Hematolog a22000emplane

Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):78-89
Artículos de revisión
Instituto de Hematología e Inmunología
UTILIZACIÓN DE LA SANGRE Y SUS COMPONENTES CELULARES
Dr. Lázaro Cortina Rosales y Dra. María del Rosario López De Roux
RESUMEN
La terapia transfusional es una ciencia en constante renovación. En la actualidad las
ventajas de la transfusión de componentes individuales han limitado el empleo de
sangre total. Los parámetros clínicos y no la cifra de hemoglobina son determinantes
al decidir una transfusión de concentrados de hematíes. Se ha podido comprobar que
la refractariedad a la administración de plaquetas como consecuencia de la
aloinmunización es elevada, por lo tanto, las indicaciones para su empleo son precisas.
La poca efectividad de los concentrados de granulocitos y sus múltiples efectos
adversos han cuestionado su empleo. Los componentes celulares especiales son
costosos y requieren de procedimientos engorrosos para su elaboración, por lo que
deben utilizarse en pacientes seleccionados con indicaciones estrictas. Las
características anátomo-fisiológicas de los pacientes pediátricos y especialmente de
los recién nacidos y lactantes, hacen que la terapia transfusional tenga sus
particularidades. Los beneficios de la transfusión de componentes celulares son reales,
sin embargo, pueden presentarse efectos adversos importantes y por eso cada
indicación requiere una valoración profunda que garantizará un mejor aprovechamiento
y éxito de la hemoterapia.
Descriptores DeCS: TRANSFUSION SANGUINEA; PEDIATRIA; TRANSFUSION
DE COMPONENTES SANGUINEOS.
La transfusión de sangre ha adquirido
en nuestros días un gran desarrollo y
seguridad; sin embargo, una práctica transfusional adecuada requiere de una
constante y crítica valoración clínica, si se
tiene en cuenta que la transfusión de sangre
alogénica continúa siendo riesgosa. En un
estudio publicado recientemente en Estados
Unidos de Norteamérica se determinó que
las complicaciones como la reacción febril
no hemolítica (RFNH) y la urticaria se
presentan en 1:100 unidades transfundidas,
la hemólisis inmune en 1-6 000 unidades y
la hemólisis inmune fatal en 1-100 000
unidades; el riesgo de transmisión de hepatitis
B y C es de 1 x 65 000 y 1 x 100 000 unidades,
respectivamente, mientras que para el VIH
es de 1 x 500 000 unidades y los virus
78
− Concentrados de hematíes congelados.
− Concentrados de hematíes libres de
leucocitos por filtración.
− Plasma rico en plaquetas.
− Concentrados de plaquetas.
− Concentrados de plaquetas obtenidos
por aféresis.
− Concentrados de leucocitos.
− Componentes irradiados.
− Plasma fresco congelado.
− Plasma homólogo.
− Crioprecipitado.
linfotrópicos humanos I y II tienen una
probabilidad de 1 x 50 000.1,2
Algunos de los problemas presentes
en la práctica transfusional corriente, son
la elevada proporción de transfusiones que
son catalogadas como innecesarias y la
variabilidad en los criterios para
determinar la necesidad de una transfusión,
los que suelen ser complejos y de difícil
aplicación a una población heterogénea.2,3
Estos
hechos
representan
una
preocupación para la medicina
transfusional y exigen una revisión sobre
el uso de la sangre y sus componentes.
SANGRE TOTAL FRESCA
LA TRANSFUSIÓN DE SANGRE
Y SUS COMPONENTES
El empleo de sangre fresca de menos
de 24 horas es una práctica transfusional
del pasado. Una unidad de sangre total
contiene hematíes, leucocitos, plaquetas,
proteínas plasmáticas, globulinas, anticuerpos, factores estables de la coagulación, etc., y 63 mL de anticoagulante.
Tiene un hematócrito ligeramente menor
al del donante, debido a la dilución por el
anticoagulante / preservativo (CPDA-1) y
su volumen es de 450 +/- 45 mL. Existen
varios elementos que no aconsejan su uso,
como son: mayor posibilidad de
transmisión de enfermedades virales; no
suele estar disponible de forma fresca dado
los complejos y numerosos controles que
requiere la sangre; las plaquetas y proteínas
de la coagulación contenidas en una unidad
de sangre total fresca son insuficientes en
cantidad y calidad para corregir defectos
específicos, solo aportados por los
concentrados de plaquetas y factores de la
coagulación. No obstante, algunas instituciones emplean la sangre total en las
siguientes circunstancias:5
La sangre es una mezcla de diversas
poblaciones celulares y proteínas
plasmáticas en un medio acuoso. Cada uno
de estos elementos tiene una función bien
definida. El objetivo de la transfusión es
remplazar el producto sanguíneo deficitario
en el paciente desde el punto de vista
cuantitativo o cualitativo. Desde los inicios
del siglo XX, algunos médicos predicaban
el empleo de componentes individualizados
a partir de la sangre total, recomendaban la
utilización de hematíes desplasmatizados en
la anemia sin hipovolemia y el uso solo de
plasma en caso de quemaduras graves.4 No
fue hasta la década de los 60, con el
desarrollo de material plástico para las
bolsas y equipos de transfusión, que se hizo
una práctica rutinaria la separación de la
sangre en componentes, lo que permitió una
mayor racionalidad y respetar las
necesidades del enfermo.
SANGRE Y SUS COMPONENTES
− Transfusión masiva.
− Exanguinotransfusión.
− Cirugía cardio-pulmonar con circulación
extracorpórea.
− Sangre total fresca.
− Concentrados de hematíes.
− Concentrados de hematíes lavados.
79
En estas situaciones, es más adecuado
el empleo de concentrados de glóbulos
rojos combinados con sustancias
cristaloides y coloides y según los
resultados de laboratorio y la existencia
de sangramiento microvascular, se
administrarán otros componentes
(concentrados de plaquetas, plasma fresco
congelado o ambos). No está indicada
como expansor de volumen.5
Dosis: debe ajustarse a las necesidades
clínicas del paciente. Una unidad debe
producir un incremento de la concentración
de hemoglobina (Hb) en 10 g/L.
La duración de la administración no
debe ser mayor de 4 horas.
se correlaciona con la cuantía de esta y
el estado clínico del paciente:7,9,10
− Pérdidas menores del 20 % del
volumen sanguíneo estimado no suelen
ocasionar síntomas y la transfusión de
hematíes no es necesaria, salvo en
aquellos pacientes que previamente
tenían niveles de Hb menores de 100 g/L
o exista alguna enfermedad de base que
determine la aparición de trastornos
cardiovasculares y síntomas de
hipovolemia.
− Las pérdidas mayores o iguales al 20 %
del volumen sanguíneo estimado suelen
ser sintomáticas y deben administrarse
glóbulos rojos precedidos de sustancias
cristaloides y coloides para reponer el
volumen sanguíneo y la capacidad de
transporte de oxígeno; otros componentes de la sangre se administrarán
según los resultados de los exámenes
de laboratorio.
3. La transfusión perioperatoria: la práctica
de la anestesia quirúrgica ha sido guiada
por la creencia de que un valor de Hb
menor de 100 g/L o un hematócrito
menor del 30 % es una indicación para
la transfusión. En nuestros días estos
criterios son discutidos y se señala con
insistencia que en lugar de corregir un
valor de laboratorio, deberán tomarse en
consideración múltiples factores como
la duración de la anemia, el volumen
intravascular, extensión de la cirugía,
probabilidad de una pérdida masiva de
sangre, así como otras condiciones
coexistentes, como son: deterioro de la
función respiratoria, gasto cardíaco
inadecuado, isquemia miocárdica o
cerebrovascular y la enfermedad
vascular periférica.
Si la persona está sana y no existen
factores de riesgo adicionales asociados
a la naturaleza de la cirugía, los niveles
de Hb menores o iguales a 80 g/L serán
bien tolerados si el paciente está bien
controlado. Un estudio de 82 pacientes
con un hematócrito medio de 24,5 %
Concentrados de hematíes
Se obtienen después que la sangre total
ha sido centrifugada y separado el plasma
y la capa leucoplaquetaria. Las células
rojas en solución CPDA-1 se almacenan
hasta 35 días a una temperatura entre 2 y
6 °C; tiene un volumen de 250 a 300 mL y
un hematócrito final no mayor del 80 %.
El objetivo fundamental de su empleo es
mejorar la capacidad de transportar
oxígeno.
Una unidad de concentrado de
hematíes debe incrementar los niveles de
hemoglobina en 10 g/L y el hematócrito
en 3 % en un receptor de 70 kg de peso.
En la actualidad, los criterios más
aceptados para la transfusión de
concentrados de hematíes son los
siguientes: 5-8
1. Anemia sintomática en un paciente
normovolémico independiente de los
niveles de Hb. El estado clínico del
paciente y no el resultado de laboratorio
es el factor más importante para determinar las necesidades transfusionales.
2. En las pérdidas agudas de sangre la
necesidad de la transfusión de glóbulos
80
no reveló un aumento de la morbilidad
intraoperatoria, ni de la mortalidad
posoperatoria.5
4. Hemoglobina menor o igual a 90 g/L
en un paciente en régimen de
hipertransfusión crónica (β talasemia
mayor).11
5. Complicaciones de la drepanocitosis:
la transfusión de glóbulos suele ser
necesaria en muchas de las complicaciones como son la crisis aplástica,
crisis de secuestro, accidentes vasculares encefálicos, síndrome torácico
agudo, priapismo, entre otras. Teniendo
en cuenta las características y la
gravedad de estas se emplea la
transfusión simple, la exanguinotransfusión o el régimen de transfusión
crónica.12,13
6. Hemoglobina menor o igual a 80 g /L en
pacientes que reciben radioterapia o
quimioterapia.
No constituyen indicaciones de
transfusión de hematíes la promoción
de la cicatrización de heridas, la
prevención de infecciones o la corrección del tiempo de sangría prolongado.
plaquetas del paciente, el valor que se desea
alcanzar, el volumen sanguíneo y la
presencia de factores secundarios que
compliquen la respuesta; sin embargo,
empíricamente se ha adoptado la dosis
de 1 unidad / 10 kg de peso o 4 unidades / m2
de superficie corporal, con lo cual se logra
un incremento de la cifra de plaquetas
mayor o igual a 50 x 109/L sobre el conteo
previo y se obtiene un efecto terapéutico
satisfactorio. El intervalo entre las
siguientes dosis lo determinará el estado
clínico del paciente y la existencia de
situaciones que disminuyan la sobrevida
plaquetaria; en casos de trambocitopenia
no complicada la transfusión está indicada
2 ó 3 veces por semana, mientras que en
pacientes que presenten fiebre, sepsis,
hepatoesplenomegalia, sangrado activo,
sometidos a quimioterapia y otros
agravantes, es necesario suministrar
plaquetas 2 veces al día. El PRP suele ser
similar al concentrado de plaquetas
obtenido de un donante, con la desventaja
de contener un mayor volumen de plasma.
La velocidad de administración está
determinada por la tolerancia al volumen
y el tiempo máximo de infusión debe ser
de 4 horas. Las plaquetas se almacenan en
agitación continua a 22 °C por un período
de 5 días, si permanecen a 4 °C sin
agitación su viabilidad disminuye. La
transfusión de plaquetas puede ser
profiláctica o terapéutica y los criterios
para su indicación son los siguientes: 5-7,13,14
CONCENTRADOS DE PLAQUETAS
Y PLASMA RICO EN PLAQUETAS
(PRP)
La transfusión de plaquetas es
apropiada para prevenir o controlar los
sangramientos asociados a defectos
cualitativos o cuantitativos de las
plaquetas. El concentrado de plaquetas
obtenido de una unidad de sangre entera
contiene de 0,55-0,75 x 1011 plaquetas en
40-60 mL de plasma y en condiciones
óptimas es de esperar que eleve el recuento
plaquetario en un receptor de 70 kg de peso
en 5 000 a 10 000. Para establecer la dosis
óptima y la frecuencia de administración,
se deben tener en cuenta el número de
TRANSFUSIÓN PROFILÁCTICA
1. Trombocitopenia hipoproliferativa con:
− Recuento plaquetario menor o igual a
10 x 109/L sin sangramiento.
− Recuento plaquetario menor o igual a
20 x 109/L sin sangramiento, pero con
factores que favorecen la ocurrencia
del mismo: infecciones, fiebre, espleno-
81
−
−
−
2.
megalia, lesión anatómica, medicación
anticoagulante, coagulopatía.
Recuento plaquetario menor o igual
a 50 x 10 9 /L y cirugía mayor o
proceder invasivo.
Recuento plaquetario menor o igual a
100 x l0 9/L y cirugía de cerebro.
Los pacientes con leucemia y recuento
de blastos mayor de 100 000 en sangre
periférica deben mantener niveles de
plaquetas mayores de 50 x 109/ L por el
peligro de leucostasis cerebral o
pulmonar.
En pacientes con disfunción plaquetaria
y cirugía inminente, parto, proceder
invasivo, extracción dentaria, teniendo
presentes las características individuales de cada paciente.
tromboféresis. Contiene una dosis
terapéutica para un paciente adulto (>3 x
1011 plaquetas). El volumen oscila entre 200
y 500 mL.
El contenido en leucocitos varía según
el separador celular empleado y si el
procedimiento incluye filtrado prealmacenaje.
Están particularmente indicados en
aquellos pacientes que van a recibir
múltiples transfusiones de plaquetas
(trasplante de médula ósea), para disminuir
el número de exposiciones a donantes y así
reducir el riesgo de sensibilización a
antígenos leucocitarios y plaquetarios.
También si se necesitan plaquetas tipadas
HLA-HPA o con prueba cruzada compatible
para aquellos pacientes que desarrollan una
refractariedad de tipo inmunológico.
No son más útiles que los concentrados
de plaquetas en la coagulación intravascular
diseminada, púrpura trombocitopénica
autoinmune y esplenomegalia.
La conservación, caducidad y
administración es similar a los concentrados
de plaquetas habituales.
El aumento esperado de recuento
plaquetario es de 30 a 60 x 109/L a los 60
minutos posteriores a la transfusión.15
TRANSFUSIÓN TERAPÉUTICA
1. Síndromes hemorrágicos en el curso de
trombocitopenia; en estos casos constituye una meta razonable alcanzar cifras
en el recuento plaquetario postransfusional mayores o iguales a 40 x 109 /L.
2. Sangramiento microvascular difuso en
un paciente con coagulación intravascular diseminada o transfusión
masiva y un recuento de plaquetas no
disponible o menor de 50 x 109/L.
3. Sangramiento microvascular difuso que
se presenta posterior a un bypass
cardiopulmonar o balón intraaórtico y
recuento plaquetario no disponible o
menor de 100 x 109/L.
4. Sangramiento microvascular y
disfunción plaquetaria con tiempo de
sangramiento prolongado.
CONCENTRADOS DE
GRANULOCITOS
Se preparan por 2 métodos: leucoféresis
por centrifugación con flujo continuo o
intermitente y leucoféresis por filtración, se
almacenan entre 20 y 24 °C durane 24 horas,
pero lo mejor es transfundirlos tan pronto
como sea posible luego de la extracción, ya
que a partir de las 8 horas de almacenamiento muestran una reducción de la
capacidad circulante y migratoria de los
granulocitos.5
Aunque los primeros estudios
mostraron beneficios en adultos con
neutropenia reversible e infecciones por
CONCENTRADOS DE PLAQUETAS
OBTENIDOS POR AFÉRESIS
Suspensión de plaquetas de donante
único obtenido mediante procedimiento de
82
que a las 48 horas no responde al
tratamiento antibiótico agresivo, con
hipoplasia mieloide y la posibilidad
razonable de recuperar la función de la
médula ósea.
− Los pacientes con disfunción granulocítica documentada (enfermedad
granulomatosa crónica) y sepsis
bacterianas progresivas.16,17
gérmenes gramnegativos que no
respondían al tratamiento antibiótico, la
experiencia acumulada posteriormente en
pacientes sometidos a trasplante de médula
ósea con infecciones ha sido decepcionante, es por eso que su eficacia clínica
en adultos es un tema de controversia
actualmente. 16-18 Se señalan otros
elementos que han reducido su empleo,
como el uso de nuevos agentes
antimicrobianos más potentes, 5,16 los
factores estimuladores de colonias que
acortan el período de aplasia 16 y los
efectos adversos, que suelen ser
frecuentes y de importancia clínica
(transmisión de citomegalovirus, reacción
pulmonar fatal, enfermedad de injerto
contra huésped (EICH), inmunomodulación, reacciones febriles no hemolíticas).16,17
Dosis: es otro aspecto en discusión.
Los concentrados habitualmente (75 %)
tienen al menos 1010 neutrófilos, lo que
para un paciente de 70 kg de peso
equivale a 1,5/108 neutrófilos x kg de
peso. Sin embargo, un individuo saludable
tiene un recambio diario de 10 11
neutrófilos y es mucho mayor en pacientes
con enfermedades inflamatorias. La dosis
de 10 10 es sólo la décima parte del
recambio diario, si fuera posible
suministrar 10 11 neutrófilos por
transfusión podría esperarse una respuesta
clínica convincente.13
En lactantes sépticos los resultados
obtenidos han sido satisfactorios, esto se
ha atribuido a la dosis relativamente mayor
en receptores con menor superficie
corporal o porque está ausente la
aloinmunización. 5,7,16
A pesar de que el uso de la transfusión
de granulocitos ha disminuido considerablemente, los criterios clínicos para
su empleo no han cambiado:16-18
Siempre que se decida indicar una
transfusión de concentrado de granulocitos, debe administrarse una dosis diaria
hasta que se controle la infección o cese el
período de aplasia. La velocidad de infusión
debe ser lenta, de 1 a 4 horas y se debe
tener presente no administrar Anfotericin
B en las primeras 4 horas posteriores a la
transfusión de granulocitos, ya que se ha
observado un aumento en la incidencia de
disfunción pulmonar aguda.16
La transfusión profiláctica no es
aceptada.
TRANSFUSIÓN EN PEDIATRÍA
Muchos de los lineamientos señalados
para la transfusión en adultos son aplicados
en pacientes pediátricos, aunque existen
diferencias anatomofisiológicas que
determinan indicaciones particulares,
principalmente en recién nacidos y
lactantes. Estos pacientes tienen un
volumen sanguíneo mayor en relación con
su superficie corporal (85 mL x kg de
peso), los mecanismos de compensación
cardiovascular son inmaduros, esto los
hace más susceptibles a la hipovolemia y
el control de la temperatura corporal no
es eficiente con peligro de desarrollar
hipotermia si se emplean componentes sin
la temperatura adecuada. El defecto
fisiológico del sistema inmune ocasiona
una mayor susceptibilidad a las infecciones
− Pacientes con neutropenia menor de
0,5 x 109, e infección bacteriana severa
83
transmitidas por la sangre, así como la
inmadurez de órganos vitales (riñón e
hígado) determina el empleo de componentes frescos (menores de 5 días) para
evitar las complicaciones metabólicas.5,19
flebotomías para exámenes de
laboratorios exceden el 10 % del
volumen de sangre, en una semana.
− Hemoglobina menor de 80 g/L en un
recién nacido con manifestaciones
clínicas de anemia.
SANGRE TOTAL O SANGRE
RECONSTITUIDA
NIÑOS MAYORES DE 4 MESES DE EDAD
Indicaciones: 6,19,20
Los criterios para su uso son:
− Hemoglobina preoperatoria menor de
80 g/L cuando la terapia alternativa no
es aconsejable o la Hb posoperatoria
es menor de 80 g/L y el paciente tiene
síntomas y signos de anemia.
− Pérdida aguda mayor o igual al 15 %
del volumen de sangre o existen
síntomas y signos de anemia que no
responden a la administración de
fluidos.
− Hemoglobina menor de 130 g/L y
enfermedad cardiopulmonar severa.
− Hemoglobina menor de 80 g/L en
pacientes que reciben quimioterapia
y/o radioterapia.
