Utilización de un extracto alcohólico de Neem
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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Agrarias Escuela de Agronomía Utilización de un extracto alcohólico de Neem (Azadirachta indica A. Juss.) para el control de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae). Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero Agrónomo Luisa Lorena Cecilia Contreras Núñez Valdivia – Chile 2011 PROFESOR PATROCINANTE: ____________________________________ Maritza Reyes C. Ing. Agrónomo, M. Sc. Dr. Cs. Agr. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. PROFESORES INFORMANTES: ____________________________________ Miguel Neira C. Ing. Agrónomo. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. ___________________________________ Laura Böhm S. Ing. Agrónomo. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Le dedico esta memoria de titulo a mi querido padre Alfonso Contreras Schweinitz Sin duda el tiempo que estuviste junto a nosotros nos dejo gratos momentos para recordarte por siempre. Siempre estarás en mi corazón. Como no dejar unas palabras de agradecimiento a mis amigos y seres queridos que estuvieron junto a mí en todo este tiempo. Gracias a mi madre que la amo infinitamente por apoyarme siempre en todas mis decisiones y por el amor y compromiso hacia todos sus hijos. Los valores inculcados por una madre son la base de nuestro “ser”. A mis hermanos Mauricio y Alejandro les agradezco su apoyo, alegría, respeto y también los malos momentos que hemos vivido juntos, sin duda nos fortalecieron e hicieron personas con ganas de ser lo que queramos ser. Mis más sinceros sentimientos de gratitud a mi tío Edgardo y mi primo Juan Carlos quienes se preocuparon y me apoyaron durante todos estos años, fue una importante fuente de aliento y confianza para mí. Por último, pero no menos importante, quiero agradecerle a todos mis grandes y queridos amigos, con los cuales viví tantos momentos coloquiales a lo largo de estos años, a algunos los conozco desde siempre y a otros hace unos cuantos años pero sin duda hemos forjado una amistad que perdurara en el tiempo. Me faltarían hojas para dedicarle unas palabras a cada uno de ustedes, pero creo que este párrafo resume gran parte de mi forma de ser y de cómo creo ver la vida. Es mi forma de agradecerles su inconmensurable aprecio y apoyo. En especial para: Sara, Pía, Dayana, Mona, Rodrigo (tatita), Pato, Nanda, Diego, Marce, Dani, Dino, Feña, Karla, Paulina (peñi) y Gabi. “Que nada te detenga de ser y vivir como quieras vivir… Que todo lo que buscas en este planeta lo encuentres en el tiempo justo de tu vida… Que todo lo que sientes se exprese de la forma más pura y sin duda todos los que te rodean verán la grandeza de tu ser de la forma que yo la veo”. Luisa Lorena Cecilia Contreras Núñez. i INDICE DE MATERIAS Capítulo Página RESUMEN 1 SUMMARY 2 1 INTRODUCCIÓN 3 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 2.1 Galleria mellonella L. 5 2.1.1 Morfología 5 2.1.2 Ciclo biológico 6 2.1.3 Daño causado por Galleria mellonella L. 8 2.2 Formas de control 10 2.2.1 Control aplicado 10 2.2.2 Control biológico 11 2.3 Azadirachta indica A. Juss. 13 2.3.1 Características morfológicas 14 2.3.2 Propiedades y utilización 15 2.4 Extracto alcohólico de Neem 16 2.4.1 Elaboración 16 ii 2.4.2 Modo de acción 17 3 MATERIAL Y MÉTODOS 20 3.1 Lugar del ensayo 20 3.2 Material biológico 20 3.3 Material de laboratorio 20 3.4 Dieta 20 3.5 Diseño experimental 22 3.6 Metodología 22 3.7 Evaluaciones realizadas 23 3.7.1 Alimentación 23 3.7.2 Desarrollo 24 3.7.3 Mortalidad 24 3.7.4 Efectos sub letales 24 3.8 Análisis estadístico 24 4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 26 4.1 Efecto de distintas concentraciones de Neem-X® en la conducta alimenticia de larvas de Galleria mellonella 4.2 Efecto de distintas concentraciones de Neem-X® en el desarrollo de Galleria mellonella 4.3 26 29 Efecto de distintas concentraciones de Neem-X® sobre la mortalidad de Galleria mellonella 32 iii 4.4 Efectos subletales de distintas concentraciones del extracto NeemX® sobre Galleria mellonella 34 5 CONCLUSIONES 37 6 BIBLIOGRAFÍA 38 7 ANEXOS 42 iv INDICE DE CUADROS Cuadro 1 Página Distribución del número y porcentaje, nacional y regional, de apicultores que observaron polilla de la cera durante la temporada 2005 9 2 Cantidad de azadiractina obtenida utilizando distintos solventes 17 3 Sensibilidad conductual de los insectos a la azadiractina 18 4 Ingredientes para la elaboración de 1 Kg. de dieta para larvas de Galleria mellonella 5 21 Concentraciones de azadiractina utilizadas como tratamientos sobre Galleria mellonella L. 23 v INDICE DE FIGURAS Figura Página 1 Ciclo biológico de Galleria mellonella L. 2 Ciclo estacional de Galleria mellonella L. en la IX región de la 7 Araucania, Chile, obtenido de acuerdo a la sumatoria grados días (promedio 4 años de observaciones: 2000 a 2003) 3 8 Porcentajes de mortalidad larval bajo la influencia individual de biopesticidas tratados en combinación con H. indica sobre Galleria mellonella 13 4 Follaje (a) y fruto (b) de Azadirachta indica A. Juss 15 5 Elaboración de la dieta utilizada en el ensayo 21 6 Porcentaje de alimentación de larvas de Galleria mellonella L. alimentadas con dieta que incorpora distintas concentraciones de azadiractina, durante los primeros cinco días del ensayo 7 26 Porcentaje de alimentación durante el día doce, desde el establecimiento del ensayo, en larvas de Galleria mellonella tratadas con distintas concentraciones de azadiractina 8 Conducta atípica en la alimentación de las larvas de Galleria mellonella tratadas con distintas concentraciones de azadiractina 9 27 Desarrollo del ciclo de Galleria mellonella a la tercera semana desde 28 vi el inicio del ensayo con diferentes concentraciones de azadiractina 10 Emergencia de adultos transcurridas cinco semanas desde el inicio del ensayo proveniente de larvas tratadas con distintas concentraciones de azadiractina 11 33 Fertilidad de Galleria mellonella a partir de larvas alimentadas con dieta con diferentes concentraciones de azadiractina incorporada 13 31 Mortalidad corregida de adultos de Galleria mellonella provenientes de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina 12 29 34 Fecundidad de Galleria mellonella a partir de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina 35 vii INDICE DE ANEXOS Anexo 1 Página Mortalidad expresada en porcentaje de adultos de Galleria mellonella provenientes de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina 2 Cantidad de huevos puestos por adultos de Galleria mellonella provenientes de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina 3 42 42 Cantidad de larvas eclosionadas de huevos puestos por adultos de Galleria mellonella provenientes de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina 43 1 RESUMEN En el presente trabajo se determinó la acción insecticida, anti alimentaria, inhibidora del crecimiento y causante de efectos subletales del extracto de Neem-X® sobre la polilla mayor de la cera Galleria mellonella L. que es una importante plaga en colonias de Apis mellifera L. atacando los panales de las colmenas almacenadas causando daños una temporada tras otra. Se evaluaron distintas concentraciones del extracto alcohólico de Neem sobre la alimentación, desarrollo, mortalidad, fecundidad y fertilidad del insecto. La metodología utilizada consistió en la crianza de larvas de Galleria mellonella