universidad central del ecuador facultad de ciencias químicas
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA QUÍMICA DE ALIMENTOS COMPARACIÓN DE LOS MÈTODOS KJELDAHL Y DUMAS PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNA CRUDA EN MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS TERMINADOS EN UNA PLANTA DE ALIMENTOS BALANCEADOS AUTORA: Liliana Alejandra Mera Ramírez e-mail:[email protected] Tesis de Grado para optar por el Título Profesional de: QUÍMICA DE ALIMENTOS TUTOR: Dr. Iván Luis Tapia Calvopiña e-mail:[email protected] Quito, Diciembre del 2015 Mera Ramírez, Liliana Alejandra (2015). Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para análisis de proteína cruda en materias primas y productos terminados en una planta de alimentos balanceados. Trabajo de investigación para optar por el grado de Química de Alimentos. Carrera de Química de Alimentos. Quito: UCE. 142 p. i DEDICATORIA En primer lugar a Dios por darme la vida, la fuerza, el camino, por ser quien soy, todo es gracias a él. A quienes me han regalado el mejor legado “el amor y la educación”, sin ustedes jamás habría llegado a cumplir esta meta, gracias Mami Teresita y papi Miguel, por su apoyo, su amor, mil gracias por todo y por tanto. A ti mi motor, mi fuerza, esa personita que llego a mi vida a iluminarme, quien se ha desvelado conmigo, quien me regala tanta paciencia, no te he podido dar todo el tiempo necesario pero sé que algún día entenderás que cada esfuerzo que hago es por nosotras tu mi pequeña hija Doménica Valentina, lo logramos junta Te amo…… A mis hermanas Sandry, Vivi, Adry gracias por ese ejemplo de amor y perseverancia gracias por sus palabras y el apoyo constante. Mi querida familia sobrinos, cuñados, abuelitos, tíos, que siempre me dieron ánimos para cumplir esta meta tan importante en mi vida. ii AGRADECIMIENTOS A la Universidad Central del Ecuador, a la Facultad de Ciencias Químicas por haberme brindado la oportunidad de formarme en sus aulas, por darme las herramientas necesarias para formarme como profesional y salir adelante. Amis queridos profesores por cada conocimiento impartido, por sus consejos y ejemplo a seguir. Ami director de tesis, Dr.Iván Tapia mil gracias por su apoyo, su guía, paciencia, su tiempo y los conocimientos impartidos durante mi carrera universitaria y la realización de este trabajo de investigación. A los miembros del tribunal: Ing. Milene Díaz y Dr., Wilson Parra gracias infinitas por su gran apoyo, comprensión, conocimientos, su tiempo, y por sus valiosas sugerencias. Un agradecimiento especial a la Dra., Guadalupe Jibaja, por su apoyo en la culminación de esta etapa en mi vida universitaria. Al Área de aseguramiento de calidad, y mi equipo de trabajo Ing. Oscar Andino, Irmita, Marianita, Saskia, Andrea gracias por confiar en mí, por su apoyo y permitirme realizar este trabajo de investigación. Como no agradecer a valiosas personas con las que compartí esta etapa importante de mi vida, con quienes viví momentos inolvidables en las aulas, mil gracias por su amistad y su apoyo incondicional de siempre Eddy Guaño, Cris López, Yoly López, Dary Martínez, los llevo en mi corazón. Gracias Pauly Noboa por tu apoyo y tu tiempo, defininitivamente eres la mejor prima, te quiero. iii iv v vi CONTENIDO CONTENIDO vii CAPITULO I 1 INTRODUCCIÓN 1 1.1 Planteamiento del problema 1 1.2 Formulación del problema o hipótesis de trabajo 1 1.3 Objetivos de la investigación 1 1.3.1 Objetivo general 1 1.3.2 Objetivos específicos 2 1.4 Importancia y justificación de la investigación 2 CAPÍTULO II 3 2. 3 MARCO TEÓRICO 2.1 Antecedentes 3 2.2 Fundamento Teórico 4 2.2.1 Proteínas 4 2.2.2 Composición elemental de las proteínas 5 2.2.3 Clasificación de las proteínas 6 2.2.4 Aminoácidos 6 2.2.5 Proteínas en animales 8 2.2.6 Las proteínas y su metabolismo 8 2.2.7 Digestión y absorción de proteínas 9 2.2.8 Metabolismo proteico en monogástricos 11 2.2.9 Metabolismo proteico en rumiantes 12 2.2.10 Proteínas en heces 13 2.2.11 Metabolismo en el hígado y reciclaje de urea 13 2.2.12 Métodos para determinación de proteinas 14 2.2.13 Determinación de nitrógeno en proteínas 14 2.2.14 Nitrógeno total 14 2.2.15 Alimentos balanceados 22 2.2.16 Materias primas 23 2.2.17 Ingredientes proteicos de origen vegetal 24 2.2.18 Ingredientes proteicos de origen animal: 26 2.2.19 Productos terminados: 26 2.2.20 Muestreo 29 vii 2.2.21 AAFCO (ASOCIACION AMERICANA DE FUNCIONARIOS DE CONTROL DE ALIMENTACION) 30 2.2.22 Pruebas de aseguramiento de la calidad en materias primas 31 2.2.23 Pruebas de aseguramiento de la calidad en producto terminado 31 2.2.24 Análisis Estadístico 31 2.2.25 Evaluación de los datos analíticos 31 2.2.26 Pruebas de significación 32 2.2.27 Poblaciones y muestras 34 2.2.28 Contrastes de Significación 34 2.2.29 Comparación de una media experimental con un valor conocido 34 2.2.30 El contraste F para la comparación de desviaciones estándar 36 2.2.31 Grados de libertad para la prueba “t”:Al comparar promedios de dos grupos: 37 2.2.32 Diseños Experimentales 37 2.2.33 Diseños factoriales con dos factores 37 2.2.34 Diseño Anidado o Jerárquico: 39 2.3 Fundamento Legal 39 2.3.1 FEDNA 39 2.3.2 Ley Orgánica de Sanidad Animal y vegetal e inocuidad alimentaria 41 CAPITULO III 42 3 42 MARCO METODOLOGÍCO 3.1 Tipo de investigación 42 3.2 Población y Muestra 42 3.2.1 Población 42 3.2.2 Muestra 42 3.3 Diseño experimental 45 3.3.1 Diseño metodológico 45 3.3.2 Diseño estadístico 54 CAPÍTULO IV 60 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 60 4.1 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 60 a.1) MATERIAS PRIMAS (MP) 60 CAPITULO V 108 1. 108 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.1 Conclusiones 108 BIBLIOGRAFIA 110 ANEXOS 112 viii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Fórmula general de un aminoácido ..................................................................................... 7 Figura 2.Esquema proteína vegetal a proteína animal ...................................................................... 9 Figura 3.Activación de enzima......................................................................................................... 10 Figura 4. Acción de enzimas activas en el organismo ..................................................................... 10 Figura 5. Aminoácidos en monogástricos ........................................................................................ 11 Figura 6. Amoníaco en rumiantes .................................................................................................... 13 Figura 7. Equipo determinación Nitrógeno por método Kjeldahl (Destilador , Digestor) ............... 16 Figura 8. Equipo determinación Nitrógeno Método DUMAS ......................................................... 18 Figura 9. Equipo determinación Nitrógeno Método DUMAS ......................................................... 18 Figura 10. Proceso de Combustión DUMAS ................................................................................... 20 Figura 11. Procesamiento de un Alimento Balanceado ................................................................... 23 Figura 12. Proceso de elaboración de alimento balanceado ............................................................. 28 Figura 13. Portada revista anual AAFCO ........................................................................................ 30 Figura 14. Exactitud y Precisión ...................................................................................................... 32 Figura 15. Materias primas en sacos y a granel ............................................................................... 44 Figura 16. Muestras molidas ............................................................................................................ 47 Figura 17. Adición de tableta Kjeldahl y digestión .......................................................................... 47 Figura 18. Muestras digestadas ....................................................................................................... 48 Figura 19. Muestras añadidas indicador mixto y ácido bórico........................................................ 48 Figura 20. Destilación de las muestras ............................................................................................. 49 Figura 21. Viraje de color luego de la titulación .............................................................................. 49 Figura 22 Preparación y pesado de muestras ................................................................................... 51 Figura 23. Sellado de muestras ........................................................................................................ 52 Figura 24. Disco porta muestras ....................................................................................................... 52 Figura 25. Trampas de Oxidación y Reducción ............................................................................... 53 Figura 26. Equipo Dumas................................................................................................................. 53 ix LISTA DE TABLAS Tabla 1. Composición elemental de las Proteínas .............................................................................. 5 Tabla 2. Aminoácidos esenciales y no esenciales ............................................................................. 8 Tabla 3 Comparación Kjeldahl vs AOAC ........................................................................................ 17 Tabla 4. Continuación ...................................................................................................................... 18 Tabla 5. Comparación Dumas vs AOAC ......................................................................................... 20 Tabla 6. Muestreo de acuerdo al número de lotes AOAC 988.5 AOAC 988.5 ............................... 29 Tabla 7. ANOVA para el diseño factorial axb ................................................................................. 38 Tabla 8. Norma FEDNA para la formulación de piensos compuestos............................................ 40 Tabla 9. Especificaciones de porcentaje de proteínas en materias primas ...................................... 42 Tabla 10 Especificaciones de porcentaje de proteína en productos terminados............................... 43 Tabla 11. Condiciones de funcionamiento equipo thermocombustion Flash 2000 .......................... 51 Tabla 12. Resultados análisis de comparación entre laboratorios .................................................... 55 Tabla 13 ANOVA Diseño Anidado ................................................................................................. 56 Tabla 14. Esquema resultados para prueba T con un valor conocido .............................................. 57 Tabla 15. Esquema resultados obtenidos Método Kjeldahl y Dumas .............................................. 58 Tabla 16. Esquema Resultados para comparación de métodos ....................................................... 58 Tabla 17. Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para maíz .................................................. 60 Tabla 18.Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para palmiste ....................................... 62 Tabla 19.Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para afrechillo de trigo ........................ 63 Tabla 20. Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para polvillo de cono.......................... 64 Tabla 21. Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para afrecho de cerveza....................... 65 Tabla 22.Comparación para los métodos Kjeldahl y Dumas para pasta de soya ............................. 66 Tabla 23.Comparación Kjeldahl y Dumas para harina de pescado .................................................. 67 Tabla 24.Comparación Laboratorio 3 OSP vs Laboratorio 1 Puembo ............................................ 70 Tabla 25.Resultados obtenidos Método Kjeldahl y Dumas para muestra ........................................ 72 Tabla 26.Resultados obtenidos Método Kjeldahl y Dumas muestra ................................................ 73 Tabla 27. Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para maíz nacional .................................... 74 Tabla 28.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para arrocillo molido ................................ 76 Tabla 29.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para trigo suave ......................................... 77 Tabla 30. Promedio de Materias Primas < 10% de Proteìna ............................................................ 78 Tabla 31. Resultados de Materias primas < 10% de proteína .......................................................... 78 Tabla 32. ANOVA Materias primas < 10% de Proteína .................................................................. 79 Tabla 33.Comparación Kjeldahl y Dumas para afrechillo de trigo .................................................. 81 Tabla 34.Comparación métodos Kjeldahl y Dumas para polvillo de cono ...................................... 82 Tabla 35.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para palmiste.............................................. 84 Tabla 36.Promedio de Materias Primas 10 a 20% de proteína......................................................... 85 Tabla 37.Resultados de Materias primas 10 a 20 % de proteína ..................................................... 85 Tabla 38.ANOVA Materias primas 10 - 20% de Proteína .............................................................. 86 Tabla 39.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para afrecho de cerveza ............................. 89 Tabla 40.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para pasta de Soya ..................................... 90 Tabla 41.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para harina de pescado............................... 90 Tabla 42.Promedio de Materias Primas > 20% de Proteína ............................................................. 92 Tabla 43. Resultados de Materias primas > 20 % de Proteína ........................................................ 92 Tabla 44.ANOVA Materias primas >20% de Proteína ................................................................... 93 Tabla 45.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 1 .......................................... 95 x Tabla 46.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 2 .......................................... 96 Tabla 47.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 3 .......................................... 97 Tabla 48.Promedio de Productos Terminados 10 - 20% de Proteína .............................................. 98 Tabla 49. Resultados de Productos Terminados 10 - 20 % de Proteína ........................................... 98 Tabla 50. ANOVA Productos terminados 10 - 20% de Proteína .................................................... 99 Tabla 51.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 4 ........................................ 101 Tabla 52.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 5 ........................................ 102 Tabla 53.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 6 ........................................ 103 Tabla 54. Promedio de Productos Terminados > 20% de Proteína ................................................ 104 Tabla 55. Resultados de Productos Terminados >20 % de Proteína .............................................. 104 Tabla 56.ANOVA Productos terminados > 20% de Proteína ........................................................ 105 xi LISTA DE ECUACIONES Ecuación 1.Cálculo proteína cruda................................................................................................... 14 Ecuación 2. Cálculo de media de la muestra .................................................................................... 33 Ecuación 3. Media de la población .................................................................................................. 33 Ecuación 4. Desviación estándar de la población (σ): ..................................................................... 33 Ecuación 5.Varianza de la población (σ2) ........................................................................................ 33 Ecuación 6. Calculo t ....................................................................................................................... 35 Ecuación 7. Prueba t para dos muestras emparejadas ...................................................................... 35 Ecuación 8. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales ........................................... 35 Ecuación 9. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales ...................................... 36 Ecuación 10. Prueba F...................................................................................................................... 36 Ecuación 11.. Cálculo de los grados de libertad (gl) ........................................................................ 37 Ecuación 12.Suma de cuadrados totales........................................................................................... 38 Ecuación 13. Grados de libertad ...................................................................................................... 38 Ecuación 14. Ecuación correlación MP>10% proteína .................................................................... 81 Ecuación 15.Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína .............................................................. 88 Ecuación 16. Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína ............................................................. 94 Ecuación 17. Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína ........................................................... 100 Ecuación 18. Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína ........................................................... 106 xii LISTA DE DIAGRAMAS Diagrama de proceso. 1 Proceso de investigación .............................................................. 45 Diagrama de proceso. 2 Diseño Anidado ............................................................................ 56 Diagrama de proceso. 3 Diseño Anidado para Muestra AAFCO 60% y AAFCO 16% ..... 56 xiii LISTA DE GRÁFICAS Grafica 1. Grafica de dispersión de la correlación Dumas Vs Kjeldahl para MP con contenido de proteína < 10% ................................................................................................................................. 80 Grafica 2. Gráfica de Dispersión Dumas vs Kjeldahl MP 10 - 20 % Proteína................................ 87 Grafica 3.Gráfica de Dispersión DUMAS vs Kjeldahl MP > 20 % Proteína.................................. 93 Grafica 4. Gráfica de Dispersión DUMAS vs Kjeldahl PT 10 - 20 % Proteína ............................ 100 Grafica 5. Gráfica de Dispersión DUMAS vs Kjeldahl PT > 20 % Proteína ............................... 106 xiv LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Instrucciones Planes de Muestreo ........................................................................ 29 Anexo 2. Resultados AAFCO ............................................................................................ 30 Anexo 3. Procedimiento Kjeldahl ...................................................................................... 46 Anexo 4. Procedimiento Dumas .......................................................................................... 