ETS-D

Iniciación y
señalización celular en
el sarcoma de Ewing
ENRIQUE DE ALAVA
UNIVERSIDAD DE SALAMANCA-CSIC
Spain
Ewing/pPNET (now)
Ewing sarcoma/PNET (WHO classification)
Ewing’s
sarcoma
of bone
Bone PNET
Askin
Peripheral
neuroepithelioma
Paraverterbral SRCT
Ewing
extraeskeletal
Rabdomyosarcoma
Neuroblastoma
Neural differentiation
Ewing and pPNET share…
• Variable degree of
neural differentiation
• CD99 expression
• Same chromosomal
translocations (1983)
EWS-NT-D
1
2 3
4
5
6
ETS-D
7
NH2
COOH
Transactivation
DNA Binding
EWS-ETS
Variability of Gene Structure
in Fusion Transcripts
Different Translocation Partners
NTD-EWS
1
NH
2
3 4
5
6
7
ETS-D
COOH
2
DNA Binding
NTD-EWS
1
NH
2
3 4
5
EWS-FLI-1
6
7
ETS-D
EWS-ERG
2
DNA Binding
Same Translocation Partners, but different genomic
breakpoints (different exon distribution)
NTD-EWS
1
7-9
NH
2
3 4
5
6
7
ETS-D
COOH
2
DNA Binding
NTD-EWS
1
9-4
NH
2
3 4
5
6
7
8
9
ETS-D
COOH
2
DNA Binding
Molecular pathology of soft tissue tumors
STT with specific reciprocal
translocations (and gene fusions), and
relatively simple karyotypes
STT with complex and nonbalanced karyotypes, without
specific translocations
•Approx 1/3 of STT
•Approx 2/3 of STT
•About 15 different types of STT, and 30
described translocations
•Genetic instability, telomeric
disfunction
•Gene fusions: chimerical proteins
expressed in all cells throughout
clinical course
•Transcription factors OR
•Altered kinases
GOOD DIAGNOSTIC MARKERS
NO DIAGNOSTIC MARKERS
Chimeric transcription factors (i.e. EWS-ETS)
Target
cell
1
2 3
4
5
EWS-NT-D
NH22
NH
6
7
ETS-D
COOH
Pheno
-type
Vías de señalización en el Sarcoma de Ewing
La importancia del contexto celular
Ewing sarcoma histogenesis
shRNA
EWS-FLI1
Ewing sarcoma silenced cells show
features of hMSCs
(CD44+, CD54+, CD59+ y CD73+)
+ EWS-FLI1
Less committed to a
chondrogenic lineage
MPCEWS-FLI1-T1
MPCEWS-FLI1-T2
Adipocyte
(Oil-Red)
Osteoblast
(Von-Kossa)
EWS-FLI1 expression induces tumorigenicity
In mice mesenchymal progenitor cells
References:
1.- Development of Ewing´s Sarcoma from Primary Bone Marrow-Derived Mesenchymal Progenitor Cells.(Riggi et al., 2005; Cancer Res)
2.- Mesenchymal Stem Cell Features of Ewing Tumors. (Tirode et al., 2007; Cancer Cell)
The expression profile
of hMSCEWS-FLI-1 closely
mimics that of ESFT
but not of other bone
and soft tissue tumors.
Transformed cells are
not tumorigenic in vivo.
Additional genetic
events are required
The expression profile
of hMSCEWS-FLI-1 closely
mimics that of ESFT
but not of other bone
and soft tissue tumors.
Transformed cells are
not tumorigenic in vivo.
Additional genetic
events are required
Objetivos 2008-2009
• Interferencia estable EWS-FLI1
• Eventos previos a la translocación
• Cambios en la señalización
inmediatamente tras la transfección de
EWS-FLI1
• Factores predictivos de respuesta a
terapias anti IGF1R
Objetivos 2008-2009
• Interferencia estable EWS-FLI1
• Eventos previos a la translocación
• Cambios en la señalización
inmediatamente tras la transfección de
EWS-FLI1
• Factores predictivos de respuesta a
terapias anti IGF1R
Diseño de un sistema de ARN de interferencia estable.
