capitulo i - Instituto de Investigaciones Biotecnológicas

 P á g i n a | 2 A mi hija, Julia y a mis padres
P á g i n a | 3 Agradecimientos La realización de ésta Tesis doctoral fue una experiencia vital, intensa, en la que he compartido momentos y vivencias con un gran número de personas, que directa o indirectamente participaron del trabajo realizado. Por lo tanto quisiera mostrar mi agradecimiento de una manera general a todas las personas que han intervenido. Especialmente a mi director, el Dr. E. Albertó, por darme la oportunidad de realizar el trabajo de Tesis doctoral en su laboratorio. A mi Co Director, el Dr. Julio Zigadlo por sus consejos e insentivo; y a su grupo de investigación de la Catedra de Química Orgánica y Productos Naturales de la FCEFyN, UNC. Además: a la Dra. Valeria Nepote y al Dr. Ruben del Groso, del ICTA, IMVIB‐CONICET (UNC); a la Dra. Mirta Valentich del Instituto de Biología Celular y Embriología de la Facultad de Cs Médicas de la UNC; al Ing .Jorge Ringelet de la Cátedra de Fitoquímica de la Facultad de Cs Agropecuarias de la UNLP; a la Dra. Alicia Fernandez Cirelli y su grupo de investigación, Mariana Galicio y Diego Grassi, del Centro Transdiciplinario de Aguas (CETA), Facultad de Cs. Veterinarias de la UBA. También un agradecimiento muy ESPECIAL a mis amigos y compañeros del INTECH por todos los hermosos momentos compartidos durante estos años de trabajo, a Rosalía, Marina, Hernán, Cheta, Hugo, Carolina, Alet, Proli y en general a todos mis compañeros. A los residentes con quienes he compartido este último año, Mariana y Franco, Micheli, Solcito, Vale, Energi A DianaMaría, Jorge y Silvinita, mis vecinos de laboratorio… por los recreitos de charla y mate y al Dr. Santa María por sus consejos. A mis amigas de la Villa, Belen, Fuchi y la Negra. A la Flaca por la cama y el aguante cada vez que tenía que ir a trabajar a Córdoba. Por sobre todo, agradezco a mi hija Julia, por su comprensión en estas cuestiones de hacer ciencia y ser madre, por su espera durante este largo año, por acompañarme en cada momento y lugar durante todos los caminos recorridos, por su fuerza …. sin su apoyo todo este esfuerzo tal vez no haya sido posible…. Y finalmente a mis padres porque siempre pero siempre confiaron en mi y me apoyaron. Gracias a todos!! P á g i n a | 4 Resumen. En el presente trabajo se determinaron las condiciones óptimas para el cultivo intensivo sobre residuos lignocelulósicos de una especie de hongo silvestre comestible nunca antes cultivada, Polyporus tenuiculus. Se emplearon bolsas de sustrato, las cuales se incubaron a 25°C en oscuridad durante 60 días. Para inducir la fructificación, las bolsas se removieron y se expusieron a un fotoperíodo de 9 h de luz/15 de oscuridad a 20 °C y riego por aspersión. El aserrín de sauce resultó el sustrato más adecuado para el cultivo, principalmente cuando se utilizó como suplemento salvado de trigo (15 %) y harina de soja (5%), obteniendo una eficiencia biológica de 82 %. Además, se ensayaron como sustrato los desechos provenientes de la industria de los aceites esenciales. Se obtuvieron bajos rendimientos pero ejemplares de mayor peso y diámetro (5 a 6,5 cm.) sobre todo cuando se cultivaron en laurel. Se ensayó el cultivo sobre troncos de álamo y eucalipto obteniéndose rendimientos muy bajos. Nutricionalmente P. tenuiculus es rico en proteína y posee bajo contenido de grasa. La adición de suplementos al sustrato contribuyó al incremento del porcentaje de cenizas (6,6 %) y proteína (15,8‐15,4 %) y a un menor contenido de grasa (5,2‐5,7%), fibra (7,5‐8,3%) y carbohidratos (48, 2%) en los basidiocarpos. El uso de sustratos provenientes de la industria de los aceites esenciales incrementó el porcentaje de proteína (24‐32%) y cenizas (7,3‐8,5%) y disminuyó el contenido de carbohidratos (49‐50%). Dentro de la composición de ácidos grasos los insaturados fueron los predominantes. Se estableció el perfil de volátiles de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus, siendo el compuesto volátil mayoritario el 1‐octen‐3‐ol (38‐43,9%) responsable del aroma característico. Las muestras de hongos en general tuvieron aceptabilidad positiva por los consumidores, con resultados mayores a 5 y cercanos a la categoría 6 (me gusta ligeramente) de la escala hedónica de 9 puntos. El análisis sensorial de las muestras de hongos deshidratados cosechados de laurel y eucalipto tuvieron un incremento en la intensidad del color marrón, del gusto ácido, del sabor a “hongo” y de la gomosidad, mientras que percibieron una menor intensidad del gusto amargo y en la dureza. Se estudió la capacidad biodegradadora del hongo y se comprobó que el porcentaje de pérdida de materia seca de los bloques de aserrín de sauce se correlaciona con el incremento observado en la eficiencia biológica de cada sustrato, indicando mayor eficiencia de bioconversión en los sustratos suplementados. La acción de P. tenuiculus P á g i n a | 5 causó una disminución del 67,2 al 74,5 % de la celulosa, del 80,4 al 85,7 % de hemicelulosa y del 60,6 al 66,2 % de lignina al final del ciclo de cultivo. Fue posible la recuperación de terpenos presentes en los AE de los bloques de sustratos inoculados con P. tenuiculus y Pleurotus ostreatus confeccionados con desechos de plantas aromáticas provenientes de la industria. Ambas especies fueron capaces de producir tres compuestos mediante la biotransformación del 1,8‐cineol, dos de los tres compuestos identificados son el 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐
6‐ol y el 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ona. Finalmente, la biomasa deshidratada de P. tenuiculus demostró ser eficiente como biosorbente en la remoción de metales pesados de efluentes acuosos, siendo el Pb y el Cd los más retenidos. Palabras claves: Polyporus tenuiculus, cultivo intensivo, propiedades nutricionales, características organolépticas, biodegradación, biotransformación. P á g i n a | 6 ABREVIATURAS AEM: Agar Extracto de Malta APG : Agar Papa Glucosado CMC: Carboximetilcelulosa MN: Medio de Nobles PT: Paja de trigo PTs: Paja de trigo suplementada AS: Aserrín de sauce AS1‐3: aserrín de sauce suplementado PVC: Policloruro de vinilo ST: Shock térmico EL: Exposición a la luz SI: Sin inducción EB: Eficiencia biológica RT: Rendimiento total G1‐3: Grupo 1‐3 L: Laurus nobilis E: Eucalyptus cinerea OV: Origanum vulgare OxA: Origanum x applii ECa: Eucalyptus camaldulensis PA: Populus alba Eci: Eucalyptus cinerea (troncos) CF: cuerpos de fructificación AE: Aceite esencial át de C: Átomos de carbono NC: No conocido CG: Cromatografía gaseosa CG/EM: Cromatografía gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas IR: Índice de retención tr: Cantidad traza Po: Pleurotus ostreatus Pt: Polyporus tenuiculus NDF: Fibra de detergente neutro ADF: Fibra de detergente ácido FES: Fermentación en estado sólido P á g i n a | 7 ACP: Análisis de componentes principales CP1: Componente principal 1 CP2: Componente principal 2 P á g i n a | 8 1. INTRODUCCIÓN 13
1.1. Residuos agroindustriales …………………………………………………………………………………………………… 14
1.2. Los hongos Basidiomicetes: biodegradadores de los desechos lignocelulósicos. …………………… 18
1.3. Biotecnología ambiental …………………………………………………………………………………………………….. 21
1.4. Consumo, comercialización y cultivo de especies silvestres en Latinoamérica ……………………… 25
1.4.1. Hongos silvestres comestibles de valor económico en Argentina ……………………………………….. 26
1.5. Cultivo de hongos comestibles en Argentina ………………………………………………………………………... 28
1.5.1. Reseña histórica ………………………………………………………………………………………………………………. 28
1.5.2. Situación actual de la producción de hongos comestibles …………………………………………………. 28
1.5.3. Consumo de hongos comestibles en Argentina ………………………………………………………………… 30
1.5.4. Calidad nutricional de los hongos comestibles ………………………………………………………………….. 30
1.5.5. Compuestos volátiles: potencial uso para la producción de aromas y sabores …………………… 32
1.5.6. Importancia de la evaluación sensorial de los hongos comestibles ……………………………………. 21
1.6. Polyporus tenuiculus: una especie comestible no cultivada ………………………………………………….. 36
CAPÍTULO I: Desarrollo del cultivo intensivo de Polyporus tenuiculus
38
1. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………………………………………………. 39
2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Optimización del cultivo de Polyporus tenuiculus ………………………………………………………………... 41
2.1.1. Medios de cultivo ……………………………………………………………………………………………………………... 41
2.1.2. Cepas utilizadas ……………………………………………………………………………………………………………….. 41
2.1.3. Determinación de la temperatura de incubación del micelio …………………………………………….. 42
2.1.4. Análisis cualitativo de la actividad de enzimas lignocelulolíticas ……………………………………… 42
2.1.4.1. Actividad celulolítica …………………………………………………………………………………………………….. 42
2.1.4.2. Actividad ligninolítica: Decoloración de Poly R­478 ……………………………………………………….. 43
2.1.5. Cultivo utilizando sustratos tradicionales: paja de trigo y aserrín de sauce ……………………….. 43
2.1.5.1. Preparación del inóculo o “semilla ………………………………………………………………………………… 43
2.1.5.2. Formulado, preparación de sustratos y condiciones de incubación ………………………………… 44
2.1.5.3. Cultivo de cepas de Polyporus: diseño experimental y condiciones de fructificación ………... 45
2.1.5.4. Período de cosecha, rendimiento y otros parámetros analizados ……………………………………. 45
2.1.6. Uso de sustratos no tradicionales para el cultivo de P. tenuiculus: uso de residuos de plantas aromáticas utilizadas para la extracción de aceites esenciales ……………………………………… 46
2.1.6.1. Cepas utilizadas ……………………………………………………………………………………………………………. 46
2.1.6.2. Preparación del sustrato y condiciones de cultivo ………………………………………………………….. 47
2.1.6.3. Evaluación del rendimiento y calidad de fructificaciones obtenidas ……………………………….. 47
2.1.7. Cultivo de P. tenuiculus en troncos …………………………………………………………………………………… 48
P á g i n a | 9 2.1.7.1. Cepas utilizadas …………………………………………………………………………………………………………… 48
2.1.7.2. Preparación de troncos y condiciones de cultivo ……………………………………………………………. 48
2.1.7.3. Período de cosecha, rendimiento y otros parámetros analizados ……………………………………. 49
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Determinación de la temperatura de incubación del micelio ……………………………………………….. 51
3.2. Análisis cualitativo de actividad enzimas lignocelulolíticas …………………………………………………. 53
3.2.1. Análisis cualitativo de la actividad celulolítica …………………………………………………………………. 53
3.2.2. Análisis cualitativo de la actividad ligninolítica ………………………………………………………………... 55
3.3. CULTIVO …………………………………………………………………………………………………………………………….. 57
3.3.1. Selección de cepas de P. tenuiculus y efecto del sustrato en el rendimiento ……………………….. 57
3.3.2. Efecto del suplemento en el rendimiento …………………………………………………………………………... 59 3.3.3. Efecto de tratamientos de inducción en la precocidad y el rendimiento …………………………….. 60
3.3.4. Efecto del suplemento y tratamientos de inducción en las características de las fructificaciones …………………………………………………………………………………………………………………………. 63
3.3.5. Uso de residuos de la industria de los aceites esenciales como sustrato en el rendimiento de P. tenuiculus y P. ostreatus ………………………………………………………………………………………………………... 65
3.3.6. Efecto del uso de residuos de la industria de los aceites esenciales en la morfología de las fructificaciones …………………………………………………………………………………………………………………………. 68
3.3.7. Cultivo de P. tenuiculus en troncos …………………………………………………………………………………… 71
3.3.7.1. Cultivo sobre troncos de Populus alba y Eucalyptus camaldulensis y su efecto en el rendimiento ……………………………………………………………………………………………………………………………… 71
3.3.7.2. Efecto del cultivo en troncos en la morfología de las fructificaciones ……………………………… 73
3.3.7.3. Cultivo sobre troncos de Eucalyptus cinerea y su efecto en el rendimiento ……………………… 74
3.3.7.4. Efecto del cultivo en troncos en la morfología de las fructificaciones ……………………………… 75
4. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………………………………………….. 78
CAPÍTULO II: Calidad nutricional y composición de volátiles de Polyporus tenuiculus 80
1. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………………………………………………. 81
2. MATERIALES Y MÉTODOS 83
2.1. Evaluación de la calidad nutricional …………………………………………………………………………………… 83 2.1.1. Especies utilizadas …………………………………………………………………………………………………………… 83
2.1.2. Análisis proximal de la composición nutricional de P. tenuiculus cosechados de sustratos tradicionales y desechos de la industria de los aceites esenciales ………………………………………………. 83
2.2. Determinación de la composición de ácidos grasos de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus y P. ostreatus cultivados sobre desechos provenientes de la industria de los aceites esenciales …………………………………………………………………………………………………………………………………. 84