50 xv LOCALIZACIÓN Y REALIZACIÓN El presente tema COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS KJELDAHL Y DUMAS PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNA CRUDA EN MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS TERMINADOS EN UNA PLANTA DE ALIMENTOS BALANCEADOS, se realizó en las provincias de Pichincha y Guayas, en las plantas de Producción de Alimentos Balanceados ubicadas en las ciudades de Quito y Guayaquil, el muestreo y los análisis se realizaron en las instalaciones y laboratorios de Aseguramiento de la Calidad de las plantas de Producción antes mencionadas. xvi RESUMEN DOCUMENTAL El propósito de esta investigación fue la comparación de dos métodos para determinar proteína cruda en materias primas y productos terminados en una industria ecuatoriana dedicada al procesamiento de alimentos balanceadospara aves, ganado, porcino, cuyes-conejos y equinos, ubicadas en la ciudad de Quito y Durán. El porcentaje de proteína fue analizado mediante el método Kjeldahl (AOAC988.05 modificado) y el método Dumas (AOAC 992.15, AOAC 990.03) que se emplean en el laboratorio de Aseguramiento de calidad de dicha planta. En Enero de 2014 se conoció que los resultados de ese año y los resultados de años anteriores tenían una notable variación en los datos que se obtuvieron por los dos métodos, Por esta razón se busca las causas a las que se atribuyen estas variaciones. Se determinó que los resultados de los métodos a utilizar para este estudio son precisos y exactos mediante pruebas de comparación aplicando diseños estadísticos como son diseño anidado, prueba f (comparación de varianzas) y prueba t (comparación de medias) para asegurar la confiabilidad de los resultados. El estudio experimental se realiza con 9 materias primas clasificadas en tres grupos, menores a 10% de proteína, entre 10-20% de proteína y mayores a 20% de proteína y 6 productos terminados de la misma manera clasificadas en dos grupos, menores a 10% de proteína y mayores a 20% de proteína. Al realizar la determinación de proteína en las materias primas y productos terminados con 10 repeticiones cada una por los dos métodos, se estableció que existen variaciones en los resultados obtenidos y esto se atribuye al tipo de muestra la misma que influye significativamente en la presencia de errores sistemáticos en uno o ambos métodos, al determinar los modelos de correlación para cada rango de porcentaje de proteína se concluye que si existe correlación, sin embargo no se pudo llegar a un modelo de correlación lineal ideal, porque los métodos presentan una variación proporcional entre ellos, y no se ajustan al tipo de muestra. PALABRAS CLAVES: PROTEÍNA CRUDA, PROTEÍNA KJELDAHL, DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO, COMPARACIÓN xvii DUMAS, BALANCEADOS, SUMMARY The purpose of this researchwas compare two methods to determinate crude protein in raw materials and finished products in a Ecuadorian industry dedicated to balanced food processing for poultry, cattle, pigs, guinea pigs, rabbits and horses, located in Quito and Duran cities. The protein percentage was analyzed by the Kjeldahl method (modified AOAC988.05)andthe Dumas method (AOAC 992.15, AOAC 990.03) used in Quality assurance laboratory of the industry. In 2014 the January monthit was known thatthe results of thisyear and the resultsofprevious yearshada significantvariation indata obtainedby the two methods, For this reason arises the doubt that ifbothmethods determinenitrogen, whythis changeoccur? Before starting theexperimentalstudy foundthat the results fromthe methods usedfor this study areaccurate and preciseas itisalldone withan accredited laboratoryto ensurereliability of results. The experimental study begins by analyzing nine raw materials classified in three groups, minor 10% protein, 10-20% protein and greater than 20% protein and six finished products in the same manner classified in two groups, less than 10% protein and greater than 20%protein. In making the determination of protein in raw materials and finished products with 10 repetitions each for the two methods, it was established that there are variations in the results and this is attributed to the same type of sample that significantly influences the errors systematic in one or both methods to determine the correlation models for each protein percentage range is concluded that there is a correlation , but failed to reach an ideal linear correlation model , because the methods have a proportional variation between them and do not fit the sample type. KEYWORDS CRUDE PROTEIN, PROTEIN, KJELDAHL, DUMAS, BALANCED FOOD, NITROGEN DETERMINATION, COMPARISON xviii CAPITULO I INTRODUCCIÓN 1.1 Planteamiento del problema Las plantas de producción de alimentos balanceados en las que se realizó el presente estudio se encuentran ubicadas en las provincias de Pichincha y Guayas; éstas se dedican al procesamiento de alimentos balanceados para aves, ganado, porcinos, cuyes-conejos y equinos. Estos alimentos balanceados son formulados en base a los requerimientos nutricionales de cada especie, en la planta procesadora de alimentos balanceados se analiza tanto materias primas como productos terminados para asegurar que se cumpla con la formulación establecida y las normas de calidad respectivas. En la planta 1(laboratorio 1)1 se emplea para el análisis de proteínas el método de Kjeldahl y en la planta 2 (laboratorio 2)2 el método Dumas, los resultados obtenidos en los análisis presentan una variación al ser comparados. Consecuentemente surgió la necesidad de determinar la precisión y exactitud en ambos métodos y compararlos entre sí para establecer si existe diferencia significativa en los resultados obtenidos, asegurando de esta manera equivalencia en todo el rango de aplicabilidad. 1.2 Formulación del problema o hipótesis de trabajo ¿Existe diferencia significativa en los resultados obtenidos con los métodos Kjeldahl modificado y Dumas, para determinación de proteína cruda en materias primas y productos terminados en una planta de alimentos balanceados? 1.3 Objetivos de la investigación 2.1.1 Objetivo general Comparar los métodos Kjeldahl y Dumas para determinación de proteína cruda en materias primas y en productos terminados en una planta de alimentos balanceados. 1 Planta1(Laboratorio 1), Planta de Producción ubicada en Quito 2 Planta2 (Laboratorio 2), Planta de Producción ubicada en Durán 1 2.1.2 Objetivos específicos Analizar los resultados del porcentaje (%) de proteína en materias primas correspondiente al mes de enero 2014, obtenidos mediante los métodos Dumas y Kjeldahl modificado. Establecer si existe variación en los resultados de los análisis de la base de datos. Determinar la precisión y exactitud en los resultados alcanzados con los métodos utilizados. Determinar el porcentaje de proteína en materias primas de contenido bajo (< 10%), medio (10 a 20%) y alto (> 20%) y en productos terminados de contenido medio (10 a 20%) y alto (> 20%). Establecer ecuaciones de correlación para Kjeldahl y Dumas a diferentes concentraciones de proteína. 1.4 Importancia y justificación de la investigación La determinación de proteína es una de las fases esenciales del análisis proximal en alimentos debido a su importancia fisiológica y su composición. El presente estudio va enfocado a la comparación de los dos métodos más empleados para determinación de proteína, Kjeldahl que es un método por vía húmeda o digestión, y Dumas método de combustión basado en la conversión de los gases de combustión, este estudio permitirá establecer la precisión, y exactitud en los métodos. Estos métodos presentan una serie de ventajas y desventajas en cuanto a tiempo, costos, riesgos y resultados; de acuerdo a estos parámetros se emplean en los laboratorios para sus análisis. En función de los resultados obtenidos, se puede definir si los datos obtenidos son fiables y si la metodología está siendo empleada correctamente. 2 CAPÍTULO II 2. MARCO TEÓRICO 2.2 Antecedentes En el año de 1982 las plantas procesadoras de alimentos balanceados ubicadas en las provincias de Pichincha y Guayas, iniciaron su producción abasteciendo únicamente a granjas propias del grupo con alimento balanceado para aves, luego con alimentos para equinos, cerdos, bovinos, pavos, mascotas, cuyes-conejos; a partir de año 2001 inicia la producción de alimento para ganado; actualmente la producción mensual es de aproximadamente 27.000 ton. en la planta Guayas y 11.000 ton. en la planta de Pichincha. Las materias primas tienen un rol importante en la producción de alimentos balanceados, representan alrededor del 85 % de su costo, lo que hace que el control de calidad sea minucioso y apegado a cada una de las diferentes especificaciones de calidad. Un alimento balanceado contiene un 70% de maíz y pasta de soya, combinados con otras materias primas para de esta manera cumplir con los requerimientos nutricionales de cada especie. Las materias primas inmediatamente de ser recibidas son sometidas a análisis físicos y químicos para determinar el cumplimiento con las especificaciones requeridas, para luego ser aceptadas para la producción, de la misma manera el producto terminado es sometido a análisis de calidad para determinar si cumple con la formulación respectiva. Entre los análisis que aseguran la calidad de materias primas y productos terminados se encuentra la determinación de proteína cruda mediante el método Kjeldahl (AOAC 988.05 - modificado) y mediante el método Dumas (AOAC 992.15, AOAC 990.03) observándose una variación en los resultados de porcentaje de proteína en materias primas y productos terminados, sobre todo en aquellos con porcentaje de proteína superior al 40%. (AOAC, 2000) Se han realizado varias investigaciones sobre comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas; en el año 2007 Lugo realizó un estudio para determinación de la correlación entre el método Kjeldahl tradicional y el método Dumas automatizado para determinación de proteína en granos; se obtuvo una medida de proteína altamente correlacionada al ser analizada por los dos métodos(Lugo, 2007) Luego en el año 2008 Calvo llevó a cabo un estudio para conocer la relación nitrógeno (N), azufre (S) para diagnosticar deficiencias de S en trigo y determinar este índice, se comparó la precisión del método de combustión seca de Dumas para la determinación de N y S total, respecto a los métodos tradicionales de digestión húmeda. La determinación de N y S se realizó en muestras de trigo provenientes de cuatro experimentos obteniendo una correlación significativa entre los resultados alcanzados. 3 La cantidad de nitrógeno recuperada por el método de Dumas no difirió respecto del método de Kjeldahl, sin embargo, la precisión del primero fue superior (menores coeficientes de variación, cv). 2.3 Fundamento Teórico Según Martínez 2006 las proteínas constituyen el principal componente estructural y funcional de las células, presentan importantes funciones dentro del organismo que van desde su papel catalítico (enzimas) hasta su función en la motilidad corporal (actina, miosina), pasando por su papel mecánico (elastina, colágeno), de transporte y almacén (hemoglobina, mioglobina, citocromos), protección (anticuerpos), reguladora (hormonas), energética(1 g de proteína proporciona 4,1 Kcal al organismo), etc. La característica sobresaliente es que contienen nitrógeno, siendo el contenido medio de este elemento de un 16%. Estas macromoléculas están formadas por cadenas de unidades estructurales, llamados aminoácidos. Los aminoácidos se unen por medio de enlaces peptídicos entre los grupos carboxilo y el grupo a-amino (imino), con pérdida de agua. Las secuencias de aminoácidos dan lugar a la formación de proteínas con estructuras primarias, secundarias, terciarias, siendo la proteína de estructura primaria de vital importancia nutricionalmente. Se las clasifican tomando en cuenta: solubilidad, composición, forma, propiedades físicas, función, estructura tridimensional, etc. Las proteínas suponen aproximadamente el 17% de la masa corporal, un 25% es proteína estructural y hemoglobina. (Martìnez, 2006) 2.3.1 Proteínas Burton define las proteínas como entidades quimicas de estructura definida, de quimicamàs compleja que los carbohidratos y lìpidos, de composicion constante y por tanto susceptibles de estudio químico convencional.(Burton, 2001) La gran parte de los procesos biológicos se realizan por acción de la proteinas, su calidad depende de su contenido de aminoácidos esenciales, la misma que esta medida por un índice llamado valor biológico(mayor aprovechamiento fisiológico de una proteína por parte del organismo)(Bassi, 2014) Según estudios de Ureña 2014, la cantidad de aminoácidos esenciales es demasiado limitada, el conjunto del rendimiento de las reacciones de síntesis dependerá del aminoácido que esté presente en menor cantidad (aminoácido limitante). Los aminoácidos limitantes más importantes son la lisina (cereales y patatas) y la metionina (carne y leche).(Ureña, 2014) Con respecto al alimento balanceado, la base lo constituyen dos cereales, la soya y el maíz, que debido a su contenido de aminoácidos esenciales presentan un moderado valor biológico, por consiguiente realizan un aporte importante de aminoácidos esenciales para el buen desarrollo del animal.(Agritec Pecuario, 2014) 4 2.3.2 Composición elemental de las proteínas Al igual que los lípidos y carbohidratos, las proteínas contienen en su composición carbono, hidrógeno y oxígeno, además de un porcentaje constante y considerable de nitrógeno en términos prácticos, la cifra más común usada es 16%.La mayoría de las proteínas contienen también azufre y algunas tienen fósforo y hierro. Son sustancias complejas de naturaleza coloidal y de alto peso molecular. La categoría de composición elemental de las proteínas típicas se describe en la Tabla 1 Tabla 1. Composición elemental de las Proteínas Elemento % Carbono 51.0 – 55.0 Hidrógeno 6.5 – 7.3 Nitrógeno 15.5 – 18.0 Oxígeno 21.5 – 23.5 Azufre 0.5 – 2.0 Fósforo 0.0 – 1.5 Fuente:(Maynard L. , Nutricion Animal, 1993) Ureña 2014, explica que las proteínas constituyen la fracción más importante de la ración alimenticia de la especie animal, son componentes fundamentales en los tejidos animales y requeridas para el mantenimiento de las funciones vitales como renovación de tejidos, reproducción, crecimiento y lactación. En los tejidos vegetales se encuentran en cantidades discretas a excepción de las semillas de leguminosas que tienen una cantidad aproximada del 20%. Los granos de cereal contienen aproximadamente un 10% de proteína. Las especies monogástricos necesitan aminoácidos pre-formados en su dieta con los cuales fabrican sus proteínas corporales, los rumiantes utilizan otras fuentes de nitrógeno ya que tienen la capacidad de sintetizar aminoácidos y de formar proteína a partir de nitrógeno no proteico, poseen un mecanismo para ahorrar nitrógeno. Cuando el contenido de nitrógeno en la dieta es bajo, la urea, un producto final del metabolismo proteico puede ser reciclada al rumen en grandes cantidades, mientras que en los monogástricos, la urea siempre se pierde en la orina. Al considerar estas adaptaciones del metabolismo de nitrógeno, es posible alimentar rumiantes con fuentes de nitrógeno no proteico y obtener una proteína de alta calidad.(Ureña, 2014) 5 2.3.3 Clasificación de las proteínas Las proteínas son muy diversas, por lo que su clasificación se basa en su forma, propiedades físicas, configuración química, su relación con nutrición y metabolismo animal. a) Proteínas Simples Este grupo incluye a las que al hidrolizarse producen aminoácidos o sus derivados. b) Proteínas Conjugadas Aquí se incluyen aquellas proteínas simples que están combinadas con radicales no proteicos (grupo prostético) como por ejemplo las nucleoproteínas (ribosomas; RNA), fosfoproteínas (caseína de la leche; fosfato), metaloproteínas (citocromo oxidasa; hierro y cobre), lipoproteínas (VLDL; fosfolípidos grasa, colesterol), flavoproteínas (deshidrogenasa succínica; FAD), glicoproteínas (γ globulinas; galactosa, manosa, hexosamina). Las proteínas también se pueden distinguir por su conformación estructural: c) Proteínas fibrosas Son cadenas largas de polipéptidos, que se encuentran en los animales en forma de colágeno, elastina y queratina. d) Proteínas globulares Incluyen las enzimas, hormonas proteicas y proteínas portadoras de oxígeno (Maynard L. , Nutricion Animal, 1993) 2.3.4 Aminoácidos Los aminoácidos son moléculas orgánicas pequeñas con un grupo amino (NH2) y un grupo carboxilo (COOH). Las proteínas son polímeros de aminoácidos, los que varían en cuanto a cantidad y tipo entre proteína y proteína. (Maynard L. , Nutricion Animal, 1993). La gran cantidad de proteínas que se conocen están formadas únicamente por 20 aminoácidos diferentes. Se conocen otros 150 que no forman parte de las proteínas. Generalmente, el número de aminoácidos que forman una proteína oscila entre 100 y 300. Los enlaces que participan en la estructura primaria de una proteína son los enlaces peptídicos.(Ureña, 2014) a) Enlace peptídico Es un enlace amida que se forma entre el grupo carboxilo de una aminoácido con el grupo amino de otro y la eliminación de una molécula de agua. Independientemente de la longitud de la cadena 6 polipeptídica, siempre hay un extremo amino terminal y un extremo carboxilo terminal que permanecen intactos. (Raisman, 2007) El orden de los aminoácidos varia para cada proteína, la secuencia, en que van ordenados los aminoácidos, es diferente. Existe un sinnúmero de proteínas diferentes debido al número de secuencias posibles de aminoácidos. Al tener un átomo de carbono asimétrico pueden presentar isomería. Los de la serie L son los que utilizan los animales. Los sintéticos se encuentran en las dos formas mezcladas (series L y D), por lo que adicionados a la ración no son tan eficaces como los naturales. Cada especie animal puede sintetizar sólo algunos de los aminoácidos que necesita para formar proteínas y, por lo tanto, depende de la dieta para incorporar aquellos que no puede sintetizar. Esos aminoácidos se los considera esenciales y no porque sean los únicos necesarios para la vida de la especie, sino porque deben estar incluidos en la dieta. Cada especie, tiene su grupo de aminoácidos esenciales propios. Los organismos heterótrofos pueden sintetizar la mayoría de los aminoácidos esenciales. Todos los aminoácidos tiene la misma fórmula general que se indica en la figura 1: Figura 1. Fórmula general de un aminoácido Fuente:(Plumer, 1981) 2.3.4.1 Clasificación de los aminoácidos Desde el punto de vista fisiológico - alimentario es importante saber si determinados aminoácidos son esenciales o no para el hombre y los animales. Los 22 aminoácidos más comúnmente encontrados en los alimentos son clasificados en dos grupos los aminoácidos esenciales y los no esenciales; Ver tabla 2. 7 Tabla 2. Aminoácidos esenciales y no esenciales AMINOACIDOS ESENCIALES AMINOACIDOS NO ESENCIALES No son elaborados por el organismo y se los debe incorporar a través de la dieta. Son sintetizados por el metabolismo. Treonina Serina Metionina Alanina Leucina Glicina Valina Ácidoglutámico Lisina Ácidoaspártico Arginina Prolina Fenilalanina Cisteína Histidina Cistina Isoleucina Tirosina Triptófano Taurina Fuente:(Plumer, 1981) 2.3.5 Proteínas en animales Macy 2005, explica que las células de los animales están constituidos de tres tipos de compuestos grasa, hidratos de carbono y proteínas, siendo de gran importancia desde un punto de vista fisiológico y químico las proteínas, las especies animales pueden vivir sin grasas e hidratos de carbono por largos periodos en su dieta, pero no sin las proteínas que son de importancia fundamental para la estructura de las células vivientes.(Macy, 2005) 2.3.6 Las proteínas y su metabolismo Las proteínas son el principal constituyente de los órganos y estructuras blandas del cuerpo animal, se requiere de una provisión abundante y continua de ellas en el alimento durante toda la vida para crecimiento y reposición. La transformación de la proteína alimenticia en proteína corporal es una parte muy importante del proceso nutricional. (Maynard L. , Nutricion Animal, 1993) 8 La palabra “proteína” es un término selectivo que abarca un grupo de productos afines pero con diferencias fisiológicas. Las proteínas vegetales difieren unas de otras, de las proteínas animales; cada especie animal tiene sus proteínas específicas, que también varían en los diferentes órganos, fluidos, y otros tejidos. No hay dos proteínas que sean exactamente iguales en cuanto a su comportamiento fisiológico. Desde el punto de vista nutricional, la característica que distingue las diversas proteínas son los aminoácidos que las componen. (Maynard L. , Nutricion Animal, 1993) 2.3.7 Digestión y absorción de proteínas Ureña 2014, en su estudio explica que partir de fuentes inorgánicas, los animales sintetizan limitadamente proteínas, para obtener proteína dietética dependiendo de plantas y de otros animales; La mayoría de los aminoácidos se ingieren en forma de proteínas, y sólo ellos pueden incorporarse a las diferentes rutas metabólicas. Para ello, las proteínas y péptidos ingeridos sufren un proceso de degradación hidrolítica por medio de enzimas proteolíticas (secretadas por el estómago, páncreas e intestino delgado) en el tracto gastrointestinal. Después de la acción de las enzimas los aminoácidos quedan libres y son absorbidos y transportados a la corriente sanguínea hasta llegar al hígado donde se metabolizan y luego se distribuyen.