LABORATORIO No 7 PCR

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
LABORATORIO No 7: REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
1. INTRODUCCIÓN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica in Vitro que imita
la habilidad natural de la célula para duplicar el ADN, generando múltiples copias
de una secuencia específica de nucleótidos
o amplificando selectiva y
exponencialmente el ADN de un organismo. Por lo tanto, es un procedimiento muy
sensible que en teoría, permite detectar específicamente una sola molécula del
ADN en solución, lo que ha generado el desarrollo de muchos métodos de
diagnóstico basados en este principio.
Una de las ventajas que plantea esta técnica es la adaptación del método general
para determinar la presencia de una secuencia específica en cualquier agente
patógeno, incluyendo bacterias, protozoarios, virus y helmintos, ya que, todos los
organismos invasores poseen ADN o ARN, como material genético. De esta
manera, puede proveer resultados en el mismo día para organismos en los que
normalmente se tomarían varias semanas utilizando tecnologías convencionales.
El diseño continuo de protocolos que incluyen diferentes secuencias iniciadoras,
cebadores o primers, y múltiples variaciones en la concentración de cada uno de
los componentes de la PCR según la secuencia de nucleótidos que se desee
amplifica, se debe a que el ADN o ARN usado como blanco cambia entre
especies, y por ende los sistemas de medición son modificados y adaptados a
nuevas tecnologías que mejoren la sensibilidad, especificidad y rapidez en la
determinación. Es así como, en la actualidad ya están disponibles kit de
diagnóstico de PCR en tiempo real.
2. OBJETIVOS
•
•
•
•
Comprender las fases de desnaturalización, hibridización y elongación o
extensión que comprende la PCR.
Analizar cada uno de los componentes necesarios para la realización de una
amplificación de ADN.
Realizar la amplificación de un fragmento de ADN.
Discutir algunas aplicaciones de la amplificación de los fragmentos de ADN por
PCR.
3. MARCO TEORICO
FUNDAMENTO
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica de Biología
Molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico
(ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. A través de
ciclos; donde en cada uno se duplica la cantidad de ADN, por lo que permite
obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento y en unas pocas horas.
Esta metodología fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en
1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en
una de las primeras compañías dedicadas a la comercialización de la Ingeniería
Genética la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta
técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había
generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo.
Dentro de las principales aplicaciones de la PCR se encuentran: Estudios
Arqueológicos, Medicina Forense, Genética, Pruebas de paternidad,
Investigaciones Biomédicas, Ambientales, Industriales y Diagnóstico Clínico. En
este último, los Laboratoristas Clínicos, pueden tomar una muestra mínima de
material genético, copiar la secuencia de interés las veces necesarias y generar
suficiente cantidad de muestra para detectar la presencia o ausencia de
patógenos y en muchos casos realizar la cuantificación del mismo.
PROCESO METODOLOGICO
Cada ciclo de PCR consta de tres fases:
1. Desnaturalización: En esta el ADN blanco de doble cadena se somete a una
temperatura de 90º a 95 ºC durante 30 segundos; permitiendo la separación de las
dos cadenas.
2. Hibridización: En esta la temperatura de la mezcla se disminuye hasta
alcanzar la temperatura adecuada para favorecer el apareamiento de los primers
con la secuencia blanco, lo cual generalmente ocurre entre 45 a 55 ºC
(dependiendo de la temperatura de Fusión o Tm de los primers) durante 20 a 30
segundos
3. Elongación o extensión: En este la temperatura de la mezcla se eleva hasta
72 °C para que la Taq polimerasa (DNA polimerasa) comience el proceso de
extensión en dirección 5’ a 3’ agregando los nucleótidos correspondientes,
obteniéndose la hebra complementaria de DNA o AMPLICÓN.
En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reacción, de manera
que en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un solo fragmento.
Estas tres fases tienen lugar en el mismo tubo y constituyen un ciclo completo de
PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se
puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen
renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres
horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN.
Consideraciones:
•
Al final del primer ciclo de la PCR, hay dos dobles hebras de ADN idénticas a
la original, cada nueva hebra producida se denomina AMPLICÓN.
•
Este ciclo de tres pasos (desnaturalización, alineamiento y extensión) puede
ahora repetirse muchas veces. Conforme la PCR continúa, se crean primero
dos, cuatro, ocho,…….2n copias (n= número de ciclos), obteniéndose después
de 30 ciclos 1.073.741.824 copias. Este proceso de la PCR también es llamado
AMPLIFICACIÓN debido a que la secuencia objetivo es copiada una y otra vez
con el objeto de hacer millones de copias. Ahora ya hay suficiente material
genético para detectar la presencia y la cantidad del patógeno.