2.2.1. Extracción y esterificación de ácidos grasos de los cuerpos de fructificación …………………….. 84
2.2.2. Separación e Identificación de Ácidos Grasos por Cromatografía Gaseosa ………………………… 84
P á g i n a | 10 2.3. Evaluación de la composición de compuestos volátiles de cuerpos de fructificación ……………... 85
2.3.1. Especies utilizadas …………………………………………………………………………………………………………… 85
2.3.2. Análisis de volátiles de cuerpos de fructificación por CG­EM ……………………………………………... 85
2.4. Análisis estadístico ……………………………………………………………………………………………………………... 86
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 87
3.1. Evaluación de la composición nutricional …………………………………………………………………………… 87
3.1.1. Determinación de la composición nutricional de P. tenuiculus cosechados de sustratos tradicionales …………………………………………………………………………………………………………………………….. 87
3.1.2. Determinación de la composición nutricional de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados sobre sustratos provenientes de la industria de los aceites esenciales ………………………………………… 90
3.2. Determinación de la composición de ácidos grasos de las fructificaciones de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados sobre desechos de la industria de los aceites esenciales ………………………… 92
3.3. Evaluación de la composición de volátiles de cuerpos de fructificación cosechados a partir de sustratos tradicionales …………………………………………………………………………………………………………. 94
4. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………………………………………….. 99
CAPÍTULO III: Evaluación sensorial y cualidades organolépticas de P. tenuiculus 101
1. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………………………………………………. 102
2. MATERIALES Y MÉTODOS 104
2.1. Análisis descriptivo cuantitativo de la calidad sensorial de hongos deshidratados cosechados de diferentes sustratos ……………………………………………………………………………………………………………… 104
2.1.1 Muestras utilizadas …………………………………………………………………………………………………………... 104
2.1.2. Análisis sensorial de hongos deshidratados .................................................................................................. 104
2.1.2.1. Procedimiento ………………………………………………………………………………………………………………. 104
2.1.2.2. Entrenamiento ……………………………………………………………………………………………………………… 105
2.1.2.3. Evaluación de las muestras …………………………………………………………………………………………… 108
2.2. Prueba de aceptabilidad con consumidores ……………………………………………………………………….. 108
2.2.1. Muestras utilizadas ………………………………………………………………………………………………………….. 108
2.2.2. Prueba de aceptabilidad de hongos frescos ………………………………………………………………………. 109
2.2.2.1. Procedimiento ………………………………………………………………………………………………………………. 109
2.2.2.2. Preparación de las muestras …………………………………………………………………………………………. 109
2.2.2.3. Evaluación de las muestras …………………………………………………………………………………………… 110
2.2.3. Análisis estadístico …………………………………………………………………………………………………………... 111
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 112
3.1. Análisis descriptivo cuantitativo de la calidad sensorial de hongos deshidratados cosechados de diferentes sustratos ……………………………………………………………………………………………………………… 112
3.2. Prueba de aceptabilidad con consumidores ………………………………………………………………………… 118
3.2.1. Prueba de aceptabilidad de muestras frescas de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de P á g i n a | 11 paja de trigo, laurel y eucalipto ……………………………………………………………………………………… 118 3.2.2. Prueba de aceptabilidad de muestras frescas de P. tenuiculus, P. ostreatus y Agaricus bisporus ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 122
4. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………………………………………….. 127
CAPITULO IV: Biodegradación y biotransformación de los sustratos utilizados para el 129
cultivo 1. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………………………………………………. 130
2. MATERIALES Y MÉTODOS 132
2.1. Evaluación de la biodegradación en aserrín ………………………………………………………………………... 132
2.1.1. Cepa utilizada ………………………………………………………………………………………………………………….. 132
2.1.2. Sustratos utilizados …………………………………………………………………………………………………………. 132
2.1.3. Análisis de los cambios en la composición del sustrato ……………………………………………………… 132
2.2. Biotransformación de compuestos presentes en el sustrato utilizado para cultivo: uso de desechos de la industria de aceites esenciales ……………………………………………………………………………. 133
2.2.1. Cepas y sustratos utilizados ……………………………………………………………………………………………… 133
2.2.2. Evaluación de la biotransformación de terpenos presentes en los sustratos de plantas aromáticas empleados para cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus …………………………………………….. 133
2.2.2.1. Análisis de terpenos por CG …………………………………………………………………………………………… 134
2.2.2.2. Análisis de terpenos por CG­EM ...................................................................................................................... 134
2.3. Evaluar la capacidad biotransformadora de P. tenuiculus y P. ostreatus en medio de cultivo líquido utilizando terpenos ……………………………………………………………………………………………………….. 135
2.3.1. Preparación del medio de cultivo e inoculación de cepas ………………………………………………….. 135
2.3.3. Biotransformación de terpenos en medio líquido ……………………………………………………………… 136
2.3.4. Análisis e identificación de compuestos volátiles en el medio de cultivo …………………………….. 136
2.4. Análisis estadístico ……………………………………………………………………………………………………………... 136
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 138
3.1. Evaluación de la biodegradación en aserrín: Análisis de los cambios de la composición del sustrato ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 138
3.2. Evaluación de la biotransformación de compuestos presentes en el sustrato utilizado para cultivo ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 141
3.2.1. Biotransformación de terpenos utilizando como sustrato de cultivo Eucaliptus cinerea ……. 141
3.2.1.1. Análisis de componentes principales ……………………………………………………………………………… 153
3.2.2. Biotransformación de terpenos utilizando como sustrato de cultivo Origanum x applii …….. 155
3.2.2.1. Análisis de componentes principales ……………………………………………………………………………… 159
3.2.3. Biotransformación de terpenos utilizando como sustrato de cultivo Origanum vulgare ……. 161
3.1.3.1. Análisis de componentes principales ……………………………………………………………………………… 164
4. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………………………………………….. 166
P á g i n a | 12 CAPÍTULO V: Ensayo preliminar para el uso de P. tenuiculus como bioadsobente de metales pesados 168
1. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………………………………………………. 169
2. MATERIALES Y METODOS 170
2.1. Muestras utilizadas …………………………………………………………………………………………………………….. 170
2.2. Sorción de metales en solución acuosa: cobre, plomo y cadmio ……………………………………………. 170
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 172
3.1. Adsorción de metales pesados utilizando biomasa deshidratada de P. tenuiculus ………………… 172
4. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………………………………………….. 175
CONCLUSIONES GENERALES …………………………………………………………………………………………………… 176
Perspectivas futuras ………………………………………………………………………………………………………………. 180
BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………………………………………………………………………….. 182
P á g i n a | 13 INTRODUCCIÓN P á g i n a | 14 1. INTRODUCCIÓN Los procesos industriales generan una gran cantidad de residuos que generalmente forman parte del proceso de fabricación, los cuales son acumulados en el ambiente, pudiendo contaminarlo o bien son quemados, generando emisiones de gases tóxicos (Zheng & Shetty, 2000). Esta materia orgánica ocasiona inconvenientes al ambiente: ocupa mucho espacio, su degradación natural es lenta y casi imposible en los volúmenes que se genera. En los últimos años se han intensificado los aprovechamientos provenientes de residuos, especialmente los agroindustriales tales como, el aserrín, rastrojos de cereales y otros cultivos, la pulpa y hojas de café, residuos de frutas, bagaso de caña de azúcar, etc. Para contrarrestar los efectos nocivos que su acumulación produce, se desarrollaron varios emprendimientos biotecnológicos que utilizan los desechos para la producción de alcohol, enzimas, ácidos orgánicos y hongos comestibles, generando productos con valor económico y contribuyendo de esta manera a cuidar al medio ambiente (Baldrian & Valásková, 2008). Los procesos biotecnológicos están siendo ampliamente considerados por las industrias como una alternativa para la generación de bienes y servicios, transformando los residuos generados en productos útiles, y de esta manera utilizar su potencial por medio de bioprocesos. Dentro de este contexto, los hongos comestibles desempeñan un importante papel en el proceso de bioconversión, ya que son capaces de reducir grandes cantidades de residuos, minimizar la contaminación, y formar productos de interés para la industria de alimentos, papel, fármacos, entre otras. 1.1. Residuos agroindustriales La actividad agroindustrial en la Argentina está constituida principalmente por la industria agropecuaria representada por los cultivos de cereales, oleaginosas, frutas, hortalizas, etc.; la industria forestal, con explotaciones de varias especies tales como eucaliptos, álamo, sauce y pinos; y los cultivos industriales, tales como el plantas aromáticas, especias, té, yerba mate, caña de azúcar, jojoba, entre otros. Estas P á g i n a | 15 actividades, han evolucionado en los últimos años, generando cada vez mayor cantidad de residuos que afectan al medio ambiente. Los residuos agrícolas, forestales y agroindustriales, son en su mayoría, biomasa lignocelulósica, la que representa una fuente abundante y renovable de sustratos que pueden ser biológicamente transformados en biomasa microbiana de elevado valor nutricional, como lo son los hongos comestibles, sin generar efluentes contaminantes, sino por el contrario, sus desechos pueden ser reutilizados como fertilizantes orgánicos (Sánchez, 2004). Los materiales lignocelulósicos están formados mayoritariamente por polímeros presentes en la pared de las células vegetales: celulosa, hemicelulosa, sustancias pécticas y lignina. Mientras que la celulosa y la hemicelulosa otorgan soporte a la planta, la lignina le confiere rigidez y protección (Azcón‐Bieto & Talón, 2001; Sin et al., 2002). El contenido de nitrógeno de estos residuos es, generalmente, muy bajo. La proporción porcentual de estos componentes es altamente variable, depende del tipo de organismo, la edad, y estado metabólico al momento de la extracción (Rajarathnam et al., 1992). La celulosa constituye el polisacárido predominante en los residuos vegetales, representando entre el 30 y 60 % de su peso seco total (Taiz & Zeiger, 2002). Es un homopolímero lineal constituido por unidades de D‐glucosa unidas por enlaces glicosídicos β‐1,4 (Fig. 1) y dispuestas en paquetes de largas cadenas unidas por puentes hidrógeno (fibrillas elementales). Las microfibrillas, constituidas por fibrillas elementales, se distribuyen con diferente orientación dentro de la pared primaria confiriendo un soporte estructural. Las microfibrillas están embebidas en una matriz compuesta por hemicelulosa, proteína y pectinas. Es el principal componente de las paredes celulares, responsable del sostén vegetal y posee una estructura cristalina altamente resistente (Baldrian & Valásková, 2008). La estructura de la celulosa es altamente ordenada, pero a lo largo de ella se encuentran zonas amorfas. Estos son los puntos donde mayoritariamente se inicia la biodegradación de este componente por las enzimas fúngicas, principalmente endoglucanasas (Zhang et al., 2006). La hemicelulosa es un heteropolisacárido frecuentemente ramificado, compuesto de hexosas, pentosas, ácido urónico y azúcares menores fácilmente hidrolizables, representando el 40 % del peso seco total (Taiz & Zeiger, 2002). Está formada por una cadena plana de azúcares unidos entre sí, por enlaces β‐1,4, de la que pueden salir P á g i n a | 16 ramificaciones muy cortas generalmente de un azúcar de longitud (Fig. 2). Constituye la porción fácilmente hidrolizable de la pared celular en contraste con la celulosa que es más resistente. Por lo general, es el primer componente de la pared celular que es atacado por los hongos, debido a la menor extensión de sus cadenas, solubilidad y localización expuesta alrededor de las microfibillas de celulosa (Zabel & Morrel, 1992). Aparece en las paredes celulares en forma amorfa, asociada a las microfibrillas de celulosa por uniones hidrógeno y mediante uniones covalentes a la lignina. Fig. 1. Estructura de la celulosa: unidades de D‐glucosa unidas por enlaces glicosídicos β (1‐4). La lignina puede representar el 25 % de toda la biomasa lignocelulósica producida en el planeta, representando hasta el 40% de su peso seco total (Taiz & Zeiger, 