Clave: CAL81MAR20120112 IDENTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS CON

XVIII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
XVIII National Congress of Biochemical Engineering
VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
VII International Congress of Biochemical Engineering
X Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular
X Biomedicine and Molecular Biotechnology Meeting
Clave: CAL81MAR20120112
IDENTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS CON ACTIVIDAD
ANTITUMORAL EN UN HIDROLIZADO DE PROTEÍNA
DE SOYA GERMINADA
Robles-Ramírez, María del Carmena; Mora-Escobedo, Rosalvaa;
Ramón-Gallegos, Evab
a
Departamento de Graduados en Alimentos. bLaboratorio de Citopatología Ambiental.
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, I.P.N. Carpio y Plan de Ayala S/N, Col. Sto.
Tomás, 11340, D.F., México.
[email protected]
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INTRODUCCIÓN
La soya es una abundante fuente de
proteínas de alto valor nutricional y
excelentes propiedades fisicoquímicas,
pero también es fuente de proteínas y
péptidos biológicamente activos que
producen efectos benéficos sobre la salud.
Con relación al tratamiento del cáncer se
han identificado, en la soya, diferentes
péptidos con actividad anticarcinogénica.
Los inhibidores de proteasas, la lectina de
soya, algunos péptidos de bajo peso
molecular obtenidos por digestión
enzimática in vitro, y el más
recientemente
descubierto
péptido
lunasina, son ejemplos de ellos (Barac et
al., 2005). Debido a que durante la
germinación de la soya se producen
diferentes cambios en la distribución de
metabolitos secundarios, movilización de
las proteínas de reserva y cambios en la
composición de aminoácidos (Davila et
al., 2003; Mora-Escobedo et al., 2009), se
pensó que este proceso natural podría
mejorar las propiedades nutracéuticas de
esta leguminosa al modificar el contenido
de los diferentes metabolitos y, en
particular, generando péptidos con
posible actividad biológica. En estudios
anteriores se demostró que la proteína de
soya germinada inhibe el crecimiento de
las células de cáncer cérvico-uterino tanto
in vitro como in vivo (Mora-Escobedo y
col., 2009; Robles-Ramírez y col., 2010).
Una fracción peptídica (FA), obtenida por
ultrafiltración de la proteína de soya
germinada durante 6 días, fue la más
activa contra las células de cáncer
induciendo la disminución en la expresión
de los genes TOP2A y PTTG1 (dos
genes considerados como blancos
terapéuticos) y provocando, como
consecuencia, la apoptosis de las células
cancerosas. El perfil electroforético de FA
reveló tres bandas principales de 6, 11 y
21 kDa (Robles-Ramírez y col., 2011).
OBJETIVOS
Identificar los péptidos responsables del
efecto anticanceroso de FA, mediante su
análisis por cromatografía de líquidos
acoplada a espectrometría de masas (LCMS/MS).
MATERIALES Y MÉTODOS
Secuenciación e identificación de
péptidos por LC-MS/MS. Se realizó el
corrimiento electroforético de la fracción
peptídica más activa (FA) por SDSPAGE. Posteriormente, las bandas
obtenidas se recortaron para su análisis
por espectrometría de masas, para lo cual
previamente se redujeron con DTT, se
alquilaron con yodoacetamida y se
digirieron usando tripsina modificada.
Los péptidos trípticos así obtenidos, se
desalaron y se analizaron por LCMS/MS. La cromatografía se realizó
usando un HPLC Accela (Thermo Fisher
Scientific, San Jose, CA) a una velocidad
de flujo de 300 nl/min. Se usó una
columna PicoFrit Proteopep 2 C18 75 µM
ID × 50 mm y un gradiente de 90 min. El
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solvente A fue agua/ácido acético 0.1%, y
la fase B acetonitrilo/ácido acético 0.1%;
los péptidos se eluyeron con un gradiente
de 5 a 70% del solvente B por 90 min.