en laboratorio alimentadas con dieta artificial y con incorporación de distintas concentraciones del extracto de Neem-X® (3,75 ppm; 7,5 ppm; 15 ppm; 30 ppm y 60 ppm de ingrediente activo) bajo condiciones controladas de temperatura (28 ºC ± 2ºC) y fotoperiodo (0 horas luz y 24 horas de oscuridad) observando los efectos producidos por el extracto de Neem-X® en el desarrollo del ciclo del insecto a través del tiempo. La utilización de diferentes concentraciones del ingrediente activo (azadiractina) del extracto de Neem-X® produjo una disminución en el porcentaje de alimentación de las larvas tratadas con las mayores dosis. El desarrollo del ciclo de Galleria mellonella evaluado (larva, pupa y adulto) fue más prolongado en los tratamientos con mayores dosis de azadiractina, sin embargo la emergencia de adultos no fue afectada, observándose en todos los tratamientos un porcentaje similar de insectos. El producto no tuvo efectos en la mortalidad del estado de larva, pero si hubo mortalidad en el estado adulto. Se observó un efecto negativo en la fertilidad y fecundidad de Galleria mellonella a medida que la concentración de azadiractina aumentaba, expresándose en un menor número de huevos y una menor eclosión. 2 SUMMARY The following study determined the action of the insecticide, anti-alimentary, inhibitory of growth and the cause of sublethal effects of Neem-X® extract over the great wax moth Galleria mellonella L. which is one of the main plague on Apis mellifera L. colonies attacking stored combs of hives, causing damage season after season, we evaluated different concentrations of the alcoholic extract of Neem-X® over the alimentation, development, mortality, fecundity and fertility of the insect. The methodology of work consisted in the breeding of Galleria mellonella larvae under laboratory conditions and fed with an artificial diet including different concentrations of Neem-X® (3.75ppm, 7.5 ppm, 15 ppm, 30 ppm and 60 ppm of azadirachtin which is the active ingredient) under controlled temperature (28 ºC ± 2 ºC) and photoperiod (0 hours light and 24 hours dark) observing the effects of the Neem-X® extract in the development cycle of the insect over time. The use of different concentrations of the active ingredient (azadirachtin) of Neem-X® produced a decrease on the feeding percentage in the larvae treated with the higher doses. The development of the cycle of Galleria mellonella evaluated (larvae, pupa and adult) was longer in treatments with higher doses of azadirachtin, but the adult emergency was not affected observing in all treatments a similar percentage of insects. The product had no effect over mortality in larval stages, but effects did exist in adult individuals. It was observed a effect on fertility and fecundity of Galleria mellonella as the concentration of azadirachtin increased which was expressed in a lower number and also in the lower eggs eclosion. 3 1 INTRODUCCIÓN La sanidad es uno de los factores más importantes para el logro de una buena producción en cualquier actividad agropecuaria. La apicultura no escapa a esta regla, ya que son numerosas las enfermedades que afectan a las abejas en sus diferentes estados, debilitando las poblaciones en las colmenas. Es fundamental conocer la enfermedad y al agente causal de ésta, con el fin de evitarla o controlarla utilizando medidas de manejo que aseguren colmenas sanas y por lo tanto una buena producción. Se denominan enemigos o antagonistas de las abejas, a aquellos organismos que en asociación con éstas ocasionan daños en los panales, como la polilla mayor de la cera (Galleria mellonella L.), o alteran el comportamiento de las abejas, como el piojo de las abejas (Braula coeca Nitzch). La polilla mayor de la cera es considerada uno de los mayores antagonistas de las abejas, ya que en su fase larvaria destruye de forma significativa los panales y se encuentra distribuida en todas las regiones de mundo donde se practica la apicultura. El control de la polilla mayor de la cera está enfocado básicamente en la prevención de su establecimiento en las colmenas, aunque existen numerosos productos químicos o naturales que son efectivos contra el insecto, como lo son las aplicaciones de concentrados bacterianos y los extractos naturales de plantas o árboles, que poseen cualidades insecticidas. El árbol de Neem (Azadirachta indica A.Juss.), corresponde a una de las principales fuentes de extractos vegetales, siendo materia de numerosos estudios científicos en medicina, industria y agricultura. Hasta ahora distintas formulaciones de extractos de este árbol han sido evaluados contra más de 500 especies de insectos y ha sido utilizado como pesticida en casi todos los cultivos del mundo. 4 Debido a la buena eficacia mostrada por los derivados de este árbol en distintos insectos, su aplicación en el control de Galleria mellonella es una interesante manera de avalar su utilización como bioinsecticida. En esta investigación se planteó como hipótesis que el extracto alcohólico Neem-X® posee cualidades insecticidas, inhibidoras del crecimiento, anti alimentarias y causa efectos sub letales en la polilla mayor de la cera. Como objetivo general se planteó evaluar la acción del extracto alcohólico Neem-X® sobre la alimentación, desarrollo y mortalidad de Galleria mellonella L. Los objetivos específicos de este estudio fueron: Analizar los efectos producidos en la alimentación de larvas de G. mellonella al utilizar distintas concentraciones de Neem-X® en una dieta artificial. Evaluar el efecto de distintas concentraciones de Neem-X® sobre el desarrollo de G. mellonella. Analizar la mortalidad producida durante el ciclo de vida de G. mellonella expuesta a distintas concentraciones de Neem-X®. Evaluar los efectos subletales en la polilla mayor de la cera, a través del análisis de fertilidad y fecundidad de los adultos emergidos de los tratamientos con distintas concentraciones de Neem-X®. 5 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 Galleria mellonella L. Esta polilla pertenece al orden Lepidoptera, familia Pyralidae. Las hembras son mariposas de hábitos nocturnos, de color gris, longitud comprendida entre 8 y 17 mm; su envergadura alar varía entre 14 y 38 mm (LLORENTE, 2004). Según WILLIAMS (1990), la polilla mayor de la cera es considerada un insecto útil, ya que sus larvas son comercializadas en Estados Unidos y Europa para la alimentación de peces, además de ser utilizadas en estudios de fisiología, toxicología, patología y como huésped artificial para la propagación masiva de parásitos de dípteros e himenópteros. Sin embargo, la polilla mayor de la cera es por lejos la mayor plaga de productos apícolas, causando cada año mayores pérdidas a los apicultores. Este insecto infecta colonias de Apis cerana F., A. dorsata F. y A. mellifera L. (Morse y Laigo ,1968; Shimanuki ,1981 y Sigha ,1982 citado por WILLIAMS, 1990). 2.1.1 Morfología. WILLIAMS (1990), señala que los huevos, por lo general, son blancos y lisos, algunos están cubiertos con fecas oscuras, usualmente miden de 12 a 20 mm de longitud y cerca de 5 a 7 mm de diámetro. Una larva recién salida del huevo tiene el cuerpo de color blanco cremoso que se vuelve gris a gris oscuro en la parte dorsal y lateral a medida que avanza en sus estadíos; puede alcanzar hasta 28 mm de longitud y pesar sobre 240 mg (Hase ,1926 citado por WILLIAMS, 1990). 