TAMIZACION NEONATAL por Cromatografía de Alta Resolución

HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS
PARA HEMOGLOBINOPATÍAS
CONTENIDO
1. Electroforesis de Hemoglobinas en pH Alcalino
2. Electroforesis de Hemoglobina en pH Ácido
3. Enfoque Isoeléctrico
4. Electroforesis Capilar
5. “Siclkle Solubility Test”
6. Separación de Hemoglobina H
7. Prueba para inestabilidad de Hemoglobina
8. Pruebas para alta y baja afinidad de la Hemoglobina
9. Preparación Cuerpos de Heinz
10. Prueba de Kleihauer
11. Prueba para Hemoglobina M
12. Investigación sospecha de β Talasemia (heterocigótica)
13. Tamizaje Neonatal
14. Análisis de DNA
15. Espectrofotometría de masas
1. ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN UNA
MENBRANA DE ACETATO DE CELULOSA A pH
ALCALINO
MOVILIDAD DE HEMOGLOBINAS NORMALES Y ANORMALES POR
ELECTROFORESIS DE ACETATO DE CELULOSA A pH 8,4 – 8,6
MOVILIDAD
NORMAL
Hb Bart´s, Hb H , varias variantes de
hemoglobina designadas como I, N, J y K
Mas rápido que la Hb A
Movilidad de HbA
Hb A
Movilidad de Hb F
Hb F
Movilidad de Hb S (o
similares)
Movilidad de Hb C (o
similares)
Mas lento que la Hb A₂
VARIANTE
Hb S, variantes de hemoglobina
designadas como D o G (e.g. D-Punjab, GFiladelfia), Hb Hasharon, Hb Lepore, Hb
Korle-Bu
Hb A₂
Hb C, Hb EƗ, Hb E- Saskatoon. Hb OArab, Hb Osu-Christiansborg, Hb CHarlem, αᴳ ᴾʰᶦᶥᵃᵈᵉᶥᴾʰᶦᵃ βᶳ hibrida
Hb A₂ también anidrasa carbónica
Parámetro
% de Hemoglobina total
Valor de referencia
Hemoglobina A1
> 96 %
Hemoglobina A2
1.5 – 3.5 %
< 2.0 %
50 – 80% Recién Nacido
Hemoglobina F
8% 6 meses de edad
Hemoglobina S
Negativo
Negativo
Hemoglobina C
Negativo
Negativo
Hemoglobina D
Negativo
Negativo
Hemoglobina E
Negativo
Negativo
Hemoglobina G
Negativo
Negativo
4 – 5.8 %
Beta-talasemia menor
Menos de 2 %
Enfermedad de Hb H
2–5%
Beta Talasemia menor
10 – 90 %
Beta Talasemia mayor
5 – 15 %
Beta-Delta Talasemia menor
Persistencia Hereditaria de
Hemoglobina Fetal Heterocigota
(PHHF)
PHHF Homocigota
Implicaciones clínicas
Hemoglobina A2
Hemoglobina F
5 – 35 %
100%
15%
Hemoglobina
Homocigota
Hemoglobina
Homocigota
Hemoglobina
Heterocigota
Hemoglobina
Heterocigota
Hemoglobina
Homocigota
Hemoglobina S Homocigota
Anemia de células falciformes
(Drepanocitosis)
S
70 – 98 %
C
90 – 98 %
Enfermedad de Hb C
C
24 – 44 %
Portador Hb C
E
20 – 35 %
Portador Hb E
E
98 – 98 %
Enfermedad de Hb E
(*) Diagnostic Tests Handbook. pp 16-17, 1987 Ed. Springhouse
FLUJOGRAMA QUE MUESTRA ELECTROFORESIS CON LA
MOBILIDAD DE DOS BANDAS DE HEMOGLOBINAS A y S
Bandas con la movilidad de
AyS
Positivo
Reconocer A + S (rasgo de
células falciformes o rasgo de
células β Talasemia, dependiendo
del porcentaje de hemoglobina S
Realizar test de solubilidad
de la Hoz
Negativo
Realizar Electroforesis en gel de agarosa
a pH ácido, evaluar indices de glóbulos
rojos, porcentaje de hemoglobina y
presencia o ausencia de variante A₂;
reconocer A + Lepore, D o G
Hemoglobina D –
Posible Punjab
Realizar test de
finitivo, e.g. Analisis
de DNA
“ Variant Haemoglobins: A Guide to Identification. Barbara J. Bain; Barbara J. Wild; Adrian