ƒ Cuatro líneas celulares de tumor de Ewing: A673,TC71 (7-6), SK-ES-1 (75) y A4573 (10-6).
ƒ Diseño en torno al punto de unión.
ƒ Plásmido pSUPER neo.gfp (Oligoengine): promotor RNA polimerasa III.
EWS
793
656
FLI1
ADNc
GCTACGGGCAGCAGA ACCCTTCTTATGA..
CAGAGCAGCAGCTACGGGCAGCAGA ACC
GGGCAGCAGA ACCCTTCTT
7-6 (sentido)
7-6M (sentido)
ARN de interferencia redujo los niveles de EWS-FLI1
Early stage
EWS-FLI1
FLI1
Actin
MM1S
NB
TC71wt
3
4
5
6
M2
Mock
6
M2
Late stage
EWS-FLI1
Actin
NB
TC71wt
Mock
3
4
5
Early stage
TC71wt
shRNAi
Late stage
Mock
NB
TC71wt
shRNAi
Mock
EWS
Relative expression value
Actin
EWS-FLI1 mRNA expression level
*
TC71 wt
early
TC71 wt
late
shRNAi
early
*
shRNAi
late
Mock
early
Mock
late
Herrero et al., 2008 (under reviewing)
La interferencia de EWS-FLI1 provoca un notable aumento en
la actividad apoptótica
Índice Apoptótico Estadío Temprano
Número de células
120
100
Necrosis
80
Apoptosis Tardía
60
Apoptosis Inicial
40
Vivas
20
0
shARNi clon
pS
TC71wt
Índice Apoptótico Estadío Tardío
Número de Células
120,00
100,00
Necrosis
80,00
Apoptosis Tardía
60,00
Apoptosis Inicial
40,00
Vivas
20,00
0,00
shARNi clon
pS
TC71 wt
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
Activación de caspasa 9 / PARP en el clon interferido
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
La inhibición de EWS-FLI1 reduce la capacidad migratoria
Valor de absorbancia relativa
Índice de Migración Estadío Temprano
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
shARNi clon
pS
TC71wt
Valor de absorbancia relativa
Índice de Migración Estadío Tardío
1,2
1
0,8
0,6
0,4
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
0,2
0
shARNi clon
pS
TC71wt
El clon shARNi posee una menor capacidad de crecimiento
independiente de anclaje.
Capacidad de Transformación Oncogénica
Número de colonias por pocillo
Ensayo de tumorigenicidad
1200,00
1000,00
800,00
600,00
400,00
200,00
0,00
shARNi clon estadío
temprano
shARNi estadío
tardío
pS estadío temprano
pS estadío tardío
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
Correlación de los efectos con el grado de interferencia de
EWS-FLI1.
Valor de absorbancia relativa
Índice de proliferación (MTT)
100%
80%
Índice Apoptótico (Annexina V/FACS)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
Necrosis
0,2
60%
Apoptosis Tardía/Necrosis
0
TC71wt
pS clon 1 (Mock)
shARNi clon 5
shARNi clon
M2
Apoptosis
40%
temprana
Vivas
20%
0%
TC71 wt
Ciclo Celular
(FACS)
pS clon1
sh ARNi
clon shARNi clon
(Mock)
5
M2
120%
Número de células
Número de células
120%
1,4
100%
G2/M
80%
S
60%
G0/G1
40%
A
20%
0%
TC71wt
pS clon1 (Mock)
shARNi clon 5
shARNi clon M2
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
ARN de interferencia redujo el crecimiento tumoral in vivo
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
Análisis de la vía de señalización de IGF-1/IGF-1R.
ƒ Reducción en los niveles de IGF-1 en el clon shARNi
mientras que los de su receptor no varían.