(Ureña, 2014) Las proteínas endógenas al degradarse adquieren unas señales que van a indicar a las enzimas de degradación cuando deben comenzar su proceso. Los aminoácidos libres que provienen de este proceso de digestión de las proteínas son absorbidos por las paredes del intestino y conducidos por medio del sistema porta-hepático. Una vez que llegan al hígado, a través de la corriente sanguínea, son distribuidos por las células para su posterior utilización; enlafigura.2se observa la transformación de la proteína vegetal en proteína animal Figura 2.Esquema proteína vegetal a proteína animal PROTEINAS VEGETALES Aminoacidos Mucosa Sangre ENZIMA Fuente: (Ureña, 2014) 9 Tejidos PROTEINAS ANIMALES Las enzimas que intervienen en la digestión proteica están presentes en los respectivos órganos en forma de precursores inactivos conocidos como zimógenos que pierden parte de su molécula activándose así su acción enzimática por acción del ácido clorhídrico estomacal, por ejemplo el pepsinógeno un péptido de peso molecular aproximado 42000 por la acción del HCl se transforma en pepsina que tiene un peso molecular de 34000 convirtiéndose en un importante precursor de la pepsina Figura 3.Activación de enzima Fuente:(Ureña, 2014) La pepsina a nivel estomacal, actúa en un medio muy ácido (pH 1,8-2), es eficaz en la liberación de triptófano, fenilalanina, tirosina, metionina y leucina. Figura 4. Acción de enzimas activas en el organismo Fuente:(Ureña, 2014) Ya en el intestino delgado a pH alcalino (7-8-9) actúan las enzimas pancreáticas: Tripsina con actividad sobre arginina y lisina, quimiotripsina con acción sobre metionina y aminoácidos 10 aromáticos, elastasa que libera preferentemente aminoácidos alifáticos y las carboxipeptidasas A y B que actúan a nivel de aminoácidos aromáticos y arginina y lisina respectivamente. También en el intestino actúan las aminopeptidasas sobre los aminoácidos que tienen un grupo NH2 libre. La peptidasas al absorber péptidos y liberar aminoácidos en la mucosa intestinal permiten la absorción, además de colaborar activamente en el transporte a través de las membranas de iones sodio y vitamina B6 (piridoxina). Únicamente los aminoácidos libres de la mucosa intestinal pasan a la sangre hasta ser absorbida en el hígado. La cantidad de proteínas contenidas en un alimento estimulan a las proteasas; estos procesos se ven favorecidos por el tratamiento térmico y por la cantidad de proteína que contiene el alimento que estimula a las proteasas. Si bien un tratamiento térmico excesivo reduce el valor de las proteínas de la ración por la reacción de Maillard por la cual los grupos aldehídicos de los azúcares se unen a los grupos amino de los aminoácidos formando complejos inutilizables. También existen inhibidores de las proteasas que están presentes en las proteínas de determinadas semillas crudas como en el caso de la soya, las más importantes inhiben la actividad de la tripsina y quimotripsina. Suele tratarse de proteínas termolábiles por lo que un tratamiento térmico moderado hace que desaparezcan. (Ureña, 2014) 2.3.8 Metabolismo proteico en monogástricos Los procesos de síntesis y degradación de proteína en el organismo animal son simultáneos. En el organismo existe un pool de aminoácidos en constante renovación, se lo representa en la Figura 5 Figura 5. Aminoácidos en monogástricos Fuente:(Ureña, 2014) 11 2.3.9 Metabolismo proteico en rumiantes En los monogástricos son de mucha importancia los aminoácidos, en los rumiantes el amoníaco. La proteínas de los alimento son degradadas por microorganismos que se encuentran en el rumen formando amoniaco y ácidos orgánicos, el amoniaco se origina de las fuentes de nitrógeno no proteico contenidas en los alimentos y de la urea proveniente de la saliva a través de la pared del rumen. Al existir bajos niveles de amoniaco existen escases de nitrógeno para las bacterias, disminuyendo la digestibilidad de los alimentos, y si existe demasiado amoniaco en el rumen produce la pérdida de peso, toxicidad por el amoniaco hasta la muerte del animal. (Ureña, 2014) La disponibilidad de energía generada en la fermentación de carbohidratos indica el nivel de utilización de amoniaco en la síntesis de proteína microbiana En promedio, 20 g de proteína bacteriana es sintetizada a partir de 100 g materia orgánica fermentada en el rumen. La síntesis de proteína bacteriana puede variar de 400 g/día a 1500 g/día según la digestibilidad de la dieta. El porcentaje de proteína en las bacterias varía entre el 38 y 55%. Cuando los animales consumen más alimentos las bacterias contienen más proteína pasando rápidamente del rumen al abomaso. La composición de los aminoácidos en la proteína bacteriana es relativamente constante, respecto de la composición de la proteína en la dieta. Todos los aminoácidos, incluyendo los esenciales, están presentes en la proteína bacteriana en una proporción que se aproxima a las proporciones de aminoácidos requeridos por la glándula mamaria para la síntesis de leche. Así la conversión de proteína de los alimentos a proteína bacteriana es usualmente un proceso beneficioso. La excepción es cuando se alimenta con proteína de alta calidad y el amoniaco producido en el rumen no puede ser utilizado debido a una falta de energía para producir su fermentación(Ureña, 2014) El nivel de utilización de amoniaco para sintetizar proteína microbiana depende principalmente de la disponibilidad de energía generada por la fermentación de carbohidratos. En promedio, 20 g de proteína bacteriana es sintetizada a partir de 100 g materia orgánica fermentada en el rumen. La síntesis de proteína bacteriana puede variar de 400 g/día a 1500 g/día según la digestibilidad de la dieta. El porcentaje de proteína en las bacterias varía entre el 38 y 55%. En general, las bacterias contienen más proteína cuando los animales consumen más alimentos y las bacterias pasan más rápidamente del rumen al abomaso pegadas a las partículas de alimento. Ver Figura 6. 12 Figura 6. Amoníaco en rumiantes Fuente:(Ureña, 2014) La composición de los aminoácidos en la proteína bacteriana es relativamente constante, respecto de la composición de la proteína en la dieta. Todos los aminoácidos, incluyendo los esenciales, están presentes en la proteína bacteriana en una proporción que se aproxima a las proporciones de aminoácidos requeridos por la glándula mamaria para la síntesis de leche. Así la conversión de proteína de los alimentos a proteína bacteriana es usualmente un proceso beneficioso. La excepción es cuando se alimenta con proteína de alta calidad y el amoniaco producido en el rumen no puede ser utilizado debido a una falta de energía para producir su fermentación.(Ureña, 2014) 2.3.10 Proteínas en heces Una importante fuente de nitrógeno en las heces son las enzimas digestivas que son secretadas en el intestino, por cada incremento de1 Kg. de materia seca ingerida, hay un aumento de 33g de proteína corporal eliminado en las heces. (Ureña, 2014) 2.3.11 Metabolismo en el hígado y reciclaje de urea El amoniaco se produce por el rumen y este es convertido a proteína microbiana este proceso se da cuando hay falta de energía para la fermentación o hay un exceso de proteína en la dieta, elevados niveles de amoniaco son convertidos en urea que se libera en la sangre siguiendo dos vías la primera es volver al rumen por la saliva a través de la pared del rumen sirviendo como fuente de nitrógeno para el crecimiento bacteriano y la segunda excreción en la orina por los riñones en donde se pierde, 13 sin embargo al incrementar el contenido de proteína se recicla menos urea y se excreta más cantidad por la orina(Ureña, 2014) 2.3.12 Métodos para determinación de proteinas Según la FAO, desde la introducción del sistema proximal de análisis, los valores de las «proteínas brutas» se han calculado multiplicando el nitrógeno total (N) por un determinado factor. Este factor era al principio 6,25, tomando como base la hipótesis de que las proteínas contenían un 16% de N2.(FAO.org, 2015). Entre los métodos mas para deterrminación de proteina estan el Método Kjeldahl, Mètodo Dumas. Metodo NIR, metodo Hach, siendo Kjeldahl el mètodo tradicional màs empleado. 2.3.13 Determinación de nitrógeno en proteínas El elemento químico nitrógeno permite diferenciar proteínas de diversos compuestos como son grasas y carbohidratos. Las fuentes de nitrógeno no son únicamente las proteínas del sistema biológico, de estas pueden derivarse también péptidos, aminoácidos libres y compuestos nitrogenados de naturaleza no proteica, determinando así nitrógeno total y así calcular el porcentaje de proteína calificándolo como “cruda” He aquí la importancia de la determinación de nitrógeno en cuantificación de la fracción de proteínas sin interferencias como los lípidos y carbohidratos.(FAO.org, 2015) 2.3.14 Nitrógeno total El sistema proximal, en el que se determinan las «proteínas» como el nitrógeno total multiplicado por un factor específico, es el predominante en los estudios sobre la composición de alimentos; la mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrógeno. 100 g proteína ------------------------ = factor = 6.25 16g de nitrógeno % proteína cruda = % N x factor Ecuación 1.Cálculo proteína cruda El nitrógeno total se mide utilizando el método Kjeldahl (1883), el cual mide el nitrógeno orgánico total; El método de Dumas mide el nitrógeno total como gas nitrógeno 14 a) Método Kjeldahl En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica la muestra se disuelve en ácido sulfúrico concentrado y se calienta con la finalidad de que la materia carbonosa se libere en forma de CO2, los minerales se sulfaten y el nitrógeno se transforme en sulfato de amonio. Como catalizador se utiliza CuSO4, puede usarse sales de Hg, Zr, Se, pero éstos dos últimos tienen costos elevados y el Hg es tóxico. El K2SO4 sirve como elevador de la temperatura de ebullición (no es catalizador), por cada 10° C de elevación de la temperatura, la velocidad de la reacción se duplica. (Ver equipo Figura 7) El ataque finaliza cuando la solución se torna de un color verde-esmeralda, en este proceso de digestión o ataque de la muestra, se libera en la digestión la grasa, fibra, carbohidratos presentes en la muestra en forma de CO2; la parte oxigenada de la proteína también se libera, sólo queda la parte nitrogenada de la proteína. (Ver equipo Figura 7); Al final del ataque, se tiene en la solución H2SO4 sobrante, sales sulfatadas de los minerales disueltos, y el sulfato de amonio.(Gerardo, 2001) El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos. El método Kjeldahl ha tenido varias modificaciones. Originalmente se utilizó permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utilizando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso añadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción. En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta - hidratado CuSO4.5H2O como catalizador.(Santiago, 2014) Etapas: a.1) Digestión (1) n - C -NH2 + mH2SO4 Proteína calor catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 b.2) Neutralización y Destilación 15 (2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) NH4 + H2BO3- (ión borato) b.3) Titulación El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl estandarizado: (4) H2BO3- + H+ H3BO3 Para el cálculo de la proteína total o “proteína bruta” de un alimento, se determina en principio el contenido de nitrógeno tras eliminar la materia orgánica con ácido sulfúrico, calculándose finalmente el contenido de proteína con ayuda de un factor (en general 6,25). (Ureña, 2014) Figura 7. Equipo determinación Nitrógeno por método Kjeldahl (Destilador , Digestor) (Gerdhart, 2015) 16 Comparación entre la metodología NA-AC15-M12 determinación de proteína cruda Kjeldahl y AOAC 988.5 (Proteine crude in animal feed) Tabla 3 Comparación Kjeldahl vs AOAC MATERIALES Y EQUIPOS AOAC. 988.5 Equipo de digestión Kjeldhal Destilador No especifica detalladamente NA-AC15-M02 (Metodología empleada) Tubos de Digestión de 350 ml Erlenmeyer de 250 ml Bureta digital de 50 ml Probetas Graduadas de 25 Balanza Analítica con precisión 0,1mg Digestor Gerhardt Destilador Kjeldhal ROCEDIMIENTO Peso de 0,25 -1 g. No especifica detalladamente. Peso de 0,5 g. con precisión de 0,1 mg. Muestra finamente molida y homogenizada. Colocar la tableta de digestión Kjeldhal y 20 ml de Preparación de catalizador y 20 ml de H2SO4. H2SO4 en cada Tubo. Colocar el tubo de digestión con la muestra en el digestor, prender el extractor de gases y calentar la Tiempo de digestión 1 Hora muestra hasta ebullición del ácido (regular la temperatura de calentamiento aproximadamente a 400°C para mantener una ebullición fuerte y constante) Mantener el calentamiento hasta 15 min. después de que No define ajuste de Temperatura. el digestado esté completamente claro (aproximadamente 1:45 min. tiempo total de digestión). Enfriar, cuidadosamente añadir alrededor de 250 ml de agua destilada libre de Enfriar, cuidadosamente añadir alrededor de 100 ml de nitrógeno. agua destilada libre de nitrógeno. Añadir suficiente cantidad de hidróxido Se añade 25 ml de NaOH en STEP 1 No utiliza H3BO3 sino HCl. Añadir 50 ml de H3BO3en erlenmeyer de 250 ml. Añadir 3 a 4 gotas de solución de Añadir 2 gotas de Solución de indicador Mixto en el indicador Mixto en el erlenmeyer con la erlenmeyer con la solución de H3BO3. solución de HCl. Acoplar el tubo digestado en el equipo para destilar cuya Operar el Equipo adaptándolo y programación es: STEP 1: 8s; STEP 2: 3s; STEP 3: 100% destilando aproximadamente por 7,5 min. al igual que el erlenmeyer que contiene la solución de H3BO3e indicador mixto Obtener un vol. ≥150 ml de destilado Destilar hasta obtener 100 ml de condensado. Retirar el erlenmeyer y lavar con agua destilada la punta No detalla del tubo recolector dentro el recipiente. Titular con NaOH a 0,1 M y no menciona Titular con HCl 0.1 N hasta cambio de color de verde a los cambios de color violeta. 17 Calcular el porcentaje de proteína. No detalla. Calcular el porcentaje de proteína. Al finalizar cada jornada lavar el equipo corriendo 2 programa completo en el destilado. REACTIVOS Tabla 4. Continuación H2SO4 sin detalle de concentración H2SO4(c) 96-98% libre de Nitrógeno Mezcla catalizadora.16,7 g. de K2SO4, 0,01 gramos de CuSO4, 0,6 g. de TiO2, 0,3 g. de piedra pómez. Tabletas Kjeldhal Solución de NaOH al 45 %. Solución de Rojo de Metilo Solución de HCl0,5M Solución de NaOH al 30 %. Solución indicador mixto Solución acuosa de H3BO3al 2.5 %. Solución de NaOH0,1M HCl 0.1 N valorado Fuente:(AOAC, 2000)(Kjeldahl, 2014) NOTA: El método NA-AC15-M12, hace referencia al Método Kjeldhal mencionado por el autor Ayres, Análisis químico cuantitativo que indica: “la modificación del ácido bórico, método Kjeldhal presenta la ventaja sobre el método clásico de que solo se necesita una disolución patrón de ácido. El amoníaco es absorbido en una disolución de ácido bórico al 4 % en exceso, cuya concentración no es crítica, pues lo que se valora es el ion borato formado en la reacción.” b) Método Dumas Figura 8. Equipo determinación Nitrógeno Método DUMAS Figura 9. Equipo determinación Nitrógeno Método DUMAS Fuente: (Scientific, 2015) 18 Método de combustión desarrollado a principios del siglo XIX por Jean Baptiste Dumas. El método consiste en la combustión de una muestra de masa conocida en una cámara de alta temperatura en presencia de oxígeno. Esto conduce a la liberación de dióxido de carbono, agua y nitrógeno. Los gases se pasan sobre columnas especiales que absorben el dióxido de carbono y agua. Una columna que contiene un detector de conductividad térmica a la final se utiliza entonces para separar el nitrógeno a partir de cualquier dióxido de carbono residual y el agua y el contenido de nitrógeno restante se mide. a) Principio de análisis La muestra de masa conocida se ingresa en una cámara a altas temperaturas con presencia de oxígeno y de un catalizador, la muestra sea ésta solida o líquida se combustiona para formar óxidos, esto conduce a la liberación de dióxido de carbono CO2, agua y nitrógeno. Los óxidos de nitrógeno (NOx) resultantes se reducen a nitrógeno elemental con la ayuda de cobre, mientras que los subproductos (H2O y CO2) se separan completamente. El nitrógeno restante se analiza con un detector de conductividad térmica a.1) Combustión 𝐶𝑛 𝐻𝑚 𝑁𝑥 + 𝑎𝑂2 990 oCnCO2 + 0.5 m H2O+ x N-Oxide 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜𝑟𝑒𝑠 b.2) Reducción N-Oxide 650oC N2 Cobre El instrumento debe ser calibrado analizando un material que es puro y tiene una concentración de nitrógeno conocido, el detector de conductividad emite una señal térmica para la muestra desconocida, se puede convertir en un contenido de nitrógeno. El nitrógeno puede ser medido con manómetro después de absorber el dióxido de carbono en una solución alcalina o por conductividad térmica en métodos automatizados.(Dumatherm, 2009). 19 Figura 10. Proceso de Combustión DUMAS Fuente:(Dumatherm, 2009) Comparación entre la metodologíaNA-AC15-M determinación de proteína cruda Dumas y AOAC 990.03 -992.15 (Proteíne crude in animal feed) Tabla 5. Comparación Dumas vs AOAC MATERIALES Y EQUIPOS AOAC. 990.03 -992.15 NA-AC15-M (Metodología empleada) Analizador de nitrógeno y accesorios ( Thermocombustion flash 2000) Instrumento de combustión Lana de vidrio Balanza analítica con precisión de 0.01 mg PROCEDIMIENTO Capsulas de estaño de 30mm Calibrar el equipo usando como estándar el ácido aspártico. Antes de cada muestra colocar el siguiente orden de las Permitir que el horno y el instrumento muestras alcance la temperatura de funcionamiento y 50 mg Acido aspártico (bypass) se estabilice. un blanco (Cápsula de aluminio sin muestra) El tiempo de calentamiento puede ser de 6 h 3 Estándares de ácido aspártico ( 50 mg c/u) desde el arranque en frío. Se calibra con estándar primario EDTA como patrón de continuación 20 Correr una muestra de ácido aspártico como acido de verificación, constatar que la curva de calibración es exacta Pesar con precisión 50-150 mg EDTA a 0,1 y está dentro de los rangos que indica el certificado del estándar o visualizando gráficamente la curva en el software. mg. Pesar con precisión 50-150 mg de muestra en la copa de papel aluminio. Colocar en el puerto de carga del instrumento y comenzar el análisis. Pesar 150-200 mg de muestra finamente molida y homogenizada en malla tamiz de 0.1 mm (Se debe manejar cuidadosamente las muestras con pinzas durante el sellado de las muestras). Colocar las muestras en el disco portador de muestra (cabezal de carga). Operar el equipo según las indicaciones del fabricante. Cuando el análisis se ha completado (3-5 min) leer los resultados de nitrógeno directamente del instrumento Temperatura mínima de funcionamiento 850 0C. Calentar por un tiempo mínimo de 2 horas el equipo a 950 °C para incinerar la muestra para ayudar a la combustión es necesaria la presencia de oxígeno, la muestra sufre un proceso de óxido reducción en donde el nitrógeno de la muestra en forma de NO2 se reduce a Nitrógeno molecular (N 2) la ayuda de filtros retiene la presencia de CO2 y H2O presentes. El N2 es arrastrado por gas helio hacia una celda de conductividad Térmica (TC) en donde se mide la concentración de N2 presente en la muestra No especifica detalladamente gas Comprimido oxígeno pureza 5.0 % Gas comprimido oxígeno pureza 99.99% REACTIVOS Gas comprimido helio pureza 99.99 % Gas Comprimido helio pureza grado 5.0 Óxido de cobre de alta pureza CO2 comprimido pureza 99.99% Gas inerte comprimido; Nitrógeno Óxido catalizador equivalente a aceite y agua libre Estándar nitrógeno EDTA, 9,59% Estándar nitrógeno-ácido aspártico 10.52% Nitrógeno lana de cuarzo Nitrógeno de alta pureza Tamices moleculares absorbentes Lana de vidrio Pellet óxido de alúmina Perclorato de magnesio anhidro (MgCl 4) Óxido de Cobre Cápsulas de combustión de estaño Vanadato de plata Hidróxido de sodio con portador de silicato Palos de cobre Láminas de combustión de aluminio virutas de metal de cobre Fuente:(AOAC, 2000) , (DUMAS, 2014) 21 2.3.15 Alimentos balanceados (Martìnez, 2006) los considera como parte de la estructura productiva de una cadena agroindustrial, los alimentos balanceados son productos intermedios que sirven de puente entre varios sectores agrícolas: semillas oleaginosas, cereales, cárnicos. Es por esto que en los países con alto nivel de desarrollo hay una fuerte integración entre la producción de cereales forrajeros y la producción de alimentos balanceados para animales.