2002). Juntamente con la hemicelulosa, envuelve las fibras de celulosa, Fig. 2. Estructura de la hemicelulosa: polímero heterogéneo, ramificado, compuesto mayormente por hexosas. P á g i n a | 17 desempeñando funciones de cementar las paredes de células contiguas y de preservación. Esta acción es posible debido a la estructura tridimensional de este heteropolisacárido de fenilpropano (Fig. 3). De esta forma la lignina forma una barrera física que dificulta la actividad de numerosos organismos productores de enzimas celulósicas, limitando los sitios de ataque enzimáticos e impidiendo la entrada de enzimas de mayor peso molecular, restringiendo el ataque a la superficie externa (Rajarathnam et al., 1992, Sin et al., 2002; Hammel & Cullen, 2008). Fig. 3. Fórmula esquemática ilustrando los tipos de uniones mayoritarios (β‐O4; C‐C) que componen la molécula de lignina. P á g i n a | 18 1.2. Los hongos Basidiomicetes: biodegradadores de los desechos lignocelulósicos. La degradación de los materiales lignocelulósicos es un paso central en el reciclado del carbono en el ecosistema terrestre. Los basidiomicetes son los organismos más importantes degradadores de madera y su habilidad consiste en degradar o modificar la lignina mediante un proceso enzimático originado hace miles de años. Estos hongos, son en la actualidad conocidos tanto por sus propiedades nutricionales y medicinales, como por su importancia económica ya que poseen especies patógenas que causan daño a la agricultura y a la industria forestal (Ferri, 1985). Los Basidiomicetes son hongos que generalmente producen cuerpos de fructificación fácilmente visibles al ojo humano (Chang & Miles, 1992). Están constituidos por una masa de filamentos, cada uno denominado hifa y el conjunto de hifas se denomina micelio. La reproducción se realiza por medio de la producción de esporas, aunque cualquier fragmento de hifa tiene la capacidad de propagarse. Las esporas dan origen a hifas tabicadas uninucleadas. Cuando dos filamentos de sexualidad distinta se ponen en contacto, forman una hifa binucleada, diploide (plasmogamia, sin fusión de núcleo). El dicarión así formado, prolifera y cuando las condiciones ambientales son favorables ocurren diferenciaciones morfológicas y fisiológicas y dan origen al cuerpo de fructificación, conocido como basidiocarpo o carpóforo (Fig. 4). En algunas células fértiles del himenio, se produce la fusión de los núcleos (cariogamia) e inmediatamente sufren la meiosis, dando origen a cuatro núcleos; cada uno de ellos migra a un filamento que se ha formado en el extremo de la célula o basidio, se rodea de una membrana formando las basidiósporas que reproducirán el ciclo nuevamente (Ferri, 1985). En el desarrollo de los hongos, se distinguen dos fases conocidas como estadio vegetativo y estadio reproductivo o de fructificación. El estadio vegetativo se refiere al desarrollo del micelio y el reproductivo a la formación del basidiocarpo. Durante la colonización del sustrato, se secretan enzimas extracelulares que degradan la materia orgánica transformándola en compuestos orgánicos solubles que son absorbidos por las hifas. El crecimiento del micelio resulta de una fusión de hifas, generando una asociación entre la hifa y el sustrato, que proporciona un fuerte soporte físico necesario para la formación del cuerpo de fructificación (estadio reproductivo). El estadio reproductivo está condicionado a variaciones de factores físicos como el descenso de la temperatura y el aumento de humedad (Chang & Miles, 1989). P á g i n a | 19 Morfológicamente, existe una gran variedad y se los agrupa según el tipo de píleo y de himenio. Por ejemplo, los Agaricales en general, tienen basidiocarpos pileados, estipitados y con himenio laminar donde se producen las esporas; en cambio los Aphilophorales pueden tener diferentes tipos de basidiocarpo (resupinado, efuso reflexo, estipitado, etc.) y con himenio generalmente poroide (Fig. 5). Fig. 4. Ciclo de vida de un basiodiomicete típico (Curtis et al., 2000). La mayoría de los basidiomicetes puede utilizar los compuestos de la madera para su crecimiento, porque poseen un sistema enzimático que los hace capaces de degradar las fuentes complejas de carbono tales como la celulosa, hemicelulosa y lignina, mostrando un importante papel en el reciclaje de la biomasa forestal y agroindustrial. Los hongos son absortrofos, por lo que absorben los nutrientes necesarios para su crecimiento desde el sustrato en el cual se están desarrollando. El sustrato disponible para el hongo debe ser reducido a sustancias solubles de bajo peso molecular que atraviesen la pared y el plasmalema para ser metabolizados en el interior de la célula. Las hifas secretan enzimas extracelulares (exoenzimas, tales como P á g i n a | 20 celulasas, hemicelulasas, lacasas, magnano y lignina peroxidasas) y ácidos orgánicos que pueden degradar moléculas orgánicas complejas (celulosa, Fig. 5. Partes de un basidiomicete hemicelulosa y lignina), obteniendo moléculas mas pequeñas, solubles que son fácilmente absorbidas por las hifas a través de la pared y membrana celular. Estos procesos requieren la presencia de agua extracelular, la cual es el principal limitante de la actividad fúngica (Alexopoulos et al., 1996; Ferri, 1985). En el caso de los hongos ligninolíticos, la biodegradación de la madera ocurre cuando está expuesta a un ambiente que ofrece las condiciones favorables para el crecimiento microbiano. La descomposición es esencial para el funcionamiento y la manutención del ecosistema (Blanchette, 1995). Dentro de los Basidiomicetes se agrupa a las especies según su capacidad de degradación específica del sustrato (Fig. 6). Es posible considerar a los hongos como: a) de pudrición castaña (“brown‐rot fungi”) a aquellos que degradan la celulosa y la hemicelulosa alterando parcialmente la estructura de la lignina sin su degradación definitiva, quedando la madera de color marrón (también conocida como pudrición cúbica), y b) los hongos de pudrición blanca (“white‐rot fungi”) que degradan la lignina, P á g i n a | 21 la celulosa y la hemicelulosa. Estos hongos degradan los tres componentes a la misma velocidad (ataque simultáneo) o hacen una degradación selectiva de la lignina y la hemicelulosa, en este caso la madera adquiere un color blanquecino (Jennings, 1995). A) B) Fig. 6. Madera degrada por la actividad fúngica A) pudrición blanca; B) castaña. Para seleccionar hongos productores de enzimas que degradan los compuestos lignocelulósicos, existen métodos cuantitativos y cualitativos. Los ensayos cualitativos son útiles cuando se posee una gran cantidad de especies de hongos, ya que son rápidos, de bajo costo y dan una reacción positiva o negativa de la producción de enzimas, utilizando colorantes particulares para visualizar la reacción de cada enzima (Pointing et al., 2000). 1.3. Biotecnología ambiental La biotecnología ambiental es la aplicación de la biotecnología a la resolución, o remedio, de los problemas ambientales naturales, agrícolas y antrópicos, y a la conservación de la calidad ambiental, teniendo especial relevancia en los procesos de producción y en el tratamiento de la contaminación (Castillo Rodríguez et al., 2005). Numerosas investigaciones han sido realizadas con el objetivo de obtener productos a partir de residuos generados por la agroindustria y de esta manera contribuir al cuidado del medio ambiente. Estas investigaciones se basaron principalmente en el uso de residuos provenientes de la industria cervecera, de los cítricos y jugos, vitivinícola, cafetera y azucarera entre otras, para ser empleados como sustratos de cultivo de varias especies de hongos comestibles, tales como Lentinula edodes, P á g i n a | 22 Pleurotus ostreatus, P. pulmonarius, P. sajor­caju, P. citrinupileatus (Lechner & Albertó, 2002; Salmones et al., 2005; Velázquez‐Cedeño et al., 2002; Zervakis et al., 1996; Wang et al., 2001; Gaitán‐Hernández et al., 2006; Thomas et al., 1998; Ragunathan et al., 1996; Worral & Yang, 1992; Salmones et al., 1998, Alexandrino et al., 2007). Además, se han intensificado los ensayos de aprovechamiento de los residuos mediante la fermentación en estado sólido utilizando Basidiomicetes (crecimiento de microorganismos en medio sólido o semi‐sólido en ausencia de agua libre) y de esta manera utilizar su maquinaria enzimática para la obtención de compuestos naturales que pueden ser utilizados en la industria alimenticia, de bebidas y farmacéutica (Zheng & Shetty, 2000, Worral & Yang, 1992; Brizuela et al., 1998; Ramachandran et al., 2007). Por otro lado, los sustratos desechados luego del cultivo de hongos pueden ser utilizados como alimento para animales (rumiantes) ya que contienen un alto valor nutricional y una comprobada digestibilidad in vitro (Salmones et al., 2005; Zhang et al., 2002; Villas‐Bôas et al., 2002) o bien para la producción de bioetanol, reduciendo la duración de los pretratamientos termoquímicos (Balan et al., 2008). Teniendo en cuenta el aumento en la producción de hongos comestibles en las distintas provincias de nuestro país y el interés por parte de los productores por abaratar los costos de producción mediante el aprovechamiento de residuos lignocelulósicos disponibles en cada región, es importante la búsqueda de sustratos alternativos de bajo costo y fácil acceso. Por ello, es interesante tener en cuenta los desechos generados por la industria de los aceites esenciales, ya que nuestro país posee un amplio espectro de condiciones edafoclimáticas y cuenta con numerosas zonas de cultivo para las especies aromáticas introducidas o exóticas. En la actualidad, las regiones más importantes para su producción son Tucumán, Misiones, Buenos Aires, Córdoba y San Luís. La superficie cultivada con estas especies se estima en más de 88.000 hectáreas, con unas 45.000 ha de especies cítricas industrializadas para la obtención de aceites esenciales (limón en Tucumán), unas 28.000 ha de especies aromáticas no cítricas (en especial manzanilla, coriandro y citronela) y otras 15.000 ha de pinos para la extracción de miera (Elechosa & Juárez, 2003). La industria de la extracción de aceites esenciales a partir de hojas de diversas plantas aromáticas, es una actividad de importancia económica tanto en nuestro país como a nivel mundial, principalmente en las regiones tropicales y subtropicales. Anualmente en el mundo, se extraen miles de toneladas de aceites, principalmente a partir de P á g i n a | 23 plantas de las Familias Gramineae, Lauraceae, Burseraceae, Myrtaceae, Umbelliferae y Geraniaceae (Martinez‐Carrera, 1986; Elechosa & Juárez, 2003). En nuestro país, el desarrollo de estas actividades permiten el autoabastecimiento de muchas materias primas indispensables para la industria alimenticia, farmacéutica, cosmética y en perfumería (Elechosa & Juárez, 2003). Las principales especies aromáticas no cítricas y su producción se presentan en la Tabla 1. En esta industria, después de la destilación de los aceites, se generan una gran cantidad de desechos de las hojas de las plantas empleadas, las cuales no tienen ninguna utilidad y podrían ser empleados como sustrato para el cultivo de hongos comestibles. Martinez‐Carrera et al. (1986) utilizaron como sustratos para el cultivo de P. ostreatus, residuos de la industria de los aceites esenciales de las especies más utilizadas en México tales como, zacate limón (Cymbopogon citratus), canela (Cinnamomum zeylanicum) y pimienta (Piper nigrum) logrando buenos rendimientos. Otro aspecto importante, es la creciente demanda por la búsqueda de soluciones para el tratamiento de efluentes generados por la industria, muchas veces con altos contenidos de metales pesados, colorantes, compuestos sintéticos, etc. O bien la biorremediación de suelos contaminados con pesticidas, clorofenoles, xenobióticos aromáticos, hidrocarburos aromáticos policiclos u otros, mediante la incorporación de tecnologías limpias utilizando organismos vivos, tales como bacterias, hongos, algas y levaduras (Blanchette, 1995; Zjawiony, 2003; Carlile et al., 2001; Miretzky et al., 2006, Levin et al., 2003). Tabla 1. Superficie cultivada y producción de especies aromáticas en Argentina. Especie Nombre científico
Hectáreas Anís Pimpinella anisum L.
400 Citronela Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor. 1200 Comino Cuminum cyminum L. 700 Coriandro Coriandrum sativum L. 4500 Hinojo Foeniculum vulgare Mill. Var. Dulce
250 Lavanda Lavandula vera DC. 20 Lavandin Lavandula x intermedia Loisel. 80 Lemongrass Cymbopogon citratus (DC.). Stapf
200 Lúpulo Humulus lupulus L.
600 Manzanilla Matricaria recutita L. 15000 Mentas Mentha x piperita L.; M. arvensis L. 950 450 Mostaza Sinapis alba L. Orégano Origanum vulgare L.