− Complicaciones de la drepanocitosis. 12,13
− Hemoglobina menor de 80 g/L en
pacientes con anemia crónica sin
esperanza de respuesta a medicamentos o síntomas y signos de anemia.
− Enfermedades con régimen de
transfusión crónica (talasemia, etc).
1. Exanguinotransfusión por enfermedad
hemolítica del recién nacido u otra
entidad que ocasiona aumento de la
bilirrubina no conjugada con peligro de
kerníctero.
2. Oxigenación por membrana extracorpórea y bypass cardiopulmonar.
3. Reposición de más de un volumen de
sangre en 24 horas.
CONCENTRADOS DE GLÓBULOS
ROJOS
Se emplearán a razón de 5 a 15 mL/kg
de peso y la velocidad de infusión debe ser
de 2 a 5 mL/kg de peso x hora.
NIÑOS MENORES DE 4 MESES DE EDAD
La transfusión de glóbulos rojos en
este grupo de edad está generalmente
relacionado con la anemia del prematuro y
menos comúnmente con la pérdida aguda
de sangre, aplasia de células rojas y
episodios agudos de hemólisis secundarios a esferocitosis hereditaria, déficit
enzimáticos, etc.19
Indicaciones: 5, 6, 19,20
CONCENTRADOS DE PLAQUETAS
Y PRP
En los pacientes prematuros menores de
37 semanas de edad gestacional, la
administración de este componente tiene
indicaciones específicas:6,15
− Hemoglobina menor de 130 g/L y
enfermedad pulmonar severa, cardiopatía cianótica o fallo cardíaco.
− Pérdida aguda de más del 10 % del
volumen de sangre o cuando las
− Recuento de plaquetas menor de 50 x
109 L en ausencia de sangrado.
− Recuento de plaquetas menor de
100 x 10 9 /L y hemorragia activa.
84
En los no prematuros:
-
especiales, estos son costosos, requieren
tiempo adicional de preparación y su vida
media es corta; es por eso que su indicación
debe ser previamente justificada.
Neonatos con menos de 20 x 109/L.
Si el exceso de volumen representa un
problema potencial, se debe extraer
plasma de la unidad y la velocidad de
infusión estará determinada por esta
situación, aunque no debe ser mayor de 4
horas. En neonatología el objetivo
habitualmente es aumentar la cifra de
plaquetas por encima de 100 x 10 9/L.
Siempre que sea posible transfundiremos
isogrupo. La transfusión de plasma
incompatible es más peligrosa que en
adultos, debido a que su volumen de sangre
es menor. El plasma incompatible debe
eliminarse hasta donde sea posible y
resuspender las plaquetas en plasma
compatible.
CONCENTRADOS DE HEMATÍES
DESLEUCOCITADOS POR FILTRACIÓN
Los componentes celulares que
contienen células blancas pueden causar
efectos adversos, incluyendo reacciones
febriles, aloinmunización, refractariedad
plaquetaria, enfermedad de injerto contra
huésped, inmunomodulación e infecciones. La reducción de leucocitos en los
concentrados de hematíes previene
algunos de estos efectos. Existen varios
tipos de filtros disponibles para la
remoción de leucocitos, que pueden
extraer entre el 70 y el 99,9 % de los
leucocitos presentes en la unidad, en
dependencia del tipo de filtro utilizado.
Sus indicaciones más frecuentes
son: 4,6,7,22
CONCENTRADOS DE GRANULOCITOS
Indicaciones en neonatos:6,19-21
− Infección bacteriana en recién nacido
menor de 2 semanas de edad con conteo
de neutrófilos menor de 3 x 109/L.
− Infección bacteriana o fúngica diseminada que no responde al tratamiento
antibiótico en pacientes mayores de
2 semanas de edad y conteo de
neutrófilos menores de 0,5 x 109/L.
− Infección que no responde a los
antibióticos y la presencia de un
defecto cualitativo de los neutrófilos
independiente del recuento.
− Prevención
de la reacción
transfusional febril no hemolítica
recurrente.
− Prevención o retraso de la aloinmunización por antígenos leucocitarios de
histocompatibilidad (HLA) y de la
refractariedad plaquetaria en pacientes
seleccionados que requieren transfusiones repetidas.
− Prevenir la trasmisión de virus
intraleucocitarios particularmente
CMV.
La dosis promedio es de 10 mL/kg de
peso y la velocidad de infusión lenta (4
horas).
Su utilidad para prevenir la enfermedad
de injerto contra huésped es discutida y no
es una técnica aceptada para prevenir la
reacción pulmonar aguda, ya que en ella el
elemento fisiopatogénico más importante es
el paso de anticuerpos del donante con
especificidad por antígenos leucocitarios.6,7
COMPONENTES CELULARES
ESPECIALES
En ciertos grupos de pacientes es
aconsejable el empleo de componentes
85
− Unidades para la transfusión de
pacientes aloinmunizados, cuando las
unidades antígeno negativas son de
difícil obtención por poseer múltiples
aloanticuerpos o ser un antígeno muy
frecuente en la población.
− Reservas para movilizaciones militares
y catástrofes civiles.5
− Como en su preparación se emplean
lavados múltiples, las indicaciones de
hematíes lavados y desleucocitados se
hacen extensivas a este tipo de
componente.
CONCENTRADOS DE HEMATÍES
LAVADOS
Este proceso elimina la mayor parte
de las proteínas del plasma,
microagregados y citocinas, así como
cantidades variables de plaquetas y
leucocitos. Su desventaja reside en que son
más costosos, tienen una corta vida de
almacenamiento (6 horas), ocurren
pérdidas hasta del 20 % de eritrocitos y es
menos efectivo que los filtros en la
eliminación de los leucocitos. Los
criterios para su uso son:6,7,22
− Pacientes con historia de reacción
anafiláctica a componentes de la
sangre.
− Déficit de IgA documentada con
anticuerpos anti IgA.
− Reacciones urticarianas severas no
prevenibles con antihistamínicos.
− Prevención de la aloinmunización
contra antígenos leuco-plaquetarios y
la reacción febril no hemolítica cuando
se carece de filtros de absorción de
leucocitos y plaquetas.
− Reacciones febriles no prevenibles por
el empleo de hematíes desleucocitados.
− Púrpura aloinmune neonatal cuando la
madre es la donante.
COMPONENTES LIBRES DE CMV
No es necesario suministrar sangre
CMV-negativa o libre de leucocitos a todos
los pacientes porque la infección adquirida
de CMV raramente causa secuelas clínicas
en individuos inmunocompetentes. Los
pacientes inmunocomprometidos presentan riesgo de enfermedad grave; los
métodos habituales que reducen el riesgo
de infección por CMV son la transfusión
de sangre de donantes seronegativos y los
concentrados desleucocitados, sin
embargo, el primer método es más seguro.
Indicaciones de sangre seronegativa
para CMV:6,22,23
− Mujeres embarazadas y fetos CMVseronegativos
− Recién nacidos con un peso menor
1 200 g nacidos de madres seronegativas.
− Receptor de trasplante de médula ósea
(TMO) alogénico CMV-seronegativo y
donante también seronegativo.
− En pacientes con infección por VIH y
que son CMV seronegativos.
HEMATÍES CONGELADOS
Y DESGLICEROLIZADOS
La producción de estos concentrados
suele ser costosa y engorrosa. Además,
ocurre cierto grado de hemólisis con
disminución del hematócrito inicial
cuando se conservan a –196 °C en
nitrógeno líquido. Hay un aumento del
potasio extracelular. La no desglicerolización total puede producir hemólisis in
vivo. El período de almacenamiento es
largo, de 10 años o más, lo cual le
confiere indicaciones precisas: 5-7,22
Son más controvertidas las siguientes
indicaciones de concentrados libres de
CMV:
− Receptor de trasplante de órgano CMVseronegativo y donante seropositivo.
− Para almacenamiento de unidades de
hematíes autólogos por más de 42 días.
86
− Pacientes CMV seronegativos candidatos potenciales a TMO alógenico
o autólogo.
− Receptor de TMO autólogo CMV
seronegativos.
− Pacientes CMV seronegativos que se
les ha practicado esplenectomía.
− Pacientes con tumores sólidos con
tratamiento inmunosupresor.
− Prematuros con peso menor de 1 200 g.
En los últimos años, la percepción del
riesgo-beneficio de la transfusión sanguínea ha cambiado dramáticamente. Al
exponer en este trabajo criterios actualizados
en relación con el empleo de la sangre total
y sus componentes celulares, no pretendemos imponer esquemas de indicaciones
absolutas, sino que cada institución
teniendo en cuenta su experiencia clínica y
los recursos a su alcance, sea capaz de
introducir estos nuevos conceptos en la
práctica. Todo médico al indicar una
transfusión debe formularse las siguientes
preguntas: ¿existe una indicación real para
la transfusión de sangre o sus componentes?, ¿cuál es el componente ideal que
necesita el paciente? ¿cuáles son los efectos
adversos de la transfusión, su prevención
y control? La adecuada valoración de cada
respuesta redundará en un mejor aprovechamiento y éxito de la terapia transfusional.
COMPONENTES SANGUÍNEOS
IR RADIADOS
Con la irradiación de los componentes
se reduce el riesgo de EICH al reducir la
respuesta proliferativa de los linfocitos. La
dosis habitual es de 25 Gy en la parte central
de la unidad con un mínimo de 15 Gy en las
otras partes del componente. Están
indicados en:4,6,7,22
− Receptores de TMO.
− Pacientes con síndromes de
inmunodeficiencia congénita.
− Fetos que reciben transfusión
intrauterina o recién nacidos a los que
se les practica exanguinotransfusión
siguiendo la transfusión intrauterina.
− Pacientes con enfermedad de Hodgking.
− Receptores de donaciones directas de
un miembro de la familia.
AGRADECIMIENTO
Algunas instituciones también
incluyen, aunque no de forma absoluta, los
casos siguientes:6
Agradecemos la asesoría científica de
la Dra. María Elena Alfonso Valdés, el Lic.
Antonio Bencomo Hernández y el Prof. José
Manuel Ballester Santovenia.
− Pacientes con otras enfermedades
malignas que no sean Hodgking.
SUMMARY
Transfusion therapy is a science of ongoing development. At present, the advantages
of the individual blood component transfusions have restricted the use of whole blood.
The clinical parameters rather than hemoglobin figures are determining in deciding
transfusion of red cell concentrates. It has been proved that refractoriness to platelet
administration as a consequence of alloimmunization is high, so indications for their
use should be clear. The low effectiveness of granulocyte concentrates and their multiple
adverse effects have questioned their use. Special cellular components are expensive
and require embarrassing procedures for their manufacture and therefore, they should
be used in selected patients under strict indications. The anatomical and physiological
87
characteristics of the pediatric patients specially infants and newborn provide
transfusion therapy with certain particularities. The benefits of transfusion of cellular
components are real; however, important adverse effects may come up and that is why
each indication demands a thorough assessment that assures a better use and the
success of hemotherapy.
Subject headings: BLOOD TRANSFUSION; PEDIATRICS; BLOOD COMPONENT
TRANSFUSION.
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Recibido: 25 de marzo de 1999. Aprobado: 11 de octubre de 1999.
Dr. Lázaro Cortina Rosales. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10 800, Ciudad de La
Habana, Cuba. Teléf: (537)578268. Fax:(537) 338979.e-mail:[email protected]
89
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):90-8
Instituto de Hematología e Inmunología
LA HEMOSTASIA EN EL EMBARAZO
Dra. Delfina Almagro Vázquez
RESUMEN
En el embarazo se producen alteraciones del mecanismo hemostático que determinan
condiciones particulares, las cuales propician la activación de este sistema biológico
ante estímulos que en otra situación serían adecuadamente controlados por el
organismo. Se ha comprobado que en el embarazo existe un estado de
hipercoagulabilidad, por lo que se ha incluido en el grupo de las llamadas trombofilias
adquiridas. En la tendencia trombótica del embarazo intervienen decisivamente
elementos esenciales del mecanismo hemostático, el sistema de la coagulación, las
plaquetas y el mecanismo fibrinolítico. Durante la gestación, se ha observado un
aumento progresivo del fibrinógeno y los factores VII, VIII, IX y von Willebrand,
complejos solubles de fibrina, complejos trombina-antitrombina y fragmentos 1
+ 2 de la protrombina. También se ha encontrado disminución de la proteína C y de la
proteína S, así como un aumento de la agregación plaquetaria, reducción de la capacidad
de respuesta a la estimulación por la prostaciclina y disminución de la formación de
AMPC . El embarazo ejerce un efecto notable sobre el sistema fibrinolítico
fundamentalmente por aumento progresivo del inhibidor del activador del plasminógeno
tipo 1 (PAI-1) y el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 2 (PAI-2).
Descriptores DeCS: HEMOSTATICOS; COMPLICACIONES HEMATOLOGICAS DEL
EMBARAZO; PLAQUETAS; FIBRINOLISIS.
o ambos, los que tienen una marcada
influencia en la mortalidad materna.
Un número importante de complicaciones obstétricas se expresan por
episodios hemorrágicos y algo más del 20 %
se deben a trastornos de la hemostasia.
Durante el embarazo ocurren alteraciones importantes en varios órganos y
sistemas, particularmente en aquellos
relacionados con el comportamiento de la
hemodinámica renal y cardiovascular. El
mecanismo hemostático sufre también
notables cambios durante la gestación y en
numerosas investigaciones se ha demostrado que las complicaciones relacionadas
con el embarazo presentan con frecuencia
trastornos hemostáticos, que se expresan
por episodios hemorrágicos, trombóticos
TENDENCIA TROMBÓTICA
EN EL EMBARAZO
En el embarazo se producen alteraciones del mecanismo hemostático que
90
determinan condiciones particulares, las
cuales propician la activación de este
sistema biológico ante estímulos, que en
otra situación serían adecuadamente
controlados por el organismo. Desde el
punto de vista clínico, esto se ha
comprobado por la demostración de que
la enfermedad trombótica y la coagulación
intravascular diseminada (CID) son más
frecuentes en las gestantes que en mujeres
no embarazadas1 y que en los accidentes
obstétricos la CID es una complicación
común,2 por lo que no fue casual que la
primera descripción de la CID fuera
comunicada por Seegers3 en pacientes con
complicaciones obstétricas.
La repercusión de estos trastornos en
los índices de mortalidad materna es sin
dudas relevante, si se tiene en cuenta que
entre el 74 y el 81 % de las muertes maternas
se deben a procesos trombóticos que
incluyen la CID. 4,5 Existe una amplia
variabilidad en la incidencia de trombosis
no fatal debido a las dificultades
diagnósticas de este trastorno por la
limitación del uso de algunas técnicas como
la venografía y los estudios con fibrinógeno
marcado;6 no obstante, con la introducción
de otros métodos diagnósticos como la
pletismografía de impedancia, se ha logrado
optimizar el diagnóstico de algunos eventos
trombóticos en estas pacientes.
Bergqvist y otros 7 encontraron el
0,07 % de trombosis durante el embarazo.
Estos mismos autores habían hallado una
incidencia del 1,8 % después de la cesárea.8
Por otra parte, Letsky y Swiet9 en una
revisión retrospectiva de 35 000
embarazadas, observaron que el 0,09 % de
los casos presentaron trombosis venosa
profunda (TVP) y tromboembolismo
pulmonar (TP). Más recientemente
Douketis y otros 10 encontraron una
incidencia de TVP sintomática de entre
0,018 y 0,27 por cada 100 partos.
Durante mucho tiempo se afirmó que
el riesgo de trombosis es mayor durante el
tercer trimestre del embarazo y en el período
de posparto. 11 Sin embargo, estudios
prospectivos recientes no han confirmado
este criterio.12
Los datos antes mencionados
demuestran que durante la gestación existen
evidencias de un estado de hipercoagulabilidad, por lo que el embarazo se
ha incluido en el grupo de las llamadas
trombofilias adquiridas.
Esta indudable tendencia a la trombosis
tiene múltiples causas. Además de los
trastornos de la hemostasia a que nos
referimos más adelante, otros factores,
presentes durante el embarazo, pueden
contribuir al desarrollo de eventos
trombóticos, entre ellos la disminución de
tono venoso con reducción del flujo
sanguíneo y la obstrucción mecánica del
útero grávido con el subsecuente estasis.
A continuación se detallan los factores
de riesgo que influyen en la aparición de
complicaciones tromboembólicas durante el
embarazo:
−
−
−
−
−
−
−
−
Cesárea.
Historia de trombosis.
Edad.
Número de partos.
Obesidad.
Reposo físico.
Hipertensión arterial.
Trombofilia congénita o adquirida.
Algunos de estos factores de riesgo
como la historia previa de trombosis,
obesidad, reposo prolongado, hipertensión
arterial y antecedentes de trombofilia
congénita y adquirida son similares a los
de la población general.
Recientemente ha sido encontrado un
aumento de la incidencia de la mutación
91
conocida como factor V Leiden en
mujeres embarazadas con episodios
trombóticos durante el embarazo y el
puerperio.13
Esta mutación consiste en una
sustitución en el residuo 506 de la
molécula del factor V de una arginina por
una glutamina, que es precisamente el sitio
de ruptura inicial de este factor por la
proteína C activa (PCA), lo que determina
una inactivación más lenta del factor Va y
provoca un estado de hipercoagulabilidad.14-16 Esta alteración molecular ha
sido encontrada en el 90 % de los pacientes
con resistencia a la PCA17 y se considera
que este trastorno es el defecto de la
coagulación más frecuentemente asociado
con la hipercoagulabilidad.18 WeinerMegnazi y otros 19 encontraron la
mutación factor V Leiden y resistencia a
la PCA en cerca del 50 % de pacientes con
desprendimiento prematuro de la placenta
y Decker y otros 20 observaron este
trastorno en el 16 % de embarazadas con
preeclampsia.
Algunos autores han encontrado una
reducción marcada del sangramiento
intraparto en mujeres con resistencia a la
PCA y sugieren que la mutación factor V
Leiden, aunque es particularmente
riesgosa en la población general, confiere
ciertas ventajas en cuanto a la
supervivencia en las portadoras de la
mutación, por la disminución del riesgo de
sangramiento durante el parto.21
La tendencia trombótica que se
presenta en el embarazo es expresión de
cambios importantes en componentes
esenciales del mecanismo hemostático:
sistema de la coagulación, plaquetas y
mecanismo fibrinolítico.
en el mecanismo de la coagulación, que
son:
− Aumento de fibrinógeno.
− Aumento de los factores VII, VIII, IX y
von Willebrand.
− Aumento de los complejos trombinaantitrombina.
− Aumento de los fragmentos 1+2 de la
protrombina.
− Disminución de la proteína C.
− Disminución de la proteína S.
Entre estos cambios se observa el
aumento progresivo de algunos factores de
la coagulación, particularmente el fibrinógeno y los factores VII, VIII, IX y von
Willebrand. Se ha demostrado que el
aumento de fibrinógeno es un factor de
riesgo independiente de trombosis.22-24 .
Por otra parte, el incremento de factor VII
se ha asociado con enfermedad coronaria
isquémica, y aunque no es un criterio
generalizado, algunos autores coinciden en
que el aumento de este factor es también
un factor de riesgo independiente de
trombosis.25 La elevación de los factores
VIII y von Willebrand se ha observado en
sujetos con tendencia trombótica.26
Actualmente se consideran como
marcadores de la activación del
mecanismo de la coagulación algunos
complejos moleculares que se forman
durante este proceso. En el embarazo se
ha observado un aumento de los complejos
solubles de fibrina, 27 los complejos
trombina-antitrombina (TAT),28 que junto
con el incremento de los fragmentos 1+2
de la protrombina, expresan la existencia
de activación de la coagulación.