6 Según NEIRA (2006), posteriormente las larvas presentan una coloración amarillo grisáceo, con dos manchas en el primer anillo del tórax. La cabeza es de color rojizo. Durante el último estado larval, el insecto procede a inmovilizarse dentro de un capullo de color blanco, de unos 2,5 cm de longitud que se denomina estado de pupa, en el cual, permanece por unos 20 días. La larva, previo a su ubicación definitiva, se ancla entre los cuadros y el alza de la colmena, lo que produce un debilitamiento de los materiales del marco (NEIRA y MANQUIAN, 2008). Los adultos son de contextura pesada y bastante pequeños. Las hembras alcanzan una longitud de 20 mm y pueden pesar hasta 169 mg. Los machos son consideradamente más pequeños y pueden ser distinguidos de las hembras por su color más ligero y el claro margen apical dentado de sus alas delanteras. También, los palpos labiales de las hembras se extienden hacia adelante, dándole a la cabeza una apariencia puntiaguda. Las dos terceras partes de las alas delanteras de los adultos de ambos sexos son más bien uniformemente oscuras, pero las posteriores tienen aéreas claras y oscuras intercaladas irregularmente con manchas desiguales. Dorsalmente, el tórax y cabeza son de color claro. Sin embargo, el tamaño y color de ambos sexos difieren considerablemente de acuerdo a la dieta de las larvas. Los adultos de G. mellonella pueden ser más pequeños que algunas polillas menores de la cera, si las larvas se han desarrollado lentamente como resultado de una escasa alimentación y bajas temperaturas (WILLIAMS, 1990). 2.1.2 Ciclo biológico. El comportamiento reproductivo de G. mellonella no es el típico de lepidópteros, porque es la hembra quien busca al macho. El macho libera una feromona y cortos pulsos ultrasónicos para atraer a las hembras (WILLIAMS, 1990). El insecto pasa por los estados de huevo, larva, pupa y adulto. Su ciclo biológico es variable, en óptimas condiciones de temperatura (26-38ºC) puede durar entre 39 a 60 días y hasta cinco meses con temperaturas más bajas (NEIRA, 2006). 7 WILLIAMS (1990), señala que la hembra comienza a poner huevos aproximadamente cuatro a diez días después de haber emergido. Puede poner hasta 1.500 huevos en su corta vida de siete a quince días (NEIRA, 2006). Los huevos se desarrollan rápidamente con una temperatura cálida y sostenida (2930ºC) y comienzan a incubar tres a cinco días después de la oviposición, y puede extenderse hasta 30 días, a 18ºC. Cortas exposiciones a temperaturas extremas (46ºC por 70 minutos, o a bajo 0ºC por 270 minutos) causarán 100% de mortalidad de huevos (WILLIAMS, 1990). La etapa larval puede extenderse desde un mes, hasta un máximo de cinco meses, dependiendo de la temperatura ambiente. Concluido este periodo, la polilla inicia el estado de pupa, en el que permanece alrededor de una semana, inmóvil dentro de un capullo (el que ha confeccionado en su último estado larval), y que es de un definido color blanco (NEIRA, 2006). Adulto pone entre 400 a 1800 huevos Incubación 8 – 10 días (29º - 30ºC) 30 días a 18ºC Alimentación de larvas y galerías en los panales Fecundación 7 – 28 días inmóvil en el capullo FIGURA 1 Ciclo biológico de Galleria mellonella L. FUENTE: adaptado de NEIRA (2006). 8 Según PARRA et al. (2006), Galleria mellonella se comporta como un insecto multiivoltino con cuatro generaciones por temporada en la IX región de La Araucanía, Chile, logrando completar una generación al alcanzar los 400 grados días, con una temperatura umbral de desarrollo de 15º C. FIGURA 2 Ciclo estacional de Galleria mellonella L. en la IX región de La Araucanía, Chile, obtenido de acuerdo a la sumatoria grados días (promedio 4 años de observaciones: 2000 a 2003). FUENTE: PARRA et al. (2006). 2.1.3 Daño causado por G. mellonella L. Este Lepidóptero causa todos los años grandes estragos, al dañar los panales de las colmenas. La hembra adulta entra a la colmena y deja sus huevos en lugares inaccesibles para las abejas. Las lavas emergen y hacen túneles en los panales al alimentarse de polen, néctar, miel o cera (NEIRA, 2006). Las dos especies de polillas de la cera, G. mellonella y Achroia grisella (estado adulto) no participan en la destrucción de los panales, pues se lo impiden sus mandíbulas que están atrofiadas (LLORENTE, 2004). 9 Según Nilsen y Brister (1977), citado por WILLIAMS (1990), durante los meses más cálidos del año, cuando las poblaciones de G.mellonella son más grandes, comúnmente se observa una aparente normal emergencia de las obreras y zánganos de los panales en el núcleo de fecundación. Después de que se han liberado de la celda operculada, las abejas quedan atrapadas en ellas por hilos de seda, que han sido fabricados por las larvas de las polillas y puestos en la base de las celdillas. Esta condición es llamada galeriosis. La mayor proporción de los daños causados por las polillas de la cera ocurre en aquel material que hallándose fuera de uso, ha sido guardado sin tener en cuenta las precauciones necesarias, tendientes a preservarlo del ataque de la polilla. Según el grado de intensidad de la invasión, variarán los daños experimentados por la colonia, pudiendo llegar, en circunstancias extremas, al abandono de la colmena por parte de las abejas (NEIRA, 2006). Según la Universidad Austral de Chile (2006), citado por ZAMORANO (2009), el principal daño a los productos almacenados es el que ocurre en la cera, la cual representa entre un 30 % a un 50 % del costo de cada colmena. Además señala la incidencia en Chile que tiene este insecto en las colmenas de los apicultores, la cual se puede observar en el Cuadro 1. CUADRO 1 Distribución del número y porcentaje, nacional y regional, de apicultores que observaron polilla de la cera durante la temporada 2005. Observó polilla de la cera en la temporada 2005 SI NO TOTAL Región N % N % N IV 21 72 8 28 29 V 6 27 16 73 22 VI 21 64 12 36 33 VII 14 37 24 63 38 VIII 32 63 19 37 51 IX 14 40 21 60 35 X 11 23 36 77 47 RM 1 4 26 96 27 TOTAL 120 43 162 57 282 FUENTE: Universidad Austral de Chile (2006), citado por ZAMORANO (2009). % 100 100 100 100 100 100 100 100 100 10 LLORENTE (2004), señala que en las colmenas se pueden detectar signos evidentes que corroboran la presencia de estos enemigos de las abejas como son la presencia de polillas adultas, larvas en distinto estado de desarrollo, deyecciones y cuadros destruidos. 2.2 Formas de control Según NEIRA y MANQUIAN (2008), estos insectos no causan daño económico cuando la población de abejas es normal, ya que éstas se encargan de removerlas del colmenar, sacándolas del panal, tirándolas al piso y desde allí al exterior a través de la piquera. Según MID ATLANTIC APICULTURAL RESEARCH & EXTENSION CONSORTIUM (MAAREC) (2000), es necesario estar alerta para evitar que su ataque sea severo ya que estos insectos están bien adaptados para sobrevivir alrededor de las colonias, por lo cual los apicultores no son capaces de combatirlas en un 100%. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO) (2006), señala que para prevenir o controlar la infestación de estos lepidópteros en los panales almacenados o productos de la colmena que sean vulnerables, se pueden tomar varias medidas. Existen métodos técnicos, físicos, biológicos y químicos (Burges, 1978; Charriere y Imodorf, 1997; Feldlaufer et al, 1998 y Kochansky, 2002 citados por NEIRA, 2006). 2.2.1 Control aplicado. Según la Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados Unidos de Norteamérica , para el control de productos de la colmena que son consumidos por los humanos, están aprobadas las fumigaciones con dióxido de carbono, aplicaciones de calor y congelación (WILLIAMS, 1990). 