600 Pimiento Capsicum spp.
1000 Subtotal 25950 Valores anuales estimados, promedios del último quinquenio (Fuente: Elechosa & Juárez, 2003). P á g i n a | 24 En el caso particular del tratamiento de efluentes industriales que contienen metales pesados (en concentraciones de 1‐100 mg·L‐1) existen varios métodos convencionales, entre los que se incluyen: precipitación, coagulación, proceso de reducción, cambio iónico, tecnologías de membrana y adsorción en carbón activado (Rebhun & Galil, 1990; Kurt & Volchek, 1996; Marcus & Kertes, 1969; Reed et al., 1996). Todos estos métodos están asociados con un alto costo o con una baja eficacia, y no garantizan los límites de concentración metálica exigida por las normas legales. El proceso de bioadsorción aparece como una nueva tecnología, capaz de quitar los rastros de metales pesados de soluciones acuosas, mediante el empleo de biomasa fúngica, algas y bacterias, obteniéndose muy buenos resultados a bajo costo (Kapoor & Viraraghavan, 1995; Miretzky et al., 2006). Este proceso puede definirse como la incorporación de especies metálicas orgánicas e inorgánicas, soluble o insoluble, por microorganismos mediante la adsorción (mecanismo fisicoquímico). En bacterias, la adsorción de cationes es debida principalmente por la unión a grupos carboxílicos de peptidoglucanos en la pared celular de las gram (+) o con grupos fosfatos que contribuyen significativamente en las especies gram (‐). En hongos, la bioadsorción es debida, esencialmente, a la presencia de los polisacáridos en la pared fúngica, tales como quitina y quitosan, o por otros compuestos que poseen sitios de unión a metales como la melanina o polímeros fenólicos. Esta capacidad de adsorber metales pesados les confiere un potencial uso biotecnológico, ya que puedan ser utilizados como material empaquetado para columnas o birreactores (Galli et al., 2003). Recientemente, algunos investigadores han informado que muchos hongos, entre los que se destacan los Basidiomicetes, tienen una gran capacidad para bioacumular iones metálicos. Galli et al. (2003) y Veit et al. (2005) indicaron que tanto el uso del micelio de Auricularia polytricha, o bien la biomasa deshidratada (no viva) de Pleurotus pulmonarius y Schizophyllum commune, al ser empleados como bioadsorbente acumularon una alta concentración de cobre. El uso de biomasa no viva como bioadsorvente es una ventaja ya que no requiere la adición de sustancias nutritivas, además de poder ser expuesto a ambientes con alta toxicidad. También, cabe destacar que se han realizado estudios para demostrar la posibilidad de recuperar los metales de la biomasa utilizada como adsorbente. Ésta podría ser realizada utilizando una elusión apropiada capaz de quitar efectivamente el metal de la biomasa y devolverlo a P á g i n a | 25 la solución, obteniendo así, una solución concentrada con el metal de interés (Tsezos et al., 1989; Huang et al., 1990; Kuyucak & Volesky, 1988). 1.4. Consumo, comercialización y cultivo de especies silvestres en Latinoamérica En la actualidad, muchos estudios están enfocados en la búsqueda de la optimización de los parámetros de cultivo que permitan cultivar nuevas especies silvestres de hongos comestibles y de esta manera poder obtener fructificaciones para estudios taxonómicos, su uso para consumo humano, búsqueda de propiedades medicinales, etc. Ruán‐Soto et al. (2004, 2006) informaron que los pobladores de varias regiones de México, de la Amazonia brasileña y de la zona tropical de Guatemala, han mostrado una tendencia al conocimiento y al consumo de especies silvestres tales como, Schizophyllum commune, Auricularia polytricha, Auricularia delicata, Pseudofistulina radicata, Cookenia sulcipes, Honhenbuehelia petaloides y P. tenuiculus, muchas de las cuales se encontraron a la venta en diferentes mercados (Fig. 7). Garibay‐Orijel et al. (2007) realizaron un estudio en varias regiones de México sobre el significado cultural de muchas especies de hongos silvestres comestibles para definir el rol que cada organismo tiene con una cultura particular y poder determinar el conocimiento y uso que realizaban sus habitantes. De las 37 especies analizadas, muchas de ellas tuvieron un índice de consumo alto, entre las que se destacan varias del género Cantharellus, Pleurotus, Sparassis crispa y Laccaria laccata siendo catalogadas como de “buen sabor”. Además cabe destacar, que en muchos lugares donde se consumen diversas especies de hongos silvestres, sus pobladores son de escasos recursos y reemplazan la ingesta de carne por la de hongos. Por otra parte, muchos pobladores utilizan los hongos con fines medicinales o religiosos. También es importante destacar el consumo de una especie de hongo que causa importante pérdidas económicas, Ustilago maydis o “Huitlacoche”, el cual se desarrolla en las plantas de maíz vivas, formando un tumor o vesícula, lo que requirió la manipulación del sitema maíz‐“huitlacoche” para su domesticación (Villanueva, 1997). Esta especie se la comercializa en mercados locales y en varios países. De León (2003) destacó que en Guatemala hay una gran variedad de especies de hongos silvestres que son comercializados en el mercado, entre ellos, Cantharellus P á g i n a | 26 cibarius, C. odoratus, Amanita caesarea, Schizophyllum commune, Pleurotus levis, Lactarius deliciosus, Hypomyces lactifluorum, Tremella reticulata, Helvella crispa, Polyporus umbellatus y Agrocybe aegerita. Hasta el momento, Polyporus umbellatus es la única especie del género Polyporus que pudo ser cultivada industrialmente, para ser utilizada con fines medicinales (en polvo o pastillas) ya que sus fructificaciones son muy duras para ser ingeridas (Ishida et al., 1999; Sekiya et al., 2005; Stamets, 1993). Por otro lado, Borges da Silveira (2001) aplicó técnicas de cultivo para la obtención de basidiocarpos de algunas especies del género Polyporus (P. tenuiculus (Beauv.) Fr., P. arcularius Batsch. Fr., P. ciliatus Fr., P. philippinensis Beck y P. tucumanensis Speg.) para poder realizar una buena identificación taxonómica de las mismas. Para ello utilizó técnicas tradicionales para el cultivo de especies del género Pleurotus (Stamets, 1993) utilizando como sustrato una mezcla de aserrín suplementado con salvado de trigo y avena arrollada, obteniendo fructificaciones con las mismas características que las encontradas en la naturaleza y que fueron de gran utilidad para la caracterización taxonómica de cada especie estudiada. Este conocimiento previo de las especies de hongos que crecen en la naturaleza y que son utilizadas en varios lugares por sus cualidades como comestibles, ha estimulado a muchos grupos de investigación en el estudio de los parámetros para su cultivo y de esta manera permitir un incremento en cuanto a nuevas especies disponibles en el mercado para ser ofrecidas al consumidor de manera continua. 1.4.1. Hongos silvestres comestibles de valor económico en Argentina Los hongos comestibles que crecen espontáneamente en la naturaleza sobre diversos sustratos y que denominamos “silvestres”, son aquellos que no se los cultiva en forma comercial y tiene interés gastronómico ya que son alimentos que pueden ser fácilmente certificados como ecológicos, orgánicos o biológicos, y son recolectados y procesados para su venta a muy bajo costo. Son considerados “delicatessen” por aquellas personas que aprecian los gustos y aromas delicados, y por los cuales se puede pagar un precio elevado, por sus cualidades, su origen, libre de productos químicos de síntesis, los hacen muy atractivos para un público más exigente. P á g i n a | 27 Fig. 7. Puesto típico de venta de hongos silvestres comestibles en Temperate, México. (Tomado de Ruán‐Soto et al., 2006). Los hongos silvestres comestibles que tienen mayor aceptación en el mercado crecen en regiones con clima templado. En nuestro país sólo se comercializan cinco especies de hongos silvestres comestibles (Deschamps, 2002; Albertó et al., 2008) Phlebopus bruchii (hongo del coco), se encuentra en las zonas serranas de Córdoba y San Luís; es una de las especies más codiciadas dentro de las boletáceas. También podemos nombrar a Suillus luteus asociados a los bosques de pinos en la zona cordillerana de Argentina y Chile, y a Suillus granulatus asociados a bosques de pinos en la zona litoral atlántica de Argentina y Uruguay. Lactarius deliciosus (lactarios, robellones o níscalos) asociados a los mismos bosques mediterráneos o de pinos californianos en los bosques patagónicos. Por último Morchella intermedia (morillas o morchelas) del sur patagónico que pareciera estar asociadas a los bosques de ciprés de la cordillera. Por lo general estas especies silvestres se comercializan frescas en la zona donde son cosechadas o bien deshidratadas. P á g i n a | 28 1.5. Cultivo de hongos comestibles en Argentina 1.5.1. Reseña histórica La producción y el consumo de hongos superiores han aumentado notablemente a nivel mundial durante las dos últimas décadas, y si bien en la Argentina la producción comenzó en la década del cuarenta, no tuvo un crecimiento importante. Durante 40 años, la única especie cultivada fue el champiñón de París o champiñón blanco. A partir de la década del ochenta, las instituciones universitarias del país abordaron el tema de la producción de hongos desde un enfoque científico‐tecnológico, con nuevas propuestas, y mediante el asesoramiento y el dictado de cursos, se buscó no sólo cubrir las necesidades de conocimiento de los productores sino también de capacitar nuevos emprendedores. Esto condujo a que en los ´90 se comenzara con el cultivo de nuevas especies, tales como las gírgolas (Pleurotus ostreatus) o el shiitake (Lentinula edodes) en bolsas, preferentemente, sobre sustratos. Actualmente esta actividad se encuentra en expansión en todo el país (Albertó & Gasoni, 2003). 1.5.2. Situación actual de la producción de hongos comestibles Las regiones tropicales y semi‐tropicales representan características que las tornan áreas propicias para el cultivo de hongos comestibles, ofreciendo condiciones climáticas favorables (Loguercio Leite & Wright 1991). La Argentina, al ser un país principalmente agrícola‐ganadero y productor de alimentos, produce una inmensa biomasa de desechos lignocelulósicos, los cuales constituyen potenciales sustratos para el cultivo de hongos comestibles y medicinales. El cultivo de hongos se basa en la fermentación sólida de sustratos vegetales pasteurizados o esterilizados, permitiendo la conversión de desechos agroindustriales en alimento para consumo humano. En el caso de las especies de Pleurotus y Shiitake, existen dos sistemas de cultivo: sustratos artificiales formulados en bolsas y sustratos naturales por inoculación de troncos (principalmente sauce, álamo o eucalipto). La producción de hongos ostra está en continuo crecimiento, un 53% de los productores lo hace sobre sustrato artificial, 40% sobre troncos y un 7% opta por una forma mixta. Esto se debe principalmente a la disponibilidad de materia prima, pues se busca adaptar la producción a las posibilidades de la materia prima que pueda P á g i n a | 29 disponerse a menor costo. De esta forma, en las provincias patagónicas es donde se lleva a cabo la producción sobre troncos de álamo (Populus sp) en sistemas semi‐
protegidos o a la intemperie. Es una producción estacional y con baja inversión. Mientras que en la Pampa húmeda prevalece la producción sobre sustrato a base de semillas, cáscara de girasol, paja de trigo, aserrín o algún otro residuo lignocelulósico ya que es mucho más económico conseguir estos materiales. De esta manera y con la infraestructura adecuada obtienen una producción continua durante todo el año. La producción de hongos alcanzó un máximo de 1500 ton anuales en el período comprendido entre 1998 y 2000, siendo el champiñón el hongo que mayormente se industrializa en conserva o fresco en bandejas (Albertó & Gasoni, 2003). Al presente, los principales centros de producción y consumo de hongos del país se encuentran definidos por las provincias de Buenos Aires, Neuquén, Río Negro, Mendoza, Santa Fe y Córdoba. Se cree que actualmente la producción es cercana a los 2500 ton anuales. Desde hace varios años en el Laboratorio de Micología y Cultivo de Hongos Comestibles del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB‐INTECH) se llevan a cabo ensayos experimentales, con el fin de identificar especies silvestres que puedan ser cultivadas (Lechner & Albertó, 2007; Uhart et al., 2008). En especial, cepas que proporcionen algunas características ventajosas respecto a las actualmente en cultivo, como diferencia en el color, sabor, textura o condiciones de cultivo (que fructifiquen a mas de 20ºC, formulación de sustrato de alta productividad, entre otras). También han sido motivo de numerosas investigaciones, el desarrollo de formulaciones de sustratos de alta productividad, especialmente para el cultivo especies de Pleurotus y Lentinula edodes (shiitake), que permitan incrementar los rendimientos comparados a los obtenidos con las formulaciones tradicionales. En el caso de las especies de Pleurotus, están orientadas a los potenciales productores del interior del país, que se encuentran alejados de las zonas productoras de trigo, con el fin de abaratar los costos de la producción. Adicionalmente, se investigó el uso de la cáscara de semilla de girasol como ingrediente energético y nutricional para la optimización del crecimiento y fructificación de Pleurotus (Curvetto et al., 2002), Ganoderma lucidum (González Matute, 2002) y Hericium erinaceus (Figlas et al., 2007). También se estudió la forma de adaptar el cultivo de shiitake mediante el uso de maderas de árboles originarios de nuestro país, utilizando aserrines de varias especies de árboles (coihue, lenga, ñire, roble pellín, eucalipto y sauce) en el sistema de bloque P á g i n a | 30 sintético (Pire et al., 2001). Muchas de las técnicas y sustratos desarrollados son actualmente empleados por los cultivadores que se inician en la actividad. 1.5.3. Consumo de hongos comestibles en Argentina Nuestro país no es un gran consumidor de hongos, ya que no es un hábito característico de nuestra cultura. Se considera que el consumo de hongos es una costumbre moderna, adquirida a comienzos del siglo pasado como consecuencia de la inmigración de europeos, ávidos consumidores de setas silvestres. A fines del siglo XX, la inmigración de comunidades orientales determinó que se importaran especies para su consumo. Más recientemente, a causa del proceso de globalización, se ha producido un de intercambio cultural en el ámbito de comidas y recetas exóticas que incorporan a los hongos dentro del arte culinario. El consumo de hongos en 1995 fue aproximadamente 35 g/hab./año, cantidad realmente escasa si se lo compara con los 2 a 10 Kg./hab./año en Europa. El análisis de consumo de hongos en la Argentina para el año 2000 indica que el champiñon mantuvo su dominio sobre el resto de los hongos consumidos con un 94,5 % del total (Albertó & Gasoni, 2003). Si bien el consumo se concentra en el champiñón de París, seguido por el hongo de pino seco, de a poco crece la producción y demanda de gírgolas y shiitake. En general, el conocimiento de los consumidores sobre recetas para cocinar y combinar distintos tipos de hongos es muy limitado. Por ello es importante poder informar a los potenciales consumidores la manera de prepararlos y conservarlos, no sólo incorporando recetas en los envases, sino que además hay que comunicar que representan un alimento con un excelente valor funcional, es decir que además de ser nutritivos, son beneficiosos para la salud de muchas maneras. 1.5.4. Calidad nutricional de los hongos comestibles Para incentivar el consumo de hongos comestibles es necesario promover y divulgar la importancia que estos organismos tienen en la dieta y de esta manera brindar mayor conocimiento sobre sus propiedades nutricionales, sobre todo a aquellas personas que no ingieren alimentos de origen animal en su dieta. P á g i n a | 31 Los hongos comestibles constituyen una importante fuente de nutrientes y compuestos bioactivos (Tabla 2). Poseen el doble de contenido de proteína que la mayoría de los vegetales, teniendo muchos de ellos los nueve aminoácidos esenciales (Tabla 3). Además, son ricos en leucina y lisina, ausente en la mayoría de los cereales. También poseen cantidades no despreciables de minerales tales como K, P, Mg, Cu, Zn y Se (Tabla 4), superando en este aspecto a la carne de pescado y vitaminas tales como, riboflavina, niacina, tiamina, ácido fólico y ácido ascórbico (Tabla 5). Además tienen bajas calorías y constituyen una buena fuente de fibras y carbohidratos (Chang et al., 1993; Chang, 1996; Mattila et al., 2001). Podríamos ubicar entonces al valor nutritivo de los hongos comestibles entre los vegetales y las carnes. Cabe destacar que la composición nutricional varía dependiendo de la cepa, composición del sustrato y estado de desarrollo de los cueros de fructificación (Silva et al., 2007; Valencia del Toro et al., 2006; Shashirekha et al., 2005).