Valor de expresión relativa
IGF1 ARNm nivel de expresión
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
TC71 wt
estadío
temprano
TC71 wt
estadío tardío
shARNi clon
estadío
temprano
shRNAi clon
estadío tardío
pS estadío
temprano
pS estadío
tardío
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
ƒ Los niveles de fosforilación de AKT y MAPK42/44 están
reducidos.
ƒEl clon shARNi es más sensible a la acción de los inhibidores de
la vía de IGF-1/IGF-1R.
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
ƒ Las células del clon shARNi son capaces de responder a la acción
de los inhibidores de IGF-1/IGF-1R incrementado aún más sus
niveles de apoptosis.
ƒ No se produce variación en los niveles de IGFBP3
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
TOPK es una diana directa de EWS-FLI1
EWS/FLI1 and some ETS family members as wild-type FLI1 require a 9 bp consensus sequence
harboring a GGAA "core". A 9 bp sequence ,GAAGGAAGT, was found in the TOPK intron 1 that
showed limited similarity to the high-affinity ETS binding consensus (ACCGGAAGT)
Herrero et al., 2008 (under reviewing)
Análisis de la expresión génica del clon shARNi. Búsqueda de nuevas
dianas putativas de EWS-FLI1.
Induced genes
Probe set
Gene symbol
Gene name
Map location
Magnitude of
Association
215706_x_at
ZYX
Zyxin
7q32
9,94
208211_s_at
ALK
anaplastic lymphoma kinase (Ki-1)
2p23
7,98
205467_at
CASP10
Caspase 10, apoptosis-related cysteine
protease
2q33-q34
6,88
203984_s_at
CASP9
Caspase 9, apoptosis-related cysteine
protease
1p36.3-p36.1
6,88
208796_s_at
CCNG1
Cyclin G1
5q32-q34
10,47
202770_s_at
CCNG2
Cyclin G2
4q21.22
8,36
216894_x_at
CDKN1C
cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (p57,
Kip2)
11p15.5
33,16
204249_s_at
LMO2
LIM domain only 2 (rhombotin-like 1)
11p13
9,43
55065_at
MARK4
MAP/microtubule affinity-regulating kinase
4
19q13.3
11,16
200714_x_at
OS-9
Amplified in osteosarcoma
12q13
9,26
221523_s_at
RRAGD
Ras-related GTP binding D
6q15-q16
7,4
1729_at
TRADD
TNFRSF1A-associated via death domain
16q22
7,33
204121_at
GADD45G
Growth arrest and DNA-damage-inducible,
gamma
9q22.1-q22.2
7,82
Herrero et al., 2008 (under reviewing)
Análisis de la expresión génica del clon shARNi. Búsqueda de nuevas
dianas putativas de EWS-FLI1.
Repressed genes
Probe set
Gene symbol
Gene name
219148_at
TOPK
T-LAK cell-originated protein kinase
204971_at
CSTA
cystatin A (stefin A)
201017_at
EIF1A
204409_s_at
Map location
Magnitude of
association
8p21.2
-6,78
3q21
-7,26
Eukaryotic translation initiation factor 1A
Xp22.13
-8,11
EIF1AY
eukaryotic translation initiation factor 1A, Ylinked
Yq11.222
-11,32
201435_s_at
EIF4E
Eukaryotic translation initiation factor 4E
4q21-q25
-6,51
205110_s_at
FGF13
Fibroblast growth factor 13
Xq26.3
-15,12
214412_at
H2AFB
H2A histone family, member B
Xq28
-10,91
207826_s_at
ID3
inhibitor of DNA binding 3, dominant negative
helix-loop-helix protein
1p36.13-p36.12
-7,17
207121_s_at
MAPK6
Mitogen-activated protein kinase 6
15q21
-6,94
214321_at
NOV
Nephroblastoma overexpressed gene
8q24.1
-19,87
208690_s_at
PDLIM1
PDZ and LIM domain 1 (elfin)
10q22-q26.3
-8,39
213791_at
PENK
proenkephalin
8q23-q24
-10,79
218009_s_at
PRC1
Protein regulator of cytokinesis 1
15q26.1
-6,78
205880_at
PRKCM
Protein kinase C, mu
14q11
-8,32
206039_at
RAB33A
RAB33A, member RAS oncogene family
Xq26.1
-9,81
209371_s_at
SH3BP2
SH3-domain binding protein 2
4p16.3
-6,62
40420_at
STK10
Serine/threonine kinase 10
5q35.1
-11,45
202338_at
TK1
Thymidine kinase 1, soluble
17q23.2-q25.3
-6,79
Herrero et al., 2008 (under reviewing)
Validación del clon interferido: análisis de la expresión de dianas
descritas de EWS-FLI1
ƒ Los niveles de p57 aumentan al inhibir EWS-FLI1.