Los péptidos eluídos se electroatomizaron
a un voltaje de nano-electroaspersión de 2
kV en un espectrómetro de masas LTQOrbitrap XL (Thermo Fisher Scientific,
San Jose, CA).
Análisis de datos. Los datos de
fragmentación se investigaron usando el
programa Sequest de Discoverer 1.0
(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)
contra una base de datos no redundante de
proteínas. Los archivos crudos se
investigaron usando Peaks Online Engine
(Bioinformatics
Solutions,
Canada)
contra diferentes bases de datos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Tabla I muestra los péptidos
identificados en cada banda, así como el
grado de confiabilidad en la identificación
de la proteína basada en el péptido
secuenciado (0-100%), el porcentaje que
representa el péptido identificado con
respecto a la proteína fuente (% de
cobertura), y la proteína de la que se
originó dicho péptido (proteína fuente),
incluido su peso molecular. Podemos
apreciar que la fracción FA es una mezcla
de péptidos, la mayoría de ellos
procedentes de proteínas con actividad
antitumoral. El inhibidor de tripsina de
Kunitz (ITK) es un componente constante
en las tres bandas electroforéticas
estudiadas. La banda de 21 kDa contuvo
únicamente este péptido que al parecer se
encontró completo ya que su peso
molecular corresponde con el de dicha
banda. Péptidos procedentes de este
inhibidor se encontraron también en las
bandas de 11 y 6 kDa; al parecer la
germinación o menos probablemente la
digestión enzimática de las proteínas de la
soya, provocaron su degradación.
Papastoitsis y Wilson (1991) identificaron
a la proteasa K1 como la responsable de
la degradación de ITK en los cotiledones
de la semilla durante la germinación. La
enzima K1 también es activa contra la
principal forma del inhibidor de Bowman
Birk (BBI-E) y contra las subunidades α,
α’ y β de la β-conglicinina. La
degradación de ITK y de BBI da lugar a
nuevas isoformas (IKT-A y BBI-D) por el
sexto día de germinación (Tan-Wilson et
al., 1982). La nueva forma del ITK aún
presenta actividad inhibidora de la
tripsina, pero ésta se ve grandemente
disminuida. Kumar et al. (2006),
encontraron una disminución de casi 50
% en la actividad del inhibidor cuando
germinaron
a
25ºC,
y
de
aproximadamente 70% a 35ºC de
temperatura, después de 5 días de
germinación de la soya (variedad JS7105). Aún cuando ITK aún conserva
actividad inhibidora de la tripsina a los 6
días de germinación, es poco probable
que sea el responsable de la actividad
anticancerosa de FA ya que la proteína de
soya germinada por 6 días tuvo efecto
antitumoral en el ensayo in vivo, aun
cuando la dieta se esterilizó a 15 lb por 15
min, condiciones que desnaturalizan al
ITK y suprimen su actividad. Otra
proteína identificada por LC-MS/MS fue
la albúmina 2S de la soya. Esta proteína
está formada por dos cadenas, una
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Tabla I. Péptidos identificados en la fracción peptídica más activa por LC-MS/MS
PM de
proteina
fuente
(kDa)
68
Inhibidor de
tripsina de
Kunitz
21
100
25
Inhibidor de
tripsina de
Kunitz
21
100
27
Inhibidor de
tripsina de
Kunitz1
21
14
Cobertura
DFVLDNEGNPLENGGTYYILSDITAFGGIR
CPLTVVQ SRNELDKGIGTIISSPYR
FIAEGHPLSLK
NKDAMDGWFR
VSEFNNYKLVFCPQDKCGDIGISIDHDDGTR
NKPLVVQFQK
100
NELDKGIGTIISSPYR
FIAEGHPLSLK
VSDDEFNNYK
NKPLVVQFQK
EICPLTVVQSPNELDK
FGSFAVITLCAGMPTEWAIVER
DTVDGWFNIER
NKPLVVQFQK
Péptidos identificados
21
11
Proteína
fuente
Nivel de
confianza
(%)
Banda
(kDa)
(%)
CCTEMSELR
IMENQSEELEEK
ELINLATMCRFGPMIQCDLSSDD
99
28
Albúmina
2S
(precursora
de lunasina)
TSNILSDVVDLK
90
4
Lectina de
soya
31
TNDFCYKPCKS
-
10
Inhibidor de
Bowman
Birk-D
14
ADCNGACSPFEVPPCR
CVPIGLFVGFCIHPTG
100
89
Leginsulina
4
ALIQVVNCNGERVFDGELQEGR
92
4
Glicinina
G1
48
GIGTIISSPYR
30
7
Inhibidor de
tripsina de
Kunitz
21
ALLPHFNSK
-
2
Subunidad
α de la βconglicinina
60
6
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pequeña, rica en aspártico, que
corresponde al péptido lunasina, y otra
mayor de 8 kDa rica en metionina. Sin
embargo, ninguno de los péptidos
identificados en el análisis pertenece a
lunasina. Por otro lado, diferentes
estudios demostraron que la lunasina se
degrada durante la germinación (Park et
al., 2005; Paucar et al., 2010), por lo que
es poco probable que este péptido sea el
compuesto activo que se busca.