D. Stephens; Lorraine Phelan. Wiley-Blackwell. 2012.”
FLUJOGRAMA QUE MUESTR A ELECTROFORESIS CON UNA SOLA
BANDA PRINCIPAL CON LA MOBILIDAD DE HEMOGLOBINA S
Investigar probable
Talasemia DD* o D*β°
Solo una banda principal
con la movilidad de S
Negativo
Realizar test de solubilidad
de la Hoz
Positivo
Hacer un diagnostico de
Talasemia SS o Sβ°
Solo una banda
con movilidad de S
Realizar Electroforesis
en gel de agarosa a pH
ácido.
Dos bandas con
mmovilidad de A y S
Hacer un diagnóstico de
SD* o S-Lepore
(dependiendo del índice
de glóbulos rojos y el %
de hemoglobinas
variantes)
“ Variant Haemoglobins: A Guide to Identification. Barbara J. Bain; Barbara J. Wild; Adrian
D. Stephens; Lorraine Phelan. Wiley-Blackwell. 2012.”
FLUJOGRAMA QUE MUESTRELECTROFORESIS CON LA
MOBILIDAD DE DOS BANDAS DE HEMOGLOBINAS A y C
Bandas con la movilidad de
AyC
Realizar Electroforesis en gel de agarosa
a pH ácido,
Dos bandas con movilidad
de A y C
Reconocer A + C (rasgo C o Cβ+
dependiendo del porcentaje de
C)
Solo una banda
con movilidad de A
Reconozca A + E C
(rasgo E o
Talasemia Eβ+
dependiendo del
porcentaje de E)
“ Variant Haemoglobins: A Guide to Identification. Barbara J. Bain; Barbara J. Wild; Adrian
D. Stephens; Lorraine Phelan. Wiley-Blackwell. 2012.”
FLUJOGRAMA QUE MUESTR A ELECTROFORESIS CON UNA SOLA
BANDA PRINCIPAL CON LA MOBILIDAD DE HEMOGLOBINA C
Solo una banda principal
con la movilidad de C
Realizar Electroforesis
en gel de agarosa a pH
ácido.
Solo una banda con
movilidad de C
Solo una banda
con movilidad de A
Diagnóstico de
Talasemia CC o C β°
Reconocer O-Arab
Banda con movilidad
silmilar a S con o sin otra
banda
Dos bandas con
movilidad de A y C
Diagnóstico de
Talasemia EE o E β°
Reconocer E + C
“ Variant Haemoglobins: A Guide to Identification. Barbara J. Bain; Barbara J. Wild; Adrian
D. Stephens; Lorraine Phelan. Wiley-Blackwell. 2012.”
FLUJOGRAMA QUE MUESTRELECTROFORESIS CON LA
MOBILIDAD DE DOS BANDAS DE HEMOGLOBINAS S y C
Bandas con la movilidad de
AyC
Realizar prueba de solubilidad de la Hoz
Positivo
Realizar Electroforesis en gel de
agarosa a pH acido; reconocer
SC si la banda no-S tuvo la
movilidad de C, SE si la banda
no-S tuvo la movilidad de A o SOArab si la banda no-S tuvo una
movilidad similar a la del S
Negatico
Realizar Electroforesis en gel de
agarosa a pH acido; reconocer
D+C si dos bandas con la
movilidad de A y C, D*E si hay
solo una banda con la movilidad
de A o D*O-Arab si hay dos
bandas con movilidad de A y
similar a la del S
Una cadena β de variante de hemoglobina g podría tener el mismo resultado
“ Variant Haemoglobins: A Guide to Identification. Barbara J. Bain; Barbara J. Wild; Adrian