Los moduladores o inhibidores
fisiológicos del mecanismo de la coagulación son de gran importancia en el
desarrollo de episodios trombóticos. En
el embarazo se han encontrado trastornos
CAMBIOS EN EL MECANISMO
DE LA COAGULACIÓN
DURANTE EL EMBARAZO
Se ha observado que durante el
embarazo ocurre una serie de cambios
92
en el sistema de la proteína C (PC) con
disminución de la PC y de la proteína S
(PS).29,30
La PC es un importante modulador de
la formación y degradación de la fibrina,
se sintetiza en el hígado en presencia de
vitamina K y es activada por un complejo
formado por la trombina y la trombomodulina, que es una proteína integral
de la membrana presente en la superficie
de las células endoteliales y un receptor
de alta afinidad para la trombina. La trombomodulina provoca un cambio
conformacional en la trombina que le
permite ejercer una acción activadora
sobre la PC, que es entonces liberada de
la superficie endotelial y se une a la PS
que es su cofactor. El complejo PCA-PS
inactiva los factores Va y VIIIa y promueve
la fibrinólisis por inhibición del inhibidor
del activador del plasminógeno-1 (PAI-1)
(fig.1). 31,32 Es importante señalar que el
40 % de la PS se encuentra en el plasma
en forma libre, que es su estado funcional,
y el resto no tiene actividad biológica y
está unida al componente del complemento
C4b. 33 La PS actúa incrementando la
afinidad de la PCA por los fosfolípidos
cargados negativamente, lo que propicia su
concentración en la superficie donde se
producen las reacciones procoagulantes y
permite que los factores Va y VIIIa sean
fácilmente accesibles a la acción de este
inhibidor.29
Algunos autores han estimado que las
manifestaciones trombóticas se presentan
en el 30 % de los pacientes con déficit de
PC y en el 35 % de los deficientes de PS.34
Munster y otros35 en un estudio
realizado en 42 mujeres embarazadas
encontraron que el 95 % de los casos tenía
disminución de la PS. Sin embargo, no
hallaron ninguna alteración en los niveles
de PC y antitrombina III.
Aunque se ha sugerido la posibilidad
de que el inhibidor de la vía del factor
tisular, que ejerce su acción sobre el
complejo factor tisular-factor VIIa, tenga
algún papel en el estado de
hipercoagulabilidad que se presenta en el
embarazo, aún no se conoce bien qué
factores influyen en los niveles de este
inhibidor durante la gestación.36
Proteína C
Trombina
Trombomodulina
Células endoteliales
Proteína C activada-proteína S libre
Inactivación de los
factores Va y VIIIa
Inhibición del
PAI-1
93
FIG. 1. Activación de la proteína C.
CAMBIOS EN LAS PLAQUETAS
DURANTE EL EMBARAZO
otros40 comprobaron que la sensibilidad de
las plaquetas a un análogo de la PGI2
disminuyó progresivamente durante la
gestación hasta llegar al 30 % al final del
embarazo. Más recientemente se ha
demostrado que durante el tercer trimestre
del embarazo existe una reducción de la
capacidad de respuesta de la adenilatociclasa a la estimulación por la PGI2
con una disminución de la formación de
AMPc, lo que explicaría, al menos en parte,
la activación plaquetaria in vivo que se
presenta en el embarazo.41
El AMPc es un segundo mensajero de
la activación plaquetaria y se forma a partir
del ATP por acción de la adenilatociclasa
(fig.2). Se ha demostrado que los agentes
que aumentan el AMPc intracelular, tales
como la PGE1 y la PGI2, limitan la
reactividad plaquetaria, ya que su elevación
incrementa la liberación de Ca++ a través
de la membrana y promueve su ingreso en
el sitio de almacenamiento, el sistema
tisular denso.42,43 Por otra parte, se ha
demostrado que la mayoría de las agonistas
de la activación plaquetaria suprimen la
formación de AMPc.44
Las plaquetas tienen también una
función importante en la tendencia
trombótica que se produce durante el
embarazo y pueden ocurrir los siguientes
cambios:
− Aumento de la agregación plaquetaria.
− Aumento de la prostaciclina en vasos
maternos y fetales.
− Reducción de la respuesta de la
adenilatociclasa a la estimulación por la
prostaciclina.
− Disminución de la formación de AMPc.
Al inicio de la década de los 80 se
comprobó que en la gestación existía un
aumento de la agregación plaquetaria.37
Algunos autores han observado que
la producción de prostaciclina (PG12),
prostaglandina sintetizada en la pared
vascular a partir de los endoperóxidos lábiles
y de conocida acción antiagregante y
vasodilatadora, está aumentada en los
vasos maternos y fetales cuando se
compara con vasos de mujeres no
embarazadas.38,39 Sin embargo, Briel y
Fosfodiesterasa
AMP
ATP
AMPc
Adenilatociclasa
Prostaciclina (PGI 2 )
FIG. 2. Formación del AMPc.
94
Además de los trastornos plaquetarios
relacionados con la tendencia trombótica
antes mencionados, durante el embarazo
se ha observado con cierta frecuencia la
presencia de tombocitopenia. Aunque
puede tener diversas causas, la mayoría de
los casos corresponde a la llamada
trombocitopenia gestacional o incidental,
si se descarta la preeclampsia.45
Este tipo de trombocitopenia puede
aparecer entre el 6 y el 60 % de los embarazos
y no representa ningún riesgo para la madre
y el feto.46 Altes y otros 47 encontraron una
incidencia significativamente superior, con
el 62 % de trombocitopenia de carácter
benigno en gestantes. Por otra parte,
Boehlen y otros48 hallaron el 8,7 % de
gestantes con trombocitopenia y anticuerpos antiplaquetarios. Sin embargo,
dichos autores señalan que la presencia de
estos anticuerpos no está relacionada con
la severidad de la trombocitopenia, su
persistencia después del parto y el riesgo
de trombocitopenia neonatal.
Para algunos autores, la trombocitopenia que se presenta en el embarazo
traduce probablemente la hiperdestrucción
plaquetaria fisiológica del último período de
la gestación49 o un estado de CID crónica
compensada. 37,50
El embarazo ejerce un efecto notable
sobre el sistema fibrinolítico, en el que
pueden ocurrir cambios tales como:
− Aumento del inhibidor del activador del
plasminógeno-1.
− Aumento del inhibidor del activador del
plasminógeno-2.
− Disminución del activador tisular del
plasminógeno.
Hasta el tercer trimestre:
− Aumento de productos de degradación
del fibrinógeno.
− Aumento de dímero D.
Estos cambios provocan una disminución evidente de su activación, lo que
contribuye de manera importante al estado
de hipercoagulabilidad. La causa principal
de este trastorno es el aumento progresivo
del PAI-1 y el PAI-2.5 El PAI-1, que se
sintetiza en las células endoteliales, llega a
alcanzar al término del embarazo hasta 3,5 veces su nivel basal, mientras que el PAI-2,
que se origina en la placenta, puede
aumentar hasta 30 veces su nivel basal al
término de la gestación. 51
Algunos autores, 52,53 han observado la
disminución del activador tisular del
plasminógeno (t-PA). Sin embargo, Reyes y
Gil 51 encontraron niveles estables de t-PA
en un grupo de mujeres embarazadas.
Aunque durante la gestación existen
algunas evidencias de activación del
sistema fibrinolítico, como aumento de los
productos de degradación del fibrinógeno
(PDF)27 y del dímero D, se ha observado
que a diferencia de lo que ocurre con el
PAI-2 que aumenta progresivamente
durante el embarazo, el incremento de estos
parámetros se detiene en el tercer trimestre,
mientras que los complejos TAT continúan
ascendiendo hacia el final de la gestación,
por lo que se produce en esta última etapa
una franca tendencia hacia la hipercoagulabilidad.28
CAMBIOS EN EL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO DURANTE
EL EMBARAZO
El sistema fibrinolítico representa el
evento final del proceso hemostático, pues
se encarga de lisar los coágulos de fibrina
para propiciar la restauración de la pared
vascular. Este mecanismo, en el cual
intervienen numerosas proteínas con
actividad enzimática, así como activadores
e inhibidores, consiste fundamentalmente
en la conversión de un zimógeno, el
plasminógeno, en una enzima activa: la
plasmina.
95
Los cambios más relevantes en el
mecanismo hemostático durante la
gestación se expresan por activación de la
coagulación sanguínea y de las plaquetas,
así como disminución de la activación del
sistema fibrinolítico, lo que explica la
frecuencia de la enfermedad tromboembólica y la CID observadas en el
embarazo y en un grupo numeroso de
complicaciones de este.
SUMMARY
There are hemostatic mechanism alterations in pregnancy that determine particular
conditions which facilitate the activation of this biological system before stimuli that
otherwise would be adequately controlled by the body. It has been confirmed that
there exists hypercoagulability in pregnancy, therefore it has been included in the
group of the so called acquired thrombophilias. Basic elements of the hemostatic
mechanism, the coagulation system, platelets and fibrinolytic mechanism affect in a
decisive way the thrombotic trend of pregnancy. During pregnancy, a series of changes
is observed in the clotting mechanism such as progressive increase of fibrinogen and
factors VII, VIII, IX and von Willebrand, soluble fibrin complexes, thrombin-prothrombin
complexes and 1 + 2 fragments of prothrombin. A decrease in protein C and protein S
has also been found. Platelets play an important role in the thrombotic trend during
pregnancy, also an increase of platelet aggregation, a reduction of responsive capacity
to activation by prostacycline and a decline in AMPc formation have been observed.
Pregnancy has a remarkable effect on the fIbrinolytic system, fundamentally due to a
progressive increase of type-1 plasminogen activator inhibitor (PA1-I) and the type-2
plasminogen activator inhibitor (PAI-2).
Subject headings: HEMOSTATICS; PREGNANCY COMPLICATIONS,
HEMATOLOGIC; BLOOD PLATELETS; FIBRINOLYSIS.
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Recibido: 14 de octubre de 1999. Aprobado: 20 de octubre de 1999.
Dra. Delgina Almagro Vázquez. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800,
Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537) 578268. Fax: (537)338979. e-mail:[email protected]
98
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):99-104
Instituto de Hematología e Inmunología
LA PENICILINA Y SUS DERIVADOS COMO AGENTES
DESENCADENANTES DE LA RESPUESTA INMUNE
Lic. Yulién Alpízar Olivares
RESUMEN
Con el uso de la penicilina y sus derivados aparecen comúnmente reacciones de
hipersensibilidad. Con el fin de caracterizarlas, se estudia la estructura química de
estos antibióticos y su influencia en dichas reacciones. Existen factores que pueden
predisponer al desarrollo de estos efectos adversos, entre los que se encuentran la
gran heterogeneidad en la restricción por el sistema principal de histocompatibilidad
(SPH), el fenotipo de los clones celulares reactivos a estas drogas y el patrón de
citocinas que se liberan. Todo lo anterior da origen al cuadro clínico tan diverso que
exhiben las reacciones causadas por estos fármacos. La profundización en el
conocimiento de los mecanismos que condicionan estas respuestas constituye un reto
para los investigadores en el campo de la inmunología.
Descriptores DeCS: PENICILINAS/efectos adversos; HISTOCOMPATIBILIDAD;
ALERGIA E INMUNOLOGIA.
En la actualidad, cada día es más amplio
el arsenal de nuevos antibióticos disponibles
para el tratamiento de los diferentes procesos infecciosos. No obstante, la penicilina
y sus derivados constituyen drogas de
primera línea en muchos de estos procesos.
Estos antibióticos no son relativamente
tóxicos, inclusive a altas dosis; sin embargo,
su uso frecuente conduce a la aparición de
reacciones de hipersensibilidad que pueden
definirse como aquellas donde aparece una
respuesta inusual tras la administración de
un medicamento o producto biológico,
después de que el paciente se ha puesto en
contacto con concentraciones normales de
este en una o más ocasiones anteriores
(contacto sensibilizante y contacto
desencadenante).1
La inmensa mayoría de los medicamentos se comportan como haptenos, es
decir, son capaces de desencadenar la
respuesta de hipersensibilidad cuando se
combina con macromoléculas, principalmente proteínas endógenas. Muchas
veces no es el medicamento en sí quien se
une a estas macromoléculas, sino sus
metabolitos o las impurezas que estos
contienen.1
Existen 4 tipos de reacciones de
hipersensibilidad descritas por Coombs y
99
Gell en 1963: tipo I o inmediata, tipo II o
citotóxica dependiente de anticuerpos, tipo
III o mediada por complejos inmunes y
tipo IV o retardada. Tanto la penicilina
como sus derivados son capaces de
desencadenar todas estas reacciones, lo
que habla de su gran poder reactivo.2
Además de la prueba cutánea, la
medida de la respuesta proliferativa de las
células T a estos medicamentos in vitro a
través de la prueba de transformación
linfoblástica mediante criterio morfológico o con timidina tritiada, es el método
más común usado para demostrar una
sensibilización previa in vivo de células T
específicas. 3,4
Se han realizado diferentes investigaciones acerca del fenotipo de las células
T respondedoras y su patrón de citocinas,
así como de la participación de enzimas
mitocondriales, por ejemplo: citocrono
P450 en el metabolismo de las drogas. Se
conoce por estos estudios que algunos
medicamentos pueden interactuar con
proteínas y enzimas que potencian el
metabolismo de esas drogas y alteran su
inmunogenicidad, lo que influye en el
desarrollo de la respuesta inmune.5,6
En este trabajo se realiza una revisión
del papel del sistema inmune en el
desarrollo de las reacciones de
hipersensibilidad frente a la penicilina y
sus derivados.
para la actividad biológica. La cadena
lateral determina muchas de las
características antibacterianas y farmacológicas de un tipo determinado de
penicilinas.
La estructura química de la penicilina
es la siguiente:
O
S
CH3
R
C
NH
CH
CH
B
O
C
C
A
N
CH
CH3
COOH
Los antibióticos β-lactámicos producen efectos característicos sobre las
bacterias, estos actúan sobre enzimas
sintetizadoras de la pared celular de los
microorganismos sensibles y provocan el
engrosamiento de esta pared y su lisis
posterior.7
Los metabolitos que se derivan de la
molécula intacta de penicilina actúan como
haptenos a través de su unión de tipo
covalente, con las proteínas endógenas,
preferentemente por ataques a los grupos
ε-amino de la lisina de estas proteínas. El
intermediario antigénico de las penicilinas
es el ácido peniciloil (determinante
mayor) que se forma al abrirse el anillo
β-lactámico. El 95 % de la droga unida a
los tejidos aparece en esta forma. Dicho
ácido, conjugado con un carrier
inmunogénico (poli-L-lisina), es uno de
los agentes más usados en las pruebas
cutáneas. Además hay otros determinantes
menores, que incluyen al benzilpeniciloato
y la amina-benzilpeniciloil. Todos estos
productos se forman in vivo y pueden
también encontrarse en las soluciones de
penicilina preparadas para su administración.8-11
Los términos determinante mayor y
menor se refieren a la frecuencia con la
que aparecen los anticuerpos frente a estos
haptenos y no a la intensidad de la reacción.
ESTRUCTURA QUÍMICA
Y FUNCIÓN DE LAS
PENICILINAS
La estructura química básica de la
penicilina consiste en un anillo de
tiazolidina (A) unido a un anillo βlactámico (B), al que está unido una cadena
lateral (R). El núcleo de la penicilina en sí
es el principal requerimiento estructural
100
REACCIONES DE
HIPERSENSIBILIDAD
A LAS PENICILINAS.
CARACTERÍSTICAS
vitro y capaz de producir in vivo la
eliminación acelerada del antígeno y
efectos favorables o perjudiciales, según
los casos, para el individuo en que se
desarrolla. 16
Ha sido posible obtener clones de
células T específicas a las penicilinas de
individuos alérgicos a ella. Los clones
aislados son heterogéneos en relación con
el fenotipo, a la restricción con respecto
al SPH y al patrón de citocinas liberadas
después de la estimulación (tabla ).17
En contraste con los antígenos
proteicos convencionales, la penicilina
tiene la capacidad de unirse a diferentes
tipos celulares independientemente del
mecanismo de captura del antígeno, es
decir, debido a que se comporta como un
hapteno, su presentación antigénica a las
células T no está restringida a una célula
presentadora de antígeno clásica. Se ha
sugerido que es precisamente esta
presentación no clásica quien conduce a
la activación de clones de células T
específicas a las penicilinas, lo que da
origen al cuadro clínico tan diverso de las
alergias a dichas drogas y sus
manifestaciones en diferentes órganos.18,19
En una investigación realizada con el
fin de conocer cómo son presentados los
péptidos inmunogénicos que de la droga
se derivan, se aislaron células T
provenientes de personas sensibles a estos
medicamentos, las cuales fueron
estimuladas con penicilina, oxacillín,
ampicillín y antígenos solubles
(tuberculina y toxoide tetánico), antígenos
virales (virus de Epstein-Barr) e influenza
tipo A. Los resultados de este estudio
demostraron una estimulación de
subpoblaciones de células T que recuerda
más a una reacción frente a antígenos
virales que a antígenos solubles. Estos
resultados sugieren que los péptidos
antigénicos son presentados a las células
T como lo son las proteínas virales.
E s t o tiene gran importancia, ya que
corrobora la semejanza en el cuadro clínico
Este tipo de reacciones es el efecto
adverso más común que aparece con el uso
de este antibiótico. Sus síntomas varían
ampliamente: anafilaxia, enfermedad del
sueño, anemia hemolítica, enfermedades
renales, angioedema, urticaria, vasculitis y
otros, y pueden llegar a ocasionar la muerte.12
La mayor frecuencia de reacciones de
hipersensibilidad aparece en los jóvenes y
personas de mediana edad, no así en niños
y ancianos, lo que está relacionado con la
capacidad de respuesta del sistema inmune;
la vía de administración más frecuente con
la cual aparecen estas reacciones es la
endovenosa, y raramente ocurre cuando se
administra por vía oral.13
Para desarrollar la reacción se necesita
de una exposición inicial al medicamento o
sus determinantes antigénicas, que puede
ser ambiental u ocupacional. Por ejemplo:
al ingerir leche o carne de animales tratados
con penicilina, a través de la leche materna
o por el contacto con la droga al
administrarla. Se ha observado además que
la posibilidad de experimentar reacciones
adversas tiende a disminuir con el tiempo
transcurrido desde la última exposición al
medicamento.14,15
LAS PENICILINAS Y LA
DINÁMICA DE LA RESPUESTA
INMUNE
La respuesta inmune es el conjunto de
fenómenos en virtud de los cuales el
reconocimiento de un antígeno, da lugar a
la producción de moléculas o células
capaces de unirse a él con la misma
especificidad. Estos productos finales dan
lugar a la reacción inmune, detectables in
101
TABLA. Heterogeneidad de la respuesta inmune en la reacción de hipersensibilidad a las penicilinas
Subpoblaciones de células T
respondedoras
Clones de células CD4+ y CD8 + en niveles
variables
Haplotipos del SPH
Detección de anticuerpos frente al determinante
mayor
Patrón de citocinas
DR52 (89,4 %), DR3 (36,8 %), A2 (35%) DR4 (10 %)
IgM (64 %), IgG (13 %), IgM e IgG (5 %)
Concentraciones altas de I12, INF y TNF
Concentraciones variables de I14 e I15
TH1 y TH2
(sin predominio característico)
Tipo de respuesta
a la diferenciación, maduración y
producción de las diferentes clases de
inmunoglobulinas que se producen como
consecuencia de este reto antigénico. Los
anticuerpos antipenicilina son detectables
prácticamente en todos los individuos que
han recibido la droga y en otros muchos
que a sabiendas, nunca han estado
expuestos a esta.23
Investigaciones realizadas con pacientes
de diferentes edades y sexos, indican que
el 64 % tiene anticuerpos IgM que
reaccionan con el determinante mayor de la
penicilina, el 13 % tiene anticuerpos IgG para
este compuesto, el 5 % tiene ambos tipos y
sólo el 16 % no tenía ninguno (tabla).23
Las citocinas son importantes
mediadores de las funciones efectoras de
las células T. Las concentraciones que estas
alcanzan, así como su fenotipo, están muy
relacionadas con el tipo de respuesta
inmune. La evaluación del patrón de
citocinas secretadas por los clones de
células T generadas por el medicamento,
revelan un patrón muy diverso: altas
concentraciones de interleucina 2,
interferón gamma, factor de necrosis tumoral
alfa y concentraciones variables de
interleucina 4 e interleucina 5, lo que no
habla a favor de respuestas auxiliadoras de
células T del tipo 1 (TH1, del inglés T
helper 1) o auxiliadora de células T del tipo
2 (TH2, del inglés T helper 2) características
(tabla).19
Como se ha discutido, es difícil
caracterizar la respuesta inmune específica
que produce el uso de estos antibióticos y
las enfermedades virales. Un ejemplo de
esto lo constituye el hecho de que las
reacciones dermatológicas que aparecen
con el uso de esos antibióticos, son
similares a los síntomas en piel con que
cursan las enfermedades virales.20
Numerosos datos sugieren que la
penicilina y sus derivados son capaces de
unirse a los antígenos del SPH, pero aún no
está claro cómo ocurre dicha unión. Esta
unión puede identificar un único
mecanismo patogénico para las reacciones
de hipersensibilidad a los β-lactámicos, ya
que existe de manera general una analogía
en los haplotipos de pacientes sensibles.
