquier método que consiga
la deseada conformación de microsuspensiones y
mantenga sustancialmente la actividad biológica
del polipéptido macromolecular. Un método preferido implica moldear por rociado y colada una
microsuspensión del polipéptido en una solución
de la poli - lactida. El quı́mico experto abarcará
diversos métodos, mediante los cuales se pueda
preparar la microsuspensión. Se describen seguidamente dos métodos nuevos y útiles. (Un experto apreciará que se pueden utilizar disolventes
distintos de acetona y di - cloruro de metileno,
con tal de que la proteı́na sea compatible con el
disolvente e insoluble en el mismo).
Método de la acetona
Una solución acuosa tamponada del polipéptido macromolecular y otros componentes
opcionales solubles en agua y tamponadores se
añade a una solución de la poli - lactida escogida en acetona a temperatura ambiente. La mezcla resultante es vorticada a alta velocidad utilizando un mezclador vortical de laboratorio normalizado durante aproximadamente 5 a 120, preferiblemente alrededor de 10 segundos. Se forma
un precipitado del polı́mero, polipéptido y los
otros componentes, que luego se centrifuga durante aproximadamente 0,5 a 30 minutos, preferiblemente alrededor de 10 minutos, a 500 hasta
1.000, preferiblemente 700 x g. el material sobrenadante resultante de acetona y agua se elimina, se añade acetona adicional, y la mezcla se
somete a vorticación a alta velocidad hasta que el
polı́mero, por ejemplo PLGA, existente en el sedimento, se disuelva, dejando una microsuspensión
de polipéptido y otros componentes solubles en
agua en la solución del polı́mero en acetona.
Método del dicloruro de metileno
Una solución acuosa tamponada del polipéptido y otros componentes solubles en agua
opcionales se añade a una solución de la poli lactida escogida en di - cloruro de metileno. La
mezcla resultante es vorticada durante aproximadamente 10 a 180 segundos, preferiblemente durante alrededor de 60 segundos, a alta velocidad,
hasta que se forme una emulsión de color blanco.
Inmediatamente, la emulsión es transferida a un
pulverizador de aire comprimido u otro dispositivo rociador apropiado y se moldea por rociado
y colada tal como se describe seguidamente.
Formación de los sistemas de suministro de
agentes activos
Los sistemas de suministro de agentes activos
de este invento se forman de manera tal que el
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producto sólido final de polipéptido y matriz de
poli - lactida posea la requerida morfologı́a de microsuspensión, en la que sustancialmente la totalidad de las partı́culas del polipéptido y otros componentes solubles en agua tienen diámetros de 10
µm o menores y están dispersados uniforme y discretamente a lo largo de toda la matriz. Para asegurar que la microsuspensión lı́quida de componentes solubles en agua en la solución de polı́mero
no experimente coalescencia para formar una suspensión de partı́culas mayores después de solidificación de la formulación, es preferible rociar y
colar la microsuspensión sobre una superficie no
pegajosa con un pulverizador de aire comprimido
u otro dispositivo apropiado utilizando condiciones idóneas. El pulverizador de aire comprimido
es sostenido a aproximadamente 10 a 15 cm desde
la superficie de la lámina y la pelı́cula es rociada
con un movimiento constante para conseguir una
pelı́cula uniforme. Superficies no pegajosas apropiadas incluyen las de polipropileno, teflon, nilon,
polietileno o derivados de los mismos, y otros materiales con similares propiedades no pegajosas.
Se prefieren polipropileno, teflon y polietileno. La
pelı́cula moldeada por rociado y colada se puede
hacer tan delgada como aproximadamente 5 µm y
tan gruesa como 1.000 µm. Para pelı́culas de grosor mayor que aproximadamente 100 µm, es preferible dejar algún tiempo para secar entre operaciones repetidas de rociado y colada de capas.
Pelı́culas más delgadas (alrededor de 10 a 50 µm)
son preferidas cuando es deseable minimizar la
exposición del polipéptido al disolvente orgánico.
En general, la pelı́cula resultante deberá dejarse
secar por completo antes de ser configurada a
la forma del dispositivo o sistema de liberación
controlada final. Dependiendo del grosor de la
pelı́cula, el tiempo de desecación para conseguir
la sequedad completa variará desde menos de una
hora hasta aproximadamente tres dı́as, y se puede
acortar si se desea secando bajo vacı́o después de
que la matriz se haya solidificado hasta el punto
en que no se provoquen burbujas.
Para muchos polipéptidos, la inyección parenteral es la vı́a preferida de administración. La
formulación de polipéptido y matriz de poli - lactida de este invento se puede preparar en una
forma inyectable atomizando las microsuspensión
lı́quida y secando las micropartı́culas resultantes
en una contracorriente o en un vórtice de aire o de
un gas inerte. Las partı́culas resultantes se pueden inyectar directamente, o se pueden incorporar
en una solución o suspensión inyectable compatible y farmacéuticamente aceptable.
Los sistemas de suministro controlado de este
invento se pueden reforzar estructuralmente con
un material inerte, farmacéuticamente aceptable,
tal como malla fina de seda, malla de teflon u
otro material quirúrgicamente inerte. Es especialmente ventajoso incorporar un material de refuerzo cuando se prevea que el dispositivo de liberación controlada necesite ser recuperado de su sitio de suministro activo. Se pueden producir dispositivos reforzados rociando la microsuspensión
de polipéptido y poli - lactida sobre el material de
refuerzo que está descansando preferiblemente sobre una superficie no pegajosa. Luego se deja que
la pelı́cula se seque brevemente y se puede invertir
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de posición y rociar por la otra cara. Este proceso se repite hasta que se consiga una pelı́cula
del grosor deseado. Preferiblemente, la textura
del material de refuerzo será cubierta completamente por una capa lisa del polı́mero.