D. Stephens; Lorraine Phelan. Wiley-Blackwell. 2012.”
2. ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN GEL DE
AGAROSA A pH ACIDO 6,0 Y 6,2
E C
A
F
A/D
Punjab
Movilidad Normal de alguna variantes de
Hemoglobina en gel de agarosa a pH 6,0 – 6,2
MOVILIDAD
NORMAL
Movilidad de F
Hb F
Movilidad de HbA (o
similares)
Hb A , HbA₂
Movilidad de S
Hb S
Movilidad de Hb C
Hb C
VARIANTE
Hb Bart´s
Hb E, Varias Hb designadas D ó G, Hb
Lepore, Hb Osu-Christiansborg, Hb H, Hb
I, J, y N, Hb E-Saskatoon
αᴳ ᴾʰᶦᶥᵃᵈᵉᶥᴾʰᶦᵃ βᶳ hibrida, Hb Hasharon, Hb
O-Arab, Hb C- Harlem
3. ENFOQUE ISOELECTRICO
En lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se
separan en función de su punto isoeléctrico (pI):
F1
A0
F0
D-Punjab
C
4. ELECTROFORESIS CAPILAR
Es una técnica de separación basada en la diferente migración de los iones
presentes en una disolución, en función de su relación carga/masa, al aplicar
un campo eléctrico
(E.J.: Anemia Drepanocitica heterocigótica)
5. “SICKLE SOLUBILITY TEST”
Se introduce un agente lisigénico como la saponina en un tampón de fosfato y
ditionito de sodio. Las células se lisan. Los tetrámeros de Hb S se
desoxigenan. Formación de micro filamentos y micro cables. Se forma un
sistema liquido hemático cristalino.
Prueba positiva: Solución turbia Hb S
Prueba Negativa: Solución nebulosa (Hb A, C, F y D
6. SEPARACION DE HEMOGLOBINA H
7. PRUEBA PARA INESTABILIDAD DE
HEMOGLOBINA
8. PRUEBAS PARA ALTA Y BAJA AFINIDAD DE LA
HEMOGLOBINA
9. PREPARACION CUERPOS DE HEINZ
Los precipitados intraeritrocitarios de Hb desnaturalizada se tiñen con el
cristal violeta y adquieren el aspecto de pequeñas granulaciones que
reciben el nombre de cuerpos de Heinz
11. PRUEBA PARA HEMOGLOBIA M
La Metahemoglobina es la Hemoglobina oxidada, y una variante de
hemoglobina que es propensa es la denominada Hb M. (Hb M-Iwate, Hb
M-Boston).
Esta prueba es indicada cuando hay cianosis con un nivel de oxigeno
normal en la sangre. (sangre macroscópicamente de color marrón).
10% a 25%: ocasiona Cianosis
35% a 40%: ocasiona Dificultad
respiratoria y Dolor de cabeza.
Superior al 60%: ocasiona Letargo y
estupor.
Superior al 70% ocasiona la muerte
12. INVESTIGACION SOSPECHA DE
β TALASEMIA (heterocigótica)
Determinación precisa y exacta del porcentaje de
Hemoglobina A₂
HPLC
INVESTIGACION DE SOSPECHA DE
α TALASEMIA (heterocigótica)
Tamizaje y conteo de sangre.
Investigar para excluir β talasemia heterocigótica y
condiciones relacionadas.
Evaluar el origen étnico
Realizar análisis de DNA para detectar α° Talasemia
heterocigótica
14. ANALISIS DE DNA
Diagnostico de α Talasemias
gap-PCR : determina la naturaleza precisa de la mutación, distingue entre la
mas leve e inofensiva α+ talasemia y α° Talasemia.
Muestras analizadas pueden ser Vellosidades coriónicas, líquido amniótico
y sangre fetal.
La extracción de DNA se realiza simultáneamente con la de los padres;
utilizando dos métodos analíticos.
Hemoglobina S:
El sistema de amplificación mutación refractario (ARMS) (uso de primer
específicos)
Análisis de restricción enzimática PCR (enzimas de restricción que
evidencian presencia o ausencia de la mutación)
15. ESPECTROFOTOMETRÍA DE MASAS
El espectrómetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un
haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los
diferentes átomos haz de iones produce un patrón específico en el detector, que
permite analizar el compuesto
Identificación definitiva de variantes de Hemoglobina y β Talasemias
REUSLTADOS INVESTIGACION
“TAMIZACION NEONATAL por Cromatografía
de Alta Resolución para el Diagnóstico de
Anemia de Células Falciformes y Otras
Hemoglobinopatías en Medellín, Colombia”
Rev. Pediatría – Vol. 43 NO. A – 2011. Fabio Restrepo. Natalia Loaiza y
Colaboradores
“TAMIZACION NEONATAL por Cromatografía de Alta Resolución para el Diagnóstico de
Anemia de Células Falciformes y Otras Hemoglobinopatías en Medellín, Colombia”
METODOLOGIA:
Estudio prospectivo en el periodo comprendido entre Febrero y Agosto
de 2009.