Estos son: DR52 (89,4 %) DR3 (36,8 %)
A2 (35 %) y DR4 (10 %) (tabla).21,22
En relación con el análisis fenotípico
de las subpoblaciones de células T
respondedoras, este indica que hay una
gran heterogeneidad (clones CD4+ y CD8+
en niveles variables de acuerdo con la
susceptibilidad individual de cada
paciente), lo que está dado por su capacidad de unirse a diferentes estructuras de
las moléculas del SPH, es decir, no existe
una restricción definida. Esta heterogeneidad clonal refleja la amplia gama de
efectos adversos inducidos por la penicilina
(tabla ).19
Los clones de células T participan en
este tipo de reacciones, bien como
activadores de diferentes células o como
auxiliadores de las célula B, lo que conlleva
102
a la penicilina y sus derivados, debido entre
otras causas a que las reacciones de las
células T a los haptenos aún no es un
mecanismo conocido.24,25
Constituye pues, un reto a los investigadores, avanzar en el conocimiento de
los mecanismos que condicionan dicha
respuesta, puesto que estas reacciones son
una limitación en el uso de agentes tan
importantes dentro de la terapéutica
moderna como lo son la penicilina y sus
derivados.
SUMMARY
The use of penicillin and its derivatives very often brings about hypersensitivity
reactions. To characterize them, we studied the chemical structure of these antibiotics
and their influence on such reactions. There are factors that may predispose people to
the development of these adverse reactions, among them are the great heterogeneity in
restriction by the main histocompatibility system, the phenotype of reactive cell clones
to these drugs and the pattern of cytokines that are released. All the above-mentioned
gives rise to the so diverse clinical picture of the reactions caused by these drugs.
Widening of knowledge on mechanisms leading to these reactions becomes a challenge
for researchers in the field of immunology.
Subject headings: PENICILLINS/adverse effects; HISTOCOMPATIBILITY; ALLERGY
AND IMMUNOLOGY.
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Recibido: 28 de octubre de 1999. Aprobado: 1 de diciembre de 1999.
Lic. Yulién Alpízar Olivares. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad
de La Habana, Cuba. Teléf: (537) 578268. Fax: (537) 338979. e-mail:[email protected]
104
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):105-14
Artículos originales
Instituto de Hematología e Inmunología
TÍTULO Y CONCENTRACIÓN DE IgG ANTI D EN LA ENFERMEDAD
HEMOLÍTICA DEL FETO Y EL RECIÉN NACIDO
Dra. María Elena Alfonso Valdés,1 Dr. Víctor H. Cortés Rodríguez,1 Lic. Patricia Hernández
Díaz,2 Lic. Antonio Bencomo Hernández,1 Lic. Yalile Alfonso Valdés,1 Dra. Girelda Cordero
López,3 Dra. Sonia Águila4 y Téc. Lisette Orbeal Aldama1
RESUMEN
La predicción prenatal de la enfermedad hemolítica del feto y el recién nacido (EHFRN)
y la severidad de esta, por métodos no invasivos, es de gran importancia para la
adopción temprana de medidas que eviten o minimicen el daño fetal. Se realizó un
estudio retrospectivo de datos de las historias clínicas y resultados de laboratorio de
14 mujeres Rh D negativas, en el que se analizó la relación entre los títulos de anticuerpos
IgG anti D séricos, determinados por la prueba de anti-inmunoglobulina indirecta durante
los 3 trimestres del embarazo y la afectación del feto-neonato por EHFRN. Se introdujo
un método inmunoenzimático para medir la concentración de IgG anti D en los sueros
conservados en el laboratorio, correspondientes al final del último trimestre del embarazo.
Se concluyó que las variaciones de los títulos de anticuerpos entre los trimestres I-II y
I-III son valiosas para la predicción de afectación fetal-neonatal. La concentración de
IgG anti D fue mayor de 4 Ul/mL en todos los casos con afectación clínica y aumentó de
acuerdo con la severidad de la enfermedad. Se propone introducir este método en el
seguimiento de embarazadas Rh D negativas.
Descriptores DeCS: ERITROBLASTOSIS FETAL/prevención y control; GLOBULINA
INMUNE RHO(D); TEST DE ELISA.
La enfermedad hemolítica del feto y
el recién nacido (EHFRN) es una
condición en la cual se reduce la vida media
1
2
3
4
de los eritrocitos del feto o el neonato
debido a la acción de aloanticuerpos
(aloAcs) eritrocitarios maternos que
Instituto de Hematología e Inmunología.
Laboratorios BETERA.
Facultad “Enrique Cabrera”.
Hospital Ginecoobstétrico “Eusebio Hernández”.
105
atraviesan la barrera placentaria. La
EHFRN comienza durante la vida
intrauterina, puede ser severa y causar
anemia intensa en el feto, la cual puede
llevar a hidropis y óbito fetal o a
hiperbilirrubinemia, íctero y aún
kerníctero en el recién nacido.1-3
La patogenia de la EHFRN consta de
3 estadios: aloinmunización materna,
transferencia de inmunoglobulina G (IgG)
al feto y destrucción de los hematíes
fetales.
La aloinmunización por antígenos
(Ags) eritrocitarios se produce como
consecuencia del contacto del sistema
inmune de un individuo con antígenos
presentes en los hematíes de otro individuo,
de los cuales él carece.4,5
La transferencia de Acs maternos a la
circulación fetal ocurre a través de la
placenta; la única Ig capaz de atravesar la
barrera placentaria es la IgG, de la cual sólo
se transfieren pequeñas cantidades durante
el primer trimestre de gestación.
Aproximadamente un tercio de las
embarazadas con aloAcs anti Rh D contiene
solo IgG, la mayor parte de las restantes
contiene una mezcla de IgG1 + IgG 3 anti D.6
Esta última combinación se asocia con
frecuencia a EHFRN severa.1,7,8
Los aloAcs responsables de la EHFRN
pueden estar dirigidos contra antígenos de
varios sistemas de grupos sanguíneos,
entre ellos ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd y
MNSs. En Europa y Norteamerica, incluida
Cuba, el aloAc más comúnmente asociado
con EHFRN severa es el anti Rh D, seguido
por anti c y anti K, y es además la causa
más común de muerte por dicha patología.
Muestra de ello es que el 60 % de los
infantes con prueba de antiglobulina
directa (PAD) positiva debido a anti D,
necesitan exanguinotransfusión, mientras
que sólo el 30 % de los que presentan anti-c
requieren de este proceder.1,3,9-12
En toda mujer embarazada Rh D
negativa, se debe investigar la presencia de
aloAcs anti Rh (D) durante la captación del
embarazo (entre las 12 y 16 semanas). De
detectarse aloAcs se debe determinar su
especificidad, así como el título y/o
concentración sérica. En estos casos, se
debe determinar el grupo sanguíneo a la
pareja para determinar si posee el Ag
eritrocitario contra el que la embarazada
está sensibilizada. En caso de detectarse
aloAc anti D, se debe repetir el título y/o
concentración durante los 3 trimestres del
embarazo, mensualmente hasta las 28
semanas y posteriormente cada 15 días,
incluso en mujeres primíparas se pueden
detectar ocasionalmente anticuerpos
producto de abortos o transfusiones
previas.2
En los niños nacidos de mujeres que
presentan aloAcs eritrocitarios de
importancia clínica, se debe realizar el
diagnóstico de EHFRN, mediante la PAD.
Si la prueba es positiva, se deben
determinar los niveles de Hb y
bilirrubina.1,2,13 En la práctica es difícil
definir sólo por el íctero y la anemia si
existe hemólisis inmune, ya que en la
mayoría de los recién nacidos hay un
aumento de la concentración de bilirrubina
sérica en los 2 ó 3 primeros días de vida y
existe una progresiva disminución de la
concentración de hemoglobina que
continúa por un período de 2 a 3 meses.2
Algunos autores consideran las cifras
elevadas de bilirrubina indirecta por encima
de 342 mmol/L como un buen criterio para
practicar exanguinotransfusión en infantes
con PAD positivas.14
La inmunoprofilaxis con anti D, los
avances en la medicina fetal, y el alto nivel
del manejo obstétrico, así como de los
cuidados intensivos neonatales, han
permitido lograr una reducción significativa de la mortalidad por esta enfer-
106
medad en las últimas 3 décadas en el
mundo desarrollado.1,15,16
No existe un método único capaz de
predecir el 100 % de los casos de EHFRN,
por lo que el nivel de aloAcs y su variación,
así como los antecedentes de EHFRN
anterior, suelen ser elementos predictivos
útiles. Existen varias técnicas no invasivas
que miden y/o caracterizan los anticuerpos
séricos maternos y son útiles para predecir
la severidad de la EHFRN, entre las que se
encuentran técnicas serológicas tales como
la prueba de antiglobulina indirecta (PAI) y
la cuantificación de anti D con el empleo de
un analizador automatizado, ensayo
inmunoenzimático (ELISA) y la citometría
de flujo. Todas ellas tienen un valor
predictivo limitado. Otros ensayos in vitro
intentan mimetizar las condiciones en que
se produce la hemólisis de los glóbulos rojos
fetales en la EHFRN. Entre ellos se
encuentran el ensayo monocíticomacrofágico y la prueba de citotoxicidad
celular dependiente de Acs (ADCC).17-22
Otros métodos diagnósticos empleados son los estudios fetales por
ultrasonografía, amniocentesis o a través
de tomas de muestras de sangre fetal. Los 2
últimos tienen la desventaja de ser
invasivos, y por lo tanto, pueden aumentar
el riesgo fetal.2,16,21,22
Algunos autores señalan que las
pruebas cuantitativas se correlacionan
mejor con la severidad de la enfermedad
que los títulos de anticuerpos. En estudios
realizados en países como el Reino Unido,
se ha encontrado correlación entre los
niveles de anti D materno cuantificados
por el autoanalizador y la severidad de
la enfermedad. Un nivel de anti D mayor
de 4 UI/mL es considerado significativo
para provocar la destrucción mediada por
células, cuando se ha utilizado el
autoanalizador. 3,7,23 Sin embargo, se han
encontrado altos niveles de aloAcs en
algunos casos de EHFRN leves y niveles
de aloAcs relativamente bajos en casos con
afectación severa, lo que sugiere que la
severidad de la afectación está asociada
con otros factores en adición al de la
concentración de Ac.22
Los ensayos inmunoenzimáticos se
han utilizado para la detección de
numerosas reacciones Ag-Ac y se emplean
en nuestro país en numerosos centros de
salud con múltiples fines. Su sensibilidad es
comparable con la del radioinmunoensayo,
los reactivos empleados por lo general
tienen una conservación prolongada, su
lectura es fácil y los resultados se pueden
medir en microgramos por mililitros.
Mediante esta técnica se puede determinar
la concentración de aloAcs anti D en suero,
por lo que se puede emplear con
propósitos clínicos en el monitoreo de la
inmunización feto-materna.24,25
En Cuba nunca se han aplicado
métodos para cuantificar la concentración
de IgG anti D en el suero materno, por lo
que el seguimiento de la embarazada
aloinmunizada se realiza a través del título
de anticuerpos por PAI; tampoco contamos
con estudios en los que se relacionen los
títulos de anticuerpo o la variación de estos
con el desarrollo de signos de enfermedad
hemolítica en el feto y recién nacido, por
lo que se decidió la realización de este
trabajo.
MÉTODOS
Se revisaron las historias clínicas de
14 puérperas Rh D negativas con parejas
Rh D positivas, a las que previamente se
les había realizado el estudio inmunohematológico de seguimiento durante el
107
tratamiento o solo requirieron
fototerapia o transfusión sencilla.
4. No afectados: casos sin signos clínicos
o de laboratorio de EHFRN.
embarazo en el Laboratorio de Inmunohematología del Instituto de Hematología
e Inmunología.
En el laboratorio se recogieron los
datos siguientes:
Se cuantificó la concentración de IgG
anti D empleando un método de ELISA en
todos los sueros maternos del último
trimestre del embarazo.
−
−
−
−
Nombre y apellidos.
Número de historia clínica.
Grupo ABO y Rh.
Resultados de la PAI en los 3 trimestres
de embarazo.
− Título de IgG anti D por PAI.
De las historias clínicas
recolectaron los datos siguientes:
Método de ELISA para la cuantificación
de IgG anti D24
se
Se emplearon microplacas de poliestireno con 96 pozos de fondo en U
recubiertas previamente con albúmina
sérica bovina al 2 % en solución
amortiguadora de fosfato de sodio (SAFASB al 2 %) incubadas durante toda la
noche a 4 °C. La solución se eliminó antes
del uso de la placa en el ensayo.
Fase de sensibilización: en cada pozo
se depositaron 20 µL de eritrocitos
humanos Rh D positivos al 4 % en SAF a
pH 7,3; posteriormente en 8 de los pozos
se añadieron 40 µL de diluciones dobles
del estándar internacional de anti D
(lote 68/419), con una concentración de
anti D de 1,2 µg/mL; en otro pozo un suero
control con una concentración de anti D de
10 µg/mL y en los restantes triplicados de
cada una de las muestras de suero de las
embarazadas obtenidas durante el tercer
trimestre, diluidas 1/200 en SAF. Se utilizó
como control negativo un suero AB de
donante masculino sano. La placa se
incubó a 37 °C durante 30 minutos.
Después de la incubación, todos los
pozos se lavaron 3 veces con SAF y se
centrifugaron cada vez a 1 000 rev/min
durante 2 min a 20 °C.
Reacción antiglobulínica: se añadieron en cada pozo 50 µL de suero de
carnero anti IgG humana conjugado con
fosfatasa alcalina (Sigma), diluido 1/600 en
− Antecedentes obstétricos (embarazos,
partos y abortos).
− Antecedentes de fetos/niños anteriormente afectados por EHFRN.
− Trastornos en el curso del embarazo.
− Signos de afectación por EHFRN del
feto/niño del último embarazo, tales
como: disminución de la cifra de Hb,
aumento de las cifras de bilirrubina
indirecta, hepatoesplenomegalia, PAD
positiva, necesidad de fototerapia,
necesidad de transfusión intraútero o
exanguinotransfusión, hidropis fetal,
muerte fetal/neonatal.
− Grupo sanguíneo del niño.
Según el grado de afectación del feto/
niño, se dividieron los casos en 4 grupos:15
1. Afectados severos: casos en que
ocurrió muerte fetal/neonatal o
hidropis fetal.
2. Afectados moderados: casos con algún
grado de hepatoesplenomegalia, anemia
moderada, ictericia severa con riesgo
de kerníctero si no se efectúa
tratamiento; estos casos necesitaron
transfusión intraútero o exanguinotransfusión.
3. Afectados leves: casos con anemia
leve (> 100 g/dL), bilirrubina inferior a 340 µmol/L, que no requirieron
108
y posteriormente se aplicó la t de Student
para n-1 grados de libertad, para verificar
si era significativo el valor de r obtenido.
SAF-ASB al 2 %. Después de incubar
durante 30 minutos a 37 °C, se lavaron los
pozos de la forma antes descrita.
Reacción enzimática: se añadieron 50 µL
de solución de sustrato p nitrofenil fosfato
de sodio (Sigma) a cada pozo, disuelto a
una concentración de 1 mg/mL en solución
amortiguadora de carbonato/bicarbonato
0,05 M (Na2 CO3 /NaHCO 3) con 2mM
MgCl 2; pH 9,8 y se incubó la placa durante
20 minutos a 37 °C.
Se centrifugó a 1 000 rev/min durante
5 minutos a 20 °C, y se transfirieron 40 µL
de sobrenadante de cada pozo a los
correspondientes pozos de una nueva
placa que contenía 40 µL de formaldehído
al 10 %.
Se midió la densidad óptica (DO) a
405 nm en cada uno de los pocillos de
esta nueva placa, en un espectrofotómetro ANTHOS.
Con el uso de las diluciones del estándar
internacional de anti D se determinaron las
concentraciones de IgG anti D. Se realizó una
regresión lineal y se determinó el cálculo de
la correlación, mediante la recta de mejor
ajuste para los puntos obtenidos, en la que
los valores de y correspondían con los de la
DO y los de x con los del logaritmo de la
concentración de Ac. La concentración
obtenida en µg/mL se convirtió a UI/mL,
considerando que 1 µg = 5 UI.
RESULTADOS
De los 14 casos estudiados, 10 presentaron afectación clínica neonatal o fetal
(2 leve, 4 moderada y 4 severa) y 4 no
presentaron afectación (tabla 1).
No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los antecedentes obstétricos de embarazos, partos y
abortos en los casos con afectación
neonatal/fetal y los casos no afectados.
Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p<0,02) entre los
antecedentes de embarazo en el grupo con
afectación moderada y el grupo con
afectación severa, no así entre los
antecedentes de partos y abortos por
separado.
No se observaron diferencias significativas entre los títulos de anticuerpos anti
D del primer trimestre de embarazo en los
casos afectados y no afectados (tabla 2).
Sin embargo, se observaron diferencias
significativas (p<0,004) entre los títulos de
anti D del tercer trimestre de embarazo en los
casos afectados y no afectados (tabla 2).
También se encontraron diferencias
significativas (p< 0,01) en la variación entre
el título final e inicial de anti D, en los casos
afectados y no afectados (tabla 3).
No se observaron diferencias significativas entre la variación del título final de
anti D en relación con el inicial, en los grupos
con diferente grado de afectación clínica.
Se observaron diferencias altamente
significativas (p<0,006) entre la variación
del título de anti D del segundo trimestre
con relación al primero, en los casos
afectados y no afectados (tabla 3) y entre
los grupos con diferente grado de
afectación.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para aplicar las pruebas estadísticas se
llevaron los valores a comparar a logaritmo
neperiano (de base 2).
Para las comparaciones entre 2 grupos
se empleó el estadígrafo t de Student y para
las comparaciones entre 3 o más grupos el
análisis de varianza (ANOVA), en ambos
casos para un intervalo de confianza α = 0,05.
Para evaluar la correspondencia entre
los valores de títulos y cuantificación de
anticuerpos se realizó una correlación lineal
109
TABLA 1. Antecedentes obstétricos, título y concentración de la Ig G anti D en los casos estudiados
Caso No.
2
9
3
4
6
10
1
5
7
14
8
11
12
13
Grado de severidad
Leve
Leve
Moderada
Moderada
Moderada
Moderada
Severa
Severa
Severa
Severa
No afectado
No afectado
No afectado
No afectado
Antecedentes obstétricos
E
P
A
3
8
3
4
3
3
5
4
5
4
4
4
4
4
1
4
2
1
1
1
1
0
2
1
1
1
0
1
1
3
0
2
2
1
3
3
2
2
2
2
3
2
Título de Ig G anti D
(trimestres)
I
II
III
0
0
4
64
64
1
8
64
16
64
Puro
8
64
2
64
32
8
256
128
8
32
64
16
128
Puro
8
64
2
256
32
64
512
512
64
256
128
256
512
Puro
16
64
2
Concentración
UI/mL
4,65
6,00
12,00
5,00
7,50
512
23,00
36,40
17,90
120,50
98,55
3,00
2,00
3,50
E: embarazos; P: partos; A: abortos.