•
La temperatura de fusión o Tm a la cual se realiza el paso de hibridización,
representa la temperatura a la cuál 50% de un oligonucleótido con una
secuencia específica se encuentra unido y la otra mitad se encuentra
desnaturalizado.
ZONAS DE TRABAJO PARA PCR
(Espacio de laboratorio asignado)
AREA A
AREA B
TRABAJO PRE – PCR
TRABAJO POST – PCR
Pesada de químicos
Preparación del Buffer
Extracción del ADN
Preparación de
stock para PCR.
soluciones
Preparación de reacciones
PCR (mezcla).
Amplificación
(Termociclador).
Electroforesis de productos
PCR
Procesamiento
productos PCR
de
Secuenciación y análisis de
restricción de reacciones
PCR
Cargamento de productos
amplificados para segundo
periodo de amplificación.
4. PRELABORATORIO
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica para la
síntesis in vitro de secuencias específicas de ADN, con la cual se amplifica el ADN
problema. La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos
eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de
una cadena complementaria de ADN en el sentido 5' → 3' usando un molde de
cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta
región de doble cadena se usan los denominados iniciadores (primer). Estos son
una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios
a cada uno de los extremos 3' del fragmento de ADN que se desea amplificar. La
reacción de PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:
-
Desnaturalización del ADN del doble cadena
-
Hibridización de los iniciadores a la zona 3' específica de cada una
de las hebras.
-
Extensión del cebador 3' por medio de la ADN polimerasa.
Teniendo en cuenta las tres etapas de las PCR.
1. ¿Cuáles son las características más predominantes de la Taq polimerasa?
2. Nombre algunas de las modificaciones de la PCR y sus aplicaciones.
3. Mencione brevemente la función de los componentes más usuales de una PCR
(DNA
polimerasa;
iniciadores,
cebadores
o
primers;
dNTPs
o
desoxirribonucleótidos trifosforilados; Buffer y Cloruro de magnesio).
4. ¿Cómo se diseña un cebador y cuáles son los parámetros a tener en cuenta?
5. Si la técnica de PCR es exponencial, en cada ciclo se obtiene el doble de
producto, calcule cuantos millones de copias obtendría después de 34 ciclos en la
PCR.
5. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
Materiales
Guantes estériles
Pipetas automáticas
Puntas estériles
Tubos de PCR estériles
Gradilla para tubos de PCR.
Reactivos
Mezcla maestra con:
•
dNTPs : Adenina, Guanina, Citosina y Timina
•
Cloruro de Magnesio (MgCl2)
•
DNA polimerasa (Taq polimerasa)
•
Buffer 1X
•
Agua destilada, des ionizada y estéril o milliQ
•
Primers o cebadores DISPONIBLES (para ADNr 16s o específicos del
microorganismo a amplificar).
•
ADN extraído listo para amplificar.
•
Cepa de microorganismo en estudio en cultivo sólido (agar LB)
Equipos
•
•
•
•
•
•
•
•
Centrífuga, micro centrífuga
Termociclador
Potenciómetro
Balanza analítica
Transiluminador de U.V.
Cámaras de flujo laminar, cámaras de extracción
Congeladores
Desionizador
PRIMERA SESION
•
Se realizara la Fundamentación de la técnica, diseño de primers, cuidados
para prevenir contaminación, usos de controles positivos y negativos
•
los cálculos para realizar la mezcla maestra y las soluciones stock d primers
montaje en general
•
Descripción de tipos de controles que se deben incluir
•
Manejo de termociclador
SEGUNDA SESION
Realizar el protocolo estandarizado en el laboratorio de Biotecnología, que se
describe a continuación
6. PROCEDIMIENTO
El procedimiento que a continuación se describe es utilizado para la detección del
gen de resistencia a amino glucósidos aac(6´)aph(2´) en cepas de
Staphylococcus epidermidis y/o se llevara a cabo la confirmación de género y
especie mediante amplificación multiplex. De acuerdo al protocolo estandarizado
por el laboratorio de Biotecnología, Grupo de Investigación REMA.
NOTA: Si previamente se realizó la extracción del ADN empezar en el numeral
5.2. O a partir de una caja de cultivo de una cepa de S epidermidis o
microorganismo en estudio, realizar el procedimiento de extracción en crudo de
ADN (Método de ebullición o Boilling)
6.1 Extracción del ADN por el método de Boiling, de acuerdo a protocolo del
laboratorio de Biotecnología, Grupo de Investigación REMA.