Tabla 2. Contenido de proteína cruda, carbohidratos totales, grasas y fibra de algunas especies comestibles. Especies Agaricus bisporus Agaricus campestris Lentinus edodes Pholiota nameko Pleurotus ostreatus Pleurotus sajor‐cuju Pleurotus pulmonarius Volvariella volvaceae Volvariella displacia Flammulina velutipes Auricularia spp. Fuente: Albertó 2008. Grasas 1.7‐8.0 Fibra 8.0‐10.4 Valor energético (Kcal) 328‐381 67.5‐78.0 1.9 4.9‐8.0 8.1 7.3‐8.0 354 387‐392 20.8 10.5‐30.4 9.9‐26.6 8.7‐37.2 66.7 57 6‐81.8 50.7‐54.4 56.6‐58.0 4.2 1.6‐2.2 2.0‐7.7 1.7‐5.8 6.3
7.5‐8.7 10.3‐17.5 9.0‐14.5 372 345‐367 300‐337 21.3‐43.0 28.5 17.6 4.2‐7.7 50.9‐60.0 57.4 73.1 79.9‐87.6 0.7‐6.4 2.6 1.9 0.8‐9.7 4.4‐13.4 17.4 3.7 11.9‐19.8 254‐374 304 378 347‐384 Proteína (N x 4.38) 23.9‐34.8 33.2 Carbohidratos Totales 51.33‐62.5 56.9 13.4‐17.5 265‐336 P á g i n a | 32 Tabla 3. Composición de aminoácidos esenciales presentes en algunos hongos comestibles Aminoácidos (Aa) Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Trionina Valina Triptofano Histidina Aa esenciales Totales Aa totales Fuente: Albertó 2008 A. bisporus 200‐366 329‐580 357‐527
41‐126 186‐340
243‐366 112‐420 91‐413
0‐179 1697
L. edodes 218 348 174
87 261
261 261 nd
87 1933‐2304
P. ostreatus 266‐267 390‐610 250‐287
90‐97 216‐233
264‐290 309‐326 61‐87
87‐107 1782‐2810
4962 5169‐5747 4513‐6332 V. volvacea V. diplasia 193‐261 491 248‐346 312 427‐650
384 78‐94 80 159‐285
437 209‐307 375 298‐414 607 86‐112
98 84‐341 187 2971
1697 nd 4962 Tabla 4. Contenido de minerales (g, mg o µg / kg) en los principales hongos comestibles. Calcio, g Potasio, g Magnesio, g Fósforo, g Sodio, g Cobre, mg Hierro, mg Manganeso, mg Cinc, mg Selenio, µg Plomo,µg Cádmio, µm Materia seca, % Fuente: Albertó 2008 Agariscus bisporus (blanco) Fresco Deshidr. 0,019 0.25
3,64 47.3 0,10 1.30
0,980 12.7 0,032 0.42 2,2 29
3,7 48 0,42 5.5
5,1 66 110 1400 14 180
2,8 36 7,7 Agaricus bisporus (marrón) Fresco Deshidr. 0,01
0.13
3,59 46 0,11
1.41
1,01 12.9 0,034 0.44 2,7
35
2,2 28 0,40
5.1
3,7 47 250 3200 2,7
35
7,5 9.6 7,8
Pleurotus ostreatus Fresco Deshidr. 0,001
0.01 2,98 37.3 0,16
2.0
1,11 13.9 0,01 0.13 0,67
8.4
4,3 54 0,89
11
6,6 83 12 150 1,6
20
30 380 8,0
Lentinula edodes Fresco Deshidr. 0,004 0.05
2,24 26.7 0,13 1.55
0,73 8.7 0,011 0.13 0,44 5.2
2,8 33 1,74 21
7,7 92 3,3 39 3,1 37
100 1200 8,4 1.5.5. Compuestos volátiles: potencial uso para la producción de aromas y sabores Los compuestos de aroma fúngico no juegan un papel esencial en la nutrición pero estimulan el apetito y dan a los platos preparados con hongos un aroma característico. Los hongos representan una fuente valiosa de moléculas aromáticas para la industria de los aromas y sabores (Rapior, 2002). Se han identificado aproximadamente 150 especies de compuestos diferentes en varias especies de hongos, los cuales representan una amplia variedad de estructuras químicas incluyendo alcoholes P á g i n a | 33 alifáticos simples, aldehídos, cetonas, ésteres, lactonas, mono y sesquiterpenos y compuestos aromáticos tales como los derivados del cinámico. Tabla 5. Contenido de vitaminas (µg o mg/100 g) en los principales hongos comestibles. Vitamina C, mg Vitamina B1, mg Vitamina B2, mg Niacina, mg Vitamina B12, µg Vitamina D1, µm Materia seca, % Fuente: Albertó 2008 Agariscus bisporus (blanco) Fresco Deshidr. 1,3 17
0,05 0.6 0,39 5.1
3,3 43 0,06 0.8 <0,02 ‐ 7,7 ‐ Agaricus bisporus (marrón) Fresco Deshidr. 1,6
21
0,05 0.6 0,33
4.2
4,1 53 0,05 0.6 <0,02
‐
7,8 ‐ Lentinula edodes Fresco Deshidr. 2,1
25
0,05 0.6 0,15
1.8
2,6 31 0,07 0.8 0,1
1
8,4 ‐ Pleurotus ostreatus Fresco Deshidr. 1,6 20
0,07 0.9 0,20 2.5
5,2 65 0,05 0.6 0,02 0.3
8,0 ‐ Los compuestos de aroma típicamente sintetizados por los hongos superiores incluyen volátiles derivados del metabolismo de los ácidos grasos, especialmente el 1‐octen‐3‐
ol. Éste compuesto es frecuente en muchas especies de hongos tales como: A. bisporus, Polyporus betulinus, Fomitopsis pinicola, Cantharellus cibarius, Tricholoma sulfureum, Volvariella volvacea, Pleurotus ostretus, P. florida, Hericium erinaceum, Boletus edulis (De Pinho et al., 2008; Rösecke et al., 2000; Combet et al., 2006; Chiron & Michelot, 2005; Maga, 1981; Zawirska‐Wojtasiak, 2004; Rapior et al., 1998; Mau et al., 1997; Wood et al., 2000). Varios autores afirman que el perfil de compuestos de aroma puede ser afectado por la composición del sustrato, las variaciones genéticas entre las especies y cepas, según las partes utilizadas para el análisis (sombrero/pie), así como también con las condiciones de cultivo (Cho et al., 2008; Cho et al., 2007; Wu et al., 2005, Jong & Birmingan, 1993; Çağlarırmak, 2007). Además, el conocimiento de la composición de volátiles es importante desde el punto de vista quimitaxonómico. Callac & Guinberteau (2005), examinaron los componentes volátiles de varias especies de Agaricus, compararon las proporciones de los compuestos benzoicos con los compuestos volátiles de ocho carbonos, y fueron capaces de identificar una relación entre la proporción y la cercanía filogenética, indicando una potencial importancia de los compuestos volátiles como marcadores taxonómicos. Además, tener un perfil de los principales compuestos volátiles nos brinda la posibilidad de realizar un uso P á g i n a | 34 biotecnológico aplicado en fermentadores mediante la adición de los precursores de los compuesto de interés al medio de cultivo. El potencial de los Basidiomicetes para producir aromas naturales de novo o por biotransformación es muy interesante ya que el suministro actual de aromas naturales está principalmente limitado a la capacidad biosintética de las plantas (Bernd & Berger 1994; Lomascolo et al., 1999). Dado que los metabolitos fúngicos representan una amplia diversidad de especies químicas, la investigación del metabolismo secundario de los hongos despierta un gran interés científico. Además, recientemente varias especies de Familia Poliporaceae han sido estudiadas ya que constituyen una importante fuente de compuestos biológicamente activos (Wu et al., 2005; Zjawiony, 2004). Por lo antes expuesto, la biotransformación fúngica de sustratos de bajo costo para generar compuestos de aroma y sabor parece tener un gran potencial comercial. Un importante pre requisito es conocer los componentes volátiles genuinos de cada especie de hongo. Además, una investigación detallada de los compuestos volátiles es un principio básico para revelar el mecanismo de formación del aroma en los cuerpos fructificación de los hongos y de esta manera poder planificar la producción de compuestos aromáticos naturales mediante fermentación en estado sólido o líquido utilizando la maquinaria enzimática (lipasas, proteasas, glucosidasas) para catalizar las reacciones a partir de moléculas precursoras tales como aminoácidos, ácido linoléico, terpenos, entre otros (Wu et al., 2005; Bernd & Berger, 1994; Longo & Sanromán, 2006). Particularmente, la biotransformación de terpenos es muy interesante, ya que los microorganismos pueden transformarlos en una variedad de compuestos oxifuncionales y enantiómeros puros, muy valiosos para la industria de los aromas y sabores (Carvalho & Fonseca, 2006). 1.5.6. Importancia de la evaluación sensorial de los hongos comestibles La evaluación “Sensorial" es una disciplina científica mediante la cual se evalúan cualitativa o cuantitativamente, las propiedades organolépticas (sabor, aroma, color y textura) mediante el uso de uno o más de los sentidos humanos (olfato, gusto y/o tacto). Esta evaluación permite clasificar las materias primas y productos terminados, conocer que opina el consumidor sobre un determinado alimento, su aceptación o rechazo, así como su nivel de agrado, criterios estos que se tienen en cuenta en la P á g i n a | 35 formulación y desarrollo de los mismos (Espinosa Manfugás, 2007). Los evaluadores clasificados por su conocimiento cubren los espectros que van desde un consumidor sin entrenamiento ni experiencia hasta un juez altamente preparado con una amplia memoria sensorial de olores y sabores. Las pruebas sensoriales son indispensables en el control de la calidad de los alimentos y se clasifican, en dos grupos: analíticas y afectivas. Las afectivas se dirigen, fundamentalmente, hacia los consumidores y pretenden evaluar su aceptación o preferencia por un determinado producto y se necesita un gran número de degustadores no adiestrados, es decir, consumidores representativos de la población. En cambio para las pruebas analíticas se necesitan catadores adiestrados en dar respuesta acerca de la calidad sensorial del producto sin tener en cuenta sus gustos o preferencias personales. Dentro de ésta, el método de análisis cuantitativo descriptivo conocido como QDA (Quantitative Descriptive Analysis) tiene como objetivo identificar y cuantificar todas las características sensoriales de un producto y la información generada sirve para construir un modelo multidimensional que describe los parámetros que definen a uno o varios productos (Lawless & Heymann, 1999). Es ampliamente utilizado, ya que ofrece un perfil sensorial completo del alimento, permite establecer gráficamente patrones que pueden utilizarse en cualquier momento para describir y analizar un producto. Estas pruebas son las más adecuadas para la evaluación de la calidad de los alimentos, aunque en ocasiones se hace necesario conocer el criterio de los consumidores, especialmente durante el desarrollo de nuevos productos o formulaciones, donde se deben utilizar pruebas afectivas. A pesar de que en nuestro país se ha incrementado el cultivo y consumo de hongos comestibles siendo común encontrarlos a la venta en el mercado en sus diferentes variantes de comercialización (tales como frescos en bandejas, deshidratados o envasados al natural y/o procesados) los consumidores tienen poca información sobre las características organolépticas que ofrece el producto. Cuando se trata de la incorporación al mercado de nuevas especies de hongos comestibles, es necesario poder conocer cuales son las preferencias de los consumidores. Siendo interesante poder realizar degustaciones en centros comerciales o en otros puntos estratégicos y de esta manera informar a los consumidores sobre los atributos que se destacan en las diferentes especies de hongos comestibles que se comercializan, fomentando además sus propiedades nutricionales. P á g i n a | 36 1.6. Polyporus tenuiculus: una especie comestible no cultivada Ruán Soto et al. (2004, 2006) informaron que ejemplares de Polyporus tenuiculus cosechados de la naturaleza son comercializados principalmente en mercados del llano costero del Golfo de México, además de ser consumida en otras regiones de Latinoamérica. Sin embargo, hasta la actualidad no se conoce nada sobre su cultivo en sustratos lignocelulósicos. Polyporus tenuiculus (P. Beauv.)Fr. también conocida con el nombre de Favolus tenuiculus P. Beauv. o Favolus brasiliensis (Fr.) Fr., es una especie polimórfica lo que ha dado origen a un importante número de sinónimos (véase index fungorum: www.indexfungorum.org). Pertenece al Orden Polyporales y a la Familia Polyporaceae. Presenta un basidiocarpo anual, solitario a imbricado, lateral a