(Martinez Agustin, 2006) “Los alimentos balanceados son alimentos elaborados para animales, enfocados hacia el cumplimiento de los requerimientos nutricionales en animales domésticos monogástricos (aves y cerdos), rumiantes (bovinos, ovinos y caprinos) y los herbívoros no rumiantes (equinos) varían de acuerdo a la edad y a la fase productiva de cada especie, de ahí la importancia de tener un producto diferente para cada tipo de animal y etapa de desarrollo.”; La materia prima utilizada en la fórmula de la dieta alimenticia es transformada en alimento, lo que a su vez contribuye a uno de los factores más importantes para la producción de animales aproximadamente el 70% de los costos de producción corresponden a alimentación. Históricamente el producto de mayor importancia ha sido el destinado al sector agrícola seguidos de alimento balanceado para cerdos, vacas, tilapia, trucha, salmón.(Martinez Agustin, 2006) a) Proceso productivo de un alimento balanceado Se inicia con la selección de ingredientes, garantizando así que el producto final cumpla con los requerimientos nutricionales, razón por la que las empresas implementan programas de compra de materias primas con estándares y parámetros de calidad medibles asegurando así uniformidad de ingredientes, cumplimiento en la formulación final, control del proceso productivo por lo tanto se asegura la “calidad”. Dos componentes de suma importancia en la elaboración de alimento balanceado son: la macromezcla y la micromezcla. La primera está formada por productos de la agricultura y la agroindustria, los cuales se encuentran clasificados en fuentes de energía (cereales forrajeros) y de proteína (oleaginosas). A la mezcla básica obtenida se le adiciona la micromezcla constituida por medicinas, vitaminas, minerales y colorantes. Después de mezclar y conseguir un producto lo suficientemente homogéneo y uniforme se realizan pruebas de calidad y se envía a los tanques de empaque para posteriormente empacarlo en sacos de polipropileno o papel kraft y cerrar con costura de hilo.(Martinez Agustin, 2006) 22 Según datos obtenidos por Ecuador Exporta, existen en el país 107 plantas de producción de balanceados, de las cuales 15 tienen tecnología adecuada y 4 de éstas con tecnología de punta. Dentro de los principales proveedores se encuentran: Pronaca, AFABA, Unicol, Grupo Anhazel y Champion. De éstos, AFABA y Pronaca cubren el 85% de la producción nacional.(Ecuador Exporta, 2013). Figura 11. Procesamiento de un Alimento Balanceado Fuente: Rocha, F (2014). Diagrama ingenieril del procesamiento de alimento balanceado 2.3.16 Materias primas El análisis de la materia prima es indispensable para el estudio de la rentabilidad del producto en estudio, ya que ésta representa del 85 al 90 % del costo del balanceado. Las proteínas forman parte de la composición química de casi todas las materias primas, aunque en la mayoría de ellas se 23 encuentran en proporciones reducidas. De acuerdo con la fuente alimentaria de procedencia, se consideran dos grandes grupos de proteínas convencionales: 2.3.17 Ingredientes proteicos de origen vegetal Existe una amplia gama de alimentos de origen vegetal que contienen proteínas, las proteínas vegetales presentan notables ventajas frente a las de origen animal, sin embargo estas proteínas presentan un valor más bajo que las de origen animal. Entre los ingredientes de origen vegetal están: Harinas de soya Harinas de trigo Harinas de algodón Harinas de otras oleaginosas, etc. Las proteínas vegetales contribuyen en gran medida al total de la proteína de la ración. Las proteínas vegetales se caracterizan por: Su alta solubilidad en el agua Deficiencia de algunos aminoácidos (metionina y cisteína). En este caso las deficiencias de un ingrediente se pueden complementar con otras fuentes proteicas de origen vegetal o animal con diferente perfil de aminoácidos. El bajo costo de la proteína- relación volumen de proteína por unidad de costo. Buena fuente de proteína y energía cuando se utiliza en su estado natural como el caso de la soya en grano. (Iciar Astiasarán, 2014) a) Ingredientes farináceos: Las harinas de cereales pueden conformar un 15 - 70% del total de la fórmula. Los productos de este tipo más utilizados en la fabricación de alimentos balanceados están: trigo entero, subproductos de maíz, subproductos de la industria molinera de trigo (harinillas de trigo bajas en gluten), afrechillo de trigo, germen de trigo, harina de arroz, sorgo, etc. Las materias primas que constituyen el 80% del producto balanceado en el Ecuador son: Maíz El Maíz es el principal insumo para la elaboración de alimentos balanceados en el país, ya que todas las formulaciones para el sector avícola el 80% del total de la producción nacional de alimentos balanceados, contienen como un mínimo el 60% de este producto. Además se utiliza en 24 formulaciones de alimentos de otras especies animales. El requerimiento anual de este producto en el Ecuador asciende a 900 mil TM y se calcula una demanda mensual de 70.000 TM. (Ecuador Exporta, 2013) El maíz ecuatoriano es de muy buena calidad, ya que el clima y el suelo son adecuados para su producción; su limitación está dada por el tiempo de producción, ya que en la temporada invernal de la costa ecuatoriana, se debe importar de mercados como el argentino y el americano. En la actualidad este producto tiene gran demanda, especialmente en el mercado americano por las políticas norteamericanas de nuevas alternativas energéticas con lo que está siendo destinado a la producción de etanol. Pasta de soya La pasta de soya es otro de los insumos de mayor demanda para la fabricación de alimento balanceado, ya que en la formulación de toda dieta para el sector avícola se incluye un mínimo del 15% hasta un máximo del 20%. Además de ser un insumo utilizado para la formulación de alimentos balanceados para otras especies de animales, la demanda de pasta de soya en el Ecuador es de aproximadamente 300.000 TM al año, alrededor del 80 % de la demanda nacional es abastecida por las importaciones. (Ecuador Exporta, 2013) Pero existen otras materias primas tambien empleadas en la produccion de alimentos balanceados Afrechillo de trigo nacional Es un subproducto obtenido en la fabricación de harina de trigo, contiene partículas finas provenientes del tegumento del grano, pedazos pequeños de trigo entero, germen de trigo, escasa porción de harina y residuos varios del proceso de molienda. Polvillo de cono de arroz Es un subproducto obtenido al pulir el grano de arroz, el cual ha sido previamente descascarillado. Está compuesto esencialmente por el pericarpio o salvado y el germen de arroz (no extraído); con la cantidad de cascarilla, granillo de arroz que son inevitables en el proceso de pulido del arroz comestible. Arrocillo molido Son los granos partidos de arroz, conocidos en el mercado como “arrocillo” permiten la obtención de la harina de arroz. Esta harina de arroz ha sido estudiada en muchos países como insumo sustituto de la harina de trigo en la elaboración de pan. 25 2.3.18 Ingredientes proteicos de origen animal: Son alimentos proteicos con un alto valor biológico, este tipo de ingredientes solo contribuyen a la calidad de la proteína (perfil de aminoácidos) y no a las propiedades funcionales del producto que está sometiendo al proceso. Esto se debe a que las proteínas de origen animal no se expanden o se combinan con otros ingredientes en la mezcla de la misma manera que las proteínas de origen vegetal. Algunos ingredientes de origen animal son: Harinas de pescado Harinas de hueso Harinas de carne (Iciar Astiasarán, 2014) Harina de pescado Es el producto que se obtiene por reducción del contenido de humedad y grasa del pescado entero no destinado para consumo humano, o de los residuos de su procesamiento o mezcla de los anteriores, mediante cocido, prensado, secado, molido y homogenizado, dependiendo del tipo de secado: al vapor o “spray dry”. Posee una elevada digestibilidad y un alto valor biológico; es rica en metionina, triptófano y vitamina B12 principalmente, por lo que su uso es amplio en raciones alimenticias de especies acuícolas. Harina de carne, harina de carne y hueso Son productos obtenidos por calentamiento, desecación y molienda de animales terrestres de sangre caliente enteros o de parte de estos, de los que la grasa podrá haber sido parcialmente extraída por medios físicos. Debido a sus ingredientes este producto presenta una alta variabilidad en cuanto a su composición nutricional.(Sala, 1992) 2.3.19 Productos terminados: Son productos que se originan como resultado de la transformación de materias primas en un proceso productivo. a) Alimentos balanceados para aves Una de las fases importante dentro del proceso de desarrollo delas aves es la alimentación, ya que constituye mínimo el 70 % del costo de producción y siendo un factor de importancia a considerar. Existen cuatro tipos de balanceado, el denominado pre inicial, inicial, final y comercial, que varían 26 principalmente en su cantidad de proteínas y presentación de pellets; Conforme avanza la edad del pollo, va disminuyendo la necesidad de proteínas y aumenta la energía, siempre guardando una relación adecuada de densidad del alimento.(Avipunta, 2015) b) Alimentos balanceados para cerdos En la alimentación de los cerdos existe una gran variedad de ingredientes que pueden utilizarse en la formulación de una dieta. EI nivel de uso de estos ingredientes en la ración, estará determinado por la composición nutricional del producto, de las restricciones nutricionales que tenga para las diferentes etapas productivas y del requerimiento de nutrimentos a satisfacer. Los ingredientes para la elaboración de alimentos balanceados se dividen en cuatro categorías que son: fuentes de energía, de proteína, de vitaminas y de minerales y los aditivos no nutricionales(Campabadal, 2009) c) Alimentos balanceados para mascotas: Son alimentos que cuentan con el balance correcto de nutrientes acorde a edad, actividad, raza y talla. La nutrición es parte esencial de todo perro y gato ya que gracias a una buena alimentación puede desarrollarse plenamente, lo cual se refleja en su salud, pelo, piel, huesos y músculos. Estos alimentos balanceados suelen cumplir con todos los requisitos indicados por normas establecidas de salud animal. Actualmente existen en el mercado diversas marcas y opciones para todos los gustos caninos y presupuestos de sus dueños.(Case, 2001) 27 Figura 12. Proceso de elaboración de alimento balanceado Recepción de MP Almacenamiento Formulación Dosificación Macro ingredientes Dosificación Micro ingredientes Mezclado Análisis del Producto Terminado Despacho de Producto Terminado 28 2.3.20 Muestreo El muestreo de materias primas, productos en proceso y productos terminados, material de empaque e identificación, productos para fumigación tanto envasados como a granel, se realiza tomando las unidades muéstrales al azar, (ver tabla 5) a) Material de muestreo Para materia prima sólida y producto terminado envasado se usa una pluma de muestreo. Para muestreo de líquidos se usa el muestreador de líquidos (PNA, 2013) b) Materias primas solidas a granel Todo vehículo que ingresa con materias primas a granel tales como: maíz, soya en grano, sorgo, afrecho de cerveza, pasta de soya y otros será muestreado de acuerdo al plan detallado en la tabla5. (Ver Anexo 1. Instrucciones Planes de Muestreo) Tabla 6. Muestreo de acuerdo al número de lotes AOAC 988.5AOAC 988.5 Tamaño de lote # de unidades Peso por Peso total de Nivel de (toneladas) muéstrales unidad muestra (kg) Inspección muestral (g) Menor a 9 6 480 Apróx. 2,8 1 a 22 8 480 Apróx. 3,8 II Normal 23 a 35 12 480 Apróx. 5,7 II Normal Fuente:NORMA INEN, 1994 Para el caso de Productos terminados se sigue el procedimiento establecido en la instrucción Planes de muestreo, literal 5.10 (Ver Anexo 1 Planes de Muestreo literal 5.10). 29 2.3.21 AAFCO (ASOCIACION AMERICANA DE FUNCIONARIOS DE CONTROL DE ALIMENTACION) Figura 13. Portada revista anual AAFCO Fuente: (AAFCO, 2015) AAFCO es una asociación voluntaria de agencias locales, estatales y federales encargadas por la ley para regular la venta y distribución de alimentos para el ganado y medicamentos para animales. a) Finalidad y Función de AAFCO Aunque AAFCO no tiene autoridad reguladora, la Asociación ofrece un foro para la representación de miembros de la industria para lograr tres objetivos principales: Protección de la salud de los animales y los seres humanos Garantizar la protección de los consumidores Proporcionar la igualdad de condiciones de comercio ordenado para la industria de la alimentación animal. Estos objetivos se logran a través del desarrollo e implementación de leyes uniformes y equitativos, reglamentos, normas, definiciones y políticas de aplicación para regular la fabricación, etiquetado, distribución y venta de alimentos para animales - resultando en alimentos seguros, eficaces y útiles mediante la promoción de la uniformidad entre los organismos miembros. El AAFCO evalua mensualmente a cada uno de sus miembros, enviando muestras que seràn evaluadas, se envian resultados de analisis los cuales son evaluados y comparados entre todos los laboratorios que son miembros de AAFCO, cada miembro recibe los resultados de la comparacion y asi son evaluados para verificar si los metodos empleados para sus analisis estan arrojando datos fiables. (VerAnexo 2. Resultados AAFCO) 30 El AAFCO publica los resultados en su pàgina oficial, para que sus miembros puedan acceder a ellos. (AAFCO, 2015) 2.3.22 Pruebas de aseguramiento de la calidad en materias primas Estas pruebas consisten en evaluar tanto el aspecto físico como la composición química de los ingredientes que se reciben; La evaluación física comprende determinación de la densidad, temperatura, tamaño, textura y humedad del producto para la realización de estas pruebas no se requiere de equipo muy sofisticado y son relativamente baratas. La determinación de la composición química incluye la humedad, cantidad de proteína cruda, extracto etéreo, fibra cruda, cenizas (análisis químico proximal), para realizar estos estudios se requiere de equipos especializados, personal capacitado, y estas determinaciones requieren por lo general de un periodo de tiempo largo. 2.3.23 Pruebas de aseguramiento de la calidad en producto terminado Una vez que el alimento ha sido elaborado es necesario asegurarse que la calidad de este es la esperada, para ello es necesario realizar una inspección física para determinar si el producto final tiene el tamaño, forma, consistencia, textura y humedad deseada. Es recomendable realizar un análisis químico (proximal) para verificar si la cantidad de nutrientes del producto final es el adecuado de acuerdo a la formulación previa. Los análisis microbiológicos y toxicológicos ayudan a identificar algún área dentro de la cadena de producción en donde el alimento puede sufrir una contaminación. 2.3.24 Análisis Estadístico Es el análisis que emplea técnicas estadísticas para interpretar datos, ya sea para ayudar en la toma de decisiones o para explicar los condicionantes que determinan la ocurrencia de algún fenómeno. 2.3.25 Evaluación de los datos analíticos Existen dos términos que se utilizan en las discusiones sobre la fiabilidad de los datos: a) Precisión y exactitud (Skoog, 2001), describe la “precisión” como la reproducibilidad de los resultados, es decir la concordancia entre los valores numéricos de dos o más medidas replicadas o medidas que se han realizado exactamente de la misma forma, se obtiene fácilmente mediante la simple repetición de la medida, y a la “exactitud” como un término relativo en el sentido de que un método es exacto o 31 inexacto dependiendo en gran medida de las necesidades del científico y las dificultades del problema analítico, se la expresa en términos de errores absolutos y relativos. Figura 14. Exactitud y Precisión Fuente:(Tortosa, 2015) 2.3.26 Pruebas de significación Una propiedad importante en un método analítico es que se encuentre libre de errores sistemáticos, esta propiedad se comprueba al comparar el valor experimental con el valor verdadero, y esto se realiza aplicando pruebas estadísticas que se denominan pruebas de significación.(Miller, 1993) a) Clasificación de los errores Suelen distinguirse dos tipos de errores: errores aleatorios o indeterminados y errores sistemáticos o determinados. Errores aleatorios Es aquel error que varía de forma imprevisible en valor absoluto y signo, cuando se efectúa un gran número de mediciones del mismo valor de una magnitud en condiciones prácticamente idénticas. Errores sistemáticos Estos errores no son debidos al azar o a causas no controlables, pueden surgir de emplear un método inadecuado, un instrumento defectuoso o bien por usarlo en condiciones para las que no estaba previsto su uso. 32 Los errores sistemáticos no son objeto de la teoría de errores, las causas probables pueden ser las siguientes: Errores instrumentales (de aparatos) Se atribuyen a imperfecciones de las herramientas de trabajo del experimentador como por ejemplo, los materiales volumétricos (buretas, pipetas, matraces aforados) pueden contener o proporcionar volúmenes que difieren del indicado. Error personal Este es, en general, difícil de determinar y es debido a limitaciones de carácter personal. Error de la elección del método Corresponde a una elección inadecuada del método de medida de la magnitud. Este tipo de error puede ponerse de manifiesto cambiando el aparato de medida, el observador, o el método de medida. a) Tratamiento estadístico de los errores aleatorios ̅ ): Promedio de un conjunto finito de datos. Media de la muestra (𝒙 ∑ 𝒙𝒊 . 𝒏→∞ 𝑵 ̅ = 𝐥𝐢𝐦 𝒙 Ecuación 2.Cálculo de media de la muestra Desviación estándar (σn-1) de la muestra (s): raíz cuadrática media de las desviaciones individuales respecto de la media. Varianza de la muestra (s2): Es el cuadrado de la desviación estándar Media de la población (μ): Valor verdadero de una medida. ∑ 𝒙𝒊 Ecuación 𝒏→∞ 𝑵 𝝁 = 𝐥𝐢𝐦 3. Media de la población Desviación estándar de la población (σ): raíz cuadrática media de las desviaciones individuales respecto de la media 𝝈 = √ 𝐥𝐢𝐦 𝒏→∞ ∑(𝒙𝒊 −𝒖)𝟐 𝑵 Ecuación 4.Desviación estándar de la población (σ): Varianza de la población (σ2): Es el cuadrado de la desviación estándar, porque las varianzas son aditivas. ∑(𝒙𝒊 − 𝒙 ̅)𝟐 𝒔=√ 𝑵−𝟏 Ecuación 5.Varianza de la población (σ2) 33 2.3.27 Poblaciones y muestras a) Población Se la define como un conjunto de elementos que tienen ciertas características o propiedades que son las que se desean estudiar. Cuando se conoce el número de individuos que la componen se habla de la población finita y cuando no se conoce su número, se habla de población infinita. b) Muestra Se la define como un subconjunto de la población infinita o universo(Skoog, 2001) 2.3.28 Contrastes de Significación Una de las propiedades más importantes de un método analítico es que debería estar libre de errores sistemáticos, esto quiere decir que el valor dado para la cantidad de analito debería ser el valor verdadero, sin embargo si no existieran los errores sistemáticos, los errores aleatorios hacen poco probable que la cantidad medida sea exactamente igual que la cantidad de patrón conocida Para decidir si la diferencia entre una cantidad medida y una cantidad conocida esta atribuida a errores aleatorios se puede aplicar una prueba estadística de aproximación que contrasta si son significativas las diferencias entre los dos resultados, o si se pueden justificar solo por variaciones aleatorias. Los contrastes de significación se emplean en evaluación de resultados experimentales. 