Valor de expresión relativa
CDKN1C/p57/Kip2 ARNm nivel de expresión
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
TC71 wt
estadío
temprano
TC71 wt
estadío tardío
shARNi clon
estadío
temprano
shARNi clon
estadío tardío
pS estadio
temprano
pS estadío
tardío
Herrero et al., 2008
(under reviewing)
Validación del clon interferido: análisis de la expresión de dianas
descritas de EWS-FLI1
ƒ Los nivels de DAX1/NR0B1 y NKX2.2 se reducen al inhibir EWS-FLI1
TC71wt
pS
shARNi clon
Herrero et al., 2008 (under reviewing)
Objetivos 2008-2009
• Interferencia estable EWS-FLI1
• Eventos previos a la translocación
• Cambios en la señalización
inmediatamente tras la transfección de
EWS-FLI1
• Factores predictivos de respuesta a
terapias anti IGF1R
Plasticity of adult mesenchymal stem
cells of the bone marrow
Caracterización de las células madre mesenquimales humanas
(hMSC).
ƒ Las células mesenquimales muestran los marcadores de superficie
característicos
de las hMSC.
ƒ Las células son capaces
de diferenciarse
en los 3 linajes celulares
Las hMSC de pacientes de Sarcoma de Ewing carecen de
la fusión EWS-FLI1.
Sonda de fusión
D=donante sano
P1=paciente de sarcoma de Ewing; origen húmero
P2= paciente de sarcoma de Ewing; origen intramuscular a nivel de escápula
Osuna D et al., unpublished results
Tumor initiation. hMSCs from bone marrow iliac crest of ES patients do not
express ES markers
Osuna D et al., unpublished results
Affymetrix Human Arrays 1.0 ST ® - 3 donantes sanos vs. 3 pacientes
Caracterización de genes candidatos está en progreso
Análisis proteómico donantes vs. pacientes
9
9
8
8
37
3808(a)
380(b)
72
28
79
37
340
62
340
193
1129
193
1129
65
72
28
62
340
68
68
37
380(a)
380(b)
72
28
62
68
8
79
79
380(a)
380(b)
9
82
82
82
193
1129
65
65
N1
N2
53
29
77
N1
N2
N1
N2
84
106
77
53
77
84
53
84
?
?
60
60
60
235
235
235
81
81
81
61
61
61
DONOR-3
Donante 2
DONOR-1
9
9
8
9
8
79
79
79
380(a)
380(b)
380(a) 37
380(b)
37
72
28
380(a)
380(b)
72
28
62
340
68
193
68
65
N2
N1
29
77
72
62
193
1129
65
N2
53
84
28
340
193
1129
1129
65
37
62
340
68
8
82
82
82
77
Donante 3
DONOR-2
Donante 1
29
N1
84
106
53
N2
77
106
53
N1
????