1. Se toman 50 µl de agua grado 1(milli Q).
2. Se adicionan de 2 a 3 colonias (UFC) y se calienta en el termociclador a 98º C
durante 10 minutos.
3. Se centrifuga a 14000rpm por 10 minutos y se toma el sobrenadante el cual se
puede utilizar directamente para la PCR o almacenarlo a -2º C hasta su uso
4. De este sobrenadante se toman 2 µl y se adicionan a la mezcla de PCR
(master mix).
6.2 Realizar la mezcla maestra de PCR (master mix), como se describe a
continuación, encontrar el volumen para que la concentración final quede como se
indica, adicionando los Primers específicos y el ADN en estudio.
ELEMENTO
CONCENTRACION
stock
Agua d o
milliQ
Buffer
dNTPs
MgCl2
Primer F
Primer R
DNA
---
--
5X
10mM
25mM
10uM
10uM
10-25 ng/ µl
1x
200um
3mM
0.6 µM
0.6 µM
25ng
Taq
polimerasa
VOLUMEN
FINAL
VOLUMEN
Para 1 Rx
VOLUMEN
Con controles
positivo y
negativo 3 Rx
3 µl si es
boilling
ó 2 µl si
es
purificado
5 U/ µl
----
CONCENTRACION
FINAL
2.5 U
50 µl
--
6.3. Realizar la PCR de acuerdo a las condiciones descritas en la tabla:
Condiciones de la PCR
Realizar 1 ciclo inicial así: 95 grados durante 3 minutos
Gen
aac(6´)aph(2´)
de
Resistencia a
aminoglucosi
dos
Desnaturaliz
ación
Hibridación
Extensión
No.de
Ciclos
Ciclo
final
95º C por 30 55º C por 30
seg.
seg
72º C por
30seg.
34
72 º C
por 7
min.
6.4 Visualizar el resultado en gel de agarosa de acuerdo al tamaño del producto
amplificado en la siguiente clase
Tabla 1. Secuencias de primers para la amplificación de genes específicos de una
bacteria y de un gen de resistencia.
Gen
Secuencia
Producto amplificado
Staphylococcus
epidermidis
5´ATCAAAAAGTTGGCGAAACTTTTCA-3´
(normal)
125pb
5´CAAAAGAGCGTGGAGAAAAGTATCA3´(
reverso)
16SrRNA
5´GGAGGAAGGTGGGGATGACG-3´
241pb
5´ATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3´
aac(6´)aph(2´)
5´TTGGGAAGATGAAGTTTTAGA-3´
174pb
5´CCTTTACTCCAATAATTTGGCT3¨
7. POST-LABORATORIO
1. ¿Qué tipos de ADN polimerasas se pueden emplear para PCR y que utilidad
tienen?
2. ¿Qué condiciones deben tener los Primers utilizados para la PCR?
3. El buffer empleado para PCR ¿qué características tiene?
4. ¿El cloruro de magnesio que utilidad tiene?
5. ¿Cómo se sabe la Tm de un primer?
6. Prepare una aplicación de la PCR para exponer en clase
7. En que consiste el método “boiling” para obtención simple de ADN
8. BIBLIOGRAFIA
-Revista Nature Protocolos Años 2009-2013
-Articulo Bodas de Plata de la PCR Revista Nova UCMC. 2008. Gladys Pinilla
-PCR protocols second edition Jhon M.S. BARLETT DAVID STIRLIN HUMANA
PRESS TOOWA NEW YERSEY. VOL 226 2003
-RAPID CICLE REAL TIME PCR METHODS AND APPLICATION
MICROBIOLOGY AND FOOD ANALISIS. SPRINGER U. REISTHL C.WITTWER
F. TOTKERILL 2002.
-Masa Oliva Jaime. Diagnòstico Molecular en Medicina. Manual moderno. 2004
-Arturo Panduro. Biologia Molecular en la Clinica. McGraw-Hill Interamericana
2000
-Lizcano Fundamentos moleculares en medicina 2005-09-09 Jimenez Genetica.
Biologia celular y molecular 2005
9. AUTOEVALUACION
NUMERO DE
LA PRACTICA
LOGRO
(Objetivos
cumplidos)
SI
NO
FORTALEZAS
DEBILIDADES
SUGERENCIAS
A
CADA
DEBILIDAD