La pelı́cula de carácter polı́mero, obtenida
mediante moldeo por rociado y colada como se
describe anteriormente, se puede configurar a la
forma de cualquier artı́culo sólido apropiado para
el sitio pretendido de uso. Por ejemplo, la pelı́cula
puede ser cortada en trozos de dimensiones conocidas y se puede implantar subcutáneamente
como segmentos individuales.
Alternativamente, la pelı́cula puede ser enrollada a la forma de un dispositivo cilı́ndrico de dimensiones deseadas. Capas múltiples de pelı́cula
pueden ser estratificadas y cortadas en matriz
para crear dispositivos que tengan virtualmente
cualquier tamaño y cualquier forma. La integridad de las capas se puede asegurar por ligero rociado o cepillado entre una estratificación de capas con un disolvente apropiado para el polı́mero
o una exposición a un vapor de disolvente.
Los dispositivos de liberación controlada de
este invento se pueden diseñar para suministrar el polipéptido macromolecular biológicamente activo, y cualesquiera agentes activos
acompañantes, a un régimen controlado durante
un perı́odo de tiempo prolongado que varı́a desde
menos de un dı́a hasta varios meses. Ejemplos de dispositivos que suministraron niveles terapéuticamente útiles de β - interferón por vı́a
subcutánea durante un perı́odo de 60 a 100 dı́as,
se describen en los Ejemplos 1 y 2 y se muestran
en la Figura I. El régimen y la duración reales
de liberación se pueden hacer variar dentro de la
práctica de este invento mediante la elección de
un polı́mero de poli - lactida (por ejemplo elección
de un monómero o de comonómeros, relación molar y viscosidad intrı́nseca) o de un copolı́mero,
mediante la forma y configuración del dispositivo
(por ejemplo plana, enrollada, capa única o capa
múltiple) y en una menor extensión, por la cantidad de agente activo que se incorpore.
La cantidad de agente activo que se ha incorporado en el dispositivo puede variar entre 0,0001
y 30 por ciento en peso del sistema de carácter
polı́mero. La cantidad óptima para cualquier sistema dado dependerá de la potencia del agente,
del efecto fisiológico deseado, de la longitud pretendida del tratamiento, y del régimen de liberación del agente activo. Preferiblemente, los dispositivos de este invento contienen aproximadamente de 0,0001 a 20 por ciento en peso del polipéptido macromolecular.
El tamaño del dispositivo dependerá similarmente de la cantidad de agente activo que éste
contenga, de su régimen de liberación y de la duración pretendida del tratamiento. Por ejemplo,
si se sabe que una formulación particular de polipéptido y poli - lactida libera el polipéptido a
un régimen promedio de 106 unidades por dı́a, y
que la duración deseada del tratamiento es de 60
dı́as, el dispositivo requerirá una carga de por lo
menos 6 x 107 unidades de polipéptido. Basado
en el porcentaje en peso del polipéptido en el sistema, se puede calcular el tamaño requerido del
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dispositivo.
Las siguientes preparaciones y los siguientes
ejemplos se proporcionan para ilustrar con más
detalle la práctica de este invento, y no se pretende que limiten de ninguna manera su alcance.
Preparación 1
Clonación del gen de IFNβ en el vector M13:
El uso del vector de fago M13 como una fuente
de plantilla de ADN monocatenario ha sido demostrado por G.F. Temple et al. Nature (1.982)
296:537 - 540. El plásmido pβtrp que contiene
el gen de IFN - β, bajo control del promotor trp
de E. coli se digiere con las enzimas de restricción HindIII y XhoII. El ADN de forma replicativa (RF) de M13mp8 (J. Messing, “Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA” (Tercer Simposio de Cleveland acerca
de macromoléculas: ADN recombinante), redactor A. Walton, Elsevier Press, 143 - 153 (1.981) )
se digiere con las enzimas de restricción HindIII y
BamHI y se mezcla con el ADN de pβ1trp que ha
sido digerido previamente con HindIII y XhoII.
Luego la mezcla es ligada con ligasa de ADN de
T4 y el ADN ligado es transformado en el seno de
células competentes de E.coli cepa JM 103 y es
extendido y cultivado sobre planchas de indicador de Xgal (J. Messing et al., Nucleic Acids Res
(1.981) 9:309 - 321). Las placas que contienen el
fago recombinante (placas blancas) son recogidas,
seleccionadas, inoculadas en un cultivo reciente
de JM 103 y se producen minipreparaciones de
moléculas de la RF a partir de las células infectadas (H.D. Birnboim and J. Doly, Nucleic Acid
Res. (1.979) 7:1.513 - 1.523). Las moléculas de la
RF son digeridas con diversas enzimas de restricción para identificar los clones que contienen el
inserto de IFN - β. El ADN monocatenario (ss)
de fago se prepara a partir del clon de M13 - β1
para servir como plantilla para la mutagénesis especı́fica de un sitio, utilizando un oligonucleótido
sintético.