60
60
60
235
235
235
81
81
81
61
61
61
Paciente 1
PATIENT-1
COLOUR CODE: •RED : OVEREXPRESION
•ORANGE: SLIGHTLY OVEREXPRESION
Paciente 2
PATIENT-2
•BLUE: UNDEREXPRESION
•BLUE: SLIGHTLY UNDEREXPRESION
Paciente 3
PATIENT-3
Objetivos 2008-2009
• Interferencia estable EWS-FLI1
• Eventos previos a la translocación
• Cambios en la señalización
inmediatamente tras la transfección de
EWS-FLI1
• Factores predictivos de respuesta a
terapias anti IGF1R
Clonación de la fusión EWS-FLI1 tipo I en pTet-Off combi
EWS-FLI1 tipo I
PCR en dos etapas
NheI
ClaI
V5 Epitope Tag
Inducción de la fusión EWS-FLI1 tipo I en hMSCs
Patient 2
P2
Paciente
2
Patient 3
P3
Paciente
3
Análisis proteómico de las hMSC inducidas con EWS-FLI1.
Análisis proteómico de las hMSC inducidas con EWS-FLI1.
Eventos adicionales en la génesis del Sarcoma de Ewing.
Objetivos 2008-2009
• Interferencia estable EWS-FLI1
• Eventos previos a la translocación
• Cambios en la señalización
inmediatamente tras la transfección de
EWS-FLI1
• Factores predictivos de respuesta a
terapias anti IGF1R
from KIT to IGF1R
C-KIT
Imatinib
PI3K
STAT5
STAP1
IGF1R
IGF1
SCF
742
AD W
IRS
RAS
RAF
AKT
MEK1/2
BAD
VCR
Apoptosis
DXR
mTOR
Síntesis
proteica
ERK
proliferación
Martins AS Figure 1
A)
5
4
5
Response to stress in ES cell lines
treated with anti-IGF1R agents
3
2
1
5
B)
cellular functions changed
17%
stress response/chaperoning
21%
cell proliferation
apoptosis
4%
transcription
4%
cellular adhesion/motility
4%
redox regulation
17%
mithocondrial respiration
11%
cell cycle
others
11%
11%
HSP90
C)
*
180
*
*
140
*
*
*
120
% signal
A673
TC-71
SK-ES-1
A4573
TTC466
HSP90 expression
160
100
*
*
80
*
*
40
*
*
60
*
**
**
*
*
20
0
control
ADW
IMA
24 hours treatment
A+I
control
ADW
IMA
A+I
72 hours treatment
Martins AS et al, Canc Res 2008, patent application
Martins AS Figure 2
A)
17-AAG µM
24h
72h
1.33
0.57
+/- 0.17
+/- 0.05
1.12
0.49
+/- 0.08
+/- 0.06
1.01
0.42
+/- 0.08
+/- 0.04
1.24
0.45
+/- 0.11
+/- 0.04
1.62
0.72
+/- 0.1
+/- 0.06
Cell lines
A673
TC-71
SK-ES-1
A4573
TTC466
ADW742* µM
24h
72h
5.2
1.41
+/- 0.67
+/- 0.28
5.03
0.67
+/- 0.74
+/- 0.08
5.11
0.55
+/- 0.71
+/- 0.05
4.30
0.64
+/- 0.63
+/- 0.06
5.1
1.20
+/- 0.43
+/- 0.30
Imatinib* µM
24h
72h
18.36
18.77
+/- 0.80
+/- 4.02
17.45
22.00
+/- 0.79
+/- 3.20
14.32
18.90
+/- 0.90
+/- 3.60
15.08
20.12
+/- 1.11
+/- 2.21
17.8
19.20
+/- 1.2
+/- 2.10
HSP90
inhibitor
17-AAG
inhibited
ES
cell
line
proliferation and survival in a
dose-dependent manner.