TABLA 2. Comparación en los títulos de IgG anti D en
los trimestres I y III entre el grupo de afectados y no
afectados
Grado de
afectación
Título de IgG anti D
(trimestres)
I (X ± DS)
III ( X ± DS)
No afectados
Afectados
18,75 ± 30,17
29,2 ± 30,13
20,75 ± 29,48
304 ± 194,10
Significación
NS
P < 0,003
TABLA 3. Comparación de la variación del título de Ig G anti
D en el grupo de afectados y no afectados
Grado de
afectación
No afectados
Afectados
Significación
TABLA 4. Valores centrales y de dispersión de la
concentración de IgG anti D materna según la severidad de
la EHFRN
Variación del título
de IgG anti D
(trimestres)
III-I
II-I
( X ± DS)
( X ± DS)
2 ± 3,81
274,8 ± 179,9
P < 0,006
trimestre, en casos afectados y no
afectados, así como entre los grupos con
diferente grado de severidad.
Todos los casos con afectación clínica
presentaron concentraciones de IgG anti D
mayores que 4 UI/mL.
Se observa un incremento en los
valores de la concentración a medida que
aumenta la severidad clínica de los casos
estudiados (tablas 1 y 4).
0
50 ± 56,38
P < 0,01
Grado de
severidad
Concentración de IgG anti-D
(UI/mL)
(X ±DS)
Leve
Moderada
Severa
5,325 ± 0,9545
8,5 ± 4,11
29,5 ± 48,04
No existió correlación entre el título
de anticuerpo anti D determinado por la
PAI en el tercer trimestre y la cuantificación de este por ELISA.
No se observaron diferencias
significativas entre los valores de la
concentración de anticuerpos anti D
determinados por ELISA en el tercer
110
DISCUSIÓN
El título de Ac anti D materno por PAI
se emplea como una medida de la respuesta
de Ig G materna. El título crítico se define
como aquel en el cual existe riesgo
importante de desarrollar hidropis fetal;
muchos centros usan un valor del título
entre 8 y 32 para su definición de valor
crítico, a partir del cual indican técnicas
invasivas.26 El título de aloAcs anti Rh D
determinado al inicio del embarazo no fue
útil para la predicción de la afectación o
grado de severidad, ya que se comportó de
forma similar en los grupos con afectación
y sin ella; los casos de afectación
moderada y severa tuvieron títulos
iniciales que fluctuaron entre 4 y 64. El
valor del título de aloAcs en el tercer
trimestre del embarazo fue significativamente más alto en los casos afectados
en relación con los no afectados, por lo
que se decidió analizar la influencia de la
variación entre los títulos en los diferentes
trimestres de embarazo en la predicción
de la EHFRN y su grado de severidad. El
incremento en el título de aloAcs en el
tercer trimestre en relación con el
primero, fue significativamente mayor en
los casos con afectación clínica, en
comparación con los no afectados (tabla
2), pero se comportó de manera similar
en los grupos con diferente grado de
afectación, lo que refleja la utilidad de este
parámetro en la presencia o no de la
enfermedad, pero no en el grado de
severidad de esta. La diferencia fue
también significativa cuando se analizó el
incremento de los títulos de anti D en el
segundo trimestre en relación con el
primero (tabla 2), tanto entre los grupos
con afectación y sin ella, como entre los
de diverso grado de afectación. Este
resultado permite proponer la diferencia
entre el título de anti D del segundo y
primer trimestre como un elemento de valor
predictivo de la EHFRN y el grado de
severidad de esta, útil además porque
permite hacer una estimación en un período
poco avanzado del embarazo. Estos hallazgos coinciden con otros informes.2
La predicción prenatal de la EHFRN
y su severidad, a través del estudio de los
aloAcs séricos maternos, es de gran
importancia para el éxito en el manejo
clínico de esta enfermedad y permite la
adopción temprana de medidas
encaminadas a disminuir la morbiletalidad
en el feto o el recién nacido. Un fallo en
la predicción de la EHFRN a través de los
estudios in vitro de los aloAcs del suero
materno, puede conducir al empleo de
procedimientos invasivos en fetos no
afectados o con EHFRN leve, con el
consiguiente aumento de los riesgos del
embarazo como la hemorragia
transplacentaria, que conduce a la
exacerbación de la aloinmunización
materna y el peligro de anemia fetal.22
En nuestro medio sólo contamos con
los antecedentes de afectación de
embarazos previos y los títulos de Acs anti
D, determinados por la prueba de
antiglobulina indirecta, para la predicción
de la severidad de la EHFRN, previo al
empleo de la ultrasonografía o de pruebas
invasivas fetales. No conocemos
antecedentes en la literatura científica
cubana de investigaciones en las que se
estudie la relación entre los títulos de Acs
maternos y las manifestaciones clínicas de
EHFRN, por lo que no es posible comparar
los resultados de este estudio con otras
experiencias nacionales.
Los antecedentes obstétricos generales no resultaron de valor en el análisis
de la muestra seleccionada. Dos de las
mujeres estudiadas presentaban antecedentes de embarazos anteriores con
fetos/niños afectados por EHFRN, una
de ellas tuvo un niño con afectación severa
y la otra uno no afectado, el cual resultó
ser Rh D negativo. Debido al pequeño
número de la muestra, no se pudo realizar
un análisis estadístico de este factor
predictivo.
111
En Cuba no se aplicaba ninguna
técnica de cuantificación de Acs anti Rh
D para el seguimiento de las embarazadas
Rh D negativas; estas técnicas suelen tener
una mejor correspondencia con el curso
clínico de la enfermedad que los métodos
serológicos,3 por lo que se cumplió con el
objetivo de introducir un ensayo inmunoenzimático para la determinación de la
concentración sérica de IgG anti D en
embarazadas Rh D negativas, como parte
del desarrollo del programa de prevención
de la EHFRN. El ensayo inmunoenzimático
es un método ampliamente utilizado en
nuestro sistema de salud con fines
diagnósticos, los reactivos y equipamientos
necesarios para su ejecución en la
cuantificación de anti D están disponibles,
con la única excepción del estándar
internacional de anti D. Lo anterior, sumado
a la relativa economía del método, hace
factible su generalización para estos fines.
Otros métodos empleados para la
cuantificación de anti D tienen varias
dificultades para su aplicación en nuestro
medio. La cuantificación de anti D por
analizador automático, a pesar de ser la más
ampliamente utilizada, tiene la desventaja
de su alto costo y de ser una técnica de
hemaglutinación que detecta tanto Acs IgG
como Ig M, estos últimos sin valor clínico
en la EHFRN, porque no son capaces de
atravesar la barrera placentaria. El método
de citometría de flujo, que al igual que el de
ELISA detecta sólo los Acs IgG, tiene un
alto grado de sensibilidad y seguridad, pero
tiene la desventaja de su alto costo.20
Se cuantificó la concentración de IgG
anti D en las muestras obtenidas en el tercer
trimestre del embarazo. No se encontraron
diferencias estadísticamente significativas
entre los valores de concentración de IgG
anti D en el grupo sin afectación clínica y
en el grupo afectado (tabla 4), porque uno
de los casos no afectados presentó un valor
de concentración muy elevado, sin
embargo, en el resto de los casos, las
concentraciones de IgG anti D fueron
inferiores a 3,50 UI/mL (tabla 1). La presencia
de altas concentraciones de Acs en mujeres
que tienen niños sin manifestaciones
clínicas, e incluso Rh D negativos, se ha
observado por otros autores; 27 en esta
casuística el caso con concentración
elevada fue el único de los no afectados
en que el niño era del grupo Rh D positivo, lo
que puede explicar el valor de concentración
a pesar de no haber daño fetal, ya que puede
haber coexistido un aumento en la
producción de aloAc con un fallo en el paso
transplacentario de la IgG materna. El fallo
en el paso transplacentario se puede deber
a trastornos en el mecanismo de transporte,
características genéticas del R Fc gamma,
presencia de Acs HLA inhibitorios o a las
subclase de Ig producida, ya que sólo las
Igs IgG3 e IgG1 son capaces de atravesar la
barrera y producir daño fetal.22
Por otra parte, se observó un aumento
en los valores de concentración a medida
que aumentó la severidad clínica de los
casos, lo que se hace más apreciable
cuando se comparan los valores obtenidos
en los casos leves y moderados en conjunto
con los obtenidos en los casos severos
(tabla 4). Estos resultados evidencian que
la concentración de Ig G determinada por
ELISA puede tener valor para el pronóstico
de la severidad de los casos.
Los valores de concentración en los
casos con afectación clínica se encuentran
todos por encima de 4,7 UI/mL, lo que se
corresponde con lo informado en la
literatura para la predicción de severidad
clínica.1,2,26
Varios investigadores8,18 han observado una falta de correspondencia entre los
valores de los títulos de aloAcs y su
concentración sérica, determinada por
métodos de cuantificación como el ELISA
o el autoanalizador; esta observación
112
también se describe aquí, ya que no se
encontró correlación entre los títulos de
Acs detectados en el tercer trimestre del
embarazo y los valores de concentración
sérica determinados por ELISA en la
muestra estudiada.
Todos los autores coinciden en que no
existe un método infalible para la predicción
de la EHFRN. La EHFRN es un proceso
complejo, en el que la severidad de cada
caso individual está determinada por un
conjunto de factores combinados, los que
se deben tener en cuenta para predecir la
afectación clínica a partir de ensayos que
midan o caractericen los Acs en la
circulación materna. Entre estos factores
se encuentran las subclases y grado de
glicosilación de los Acs maternos; la
estructura, densidad del sitio, madurez
del desarrollo y distribución tisular de los
Ags de grupo sanguíneo; la eficiencia
del transporte de la IgG materna al feto,
la madurez funcional del bazo fetal,
polimorfismos que afectan la función
del receptor Fc y la presencia de Acs
inhibitorios relacionados con el sistema
principal de histocompatibilidad (HLA).22
SUMMARY
The prenatal prediction of the hemolytic disease of the fetus and newborn and the
severity of this disease by non-invasive methods is highly important for the early
adoption of measures that avoid or minimize fetal damage. We made a retrospective
study of medical histories data and lab results of 14 Rh D-negative women in which the
relationship between serum anti-D IgG antibodies titers, determined by indirect
antiglobulin test during the three pregnancy trimesters, and the effects of the hemolytic
disease on fetus and newborn was analyzed. An immunoenzymatic method was
introduced to measure anti-D IgG concentrations in lab-preserved sera collected at the
end of the last pregnancy trimester. It was concluded that the variations of antibody
titers from the first to the second trimester and from the first to the third trimester are
useful for the prediction of fetal-neonatal effects. Anti-D IgG concentration was higher
than 4 Ul/mL in all the cases with clinical affection and increased with the severity of
the disease. This method is proposed to be introduced in the follow-up of RhD negative
pregnant women.
Subject headings: ERYTHROBLASTOSIS , FETAL/ prevention and control; RHO(D)
IMMUNE GLOBULIN; ENZYME- LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY.
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Dra. María Elena Alfonso Valdés. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La
Habana, Cuba. Teléf: (537)578268. Fax: (537)338979. e-mail:[email protected]
114
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):115-21
Instituto de Hematología e Inmunología
TRATAMIENTO CON TROFÍN EN NIÑOS INTOLERANTES
A LAS SALES DE HIERRO
Dra. Norma Fernández Delgado,1 Dra. Hortensia Gautier du Défaix Gómez,1 Mc. Mariela
Forrellat Barrios, 1 Dra. Tamara Cedré Hernández, 1 Dr. Raúl González Hernández 2
y Dra. Elisa Aznar García2
RESUMEN
Se realizó tratamiento con Trofín, producto cubano de origen natural con propiedades
antianémicas, a 14 niños entre 6 y 36 meses de edad con anemia ferripriva, que no
toleraban las sales de hierro oral. Se observó una recuperación de las cifras de
hemoglobina en el 86 % de los casos. Se presentaron reacciones adversas ligeras en el
36 % de los pacientes, sin que ello impidiera la continuación del tratamiento. El Trofín
constituye una alternativa eficaz en el tratamiento de este déficit nutricional en pacientes
intolerantes a las sales ferrosas.
Descriptores DeCS: DEFICIENCIA DE HIERRO/terapia; SUPLEMENTOS DIETETICOS;
TRASTORNOS DE LA NUTRICION DEL NIÑO; ANEMIAS NUTRICIONALES/terapia.
En el tratamiento de la anemia por
deficiencia de hierro (ADH) se han utilizado
de forma convencional las sales ferrosas
(sulfato, gluconato, fumarato) con un efecto
corrector relativamente rápido sobre el
estado carencial, pero con frecuencia
ocasionan reacciones adversas, fundamentalmente al nivel del tracto gastrointestinal,
como son vómitos, diarreas o constipación,
las que constituyen la causa fundamental de
abandono del tratamiento.1-3
1
2
Además se ha planteado que la ingestión
excesiva de hierro inorgánico pueden
interferir con la absorción de otros
nutrientes esenciales como el cinc, cuando
se administra en altas dosis4 y está contraindicada su administración en enfermedades infecciosas5 y malignas.6 Además,
la aplicación de la terapia parenteral con hierro
dextran (Inferón) por sus conocidos efectos
adversos, solo se utiliza en pacientes con
intolerancia extrema al hierro oral o en la
malabsorción intestinal.7-9
Instituto de Hematología e Inmunología.
Centro Nacional de Biopreparados.
115
Debido a estos inconvenientes, la
tendencia actual es reducir al mínimo la
utilización de las sales de hierro, para lo
cual se han desarrollado productos que
contienen complejos hierro-proteínas o
hierro-carbohidratos que son mejor
tolerados.10
En nuestro país se han desarrollado
algunas formulaciones con características
similares, entre las que se encuentran el
Trofín (BIOCEN, La Habana); producto de
origen natural que contiene hierro (4 mg/mL),
proteínas, aminoácidos, miel de abejas y
propóleos. La presencia de 8 de los
aminoácidos esenciales y de proteínas de
bajo peso molecular contribuyen a mejorar
las posibilidades de absorción y la
biodisponibilidad del mineral, así como su
tolerancia.
Estudios realizados en pacientes
pediátricos demostraron la eficacia y
tolerancia del Trofín en niños deficientes
de hierro, 11,12 lo que nos sugirió la
posibilidad de que este producto pudiera
ser eficaz y bien tolerado por niños con
intolerancia a las sales de hierro orales.
consentimiento informado de los padres,
datos generales y biológicos del niño, así
como una descripción del tratamiento
recibido con anterioridad (sal ferrosa
empleada, dosis, tiempo de consumo y tipo
de reacción adversa presentada).
No obstante el diagnóstico conocido
de ADH, a cada uno se le realizó un estudio
del estado nutricional en hierro para conocer
el grado de déficit previo al inicio del
tratamiento, así como electroforesis de
hemoglobina, resistencia osmótica y
hemograma completo. Se cuantificó el
hierro sérico y la capacidad total de fijación
del hierro por la transferrina por medio del
método de Beale y colaboradores
modificado por Loria,13 a partir de los cuales
se determinó el índice de saturación de la
transferrina.
Los puntos de corte utilizados
fueron: hemoglobina < 110 g/L, hierro
sérico < 10,7 µmol/L, capacidad total
de fijación de hierro por la transferrina
> 75 µmol/L e índice de saturación
de la transferrina <0,16.
Se consideraron anémicos por
deficiencia de hierro aquellos que tuvieron
valores de hemoglobina e índice de
saturación por debajo del punto de corte,
acompañado de valores de capacidad total
de fijación de hierro por la transferrina
superiores a 75 µmol/L.
Se excluyeron del estudio los niños con
enfermedades crónicas o malignas y los que
padecían síndrome de malabsorción.
Se estableció tratamiento con Trofín
en una dosis de 8 mg/kg/día, dividido en 2
subdosis, y el seguimiento se realizó por
consultas, una a los 15 días y luego
mensualmente. En cada consulta se realizó
una evaluación clínica y hemograma
completo y se recogió información sobre la
tolerancia al tratamiento. El monitoreo se
mantuvo hasta 2 meses después de alcanzar
valores de hemoglobina ≥110 g/L.
MÉTODOS
Se incluyeron en el estudio 14 niños
entre 6 y 36 meses de edad provenientes de
la consulta de anemias del Instituto de
Hematología e Inmunología, diagnosticados previamente como deficientes de
hierro, con anemia, y que habían presentado manifestaciones de intolerancia a las
sales de hierro oral.
Ocho pacientes (57 %) eran del sexo
femenino y 6 (43 %) del masculino. En relación
con el color de la piel, 7 niños (50 %) eran
blancos y el resto no blancos (negros y
mestizos).
A cada uno se le confeccionó una
historia clínica donde se incluyó el
116
Se realizó determinación de vitamina B12 sérica,14 ácido fólico sérico15 y
eritrocitario 16 a los niños en los que se
sospechó un posible déficit de estas
vitaminas.
Se confeccionó una base de datos en
la cual se incluyeron los datos contenidos
en la historia clínica, los resultados del
estado inicial y del seguimiento del
tratamiento, así como el tiempo necesario
para la recuperación de las cifras de
hemoglobina. El procesamiento se realizó
por el sistema STATISTICA.
Se calcularon los valores promedio y
las desviaciones estándar de las variables
cuantitativas al inicio del estudio, así como
de las cifras de hemoglobina y sus
incrementos con respecto a la hemoglobina
inicial en el primer trimestre de tratamiento
y del tiempo de recuperación de la
hemoglobina.
En la figura 1 se observa un incremento progresivo de la hemoglobina
durante los primeros 3 meses de tratamiento.
Hb (g/L)
110
105
100
95
90
3
No. de casos
5
4
3
TABLA. Estado nutricional en hierro al inicio del
tratamiento
2
Pruebas de
laboratorio
1
94,00
8,40
84,28
0,09
2
Meses
El tiempo de recuperación de la
hemoglobina osciló entre 1 y 8 meses (fig.
2). El 50 % (n=7) alcanzó cifras normales
de hemoglobina en los 3 primeros meses
del tratamiento, el 36 % (n=5) entre el
cuarto y el octavo mes y en el 14 % (n=2)
fue necesario suspender el tratamiento y
utilizar la terapia parenteral.
En 4 pacientes (29 %) se asociaron
otros medicamentos (fumarato ferroso o
vitamina B12) para lograr la recuperación
En la tabla se muestra el estado
nutricional en hierro previo al inicio del
tratamiento. En el 100 % de los niños se
observó un índice de saturación de la
transferrina por debajo de 0,16 y una
capacidad total de fijación del hierro por la
tranferrina mayor de 75 µmol/L.
La electroforesis mostró que 13 de
los casos (93 %) tenían hemoglobina AA
y 1 (7 %) fue AC. La resistencia osmótica
estaba aumentada (≥ ++) en el 93 %
(n=13).
Hemoglobina (g/L)
Hierro sérico ( µmol/L)
Capacidad total ( µmol/L)
Índice de saturación
1
FIG. 1. Evolución en los 3 primeros meses de tratamiento.
RESULTADOS
X
0
DS
0
10,61
2,18
10,45
0,02
0
1
2
3
4
5
Meses
6
7
8
FIG. 2. Distribución de frecuencias del tiempo de
recuperación de la hemoglobina.
117
de la hemoglobina, debido a que se produjo
un estancamiento de las cifras de esta
después del segundo mes de tratamiento.
El fumarato ferroso se utilizó en una
dosis de 4 mg/kg/día, con lo que se obtuvo
una respuesta satisfactoria aproximadamente un mes después, sin que se
presentaran manifestaciones de intolerancia.
El 50 % de los pacientes no mostraron
reacciones adversas al tratamiento con
Trofín (n=7) y en el 36 % se presentaron
diarreas (n=5). En 2 niños (14 %) la severidad
del cuadro diarreico impidió la continuación
del tratamiento (fig. 3); en los 3 casos
restantes, se aplicó igual dosis de Trofín en
días alternos, con lo que se logró una mejor
tolerancia y la recuperación de las cifras de
hemoglobina.