Tamaño de la muestra determinada mediante el Epilfon ( 520):
Prevalencia esperada 7%, Poder estadístico 80%5 e Intervalo de
confianza de 95%.
Sangre seca tomada en el momento del nacimiento en papel de filtro
Schleicher y Schuell No,. 2992.
Método inicial de tamización: HPLC, sistema automático Variant II
Hemoglobina Testing System (Bio-Rad)
Método capaz de separar e identificar las siguientes variantes: Hb F,
HbA1c, Hb A, Hb A₂/E, Hb S, Hb C y Hb D
Uso de controles de calidad interno : C1. Hb F
“TAMIZACION NEONATAL por Cromatografía de Alta Resolución para el Diagnóstico de
Anemia de Células Falciformes y Otras Hemoglobinopatías en Medellín, Colombia”
RESULTADOS:
1) Recolección de 2637 muestras.
2) 10 descartadas de acuerdo a criterios establecidos.
3) De 2627, 133 se clasificaron como positivas por a separación de bandas en la
posición de corrida de cualquiera de las Hb anormales.
4) 40 casos sospechosos no pudieron ser confirmados.
5) 57 casos Hb S
6) 38 casos Hb C
7) 1 caso Hb D
“TAMIZACION NEONATAL por Cromatografía de Alta Resolución para el Diagnóstico de
Anemia de Células Falciformes y Otras Hemoglobinopatías en Medellín, Colombia”
RESULTADOS:
8) 93 casos confirmado por electroforesis de Hb pH alcalino o ácido según el tipo
encontrado de Hb.
9) Concordancia del 100% con la tamización pr cromatografía.
10) Representación de un 3,5% de prevalencia de Hemoglobinopatías. (un caso por
cada 29 neonatos)
11) No se encontraron casos de Hb A₂.
12) No se encontró asociación de Hb SC.
13) Se encontraron 66 muestras con bandas en posición de Hb anormales
cromatografía pero que no superan el 1% al total de Hb anormales.
por
14) Confirman punto de corte para catalogar a presencia o no de Hb anormales presente
al nacimiento es del 1% del total de la Hb.
“TAMIZACION NEONATAL por Cromatografía de Alta Resolución para el Diagnóstico de
Anemia de Células Falciformes y Otras Hemoglobinopatías en Medellín, Colombia”
DISCUSIÓN:
La prevalencia de las hemoglobinopatías supera otras afecciones congénitas
como hipotiroidismo, fenilcetonuria, galactosemia…entre otras.
Hemoglobinopatía mas frecuente Hb S
El método HPLC elegido para la tamización inicial es sencillo, rápido y
reproducible, con una imprecisión entre los análisis y en los análisis para cada
variante estudiada menor del 5%.
HPLC recomendado como de elección en cualquier programa de tamización de
hemoglobinopatías.
“TAMIZACION NEONATAL por Cromatografía de Alta Resolución para el Diagnóstico de
Anemia de Células Falciformes y Otras Hemoglobinopatías en Medellín, Colombia”
CONCLUSIONES:
Una prevalencia de 3,5%, con una tasa de morbimortalidd del 30% para los
afectados, sugiere que estas enfermedades deberían ser tamizadas de manera
universal y sistemática.
Se comprueba que el HPLC es un método rápido, ya que se obtienen resultados
en unos 20 minutos desde la preparación de la muestra hasta el resultado.
Sencillo porque es automatizado y permite montar series desde una a un numero
deseado de muestras en la misma corrida y con costos aceptables en caso de
una posible implementación integrada a la prueba de tamización neonatal para
hipotiroidismo.
EJEMPLOS DE
INTERPRETACION
MUCHAS GRACIAS!!!