14
* previously published
AV
PI
PI
PI
PI
B)
AV
control
AV
AV
10uM Imatinib
0,25uM ADW742
PI
PI
0,1uM 17-AAG
AV
AV
0,1AAG+0,25ADW
0,1AAG+10IMA
C)
Alive
120%
A/N
100%
A673
%cells
80%
60%
40%
20%
IMA
ADW
0,25AAG+0,1A
0,25AAG+0,25A
0,25AAG+0,5A
0,25AAG+5I
0,25AAG+10I
0,25AAG+15I
5IMA
10IMA
15IMA
ADW
0,1AAG+0,1A
0,1AAG+0,25A
0,1AAG+0,5A
0,1AAG+5I
0,1AAG+10I
0,1AAG+15I
0,1ADW
0,25ADW
0,5ADW
CONTROL
0,1AAG
0,25AAG
0%
IMA
IMA
ADW
AAG
17-AAG
Alive
120%
A/N
100%
60%
40%
20%
ADW
AAG
IMA
ADW
0,25AAG+15I
0,25AAG+5I
0,25AAG+10I
0,25AAG+0,5A
0,25AAG+0,1A
0,25AAG+0,25A
0,1AAG+15I
0,1AAG+5I
0,1AAG+10I
0,1AAG+0,5A
0,1AAG+0,1A
5IMA
15 IMA
IMA
0,1AAG+0,25A
ADW
10IMA
0,5ADW
0,25ADW
0,1ADW
0,25AAG
0,1AAG
0%
CONTROL
%cells
A4573
80%
IMA
17-AAG
HSP90 stress-response
development is a specific
mechanism of resistance to
IGF1R treatment in ES.
Martins AS Figure 4
A)
A673
-
TTC466
+
-
+
-
+
-
+
HSP90
GAPDH
B)
TTC466
A673
17-AAG or HSP90siRNA treatment
effetcs on A673 proliferation
no treatment
siRNAHSP90
100
pro liferation (% )
125
**
*
*
*
*
50
*
*
**
**
25
0,1
0,25
0,5
5
10
siRNAHSP90
17-AAG
75
*
*
50
*
*
*
**
*
25
0
15
control
0,1
0,25
0,5
IMA
ADW
siRNA technology for HSP90 in
cell lines resistant to anti IGF1R
*
**
*
0
control
siRNAneg.control
100
17-AAG
75
no treatment
17-AAG or HSP90siRNA treatment
effects on TTC466 proliferation
siRNAneg. Control
proliferation (% )
125
5
10
15
IMA
ADW
C)
A4573
transfection 0h
24h
SK-ES-1
48h
96h
0h
24h
TC-71
48h
96h
0h
24h
48h
96h
HSP90
GAPDH
D)
*
HSP90 overexpression effetcs
on A4573 proliferation
*
p roliferatio n (% )
100
*
no treatment
HSP90clon
mock
*
*
*
*
75
50
125
0
0
0,25
0,5
ADW
5
10
15
IMA
no treatment
HSP90clon
mock
*
50
25
0,1
HSP90 overexpression effetcs
on T C71 proliferation
*
*
75
25
control
*
100
pro liferation (% )
125
control
0,1
0,25
0,5
ADW
5
10
15
IMA
HSP90 over-expression in ES cell
lines sensitive to anti IGF1R
Martins AS et al, Canc Res 2008 patent application
A)
T u m o r v o lu m e e v o lutio n
3
tum or volum e (cm
)
2500
Ewing sarcoma cell
lines
resistant
to
ADW/IMA
treatment
respond to 17-AAG
treatment,
alone
or
combined with anti
IGF1R
control
A E W 541
17-AA G
17-AA G+A E W
2000
1500
1000
*
500
*
*
*
*
8
10
*
*
**
***
12
15
0
0
3
5
days
IGF1R
17-AA G+AE W
combining HSP90 and
inhibition in ES xenografts.
control
B)
A significant subgroup of clinical samples showed diffuse HSP90 expression.
Correlation between IGF1R and HSP90
expression in ES clinical samples
IGF1R+
IGF1R-
HSP90 +
18
5
HSP90 -
20
10
Martins AS et al, Canc Res 2008 , patent application
Lab. PMS
Ana Pastora Otero
Ana Sofía Martins
Ana Teresa Amaral
Carlos Mackintosh
Daniel Osuna
David Herrero
Gemma Caballero
José Luis Ordóñez
Juan Madoz
Victoria Sevillano
Universidad de Salamanca