36 %
Ninguna
Diarreas
Rechazo
de los casos. Estas pueden evitarse con el
empleo de preparados hierro - proteínas.
El Trofín, producto cubano que tiene entre
sus componentes hierro hemoglobínico, es
útil en el tratamiento de la ADH en niños,11,12
lo que hace de él una alternativa para el
tratamiento de este déficit nutricional en
pacientes que no toleran las sales de hierro.
El hecho de que la totalidad de los
niños incluidos en el estudio mostrara un
índice de saturación de la transferrina
disminuido, acompañado de una capacidad
total de fijación del hierro por la transferrina
aumentada, evidenció que los niños
estudiados eran realmente deficientes de
hierro, ya que la disminución del índice de
saturación de la transferrina es un indicador
confiable de esta deficiencia, cuando la
capacidad total de fijación de hierro por la
transferrina está elevada.17
La observación en el 93 % de los casos
de una resistencia osmótica mayor o igual a
2 cruces, es otro dato que apoya el
diagnóstico18 y excluye la posible presencia
de otras causas de anemia frecuentes en
esta edad.
El 50 % de los niños alcanzó cifras
de hemoglobina ≥110 g/L en el primer
trimestre de tratamiento. Resultados
similares se observaron en pacientes
pediátricos con ADH sin antecedentes de
intolerancia a las sales ferrosas, tratados
con Trofín,12 lo que coincide con lo
comunicado en pacientes con deficiencia
de hierro, a los que se les administró
tratamiento con hierro hemiglobínico.19
La hemoglobina no aumentó después
del segundo mes en 4 pacientes (29 %), lo
que sugiere la existencia de deficiencia de
otros nutrientes hematopoyéticos, no
descartada en el estudio inicial, que
interferían con la respuesta. A partir de este
análisis, se decidió realizar dosificación
de vitamina B12 y ácido fólico en estos 4
niños, y se detectaron cifras de vitamina
B12 muy cercanas al límite inferior del
14 %
50 %
FIG. 3. Reacciones adversas al Trofín.
En 2 pacientes (14 %) se produjeron
vómitos en el momento de la administración del Trofín, que no impidieron la
continuación del tratamiento.
DISCUSIÓN
Las reacciones adversas a las sales
ferrosas se presentan entre el 10 y el 20 %
118
se diagnosticó un síndrome de
malabsorción intestinal, que pudiera
explicar la causa del cuadro diarreico
observado. En los otros 3 pacientes que
presentaron diarreas se aplicó igual dosis
del medicamento en días alternos, con lo
que se logró la normalización de la
hemoglobina en todos los casos. Estos
resultados concuerdan con lo que se recomienda en la literatura: la utilización de
dosis intermitentes de sales ferrosas en el
tratamiento de la anemia ferropénica. Se
plantea que los buenos resultados
obtenidos con esta variante de tratamiento
se deben a que se evita el bloqueo de la
mucosa intestinal por sobresaturación, con
lo que se mejora la absorción y tolerancia
al medicamento,21 lo que es poco probable
que haya ocurrido en el presente estudio.
Es conocido que el hierro hemínico no
provoca las reacciones adversas de las
sales ferrosas y que su mecanismo de
absorción difiere del mecanismo del
hierro inorgánico. Es más probable que
nuestros resultados estén relacionados con
una disminución de la exposición de la
mucosa intestinal a los aditivos de la
formulación.
En 2 niños se presentaron vómitos
como manifestación de un rechazo al
sabor del medicamento; esto se resolvió
al mezclar el Trofín con alimentos, lo que
permitió continuar el tratamiento. Este
rechazo al sabor pudiera estar relacionado
con los aditivos de la formulación, así
como con las cantidades que necesitaban
ingerir (más de 20 mL).
Nuestros resultados muestran que el
Trofín es eficaz y bien tolerado en niños
con ADH intolerantes a las sales de hierro
oral, por lo que constituye una alternativa
para el tratamiento de este déficit
nutricional en estos niños. Los resultados
de nuestra investigación sugieren que
nuevas formulaciones del Trofín que
contengan pequeñas cantidades de hierro
inorgánico pudieran ser de utilidad.
intervalo de referencia en 2 de los
pacientes, por lo que se les asoció esta
vitamina al tratamiento con Trofín en dosis
de 100 mg en días alternos durante 2
meses.
Se conoce que el aumento de la
eritropoyesis, como consecuencia del
tratamiento antianémico, produce disminución de los niveles de otras vitaminas
que pueden llegar a interferir con la
respuesta al tratamiento, cuando los
niveles séricos de éstas se encuentran en
valores subnormales o cercanos al límite
inferior del intervalo de referencia, como
posiblemente ocurrió en estos niños. A
partir de la introducción de esa
vitaminoterapia, los niveles de
hemoglobina ascendieron paulatinamente
hasta alcanzar las cifras deseadas.
En los 2 pacientes restantes, el
resultado de las determinaciones de
vitaminas fue normal, por lo que se decidió
añadir fumarato ferroso en dosis bajas al
tratamiento con Trofín, teniendo en cuenta
los resultados obtenidos en mujeres con
el uso del Hemoestimulín.20 Este producto
contiene una proporción hierro hemoglobínico/hierro inorgánico de 2:1, similar
a la empleada en estos 2 pacientes.
La recuperación de las cifras de
hemoglobina se alcanzó aproximadamente
un mes después de la introducción de la
sal ferrosa. Es interesante señalar que no
hubo manifestaciones de intolerancia en
ningún niño, lo que pudiera estar en
relación con la baja dosis de hierro
inorgánico utilizada, con lo que se evita la
saturación de la mucosa intestinal, a lo que
se añade que la combinación de ambos
tipos de hierro favorece la absorción del
mineral al utilizar simultáneamente los 2
mecanismos de absorción.
El Trofín fue bien tolerado en 7 niños
(50 %). En 2 pacientes fue necesario usar
la terapia parenteral, debido a la existencia
de diarreas que por su severidad
impidieron la continuación del tratamiento
oral. En estos niños, durante la investigación,
119
SUMMARY
Treatment with Trofin, a Cuban-made natural product with anti-anemic properties, was
given to 14 children aged 6-36 months of age suffering from iron deficiency anemia,
who do not assimilate oral iron salts. Adequate levels of hemoglobin figures were
observed to be restored in 80% of the cases. 36% of patients showed minor adverse
reactions without interrupting the treatment. Trofin is an effective alternative in treating
this nutritional disorder in patients who do not tolerate iron salts.
Subject headings: IRON DEFICIENCY/therapy; DIETARY SUPPLEMENTS; CHILD
NUTRITION DISORDERS; NUTRITIONAL ANEMIAS/therapy.
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Dra. Norma Fernández Delgado. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800,
Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537) 578268. Fax: (537) 338979. e-mail:[email protected]
121
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):122-24
Instituto de Hematología e Inmunología
ESTUDIO LONGITUDINAL DE ANTICUERPOS ANTICITOPLASMA
DE NEUTRÓFILOS EN PACIENTES CON ANEMIA DREPANOCÍTICA
Lic. Ana María Guerreiro Hernández, Lic. Rinaldo Villaescusa Blanco, Lic. Ada A. Arce
Hernández, Lic. Julio C. Merlín Linares, Lic. Luz M. Morera Barrios, Dra. Valia Pavón
Morán, Dr. Edgardo Espinosa Martínez y Dr. Porfirio Hernández Ramírez
RESUMEN
Se realizó un estudio longitudinal para detectar anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos
(ANCA) en 13 pacientes con anemia drepanocítica en crisis vasooclusiva y en estado basal,
mediante un método de inmunofluorescencia indirecta. Del total de 34 muestras de suero
obtenidas, 16 fueron en crisis vasooclusiva y en 12 de ellas, correspondientes a 10 pacientes,
se demostró la presencia de p-ANCA. En el resto de las muestras en crisis vasooclusiva y en
estado basal no se observó la presencia de p-ANCA o c-ANCA. Los resultados obtenidos
sugieren la posible participación de los p-ANCA en el daño isquémico, así como la importancia
de su medición en el diagnóstico de las crisis vasooclusivas (CVO) en los pacientes con
anemia drepanocítica (AD).
Descriptores DeCS: ANTICUERPOS CITOPLASMATICOS ANTINEUTROFILO; ANEMIA DE
CELULAS FALCIFORMES; ENFERMEDADES HEMATOLOGICAS.
La anemia drepanocítica (AD) (SS) es
una enfermedad crónica no transmisible
que presenta diversas complicaciones
vasculares y un elevado riesgo de
infecciones bacterianas para los pacientes
que la padecen.1-3
Los anticuerpos anticitoplasma de
neutrófilos (ANCA) constituyen un grupo
de autoanticuerpos que son inducidos por
enzimas lisosomales de los neutrófilos, y
que de acuerdo con el patrón obtenido al
aplicar la técnica de tinción por
fluorescencia indirecta, se clasifican en 2
tipos: los que producen un patrón
citoplasmático (c-ANCA), inducidos por
la proteinasa 3, y los que producen una
tinción perinuclear (p-ANCA) que se ha
mostrado unen mieloperoxidasa. 4 Se
considera que estos autoanticuerpos
intervienen en las alteraciones de las
paredes vasculares que se observan en
algunas enfermedades, caracterizadas por
inflamación con infiltración de neutrófilos
y leucocitos mononucleares, por lo que su
detección se ha incluido, en ocasiones,
como parte de la evaluación diagnóstica de
ciertas formas de vasculitis y glomerulonefritis.5
122
de los drepanocitos y las células
endoteliales estimuladas por citocinas
como la interleucina 1β y el factor de
necrosis tumoral α. Estas citocinas,
liberadas a la circulación por diferentes
factores extrínsecos, pueden también
estimular los neutrófilos con la
transferencia de mieloperoxidasa y
proteinasa 3 a la superficie de la membrana
celular, lo que provoca la síntesis de
autoanticuerpos, p-ANCA y c-ANCA
respectivamente, dirigidos contra dichas
enzimas lisosomales; la unión de estos a
los neutrófilos provoca su activación,
aumenta su adhesión y amplifica el daño
celular endotelial.8-11
La presencia de p-ANCA demostrada
en la mayoría de los pacientes en CVO,
puede ser un factor favorecedor del daño
isquémico. Es de señalar que en 3 de los
pacientes estudiados no se observaron los
ANCA, lo que pudiera deberse, entre otras
razones, a la incapacidad de estos de
responder a los antígenos lisosomales
expuestos en la membrama celular del
neutrófilo estimulado, a la intensidad de
la crisis o a la presencia en estos pacientes
de autoanticuerpos con especificidades
diferentes no detectables por el procedimiento empleado.
Los resultados obtenidos en nuestro
trabajo indican la elevada frecuencia de los
p-ANCA en la CVO de la AD, ya que en el
estudio longitudinal, el 75 % (12/16) de
las muestras en crisis fueron positivas para
dicho autoanticuerpo y negativos en estado
basal; debemos señalar que en 3 pacientes
en CVO no se demostró la presencia de
estos autoanticuerpos, lo que pudiera estar
relacionado con la intensidad de la crisis,
aspecto que no se tomó en cuenta en este
trabajo. Estudios posteriores nos
permitirán profundizar en la posible
participación de los p-ANCA en la
patogenia del daño vascular en la AD.
En comunicación reciente se
demostró la presencia de p-ANCA en
pacientes con AD en crisis vasooclusiva
(CVO), no así en el grupo en estado basal.6
El significado clínico y patogénico de este
resultado no se ha establecido, de ahí que
nos propusiéramos un estudio longitudinal
en un grupo de pacientes con AD en
distintos estadios clínicos.
MÉTODOS
Se estudiaron 13 pacientes con AD, 5
mujeres y 8 hombres, con una edad
promedio de 14 años y un rango de 6-25
años, de los que se extrajeron 34 muestras,
16 en CVO y 18 en estado basal, para
determinar la presencia de ANCA. La sangre
se obtuvo por punción venosa y se
conservó el suero a -30 °C hasta su uso.
La detección de p-ANCA y c-ANCA se
realizó por inmunofluorescencia indirecta.7
RESULTADOS
Se detectó la presencia de p-ANCA en
12 muestras obtenidas durante las CVO,
correspondientes a 10 pacientes; las 4
muestras extraidas en CVO de los 3
pacientes restantes fueron negativas para
p-ANCA y c-ANCA. No se demostraron
ANCA en ninguna de las muestras de
pacientes en estado basal.
DISCUSIÓN
El curso clínico de la AD se caracteriza por episodios vasooclusivos periódicos. Estudios recientes han sugerido que
la iniciación y progresión de estas CVO
pueden estar asociadas con la interacción
123
SUMMARY
A longitudinal study was made to detect antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)
in 13 patients with sickle cell anemia in vasocclusive crisis and basal state by using an
indirect immunofluorescence method. Of 34 serum samples, 16 were in vasocclusive
crisis and 12 of them corresponding to 10 patients revealed the presence of p-ANCA.
Neither p-ANCA nor c-ANCA was observed in the rest of the samples taken in
vasoclussive crisis and in basal state. The results achieved signaled a possible
involvement of p-ANCA in ischemic damage as well as the importance of their
measurement in the diagnosis of vasocclusive crisis in patients with sickle cell anemia.
Subject headings: ANTIBODIES, ANTINEUTROPHIL CYTOPLASMIC; ANEMIA,
SICKLE CELL; HEMATOLOGIC DISEASES.
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Recibido: 15 de noviembre de 1999. Aprobado: 30 de diciembre de 1999.
Lic. Ana María Guerreiro Hernández. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800,
Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537) 578268. Fax: (537) 338979. e-mail:[email protected]
124
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):125-31
Instituto de Hematología e Inmunología
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA LEUCEMIA AGUDA
PROMIELOCÍTICA: RESULTADOS PRELIMINARES
Dra. Gisela Martínez Antuña,1 Lic. Niubys Cayado Gutiérrez, 1 Lic. Adriana Muñiz
Fernández,1 Dr. Edgardo Espinosa Martínez,1 Dra. Elvira Dorticós Balea,1 Dr. Alejandro
González Otero,1 Dr. José Carnot Uría,2 Dr. Oscar Fernández Ramos3 y Dr. Porfirio Hernández
Ramírez1
RESUMEN
La leucemia aguda promielocítica (LAP) se caracteriza por la presencia de la
translocación recíproca t (15;17) que tiene como resultado la formación del gen
híbrido PML-RARα. Como la LAP se considera una emergencia hematológica y
además tiene hoy en día un tratamiento muy específico con ácido retinoico
(ATRA), es muy importante hacer un diagnóstico rápido y preciso, que en muchos
casos permite incluso salvar la vida del paciente. En la actualidad se han
desarrollado métodos de RT-PCR para detectar el gen híbrido PML-RARα. Estas
técnicas moleculares han sido extremadamente útiles en el diagnóstico de esta
entidad. En este trabajo presentamos los resultados preliminares del diagnóstico
molecular en 38 pacientes con LAP. En 36 pacientes se demostró la presencia del
gen híbrido y 2 fueron negativos. Del total de enfermos con resultados
positivos, 19 (55 %) fueron bcr 1, 2 (5 %) fueron bcr 2 y 14 (40 %) fueron bcr 3.
Todos los pacientes con resultados positivos respondieron al tratamiento con
ATRA. En 1 de los 2 pacientes con resultados negativos se demostró la presencia
de la t(11;17). Ninguno de estos 2 enfermos respondió al tratamiento con ATRA.
Descriptores DeCS: LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA/diagnóstico.
adultos jóvenes.2 Varios estudios recientes
han demostrado un aumento relativo en la
frecuencia de LAP en algunas poblaciones
de Europa, África y América Latina que van
desde el 17 al 58 % de las LMA en niños
hasta del 22 al 37 % en el adulto.3,4 En la
La leucemia aguda promielocítica
(LAP), M3 según la clasificación FAB
(Grupo Franco-Americano-Británico),1 es
uno de los subtipos más comunes de las
leucemias mieloides agudas (LMA) y
constituyen del 10 al 15 % de los casos en
1
2
3
Instituto de Hematología e Inmunología.
Hospital Clinicoquirúrgico “Hermanos Ameijeiras”.
Hospital Militar “Carlos J. Finlay”.
125
y de esta manera promueve el proceso
leucemogénico.5
Los estudios citogenéticos iniciales
sugirieron que la t(15;17) se encontraba
presente en todos los casos morfológicamente diagnosticados como LAP. Hoy
en día se sabe que existen casos raros de
LAP con otras translocaciones balanceadas que también involucran al RARα .
Las translocaciones alternativas asociadas
con LAP descritas hasta el momento se
resumen al pie de la página.
Datos recientes sugieren que las
proteínas PLZF y NPM, al igual que la
PML, puedan tener actividad supresora de
crecimiento y que la NuMA interviene en
el proceso de formación del huso mitótico
en la división celular. Aunque el número
de pacientes con estas translocaciones es
hasta el momento muy pequeño, los
ensayos de diferenciación y los datos
clínicos sugieren que los reordenamientos NPM-RAR α y NuMA-RAR α
responden al tratamiento con ATRA
como el PML-RARα y contrariamente
a lo que sucede con el PLZF-RARα .5
mayoría de los pacientes con esta leucemia
se observa la translocación recíproca entre
los cromosomas 15 y 17: t(15;17)
(q22;q11-21). Como resultado de la
t(15;17) en el cromosoma 15 se interrumpe
el gen PML, previamente desconocido, y
en el cromosoma 17 se interrumpe el gen de
la cadena α del receptor del ácido
retinoico (RARα ). El RARα pertenece a
la superfamilia de los receptores de
hormonas y actúa como un factor de
transcripción regulado por el ácido
retinoico (AR), mientras que el PML
recientemente se ha demostrado que forma
parte de un complejo multiproteico
llamado cuerpo nuclear (nuclear body).
Estos cuerpos nucleares tienen un papel
importante en el control del crecimiento
celular y se ha sugerido que la desregulación de algunos de sus componentes
puede tener importancia en el desarrollo
de neoplasias.5
Como resultado de la translocación,
se sintetizan las proteínas híbridas PMLRARα y su recíproca RAR α-PML. La
primera se detecta en todos los casos de
LAP, mientras que la segunda sólo en un
70-80 % de estos. Hoy en día se plantea
que la proteína híbrida PML-RARα
desempeña una función importante en la
patogénesis de la LAP porque al provocar
la disrupción de los cuerpos nucleares
interfiere con el proceso normal de
apoptosis. Esto tiene como consecuencia
un aumento en la sobrevida de las células
Translocación
t(15;17)(q22;q 21)
t(11;17)(q23;q21)
t(11;17)(q13;q21)
t(5;17)(q32;q21)
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DE LA LAP
Esta enfermedad tiene una serie de
características que hacen que se considere
una emergencia hematológica y enfatizan
la necesidad de un diagnóstico rápido y
preciso. En la actualidad está muy claro que
Oncogenes
PML-RAR α
PLZF-RAR α
NuMA-RARα
NPM-RAR α
126
Respuesta al ATRA
Responde
Resistente
Responde?
Responde?
la LAP requiere un tratamiento muy
específico en comparación con otros tipos
de LMA. Esto se debe al riesgo de muerte
por hemorragia y al gran riesgo de recaída
asociada con una baja supervivencia si
estos enfermos no se tratan con ATRA en
combinación con quimioterapia. El
subgrupo de pacientes con LAP que se
benefician del tratamiento con ATRA está
definido por la presencia del gen quimérico
PML -RAR α. Por lo tanto, establecer la
presencia del reordenamiento PML-RAR α
en pacientes en los que se sospeche una
LAP, es crítico para el manejo óptimo del
paciente.5,6
En la mayoría de los pacientes la
presencia indirecta del PML-RARα está
indicada por la detección de la t(15;17).