Preparación 2
Mutagénesis especı́fica de un sitio
Se tratan cuarenta picomoles del oligonucleótido sintético GCAATTTTCAGAGTCAG
(iniciador) con quinasa de T4 en presencia de tri fosfato de adenosina (ATP) 0,1 mM, hidrocloruro
de hidroxi - metil - amino - metano (Tris - HCl) 50
mM de pH 8,0, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT)
5 mM y 9 unidades de quinasa de T4 , en 50 µl
a 37◦C durante 1 hora. El iniciador quinasado
(12 picomoles) es hibridado con 5 µg de ADN ss
de M13 - β1 en 50 µl de una mezcla que contiene
NaCl 50 mM, Tris - HCl 10 mM de pH 8,0, MgCl2
10 mM y β - mercapto - etanol 10 mM calentando
a 67◦C durante 5 minutos y a 42◦C durante 25
minutos. La mezcla combinada es luego enfriada
sobre hielo y añadida seguidamente a 50 µl de una
mezcla de reacción que contiene sendos 0,5 mM
de cada uno de los tri - fosfatos de desoxi - nucleótidos (dNTP), Tris - HCl 80 mM de pH 7,4,
MgCl2 8 mM, NaCl 100 mM, 9 unidades de fragmento Klenow de polimerasa I de ADN, ATP 0,5
mM, y 2 unidades de ligasa de ADN de T4 , e incubada a 37◦ C durante 3 horas y a 25◦ C durante 2
horas. Luego la reacción se termina mediante extracción con fenol y precipitación con etanol. El
ADN se disuelve en Tris - HCl 10 mM de pH 8,0,
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ácido etileno - diamina - tetra - acético (EDTA)
10 mM, sacarosa al 50 % y azul de bromo - fenol
al 0,05 % y luego se somete a electroforesis sobre
un gel de agarosa al 0,8 % en presencia de 2 µg/ml
de bromuro de etidio. Las bandas de ADN que
corresponden a las formas de RF de M13 - β1 son
eluidas a partir de rodajas de gel por el método
del per - clorato (R.W. Davis et al., “Advanced
Bacterial Genetics” Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., páginas 178 - 179 (1.980) ). El ADN
eluido se utiliza para transformar célula JM 103
competentes, se hace crecer durante una noche,
y se aı́sla ADN monocatenario (ss) a partir del
material sobrenadante del cultivo. Este ADN ss
se utiliza como plantilla en un segundo ciclo de
prolongación del iniciador, las formas de RF purificadas en gel del ADN son transformadas en el
seno de células JM 103 competentes, son extendidas y cultivadas sobre planchas de agar e incubadas durante una noche para obtener placas de
fago.
Preparación 3
Exploración e identificación de placas mutagenizadas
Planchas que contienen placas de M13 - β1
mutadas ası́ como dos planchas que contienen placas de fago M13 - β1 no mutadas son enfriadas
profundamente a 4◦ C, y placas procedentes de
cada plancha son transferidas sobre dos cı́rculos
de nitro - celulosa, estratificando un filtro seco
sobre la plancha de agar durante 5 minutos para
el primer filtro y durante 15 minutos para el segundo filtro. A continuación, los filtros son colocados sobre papeles de filtro gruesos empapados
con NaOH 0,2 N, NaCl 1,5 M y Triton X - 100
al 0,2 % durante 5 minutos, y son neutralizados
estratificando sobre papeles de filtro empapados
con Tris - HCl 0,5 M de pH 7,5 y NaCl 1,5 M durante otros 5 minutos. Los filtros son lavados de
una manera similar dos veces sobre filtros empapados en 2xSSC (citrato - solución salina patrón),
son secados y luego cocidos en un horno de vacı́o
a 80◦ C durante 2 horas. Los filtros duplicados
son prehibridados a 55◦C durante 4 horas con 10
ml por filtro de tampón de hibridación de ADN
(5xSSC de pH 7,0, 4 x solución de Denhardt (poli
(vinil - pirrolidina), ficoll y albúmina de suero de
bovino, 1x = 0,02 % de cada uno), dodecil - sulfato de sodio (SDS) al 0,1 %, tampón de fosfato de
sodio 50 mM de pH 7,0 y 100 µg/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado. Una sonda
marcada con 32 P se prepara quinasando el iniciador de oligonucleótido con ATP marcado con 32 P.
Los filtros son hibridados a 3,5 x 105 cpm/ml de
iniciador marcado con 32 P en 5 ml por filtro de
tampón de hibridación de ADN a 55◦ C durante
24 horas. Los filtros son lavados a 55◦ C cada vez
durante 30 minutos en tampones de lavado que
contienen SDS al 0,1 % y cantidades decrecientes
de SSC. Los filtros son lavados inicialmente con
un tampón que contiene 2xSSC y los filtros testigos que contienen placas de M13 - β1 no mutadas
son comprobados en cuanto a la presencia de cualquier radiactividad. La concentración de SSC es
disminuida escalonadamente y los filtros son lavados hasta que no queda ninguna radiactividad
detectable sobre los filtros testigos con las placas
2 039 437
19
de M13 - β1 no mutadas. Los filtros son secados
en aire y autorradiografiados a - 70◦ C durante 2
- 3 dı́as.
Preparación 4
Expresión de IFN - β1 mutado en E. coli
ADN de RF procedente de M13 - SY2501 se
digiere con las enzimas de restricción HindIII y
XhoII y el fragmento de inserto de 520 pb (pares
de bases) se purifica sobre un gel de agarosa al
1 %. El plásmido pTrp3, que contiene el promotor de trp de E. coli, se digiere con las enzimas
HindIII y BamHI, se mezcla con el fragmento de
ADN M13 - SY2501 y se liga en presencia de ligasa de ADN de T4 . El ADN ligado es transformado en el seno de E. coli cepa MM294. Los
transformantes resistentes a ampicilina son explorados en cuanto a sensibilidad al fármaco tetraciclina. Los ADN’s de plásmidos procedentes de
cinco clones resistentes a ampicilina y sensibles a
tetraciclina, se digieren con Hinf1 para explorar
en cuanto a la presencia del inserto M13 - SY2501.
El plásmido designado como pSY2501 de clon
está disponible de la colección Agricultural Research Culture Collection (Colección de cultivo
de investigación agrı́cola) (NRRL) Laboratorio
de Fermentación, Centro de Investigación Regional del Norte, Administración de Ciencia y Educación, Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de América, 1815 North University
Street, Peoria, Illinois, 60604, y se le asignan los
números de llegada CMCC N◦ 1533 y NRRL N◦
B - 15356.
Los cultivos de pSY2501 y pβltrp se hacen
crecer hasta conseguir una densidad óptica a 600
nanómetros (DO600 ) de 1,0. Se preparan extractos exentos de células y la cantidad de la actividad
antivı́rica de IFN - β se ensaya en células GM2767
(de mamı́fero) en un ensayo de microtitulación.