11 LLORENTE (2004) señala que para proteger los materiales a utilizar en la próxima temporada, estos pueden ser desinfectados con productos químicos tales como: - El dibromuro de metilo, es uno de los compuestos más utilizados, aunque es toxico para el hombre y no posee cualidades ovicidas. - Sulfuro de carbono, que es un producto eficaz, pero no destruye los huevos de la polilla. Su uso es restrictivo, ya que, en su estado líquido es inflamable y el gas que produce es explosivo y sus emanaciones son toxicas para el hombre. - Anhídrido sulfuroso, que corresponde a un gas que se desprende de la combustión del azufre, no es ovicida pero se destruyen larvas y adultos. Posee el inconveniente de ser corrosivo para los materiales metálicos de la colmena. Otro compuesto utilizado es el paradiclorobenzol, el cual libera vapores lentamente por un largo período y es de sencilla aplicación. No es tóxico para las abejas y en el hombre tiene una baja toxicidad, aunque si se pone en contacto con la cera ésta se destruye (NEIRA, 2006). Sin importar el producto a utilizar, es necesario airear los materiales por lo menos por 48 horas antes de ser introducidos en la colmena. Además, ninguno de los estadíos de estas polillas sobreviven a temperaturas superiores a 46 ºC por 80 minutos, por lo cual se pueden utilizar tratamientos que no incluyen químicos (LLORENTE, 2004). 2.2.2 Control biológico. Hasta ahora no se ha desarrollado una trampa efectiva contra la polilla de la cera, ya que las hembras no sólo se guían por las feromonas de los machos, sino que también usan el ultrasonido. Además, se han encontrado componentes de las hormonas femeninas en las ceras de abejas, lo que podría explicar cómo encuentran la cera para oviponer (MAAREC, 2000). Según FAO (2006), una vez que la infestación en las colonias se concreta, no existen medidas quimioterapéuticas fáciles o económicas. Una posibilidad es la utilización de 12 una solución acuosa de Bacillus thuringiensis L. la cual es asperjada en los panales donde permanece por varias semanas. En Chile y más específicamente en la IX Región de La Araucanía se detectó la presencia del controlador biológico Bracon hebetor Say (Hymenoptera: Braconidae) el cual es un parasitoide cosmopolita que ataca larvas de lepidópteros (PARRA et al., 2006). También es factible la utilización de un producto natural como el propóleo. Este corresponde a una sustancia resinosa colectada por las abejas la que es mezclada con cera y secreciones de las glándulas salivales. Los distintos componentes de los propóleos, son producidos por las plantas para evitar infecciones en heridas en diferentes partes de las plantas y para ayudar a controlar insectos o ácaros parásitos. Las abejas lo utilizan como un pegamento multiuso y para proteger la colmena de infecciones. Concentraciones de un 4% de propóleo son letales para las etapas más tempranas y aborta el desarrollo pupal en las etapas más tardías de G. mellonella (GAREDEW et al., 2004). SANKAR et al. (2009), estudiaron en laboratorio una serie de controladores biológicos, contra la polilla mayor de la cera como el nemátodo Heterorhabditis indica, tres hongos antagonistas a insectos (Metarhizum anisopliae, Beauveria bassiana y Trichoderma viride), una bacteria antagonista (Pseudomonas fluorescens) y dos biopesticidas basados en el árbol Azadirachta indica (Neem y Nimor). Los resultados que obtuvieron se pueden apreciar en la Figura 3, en la cual se indica que la aplicación del nemátodo solo logro un 100 % de mortalidad y la combinación del nemátodo con los otros biopesticidas varió, siendo las más altas aquellas con los extractos de A. indica (90 % con Neem, 92 % con Nimor), un 90 % de mortalidad con P. fluorescens. La acción individual de los distintos biopesticidas fue de un 40% con B. bassiana, 24% con M. anisopliae, 16% con T. viride, 10% con P. fluorescens y Neem, y sólo un 8% con Nimor. 13 FIGURA 3 Porcentajes de mortalidad larval bajo la influencia individual de biopesticidas tratados en combinación con H. indica sobre Galleria mellonella. FUENTE: SANKAR et al. (2009). 2.3 Azadirachta indica A. Juss El origen de este árbol no es claro, según Gamble (1902) citado por KOUL y WAHAB (2004), el árbol de Neem de la familia Meliaceae, puede haberse originado en los bosques de Karnataka en el sur de la India o en los bosque Myanmar (Birmania). Las plantas han sido largamente estudiadas, lo que ha permitido su utilización en la industria, medicina y agricultura, el árbol de Neem no escapa a estos estudios. Hasta ahora preparados de Neem han sido evaluados contra más de 500 especies de insectos y más de 400 son susceptibles en concentraciones diferentes. En el mundo están disponibles muchas formulaciones comerciales y este árbol ha empezado a ser conocido como un modelo biopesticida botánico y que ha sido utilizado como pesticida prácticamente en casi todos los cultivos, además de ser eficaz en el control de ectoparásitos en la crianza animal (KOUL y WAHAB, 2004). 14 2.3.1 Características morfológicas. Es un árbol siempreverde de tamaño mediano a grande, con un fuste corto y recto, corteza arrugada de color marrón oscuro a gris, de copa densa y redondeada con hojas pinadas. Las flores se presentan en panículas estrechas y ramificadas de 5 a 15 cm de largo; las flores individualmente están compuestas de un cáliz de cinco lóbulos redondeados y de color verde pálido, cinco pétalos redondeados, oblongos y blancos de 0,5 cm de largo y 10 estambres unidos en un tubo y un pistilo con un ovario redondeado y un estilo delgado (Figura 4). En su área de distribución natural florece entre marzo y mayo (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994). Las frutas son drupas en forma de aceitunas de 1,0 a 2,0 cm de largo, lisas de un color amarillo verdoso a amarillo en la madurez (junio a agosto en Asia), por lo general, poseen una sola semilla elíptica rodeada de una pulpa dulce con un fuerte olor semejante al ajo. La producción de frutas comienza cuando los árboles tienen entre tres a cinco años de edad y alcanzan su máxima producción a los 10 años. Lo usual es encontrar entre 4.000 y 5.000 semillas por kilogramo de fruta y son diseminadas principalmente por las aves (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994). La germinación es epigea y no requiere de escarificación, aunque limpiando la semilla se pueden lograr porcentajes de germinación de entre un 60 a 85 % y su viabilidad no supera los dos meses. Su propagación vegetativa se logra por medio de estacas de ramas y se obtienen mejores resultados cuando las estacas son tratadas con ácido indolbutírico (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994). 15 (a) (b) FIGURA 4 Follaje (a) y fruto (b) de Azadirachta indica A. Juss. FUENTE: PARROTTA y CHATURVEDI (1994). 2.3.2 Propiedades y utilización. El parecido que poseen los componentes de los distintos extractos de Neem con las hormonas naturales de los insectos, hacen que éstos los absorban como si fueran las hormonas reales, afectando el normal funcionamiento del insecto, bloqueando su sistema endocrino (RAMOS, s/f). De las diferentes partes (semillas y hojas) de Azadirachta indica se han aislado e identificado cerca de 100 compuestos, de los cuales 70 de ellos de origen triterpénico destacan por su actividad insecticida y en especial la azadiractina (Koul et al., 1990. citado por BURBALLA et al., 1995). La azadiractina es el principal componente biológicamente activo del Neem y es extraída de las semillas maduras del árbol, posee una potente acción anti alimentaria y propiedades reguladoras del crecimiento (MORDUE, 1997). 