El único péptido identificado de la lectina
de soya sólo cubre el 4% de la molécula
completa. Es claro que las lectinas se
degradaron durante la germinación puesto
que esta proteína se encontró en la banda
de 11 kDa y su peso original era de 31
kDa. Paucar et al., (2010) encontraron
que la germinación de la soya BRS133
durante 42 h a 25ºC, disminuyó en 58.7%
los niveles de lectinas.
El presente estudio también identificó un
péptido procedente de la isoforma D del
inhibidor de Bowman Birk. Esta isoforma
resulta de la degradación de la isoforma E
original debido a la germinación (TanWilson et al., 1982). Aparentemente este
polipéptido se encuentra casi intacto ya
que se encontró en la banda de 11 kDa y
su peso original es de 14 kDa. Sin
embargo, el único péptido identificado no
pertenece a su sitio activo.
En la banda de 6 kDa se encontró un
péptido muy interesante, la leginsulina.
Éste es un péptido aislado de las radículas
de semillas de soya germinada, que se
cree que está implicado en alguna ruta de
transducción de señales celulares ya que
se une a una cinasa de proteína anclada a
la membrana de la célula vegetal (Bg)
estimulando su actividad forsforilativa.
Además, aunque la secuencia de
aminoácidos de la leginsulina no es
similar a la de la insulina ni a la de los
factores de crecimiento semejantes a
insulina (IGF) de los mamíferos, éstos
compiten con la leginsulina por el sitio de
unión con Bg (Watanabe et al., 1994). La
leginsulina es un péptido de 37
aminoácidos que presenta 6 cisteínas en
su estructura las cuales forman tres
puentes disulfuro. Se cree que este nudo
formado por las cistinas le confiere
estabilidad térmica. Por otro lado, este
péptido presenta las características que
distinguen a los péptidos catiónicos de
defensa del huésped (también llamados
antimicrobianos), es decir, más de 2
aminoácidos básicos (la leginsulina tiene
3 argininas y una histidina), tres puentes
disulfuro y aproximadamente 50% de
aminoácidos
hidrofóbicos.
Algunos
péptidos de este tipo se ha visto que
tienen propiedades anticancerosas (Papo
y Shai, 2005).
Finalmente, como puede observarse en la
Tabla I, la leginsulina es el péptido
identificado con mayor cobertura por el
análisis de LC-MS/MS.
También en la banda de 6kDa se
identificaron productos de la degradación
del inhibidor de tripsina de Kunitz, de la
subunidad G1 de la glicinina, y de las
subunidades α y α’, de la β-conglicinina.
No se debe descartar la posibilidad de que
estos péptidos pudieran tener alguna
actividad.
CONCLUSIONES
El péptido responsable de la actividad
anticancerosa de la proteína de soya
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germinada podría ser la leginsulina, un
péptido involucrado en la transducción de
señales de las células de la soya. Esto
debe confirmarse en estudios posteriores.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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