excéntrico o centralmente estipitado, píleo flaveliforme a circular, más raramente espatuliforme, 1,0‐18,0 x 0,6‐11,00 cm. y 0,5‐10 mm de grosor (contexto), carnoso a membráceo cuando fresco, frágil, quebradizo al secarse (Fig. 8). Fig. 8. Ejemplares de Polyporus tenuiculus. Superficie del píleo glabra, lisa a radialmente estriada y arrugada cuando seca; blanca a crémea cuando fresco, crémea amarillenta cuando seco. Márgen del píleo entero a globulado, liso o fimbriado, involuto y, a veces castaño claro cuando seco. Estípite cilíndrico, 0,2‐4,0 cm. de largo, 0,1‐1,3 cm. diámetro, fibroso cuando fresco, rígido a frágil cuando seco, con superficie glabra, lisa a arrugada cuando seca, concoloro o un P á g i n a | 37 poco más claro que la superficie del píleo. Himenóforo blanco a crémeo cuando fresco, beige a amarillento o castaño claro cuando seco. Poros circulares a angulares, radialmente alargados, decurrente sobre el pié, con los bordes enteros a fimbriados, 0.6‐1,5 por mm, tubos 0,5‐9,0 mm de profundidad. Contexto homogéneo, algodonoso tenaz a corchoso, blanco a crémeo o beige, 0,3‐2,0 mm de grosor, a veces indiscernible. Caracterizado microscópicamente por un sistema hifal dimítico; con hifas generativas con fíbulas, hialinas, de paredes delgadas a levemente engrosadas, abundantes en toda la fructificación, hifas esqueleto‐ligadoras de paredes engrosadas a muy gruesas, dominando en el contexto y estípite. Crece sobre madera muerta de dicotiledóneas y gimnospermas indeterminadas, produciendo pudrición blanca (Borges da Silveira, 2001). Tiene distribución Pantropical, habiéndose coleccionado en la Argentina, Brasil, Perú, Colombia, Ecuador, Bolivia, México, Venezuela, Paraguay, Cuba, Guayana Francesa, Trinidad e Indonesia (Nuñez & Rivarden, 1995; Ruán‐Soto et al., 2004, 2006). P á g i n a | 38 CAPITULO I Desarrollo del cultivo intensivo de Polyporus tenuiculus P á g i n a | 39 1. OBJETIVOS Considerando que: • La producción y el consumo de hongos comestibles está en continuo crecimiento en los últimos años, tanto a nivel mundial como en nuestro país • En trabajos previos con otras especies de hongos cultivados se ha demostrado que la elección de la temperatura óptima de incubación es importante para minimizar el tiempo de esta etapa. • La selección de la cepa y del sustrato óptimo de cultivo es importante para garantizar el rendimiento de la producción. • Es posible aprovechar una gran cantidad de materiales lignocelulósicos fácilmente disponibles en nuestro país, para ser utilizados para el cultivo de hongos comestibles. • En los últimos años ha habido una mayor difusión de la cocina “gourmet” que utiliza hongos comestibles, y una mayor información respecto a las propiedades de alimentos funcionales, que incrementarán marcadamente la demanda. se plantea para este capítulo el siguiente Objetivo General: Determinar las variables óptimas para el cultivo de Polyporus tenuiculus y seleccionar las cepas que puedan ser utilizadas por su alto rendimiento productivo. y los siguientes objetivos específicos: 1‐ Determinar la temperatura óptima de crecimiento vegetativo. 2‐ Analizar cualitativamente la actividad ligninolítica y celulolítica in vitro de varias cepas. P á g i n a | 40 3‐ Comparar el rendimiento de diferentes sustratos tradicionalmente utilizados (paja de trigo y aserrín de sauce) para el cultivo de P. tenuiculus. 4‐ Seleccionar cepas silvestres sobre la base del rendimiento y de la calidad de las fructificaciones obtenidas. 5‐ Evaluar el efecto de la adición de suplementos nutricionales al sustrato. 6‐ Evaluar el efecto de la aplicación de algún tratamiento (“shock térmico” o “browning”) previo a la inducción de la fructificación en el rendimiento. 7‐ Ensayar sustratos provenientes de la industria de los aceites esenciales y sus efectos en el rendimiento y la calidad de las fructificaciones. 8‐ Realizar ensayos de cultivo en troncos de las especies arbóreas disponibles en la región de la Pampa Deprimida del Salado. P á g i n a | 41 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Optimización del cultivo de Polyporus tenuiculus 2.1.1. Medios de cultivo •
Agar Extracto de Malta (AEM): agar, 20 g; extracto de malta, 12 g; glucosa, 10 g. •
Agar Papa Glucosado (APG): agar papa glucosado (Britania, Argentina), 39 g. •
CMC (Magnelli et al., 1997): agar, 15g; carboximetilcelulosa 5 g; NaNO3, 4,5 g; (NH4)2SO4, 3,5 g. •
Medio de Nobles: Extracto de malta, 12,5 g; agar, 20 g (Nobles, 1965). A todos los medios de cultivo se les agregó agua destilada hasta completar 1 l y se los esterilizó en autoclave a 121 ºC, durante 20 min. El medio APG fue utilizado para cultivos de rutina, con el objeto de propagar el micelio. 2.1.2. Cepas utilizadas Las cepas utilizadas se hallan depositadas en la colección de cultivos fúngicos de Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB‐INTECH), sede Chascomús, siglas ICFC de la Federación Mundial de Colección de cultivo (WFCC 826, ICFC); Tabla 6). Tabla 6. Listado de especies y cepas utilizadas. Especie Nº ICFC Procedencia
Sustrato
233/00 Brasil, Río Grande do Sul, Viamao, Parque St. Hilaire Polyporus tenuiculus 383/00 Brasil, Río Grande do Sul, Porto Alegre, Parque Farouquilla Madera muerta indeterminada ‐ Polyporus tenuiculus 418/01 Argentina, Misiones, Iguazú, Bosque Palo Rosa, Palmital ‐ Polporus tenuiculus Pleurotus ostreatus 153/99 Argentina, Bs As, Punta indio, Cultivo Coipiro, cepa comercial ‐ P á g i n a | 42 2.1.3. Determinación de la temperatura de incubación del micelio Se determinó la temperatura óptima de crecimiento vegetativo de 3 cepas de P. tenuiculus (ICFC 233/00, ICGC 383/00 y 418/01). Se utilizaron placas de Petri conteniendo 20 ml de medio sólido APG y se inocularon tres réplicas por cepa y temperatura de incubación (20, 25 y 30 ºC). Se usó como inóculo, un trozo de agar de 5 mm de diámetro tomado de la periferia de un cultivo crecido durante una semana a 25 ºC en el mismo medio. Se registró el diámetro de la colonia cada 48 h. en dos direcciones perpendiculares y se calculó el promedio para cada par de datos. Las mediciones fueron realizadas en cada caso hasta que el micelio cubrió completamente la superficie de la placa de Petri. 2.1.4. Análisis cualitativo de la actividad de enzimas lignocelulolíticas 2.1.4.1. Actividad celulolítica Se evaluó la actividad celulolítica mediante el método propuesto por Mercuri (1987), usando carboxymetilcelulosa (CMC) como sustrato para medir la actividad endoglucanasa. Este ensayo es un buen indicador de la capacidad celulolítica (Cai et al., 1994; Buswell et al., 1996; Pointnig et al., 1999a). Se analizaron 2 cepas de P. tenuiculus (ICFC 383/00 y 233/00) y se usó como control la cepa ICFC 153/99 de P. ostreatus, utilizando tres cajas por cepa. Se inoculó en el centro de la placa conteniendo 20 ml de medio CMC solidificado con un taco de agar de 5 mm tomado de la periferia de un cultivo crecido durante una semana a 25 ºC en medio APG. Se incubó a 25 ºC en oscuridad. Se midió con una regla (0.5 mm) el halo producido por la actividad enzimática (decoloración), cada 2 días con una regla (0.5 mm), hasta llegar al borde de la caja de Petri. Para el “revelado” se vertió una solución de rojo congo (0,1 %) hasta cubrir el agar de las colonias crecidas por 2 min., basándonos en la afinidad del colorante con los polímeros β 1‐4 de glucosa (Beguin, 1983). Inmediatamente después, se lavaron con una solución 1 M de NaCl. Luego, se agregó ácido acético (5 %) por 30 seg. para proveer contraste, virando el medio a color azul. P á g i n a | 43 Para evaluar la magnitud de la reacción enzimática, los cilindros teñidos se observaron en una lupa con transiluminador. Se graficó el diámetro del halo de degradación y el crecimiento de la colonia en función del tiempo trascurrido. 2.1.4.2. Actividad ligninolítica: Decoloración de Poly R­478 Se analizó la actividad ligninolítica mediante la decoloración del colorante polimérico Poly R‐478, de acuerdo con el método descripto por Gold et al. (1988). La decoloración de este compuesto ha sido correlacionada positivamente con la producción del polifenoloxidasas, lignina peroxidasa, Mn peroxidasa (Boominathan & Reddy, 1992) y laccasa (Pointning et al., 2000). Se utilizaron placas de petri conteniendo 20 ml de medio de Nobles (1965) y 0.2% de Poly R‐478. Se inoculó en el centro de la placa con un taco de agar de 5 mm tomado de la periferia de un cultivo crecido durante una semana a 25 ºC en medio APG. Se incubó a 25 ºC en oscuridad. Se midió el halo producido por la actividad enzimática (decoloración), así como el crecimiento de la colonia cada 2 días con una regla (0.5 mm), hasta llegar al borde de la caja de Petri para las cepas de mayor velocidad de crecimiento y 21 días para aquellas de crecimiento lento. Se graficó el diámetro del halo de degradación y el crecimiento de la colonia en función del tiempo. Se utilizaron las mismas cepas de P. tenuiculus y de P. ostreatus empleadas en el apartado 2.1.4.1., utilizando tres repeticiones por cepa. 2.1.5. Cultivo utilizando sustratos tradicionales: paja de trigo y aserrín de sauce 2.1.5.1. Preparación del inóculo o “semilla” El inóculo o “semilla” fue preparado en bolsas de prolipropileno de 25 x 45 cm. y 30 μm de grosor, conteniendo 600 g de granos de trigo (Triticum sp.) suplementado con 2 % p/p de CaCO3. Las bolsas fueron esterilizadas en autoclave a 121 ºC durante 2 h e inoculadas con 2 tacos de agar con micelio crecido en medio sólido APG. Se incubó a 25 P á g i n a | 44 ºC en oscuridad, evaluando el tiempo necesario para la colonización completa de los granos. 2.1.5.2. Formulado, preparación de sustratos y condiciones de incubación Se seleccionaron varios tipos de residuos agroindustriales para ser utilizados como sustrato para cultivo. Se emplearon aserrín de sauce (Salix sp., AS) y paja de trigo (Triticum sp., PT). Además se utilizaron suplementos tales como: salvado de trigo, harina de soja, semillas de mijo y avena arrollada. En la tabla 7 se pueden observar las diferentes formulaciones de sustratos utilizadas. Tabla 7. Composición de sustratos. Sustratos PT PTs AS AS1 AS2 AS3 Composición (%) Harina de soja Paja de trigo (98)
Paja de trigo (78) Aserrín de sauce (98)
Aserrín de sauce (78)
Aserrín de sauce (73)
Aserrín de sauce (78)
‐
5 ‐ 5
5 10
Suplementos (%)
Salvado de Semilla de trigo mijo ‐
15 ‐ 15
15 ‐
‐
‐ ‐ ‐
5 ‐
Avena arrollada CaCO3