2.3.29 Comparación de una media experimental con un valor conocido Al hacer una prueba de significación se está probando la veracidad de una hipótesis, que se conoce como una hipótesis nulaH0. El término nula se usa para dar a entender que no hay diferencia entre los valores observados y conocidos aparte de aquélla debido a la variación aleatoria, no está sujeta a un error sistemático Asumiéndose que esta hipótesis nula es verdadera, se puede usar la teoría estadística para calcular la probabilidad de que la diferencia observada (o una más grande) entre la media muestral, y el valor verdadero, μ, surja solamente como un resultado de errores aleatorios. Conforme disminuya la probabilidad de que la diferencia observada ocurra por casualidad, se hace menos probable que la hipótesis nula sea verdadera. Usualmente la hipótesis nula se rechaza si la probabilidad de tal diferencia, que ocurre por casualidad, es menor que 1 en 20 (es decir 0,05 ó 5%). En tal caso, se dice que la diferencia es significativa al nivel de P=0,05 (ó 5%). Usándose este nivel de significación hay, en promedio, una posibilidad de 1 en 20 de que se rechace la hipótesis nula cuando es, en realidad, verdadero, se puede usar un nivel de significación más alto, usualmente 0,01 ó 0,001 (1% ó 0,1%). El nivel de significación se indica escribiendo, P(es decir, probabilidad)=0,05, dando, este número, la probabilidad de rechazar una hipótesis nula verdadera. Es importante apreciar 34 que si la hipótesis nula se retiene, no hemos probado que sea verdadera, solamente que no se ha demostrado que sea falsa. Para decidir si la diferencia entre x y es significativa, es decir para contrastar Hola media de la población es = se calcula el estadístico t. t Ecuación 6. Calculo t (x ) N s Donde: x = media muestral s= desviación estándar muestral n= tamaño muestral Si t es mayor que cierto valor crítico entonces se rechaza la H o, el valor crítico de t para un nivel de significación concreto se puede encontrar en tablas (Anexo 1) a) Prueba “t” de Student se utiliza cuando el tamaño de muestra es pequeño, < 30. Esta prueba en el programa EXCEL, tiene tres opciones. Prueba “t” para medias de dos muestras emparejadas:Es la prueba “t” para dos grupos de datos relacionados entre sí; con esta opción no se comparan los promedios, sino las diferencias entre pares de valores. Prueba “t” para dos muestras suponiendo varianzas iguales: Es la prueba “t” donde se compara los promedios de dos grupos independientes, cuyas varianzas sean iguales u homocedásticas. Ecuación 7. Prueba t para dos muestras emparejadas td N sd Ecuación 8. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales x x t 1 sp 2 1 1 N1 N 2 s 2p N1 1s12 N 2 1s 22 N1 N 2 2 Prueba “t” para dos muestras suponiendo varianzas desiguales: Es la prueba “t” donde se compara los promedios de dos grupos independientes, cuyas varianzas sean desiguales 35 Ecuación 9. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales t x x 1 s12 s2 2 N1 N 2 2 t s12 s22 N1 N 2 2 s4 s4 2 1 2 2 N1 ( N1 1) N 2 ( N 2 1) Fuente:(Miller, 2002) 2.3.30 El contraste F para la comparación de desviaciones estándar Es de mucha importancia comparar las desviaciones estándar, es decir los errores aleatorios de dos conjuntos de datos. Esta comparación puede tomar dos formas: se puede pretender probar si el método A es más preciso que el método B (contraste de una cola), o si los métodos A y B difieren en su precisión (contraste de dos colas). El contraste F considera la razón de las dos varianzas muestréales, es decir, la razón de los cuadrados de las desviaciones estándar, S12 S 22 Para probar si es significativa la diferencia entre dos varianzas muestrales, esto es para probar: 𝐻𝑜: 𝑠21 = 𝑠22 se calcula el estadístico F (x i S2 F 12 S2 F 2 1 2 2 S S x 1 )2 N1 1 ( xi x 2 ) 2 N2 1 Ecuación 10. Prueba F F será siempre ≥ 1 El contraste supone que las poblaciones de donde se extraen las muestras son normales Prueba de hipótesis para la razón de dos varianzas de población 36 𝐻𝑜: 𝑠21 = 𝑠22 𝐻1 : 𝑠21 ≠ 𝑠22 Si la hipótesis nula es verdadera entonces la relación de varianzas debería ser próxima a 1. (Miller, 2002) La prueba “F” y la“t”, son dos pruebas independientes, pero debe hacerse primero la prueba F para saber que opción de “t” se debe aplicar. Una vez obtenido el valor de t, el modo de interpretarlo es igual al de la prueba de F. Se busca en una tabla o en el computador cual es el valor de la probabilidad que corresponde a ese valor de t con los grados de libertad, sumados. 2.3.31 Grados de libertad para la prueba “t”:Al comparar promedios de dos grupos: g.l.= n1+n2-2 Ecuación 11.. Cálculo de los grados de libertad (gl) En la prueba t pareada el número de pares de datos es – 1(Skoog, 2001) 2.3.32 Diseños Experimentales En los inicios de los años 30, Sir Ronald A. Fisher da a conocer una nueva ciencia conocida como diseño experimental. Esta ciencia se enfoca principalmente en la investigación, al estudio y manipulación de variables 2.3.33 Diseños factoriales con dos factores (Pulido, 2008) considera que los factores A y B con a y b (a, b ≥ 2) niveles de prueba, respectivamente se puede construir el arreglo o diseño factorial a × b, el cual consiste en a × b tratamientos. En diseños factoriales que involucran menos de cuatro factores por lo regularse corren replicados para tener la potencia necesaria en las pruebas estadísticas sobre los efectos de interés. Si se hacen n réplicas, el número total de corridas experimentales es n(a × b). En el modelo factorial con dos factores se establecen hipótesis tomando en cuenta los dos efectos que se está evaluando A y B y el efecto de interacción en la combinación que es el error aleatorio que se supone sigue una distribución para los tres efectos. H0 : Efecto A = 0 HA :Efecto A≠ 0 37 H0 : Efecto B = 0 HA : Efecto B ≠0 H0 : A× B =0 HA : A × B ≠ 0 Estas hipótesis se prueban mediante la técnica de análisis de varianza, que para un diseño factorial a × b con n réplicas resulta de descomponer la variación total como 𝑺𝑪𝑻 = 𝑆𝐶𝐴 + 𝑆𝐶𝐵 + 𝑆𝐶𝐴𝑥𝐵 + 𝑆𝐶𝐸 Ecuación 12.Suma de cuadrados totales Donde los respectivos grados de libertad de cada una de ellas son: nab - 1 = (a- 1) + (b- 1) + (a - 1)(b - 1) + ab(n- 1) Ecuación 13. Grados de libertad El factor (n – 1) en los grados de libertad de la suma de cuadrados del error (SCe) señala que se necesitan al menos dos réplicas del experimento para calcular este componente y para construir una tabla de ANOVA. Las sumas de cuadrados divididas entre sus correspondientes grados de libertad se llaman cuadrados medios (CM). Al dividir éstos entre el cuadrado medio del error (CME) se obtienen estadísticos de prueba con distribución F (Ver Tabla 7) Si el valor-p es menor al nivel de significancia a prefijado, se rechaza la hipótesis nula y se concluye que el correspondiente efecto está activo o influye en la variable de respuesta Tabla 7. ANOVA para el diseño factorial axb Fuente:(Pulido, 2008) 38 2.3.34 Diseño Anidado o Jerárquico: Según (Pulido, 2008) al tener un diseño factorial con dos factores cruzados A y B, se corren aleatoriamente todas las posibles combinaciones de niveles de los dos factores. Los niveles de cada factor se pueden combinar en cualquier momento con los niveles del otro factor, y en este caso los niveles de un factor son exactamente los mismos que en cada nivel del otro factor. Cuando l factor B está anidado en el factor A significa que los niveles del factor B no son los mismos en cada nivel del factor A. Esto quiere decir que hay relación entre los niveles del factor A y los niveles del factor B. Los diseños anidados también se conocen como diseños jerárquicos. 2.4 Fundamento Legal La Fundación Española para el Desarrollo de la Nutrición Animal (FEDNA) presenta una serie de publicaciones cuyo objetivo es proporcionar información básica que permita al nutricionista mejorar la eficiencia productiva de sus explotaciones. Para la elaboración de estas normas se ha revisado la información disponible en diversos países. Para ello se han utilizado datos proporcionados por empresas y técnicos del sector que han colaborado en la elaboración de estas normas. Para facilitar el trabajo del nutricionista, cada documento incluye información básica que permite recalcular, mediante extrapolación, las necesidades bajo distintas circunstancias productivas. Los datos que se aportan en las tablas no se corresponden con necesidades mínimas obtenidas en estaciones experimentales o laboratorios universitarios sino con recomendaciones prácticas en condiciones de campo. Es misión de cada nutricionista modificar estos estándares para ajustar mejor las necesidades de cada especie al tipo de animal, las condiciones de manejo y medio ambiente y los objetivos de su explotación particular. 2.4.1 FEDNA “Fundación Española para el desarrollo de la nutrición animal” proporciona Normas para Control de Calidad de ingredientes para piensos, y normas para la formulación de piensos, para la estimación del valor nutritivo de cada ingrediente y tomando en cuenta las especificidades de cada sistema de producción FEDNA ha recurrido en lo posible a datos obtenidos en Centros de Investigación españoles . (FEDNA, 2009) En la tabla 8 se detalla el porcentaje de proteína requerida en materias primas para formulación de un alimento balanceado. 39 Tabla 8. Norma FEDNA para la formulación de piensos compuestos. MATERIA PRIMA Proteína (%) MAIZ NACIONAL 7,5 MAIZ FRANCES 7,7 MAIZ USA 7,9 TRIGO BLANDO 11.2 PB 11,2 TRIGO BLANDO 10.2 PB 10,2 TRIGO INGLES BLANDO 10,2 TRIGO DURO 13,8 HARINA DE PALMISTE 16,3 HARINA DE PESCADO NAC. 60,1 HNA.SOJA 44 44,0 HNA.SOJA 45,5 45,5 HNA.SOJA 47 47,0 HNA.SOJA 48.5 48,5 SALVADO ARROZ 14 EE 13,8 SALVADO ARROZ 17 EE 13,6 CARNE 44/15/28 43,7 CARNE 50/14/26 49,3 CARNE 52/14/25 52,3 Fuente:(FEDNA, 2009) 40 2.4.2 Ley Orgánica de Sanidad Animal y vegetal e inocuidad alimentaria En nuestro país según la LEY ORGÁNICA DE SANIDAD ANIMAL Y VEGETAL E INOCUIDAD ALIMENTARIA, en su Artículo 73.- Producción y comercialización de alimentos para animales. Los alimentos procesados, aditivos y complementos alimenticios para animales deberán cumplir con las normas sanitarias establecidas en la presente Ley y su Reglamento General. No podrán comercializarse alimentos para animales que se encuentren contaminados, que contengan productos transgénicos, o residuos de carne, hueso o sangre de animales. Tampoco podrán comercializarse alimentos procesados para animales que no se encuentren registrados y autorizados por la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro AGROCALIDAD. (Ecuador, 2015) 41 CAPITULO III 3 MARCO METODOLÓGICO 3.1 Tipo de investigación El presente estudio es de tipo experimental, ya que el planteamiento a investigar es delimitado y específico, se llevó a cabo en los Laboratorios de Aseguramiento de la Calidad de las Plantas de Alimento Balanceado 1 y 2 se analizó el porcentaje de proteína cruda en materias primas y productos terminados por dos métodos Kjeldahl y Dumas. 3.2 Población y Muestra 3.2.1 Población Lotes con materias primas y producto terminado a granel y ensacado, correspondientes al 6 de Julio de 2015. 3.2.2 Muestra Se muestreó 9 materias primas y 6 productos terminados, identificados con nombre, fecha , número de lote, las cuales fueron analizadas por los dos métodos Kjeldahl y Dumas 10 muestras por cada materia prima y producto terminado (ver tabla 9-10 ) Matriz: Materias primas (MP) Productos terminados (PT) Tabla 9. Especificaciones de porcentaje de proteínas en materias primas MP Maíz Trigo Arrocillo Molido MATERIAS PRIMAS % Proteína (especificaciones) <10 10 a 20 > 20 Especificación MP Especificación MP Especificación % % % 9,0 ± 0,8 Afrechillo de trigo 14 ± 2 Harina de pescado 65 ± 4.0 10,5 ± 1,5 Palmiste 13,0 ± 3,0 Pasta de Soya 46 ± 1 Importada 8±2 Polvillo de cono de 13 ± 1,5 Afrecho de Cerveza 27.5 ± 3,5 arroz 42 Tabla 10 Especificaciones de porcentaje de proteína en productos terminados. PRODUCTOS TERMINADOS % Proteína (Formulación) 10 a 20 CÓDIGO T114R1I0 T321R2GB T431R2GB > 20 PT % 18 18 14 Alimento 1 Alimento 2 Alimento 3 CÓDIGO T115M2GB T324M2GB T628Z2A1 PT Alimento 4 Alimento 5 Alimento 6 % 41 34 21 Elaborado por Liliana Mera. Se eligió las materias primas (MP) tomando en cuenta los siguientes aspectos: MP de uso común en las plantas de Alimento Balanceado MP que constituyen aproximadamente el 80% en la formulación como es el caso del maíz, pasta de soya importada, trigo. En el caso de productos terminados PT se tomó en cuenta los siguientes aspectos (Ver Tabla 9) PT que constituyen el mayor porcentaje de producción en las plantas de Alimento Balanceado - En la Planta 1: Producción aproximada 10,000 ton/mes Los alimentos 2 y 3 constituyen el 10% de la producción siendo los dos productos de mayor producción, tomando en cuenta que el 90% restante corresponde a un aproximado de 113(formulaciones) (PT) - En la Planta 2: Producción aproximada 23,000 ton/mes Los alimentos 1 y 6 constituyen 21,7% y 8.7% respectivamente de la producción total PT que contienen alto porcentaje de Proteína Alimentos 4 y 5 (PRONACA, 2014) 43 Figura 15. Materias primas en sacos y a granel 44 3.3 Diseño experimental 3.2.1 Diseño metodológico Diagrama de proceso. 1Proceso de investigación 45 a) Descripción del Procedimiento Método Kjeldahl modificado (VerAnexo 3. Procedimiento Kjeldahl) Materiales y equipos Tubos de digestión Kjeldahl de 350 ml Erlenmeyer de 500 ml Bureta digital de 50 ml Dispensadores de 50 ml para ácido bórico Dispensadores de 50 ml para agua destilada Bureta digital de 50 ml para ácido clorhídrico Balanza Analítica con precisión 0,0001mg Digestor Gerhardt Dispositivo extractor de humos (Sorbona) Destilador Kjeldahl Piceta Gotero Material de pesaje Reactivos Ácido sulfúrico concentrado 96-98% libre de Nitrógeno Mezcla catalizadora. 95.4 % de sulfato de sodio anhidro, 1.8 % de sulfato de cobre pentahidratado y 2.8 % de óxido de titanio ó tableta Kjeldahl Solución de hidróxido de sodio al 30 %. Solución indicador mixto Solución acuosa de ácido bórico al 2.5 %. Ácido clorhídrico 0.1 N valorado 3 veces en cada cambio Agua destilada conductividad Máx.: 2 Procedimiento 1. Se pesó 0,5 gramos con precisión de 0,1 mg de la muestra finamente molida y homogenizada. 46 Figura 16. Muestras molidas 2. Se colocó en un tubo Kjeldahl 3. Se añadió una tableta de digestión Kjeldahl y 20 ml de H2SO4 Figura 17. Adición de tableta Kjeldahl y digestión 4. Se colocó el tubo de digestión con la muestra en el digestor, encendiendo el extractor de gases, la muestra alcanza una temperatura de calentamiento aproximadamente a 400°C, hasta ebullición del ácido 5. Se mantuvo el calentamiento hasta 15 minutos después de que el digestado estuvo completamente claro (aproximadamente 1:30 minutos, tiempo total de digestión). 47 Figura 18. Muestras digestadas 6. Se enfría, cuidadosamente añadiendo alrededor de 100 ml de agua destilada libre de nitrógeno. 7. Se añadió 50 ml de ácido bórico en un erlenmeyer de 500 ml 8. Se añadió 4 gotas de solución de indicador mixto en el erlenmeyer con la solución de ácido bórico Figura 19. Muestras añadidas indicador mixto y ácido bórico 48 9. Al iniciar la operación por primera vez en el equipo destilador se corrió un lavado completo (programa en el destilado) 10. Se acopló el tubo digestado en el equipo para destilar cuya programación es: STEP 1: 8s; STEP 2: 3s; STEP 3: 100% al igual que el erlenmeyer que contiene la solución de ácido bórico e indicador mixto 11. Se retiró el erlenmeyer y se lavó con agua destilada la punta del tubo recolector dentro el recipiente. Figura 20. Destilación de las muestras 12. Se tituló con ácido clorhídrico 0,1 N hasta cambio de color de verde a violeta. Figura 21. Viraje de color luego de la titulación 49 13. Se calculó el porcentaje de proteína. 14. Al finalizar cada jornada se lava el equipo corriendo un programa completo en el destilado Cálculos Proteína cruda (%) = % nitrógeno x 6.25 o 5,83 b) Determinación de proteína método Dumas (Ver Anexo 4. Procedimiento Dumas) Materiales y equipos Lana de vidrio (quartz wool) Balanza analítica con precisión de 0,01 mg Capsulas de aluminio de 30mm Analizador de nitrógeno y accesorios ( thermocombustión Flash 2000) Gas comprimido oxígeno Pureza 5,0 Gas comprimido helio pureza grado 5,0 Standard nitrógeno-ácido aspártico 10,52% nitrógeno de alta pureza Oxido de cobre de alta pureza Oxido catalizador Sílica gel Soda lime Molecular sieves Reactivos Procedimiento 1. Se encendió el equipo 2 horas antes del análisis, se verificó que cumpla con los siguientes parámetros, lo que nos garantiza su correcto funcionamiento. 2. Antes de cada corrida fue necesario verificar que el instrumento se encuentra en óptimo funcionamiento. Temperatura de tubo de la izquierda 950oC Temperatura de tubo de la derecha 840oC Temperatura horno Flujo de carrier 50oC 140 ml/min 50 Flujo de oxígeno Flujo de referencia Estándar Tiempo de recorrido de la muestra 300ml/min 200ml/min 50 mg de ácido aspártico 460 seg. Tabla 11. Condiciones de funcionamiento equipo thermocombustión Flash 2000 3. Se encendió el software xperience eager en el PC 4. Previo al análisis de muestras se realizó una estandarización que consistió en a) Añadir un blanco (cápsula vacía) en el automuestreador, seguido de una cápsula que contiene la sustancia estándar (ácido aspártico) bypass,se analizó tres muestras de la sustancia patrón, de esta manera se acondiciona al equipo. 5. Se pesó 150-200 mg de muestra finamente molida y homogenizada en malla tamiz de 0,1 mm. Figura 22Preparación y pesado de muestras 6. Se cierra la cápsula de aluminio (manejando cuidadosamente las muestras con pinzas durante el sellado). 51 Figura 23. Sellado de muestras 7. Se colocó las muestras en el reactor de combustión a través del inyector automático automuestreador junto con la cantidad adecuada de oxígeno. Ver tabla 10 Figura 24. Disco porta muestras 8. Después de la combustión, los gases resultantes se llevan por un flujo de helio, a un segundo reactor lleno con cobre, se retiene H2O y CO2, con ayuda de trampas pasa a una columna cromatográfica (GC), el N2 finalmente se determina por un detector de conductividad térmica (TCD) 52 Figura 25. Trampas de Oxidación y Reducción 9. El Informe de resultados se generó automáticamente al software (xperience eage) Figura 26. Equipo Dumas 53 Cálculos Proteína cruda (%) =% nitrógeno x 6.25 o 5,83 3.2.2 a) Diseño estadístico Variables independientes Método Kjeldahl y Método Dumas Tipo de matriz b) Variable dependiente Porcentaje de Proteína a) Investigación preliminar Se realizó un estudio preliminar utilizando la base de datos de porcentaje de proteína en materias primasde Laboratorio 1 (Método Kjeldahl) y laboratorio 23(Método Dumas) correspondiente al mes de enero 2014 Se empleó una prueba F de comparación de varianzas y una prueba t de comparación de medias para determinar si existe diferencia significativa entre los métodos Kjeldahl y Dumas Método 1: Kjeldahl Método 2: Dumas Ho: No hay diferencia significativa entre los dos métodos H1: Sí hay diferencia significativa entre los dos métodos Se aplicó estadísticamente las pruebas de comparación de medias y varianzas de los datos obtenidos Prueba t para varianzas iguales (comparación de medias) x x t 1 sp 2 s 2p 1 1 N1 N 2 3 N1 1s12 N 2 1s22 N1 N 2 2 Laboratorio 1: Laboratorio correspondiente a la planta de alimento balanceado 1 ubicada en Pichincha Laboratorio 2: Laboratorio correspondiente a la planta de alimento balanceado 2 ubicada en Guayas 54 Prueba t para varianzas desiguales (comparación de medias) t x x 1 s12 s22 N1 N 2 2 s12 s22 N1 N 2 2 s4 s4 2 1 2 2 N1 ( N1 1) N 2 ( N 2 1) Prueba F Comparación de varianzas de los dos métodos Kjeldahl y Dumas. (x x ) i F 2 1 N1 1 ( xi x 2 ) 2 N2 1 2 1 2 2 S S b) Determinación de exactitud de los métodos. Prueba de exactitud Por intercomparación de los resultados con laboratorios acreditados Para la determinación de exactitud de los métodos, se analizaron muestras certificadas con porcentaje de proteína medio y alto, que se tomaron como referencia tanto para MP como para PT (muestras AAFCO, con porcentaje de proteína 16% y 60%) , por el método Kjeldahl en dos laboratorios acreditados y en el laboratorio de la Planta 1. Se realizó tres repeticiones de cada muestra en los tres laboratorios participantes. Se comparó los resultados obtenidos aplicando el tratamiento estadístico de diseños anidados Muestra AAFCO 16% y muestra AAFCO 60% Tabla 12. Resultados análisis de comparación entre laboratorios NÚMERO DE REPETICIONES Lab. 3 1 2 3 Lab. 4 1 2 3 Lab. 1 1 2 3 Lab. 3: Laboratorio acreditado método Kjeldahl OSP alimentos UCE 55 Lab. 4: Laboratorio acreditado método Kjeldahl Multianalítica Lab.1: Laboratorio Puembo método Kjeldahl Hipótesis H0: No existe diferencia significativa entre laboratorios H1: Existe diferencia significativa entre laboratorios Diseño estadístico aplicado Diseño de Factores anidados Diagrama de proceso. 