Sin embargo, en la actualidad se sabe que
en algunos pacientes en los cuales se
detecta por técnicas moleculares el gen
PML-RARα, no se observa la translocación por técnicas citogenéticas. Esto
puede deberse a fallos en la técnica
citogenética, a inserciones submicroscópicas en las cuales los cromosomas
15 y 17 tienen citogenéticamente una
apariencia normal, o a aberraciones
cromosómicas complejas que involucran
varios cromosomas. Según los datos más
recientes, en el 15 % de los pacientes con
LAP no se detecta la t(15;17) por los
métodos citogenéticos convencionales,
de los cuales el 9 % representa fallos
citogenéticos, el 4 % eventos de inserciones y el 2 % es debido a aberraciones
cromosómicas complejas. Sin embargo,
diversos ensayos clínicos demostraron que los
pacientes con el reordenamiento PMLRAR-α y resultados citogenéticos normales,
reaccionan favorablemente con el mismo
tratamiento que aquellos con la t(15;17)
clásica.5
Varios grupos de investigadores han
desarrollado métodos de RT-PCR (reverso
transcripción y reacción en cadena de la
polimerasa) para detectar el gen híbrido
PML-RARα. Estas técnicas moleculares
han sido extremadamente útiles en el
diagnóstico rápido de esta entidad y
también en la detección de la enfermedad
mínima residual (EMR) durante el
tratamiento y seguimiento de estos pacientes.6-10
Los estudios moleculares han
demostrado que existen 3 puntos de ruptura
dentro del gen PML: el bcr 1 (situado en el
intron 6) cuya frecuencia es de aproximadamente 60 %, el bcr 3 (situado en el
intron 3) cuya frecuencia aproximada es de
33 % y el bcr 2 (situado en posiciones
variables del exon 6) que constituye el
resto de los casos. El punto de ruptura en el
RARα es siempre el mismo.5
Por todo lo anteriormente expuesto, es
indudable que es muy importante realizar
un diagnóstico rápido y preciso de esta
entidad, por lo que el objetivo de nuestro
trabajo fue estandarizar el diagnóstico
molecular de la LAP en nuestro laboratorio. A continuación presentamos los
resultados del estudio inicial de
nuestros pacientes con LAP.
MÉTODOS
Se estudiaron muestras de médula ósea
de 38 pacientes con LAP (15 masculinos y
23 femeninos) evaluados en el Instituto de
Hematología e Inmunología de La Habana.
El rango de edad fue de 4 a 75 años. El
diagnóstico de LAP se hizo según el
criterio de la clasificación FAB utilizando
técnicas citomorfológicas y citoquímicas.11
Para realizar el diagnóstico molecular
las células mononucleadas se purificaron
en un gradiente de Ficoll-Telebrix y
posteriormente se suspendieron en una
solución de tiocianato de guanidino (GTC)
127
− R9: CTG CTG CTC TGG GTC TCA AT.
− R6: GCC CAC TTC AAA GCA CTT CT.
y se guardaron congeladas a -80 °C hasta
la purificación del ARN. El ARN se
purificó por el método fenol-guanidinio y
se guardó a -80 °C hasta su posterior
amplificación.12
Para los puntos de ruptura bcr 1 y bcr 2:
− M2 y R4 se utilizan en el primer PCR
y M3 y R9 se usan en la segunda
amplificación (nested).
TÉCNICAS DE RT-PCR DEL PML-RAR∝
Para hacer la reacción de
comprobación de bcr1 y bcr 2 (shifted),
se utilizan M3 y R6. La reacción de
comprobación se realizó en los casos al
diagnóstico.
Para el punto de ruptura bcr 3:
Se realizó la RT-PCR según el método
de la Biomed. 12 Se utilizó un estuche
comercial (Promega). Para la reversotranscripción (RT) se colocó 1 mg de ARN
total de la muestra de LAP en un volumen
de 20 µL de buffer que contenía 2,5 U de
reverso transcriptasa (Mo-MLV), random
hexamers como "amplímeros", buffer 5X,
dNTP, DTT, inhibidor de RNasa según las
condiciones del fabricante . La reacción se
realizó durante 60 min a 42 °C, después 5
min a 99 °C y 5 min a 4 °C.
Posteriormente se tomaron 2 µL de esta
solución y se diluyeron con el buffer de PCR
que contenía 1,5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L
Tris-HCl, pH 8,3, 200 µmol/L dNTP, 1 U de
Taq polimerasa y 10 pmol/µL de primers. El
volumen final de la reacción fue de 50 µL.
Después de una desnaturalización
inicial de 1 min a 94 °C, se realizó un ciclo
de desnaturalización, fortalecimiento
(annealing) y extensión de 1 min cada uno
con las temperaturas de 94, 65 y 72 ° C,
respectivamente. Este ciclo se repitió 35
veces. De esta primera reacción, se tomó 1µL y se realizó una segunda
amplificación (nested) con las mismas
condiciones, pero con los oligonucleótidos adecuados según el punto de ruptura.
Los oligonucleótidos utilizados
fueron los siguientes:
− M7 y R4 son los del primer PCR y M5
y R9 son los de la segunda amplificación (nested).
Para hacer la reacción de comprobación del bcr3 (shifted), se utilizan los
M5 y R6. La reacción de comprobación
se realizó en los casos al diagnóstico.
Como control interno de la reacción
se amplifica un segmento del exon 2 del
gen RARα con los siguientes oligonucleótidos:
− R5: CCA CTA GTG GTA GCC TGA
GGA CT.
− R2: GCT CTG ACC ACT CTC CAG
CA.
Para la determinación de PLZF-ATRA
se utilizaron los siguientes oligos:13
− Oligo A: GAC AAT GAC ACG GAG
GCC AC.
− Oligo F: GGC TTG TAG ATG CGG
GGT AG.
− Oligo C: AAC CAC AAG GCT GAC
GCT GT.
− M7: CTG CTG GAG GCT GTG GAC.
− M5: AGC GCG ACT ACG AGG AGA T.
− M3: TCA AGA TGG AGT CTG AGG AGG.
− M2: CAG TGT ACG CCT TCT CCA TCA.
− R4: GCT TGT AGA TGC GGG GTA GA.
Los oligos A y F se utilizan en el
primer PCR y para el segundo PCR
(seminested) se utilizan C y F.
Finalmente 15 µL del segundo PCR
(nested) se colocaron en electroforesis en
128
un gel de agarosa al 3 %. Las bandas se
colorearon con bromuro de etidio y se
visualizaron bajo una lámpara UV. En todos
los casos se realizó siempre un control
negativo (los reactivos + H2O) y un control
positivo conocido según el punto de
ruptura que se estuviera analizando.
con ATRA. Por otra parte, los ensayos
clínicos realizados han demostrado que los
pacientes con cariotipo normal, en los
cuales solo se detecta molecularmente el
reordenamiento PML-RARα , tienen el
mismo pronóstico favorable que aquéllos
que se identifican citogenéticamente por
la presencia de la translocación. Esto
constituye otra razón muy importante para
indicar el estudio molecular en los
pacientes cuya morfología haga sospechar
una LAP.6
La paciente nuestra con la t(11;17) no
respondió al tratamiento con ATRA y el
otro caso con resultados negativos para el
PML-RARα tampoco. Aunque no se pudo
comprobar la presencia de la t(11;17), es
muy probable que este paciente, por su
comportamiento clínico, también fuera
portador de esta variante.
La técnica molecular no solo es más
rápida (se puede tener el resultado en un
día), sino que permite detectar siempre la
presencia del gen híbrido y además contar
con un marcador con una gran sensibilidad
para confirmar la remisión y realizar el
monitoreo de la enfermedad mínima
residual durante el seguimiento de los
pacientes. También permite tener una
conformación objetiva de la remisión
morfológica, lo que posibilita distinguir
entre la regeneración medular y la
persistencia de la enfermedad, que puede
ser particularmente problemática en este
subtipo de LMA.14,15
Los resultados preliminares obtenidos en este trabajo han confirmado la
importancia práctica en el diagnóstico y
pronóstico de esta enfermedad, ya que
todos los pacientes con resultados
positivos respondieron al ATRA y
alcanzaron la remisión, mientras que los 2
casos con resultados negativos no lo
hicieron.
Por otra parte, también se comprobó
la importancia en el diagnóstico diferencial en casos con morfología dudosa al
RESULTADOS
El resultado del estudio molecular
mostró que de los 38 pacientes estudiados,
36 tuvieron resultados positivos y 2
mostraron resultados negativos para todos
los puntos de ruptura.
Del total de 36 enfermos con
resultados positivos, 19 (55 %) fueron bcr
1, 2 (5 %) fueron bcr 2 y 14 (40 %) fueron
bcr 3.
Un paciente con un diagnóstico
morfológico dudoso entre M3 y M4
mostró la presencia del gen híbrido PMLRARα , lo que confirmó el diagnóstico de
LAP.
Todos los pacientes con resultado
positivos respondieron al tratamiento
con ATRA.
De los 2 pacientes con resultados
negativos para el estudio del PML-RARα,
uno fue positivo para la t(11;17) (PLZF-RARα).
Al otro paciente no se le pudo realizar el
estudio de otras translocaciones. Estos
enfermos no tuvieron respuesta al
tratamiento con ATRA.
DISCUSIÓN
La LAP constituye una emergencia
hematológica, por lo que un diagnóstico
rápido y preciso es esencial. Todos los
estudios realizados hasta el momento
demuestran la importancia de la técnica
molecular como complemento del análisis
citogenético convencional en aquellos
pacientes donde se sospeche una LAP, para
identificar rápidamente al subgrupo de
pacientes que se benefician del tratamiento
129
El objetivo nuestro en este trabajo fue
estandarizar la técnica en nuestro laboratorio y comprobar su importancia en el
diagnóstico de los pacientes con LAP. En
estos momentos estamos realizando el
monitoreo molecular para detectar la enfermedad mínima residual durante el
seguimiento de estos pacientes. Los resultados obtenidos serán presentados en otro
trabajo.
demostrar la presencia del reordenamiento PML-RARα en el paciente que se
manifestaba morfológicamente como
M3-M4.
La frecuencia obtenida de los 3 puntos
de ruptura coincide con la descrita en la
literatura, es decir, el bcr 1 es el más frecuente, le sigue el bcr 3 y el bcr 2 es muy
poco frecuente.
SUMMARY
Acute promyelocytic leukemia (APL) is characterized by the reciprocal translocation
t(15; 17) that results in fusion gene PML-RARα formation. As APL is considered to be
an hematological emergency and also is given a very specific treatment with retinoic
acid (ATRA), then it is very important to diagnose quickly and accurately which makes
it possible in many cases to save the patient’s life. At present RT- PCR methods have
been developed to detect PML-RARα gen. These molecular techniques have been
extremely useful in diagnosing this entity. This paper sets forth the preliminary results
of molecular diagnoses of APL in 38 patients. 36 cases presented the fusion gene and
2 did not. Of the total number of positive patients, 19(55%) were bcr 1, 2 (5%) were bcr
2 and 14(40%) bcr 3. All the patients with positive results were responsive to treatment
with ATRA. One of the two patients with negative results showed the existence of t
(11; 17). These two patients did not respond to treatment with ATRA.
Subject headings: LEUKEMIA, PROMYELOCYTIC, ACUTE/diagnosis.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 24 de enero del 2000. Aprobado. 28 de enero del 2000.
Dra. Gisela Martínez Antuña. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad
de La Habana, Cuba. Teléf: (537) 578268. Fax: (537) 338979. e-mail:[email protected]
131
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):132-7
Producción
Instituto de Hematología e Inmunología
Centro de Inmunología Molecular
SISTEMA ANALÍTICO DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
BIOLÓGICA DEL REACTIVO HEMOCLASIFICADOR HEMO-CIM
ANTI-A
Lic. Lilia Suárez Batista,1 Lic. Alina Hernández Santana, 2 Lic. René Rivero Jiménez,1 Lic.
Antonio Bencomo Hernández1 y Dra. Teresita Rodríguez Obaya2
RESUMEN
Con el objetivo de llevar a cabo el escalado industrial de los productos
hemoclasificadores a partir de anticuerpos monoclonales murinos, se realizaron diversas
actividades para crear las condiciones que permitieran su manufactura con el
cumplimiento de las buenas prácticas de producción en el Centro de Inmunología
Molecular. Se introdujeron los métodos analíticos para determinar la calidad del producto
hemoclasificador Hemo-CIM anti-A en el Departamento de Control de la Calidad, se
entrenó al personal responsable de esta actividad en el uso de estos métodos de
evaluación de la actividad biológica del AcM anti-A en el sobrenadante, líquido ascítico
y producto terminado; se diseñaron y elaboraron los documentos que forman parte del
sistema de documentación; entre ellos, los procedimientos normalizados de operación
(PNO), los expedientes maestros de lotes, los documentos para la recolección de datos,
así como los registros de lote, los certificados de calidad y los registros de las mediciones
de la actividad biológica para archivar los resultados en el laboratorio.
Descriptores DeCS: ANTICUERPOS MONOCLONALES/análisis.
El control de la calidad comprende las
técnicas y actividades operativas
destinadas a monitorear un proceso y
eliminar las causas de resultados no
1
2
satisfactorios en todas las etapas de la
espiral de la calidad, con el fin de lograr una
mejor eficiencia económica.1 Por lo tanto,
en una industria interesada en producir un
Instituto de Hematología e Inmunología.
Centro de Inmunología Molecular.
132
determinado producto, es necesario crear
las condiciones en el departamento de
calidad para introducir los métodos
analíticos que permiten determinar la calidad
del producto y entrenar al personal para que
realice esta actividad.
Otra actividad necesaria es la
elaboración de la documentación, que es
una parte esencial de cualquier sistema de
aseguramiento de la calidad y está
relacionada con todos los aspectos de las
buenas practicas de producción (BPP), las
buenas prácticas de laboratorio (BPL) y las
buenas prácticas clínicas (BPC), que nos
permiten tener un camino hacia la
información, tener una guía de entrenamiento y un formato para el establecimiento de los compromisos.2
Los documentos directivos, entre ellos
los procedimientos normalizados de
operación (PNO) y los expedientes
maestros de lotes, los documentos para la
recolección de datos como los registros
de lote y los certificados, forman parte de
la documentación que componen un
sistema de documentación.2
Para la producción del reactivo
hemoclasificador Hemo/CIM anti-A en el
Centro de Inmunología Molecular (CIM),
se trabajó en estas actividades, con el fin
de crear las condiciones necesarias para
el establecimiento del control de la calidad
de dicho reactivo, que permitiera la
verificación de la conformidad de las
materias primas y el producto final de
acuerdo con las especificaciones
establecidas y para registrar todas las
etapas del proceso productivo, dejando
constancia de la realización de todas las
actividades que conforman la manufactura
del producto.
se definió por la potencia y la especificidad mediante la técnica de hemaglutinación por centrifugación en tubo; la
avidez y la intensidad mediante la técnica
de hemaglutinación en lámina portaobjeto
utilizando los métodos recomendados por
las agencias regulatorias FDA y CECMED
para la evaluación de los reactivos
hemoclasificadores. 3,4 La potencia y la
especificidad de los AcM anti-A en los
lotes de sobrenadantes se definió mediante
la técnica de hemaglutinación en placa.
Además se creó un panel de eritrocitos que
incluye los grupos A1, B, A2B y O que se
congelaron a una temperatura de-20 °C
para poder realizar esta actividad.
Se entrenó al personal responsable de
la evaluación de la actividad biológica con
el objetivo de que conociera los procedimientos necesarios para realizar esta
actividad, cumpliendo con las BPP.
CREACIÓN DE LA BASE
DOCUMENTAL
Se escribieron los PNO para la
preparación de las soluciones necesarias
para realizar las técnicas de hemaglutinación y los PNO de la descripción de
los métodos analíticos necesarios para
determinar la actividad biológica del AcM
anti-A con el fin de asegurar que el
personal relacionado con la aprobación o
no de los lotes (sobrenadante de cultivo,
líquido ascítico [LAM] y producto final),
supiera lo que tenía que hacer y cuándo
hacerlo y así evitar posibles errores.
Además, una vez definido el proceso de
producción del reactivo hemoclasificador
Hemo-CIM anti-A, se elaboraron los
registros de lotes para la formulación,
llenado, etiquetado y envase de dicho
reactivo.
En la elaboración de estos
documentos se tuvieron en cuenta los
requisitos para que estos documentos
MÉTODOS
ESTABLECIMIENTO DEL SISTEMA
ANALÍTICO
La determinación de la actividad
biológica del producto Hemo-CIM anti-A
133
fueran claros y precisos y se cumpliera con
los principios de las BPL y las BPP.5,6
Se diseñaron y elaboraron los certificados de calidad para el registro de los
resultados obtenidos en la evaluación de
los lotes por parte del Departamento de
Control de la Calidad del CIM y los
registros de las mediciones de la actividad
biológica para archivar los resultados en
el laboratorio.
que contiene anticuerpos
monoclonales
hemoclasificadores.
Congelación de eritrocitos.
Descongelación de eritrocitos.
Determinación de la actividad
biológica del producto
final de los anticuerpos
monoclonales
hemoclasificadores.
RESULTADOS
Determinación de la
Los métodos analíticos establecidos
permiten evaluar los lotes de sobrenadante,
LAM y producto final en el Departamento
de Control de la Calidad del CIM, que
cuenta en la actualidad con un personal
adiestrado y capacitado para evaluar
correctamente la actividad biológica del
AcM anti-A.
Se redactaron los PNO para la
preparación de las soluciones que se
utilizan en la realización de las técnicas de
hemaglutinación y los PNO de la descripción de los métodos analíticos.
del líquido ascítico y del
PNO para la preparación
de las soluciones necesarias
para realizar las técnicas
de hemaglutinación
Solución de glicerol al 5 %.
Solución de congelación.
Solución de glicerol al 12 %.
Solución hipertónica
de cloruro de sodio.
Solución de bromelina.
Solución de cloruro
de sodio 0,9 %/1 % de BSA.
PNO de la descripción de
los métodos analíticos
necesarios para determinar
la actividad biológica
del AcM anti-A
PNO-5043
PNO-5076
PNO-5077
PNO-5078
potencia y la especificidad
producto final de los AcM
hemoclasificadores.
PNO-5079
Determinación de la avidez,
la intensidad y la especificidad
del líquido ascítico y del
producto final de los AcM
hemoclasificadores.
PNO-5081
PNO-4052
PNO-4053
PNO-4054
En el formato de estos documentos
se desarrollaron los siguientes acápites:
título, campo de aplicación, responsabilidad, consideraciones de seguridad,
equipamiento y materiales, preparación de
soluciones, procedimiento y registro de
datos.5,7
Se elaboraron los certificados de
calidad para el registro de los resultados
de la evalución del sobrenadante, LAM y
producto final.
PNO-4055
PNO-4056
Certificados de calidad
PNO-4057
Hemoclasificador
Código
Hemo-CIM anti-A.
Código
Código
REG-5102
Pruebas al producto
de cultivo celular para
productos
diagnosticadores.
REG-5111
Líquido ascítico de los
Determinación de la actividad
biológica del sobrenadante
hemoclasificadores
134
REG-5119
Se diseñó el registro de lotes para la
formulación del producto con código
REG-7070 y el registro de lotes para el
llenado, etiquetado, y envase del producto
Hemo-CIM anti-A con código REG-7072,
una vez que se definieron todos los eventos
del proceso por separado. En el primer
documento se incluyeron los siguientes
pasos:
− Toma de la muestra y entrega al
Departamento de Control de la Calidad
para la evaluación de la actividad
biológica.
− Mantenimiento del producto a 4 °C
hasta su liberación para el llenado.
1. Creación de las condiciones para
iniciar la formulación del producto
Hemo-CIM anti-A.
− Resumen del registro de la preparación
del local y los equipos.
− Registro del material y la cristalería
necesarios.
− Registro de existencia de los reactivos
y agua para inyección.
− Recepción del líquido ascítico.
2. Preparación del líquido ascítico para la
formulación del producto Hemo-CIM
anti-A.
− Descongelación del líquido ascítico.
− Ajuste de pH.
− Preparación del filtro y filtración del
líquido ascítico.
3. Preparación de la solución balanceada
de fosfatos.
− Pesada de los reactivos.
− Disolución de los reactivos.
− Ajuste de pH y enrase de la solución
balanceada de fosfato a volumen final.