16 Según RAMOS s/f, el efecto de los extractos de Neem sobre varios insectos es bien conocido, actuando de diferentes maneras, así puede generar destrucción e inhibición en el desarrollo de huevos, larvas o crisálidas; bloquear la metamorfosis de larvas o ninfas; desarticular el apareamiento y comunicación sexual; repeler a larvas y adultos; impide la postura de huevos; esteriliza a adultos; impide la alimentación; inhibe la formación de quitina; impide que se realicen las mudas, necesarias para entrar en la siguiente etapa de desarrollo, por lo que actúa como regulador de crecimiento de los insectos. 2.4 Extracto alcohólico de Neem Debido a la complejidad estructural de la azadiractina, las formulaciones naturales están basadas en extractos alcohólicos, acuosos y en aceites extraídos de las semillas del árbol, lo que hace variar considerablemente las formulaciones comerciales existentes. En Estados Unidos existen formulaciones enriquecidas con azadiractina registradas por la Agencia de Protección del Medioambiente (Ascher, 1993. citado por BURBALLA et al., 1995). 2.4.1 Elaboración. Las hojas y en especial los granos de la semilla del árbol de Neem y sus extractos, han sido utilizados para el control de varios insectos plaga en India, sin embargo existe la necesidad de estandarizar los productos naturales. La comunidad internacional ha denominado al ingrediente activo de los extractos de Neem como azadiractina, existiendo varios tipos, la más común es la de tipo A y el contenido de ésta y de otros tipos varía según la calidad de la semilla y en especial con el tipo de extracción realizada para obtener la formulación final (KLEEBERG, 2004). Basándose en los tres procesos básicos de extracción, todo ellos generan la aparición de ciertas materias activas que varían según el proceso de extracción que se realice (RAMOS s/f). En el Cuadro 2 se observa la cantidad de azadiractina obtenida utilizando diferentes solventes. 17 CUADRO 2 Cantidad de azadiractina obtenida utilizando distintos solventes. Solvente usado Azadiractina encontrada (g 10 L-1) Etanol (95%) 2,80 Metanol / Agua (85:15) 2,60 Metanol 2,19 Acetona 0,74 Etil - éter 1,28 FUENTE: adaptado de RAMOS s/f. Según KLEEBERG (2004), debido a que existen diversas formulaciones no registradas comercialmente, la FAO ha documentado especificaciones para los productos del Neem, dividiéndolos en dos grupos, aquellos que están hechos a base de aceites y los que son ricos en azadiractina libres de aceite. Estas especificaciones fueron creadas para que las autoridades de cualquier país tomen las medidas necesarias en cuanto a calidad y demanda de pesticidas. 2.4.2 Modo de acción. La azadiractina actúa en insectos interfiriendo en el sistema neuroendocrino, afectando la producción de hormona juvenil y ecdisona. Además tiene efectos en la conducta alimenticia, oviposición, fecundidad y desarrollo de los insectos (Remblod, 1989 y Schmutterer, 1985, 1988, 1990. citados por BURBALLA et al., 1995). MORDUE (1997), señala que existen dos categorías de efectos anti alimentarios producidos por la azadiractina, el primero se relaciona con los quimiorreceptores del gusto en las patas y aparato bucal de los insectos, en donde estimula la disuasión de células e inhibe las células fagoestimulantes en los receptores. La segunda categoría 18 (anorexia) dice relación con el efecto fisiológico tóxico producido por la ingestión de la azadiractina. Las larvas de Lepidópteros son el orden de insectos conductualmente más sensible a la azadiractina; los coleópteros, hemípteros e himenópteros son moderadamente sensibles y los ortópteros tienen un amplio rango de sensibilidad, dependiendo de la especie. En el Cuadro 3 se presentan los rangos de azadiractina, a los cuales los distintos ordenes de insectos son sensibles, expresado en su ED50 correspondiente, que es la dosis en la cual el 50% de la población se ve efectivamente afectada con el compuesto. CUADRO 3 Sensibilidad conductual de los insectos a la azadiractina. ORDEN ED50 (ppm) Lepidoptera < 0.001 - 50 Coleoptera 100 – 500 Hemiptera 100 – 500 Hymenoptera 100 – 500 Orthoptera 0.001 -- > 1000 FUENTE: MORDUE (1997). Los efectos fisiológicos directos producidos por la azadiractina se basan en su acción sobre tejidos en específico y de manera indirecta a través del sistema endocrino. Estos efectos son más consistentes entre especies, con un promedio de ED 50 de aproximadamente 2 µg de azadiractina, por gramo de peso corporal (MORDUE, 1997). Los extractos de Neem, en general no muestran efectos tóxicos para los enemigos naturales de las plagas u otros organismos benéficos, mamíferos o humanos (Schmutterer, 1990 y Larson, 1987. citados por BURBALLA et al., 1995). La azadiractina es fotosensible, es decir, se degrada rápidamente por los rayos ultravioleta, es afectada por las altas temperaturas, la humedad y soluciones levemente 19 alcalinas, por lo que este compuesto no persiste en el ambiente (Jarvis et al 1998. citados por CHARBONNEAU et al. 2007). Sauphanor et al. (1995) citados por RAGURAMAN et al. (2004), estudiaron el efecto de un formulado comercial de Neem, el NeemAzal-F, en el insecto polífago Forficula auricularia L. (Dermaptera: Forficulidae), llamada vulgarmente tijereta, que es una peste en huertos de duraznero y damasco causando serios daños, al alimentarse de los frutos maduros. En dicho estudio se observó que al utilizar dosis de entre 25, 50 o 250 ppm, en ninfas de segundo estadío del insecto, éstas no pudieron completar su metamorfosis y murieron. También se observó una disminución en la alimentación y una prolongación de los estadíos. En condiciones de campo en un huerto de duraznero aplicando en forma asperjada el producto NeemAzal-F en una concentración de 50 ppm se observó una reducción de la población de un 70%. 20 3 MATERIAL Y MÉTODOS 3.1 Lugar del ensayo El ensayo se realizó en el Laboratorio de Entomología del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile. 3.2 Material biológico Las 180 larvas neonatas de Galleria mellonella, utilizadas para este estudio se obtuvieron de una muestra de huevos facilitados por el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) Quilamapu, Chillán, Chile. El insecticida biológico, correspondió a un formulado comercial llamado Neem-X®, que contiene un 0,4 % de azadiractina como ingrediente activo. 3.3 Material de laboratorio Se utilizó una cámara con ambiente controlado (temperatura y fotoperiodo), 180 frascos de 8 mL para cada larva y todos los materiales de laboratorio básicos necesarios para el adecuado desarrollo del experimento. 3.4 Dieta La formulación de la dieta es una adaptación de la utilizada en el INIA Quilamapu, para la mantención de larvas de Galleria mellonella, que a su vez es una adaptación de la formula descrita por SINGH y MOORE (1985). Los ingredientes para su elaboración se describen en el Cuadro 4. 