Preparación 5
Purificación de IFN - β ser17 :
Se recupera IFN - β ser17 a partir de células de
E. coli que han sido transformadas para producir
IFN - β ser17 . Las E. coli se hacen crecer en el
siguiente medio de crecimiento hasta alcanzar una
DO de 10 - 11 a 680 nm (peso en seco 8,4 g/l).
Ingrediente
NH4 Cl
K2 SO4
KH2 PO4
Na2 HPO4
MgSO4 .7H2 O
Na2 citrato.2H2 O
MnSO4 .4H2 O
ZnSO4 .7H2 O
CuSO4 .5H2 O
L - triptófano
FeSO4 .7H2 O
tiamina.HCl
glucosa
el pH se controla
con NH4 OH.
Concentración
20 mM
16,1 mM
7,8 mM
12,2 mM
3 mM
1,5 mM
30 µM
30 µM
3 µM
70 mg/l
72 µM
20 mg/l
40 g/l
Una cosecha de 9,9 l (9,9 kg) de las E. coli
transformadas se enfrı́a a 20◦ C y se concentra ha-
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ciendo pasar la cosecha a través de un filtro de
flujo cruzado con una caı́da de presión media de
110 kPa y con un caudal de material filtrado en estado permanente de 260 ml/min hasta que el peso
del material filtrado sea de 8,8 kg. El concentrado
(aproximadamente un litro) es drenado dentro de
un recipiente y enfriado a 15◦C. Las células existentes en el material concentrado son luego rotas haciendo pasar el concentrado a través de un
homogeneizador Mason - Gaulin a 5◦ C y 69.000
kPa. El homogeneizador es lavado con un litro de
solución salina tamponada con fosfato (PBS) de
pH 7,4, y el material lavado es añadido al material
roto para dar un volumen final de dos litros. Este
volumen es centrifugado continuamente a 12.000
xg a un caudal de 50 ml/min. El sólido es separado del material sobrenadante y vuelto a suspender en cuatro litros de PBS que contiene 2 % en
peso de SDS. Esta suspensión es agitada a temperatura ambiente durante 15 minutos, después de
lo cual no deberı́a haber material suspendido visible. A continuación la solución es extraı́da con
2 - butanol con una relación en volumen 1:1 de 2 butanol a solución. La extracción se lleva a cabo
en un separador de fases lı́quido - lı́quido utilizando un caudal de 200 ml/min. Luego la fase
orgánica es separada y evaporada hasta sequedad
para proporcionar 21,3 g de proteı́na. Esta se
puede resuspender luego en agua destilada a una
relación en volumen 1:10.
Las cepas de E. coli utilizadas en estas Preparaciones son materiales conocidos comercialmente
disponibles, por ejemplo de Culture Collections
(Colecciones de cultivo) tales como la A.T.C.C.
o fuente similar. El IFN - β ser17 es también un
material conocido que está disponible comercialmente. Véase también el documento de patente
U.S. N◦ 4.518.584.
Ejemplo I
Preparación de dispositivos de liberación controlada que contienen interferón (método de la
acetona)
A. Preparación de una microsuspensión de
IFN/PLGA
Se disolvió 1 gramo de D,L - PLGA (relación
molar 50:50, viscosidad inherente 0,64 dl/g) en
5 ml de acetona a temperatura ambiente. Se
añadieron 0,3 mg de HuIFN - β recombinante en
1 ml de tampón (que contenı́a 12,5 mg de HSA
y 12,5 mg de dextrosa) al PLGA en acetona y
la mezcla resultante fue vorticada a alta velocidad durante aproximadamente 30 segundos. El
precipitado de PLGA, HSA, IFN y posiblemente
dextrosa, que se formó, fue luego centrifugado durante 10minutos a 700 xg. El material sobrenadante de acetona y agua se retiró con una pipeta
y el lı́quido residual se eliminó con una torunda
de algodón. Se añadieron 10 ml de acetona y la
mezcla se vorticó a alta velocidad hasta que se hubiera disuelto el PLGA existente en el sedimento,
dejando una microsuspensión de HuIFN - β, HSA
y dextrosa en una solución de PLGA en acetona.
B. Moldeo por rociado y colada de la microsuspensión deIFN/PLGA
La resultante microsuspensión de IFN/PLGA,
obtenida tal como se describe en el párrafo A, se
roció con un pulverizador de aire comprimido, uti11
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2 039 437
lizando aire comprimido a 1 kg.cm−2 sobre una
lámina limpia de polietileno. El pulverizador de
aire comprimido se mantuvo a una distancia de
10 - 15 cm desde la superficie de la lámina y
la pelı́cula se roció con un movimiento constante
para conseguir una pelı́cula uniforme de la formulación de PLGA, que tenı́a un grosor de aproximadamente 50 µm.
C. Refuerzo de la pelı́cula
Utilizando
una microsuspensión de IFN/PLGA del párrafo
A, se preparó una pelı́cula moldeada por rociado
y colada con refuerzo de seda, del siguiente modo:
Una malla de seda tejida finamente se estiró
y tendió sobre un bastidor y la porción tendida
se pulverizó con aire comprimido y con una solución de PLGA 100 mg/ml (relación molar 50:50,
viscosidad intrı́nseca 0,64) en acetona. La malla
húmeda se dejó secar y luego se pulverizó con
aire comprimido con aplicaciones repetidas de solución de PLGA hasta que los poros en la malla de
seda estuvieran completamente llenos. La malla
se secó luego, se colocó sobre una lámina de polietileno y se moldeó por rociado y colada con la
microsuspensión de IFN/PLGA. Después de secar durante una hora, la malla revestida se invirtió de posición, se revistió por la cara inferior
y se roció de nuevo con la microsuspensión de
IFN/PLGA, aplicando una capa de polı́mero de
aproximadamente 100 µm de grosor. Después de
haber secado durante otra hora, la cara previamente revestida fue nuevamente rociada, dejada
secarse, invertida de posición, y la segunda cara
fue rociada de nuevo. La pelı́cula resultante tenı́a
un grosor de 300 µm.