4. Filtración de la solución balanceada de
fosfato.
− Preparación del filtro.
− Filtración.
5. Formulación del producto Hemo-CIM
anti-A.
− Mezcla del líquido ascítico y la
solución balanceada de fosfatos.
− Ajuste de pH.
6. Filtración del producto Hemo-CIM anti-A.
− Primera etapa de filtración.
− Segunda etapa de filtración.
− Balance de la filtración.
7. Toma de muestra a granel.
1. Creación de las condiciones para
iniciar el llenado, etiquetado y envase
del Hemo-CIM anti-A.
− Resumen del registro de la preparación
del local y los equipos.
2. Creación de las condiciones para el
llenado del Hemo CIM anti-A.
− Registro de la cristalería necesaria.
3. Llenado.
− Calibración de la llenadora.
− Llenado.
− Revisión.
4. Etiquetado.
− Edición de etiquetas.
− Etiquetado.
− Toma de muestra y distribución de las
muestras.
5. Envase del producto.
6. Entrega del lote al almacén del
producto terminado.
En el segundo documento se
incluyeron los siguientes pasos:
Todos los documentos fueron
revisados y aprobados por el Jefe del
Departamento de Control de la Calidad y
por el Departamento de Aseguramiento de
la Calidad del CIM.
DISCUSIÓN
Una vez que se decidió crear toda la
infraestructura necesaria para la
producción del reactivo monoclonal
hemoclasificador Hemo-CIM anti-A en el
135
CIM, teniendo en cuenta los resultados
alentadores obtenidos por los estudios de
carac-terización inmunohematológica del
AcM anti-A IHI-15,8,9 se hizo necesario
introducir un sistema analítico que
permitiera realizar la actividad de control
de la calidad a los lotes producidos de
dicho reactivo y las materias primas ricas
en AcM anti-A. Con este objetivo, se
introdujeron las técnicas de hemaglutinación recomendadas por la FDA y
CECMED para la evaluación de los
reactivos hemoclasificadores.3,4 Para este
propósito se adiestró al personal necesario
y se crearon los documentos que soportan
esta actividad para cumplir con las BPP.
Desde el año 1996, paralelamente con
la evaluación de los lotes del producto
terminado Hemo-CIM anti-A realizado en
el Departamento de Control de la Calidad
del CIM, también estos lotes de reactivos
se evaluaron en el Instituto de Hematología
e Inmunología como centro de referencia
nacional y laboratorio acreditado por el
CECMED, como control externo, que
redundó en una garantía de la calidad del
producto en el mercado y demostró la reproducibilidad de los resultados obtenidos
mediante las técnicas introducidas.
Para la introducción de las técnicas de
hemaglutinación necesarias para determinar
la actividad biológica del AcM anti-A en
los lotes de sobrenadante, LAM y producto
terminado, se trabajó en la confección de
los PNO con el objetivo de preparar las
soluciones necesarias para realizar las
técnicas de hemaglutinación y los PNO de
la descripción de los métodos analíticos
necesarios para determinar la actividad
biológica del AcM anti-A. En estos
documentos se describe cómo realizar las
operaciones y qué hay que hacer para llevar
a cabo la actividad de evaluación de los
lotes entregados al Departamento de
Control de la Calidad para su liberación,
evitando los errores.5
Además en la confección de los
registros de lote para la formulación del
reactivo Hemo-CIM anti-A y para el
envase, llenado y etiquetado de dicho
producto, se cuenta con un documento que
describe los pasos a realizar por los
operarios y permite registrar los datos
dejando constancia de la realización de la
actividad, con lo que se logra una
trazabilidad de todos los productos que
conforman el proceso productivo del
reactivo Hemo-ClM anti-A.6
Los certificados de calidad nos
permitieron recolectar los datos de la
evaluación de los lotes, y emitir el veredicto
sobre su calidad.
Los registros de lote y los certificados
de calidad a su vez conformaron los
registros de cada lote de producto HemoClM anti-A. Este documento, permite
analizar retrospectivamente un proceso
productivo e identificar errores cometidos,
si se detecta una desviación en la intención
para la cual el producto fue destinado,
además permite la creación del expediente
maestro de lote.6
Estos documentos se prepararon bajo
los requerimientos de las agencias
regulatorias con el objetivo de cumplir con
las buenas prácticas y su implantación,
entre otros aspectos y permitió que la
agencia regulatoria nacional CECMED, una
vez que inspeccionara el CIM, le otorgara
la licencia de producción de este producto.
136
SUMMARY
With the objective of carrying out industrial scaling of hemoclassifier products from
murin monoclonal antibodies, a number of activities were performed to create the
conditions for their manufacture in compliance with good manufacturing practices of
the Molecular Immunology Center. The analytical methods were introduced to determine
the quality of anti-A Hemo-CIM hemoclassifier in the Quality Assurance Department.
Staff responsible for this work was trained in the use of these evaluation methods of
the biological action of anti-A monoclonal antibody in supernatant, ascitic fluid and
finished product; the documents that are part of the documentation system were
designed and prepared, among them standard operating procedures, master production
batch records, documents for data-gathering, batch records, quality certificates and
biological activity measurement registers to file lab results.
Subject headings: ANTIBODIES, MONOCLONAL/analysis.
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Recibido: 5 de octubre de 1999. Aprobado: 2 de noviembre de 1999.
Lic. Lilia Suárez Batista. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La
Habana, Cuba. Teléf: (537) 578268. Fax: (537) 338979. e-mail: [email protected]
137
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):138-41
De la prensa médica extranjera
Servicio de Transfusiones de Sangre de la Cruz Roja de Hong Kong
SISTEMA AUTOMATIZADO DE DETECCIÓN DE BACTERIAS EN
LAS PLAQUETAS*
Lin CK, Liu HW
Antes de que se introdujeran el uso
de bolsas plásticas para la colección de la
sangre y los sistemas cerrados de
procesamiento, la contaminación bacteriana era uno de los peligros más
frecuentes y graves que conllevaban las
transfusiones. En los 20 últimos años, los
virus de la hepatitis y de la inmunodeficiencia humana han captado de forma
preponderante la atención del público y de
la comunidad dedicada a la atención
sanitaria, como los mayores riesgos que
pueden acarrear los productos sanguíneos.
Tras la puesta en práctica de programas
eficaces para tamizar, eliminar e inactivar
estos virus transmitidos por la sangre,1-5 la
contaminación bacteriana progresivamente
ha vuelto a surgir como un riesgo
considerable en el proceso de la transfusión. De 1986 a 1991 se informó de
29 casos de muertes relacionadas con
*
transfusiones en los Estados Unidos,
provocados por contaminaciones bacterianas, cifra que representa el doble de
los casos registrados entre 1976 y 1985. De
esos 29 fallecimientos, 21 se atribuyeron a
la contaminación bacteriana acarreada por
concentrados de plaquetas.6 El predominio
de la contaminación bacteriana mediante
las plaquetas, en comparación con otros
componentes de la sangre, se ha atribuido
parcialmente a que aquellas se han
empleado cada vez más en los últimos años.
Además, las plaquetas se almacenan a un
rango de temperatura en que la mayoría de
las bacterias pueden multiplicarse, lo cual
significa que se le va a entregar una carga
de bacterias más importante al receptor en
caso de que la unidad esté contaminada,
particularmente si ha estado almacenada
por un período prolongado.7,8
Tomado de la Revista Transfusión Internacional, No. 75 de marzo de 1999, con la gentil
autorización del Dr. In F. Young y la Sra. Robin Thompson, Director del Departamento de
Sangre y Encargada del Servicio de Comunicación y Publicaciones y la Sra. Marcela García
Gutiérrez, todos de la Federación Internacional de Sociedades de la Cruz Roja y la Media
Luna Roja.
138
técnicas disponibles actualmente para
detectar la contaminación no son lo
suficientemente sensibles como para
emplearse en un servicio de transfusión.
El límite de detección varía entre 105 y
106 UFC/mL (unidades de formación de
colonias por mililitro) para la tinción
Gram;15 entre 104 y 105 UFC/mL para la
tinción de naranja de Acridina;16 de entre
104 y 105 UFC/mL para la prueba genética
universal del ARNr (ácido ribonucleico
ribosómico) bacteriano vinculada a la
quimioluminiscencia; 17,18 y de entre 107 y
108 UFC/mL para las pruebas de glucosa
y de pH.19,20
El cultivo de bacterias ofrece un alto
nivel de precisión, pero los métodos
tradicionales son demasiado lentos para
ser prácticos. Las nuevas técnicas, basadas
en el control continuo de la producción
de CO 2, en las botellas especialmente
diseñadas para los cultivos, permiten
ejercer un control altamente automatizado
y una comprobación más rápida de los
resultados.21
En estudios prospectivos recientes se
encontró que la tasa de contaminación
bacteriana presente en los concentrados de
plaquetas oscilaba entre un 0,04 % y un
0,3 % y que la tasa de reacción en caso de
transfusión se situaba entre un 0,007 % y
un 0,046 %, 7-14 con consecuencias que
pueden variar desde una reacción febril que
remite espontáneamente hasta un choque
séptico y la muerte. Si se toma en
consideración la dosis corriente de
plaquetas que reciben los pacientes en una
transfusión, en especial quienes se someten
a terapias de ablación de la médula ósea, se
observa que el riesgo efectivo en términos
prácticos para estos pacientes se multiplica varias veces con respecto a la
contaminación que puede causar una
unidad de plaquetas. Pese a ello, al no haber
sistemas de supervisión globales y
efectivos en la mayoría de entornos
clínicos, el problema de la septicemia
bacteriana no se ha apreciado cabalmente.
En general, se reconoce que la mayoría
de los organismos aislados que contiene la
sangre donada provienen de la flora normal
de la piel o del medio ambiente y que se
introducen en las unidades de sangre en el
momento de la venopunción. Al ser poco
probable que con cualquiera de los
métodos antisépticos pueda lograrse una
esterilización absoluta de la piel antes de la
venopunción, los servicios de transfusión
deberán confiar en las pruebas de
laboratorio para detectar y prevenir la
distribución de productos contaminados.
Para que tales pruebas sean eficaces, deben
ser sencillas (adaptadas a un tamizaje
masivo), rápidas (ya que los concentrados
de plaquetas tienen una corta fecha de
almacenamiento) y sensibles (para que
puedan conservar su valor predictivo
durante el tiempo de almacenamiento
restante del producto después de haberle
hecho la prueba). La mayoría de las
RESULTADO
DE LA INVESTIGACIÓN
EN EL SERVICIO
DE TRANSFUSIÓN DE SANGRE
DE LA CRUZ ROJA DE HONG
KONG
El Servicio de Transfusión de Sangre
de la Cruz Roja de Hong Kong realizó una
investigación muy amplia y comprobó que
el tamizaje de las unidades de plaquetas,
mediante cultivos aeróbicos de corta
duración con un sistema automatizado de
análisis de bacterias, resulta eficaz para
eliminar las plaquetas contaminadas del
inventario. El sistema podría, de forma
fiable, detectar una UFC en la flora común
de la piel en un lapso de 13 a 30 horas.
139
Aumentando el inóculo también se reduce
el tiempo necesario para el análisis y se
logran diferencias más pronunciadas en la
gama de 1 a 100 UFC.
De enero de 1996 a diciembre de 1998,
el Servicio de Transfusión de Sangre de la
Sociedad Nacional realizó las pruebas en
133.777 muestras de plaquetas provenientes de sus respectivos concentrados,
separadas de la sangre entera 2 días
después de su colección. Las muestras se
obtuvieron de los segmentos previamente
mezclados de las unidades de plaquetas.
Se inoculan de 1 a 1,2 mL, en botellas de
cultivo aeróbico. Se confirmó que 96 unidades (0,07 %) estaban contaminadas con
bacterias; la incidencia es de una magnitud
similar a la que reveló un estudio clínico
local realizado anteriormente, de acuerdo
con el cual 1/2 150 unidades de plaquetas
obtenidas de sangre entera causaba una
reacción séptica en la transfusión.11 El
37,5 % de los concentrados de glóbulos
rojos y el 13,5 % del plasma recientemente
congelado también resultaron positivos en
el cultivo de los mismos organismos.
Aunque es poco probable que las bacterias
presentes proliferen en mayor medida
estando almacenadas a baja temperatura,
los componentes afectados se siguen
extrayendo del inventario en aras de la
seguridad de las transfusiones.
Los contaminantes eran Bacillus
spp. (59 unidades) Staphylococcus spp.
(27 unidades), Escherichia coli (2),
Citrobacter (1), Proteus mirabilis (1),
Klebsiella oxytoca (1), Haemophilus
influenzae (1), Non-enteroccal spp (1),
Streptocci Gp D (1), Streptococcus bovis
(1) y Propionibacterium acnes (2). Salvo
en 3 casos de contaminación por
Staphylococcus detectados en períodos de
25, 26 y 28 horas y en 2 casos de conta-
minación por Propionibacterium detectados después de las 48 horas, todos los
demás contaminantes se detectaron dentro
de las 48 horas de incubación. Por lo tanto,
se considera que es suficientemente seguro
distribuir plaquetas a partir del tercer día de
la colección de la sangre. Una de las
principales limitaciones del cultivo de corta
duración es la lentitud del desarrollo de
algunas bacterias que podrían no detectarse
en un plazo de 24 horas, motivo por el cual
seguimos vigilando el cultivo hasta 48 horas
para detectar, particularmente, la infección
por Staphylococcus, que es bastante
corriente.
Además, utilizando el protocolo que
diseñamos, hemos encontrado que la
prueba es suficientemente sensible y
permite reunir 5 muestras en una botella
de cultivo, cantidad que representa la dosis
de plaquetas recomendada generalmente
para un paciente adulto. Este procedimiento también disminuye el costo
medio de la prueba de control de bacterias
para nuestro servicio, incluyendo los
costos de reactivos y del personal, a 2,5
dólares EE.UU. por unidad de concentrado
de plaquetas. Habiendo comprobado que
1/1 394 unidades de plaquetas obtenidas
de sangre entera se contamina, el costo
de evitar la distribución de una unidad de
concentrado de plaquetas y de los
correspondientes glóbulos rojos asciende
a 3.485 dólares EE.UU. Al comparar esta
cifra con el costo de evitar una
transmisión, mediante una transfusión
sanguínea, de virus de inmunodeficiencia
humana (54.487 dólares EE.UU.) o de
virus de linfotrópicos de las células T
humanas (62.820 dólares EE.UU.) ambos
con una tasa de incidencia de 1/50 000
entre la población local de donantes,
estimamos que el sistema de control
bacteriano que hemos diseñado es el
eficiente.
140
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141
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2000;16(2):142-4
Cartas al director
MARCADORES GENÉTICOS EN PACIENTES CON ANEMIA
DREPANOCÍTICA DE LA PROVINCIA DE CIENFUEGOS:
HAPLOTIPOS DEL BLOQUE β Y α -TALASEMIA
Al Director:
Los pacientes con anemia drepanocítica presentan grandes diferencias en su
comportamiento clínico, ya que existen desde pacientes con anemia muy severa hasta otros
que tienen una vida prácticamente normal.1
El conocimiento sobre los factores genéticos y ambientales que modifican el curso de
esta enfermedad es escaso. Se ha establecido que la severidad de esta enfermedad es en gran
medida el resultado de la interacción de efectos epistáticos, entre los que se incluyen la
α−talasemia, los polimorfismos asociados al bloque de genes tipo β (haplotipos) y los
factores ligados al cromosoma X que modulan la expresión de la hemoglobina fetal.2
Powars y otros encontraron que existe una relación positiva entre la presencia del
haplotipo Senegal y la disminución de la incidencia de los eventos clínicos característicos de
la enfermedad. Sin embargo, la presencia del cromosoma CAR mostró una correlación positiva
con el aumento de la ocurrencia de eventos vasooclusivos en los órganos blandos, tales
como: cerebro, riñón, pulmón, etc. También encontró que los pacientes con cromosomas
Senegal y Benin son idénticos hasta los 20 años de edad en cuanto al riesgo de eventos
clínicos agudos y recurrentes y que después de esta edad, se evidencia el efecto protector
del cromosoma Senegal, al disminuir el riesgo de fallo orgánico.3
Además existen evidencias que apoyan el hecho de que la herencia conjunta de la
α−talasemia en pacientes con AD provoca que estos padezcan una forma más benigna de
la enfermedad, pues padecen menos anemia que aquellos pacientes con un complemento
normal de genes alfa.4
En un estudio realizado en pacientes de la Ciudad de La Habana, encontramos que
existen diferencias significativas entre la frecuencia de los diferentes haplotipos y su relación
con la edad, ya que se encontró una disminución de cromosomas CAR y un aumento de
Senegal y Benin entre los pacientes mayores de 20 años.5
También se demostró en un grupo de 234 pacientes que la α-talasemia aumenta
significativamente con la edad; estos resultados apoyan el planteamiento de que la herencia
conjunta de α-talasemia aumenta la sobrevida del paciente SS.6
142
El objetivo del presente trabajo fue determinar los haplotipos asociados al gen βs y la
frecuencia de α-talasemia en un grupo de pacientes SS de la provincia de Cienfuegos y
comparar los resultados con los obtenidos en la Ciudad de La Habana.
Se estudiaron 27 pacientes con AD (54 cromosomas βs). De ellos 9 fueron niños
(edades entre 5 y 17 años) y 17 adultos (edades entre 18 y 62 años). El fenotipo de estos
pacientes fue identificado por electroforesis de hemoglobina, prueba de solubilidad de la
hemoglobina y el estudio familiar. El análisis de los haplotipos y de la α-talasemia se
realizó según los procedimientos estándar. 7,8 Para el análisis estadístico se utilizó el test
de chi cuadrado.
La distribución de los haplotipos asociados al gen de la hemoglobina S en la muestra
total fue: Benin 40,74 %, CAR 48,15 % y Senegal 11,1 %. En la tabla 1 se comparan los
resultados obtenidos en la provincia de Cienfuegos y en la Ciudad de La Habana.
Los resultados del estudio de α-talasemia mostraron que la frecuencia de esta en los
pacientes de Cienfuegos fue de 0,1346. En la tabla 2 se comparan los resultados obtenidos en
ambas provincias.
Nuestros resultados demuestran que cuando se comparan los pacientes de Cienfuegos
con los enfermos estudiados anteriormente en Ciudad de La Habana, no existen diferencias
significativas en cuanto a la distribución de haplotipos, con la frecuencia de α-talasemia.
Sería interesante extender el estudio a otras provincias de la región central del país para
corroborar nuestros resultados, así como para establecer la posible relación de estos factores
genéticos con la sobrevida de los pacientes SS.
TABLA 1. Comparación de la distribución de los haplotipos
asociados al gen β s en los pacientes de Cienfuegos
y Ciudad de La Habana
TABLA 2. Comparación de la distribución de α-talasemia
en los pacientes de Cienfuegos y Ciudad de La
Habana
Haplotipos
Cienfuegos
No.
%
Genotipo
Benin
CAR
Senegal
22
26
6
40,74
48,15
11,1
210
135
32
Total
54
100,00
377
Ciudad de La Habana
No.
%
α4
α3
α2
55,70
35,81
8,49
Total
F (-α)
100
chi2 :4,9040,gl=2 NS.
Cienfuegos
Ciudad de
La Habana
17
7
0
220
82
11
24
0,1340
313
0,1880
Chi2 : 1,2378,gl = 1 NS.
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Lic. Adriana Muñíz Fernández1
Lic. Adrianet Puig Cano1
Dra. Maritza Cabrera Zamora2
Dr. Julio Fernández Águila2
Dra. Gisela Martínez Antuña1
1 Instituto de Hematología e Inmunología, Ciudad de La Habana.
2 Hospital Provincial "Gustavo Aldereguía", Cienfuegos.
Recibido: 15 de noviembre de 1999. Aprobado: 18 de noviembre de 1999.
Lic. Adriana Muñíz Fernández. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La
Habana. Cuba. Teléf: (537)578268. Fax:(537)338979. e-mail:[email protected]
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