21 CUADRO 4 Ingredientes para la elaboración de 1 Kg de dieta para larvas de Galleria mellonella. COMPONENTES CANTIDAD UNIDAD Nestum 3 cereales® 187 g Nestum avena y miel® 187 g Germen de trigo 120 g Azúcar granulada 148 g Glicerina líquida 219 mL Jarabe Pantiban 1,2 mL Agua destilada 138 mL FUENTE: Elaboración propia La dieta fue elaborada de la siguiente manera: en un recipiente se disolvió azúcar con agua destilada recién hervida, a la cual se la agregó glicerina y vitaminas en forma de jarabe, agitando constantemente para lograr una mezcla homogénea. En un recipiente independiente se mezclaron los dos tipos de Nestum® y el germen de trigo; luego se mezclaron ambos preparados (sólidos y líquidos), hasta obtener una mezcla ligada y medianamente dura. El proceso de elaboración de la dieta se observa en la Figura 5. FIGURA 5. Elaboración de la dieta utilizada en el ensayo. 22 3.5. Diseño experimental Se utilizó un diseño estadístico completamente al azar, que incluyó seis tratamientos, correspondientes a distintas dosis del extracto de Neem-X®, más un tratamiento control consistente en agua destilada. La unidad experimental estuvo constituida por 10 larvas de G. mellonella, con tres repeticiones utilizándose un total de 180 larvas. 3.6 Metodología Para alcanzar los objetivos propuestos se utilizó la siguiente metodología: Para cada tratamiento, seis en total, se elaboró una cantidad específica de dieta, consistente en 120 g por tratamiento. Este cálculo se realizó en base a la cantidad de dieta requerida para cada unidad experimental y sus respectivas repeticiones. Durante el proceso de elaboración de la dieta, para cada tratamiento, se procedió a reemplazar una parte del agua destilada por el concentrado del extracto de Neem.-X®, El que se obtuvo mediante la dilución en cascada de una solución madre. Según CHILE, ASOCIACIÓN NACIONAL DE FABRICANTES E IMPORTADORES DE PRODUCTOS AGRICOLAS (AFIPA) (2006), la dosis recomendada de Neem-X® para lepidópteros está en un rango de 2,5 a 5 mL L-1 de producto comercial, por lo que se consideró un promedio de 3,75 mL L-1 el cual se expresó en partes por millón de ingrediente activo, para estandarizar los resultados. Los tratamientos consistieron en dos concentraciones más bajas y más altas a partir de la concentración promedio recomendada, aumentando o disminuyendo a una razón de dos. Los distintos tratamientos y dosis se describen en el Cuadro 5. 23 CUADRO 5 Concentraciones de azadiractina utilizadas como tratamientos sobre Galleria mellonella L. TRATAMIENTO CONCENTRACIÓN (ppm) T0 0 T1 3,75 T2 7,5 T3 15 T4 30 T5 60 FUENTE: Elaboración propia. Luego de la elaboración de las dietas, con sus respectivas concentraciones de azadiractina, se procedió a introducir aproximadamente 4 g, en frascos de 8 mL. Posteriormente se introdujeron las larvas en sus respectivos frascos, los que luego de ser cerrados se ubicaron en una cámara con una temperatura de 28 ºC ± 2 ºC, una humedad relativa de 50 ± 5% y con un fotoperiodo de 0 horas luz y 24 horas de oscuridad para simular el ambiente de una colmena natural. 3.7 Evaluaciones realizadas A continuación se describen las evaluaciones realizadas durante el ensayo. 3.7.1 Alimentación. Durante los primeros cinco días desde la puesta en marcha del experimento, se observó diariamente si las larvas se estaban alimentando. Se consideró como indicador de alimentación la presencia de las larvas dentro de la dieta, considerándose como no alimentándose, cuando se encontraban en la superficie de la dieta o en las paredes del frasco. 24 3.7.2 Desarrollo. Durante un periodo de cinco semanas y con un intervalo de siete días se observó la proporción de individuos en cada estado (de larva a pupa y posteriormente a adulto). 3.7.3 Mortalidad. Luego de establecido el ensayo se observó la mortalidad de las larvas una vez por semana mientras se encontraban en esta estado, determinando la movilidad de éstas. Posteriormente se siguió observando a los distintos individuos hasta su estado adulto considerándose como muertos a aquellos que no llegaron a emerger de su capullo. 3.7.4 Efectos sub letales. Para determinar dichos efectos se procedió a ubicar cinco parejas de adultos por tratamiento en las mismas condiciones ambientales antes mencionadas, cada pareja en un frasco mediano en el cual se agrego una cinta de papel mantequilla y se procedió a sellar cada frasco. La elección de las parejas de adultos fue hecha al azar y para determinar el sexo de cada individuo se considero el tamaño de cada individuo, el cual es mayor en las hembras, la coloración del insecto, la cual es más tenue en los machos y el margen apical de las alas delanteras, el cual en los machos es dentado (WILLIAMS, 1990). Posteriormente y por un periodo de tres días se observó la postura de huevos de cada pareja para determinar diferencias entre los tratamientos en cuanto a su fertilidad. Por último y también por un periodo de tres días se observó la eclosión de dichos huevos para evaluar la fecundidad de los adultos apareados. 3.8 Análisis estadístico Los datos obtenidos de la mortalidad de larvas fueron corregidos de acuerdo a Schneider y Orelli (BAKR, 2002). La fórmula de corrección de mortalidad se señala a continuación. Mortalidad corregida = (((M/T)*100) - %MC) (100 - %MC)*100 Donde: 25 M= número de larvas muertas con insecticida. T= número total de larvas tratadas con insecticida. %MC= porcentaje de mortalidad de larvas tratadas sólo con el solvente. Todas las variables en estudio (mortalidad, desarrollo, alimentación y efectos sub letales) fueron sometidas a un análisis de varianza (ANDEVA). Y para detectar diferencias entre los tratamientos, las medias fueron comparadas a través de la prueba de Fisher (FPLSD) con una significación del 5% Para determinar las diferencias entre la proporción de los distintos estados se utilizó la Prueba de G (SOKAL y ROHLF, 1995). Los datos fueron procesados con el programa estadístico computacional STATISTICA 7.1. 26 4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4.1 Efecto de distintas concentraciones de Neem-X® en la conducta alimenticia de larvas de Galleria mellonella. En los primeros cuatro días del ensayo no se encontraron diferencias entre los tratamientos con distintas concentraciones de azadiractina y el control. Al quinto día si se observaron diferencias significativas entre el tratamiento control 0 ppm de azadiractina y los tratamientos con 30 ppm y 60 ppm de azadiractina, como se puede observar en la Figura 6. *a ab cd c FIGURA 6 Porcentaje de alimentación de larvas de Galleria mellonella L. alimentadas con dieta que incorpora distintas concentraciones de azadiractina, durante los primeros cinco días del ensayo. * Letras distintas en los puntos indican diferencia significativa según Fisher (F = 2,707; p < 0,001). Los valores graficados corresponden al promedio ± la desviación estándar. 27 Estos resultados no son del todo concordantes con los encontrados por otros autores como BURBALLA et al. (1995), quienes utilizando distintos productos a base de extractos de Neem en la polilla de la manzana Cydia pomonella L., que también es un lepidóptero, pero de una familia distinta a la polilla de la cera, observaron una rápida acción repelente de los distintos productos en los primeros tres días desde el inicio de su ensayo. Sin embargo, DE GROOTE (2010), utilizando el Neem-X® en Cydia pomonella, observó la misma reacción durante los primeros cinco días después de iniciado el ensayo, no encontrando diferencias en la alimentación entre los tratamientos, por lo que no se produjo un efecto repelente inmediato. Por otra parte, en el día doce desde el inicio del ensayo si se observó un cambio en el comportamiento alimenticio de las larvas de Galleria mellonella, presentándose una clara disminución en el porcentaje de alimentación de los tratamientos con Neem-X ® en relación al tratamiento control (Figura 7) siendo el tratamiento con la dosis más alta de azadiractina (60 ppm) el que presento una mayor disminución con un 33,3%. *a bc c FIGURA 7 Porcentaje de alimentación durante el día doce, desde el establecimiento del ensayo, en larvas de Galleria mellonella tratadas con distintas concentraciones de azadiractina. * Letras distintas sobre las columnas indican diferencias significativas de acuerdo a prueba de Fisher (F = 2,707; p < 0,001). Los valores graficados corresponden al promedio ± la desviación estándar. 