D. Las pelı́culas obtenidas en los párrafos B
y C se almacenaron a temperatura ambiente durante 18 horas. Luego fueron retiradas de la
lámina de polietileno y secadas a temperatura
ambiente durante tres dı́as.
E. Configuración del dispositivo
Utilizando una pelı́cula moldeada por rociado y colada, obtenida como se describe en los
párrafos A - D anteriores, los dispositivos de liberación controlada se configuraron de la siguiente
manera:
exposición a vapor de acetona. Se retiró el
alambre y los rollos se empalmaron a tramos
de 5 o 10 mm.
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a. Segmentos de pelı́cula plana, de 1 x 2 cm, se
cortaron a partir de la pelı́cula no reforzada.
b. Segmentos de pelı́cula plana, de 1 x 2 cm,
se cortaron a partir de la pelı́cula reforzada.
c. Segmentos de pelı́cula plana, de 3 x 5 cm,
se cortaron a partir de la pelı́cula no reforzada, se enrollaron sobre una alambre de
calibre 18 y la pelı́cula se aseguró mediante
una aplicación muy ligera de acetona con
una torunda de algodón a la longitud final
de 5 mm, o por exposición a vapor de acetona. El alambre se retiró y los rollos se
empalmaron a tramos de 5 o 10 mm.
d. Segmentos de pelı́cula plana, de 3 x 5 cm,
se cortaron a partir de la pelı́cula reforzada,
se enrollaron sobre un alambre de calibre 18
y la pelı́cula se aseguró por una aplicación
muy ligera de acetona con una torunda de
algodón a la longitud final de 5 mm, o por
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Los perfiles de liberación de estos dispositivos,
cuando fueron implantados subcutáneamente en
ratones durante un perı́odo de 100 dı́as son mostrados e identificados en la Figura 1 como dispositivos 1, 2 y 3 para las configuraciones a, b y c,
respectivamente.
Ejemplo 2
Preparación de dispositivos de liberación controlada que contienen interferón (método del di cloruro de metileno)
Se disolvió 1 g de D,L - PLGA (relación molar 50:50, viscosidad intrı́nseca 0,64 dl/g) en 4 ml
de di - cloruro de metileno. Se añadieron a la solución de PLGA disuelto 0,3 mg de HuIFN - β recombinante en 1 ml de tampón que contenı́a 12,5
mg/ml de albúmina de suero humano (HSA) y
12,5 mg/ml de dextrosa. La mezcla resultante se
sometió a vorticación durante aproximadamente
60 segundos a alta velocidad, hasta que se formo
una emulsión de color blanco. La emulsión fue
transferida inmediatamente a un pulverizador de
aire comprimido y rociada sobre una pelı́cula de
polietileno, y luego fue secada de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1, párrafo D.
Se configuraron dispositivos de liberación controlada enrollando segmentos de pelı́cula de 3 cm
x 5 cm sobre un alambre de calibre 18, asegurando
el extremo del rollo por exposición a acetona, retirando el alambre, y empalmando cada rollo a
tramos de 5 y 10 mm.
El perfil de liberación de estos dispositivos,
cuando se implantaron subcutáneamente a ratones, durante un perı́odo de 60 - 100 dı́as, se muestra como dispositivo 4 en la Figura I.
Ejemplo 3
Determinación del perfil de liberación in vivo
cuando se implanta subcutáneamente en ratones.
A. Perfil de liberación de β - interferón
Se prepararon sesenta de cada uno de los dispositivos 1 - 4 como se describe en los Ejemplos
1 y 2, pero el HuIFN - β fue combinado con
β - interferón marcado radiactivamente (125I rHuIFNser17 ). Los dispositivos fueron esterilizados con 1,25 Mrad de irradiación gamma y fueron
implantados subcutáneamente en la región dorsal de ratones hembras ICR que pesaban 18 - 20
g. Un dispositivo fue implantado en cada ratón.
Después de intervalos de tiempo variables (1 a
100 dı́as) los dispositivos fueron retirados de los
ratones y se determinó la radiactividad del 125I rHuIHN - β ser17 remanente. La Figura I muestra
los perfiles de liberación de los dispositivos 1 - 4
durante un perı́odo de hasta 100 dı́as in vivo.
Ejemplo 4
Determinación del tamaño de partı́culas y de
la distribución.
Pelı́culas de PLGA/IFN, preparadas tal como
se describe en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, se analizaron para determinar el tamaño
de partı́culas del interferón y de otras macromoléculas (albúmina de suero humano y dextrosa) en cada formulación, de acuerdo con los
siguientes procedimientos:
23
2 039 437
A. Pelı́culas de PLGA/IFN preparadas como
se describe en el Ejemplo 1
Se disolvió un gramo de D,L - PLGA (relación
molar 50:50, viscosidad intrı́nseca 0,64 dl/g) en
5 ml de acetona a temperatura ambiente. Se
añadieron 0,3 mg de HuIFN - β en 1 ml de tampón
que contenı́a 12,5 mg de HSA y 12,5 mg de dextrosa al PLGA en acetona y la mezcla se sometió
a vorticación a alta velocidad durante aproximadamente 10 segundos. El precipitado de PLGA,
HSA, IFN y posiblemente dextrosa, que se formó,
fue luego centrifugado durante 10 minutos a 700 x
g. El material sobrenadante de acetona y agua se
retiró con una pipeta y el lı́quido residual se eliminó con una torunda de algodón. Se añadieron
10 ml de acetona, y la mezcla resultante se sometió a vorticación a alta velocidad hasta que se
hubo disuelto el PLGA existente en el sedimento,
dejando un precipitado de IFN, HSA y dextrosa
suspendido en PLGA disuelto en acetona. Una
gota de la suspensión fue observada bajo un microscopio óptico de luz polarizante sobre un portaobjetos de vidrio con cubreobjetos a 100X de
aumento, utilizando un retı́culo ocular con divisiones de 10 micrómetros.