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 10 2 2 2 2 2 2 Para la preparación de los bloques de sustratos, primero el material fue procesado a un tamaño de 1,5 a 3 mm para el AS y de 30 a 50 mm para la PT. Luego cada formula empleada fue mezclada con 2 % p/p de CaCO3. Se agregó agua desionizada a todas las fórmulas hasta obtener 70 % de humedad. Se llenaron bolsas de polipropileno de 25 x 45 cm. y 30 μm de espesor con 1 Kg. de sustrato húmedo. Las bolsas fueron cerradas mediante el empleo de cilindros de PVC y tapones de algodón y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 2,5 h, dos veces a intervalos de un día. Una vez que las bolsas alcanzaron la temperatura ambiente, fueron inoculadas con 5 % p/p de semilla e incubadas a 25 °C en oscuridad. P á g i n a | 45 2.1.5.3. Cultivo de cepas de Polyporus: diseño experimental y condiciones de fructificación 1. Selección de cepas de P. tenuiculus y efecto del sustrato: Se utilizaron dos cepas de P. tenuiculus (ICFC 233/00 y 383/00) para la evaluación de los efectos del sustrato en el rendimiento. Se utilizó como sustrato aserrín de sauce con y sin suplemento (AS y AS1, Tabla 7), y paja de trigo con y sin suplemento (PT y PTs, Tabla 7). Se utilizaron 6 réplicas por sustrato y cepa. Además se evaluó el tiempo que tardó el micelio en invadir completamente el sustrato y formar un bloque compacto (tiempo óptimo de incubación). 2. Estudio del efecto del suplemento en el rendimiento: Se seleccionó la cepa ICFC 383/00 de P. tenuiculus (Tabla 6) por ser la que obtuvo mayor rendimiento en el experimento previo y se la cultivó en AS con diferente proporciones de suplemento (AS1, AS2 y AS3). Se utilizaron 8 réplicas por sustrato. 3. Efecto de la aplicación de tratamientos previos a la inducción en el rendimiento y otros parámetros de producción: Se utilizó la cepa ICFC 383/00 de P. tenuiculus y se la cultivó en AS, AS1 y AS2. Se realizaron dos tratamientos: a) Shock térmico (ST), previamente a la inducción de la fructificación, las bolsas se colocaron a 5 ºC durante 24 h; b) Exposición a la luz (EL), los bloques de sustrato fueron expuestos a un fotoperíodo de 12h luz/oscuridad, durante 12 días a 15 ± 3 ºC. Se utilizó como control bloques de sustrato sin inducción (SI). Se utilizaron 8 réplicas por sustrato y tratamiento. Posteriormente y para todos los casos, las bolsas fueron removidas y los sustratos colonizados o “bloques” de producción fueron transferidos a condiciones de fructificación (20 ±2 ºC con fotoperíodo de 9 h. luz / 15 h. oscuridad y humedad del 75‐
85 % (riego por aspersión 5 min. cada 8 h) para obtener basidiocarpos. 2.1.5.4. Período de cosecha, rendimiento y otros parámetros analizados Se recolectaron una a seis oleadas durante el período de cosecha, definido como el tiempo entre el día de inducción (en el que se pasa las bolsas de condiciones de P á g i n a | 46 incubación del micelio a condiciones de fructificación) y el último día de cosecha. El período de cosecha duró entre 30 y 90 días, según la cepa y la fórmula empleada. Se colectaron fructificaciones maduras y se registraron los siguientes parámetros de producción: i) precocidad: tiempo (en días) desde la inducción hasta la cosecha de los primeros cuerpos fructíferos (Larraya et al., 2003); ii) eficiencia biológica (EB): peso fresco de las fructificaciones (o rendimiento total, RT)/peso seco del sustrato (expresado como porcentaje); iii) número de oleadas y distribución del rendimiento por oleada, expresado como porcentaje; iv) número de fructificaciones colectadas en la primer oleada; v) diámetro del píleo (cm.); vi) peso promedio de cada fructificación (Peso fresco total de hongos cosechados/número total de hongos cosechados); vii) distribución de tamaños de las fructificaciones obtenidas. Los parámetros de peso fresco, diámetro y distribución de tamaños de los cuerpos de fructificación fueron registrados utilizando basidiocarpos de la primera oleada. Para las mediciones de tamaño, los cuerpos de fructificación fueron medidos con una regla. El diámetro del píleo fue calculado como el promedio (valor medido x el número de hongos de ese grupo/número total de hongos). Teniendo en cuenta tamaños similares de diámetro, se agruparon de la siguiente manera: grupo 1 (G1) diam < 5,4 cm.; G2, diam 5,5 – 9,4 cm.; G3 > 9,5. En el primer y segundo experimento sólo se determinó el promedio de la EB de las dos cepas cultivadas en los diferentes sustratos, mientras que en el tercero se midieron todos los parámetros mencionados. 2.1.6. Uso de sustratos no tradicionales para el cultivo de P. tenuiculus: uso de residuos de plantas aromáticas utilizadas para la extracción de aceites esenciales 2.1.6.1. Cepas utilizadas Se utilizaron P. tenuiculus, ICFC 383/00 y P. ostreatus, ICFC 153/99; esta última empleada como control (Tabla 1). P á g i n a | 47 2.1.6.2. Preparación del sustrato y condiciones de cultivo Se seleccionaron varias especies de plantas aromáticas disponibles en la región para ser utilizados como sustrato para cultivo: i) hojas de Laurus nobilis (L), ii) Eucalyptus cinerea (E) ambas especies colectadas de plantaciones naturales localizadas en la Ciudad de Chascomús (Buenos Aires), dos especies de orégano, iii) Origanum vulgare (OV) y iv) Origanum x applii (OxA), ambas cosechadas del campo experimental de la Facultad de Cs. Agropecuarias de la Universidad Nacional de La Plata (Buenos Aires). Con el fin de simular el proceso de destilación que se realiza en una planta productora de los aceites esenciales y obtener el residuo para ser usado en el cultivo de hongos comestibles, cada sustrato fue colocado en una olla sin tapa con agua destilada y hervido por una hora para evaporar el contenido de aceites esenciales. Luego de este proceso, se coló el material para escurrir el exceso de agua y llegar a un contenido de humedad final del 70%. Se utilizó como control, paja de trigo (PT) picada a un tamaño de 30 a 50 mm de longitud. El 98 % de la composición de cada sustrato consistió en el residuo de cada una de las plantas aromáticas antes mencionadas o paja de trigo. Luego fueron mezclados con 2 % p/p de CaCO3. Sólo se agregó agua destilada a la paja de trigo hasta obtener 70 % de humedad. Para el llenado de bolsas, esterilización, inoculación e incubación se siguió el procedimiento explicado en el apartado 2.1.5.2 empleándose bolsas con 350 g de sustrato húmedo. Una vez que el micelio invadió todo el bloque de sustrato, se removió la bolsa de polipropileno y se transfirieron a la sala de cultivo. Además, se determinó el tiempo de incubación para cada una de las dos especies. Se realizaron 5 réplicas por fórmula y por especie. Los cuerpos de fructificación de cada especie cosechados de cada sustrato fueron utilizados para otros estudios (Véase Cáp. 2 y 3). 2.1.6.3. Evaluación del rendimiento y calidad de fructificaciones obtenidas Se recolectaron de una a tres oleadas durante el período de cosecha, que se prolongó entre 30 y 60 días, según la especie y la fórmula empleada. Todos los bloques de producción fueron retirados luego de 60 días bajo condiciones de fructificación. Se P á g i n a | 48 colectaron fructificaciones maduras y se registraron los siguientes parámetros de producción: i) tiempo de incubación (días) de cada cepa; ii) precocidad: tiempo (en días) desde la inducción hasta la cosecha de los primeros cuerpos fructíferos (Larraya et al., 2003); iii) EB (expresado como porcentaje); iv) número de fructificaciones colectadas en la primera oleada; v) contenido de humedad de las fructificaciones: fue determinado por diferencia de peso. Las fructificaciones se secaron en una estufa convencional a 60ºC hasta peso constante durante 48 h (Bonati et al., 2004); vi) diámetro de los píleos (cm.); vii) distribución de tamaño de fructificaciones cosechadas; viii) peso fresco promedio de las fructificaciones. Los parámetros de peso, contenido de humedad, diámetro y distribución de tamaños de los cuerpos de fructificación fueron registrados utilizando basidiocarpos exclusivamente de la primera oleada. Para las mediciones de tamaño, los cuerpos fructíferos fueron agrupados por tamaño similar (± 1 mm). El número de grupos dependió de la variación de tamaños de cada cosecha. Se midió el diámetro de un basidiocarpo elegido al azar de cada grupo como se indicó en el apartado 2.1.5.4. Para determinar la distribución de tamaños, los basidiocarpos se agruparon por tamaño similar de la siguiente manera: Grupo1 (G1) diámetro < a 5 cm., Grupo 2 (G2) diámetro entre 5‐ 6,4 cm. y Grupo 3 (G3) diámetro > a 6,5 cm. Los hongos una vez secos fueron guardados en frascos para posteriores determinaciones. 2.1.7. Cultivo de P. tenuiculus en troncos 2.1.7.1. Cepas utilizadas Se utilizaron dos cepas de P. tenuiculus ICFC 383/00 y la ICFC 233/00 (Tabla 6). 2.1.7.2. Preparación de troncos y condiciones de cultivo Se utilizaron troncos recién cortados de tres especies de árboles presentes en la zona de Chascomús: Eucalyptus camaldulensis (ECa), Populus alba (PA) y Eucalyptus cinerea (ECi). Se seleccionaron troncos con un diámetro entre 10 y 25 cm. y 1 m de largo con el fin de estandarizar los tamaños y facilitar su manejo. Se hicieron agujeros con un P á g i n a | 49 taladro usando una mecha especial con tope de 1,5 cm. de diámetro y 3 cm. de profundidad como los que se emplean para el cultivo de shiitake. Los orificios se realizaron a una distancia de 10 cm. a lo largo y ancho de cada tronco (Fig. 9). Los troncos de E. calmadulensis y P. alba, fueron inoculados con las cepas de P. tenuiculus ICFC 233/00 y 383/00, y los de E. cinerea sólo con la cepa ICFC 383/00. Cada agujero fue llenado con inóculo (“semilla”) y sellados con parafina líquida. Luego de la inoculación, los troncos fueron depositados en una fosa o trinchera, cavada en la tierra bajo un bosque de árboles y tapada con chapa y bolsas de plástico negra y finalmente cubierta por una capa de tierra de manera de poder mantener la temperatura entre 15 ± 25 ºC y la humedad entre 65‐75 %. Se realizaron 6 réplicas por cada especie de árbol y cepa. Los troncos fueron incubados hasta que el micelio los invadió completamente. Luego se pasaron a una sala de fructificación con fotoperíodo de 9 h luz/15 h oscuridad y humedad del 75‐85 % (riego por aspersión 5 min. cada 8 h/día) para inducir la formación de basidiocarpos. Se trató de mantener las condiciones similares a la naturaleza por lo que no se tuvo control de la temperatura ambiente durante todo el ciclo de cultivo. Fig. 9. Esquema de las perforaciones realizadas en los troncos. 2.1.7.3. Período de cosecha, rendimiento y otros parámetros analizados El período de cosecha se contabilizó durante 2 años, según la cepa y la madera empleada. Se colectaron fructificaciones maduras y se registraron los parámetros de producción y calidad como se definieron en el punto 2.1.5.4: i) eficiencia biológica (EB); ii) número de fructificaciones colectadas en la primera oleada; iii) Peso fresco de los CF; P á g i n a | 50 iv) diámetro de los píleos (cm.); v) distribución de tamaño de fructificaciones cosechadas. Los parámetros de peso fresco, diámetro y distribución de tamaños de los cuerpos de fructificación fueron registrados utilizando únicamente basidiocarpos de la primera oleada. Para las mediciones de tamaño, los cuerpos fructíferos fueron agrupados por tamaño similar (± 1 mm). Se midió el diámetro de un basidiocarpo elegido al azar de cada grupo véase el apartado 2.1.5.4. Los basidiocarpos se agruparon por tamaño similar según se indicó el apartado 2.1.5.4. P á g i n a | 51 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Determinación de la temperatura de incubación del micelio Con el fin de poder determinar los parámetros y las condiciones ideales para la producción del cultivo de P. tenuiculus, se realizaron numerosos ensayos. En primer lugar se procedió a establecer la temperatura óptima de incubación midiendo el crecimiento del micelio de varias cepas de P. tenuiculus a 20, 25 y 30 ºC. En la Tabla 8 se representan los valores promedio del diámetro de la colonia obtenido para cada cepa y temperatura en el día 9 de cultivo; se eligió ese día ya que todas las cepas se encontraban en fase de crecimiento exponencial. En la Fig. 10, se representa el crecimiento en función del tiempo (mm/día) de cada cepa; las que requirieron de 12 a 20 días para completar la placa de Petri según la temperatura. Velocidad de crecimiento (mm/día)