28 Estos resultados permiten afirmar que si bien no existió un efecto repelente inmediato, si se observó una clara acción negativa sobre el comportamiento alimenticio en el tiempo. Además de la disminución en el porcentaje de alimentación, se observaron larvas consumiendo las tapas de los frascos (Figura 8). FIGURA 8 Conducta atípica en la alimentación de las larvas de Galleria mellonella tratadas con distintas concentraciones de azadiractina. Este comportamiento se observó en la mayoría de los tratamientos con extracto de NeemX®, no presentándose en el control. CHARBONNEAU et al (2007), observaron la misma conducta luego de dos semanas al utilizar, en una concentración de 420 y 280 mg gֿ ¹ un aceite de Neem en larvas de Galleria mellonella. Esto es explicado por la acción de los componentes del Neem como la azadiractina que produce un efecto antialimentario. 29 4.2 Efecto de distintas concentraciones de Neem-X® en el desarrollo de Galleria mellonella. Transcurridas tres semanas desde el inicio del ensayo, se procedió a observar el avance del ciclo de desarrollo de Galleria mellonella. En el estado de capullo, sólo se diferenció el tratamiento que contenía 30 ppm de azadiractina, con un 26,7% de los individuos en este estado. Los demás tratamientos con azadiractina presentaban una proporción de individuos similar a la del control (Figura 9). En el estado de pupa se observaron diferencias, entre el tratamiento con 60 ppm de azadiractina y el control, alcanzando un 70% y un 33,3% de individuos en este estado respectivamente, el resto de los tratamientos obtuvo un porcentaje similar al control (Figura 9). a A a A a A b B b B b B ab B bc B a A b C *a A a A ab A a A bc C c B b B ab A FIGURA 9 Desarrollo del ciclo de Galleria mellonella a la tercera semana desde el inicio del ensayo con diferentes concentraciones de azadiractina. * Letras mayúsculas distintas indican diferencia significativa entre estados en un mismo tratamiento. Letras minúsculas distintas indican diferencia significativa entre estados en los distintos tratamientos (p < 0,05). Los valores graficados corresponden al promedio ± la desviación estándar. 30 Con respecto al desarrollo del ciclo de Galleria mellonella dentro de un mismo tratamiento, el control presentó una relación similar entre los estados de pupas y adultos y un menor porcentaje de capullos(13,3%), mientras aquellos con las dosis más bajas de azadiractina (3,75 ppm y 7,5 ppm) se comportaron de manera más normal, ya que, existió una mayor proporción de adultos que de pupas y capullos, excepto en el tratamiento 3,75 ppm de azadiractina donde la proporción de pupas (46,66%) fue mayor a la de adultos (43,33%) sin embargo esta diferencia no fue significativa. En los tratamientos con las dosis más altas la relación fue distinta, ya que, presentaron mayor proporción de pupas que de adultos encontrándose diferencias significativas en cada uno de los tratamientos, es decir, con 15 ppm de azadiractina se observó un 66,7% de pupas y un 20% de adultos, 30 ppm de azadiractina un 60% de pupas y un 19% de adultos y 60 ppm de azadiractina un 70% de pupas y un 10% de adultos. La permanencia más prolongada en el estado de pupa en los tratamientos con las dosis más altas de azadiractina, son corroborados por MORDUE (1997), el cual afirma que los efectos fisiológicos, como el bloqueo de las hormonas neurosecretoras del cerebro y el bloqueo o retraso de las hormonas de la muda (hormona juvenil y β ecdisona), que son las encargadas de inducir la metamorfosis al estado adulto, son producidos cuando la azadiractina está en contacto directo con los tejidos. Por otra parte, al observar la quinta semana desde el inicio del ensayo no se encontraron diferencias significativas entre los distintos tratamientos, en cuanto al porcentaje de individuos que alcanzaron el estado adulto, siendo el tratamiento control el que obtuvo el mayor porcentaje con un 96,7% (Figura 10). 31 c *abc bc ab bc c bc bc abc a a a FIGURA 10 Emergencia de adultos transcurridas cinco semanas desde el inicio del ensayo proveniente de larvas tratadas con distintas concentraciones de azadiractina. * Letras distintas sobre las barras indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba de Fisher (F = 1,474; p = 0,189304) Los valores graficados corresponden al promedio ± la desviación estándar. Estos resultados no son concordantes con los encontrados por otros autores como BURBALLA et al. (1995), quienes observaron un claro retraso en el desarrollo del ciclo del insecto en estudio (Cydia pomonella L.) utilizando un extracto de Neem incorporado en la dieta. CHARBONNEAU et al. (2007), también observaron en todos los tratamientos con incorporación de un aceite de Neem o cuando se inyectó azadiractina directamente a las larvas de Galleria mellonella, algunos individuos no lograron completar su ciclo. Estas diferencias pueden explicarse porque en dicho estudio las concentraciones de azadiractina utilizadas fueron significativamente más altas a las utilizadas en este ensayo, abarcando un rango de entre 4 ppm por inyección directa en las larvas hasta 70.000 ppm de azadiractina proveniente de un aceite de Neem. 32 4.3 Efecto de distintas concentraciones de Neem-X® sobre la mortalidad de Galleria mellonella. No existió mortalidad de larvas durante las dos primeras semanas del ensayo, salvo durante los primeros cinco días donde sólo una larva del tratamiento con 30 ppm de azadiractina fue encontrada muerta. Autores como SANKAR et al. 2009, utilizando dos productos comerciales como en Neem y Nimore encontraron un 10% y 8% de mortalidad de larvas de Galleria mellonella respectivamente, utilizando una concentración de azadiractina de 3,000 ppm en Neem y 1,500 ppm en Nimore. En el estudio realizado por CHARBONNEAU et al. (2007), donde se utilizaron distintas concentraciones de azadiractina pura y un aceite natural de Neem, observaron un mayor porcentaje de mortalidad de larvas llegando a un 100 % cuando se utilizó una inyección directa que contenía 4 ppm de azadiractina en las larvas de Galleria mellonella y un 100 % cuando se utilizo el aceite natural de Neem que contenía 70,000 ppm de azadiractina. Los porcentajes más bajos se obtuvieron cuando se utilizó azadiractina pura en una concentración de 200 ppm llegando a un 17 % de mortalidad y cuando se utilizó el aceite natural de Neem en concentraciones de 2.800 ppm, 14.000 ppm y 28000 ppm llegando a porcentajes de mortalidad de un 30%, 60% y 60% respectivamente. De acuerdo a esto para producir una adecuada mortalidad de larvas por ingestión, se requieren concentraciones mucho mayores. Por otra parte, si se encontró mortalidad en el estado adulto de Galleria mellonella (Figura 11), aunque no hubo diferencias significativas entre las distintas concentraciones durante las semanas tres, cuatro y cinco, pero si se encontró diferencia entre un mismo tratamiento durante las distintas semanas, como es el caso del tratamiento con 30 ppm de azadiractina (ANEXO 1). 