Los tamaños de partı́culas de los componentes
macromoleculares sólidos (IFN, HSA, dextrosa)
suspendidos en la solución de PLGA/acetona
variaron desde menos que, o igual que, el
lı́mite de detección (aproximadamente 100 a 500
nanómetros) hasta 100 µm. Las partı́culas que
tenı́an diámetros mayores que 10 µm constituı́an
menos de 10 % del número total de partı́culas, y
la mayor parte de las partı́culas tenı́an diámetros
menores que 1 µm. Podrı́a observarse que menos del 10 % de las partı́culas visibles se estaban
tocando con al menos otra partı́cula.
B. Pelı́culas de PLGA/IFN preparadas como
se describe en el Ejemplo 2
Una gota de la microsuspensión de
PLGA/IFN, preparada de acuerdo con el método
descrito en el Ejemplo 2, se observó bajo un microscopio óptico sobre un portaobjetos de vidrio
con cubreobjetos a 100X aumentos, utilizando un
retı́culo ocular con divisiones de 10 micrómetros.
No se observaron partı́culas con un aumento de
100X, indicando que la totalidad del IFN y del
HSA tenı́an tamaños de partı́culas menores que,
o iguales que, el lı́mite de detección (100 a 500
nanómetros).
Ejemplo 5
Ensayo de actividad antivı́rica biológica del
interferón
El ensayo en cuanto a la actividad antivı́rica
biológica del interferón mide el efecto que el interferón ejerce sobre células, vigilando la inhibición
por éste del efecto citopático de virus de estomatitis vesicular (VSV) en células WISH humanas.
El daño para las células, causado por el virus,
puede ser visualizado en el microscopio óptico.
En células que son incubadas con interferón activo se reduce el crecimiento del virus. Las unidades de interferón activo se determinan como valores recı́procos de las diluciones del punto final
de un preparado de interferón, y el punto final se
define como la dilución de interferón que inhibe
el crecimiento de virus en aproximadamente un
cincuenta por ciento.
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El interferón contenido en los sistemas de liberación controlada, preparados tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2, y combinado con una
concentración conocida de [125I] rHuIFN - β ser17 ,
se extrajo de los sistemas como se describe en el
Ejemplo 6, seguidamente. Las muestras de interferón extraı́das fueron ensayadas para determinar
la actividad biológica del interferón en sistemas
fabricados, con relación a la actividad biológica
del interferón del material original, tal como se
describe en los párrafos A - D, seguidamente.
A. Método
Se pipetean individualmente sendos 25 µl de
cada muestra de interferón a ensayar y del material de referencia dentro de una fila de pocillos de
una plancha estéril de microtitulación de 96 pocillos, que contiene 50 µl de medio esencial mı́nimo
de Eagle (EMEM) por cada pocillo. El material
de referencia es el patrón internacional de HuIFN
- β procedente del National Institute of Health
(Instituto Nacional de Salud), N◦ de referencia
G - 023 - 902 - 527. Cada muestra se ensaya por
duplicado, y una fila y una columna de cada plancha se reservan para testigos, a los que se añaden
cantidades adicionales de 25 µl de EMEM. Las
planchas son tratadas luego bajo luz ultravioleta
(UV) durante 6 minutos para evitar el crecimiento
bacteriano. Se preparan luego diluciones triples
en serie (diluciones patrones de mitad de log10)
de cada muestra y luego se preparan en los pocillos remanentes de la plancha de microtitulación
por dilución con EMEM para obtener 50 µl de
una muestra diluida en cada pocillo. Se añaden a
cada pocillo 50 µl de suero de ternero fetal (FCS)
al 2 % en EMEM, seguidos por 100 µl de una suspensión bien mezclada de células WISH humanas
en EMEM con FCA al 5 %, para dar como resultado la adición de 2,5 x 104 células por pocillo.
Luego las planchas son incubadas a 37◦C en CO2
al 5 % durante 24 horas.
Aproximadamente a las 24 horas después de
haber añadido la suspensión de células WISH, se
añaden a cada pocillo, con la excepción de cuatro
pocillos testigos, 50 µl de VSV en EMEM, preparados en una dilución que añade al menos una
unidad formadora de placas de VSV por célula.
Las planchas tratadas con virus se incuban a
37◦C bajo CO2 al 5 % y se califican aproximadamente a las 18 horas después de haber añadido el
VSV.
B. Calificación
Las planchas son leı́das bajo un microscopio óptico y las calificaciones se registran cuando
los testigos de virus alcanzan el efecto citopático
completo (CPE) y el punto final de las referencias está en el tı́tulo esperado. A cada pocillo de
ensayo se le asigna una calificación del siguiente
modo: SP, posible CPE; 1, 25 % de las células
tienen CPE; 2, 50 % de las células tienen CPE; 3,
75 % de las células tienen CPE; 4, 100 % de las
células tienen CPE; C, contaminación bacteriana;
y CT, citotoxicidad de las células.
El punto final de una titulación de muestra es
el pocillo que se califica por primera vez 50 % de
CPE. El tı́tulo en log10 de unidades de IFN por
ml corresponde a la dilución de ese pocillo, y se
corrige de acuerdo con la lectura del patrón de
13
25
2 039 437
referencia.