2 Diseño Anidado MUESTRA LABORATORIO Analista REPETICIONESn Diagrama de proceso. 3 Diseño Anidado para Muestra AAFCO 60% y AAFCO 16% DETERMINACION DE PROTEINA KJELDAHL MUESTRA AAFCO 60% - 16% LABORATORIO 3 (ANALISTA) LABORATORIO 4 OSP UCE MULTIANALITICA R1 R2 LABORATORIO 2 (ANALISTA) (ANALISTA) R3 R1 R2 PUEMBO R3 R1 R2 R3 Tabla 13 ANOVA Diseño Anidado Fuente de Variación Entre grupos Dentro de los grupos Total Suma de Cuadrados Grados de libertad Cuadrado Simple F Sb p-1 Mb= Sb (p-1 ) Mb/Mw Sw p(n-1) Mw= Sw p (n-1 ) Stot= Sb - Sw pn -1 56 Prueba t con un valor conocido Se realizó la comparación del valor obtenido en los análisis en el laboratorio acreditado que este caso se toma como valor real y el valor obtenido experimentalmente en el laboratorio 3 (valor experimental), y a continuación se aplicó una tratamiento estadístico Prueba “t” Tabla 14.Esquema resultado para prueba T con un valor conocido Muestra Lab 3 NÚMERO DE REPETICIONES Lab 1 1 1 2 2 3 3 𝒖𝟎 Media valor verdadero ̅ 𝒙 S S Desviación Estándar Lab3: Laboratorio Acreditado OSP UCE Lab1: Laboratorio Puembo Prueba t: t ( x 0 ) s N Ho: No existe diferencia significativa entre la media y el valor aceptado como verdadero H1: Existe diferencia significativa entre la media y el valor aceptado como verdadero Con una muestra de valor conocido AFFCO 60% y 16% Ho: H1: El método 1-2 es exacto El método 1-2 no es exacto Método 1: Kjeldahl Método 2:Dumas 57 Tabla 15. Esquema resultados obtenidos Método Kjeldahl y Dumas % proteína Repeticiones ( x Kjeldahl ) N t 1 s 2 3 4 5 6 7 8 9 10 promedio desvest % proteína Dumas µ = valor verdadero (del certificado) S= t= t 0,05 = z= c) Comparación de métodos empleando matrices definidas MP y PT Contenido bajo de proteína (<10%), contenido medio de proteína (10-20%), contenido alto de proteína (> 20 %) Igual para cada matriz Ho: No existe diferencia significativa entre el método Kjeldahl y el método Dumas utilizando como matriz (materia prima: % proteína < 10, de 10 a 20 y > 20) y (producto terminado: % proteína de 10 a 20 y > 20) H1: Existe diferencia significativa entre el método Kjeldahl y el método Dumas utilizando como matriz (materia prima: % proteína < 10, de 10 a 20 y > 20) y (producto terminado: % proteína de 10 a 20 y > 20) Método 1: Kjeldahl Método 2: Dumas Tabla 16. Esquema Resultados para comparación de métodos % % PROTEINA PROTEINA MUESTRA Fecha N° Muestra Proveedor Lote 1 2 3 4 58 Método 1 Método 2 5 6 7 8 9 10 Promedio DesvEst Varianza Gradliber F F 0,05 F 0,01 Prueba F comparación de varianzas (x x ) i F 2 1 2 2 S S 2 1 N1 1 ( xi x 2 ) 2 N2 1 Prueba t comparación de medias para datos emparejados td N sd Gráfica de correlación comparación de métodos Eje "x": Método Kjeldahl Eje "y”: Método Dumas 59 CAPÍTULO IV 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS A) INVESTIGACIÓN PRELIMINAR Se realizó la investigación preliminar utilizando la base de datos de porcentaje de proteína en materias primasde Laboratorio 1 (Método Kjeldahl) y laboratorio 2(Método Dumas) correspondiente al mes de enero 2014 a.1) Materias primas (MP) Los resultados que se presentan en las tablas 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 muestran la comparación de los dos métodos en muestras correspondientes al mismo proveedor, se han planteado las siguientes hipótesis. H 0: No existe diferencia significativa entre varianzas (varianzas iguales) 𝑆12 = 𝑆22 H 1: Existe diferencia significativa entre varianzas (varianzas desiguales) 𝑆12 > 𝑆22 El contraste de hipótesis se ha realizado mediante la prueba F (homogeneidad de varianzas) Adicionalmente para saber si existe diferencia entre medias se ha realizado la prueba t H 0: La medias son iguales 𝐱̅ 𝟏 = 𝐱̅ 𝟐 H 1: La medias no son iguales𝐱̅ 𝟏 ≠ 𝐱̅ 𝟐 MATERIAS PRIMAS CON PORCENTAJE DE PROTEÍNA MENORES AL 10% Maíz Tabla 17. Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para maíz N° 1 2 Laboratorio 2 %PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 Laboratorio 1 %PROTEINA Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 8,12 7,81 8,40 8,17 60 Laboratorio 2 %PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 Laboratorio 1 %PROTEINA Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 3 4 5 7,75 7,92 7,87 8,02 8,67 8,60 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 x S 8,10 8,01 8,17 8,10 7,87 8,16 8,12 7,54 7,51 8,09 8,10 8,04 8,16 7,96 7,97 0,20 8,50 8,98 8,85 S2 GL 0,04 18 PRUEBA F 2,16 2,37 3,43 0,09 11 N° F= F0.05= F0.01= Estadístico t PRUEBA t -5,38 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,04 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,75 8,31 8,15 8,20 8,44 8,44 0,29 NS( varianzas iguales) ** Como lo muestra la tabla 17 no existe diferencia significativa entre varianzas, se acepta la hipótesis Ho, sin embargo la prueba t demuestra que hay una diferencia significativa entre medias aceptándose la hipótesis Hi Los datos obtenidos para la muestra de maíz son precisos pero no exactos. 61 MATERIA PRIMA CON PORCENTAJE DE PROTEÍNA DE 10 – 20 % Palmiste Tabla 18.Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para palmiste N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X S S2 GL F= F 0,05 = F 0,01 = Estadístico t Valor crítico de t (dos colas) 0,05 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 Laboratorio 2 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 12,24 12,22 13,43 11,15 Laboratorio 1 % PROTEINA Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 15,09 13,98 14,76 12,44 0,91 14,30 14,67 15,73 13,57 15,07 13,08 13,13 15,36 15,14 13,61 14,56 15,04 14,47 0,83 0,82 5 0,68 14 13,55 12,05 PRUEBA F 0,83 4,64 9,77 PRUEBA t -4,96 NS ( varianzas iguales) ** 2,09 2,86 Como lo muestra la tabla 18 no existe diferencia significativa entre varianzas, se acepta la hipótesis Ho, la prueba t demuestra que hay una diferencia significativa entre medias aceptándose la hipótesis Hi 62 Los datos obtenidos para la muestra de palmiste son precisos pero no exactos. Afrechillo de trigo Tabla 19.Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para afrechillo de trigo Laboratorio 2 %PROTEINA Laboratorio 1 %PROTEINA N° Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 X S S2 GL 16,88 16,96 16,20 16,98 16,46 16,78 15,61 15,57 16,03 15,47 15,43 15,73 15,37 15,25 14,647 13,75 15,82 0,89 15,37 14,03 15,65 14,71 14,52 0,79 15 PRUEBA F 0,43 4 F= F0.05= F0.01= Estadístico t Valor crítico de t (dos colas) 0,05 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 0,54 3,06 4,90 PRUEBA t 2,23 14,86 0,65 NS (varianzas iguales) * 2,09 2,86 Como lo muestra la tabla 19 no existe diferencia significativa entre varianzas, se acepta la hipótesis Ho, la prueba t demuestra que hay una diferencia significativa entre medias aceptándose la hipótesis Hi 63 Los datos obtenidos para la muestra de afrechillo son precisos pero no exactos. Polvillo de Cono Tabla 20. Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para polvillo de cono N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X S S2 GL F= F 0,05 = F 0,01 = Laboratorio 2 %PROTEINA Laboratorio 1 %PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 13,73 13,39 13,22 13,86 11,30 12,12 13,46 13,44 12,84 12,72 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 13,05 14,73 14,41 13,48 14,21 15,23 13,91 13,15 13,49 13,85 13,95 0,74 13,01 0,79 0,89 9 PRUEBA F 0,55 3,18 5,35 PRUEBA t Estadístico t -2,82 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 0,49 9 NS (varianzas iguales) * Como lo muestra la tabla 20 no existe diferencia significativa entre varianzas, se acepta la hipótesis Ho, sin embargo la prueba t demuestra que hay una diferencia significativa entre medias aceptándose la hipótesis Hi Los datos obtenidos para la muestra de polvillo son precisos pero no exactos. 64 MATERIA PRIMA CON PORCENTAJE DE PROTEÍNA DE >20 % Afrecho de cerveza Tabla 21.Comparación de los métodos Kjeldahl y Dumas para afrecho de cerveza N° 1 2 3 4 5 6 7 8 X S S2 GL F= F 0,05 = F 0,01 = Estadístico t Valor crítico de t (dos colas) 0,05 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 Laboratorio 2 %PROTEINA Laboratorio 1 %PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 22,96 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 21,15 25,04 23,39 23,79 25,63 22,74 20,22 21,46 19,59 22,20 22,32 1,94 3,76 7 PRUEBA F 1,01 4,74 9,55 PRUEBA t -0,66 23,19 1,95 3,81 2 NS (Varianzas iguales) NS 2,26 3,25 Como lo muestra la tabla 21, no existe diferencia significativa entre varianzas, se acepta la hipótesis Ho, la prueba t demuestra que no existe una diferencia significativa entre medias aceptándose la hipótesis HO Los datos obtenidos para la muestra de polvillo son precisos y exactos. 65 Pasta de Soya Tabla 22.Comparación para los métodos Kjeldahl y Dumas para pasta de soya N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x S S2 GL Laboratorio 2 %PROTEINA Laboratorio 1 %PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 47,32 47,20 47,42 47,55 47,39 47,46 47,19 47,24 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 47,13 47,72 47,02 47,78 48,01 48,02 47,29 47,89 47,65 48,15 47,35 0,13 47,67 0,42 0,02 7 0,15 9 F= F 0,05 = F 0,01 = PRUEBA F 9,04 3,68 6,72 Estadístico t PRUEBA t -2,41 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,20 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 3,11 **(varianzas desiguales) * Como lo muestra la tabla 22, existe diferencia significativa entre varianzas, se acepta la hipótesis H1, la prueba t demuestra que existe diferencia significativa entre medias aceptándose la hipótesis H1 Los datos obtenidos para la muestra de pasta de soya no son precisos ni exactos. 66 Harina de pescado Tabla 23.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para harina de pescado Laboratorio 2 %PROTEINA Método Dumas Laboratorio 1 %PROTEINA Método Kjeldahl AOAC 992.15, AOAC 990.03 AOAC 988,05 modificado 1 2 3 4 5 6 x S S2 65,77 64,1 62,34 65,62 64,33 64,49 64,44 1,24 1,54 63,84 66,26 64,5 GL 5 2 N° F= F 0,05 = F 0,01 = 64,87 1,25 1,56 PRUEBA F 1,02 5,79 13,27 NS (varianzas iguales) PRUEBA t -1,20 Estadístico t Valor crítico de t (dos colas) 0,05 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 NS 2,57 4,03 Como lo muestra la tabla 23, no existe diferencia significativa entre varianzas, se acepta la hipótesis Ho, la prueba t demuestra que no existe diferencia significativa entre medias aceptándose la hipótesis Ho Los datos obtenidos para la muestra de harina de pescado son precisos y exactos. 67 b) Determinación de exactitud de los métodos Se aplicó un diseño estadístico anidado comparando los resultados obtenidos por el método Kjeldahl en el laboratorio 1Puembo y en dos laboratorios acreditados por el OAE; OSP y Multianalítica. Se utilizó dos muestras certificadas AAFCO con un valor conocido de proteína AAFCO min 16% SWINE GROWER 201328 AAFCO min 60% CORN GLUTEN MEAL 201327 Realizando 3 repeticiones de cada muestra y se obtuvo los siguientes resultados MUESTRA Swine grower 16% LOTE: 201328 SWINE GROWER LABORATORIO 3 LABORATORIO 4 LABORATORIO 1 REPETICIONES LABORATORIO OSP LABORATORIO MULTIANALITICA 1 18,15 17,96 18,2 2 18,11 17,67 17,96 3 18,25 17,86 17,92 LABORATORIO PUEMBO Con ayuda de un programa estadístico Minitab 17 se aplica el diseño anidado que compara 2 variables que son laboratorio (resultados), analista (una analista por laboratorio) obteniendo los siguientes resultados ANOVA anidada: RESULTADOS vs. ANALISTAS Análisis de varianza de RESULTADOS Fuente ANALISTAS Error Total GL 2 6 8 SC MC F P 0,1747 0,0874 5,316 0,047 0,0986 0,0164 0,2733 Componentes de la varianza % del 68 Fuente ANALISTAS Error Total Comp. Var. Total 0,024 58,99 0,016 41,01 0,040 0,200 Desv.Est. 0,154 0,128 Media de cuadrados esperada 1 ANALISTAS 2 Error 1,00(2) 1,00(2) + 3,00(1) El resultado obtenido al aplicar el diseño anidado para la muestra de AAFCO SWINE GROWER 201328 demuestra que no existe una diferencia significativa entre los valores obtenidos ya que el valor p 0,047 es menor que el valor F al 0,05%, porlo tanto los resultados obtenidos por el método Kjeldahl en el laboratorio 1 no difieren de los resultados obtenidos en los laboratorios acreditados OSP Y Multianalítica. MUESTRA AAFCO 60% Corn gluten meal LOTE: 201327 CORN GLUTEN MEAL 201327 LABORATORIO 3 LABORATORIO 4 LABORATORIO 1 REPETICIONES LABORATORIO OSP LABORATORIO MULTIANALITICA LABORATORIO PUEMBO 1 58,58 58,59 58,49 2 58,96 59,25 57,35 3 58,89 59,57 58,31 ANOVA anidada: RESULTADO vs. ANALISTA Análisis de varianza de RESULTADO Fuente ANALISTA Error Total GL SC MC F P 2 1,9594 0,9797 4,677 0,060 6 1,2569 0,2095 8 3,2162 Componentes de la varianza % del 69 Fuente ANALISTA Error Total Comp. Var. 0,257 0,209 0,466 total 55,07 44,93 0,683 Desv. Est. 0,507 0,458 Media de cuadrados esperada 1 ANALISTA 1,00(2) + 3,00(1) 2 Error 1,00(2) El resultado obtenido al aplicar el diseño anidado para la muestra de AAFCO CORN GLUTEN MEAL 201327 demuestra que no existe una diferencia significativa entre los valores obtenidos ya que el valor p 0,060 es menor que el valor F al 0,05%, por lo tanto con los resultados obtenidos en las 2 muestras AAFCO CORN GLUTEN MEAL Y AAFCO SWINE GROWER por el método Kjeldahl en el laboratorio 1 no difieren de los resultados obtenidos en los laboratorios acreditados OSP Y Multianalítica, demostrando así exactitud y precisión en el método Kjeldahl Laboratorio 1Puembo Prueba t con un valor conocido Se realizó la comparación de la muestra de AAFCO CORN GLUTEN MEAL que tiene un porcentaje de proteína aproximado de 60%,y se tomó como valor verdadero la media de los resultados obtenidos en el laboratorio OSP, aplicando una prueba t de comparación de medias Se han planteado las siguientes hipótesis: Ho: No existe diferencia significativa entre la media y el valor aceptado como verdadero H1: Existe diferencia significativa entre la media y el valor aceptado como verdadero Laboratorio 3 OSP: la media se toma como valor verdadero Laboratorio 1Puembo: la media se toma como valor experimental Tabla 24.Comparación Laboratorio 3 OSP vs Laboratorio 1Puembo Fecha MUESTRA 10/08/2014 AFFCO 10/08/2014 AFFCO Proveedor CORN GLUTEN MEAL CORN GLUTEN MEAL LABORATORIO 3 LABORATORIO 1 LABORATORIO OSP LABORATORIO PUEMBO 201327 58,58 58,49 201327 58,96 57,35 Lote 70 Fecha MUESTRA 10/08/2014 AFFCO Proveedor CORN GLUTEN MEAL LABORATORIO 3 LABORATORIO 1 LABORATORIO OSP LABORATORIO PUEMBO 58,89 58,31 Lote 201327 58,81 0,20 0,04 2 x S S2 G.L 58,05 0,62 0,38 2 PRUEBA F NS (varianzas 9,28 iguales) 19 99 F= F 0,05 = F 0,01 = PRUEBA t 2,03 NS Estadístico t Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,78 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 4,60 Como lo muestra la tabla 24, no existe diferencia significativa entre varianzas, al aplicar la prueba t para comparación de medias se acepta la hipótesis Ho, demostrando que no existe diferencia significativa entre medias, por lo tanto el método Kjeldahl el preciso y exacto • Con una muestra de valor conocido Se analizó las muestras de valor conocido de proteína AFFCO 60% y 16% por los dos métodos Método 1: Kjeldahl y Método 2:Dumas, y se aplicó una prueba t de comparación de medias para determinar si existe exactitud y precisión en el método Dumas. Se planteó las siguientes hipótesis: 𝑆12 = 𝑆22 H 0: No existe diferencia significativa entre varianzas (varianzas iguales) H 1: Existe diferencia significativa entre varianzas (varianzas desiguales)𝑆12 > 𝑆22 H 0: La medias son iguales H 1: La medias no son iguales𝑥̅1 ≠ 𝑥̅2 𝑥̅1 = 𝑥̅2 Muestra AAFCO CORN GLUTEN MEAL Min. 60% proteína 71 Tabla 25.Resultados obtenidos Método Kjeldahl y Dumas para muestra AAFCO Corn Gluten Meal Fecha 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 04/07/2014 CORN GLUTEN MEAL % % PROTEÍNA PROTEÍNA Método Método Dumas Kjeldahl AOAC AOAC 992.15, N° 988,05 AOAC Muestra Proveedor Lote modificado 990.03 1 AAFCO 201327 58,49 58,98 2 AAFCO 201327 57,35 57,67 3 AAFCO 201327 58,31 57,12 4 AAFCO 201327 57,45 58,11 5 AAFCO 201327 57,71 57,45 6 AAFCO 201327 57,53 57,12 7 AAFCO 201327 57,80 58,13 8 AAFCO 201327 57,57 57,45 9 AAFCO 201328 57,75 58,23 10 AAFCO 201328 58,48 57,42 57,84 57,77 x 0,43 0,59 S 0,18 0,34 S2 9,00 9,00 G.L PRUEBA F NS (varianzas 1,88 iguales) F= 3,18 F 0,05 = 5,35 F 0,01 = PRUEBA t NS Estadístico t 0,33 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 Se acepta la hipótesis Ho no existe diferencia significativa entre varianzas y medias, por lo tanto el método Dumas es preciso y exacto Para la muestra AAFCO Corn Gluten Meal los métodos Dumas y Kjeldahl presentan datos exactos y precisos Muestra AAFCO SWINE GROWER Min 16% proteína 72 Tabla 26.Resultados obtenidos Método Kjeldahl y Dumas muestra AAFCO Swine Grower SWINE GROWER % PROTEÍNA N° Fecha Muestra 04/07/2014 1 04/07/2014 2 04/07/2014 3 04/07/2014 4 04/07/2014 5 04/07/2014 6 04/07/2014 7 04/07/2014 8 04/07/2014 9 04/07/2014 10 Proveedor AAFCO AAFCO AAFCO AAFCO AAFCO AAFCO AAFCO AAFCO AAFCO AAFCO Lote 201327 201327 201327 201327 201327 201327 201327 201327 201328 201328 x S S2 G.L Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 18,20 17,96 17,92 18,19 18,39 18,24 18,70 18,16 19,16 18,24 % PROTEÍNA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 18,23 18,01 18,30 17,99 17,89 18,10 17,90 18,34 17,99 18,65 18,32 0,37 0,14 9,00 18,14 0,24 0,06 9,00 PRUEBA F 0,42 3,18 5,35 F= F 0,05 = F 0,01 = NS (varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t 1,27 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 NS Se acepta la hipótesis Ho no existe diferencia significativa entre varianzas y medias, por lo tanto el método Dumas es preciso y exacto Para la muestra AAFCO Swine Grower los métodos Dumas y Kjeldahl presentan datos exactos y precisos. 73 c) Comparación de métodos empleando matrices definidas MP(Materias Primas ) y PT (Producto Terminado) Resultados obtenidos por método de digestión Kjeldahl y de combustión Dumas Se realizó 10 repeticiones de cada muestra por los dos métodos, planteando las siguientes hipótesis: Prueba F de homogeneidad de varianzas H0: No existe diferencia significativa entre varianzas (varianzas iguales) 𝑆12 = 𝑆22 H1: Existe diferencia significativa entre varianzas (varianzas desiguales) 𝑆12 > 𝑆22 Prueba de Comparación de medias H0: H1: Las medias son iguales 𝐱̅ 𝟏 = 𝐱̅ 𝟐 Las medias no son iguales 𝐱̅𝟏 ≠ 𝐱̅ 𝟐 c.1) Materias primas MATERIAS PRIMAS CON CONTENIDO BAJO DE PROTEÍNA (< 10%) Maíz Especificación: 9,0 ± 0,8 % Proteína Tabla 27.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para maíz nacional MAÍZ % % PROTEINA PROTEINA Método Método Dumas Kjeldahl AOAC AOAC 992.15, N° 988,05 AOAC Fecha Muestra Proveedor Lote modificado 990.03 06/07/2015 1 Buque Virgo Colossus s/l 8,90 9,07 06/07/2015 2 Buque Virgo Colossus s/l 8,68 9,16 06/07/2015 3 Buque Virgo Colossus s/l 9,25 8,94 06/07/2015 4 Buque Virgo Colossus s/l 8,38 8,90 06/07/2015 5 Buque Virgo Colossus s/l 9,08 8,06 M40006KE 74 MAÍZ M40006KE N° Fecha Muestra 06/07/2015 6 06/07/2015 7 06/07/2015 8 06/07/2015 9 06/07/2015 10 Proveedor % % PROTEINA PROTEINA Método Método Dumas Kjeldahl AOAC AOAC 992.15, 988,05 AOAC Lote modificado 990.03 Buque Virgo Colossus s/l 8,38 8,13 Buque Virgo Colossus s/l 8,62 8,22 Buque Virgo Colossus s/l 8,45 7,82 Buque Virgo Colossus s/l 8,47 8,10 Buque Virgo Colossus X S S2 GL s/l 8,74 8,20 8,70 0,30 0,09 9 8,46 0,50 0,25 9 PRUEBA F 2,74 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 NS (varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t 1,28 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 NS Como se muestra en la tabla 27 no existe diferencia significativa entre varianzas y medias, se acepta la hipótesis Ho. 75 Arrocillo molido Especificación:8 ± 2 % proteína Tabla 28.