33 *aB aB aB aB aAB aB a A a A FIGURA 11 Mortalidad corregida de adultos de Galleria mellonella provenientes de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina. *Letras minúsculas distintas indican diferencias significativas entre los distintos tratamientos, letras mayúsculas distintas indican diferencias significativas entre semanas en un mismo tratamiento de acuerdo a la prueba de Fisher (F = 0,507; p = 0,873). Los valores graficados corresponden al promedio ± la desviación estándar. Estos resultados no concuerdan con los encontrados por los autores anteriormente citados (SANKAR et al. 2009 y CHARBONNEAU et al. 2007) ya que en ambos ensayos no se observó mortalidad en los individuos que llegaron al estado adulto. La mortalidad de los insectos adultos encontrada en este ensayo puede explicarse como una consecuencia del retraso o alargamiento de los estados anteriores del desarrollo de Galleria mellonella debido al efecto en las hormona de la muda (β ecdisona) ya que se consideró como adultos muertos a aquéllos que no emergieron de sus pupas. 34 4.4 Efectos subletales de distintas concentraciones del extracto de Neem-X® sobre Galleria mellonella. Al evaluar el promedio de huevos de las cinco parejas de adultos de cada tratamiento (Figura 12), se observó una diferencia significativa entre el tratamiento control que alcanzó un promedio de 1126,4 huevos el primer día y los tratamientos con 15 ppm de azadiractina con 604,4 huevos el día dos y 205 huevos el día tres, tratamiento con 30 ppm de azadiractina que obtuvo un promedio de 286 huevos el día dos y 295,6 huevos el día tres y el tratamiento con 60 ppm de azadiractina que en el día tres promedio 212 huevos (ANEXO 2). *a ab ab bc cd cd cd cd FIGURA 12 Fertilidad de Galleria mellonella a partir de larvas alimentadas con dieta con diferentes concentraciones de azadiractina incorporada. *Letras distintas sobre las columnas indican diferencia significativa entre los distintos tratamientos de acuerdo a la prueba de Fisher (F = 26,1150; p = 0,001). Los valores graficados corresponden al promedio ± la desviación estándar. RIBA y MARTÍ (1996), observaron una disminución en la fertilidad de Nezara viridula L. (Hemiptera: Pentatomidae) al aplicar tópicamente diferentes concentraciones de azadiractina sobre ninfas del quinto estadío encontrando una clara disminución en el número de huevos puestos en relación al control. 35 CASTIGLIONI et al. (2002), señala que existe una reducción en el número de huevos puestos por hembra y por día en relación al control al tratar a Tetranychus urticae (KOCH) (Acari: Tetranychidae) con diferentes extractos acuosos y derivados de meliáceas, como las semillas del árbol de neem. a *abc ab a abc abc abc abc b abc abc ab abc c FIGURA 13 Fecundidad de Galleria mellonella a partir de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina. *Letras distintas sobre las columnas indican diferencia significativa (F = 2,7647; p = 0,006). Los valores graficados corresponden al promedio ± la desviación estándar. Como se observa en la Figura 13 existió un efecto del Neem-X® en la fecundidad de Galleria mellonella con diferencias entre el número total de huevos eclosionados entre los tratamientos control (0 ppm de azadiractina), 3,75 ppm de azadiractina y 7,5 ppm de azadiractina, que alcanzaron el mayor número de huevos eclosionados con un promedio de 60,6; 69,2 y73,5 huevos respectivamente y el tratamiento con 60 ppm de azadiractina que fue en el cual eclosionaron el menor número de huevos, con un promedio de 18,4 (ANEXO 3). 36 Por otra parte, también en la Figura 13 se observa que no existió diferencia entre los tratamientos, en el número de huevos eclosionados en el primer día, pero al tercer día si se observan diferencias entre los tratamientos. Estos resultados son concordantes con los encontrados por CASTIGLIONI et al. (2002), quienes encontraron una menor fecundidad entre los tratamientos, con respecto al control, en su ensayo con diferentes extractos acuosos y derivados de meliáceas como la Azadirachta indica. La azadiractina puede causar efectos tanto en los machos como las hembras en el proceso reproductivo, ya que se pueden degenerar los ovarios o reabsorber los huevos; la azadiractina interfiere en la síntesis de vitelógeno, tanto en hembras como machos lo que repercute en la formación del huevo y por ende se produce una menor fecundidad y esterilidad (Koul, 1984; Dorn et al., 1987; Schluter, 1987; Schmutterer, 1987; Rembold y Sieber, 1981; Tanzubil y McCaffrey, 1990 citados por MORDUE, 2004). 37 5 CONCLUSIONES - De acuerdo a los resultados logrados y en las condiciones del ensayo el extracto alcohólico Neem-X® produce efectos en la alimentación, desarrollo, mortalidad y causas efectas subletales sobre Galleria mellonella por los que se acepta la hipótesis plantaeada. - La utilización de diferentes concentraciones del ingrediente activo (azadiractina) del extracto Neem-X® produjo una disminución en el porcentaje de alimentación de las larvas tratadas con las mayores dosis, observándose además conductas atípicas en su alimentación. - El desarrollo del ciclo de Galleria mellonella (larva, pupa y adulto) fue más prolongado en los tratamientos con mayores dosis de azadiractina, sin embargo la emergencia de adultos no fue afectada, logrando emerger en todos los tratamientos un porcentaje similar de insectos. - El producto no mostró efectos en la mortalidad en el estado de larva del insecto, pero si existió mortalidad en el estado adulto (debido a lo mencionado en el punto anterior). - Se observó un efecto negativo de la azadiractina en la fertilidad y fecundidad de Galleria mellonella siendo éste mayor a medida que la concentración aumentaba. Esto se tradujo, en un menor número de huevos y a su vez en una menor eclosión de los mismos. 38 6 BIBLIOGRAFIA ASOCIACIÓN NACIONAL DE FABRICANTES E IMPORTADORES DE PRODUCTOS AGRICOLAS (AFIPA). 2006. Manual fitosanitario. AFIPA, Santiago, Chile. 1214 p. BAKR. A. 2002. Fórmula de corrección Schneider y Orelli. (On line). <http://www.ehabsoft.com/ldpline/onlinecontrol.htm> (30 jun. 2009). BURBALLA, A.; SARASÚA, M.; AVILLA, J. 1995. Alimentación, mortalidad y desarrollo de Cydia pomonella (L) y de Cacoecimorpha pronubana (Hübner) sobre dieta con extracto de Neem incorporado. Boletín de sanidad vegetal. Plagas (España). 21 (3): 425 – 437. CASTIGLIONI, E.; VENDRAMIN, J.; TAMAI, M. 2002. Evaluación del efecto tóxico de extractos acuosos y derivados de meliáceas sobre Tetranychus urticae (Koch) (Acari: Tetranychidae). Agociencia (Uruguay) 6 (2): 75 – 82. CHARBONNEAU, C.; COTÉ, R.; CHARPENTIER, G. 2007. 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Tratamientos (ppm) 0 3,75 7,5 15 30 60 semana 1 0 0 0 0 3,33 0 semana 2 0 0 3,33 0 3,33 0 semana 3 3,33 16,66 13,33 10 20 13,33 ANEXO 2 Cantidad de huevos puestos por adultos de Galleria mellonella provenientes de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina. Tratamientos (ppm) Día 1 Día 2 Día 3 0 1126,4 0 0 3,75 1039,8 0 0 7,5 0 1082,8 0 15 0 604,4 205 30 0 286 295,6 60 0 0 212 43 ANEXO 3 Cantidad de larvas eclosionadas de huevos puestos por adultos de Galleria mellonella provenientes de larvas tratadas con diferentes concentraciones de azadiractina. Tratamientos (ppm) 0 3,75 7,5 15 30 60 Día 1 27,2 12,4 25,2 12 11,2 18 Día 2 0 0 0 0,2 2,2 0 Día 3 33,4 56,8 48 15,4 14,8 0,4 TOTAL 60,6 69,2 73,2 27,6 28,2 18,4