C.Cálculo de la actividad biológica especı́fica
de interferón
Se determina la radiactividad de tres partes
alı́cuotas de 1 a 50 µl de cada muestra de interferón sin diluir, recontando en un contador
gamma de Packard. A partir del resultado en
cómputos por minuto (CPM), se determinan los
cómputos por unidad de volumen (CPM/ml). La
actividad de IFN (unidades de IFN/ml) de cada
muestra, determinada de acuerdo con el método
descrito en los párrafos A y B anteriores, se divide
por el valor de CPM/ml para la muestra, dando
la actividad del IFN en unidades/CPM.
El valor de unidades/CPM para cada muestra
obtenida por extracción de un sistema de poli lactida fabricado es dividido por el valor de unidades/CPM para el correspondiente material de
interferón original de partida (IFN original de
carga) utilizado para producir los sistemas fabricados de poli - lactida e interferón, para dar la
relación de actividad especı́fica de interferón extraı́do a la actividad especı́fica de IFN original de
carga. La relación ası́ obtenida es multiplicada
por el valor de unidades de IFN/ml para el IFN
original de carga, que da el equivalente de unidades de IFN original de carga de la muestra de
IFN extraı́da.
El log10 del equivalente de unidades de IFN
original de carga/ml para cada muestra extraı́da
se denomina el log10 de la actividad de IFN relativa (RLIA). Los valores de RLIA para cada
grupo de muestras ensayadas se promedian y
comparan con el valor de log10 de unidades de
IFN/ml del apropiado material original de carga.
Se puede obtener una exactitud adicional mediante un análisis por regresión lineal de los valores de RLIA obtenidos de una serie de sistemas
que han sido implantados en un animal de ensayo,
tal como un ratón, y se recuperan en serie a diversos intervalos a lo largo del perı́odo de ensayo,
por ejemplo de un mes. La ordenada en el origen
(Y) de la lı́nea determinada de un gráfico de valores de RLIA (eje de las Y) en función de los dı́as
de implantación (eje de las X) indica la actividad
del interferón en los sistemas fabricados antes de
implantación.
D. Resultados
Los nuevos sistemas de liberación controlada
aquı́ reivindicados, demuestran valores de RLIA
después de fabricación después de fabricación,
pero antes de aplicación in vivo, que son una mitad, o más, del log10 de unidades de IFN/ml del
correspondiente material original de carga de polipéptido.
Los sistemas de interferón y poli - lactida, preparados como se describe en los Ejemplos 1 y 2,
cuando se ensayan tal como se describe en este
Ejemplo, muestran que esencialmente no hay ninguna pérdida de actividad biológica del interferón
incorporado; esto quiere decir que los valores promedios de RLIA, después de fabricación pero antes de implantación, son esencialmente indistinguibles del log10 de unidades de IFN/ml del material original de carga de IFN a partir del cual
fueron preparados.
Ejemplo 6
Extracción de polipéptido a partir de una ma14
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triz de polilactida
A. Extracción de interferón a partir de la matriz de poli - lactida de dispositivos preparados de
acuerdo con los Ejemplos 1 y 2
Sistemas que contenı́an interferón, preparados
tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2 a partir del interferón de material original de carga
combinado con una concentración dada de [125 I]
rHuIFN - β ser17 , se disolvieron individualmente
en acetona (hasta 300 mg de poli - lactida por
10 ml de acetona) y se sometieron a vorticación a
alta velocidad hasta que la poli - lactida se hubo
disuelto por completo, y el interferón se dejó como
una suspensión de precipitado. Cada suspensión
fue centrifugada a 700 x g durante 10 minutos y el
material sobrenadante de acetona y poli - lactida
se retiró. El sedimento residual se secó durante
24 horas bajo vacı́o a temperatura ambiente, y se
extrajo subsiguientemente durante 1 hora con 0,5
ml de 12,5 mg/ml de HSA y 12,5 mg/ml de dextrosa a temperatura ambiente con suave agitación
periódica. Cada tubo fue centrifugado a 700 x g
durante 10 minutos, y el material sobrenadante
que contenı́a interferón se retiró y almacenó a 4◦
C. Se usaron muestras de 10, 50 y 100 microlitros del material sobrenadante para determinar
la radiactividad por unidad de volumen. Después
de haber determinado la actividad de interferón,
se comparó la actividad especı́fica (unidades de
IFN/cómputos de radiactividad por minuto) del
interferón extraı́do con la del material de partida
original de interferón. La determinación de la radiactividad por unidad de volumen y la actividad
biológica del interferón extraı́do se describen en
el Ejemplo 5.
Ejemplo 7
Actividad biológica de HuIFN - β en dispositivos de suministro de poli - lactida preparados por
un conocido método de formación en caliente
a. Preparación de dispositivos de poli - lactida
formados en caliente
Dispositivos de suministro de fármacos con
matriz de poli - lactida, que contenı́an HuIFN - β
como ingrediente activo se prepararon de acuerdo
con un conocido método de extrusión en caliente,
que está situado fuera del alcance y de la práctica
de este invento, en el cual el polipéptido y la poli
- lactida se combinan y mezclan en un aparato
de extrusión en caliente. Se mezclaron 10 g de
D,L - PLGA (relación molar 50/50, viscosidad
intrı́nseca 0,64 dl/g) con el contenido de 25 ampollas de interferón recombinante humano liofilizado
que contenı́an 0,3 mg de IFN - β con 4,2 x 107 unidades de interferón, 12,5 mg de albúmina de suero
humano y 12,5 mg de dextrosa por cada ampolla.
La mezcla se colocó en el embudo de carga de un
dispositivo de extrusión calentado y se extruyó
a una temperatura de aproximadamente 75◦ C a
través de una hilera de salida circular de 3 mm, e
inmediatamente se redujo a la temperatura ambiente enfriando con aire forzado. La varilla resultante de material de interferón y poli - lactida
fue segmentada en tramos de 7 mm.