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para arrocillo molido ARROCILLO MOLIDO % PROTEÍNA M50006MC Fecha 06/07/2015 N° Muestra 1 06/07/2015 2 06/07/2015 3 06/07/2015 4 06/07/2015 5 06/07/2015 6 06/07/2015 7 06/07/2015 8 06/07/2015 9 06/07/2015 10 Proveedor PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN PILADORA DURAN x S S2 GL Lote % PROTEÍNA Método Método Dumas Kjeldahl AOAC AOAC 988,05 992.15, modificado AOAC 990.03 17173 8,87 8,21 17173 8,83 8,15 17173 9,05 8,84 17173 8,28 8,93 17173 9,13 9,38 17173 8,87 8,12 17173 8,77 8,84 17173 8,56 9,38 17173 8,87 8,18 17173 8,92 8,82 0,24 0,06 9 8,26 8,63 0,51 0,26 9 PRUEBA F 4,35 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 * (varianzas desiguales) PRUEBA t Estadístico t 1,05 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,16 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 3,01 76 NS Como se muestra en la tabla 28 para la prueba F(comparación de varianzas)se acepta la hipótesis H1existe diferencia significativa entre varianzas, para la prueba t ( comparación de medias ) se acepta la Ho no existe diferencia significativa Trigo Especificación: 10,5 ± 1,5 % proteína Tabla 29.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para trigo suave TRIGO SUAVE M40016LD Fecha 06/07/2015 % PROTEINA % PROTEINA N° Muestra Proveedor Lote 1 T PRIME 6418 2 T PRIME 6418 3 T PRIME 6418 4 T PRIME 6418 5 T PRIME 6418 6 T PRIME 6418 7 T PRIME 6418 8 T PRIME 6418 9 T PRIME 6418 10 T PRIME 6418 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 x S S2 GL Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 9,62 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 10,18 9,67 10,68 9,42 10,85 9,78 10,20 9,45 10,10 9,98 10,08 9,26 10,35 9,80 9,88 9,49 9,42 9,43 9,75 9,59 0,22 0,05 12,00 10,15 0,42 0,18 12,00 PRUEBA F 3,66 2,69 4,15 F F 0,05 F 0,01 * (varianzas diferentes) PRUEBA t Estadístico t -3,73 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,14 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,98 77 * Como se muestra en la tabla 29 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la hipótesis H1 existe diferencia significativa entre varianzas, para la prueba t (comparación de medias se acepta la Hi existe diferencia significativa entre medias. Interpretación de Resultados: Se realizó la comparación en materias primas con porcentaje bajo de proteína < 10 %, las materias primas analizadas dentro de este rango fueron: maíz, arrocillo molido y trigo, en la muestra de maíz se aplicó una prueba F (contraste de dos colas) para comparar varianzas como resultado se obtuvo varianzas iguales entre los métodos por lo tanto existe precisión en los resultados obtenidos, con la prueba t ( contraste de dos colas) que compara medias experimentales de los dos métodos ,se obtuvo que los dos métodos son iguales por lo tanto existe exactitud en los resultados obtenidos ; En las muestras de arrocillo molido y trigo la prueba F (contraste de dos colas ) al 95% las varianzas difieren, al 99% no existe diferencia , no existe precisión en los resultados obtenidos, en arrocillo molido con la prueba t ( contraste de dos colas) se obtuvo que los métodos son iguales existe exactitud en los resultados obtenidos ; en la muestra de trigo con la prueba t ( contraste de dos colas) se obtuvo que los métodos no son iguales no existe exactitud en los resultados obtenidos. Tabla 30. Promedio de Materias Primas < 10% de Proteìna Promedio % Proteína MP Maíz Trigo Arrocillo Molido % Proteína (especificaciones) 9,0 ± 0,8 10,5 ± 1,5 8±2 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 8,70 9,59 8,82 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 8,46 10,15 8,63 Tabla 31. Resultados de Materias primas < 10% de proteína Promedio % Proteína MP MAIZ MAIZ MAIZ MAIZ MAIZ MAIZ MAIZ Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 8,90 8,68 9,25 8,38 9,08 8,38 8,62 78 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 9,07 9,16 8,94 8,90 8,06 8,13 8,22 Promedio % Proteína MP MAIZ MAIZ MAIZ ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO ARROCILLO TRIGO TRIGO TRIGO TRIGO TRIGO TRIGO TRIGO TRIGO TRIGO TRIGO Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 8,45 8,47 8,74 8,87 8,83 9,05 8,28 9,13 8,87 8,77 8,56 8,87 8,92 9,62 9,67 9,42 9,78 9,45 9,98 9,26 9,80 9,49 ,43 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 7,82 8,10 8,20 8,21 8,15 8,84 8,93 9,38 8,12 8,84 9,38 8,18 8,26 10,18 10,68 10,85 10,20 10,10 10,08 10,35 9,88 9,42 9,75 Se aplicó un análisis de dos factores con varias muestras por grupos, para determinar cuál es la variable que influye en el resultado Tabla 32. ANOVA Materias primas < 10% de Proteína ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de variaciones cuadrados Muestra(A) Método(B) Interacción A xB Dentro del grupo Total Grados de libertad Promedio de los cuadrados 20,04 0,03 2 1 10,02 0,03 1,98 2 0,99 7,9 29,96 54 59 0,15 79 F Probabilidad 68,50* * 0,00 0,21 0,64 6,76* 0,00 Valor crítico para F0,05 Valor crítico para F0,01 3,17 4,02 5,02 7,13 3,17 5,02 Se plantearon las siguientes hipótesis H0A : Efecto de muestra (A)= 0 HiA: Efecto de muestra (A) ≠0 H0B : Efecto de método (B) = 0 Hi B: Efecto de método(B) ≠0 H0AB : muestra × método (AB) = 0 HiAB: muestra × método (AB) ≠0 Se acepta la hipótesis HOA y HiAB existe una influencia altamente significativa del tipo de muestra en los resultados obtenidos, el método es influenciado por este tipo de muestra existe una interacción entre el método y la muestra, siendo los dos o al menos uno de los métodos diferente en este rango de % de proteína Grafica 1. Grafica de dispersión de la correlación Dumas Vs Kjeldahl para MP con contenido de proteína < 10% GRÁFICA DE DISPERSIÓN DE LA CORRELACIÓN DUMAS VS KJELDAHL 11,50 11,00 MÉTODO DUMAS 10,50 10,00 9,50 9,00 y = 0,6815x2 - 10,985x + 52,551 R² = 0,5829 8,50 8,00 7,50 7,00 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 MÉTODO KJELDAHL Ecuación para materias primas < 10% proteína y = 0,6815x2 - 10,985x + 52,551 80 10,00 10,50 11,00 Ecuación 14. Ecuación correlación MP>10% proteína R² = 0,5829 r=0,7635** r.95 = 0,306 r.99 = 0,423 (valor teórico ver Anexo 6) Para materias primas con un porcentaje de proteína menor a 10% existe una correlación de tipo polinomial altamente significativa se acepta la H1 H0: No existe correlación entre métodos ∄ H1: Existe correlación entre métodos ∃ MATERIAS PRIMAS CON CONTENIDO MEDIO DE PROTEÍNA (10 - 20%) Afrechillo trigo Especificación: 14 ± 2 % proteína Tabla 33.Comparación Kjeldahl y Dumas para afrechillo de trigo AFRECHILLO DE TRIGO % M40111MA PROTEINA N° Fecha Muestra 06/07/2015 1 06/07/2015 2 06/07/2015 3 06/07/2015 4 06/07/2015 5 06/07/2015 6 06/07/2015 7 06/07/2015 8 06/07/2015 9 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 Proveedor Lote Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado G.Superior 26476 13,55 13,67 G.Superior 26475 13,87 14,35 G.Superior 26536 13,59 14,09 G.Superior 26533 14,05 14,43 G.Superior 26585 13,37 14,18 G.Superior 26627 13,74 14,21 G.Superior 26646 13,50 14,81 G.Superior 26652 13,88 13,52 G.Superior 26627 13,28 13,74 81 AFRECHILLO DE TRIGO % M40111MA PROTEINA N° Fecha Muestra 06/07/2015 10 Proveedor Lote Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 13,79 13,86 13,66 0,24 0,06 9,00 14,09 0,40 0,16 9,00 G.Superior 26681 x S S2 GL PRUEBA F 2,62 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 NS(varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t -2,89 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 * Como se muestra en la tabla 33 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la hipótesis H0 no existe diferencia significativa entre varianzas, para la prueba t (comparación de medias se acepta la Hi existe diferencia significativa entre medias. Polvillo de cono Especificación: 13 ± 1,5 % proteína Tabla 34.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para polvillo de cono POLVILLO DE CONO Lote % PROTEINA Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 36204 13,05 13,51 36204 14,73 13,67 M40142MA Fecha 06/07/2015 N° Muestra 1 06/07/2015 2 Proveedor ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH 82 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 POLVILLO DE CONO Lote % PROTEINA Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 36204 14,41 14,01 36204 13,48 13,43 36204 14,21 14,13 36204 15,23 14,42 36204 13,91 13,56 36204 13,15 13,16 36204 13,49 13,53 36204 13,85 13,95 0,70 0,49 9 14,01 13,74 0,38 0,15 9 M40142MA Fecha 06/07/2015 N° Muestra Proveedor ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH ZAVALA JANETH x S S2 GL 3 06/07/2015 4 06/07/2015 5 06/07/2015 6 06/07/2015 7 06/07/2015 8 06/07/2015 9 06/07/2015 10 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 PRUEBA F 0,30 3,18 5,35 F= F 0,05 = F 0,01 = NS(varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t 0,82 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 NS Como se muestra en la tabla 34 para la prueba F (comparación de varianzas) y para la prueba t (comparación de medias) se acepta la hipótesis H0 no existe diferencia significativa entre varianzas y entre medias. Palmiste Especificación: 13 ± 3,0 % proteína 83 Tabla 35.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para palmiste PALMISTE M10211MQ Fecha 06/07/2015 % % PROTEINA PROTEINA Método Método Kjeldahl Dumas AOAC 988,05 AOAC 992.15, modificado AOAC 990.03 N° Muestra Proveedor Lote 1 RIO MANSO 36226 14,74 13,64 2 RIO MANSO 36226 15,96 13,87 3 RIO MANSO 36226 14,65 14,34 4 RIO MANSO 36226 15,02 13,83 5 RIO MANSO 36226 15,24 14,34 6 RIO MANSO 36226 14,35 14,39 7 RIO MANSO 36226 13,86 14,02 8 RIO MANSO 36226 14,67 13,87 9 RIO MANSO 36226 13,95 13,93 10 RIO MANSO X S S2 GL 36226 13,89 14,09 14,63 0,67 0,44 9 14,03 0,25 0,06 9 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 06/07/2015 PRUEBA F NS (varianzas 0,15 iguales) 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 PRUEBA t 2,66 * Estadístico t Valor crítico de t (dos colas)0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas)0,01 2,88 Como se muestra en la tabla 35 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la hipótesis H0 no existe diferencia significativa entre varianzas, para la prueba t (comparación de medias se acepta la Hi existe diferencia significativa entre medias. 84 Interpretación de resultados: Se realizó la comparación en materias primas con una valor medio de proteína de 10 - 20 % las materias primas analizadas dentro de este rango fueron : Afrechillo de trigo, polvillo de cono y palmiste, en las 3 muestras se aplicó una prueba F (contraste de dos colas ) que permitió comparar varianzas resultando tener varianzas iguales entre los métodos para las tres muestras, por lo tanto existe precisión en los resultados por los dos métodos, en la muestra de Afrechillo de trigo con la prueba t (contraste de dos colas) que se realizó para comparar medias experimentales de los métodos ,se obtuvo que los dos métodos no son iguales ; por lo tanto los resultados obtenidos no son exactos, en la muestra polvillo de cono en la prueba t (contraste de dos colas ) se obtuvo que los dos métodos son iguales, por lo tanto existe exactitud en los resultados obtenidos, para la muestra de palmiste con la prueba t (contraste de dos colas) las medias difieren, no existe exactitud en los resultados obtenidos. Tabla 36.Promedio de Materias Primas 10 a 20% de proteína Promedio % Proteína MP Afrechillo de trigo Palmiste Polvillo de cono de arroz % Proteína (especificaciones) 14 ± 2 13,0 ± 3,0 13 ± 1,5 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 13,66 14,63 13,95 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 14,09 14,03 13,74 Tabla 37.Resultados de Materias primas 10 a 20 % de proteína Promedio % Proteína MP Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 Afrechillo de trigo 13,55 13,67 Afrechillo de trigo 13,87 14,35 Afrechillo de trigo 13,59 14,09 Afrechillo de trigo 14,05 14,43 Afrechillo de trigo 13,37 14,18 Afrechillo de trigo 13,74 14,21 Afrechillo de trigo 13,50 14,81 Afrechillo de trigo 13,88 13,52 Afrechillo de trigo Afrechillo de trigo Polvillo de cono de arroz 13,28 13,79 13,05 13,74 13,86 13,51 85 Promedio % Proteína MP Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Polvillo de cono de arroz Palmiste Palmiste Palmiste Palmiste Palmiste Palmiste Palmiste Palmiste Palmiste Palmiste Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 14,73 14,41 13,48 14,21 15,23 13,91 13,15 13,49 13,85 14,74 15,96 14,65 15,02 15,24 14,35 13,86 14,67 13,95 13,89 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 13,67 14,01 13,43 14,13 14,42 13,56 13,16 13,53 14,01 13,64 13,87 14,34 13,83 14,34 14,39 14,02 13,87 13,93 14,09 Se aplicó un análisis de dos factores con varias muestras por grupos, para determinar cuál es la variable que influye en el resultado A: muestras (Afrechillo de trigo, polvillo de cono, palmiste) B: métodos (Dumas, Kjeldahl) Tabla 38.ANOVA Materias primas 10 - 20% de Proteína ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las variaciones Muestra (A) Método (B) Interacción (AxB) Dentro del grupo Promedio Suma de Grados de de los cuadrados libertad cuadrados 2,98 2 1,49 0,25 1 0,25 2,67 2 1,34 12,25 54 0,23 86 Valor crítico para F Probabilidad F0,05 6,57* 0,00 3,17 1,09 0,30 4,02 5,89* 0,00 3,17 Valor crítico para F0,01 5,02 7,13 5,02 Total 18,16 59 Se plantearon las siguientes hipótesis H0A : Efecto de muestra (A)= 0 HiA: Efecto de muestra (A) ≠0 H0B : Efecto de método (B) = 0 Hi B: Efecto de método(B) ≠0 H0AB : muestra × método (AB) = 0 HiAB: muestra × método (AB) ≠0 Se acepta la hipótesis HOA y HiAB existe una influencia altamente significativa del tipo de muestra en los resultados obtenidos, el método es influenciado por este tipo de muestra existe una interacción entre el método y la muestra, siendo los dos o al menos uno de los métodos diferente en este rango de % de proteína Grafica 2. Gráfica de Dispersión Dumas vs Kjeldahl MP 10 - 20 % Proteína 87 GRÁFICA DE LA DISPERSIÓN DE LA CORRELACIÓN DUMAS VS KJELDAHL METODO DUMAS 16,00 15,00 14,00 13,00 12,00 y = -0,2367x4 + 13,8x3 - 301,42x2 + 2922,9x - 10604 R² = 0,2132 11,00 10,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00 17,00 METODO KJELDAHL Ecuación para materias primas 10-20 % proteína y = -0,2367x4 + 13,8x3 - 301,42x2 + 2922,9x - 10604 Ecuación 15.Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína R² = 0,2132 r = 0,4617* r.95 = 0,306 r.99 = 0,423 (valor teórico ver Anexo 6 ) Para materias primas con un porcentaje de proteína entre 10 a 20 % existe una correlación de tipo polinomial significativa se acepta la H1 H0: No existe correlación entre métodos ∄ H1: Existe correlación entre métodos ∃ 88 MATERIAS PRIMAS CON CONTENIDO ALTO DE PROTEÍNA > 20% Afrecho de cerveza Especificación: 27,5 ± 3,5 % proteína Tabla 39.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para afrecho de cerveza Fecha 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 AFRECHO DE CERVEZA % M50101MU PROTEINA Método Kjeldahl N° AOAC 988,05 Muestra Proveedor Lote modificado 1 PRODAL 36312 26,37 2 PRODAL 36312 26,81 3 PRODAL 36312 26,66 4 PRODAL 36312 27,19 5 PRODAL 36312 26,40 6 PRODAL 36312 25,79 7 PRODAL 36312 27,39 8 PRODAL 36312 25,96 9 PRODAL 36312 26,94 10 PRODAL 36312 26,42 x 26,59 S 0,51 S2 0,26 GL 9,00 PRUEBA F 2,20 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 27,34 25,49 25,49 27,04 25,37 25,89 25,92 26,60 26,97 26,98 26,31 0,75 0,57 9,00 NS(varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t 0,99 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 NS Como se muestra en la tabla 39 para la prueba F (comparación de varianzas) y para la prueba t (comparación de medias) se acepta la hipótesis H0 no existe diferencia significativa entre varianzas y entre medias. Pasta de Soya 89 Especificación: 46 ± 1 % proteína Tabla 40.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para pasta de Soya PASTA DE SOYA BOLIVIANA % M50006MC PROTEINA Fecha 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 07/07/2015 % PROTEINA Método Método Dumas Kjeldahl AOAC N° AOAC 988,05 992.15, Muestra Proveedor Lote modificado AOAC 990.03 1 OSLO BULK 2 s/l 46,52 46,35 2 OSLO BULK 2 s/l 46,54 46,93 3 OSLO BULK 2 s/l 46,76 46,35 4 OSLO BULK 2 s/l 46,32 48,06 5 OSLO BULK 2 s/l 46,92 48,27 6 OSLO BULK 2 s/l 46,57 46,45 7 OSLO BULK 2 s/l 47,38 46,87 8 OSLO BULK 2 s/l 46,06 48,01 9 OSLO BULK 2 s/l 46,44 46,27 10 OSLO BULK 2 s/l 46,54 47,78 x 46,60 47,13 S 0,36 0,81 S2 0,13 0,66 GL 9 9 PRUEBA F * (varianzas 5,14 desiguales) F= 3,18 F 0,05 = 5,35 F 0,01 = PRUEBA t Estadístico t -1,89 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,18 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 3,05 NS Como se muestra en la tabla 40 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la hipótesis H1 existe diferencia significativa entre varianzas y para la prueba t (comparación de medias) se acepta la Ho no existe diferencia significativa entre medias. Harina de Pescado Especificación: 65 ± 4.0 % proteína Tabla 41.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para harina de pescado 90 HARINA DE PESCADO > 64% M50504MA N° Fecha Muestra 04/07/2015 1 04/07/2015 2 04/07/2015 3 04/07/2015 4 04/07/2015 5 04/07/2015 6 04/07/2015 7 04/07/2015 8 04/07/2015 9 04/07/2015 10 Proveedor JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. JUNSA S.A. Lote 37883 37883 37883 37883 37883 37883 37883 37883 37883 37883 x S S2 GL % % PROTEINA PROTEINA Método Método Kjeldahl Dumas AOAC 988,05 AOAC 992.15, modificado AOAC 990.03 67,12 67,30 66,34 63,40 67,24 67,31 66,53 64,79 66,55 70,08 66,39 66,27 66,53 68,79 66,08 67,11 66,36 63,74 66,87 63,09 66,60 66,19 0,36 2,37 0,13 5,62 9 9 PRUEBA F 42,23 3,18 5,35 F= F 0,05 = F 0,01 = ** (varianzas desiguales) PRUEBA t Estadístico t 0,54 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,26 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 3,25 NS Como se muestra en la tabla 41 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la hipótesis H1 existe diferencia altamente significativa entre varianzas y para la prueba t (comparación de medias) se acepta la Ho no existe diferencia significativa entre medias. Interpretación de Resultados: Se realizó la comparación en materias primas con una valor alto de proteína de >20 % las materias primas analizadas dentro de este rango fueron : Afrecho de cerveza, Pasta de Soya y Harina de pescado en las 3 muestras se aplicó una prueba F (contraste de dos colas ) que permitió comparar varianzas resultando para el afrecho de cerveza varianzas iguales, por lo tanto existe precisión en los resultados obtenidos por los dos métodos, en la muestra de Pasta de Soya las varianzas difieren, los resultados obtenidos no son precisos, la harina de pescado presenta diferencia en sus varianzas, por 91 lo tanto no existe precisión en los resultados obtenidos, al aplicar la prueba t (contraste de dos colas) que se realizó para comparar medias experimentales de los métodos ,las tres muestras no presentan diferencia en sus varianzas por los tanto los resultados obtenidos son exactos Tabla 42.Promedio de Materias Primas > 20% de Proteína Promedio % Proteína MP Harina de pescado Pasta de Soya Importada Afrecho de Cerveza % Proteína (especificaciones) 65 ± 4.0 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 66,60 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 66,19 46 ± 1 27.5 ± 3,5 46,60 26,59 47,13 26,31 Tabla 43. Resultados de Materias primas > 20 % de Proteína Promedio % Proteína MP AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA AFRECHO DE CERVEZA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA PASTA DE SOYA HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 26,37 26,81 26,66 27,19 26,40 25,79 27,39 25,96 26,94 26,42 46,52 46,54 46,76 46,32 46,92 46,57 47,38 46,06 46,44 46,54 67,12 66,34 67,24 66,53 92 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 27,34 25,49 25,49 27,04 25,37 25,89 25,92 26,60 26,97 26,98 46,35 46,93 46,35 48,06 48,27 46,45 46,87 48,01 46,27 47,78 67,30 63,40 67,31 64,79 HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO HARINA DE PESCADO 66,55 66,39 66,53 66,08 66,36 66,87 70,08 66,27 68,79 67,11 63,74 63,09 Se aplicó un diseño factorial A x B (análisis de dos factores con varias muestras por grupos) ,para determinar cuál es la variable que influye en el resultado A: muestras (afrecho de cerveza, pasta de soya, harina de pescado) B: métodos (Dumas, Kjeldahl) Tabla 44.ANOVA Materias primas >20% de Proteína ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las variaciones Muestra (A) Columnas (B) Interacción AXB Dentro del grupo Total Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados Probabilidad Valor crítico para F0,05 Valor crítico para F 0,01 15957,22 2 7978,61 F 6500,77* * 0,00 3,17 5,02 0,05 1 0,05 0,04 0,85 4,02 7,13 2,61 2 1,31 1,06 0,35 3,17 5,02 66,28 54 1,23 16026,15 59 Se plantearon las siguientes hipótesis H0A : Efecto de muestra (A)= 0 HiA: Efecto de muestra (A) ≠0 H0B : Efecto de método (B) = 0 Hi B: Efecto de método (B) ≠0 H0AB : muestra × método (AB) = 0 HiAB: muestra × método (AB) ≠0 Se acepta la hipótesis HOA existe una influencia altamente significativa del tipo de muestra en los resultados obtenidos, el error se debe a las muestras no a los métodos. Grafica 3.Gráfica de Dispersión DUMAS vs Kjeldahl MP > 20 % Proteína 93 GRÁFICA DE DISPERSIÓN DE LA CORRELACIÓN DUMAS VS KJELDAHL METODO DUMAS 80,00 70,00 y = 0,9728x1,0067 R² = 0,9936 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 METODO KJELDAHL Ecuación para materias primas < 20 % proteína y = 0,9728x1,0067 Ecuación 16. Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína R² = 0,9936 r =0.9968** r.95 = 0,306 r.99 = 0,423 (valor teórico ver Anexo 6) Para materias primas con un porcentaje de proteína entre >20 % existe una correlación de tipo potencial, altamente significativa se acepta la H1 H0: No existe correlación entre métodos ∄ H1: Existe correlación entre métodos ∃ c.2) Productos terminados PRODUCTOS TERMINADOS CON CONTENIDO DE PROTEÍNA DE (10 - 20%) 94 Alimento 1 Especificación: min18% proteína Tabla 45.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 1 ALIMENTO 1 T114R1I0 N° Fecha Muestra Proveedor 28/07/2015 1 DURAN 28/07/2015 2 DURAN 28/07/2015 3 DURAN 28/07/2015 4 DURAN 28/07/2015 5 DURAN 28/07/2015 6 DURAN 28/07/2015 7 DURAN 28/07/2015 8 DURAN 28/07/2015 9 DURAN 28/07/2015 10 DURAN x S S2 GL % PROTEINA Lote 1405105936 1405105936 1405105936 1405105936 1405105936 1405105936 1405105936 1405105936 1405105936 1405105936 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 21,11 20,17 20,94 20,14 20,52 19,75 20,65 19,98 20,72 20,32 20,43 0,43 0,19 9 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 19,55 19,37 19,82 19,70 20,84 19,67 20,12 19,74 20,57 19,88 19,93 0,46 0,21 9 PRUEBA F 1,13 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 NS(varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t 2,52 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 * Como se muestra en la tabla 45 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la hipótesis Ho no existe diferencia significativa entre varianzas y para la prueba t (comparación de medias) se acepta la Hi existe diferencia significativa entre medias. Alimento 2 Especificación: Min 18% proteína 95 Tabla 46.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 2 ALIMENTO 2 % PROTEINA T321R2GB N° Fecha Muestra Proveedor 27/07/2015 1 PUEMBO 27/07/2015 2 PUEMBO 27/07/2015 3 PUEMBO 27/07/2015 4 PUEMBO 27/07/2015 5 PUEMBO 27/07/2015 6 PUEMBO 27/07/2015 7 PUEMBO 27/07/2015 8 PUEMBO 27/07/2015 9 PUEMBO 27/07/2015 10 PUEMBO x S S2 GL Lote 464540 464540 464540 464540 464540 464540 464540 464540 464540 464540 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 18,02 17,81 18,05 17,78 18,11 17,93 18,72 18,15 17,96 17,88 18,04 0,27 0,07 9 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 18,09 17,13 18,19 19,37 17,58 17,59 18,07 17,98 17,99 18,00 18,00 0,58 0,34 9 PRUEBA F 4,69 3,1 5,35 F F 0,05 F 0,01 * (varianzas desiguales) PRUEBA t Estadístico t 0,21 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,16 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 3,01 NS Como se muestra en la tabla 46 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la hipótesis Hi existe diferencia significativa entre varianzas y para la prueba t (comparación de medias) se acepta la Ho no existe diferencia significativa entre medias. Alimento 3 Especificación: min14% proteína 96 Tabla 47.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 3 Alimento 3 T431R2GB Fecha 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 27/07/2015 N° Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x S S2 GL % PROTEINA % PROTEINA Proveedor PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO Lote 464577 464577 464577 464577 464577 464577 464577 464577 464577 464577 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 14,85 14,69 14,58 14,88 14,80 14,75 14,65 14,63 14,52 14,63 14,70 0,12 0,01 9 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 15,20 15,69 14,74 15,28 15,60 14,77 14,89 15,23 15,02 15,15 15,16 0,32 0,0 9 PRUEBA F 7,28 3,18 5,35 F= F 0,05 = F 0,01 = ** (varianzas desiguales) PRUEBA t Estadístico t -4,25 Valor crítico de t (dos colas) 2,20 Valor crítico de t (dos colas) 3,11 * Como se muestra en la tabla 47 para la prueba F (comparación de varianzas) para la prueba t (comparación de medias) se acepta la hipótesis Hi, para varianzas existe diferencia altamente significativa y para medias existe diferencia significativa. Interpretación de resultados: Se realizó la comparación en productos terminados con una valor medio de proteína de 10 - 20 % los productos analizados dentro de este rango fueron : Alimento 1 (T114R1I0), Alimento 2 97 (T321R2GB), Alimento 3 (T431R2GB) a las 3 muestras se aplicó una prueba F (contraste de dos colas ) que permitió comparar varianzas resultando para el Alimento 1 varianzas iguales, por lo tanto existe precisión en los resultados obtenidos, en la muestra Alimento 2 las varianzas difieren, por lo tanto no existe precisión en los resultados obtenidos, para el Alimento 3 las varianzas son diferentes por lo tanto no existe precisión en los resultados obtenidos, al aplicar la prueba t (contraste de dos colas) para comparar medias experimentales de los métodos en la muestra Alimento 1 las medias no son iguales por lo tanto los resultados obtenidos no son exactos, para Alimento 2 las medias son iguales existe exactitud en los resultados obtenidos , en la Muestra Alimento 3 las medias no son iguales no existe exactitud en los resultados obtenidos por los dos métodos. Tabla 48.Promedio de Productos Terminados 10 - 20% de Proteína PT T114R1IO T321R2GB T431R2GB % Proteína (especificaciones) Mín 18 Mín 18 Mín 14 Promedio % Proteína Método Dumas AOAC Método Kjeldahl 992.15, AOAC 988,05 AOAC modificado 990.03 20,43 19,93 18,04 18,00 14,70 15,16 Tabla 49.Resultados de Productos Terminados 10 - 20 % de Proteína Promedio % Proteína PT T114R1IO Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 21,11 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 19,55 T114R1IO 20,17 19,37 T114R1IO 20,94 19,82 T114R1IO 20,14 19,70 T114R1IO 20,52 20,84 T114R1IO 19,75 19,67 T114R1IO 20,65 20,12 T114R1IO 19,98 19,74 T114R1IO T114R1IO T321R2GB T321R2GB T321R2GB T321R2GB 20,72 20,32 18,02 17,81 18,05 17,78 20,57 19,88 18,09 17,13 18,19 19,37 98 T321R2GB T321R2GB T321R2GB T321R2GB T321R2GB T321R2GB T431R2GB 18,11 17,93 18,72 18,15 17,96 17,88 14,85 17,58 17,59 18,07 17,98 17,99 18,00 15,20 T431R2GB 14,69 15,69 T431R2GB 14,58 14,74 T431R2GB 14,88 15,28 T431R2GB 14,80 15,60 T431R2GB 14,75 14,77 T431R2GB 14,65 14,89 T431R2GB 14,63 15,23 T431R2GB 14,52 15,02 T431R2GB 14,63 15,15 Se aplicó un diseño factorial A x B (análisis de dos factores con varias muestras por grupos), para determinar cuál es la variable que influye en el resultado A: muestras (Alimento 1-2-3) B: métodos (Dumas, Kjeldahl) Tabla 50. ANOVA Productos terminados 10 - 20% de Proteína ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Grados Promedio variacione Suma de de de los Probabilida s cuadrados libertad cuadrados F d 905,43 Muestra 278,52 2 139,26 ** 0,00 (A) Método 0,01 1 0,01 0,09 0,77 (B) Interacció 2,32 2 1,16 7,53* 0,00 n AxB Dentro del 8,31 54 0,15 grupo 289,15 59 Total Se plantearon las siguientes hipótesis H0A : Efecto de muestra (A)= 0 HiA: Efecto de muestra (A) ≠0 99 Valor crítico para F Valor crítico para F 3,17 5,02 4,02 7,13 3,17 5,02 H0B : Efecto de método (B) = 0 Hi B: Efecto de método (B) ≠0 H0AB : muestra × método (AB) = 0 HiAB: muestra × método (AB) ≠0 Se acepta la hipótesis HOA existe una influencia altamente significativa del tipo de muestra en los resultados obtenidos, el método es influenciado por este tipo de muestra existe una interacción entre el método y la muestra, siendo los dos o al menos uno de los métodos diferente en este rango de % de proteína Grafica 4. Gráfica de Dispersión DUMAS vs Kjeldahl PT 10 - 20 % Proteína GRÁFICA DE DISPERSIÓN DE LA CORRELACIÓN DUMAS VS KJELDAHL METODO DUMAS 22,00 20,00 18,00 16,00 y = 1,6536x0,8248 R² = 0,9506 14,00 12,00 10,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 METODO KJELDAHL Ecuación para productos terminados 10 - 20% proteína y = 1,6536x0,8248 Ecuación 17. Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína R² = 0,9506 r = 0.9750** r.95 = 0,306 r.99 = 0,423 (valor teórico ver Anexo 6) Para productos terminados con un porcentaje de proteína entre 10 a 20 % existe una correlación de tipo potencial, altamente significativa se acepta la H1 H0:No existe correlación entre métodos ∄ 100 ∃ H1: Existe correlación entre métodos Alimento 4 Especificación: Máx.41 % proteína Tabla 51.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 4 ALIMENTO 4 T115M2GB Fecha N° Muestra 27/07/2015 1 27/07/2015 2 27/07/2015 3 27/07/2015 4 27/07/2015 5 27/07/2015 6 27/07/2015 7 27/07/2015 8 27/07/2015 9 27/07/2015 10 x S S2 GL Proveedor PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO PUEMBO Lote 464574 464574 464574 464574 464574 464574 464574 464574 464574 464574 % PROTEINA % PROTEINA Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 37,94 37,36 37,65 38,34 37,51 38,03 37,32 37,72 37,26 37,25 37,64 0,37 0,14 9 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 38,79 40,64 39,10 39,03 39,28 39,42 38,49 37,03 39,03 37,08 38,79 1,07 1,15 9 PRUEBA F 8,43 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 ** (varianzas desiguales) PRUEBA t Estadístico t -3,21 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,20 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 3,11 * Como se muestra en la tabla 51 para la prueba F (comparación de varianzas) para la prueba t (comparación de medias) se acepta la hipótesis Hi existe diferencia significativa entre varianzas y medias. 101 Alimento 5 Especificación: min33% proteína Tabla 52.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 5 ALIMENTO 5 T324M2GB Fecha 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 N° Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x S S2 GL % PROTEINA % PROTEINA Proveedor DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN Lote 464945 464945 464945 464945 464945 464945 464945 464945 464945 464945 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 35,44 34,41 34,61 34,26 33,98 34,37 34,51 34,37 35,35 34,29 34,56 0,47 0,22 9 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 33,63 33,01 33,90 33,31 34,20 33,16 33,52 33,61 34,01 34,02 33,64 0,40 0,16 9 PRUEBA F 0,71 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 NS (varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t 4,74 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 ** Como se muestra en la tabla 52 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la Ho no existe diferencia significativa entre varianzas, para la prueba t (comparación de medias) se acepta la hipótesis Hi existe diferencia significativa entre medias. Alimento 6 Especificación: min21 % proteína 102 Tabla 53.Comparación de métodos Kjeldahl y Dumas para alimento 6 ALIMENTO 6 T628Z2A1 Fecha 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 28/07/2015 N° Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Proveedor DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN DURAN x S S2 GL % PROTEINA Lote 140435640 140435640 140435640 140435640 140435640 140435640 140435640 140435640 140435640 140435640 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 23,56 23,62 23,27 24,23 23,62 23,85 24,32 24,29 24,10 24,11 23,90 0,36 0,13 9 % PROTEINA Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 23,32 23,06 23,15 23,59 23,32 23,67 23,36 22,40 22,55 23,09 23,15 0,41 0,17 9 PRUEBA F 1,27 3,18 5,35 F F 0,05 F 0,01 NS (varianzas iguales) PRUEBA t Estadístico t 4,33 Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,10 Valor crítico de t (dos colas) 0,01 2,88 * Como se muestra en la tabla 53 para la prueba F (comparación de varianzas) se acepta la Ho no existe diferencia significativa entre varianzas, para la prueba t (comparación de medias) se acepta la hipótesis Hi existe diferencia significativa entre medias. Interpretación de resultados: Al comparar productos terminados con una valor alto de proteína de > 20 % los productos analizados dentro de este rango fueron : Alimento 4 (T115M2GB), Alimento 5 (T324M2GB), 103 Alimento 6 (T628Z2A1) a las 3 muestras se aplicó una prueba F (contraste de dos colas ) que permitió comparar varianzas resultando para el Alimento 4 varianzas diferentes, por lo tanto no existe precisión en los resultados obtenidos, en las muestras Alimento 5 y 6 las varianzas son iguales, por lo tanto existe precisión en los resultados obtenidos, al aplicar la prueba t (contraste de dos colas) que se realizó para comparar medias experimentales de los métodos en las muestras Alimento 4, 5 y 6 las medias no son iguales por lo tanto los resultados obtenidos por los dos métodos no son exactos Tabla 54.Promedio de Productos Terminados >20% de Proteína PT T115M2GB T324M2GB T628Z2A1 % Proteína (especificaciones) Mín. 37 Mín. 18 Mín. 21 Promedio % Proteína Método Kjeldahl Método Dumas AOAC 988,05 AOAC 992.15, modificado AOAC 990.03 37,64 38,79 34,56 33,64 23,90 23,15 Tabla 55. Resultados de Productos Terminados >20 % de Proteína Promedio % Proteína PT T115M2GB Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 37,94 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 38,79 T115M2GB 37,36 40,64 T115M2GB 37,65 39,10 T115M2GB 38,34 39,03 T115M2GB 37,51 39,28 T115M2GB 38,03 39,42 T115M2GB 37,32 38,49 T115M2GB 37,72 37,03 T115M2GB T115M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB T324M2GB 37,26 37,25 35,44 34,41 34,61 34,26 33,98 34,37 34,51 34,37 35,35 34,29 39,03 37,08 33,63 33,01 33,90 33,31 34,20 33,16 33,52 33,61 34,01 34,02 104 Comentado [P1]: Promedio % Proteína PT T628Z2A1 Método Kjeldahl AOAC 988,05 modificado 23,56 Método Dumas AOAC 992.15, AOAC 990.03 23,32 T628Z2A2 23,62 23,06 T628Z2A3 23,27 23,15 T628Z2A4 24,23 23,59 T628Z2A5 23,62 23,32 T628Z2A6 23,85 23,67 T628Z2A7 24,32 23,36 T628Z2A8 24,29 22,40 T628Z2A9 24,10 22,55 T628Z2A10 24,11 23,09 Comentado [P1]: Se aplicó un análisis de dos factores con varias muestras por grupos, para determinar cuál es la variable que influye en el resultado A: muestras (Alimento 4-5-6) B: métodos (Dumas, Kjeldahl) Tabla 56.ANOVA Productos terminados > 20% de Proteína ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de Grados las de Promedio variacione Suma de liberta de los s cuadrados d cuadrados F Probabilidad Muestra 2296,70 2 1148,35 3500,80** 0,00 (A) Método 0,45 1 0,45 1,36 0,25 (B) Interacció 13,25 2 6,62 20,19* 0,00 n AxB Dentro del 17,71 54 0,33 grupo 2328,10 59 Total Se plantearon las siguientes hipótesis: 105 Valor crítico para F0,05 Valor crítico para F0,01 3,17 5,02 4,02 7,13 3,17 5,02 H0A : Efecto de muestra (A)= 0 HiA: Efecto de muestra (A) ≠0 H0B : Efecto de método (B) = 0 Hi B: Efecto de método(B) ≠0 H0AB : muestra × método (AB) = 0 HiAB: muestra × método (AB) ≠0 Se acepta la hipótesis HOAexiste una influencia altamente significativa del tipo de muestra en los resultados obtenidos, el método es influenciado por este tipo de muestra existe una interacción entre el método y la muestra, siendo los dos o al menos uno de los métodos diferente en este rango de % de proteína Grafica 5. Gráfica de Dispersión DUMAS vs Kjeldahl PT> 20 % Proteína GRÁFICA DE DISPERSIÓN DE LA CORRELACIÓN DUMAS VS KJELDAHL MÉTODO DUMAS 45,00 40,00 35,00 30,00 y = 9,5937e0,0368x R² = 0,9852 25,00 20,00 20,00 25,00 30,00 35,00 MÉTODO KJELDAHL Ecuación para productos terminados >20% proteína y = 9,5937e0,0368x Ecuación 18. Ecuación correlación MP 10 - 20 % proteína R² = 0,9852 r = 0,9925** r.95 = 0,306 r.99 = 0,423 (valor teórico ver Anexo 6 ) 106 40,00 Para productos terminados con un porcentaje de proteína > 20 % existe una correlación de tipo exponencial , altamente significativa se acepta la H1 H0: No existe correlación entre métodos ∄ H1: Existe correlación entre métodos ∃ 107 CAPITULO V 1. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.1 Conclusiones Las materias primas maíz, afrecho de cerveza, harina de pescado, pasta de soya, analizados en el mes de enero del 2014, presentan alta diferencia significativa en los resultados obtenidos por los dos métodos. Se comprobó exactitud y precisión en los métodos Kjeldahl y Dumas para análisis de proteína empleando una muestra de referencia AAFCO la cual se analizó en 2 laboratorios acreditados, se aplicó una prueba F y t de comparación de varianzas y medias respectivamente, lo que permitió determinar que los métodos comparados presentan precisión (varianzas iguales) y exactitud (medias iguales). Comparados los métodos Dumas (AOAC 992.15, AOAC 990.03) y Kjeldahl (AOAC988.05 modificado) para determinación de proteína en 9 materias primas y 6 productos terminados, correspondientes a la fecha de 06/07/2015, se pudo hallar evidencia de errores sistemáticos, pudo observarse que hay una influencia altamente significativa del tipo de muestra, además hay una interacción significativa entre el método y muestra. El análisis de regresión en la comparación de cantidades determinadas de proteína por los métodos Kjeldahl y Dumas muestra que existe alta correlación entre estas dos técnicas, sin embargo para diferentes tipos de matrices pudo observarse que no se encuentra un modelo de correlación lineal entre variables, además las ecuaciones de mejor ajuste halladas son de tipo potencial, polinómico e incluso logarítmico. Al no hallarse un modelo matemático único, todavía no se puede usar cualquiera de ellos para propósitos de predicción, optimización o control, siendo necesario determinar las causas del error sistemático detectado. Según la (FAO.org, 2015) se debe tomar en cuenta que el método Kjeldahl no determina el contenido de nitrógeno N2 existente en forma inorgánica ya que este se encuentra en niveles muy bajos, esto sería motivo de que ciertos valores obtenidos por el método Kjeldahl presenten diferencias no significativas comparadas con los resultados obtenidos por el método Dumas. 108 5.2. Recomendaciones Es de gran importancia en el análisis de proteína el TMP (tamaño medio de partícula) de cada muestra, mientras menor es el tamaño de partícula, más fiables son los resultados obtenidos, se recomienda un estudio de la influencia del TMP en análisis por combustión y por digestión principalmente en maíz, trigo y pasta de soya. Se recomienda, por optimización de tiempo y recursos económicos, el uso del método Dumas en el análisis de nitrógeno. Se debe realizar un mayor ajuste y calibración de los equipos usados en los métodos de Kjeldahl y Dumas de acuerdo al tipo de matriz, ya que, como se ha observado en esta investigación, se ha encontrado evidencia de errores de tipo aleatorio y sistemático en el análisis de nitrógeno (y proteína) que no permiten una buena correlación entre los dos métodos. Es importante también minimizar las fuentes de error aleatorio y sistemático, por ejemplo se deben controlar variables como temperatura de digestión, combustión y destilación de los diferentes procesos de cada método, además deben medirse con la mayor exactitud posible tiempos de operación, entrenamiento de analistas, calidad de reactivos, material volumétrico usado y demás fuentes de incertidumbre. 109 3.2.3 BIBLIOGRAFIA Ecuador Exporta. (2013). Obtenido de http://www.ecuadorexporta.org/productos_down/perfil_producto_alimentos_balanceados5 40.pdf AAFCO. (Enero de 2015). Association of American Feed Control Officials. 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Universidad de Cordoba, Departamento de Produccion Animal, Aula Virtual. Obtenido de https://www.uco.es/zootecniaygestion/menu.php?tema=148 111 ANEXOS Anexo1. Planes de muestreo 112 113 114 115 Anexo 2 AAFCO etiquetas 201328 Swine Grower 201327. Corn Gluten meal 116 Anexo 3. Procedimiento determinación método Kjeldahl 117 Anexo 4. Procedimiento determinación método Dumas 118 Anexo 4. Procedimiento determinación método Dumas 119 120 Anexo 4. Procedimiento determinación método Dumas Anexo 4. Procedimiento determinación método Dumas 121 Anexo 5. Resultados AFFCO laboratorios acreditados 122 Anexo 5. Resultados AFFCO laboratorios acreditados 123 Anexo 5. Resultados AFFCO laboratorios acreditados 124 125