B. Extracción de interferón
Los dispositivos de interferón y poli - lactida,
formados por el método descrito en el párrafo A,
fueron pesados y colocados individualmente en
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ampollas de vidrio de 2 ml separadas, que contenı́an 1 ml de una solución tampón (tampón fosfato al 74,9 % de pH 7,4, etanol al 25 % y SDS
al 0,1 %). Las ampollas se mantuvieron a 4◦ C
bajo agitación circular suave durante 24 horas.
Después de la extracción, los dispositivos se retiraron de las ampollas y los extractos se almacenaron a 4◦ C hasta que fueron ensayados.
C. em Ensayo en cuanto a actividad biológica
de interferón
La actividad de interferón, en unidades/ml de
extracto, se determinó por el método de ensayo
descrito en el Ejemplo 5. Las unidades de interferón totales estimadas, contenidas en cada dispositivo, se calcularon a partir del producto matemático del peso en seco del dispositivo y de las
unidades de interferón por cada gramo de peso en
seco de la formulación.
D. Resultados
El interferón extraı́do de los dispositivos formados en caliente dio un valor de LRIA (log10
relativo de actividad de interferón) de menos 1
% del log10de las unidades por ml del material
original de carga de interferón correspondiente.
Ejemplo 8
Preparación de un sistema de liberación controlada, inyectable o implantable, finamente dividido
Una microsuspensión de interferón en una solución de poli - lactida se prepara tal como se
describe en los Ejemplos 1 o 2. Luego la solución se atomiza con un dispositivo rociador,
y las partı́culas resultantes se secan y granulan
según se van sedimentando en una contracorriente
o vórtice de aire puro, nitrógeno u otro gas inerte.
Las partı́culas resultantes de una matriz de po-
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lipéptido y poli - lactida se almacenan bajo vacı́o
durante 3 dı́as y luego se clasifican y dimensionan
para uso o almacenamiento.
Los sistemas de liberación controlada, preparados de esta manera, se pueden incorporar en
una suspensión inyectable y administrar por vı́a
subcutánea o intramuscular.
Ejemplo 9
El texto que sigue describe una formulación
para inyección por vı́a parenteral de partı́culas de
polipéptido y poli - lactida finamente divididas,
preparadas de acuerdo con los métodos que aquı́
se debaten.
Se suspenden partı́culas de poli - lactida que
contienen interferón, finamente divididas, preparadas tal como se describe en el Ejemplo 8, en la
siguiente solución:
carboxi - metil - celulosa de sodio
NaCl
alcohol bencı́lico
Tween 80
agua purificada
0,5 %
0,6 %
0,9 %
0,1 %
c.s.100 %
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Por ejemplo, se suspenden 330 mg de
partı́culas de interferón y poli - lactida en 5,5 ml
de la solución anterior para proporcionar una dosis inyectable de 9 µg de interferón por cada 0,5
ml de una suspensión inyectable.
Se pretende que el precedente debate y realizaciones especı́ficas sean ilustrativos del alcance
y de la práctica de este invento, y no deberá considerarse que limiten la práctica del invento descrito.
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REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para preparar un sistema
de suministro de agentes activos para la administración controlada de un polipéptido macromolecular a un mamı́fero, el cual sistema comprende
una matriz polı́mera que no contiene más de aproximadamente 30 por ciento en peso de partı́culas
de un polipéptido macromolecular y otros componentes solubles en agua opcionales, dispersados
en una poli - lactida, en que sustancialmente la
totalidad de las partı́culas de polipéptido y otros
componentes solubles en agua tienen diámetros
de 10 µm o menos y están dispersadas uniforme
y discretamente a todo lo largo de la matriz, y en
que el polipéptido retiene por lo menos aproximadamente 50 por ciento de la actividad biológica
que poseı́a antes de la fabricación de la matriz, el
cual procedimiento incluye la operación de preparar una microsuspensión del polipéptido, y de
otros componentes solubles en agua, opcionales,
en la solución de poli - lactida.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el polipéptido tiene un peso molecular
mayor que aproximadamente 10.000.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación
1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido se
selecciona de citoquinas, linfoquinas, monoquinas
e interferones.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación
3, en el que el polipéptido es interleuquina - 1 o
interleuquina - 2.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación
3 en el que el polipéptido es un interferón beta.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación
1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido es
una calcitonina u hormona paratiroides.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación
1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido es
factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento en transformación - alfa o factor de crecimiento en transformación - beta.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación
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1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido es
un estimulador inmune o un depresor inmune.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación
1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido es
superóxido - dismutasa o un activador de plasminógeno.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido es una hormona de crecimiento o un factor de liberación de hormona de crecimiento.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el polipéptido es hormona de
crecimiento bovina.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera
de las precedentes reivindicaciones, en el que el
sistema es formado moldeando por rociado y colada una o más capas de pelı́cula.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, que incluye la inclusión de un material
de refuerzo inerte biocompatible en el sistema.
14. Un método de una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en el que la poli - lactida
es un copolı́mero de poli (lactida - co - glicolida)
que posee una relación molar de unidades de lactida a unidades de glicolida comprendida entre
aproximadamente 100:0 y 30:70.
15. Un método que comprende la producción
de un sistema de suministro de agentes activos para la administración controlada de un
polipéptido macromolecular a un mamı́fero, el
cual sistema comprende una matriz de carácter
polı́mero que no contiene más de aproximadamente 30 por ciento en peso de partı́culas de un
polipéptido macromolecular y otros componentes
solubles en agua, opcionales, dispersados en una
poli - lactida, en el que sustancialmente todas las
partı́culas de polipéptido y de otros componentes solubles en agua tienen diámetros de 10 µm o
menores y están dispersados uniforme y discretamente a lo largo de la matriz, y en el que el polipéptido retiene por lo menos aproximadamente
50 por ciento de la actividad biológica que poseı́a
antes de haber fabricado la matriz.
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