8
20°C 25°C 30°C e
c
6
c
c
4
ab
ab
b
ab
a
2
0
ICFC 418/01
ICFC 233/00
Cepas de P. tenuiculus
ICFC 383/00
Fig. 10. Efecto de las diferentes temperaturas sobre la tasa de crecimiento relativo del micelio de P. tenuiculus (ICFC 233/00, 383/00 y 418/01). Los valores que no comparten la misma letra son considerablemente diferente en p<0,05. Como se observa en la Tabla 8, la cepa ICFC 383/00 presentó en el día 9 un crecimiento significativamente mayor a 30 ºC (p<0,05), y el menor a 20 ºC (p< 0,05). La cepa ICFC 233/00 no tuvo diferencias en el diámetro de crecimiento a 25 y 30 ºC y P á g i n a | 52 el menor fue a 20 ºC (p<0,05). Por último, la cepa ICFC 418/01 no tuvo diferencias significativas en el diámetro de la colonia a las tres temperaturas ensayadas mientras que el crecimiento a 25 y 30 ºC fue significativamente menor que en las otras dos cepas (p<0,05). Tabla 8. Crecimiento (cm.) vegetativo en placa de Petri de tres cepas de P. tenuiculus a diferentes temperaturas de incubación, al día 9 de cultivo. Diámetro de la colonia (cm.)* Temp. óptima (ºC) Cepa 383/00 20 ºC 2,50 ± 0,301
25 ºC 4,50 ± 0,172B
30 ºC 5,93 ± 0,913C
30 233/00 2,03 ± 0,151
4,30 ± 0,442B
4,87 ± 0,322B
25, 30 418/01 2,27 ± 0,061
2,50 ± 0,171A
1,87 ± 0,061A
20, 25,30 * Valores promedios de tres réplicas, se usaron números para destacar la significancia estadística entre valores tomados a las tres temperaturas para cada cepa, y letras para destacar la significancia estadística entre valores de las distintas cepas a 25 y 30 ºC. En la Fig. 10 se puede observar que a 20 ºC no hay diferencias significativas en la velocidad de crecimiento entre las tres cepas. A 25 ºC las cepas ICFC 233/00 y 383/00 alcanzaron mayor velocidad de crecimiento que la cepa ICFC 418/00 (p<0,05) demostrando que presentan un óptimo crecimiento en esta temperatura. Sin embargo, a 30 ºC se encontraron diferencias significativas en la velocidad de crecimiento entre las cepas, siendo la cepa ICFC 383/00 la que presentó el mayor valor, 6.21 mm/día (p<0,05). P. tenuiculus (ICFC 383/00) tuvo un óptimo crecimiento a 30 ºC, coincidiendo con la temperatura media de la región donde esta especie crece naturalmente la cual tiene una distribución tropical y subtropical (Borges Da Silveira & Wright, 2002). Lechner & Albertó (2007) informaron la misma temperatura óptima de crecimiento para tres cepas de Lentinus tigrinus, otra especie subtropical encontrada en la región. Este resultado indica que las diferencias encontradas en la temperatura óptima de crecimiento del micelio dependen de la cepa, tal como lo informó Ko et al. (2005) para varias especies del género Hericium. Debido a que las cepas de P. tenuiculus ICFC 383/00 y 233/00 tuvieron un crecimiento significativamente mayor que la cepa ICFC 418/01 (p<0,05), hemos seleccionado las dos primeras para realizar los ensayos de cultivo. Además, hemos observado que, independientemente de los diferentes orígenes de las cepas ensayadas, la temperatura P á g i n a | 53 óptima para el crecimiento de P. tenuiculus ocurre dentro del rango comprendido entre 25‐30 ºC. Por cuestiones operativas hemos optado por la temperatura de 25 ºC. 3.2. Análisis cualitativo de actividad enzimas lignocelulolíticas 3.2.1. Análisis cualitativo de la actividad celulolítica Se analizó cualitativamente la actividad celulolítica de las 2 cepas de P. tenuiculus seleccionadas (ICFC 233/00 y 383/00) y se la comparó con la actividad de una cepa comercial de P. ostreatus (ICFC 153/99). Como se observa en la Fig. 11, las tres cepas decoloraron de forma radial el medio de CMC. Fig. 11. Muestra el diámetro del halo de decoloración en medio CMC a los 6 y 11 días de cultivo por P. tenuiculus (ICFC 383/00 y 233/00) y P. ostreatus (ICFC 153/00). Con el fin de poder determinar la velocidad de crecimiento y degradación de las distintas cepas en el medio CMC y efectuar comparaciones se eligió el día 7 para P. ostreatus y el día 8 para P. tenuiculus, ya que a ese día todas las cepas se encontraban en fase de crecimiento exponencial. En la Fig. 12 se observa que, la velocidad de P á g i n a | 54 degradación fue significativamente mayor que la velocidad de crecimiento (p<0,05). P. ostreatus (ICFC 153/99) creció a mayor velocidad que las cepas de P. tenuiculus (p<0,05). Sorpresivamente, no se encontraron diferencias significativas entre las cepas en la velocidad de degradación del medio CMC. A pesar que las cepas tuvieron un crecimiento lento en CMC, demostraron tener una importante actividad celulolítica, indicando que ambas especies de hongos producen endoglucanasas. Finalmente podemos sugerir que P. tenuiculus parecería ser fisiológicamente capaz de utilizar la celulosa presente en muchos residuos agroindustriales como fuente de carbono ya que evidenció la producción de enzimas que degradan el medio de cultivo con CMC. Velocidad de crecimiento y degradación (mm/día)
16
14
Velocidad de crecimiento (mm/día) Velocidad de degradación (mm/día) 12
10
8
6
b
a
4
a
2
0
ICFC 153/99
ICFC 233/00
ICFC 383/00
Fig. 12. Velocidad de crecimiento y degradación de P. tenuiculus (ICFC 233/00 y 383/00) y P. ostreatus (ICFC 153/99) en medio CMC. * Valores promedio de tres réplicas. Los valores medios que no comparten la misma letra son considerablemente diferente en p = 0,05. P á g i n a | 55 3.2.2. Análisis cualitativo de la actividad ligninolítica Se analizó cualitativamente la actividad ligninolítica de las 2 cepas de P. tenuiculus seleccionadas (ICFC 233/00 y 383/00) y se la comparó con la actividad de una cepa comercial de P. ostreatus (ICFC 153/99). Las tres cepas de hongos decoloraron de forma radial el medio de NB con Poly R‐478 (Fig. 13). La cepa de P. ostreatus (153/99) fue la más eficiente, completando la decoloración del colorante en la placa a los 10 días de cultivo, seguida por las dos cepas de , la cepa 233/00 completó la decoloración a los 16 días y la cepa 383/00 a los 21 días de cultivo. Fig. 13. Muestra el diámetro del halo de decoloración en medio Poly R‐478 a los 7 y 9 días de cultivo por P. tenuiculus (ICFC 383/00 y 233/00) y P. ostreatus (ICFC 153/00). Con el fin de poder determinar la velocidad de crecimiento y degradación de las distintas cepas en el medio NB con Poly R‐478 y efectuar comparaciones se eligió el día 7 para P. ostreatus y el día 8 para las dos cepas de P. tenuiculus. Como se puede observar en la Fig. 14, la velocidad de crecimiento fue significativamente mayor que la velocidad de degradación del colorante (p<0,05). P. ostreatus (ICFC 153/99) creció a mayor velocidad que las cepas de P. tenuiculus (p<0,05), siendo la cepa ICFC 383/00, la más lenta. Además, P. ostreatus tuvo mayor velocidad de degradación del colorante con respecto a las cepas de P. tenuiculus (p<0,05). Los datos obtenidos indicarían que ambas especies de hongos producen fenoloxidadasas y oxidasas, siendo capaces de degradar la lignina a distinta velocidad. Estos resultados podrían estar relacionado con P á g i n a | 56 diferentes estrategias para la biodegradación de la lignina, la habilidad de las cepas para producir estas enzimas y la función fisiológica propias de cada especie (Reid, 1995). Los resultados cualitativos obtenidos para P. tenuiculus son importantes ya que hasta la fecha no se encontró información con respecto a su actividad ligninolítica. Risna & Suhirman (2002) realizaron ensayos de decoloración utilizando la misma metodología, midiendo además la actividad enzimática de distintas especies de hongos de la familia Polyporaceae y encontraron que varias cepas de Trametes sp. decoloraron el medio con Poly R‐478 extensivamente y resultaron con alta actividad de lacasas, Mn peroxidasa y lignina peroxidasa, comparado con Polyporus udus. Rigas et al. (2003) obtuvieron resultados similares a los nuestros cuando realizaron un ensayo en medio de cultivo con Poly R‐478 utilizando varias especies de hongos, entre ellas P. ostreatus y varias del género Polyporus, demostrando que P. ostreatus tuvo mayor velocidad de crecimiento y degradación que las especies del género Polyporus. Finalmente podemos sugerir que P. tenuiculus produciría enzimas ligninolíticas las cuales contribuirían a degradar los componentes lignocelulósicos de los desechos utilizados para la nutrición fúngica. Velocidad de crecimiento y degradación (mm/día)
14
12
10
b
8
B
6
A
a
4
a
2
0
Velocidad de crecimiento (mm/día)
Velocidad de degradación (mm/día)
C
ICFC 153/99
ICFC 233/00
Cepas de P. tenuiculus
ICFC 383/00
Fig. 14. Velocidad de crecimiento y degradación de P. tenuiculus (ICFC 233/00 y 383/00) y P. ostreatus (ICFC 153/99) en medio de Nobles con Poly R‐478. * Valores promedios de tres réplicas, se usaron letras mayúsculas para destacar la significancia estadística entre los valores de la velocidad de crecimiento de cada cepa, y letras minúsculas para destacar la significancia estadística entre los valores de la velocidad de degradación de cada cepa. P á g i n a | 57 3.3. CULTIVO 3.3.1. Selección de cepas de P. tenuiculus y efecto del sustrato en el rendimiento Con el objetivo de elegir la cepa y el sustrato adecuado para el cultivo de P. tenuiculus, se cultivaron dos cepas (ICFC 233/00 y 383/00) en paja de trigo y aserrín de sauce con y sin suplementar (PT, PTs, AS y AS1). Luego de 21 días de incubación a 25 ºC, se obtuvo el inóculo de alta calidad que fue utilizado para inocular los sustratos. Todas las cepas colonizaron el sustrato luego de 45 días de incubación a 25 ºC, pero fueron necesarios un total de 60 días para obtener una matriz de micelio que permita la formación de un bloque compacto que no se disgregara al remover la bolsa cuando fueron pasados a la sala de fructificación. Además, es importante destacar que luego de 45 días de incubación, se observaron en los bloques de sustrato la formación de manchas (“spots”) de color marrón oscuro que cubrían entre el 5 y el 70 % de la superficie de los bloques (Fig. 15). Estas manchas Fig. 15. Bloque de sustrato de 45 días de incubación inoculado con P. tenuiculus. Obsérvese la formación de manchas marrones recuerdan al fenómeno de amarranomiento que sufren los bloques de sustratos inoculados con Lentinula edodes, en los cuales el micelio marrón forma una estructura como si fuera una “piel” protectora sobre la superficie de los mismos. Este fenómeno P á g i n a | 58 es debido a la reacción de oxidación de fenol oxidasas causada por la luz y el oxígeno. Esta cubierta actúa como una barrera protectora para evitar la pérdida de humedad del sustrato y como defensa contra la invasión de microorganismos contaminantes (Przybylowicz & Donoghue, 1988). A pesar que la paja de trigo es un excelente sustrato utilizado mundialmente para el cultivo de varias especies de hongos comestibles tales como: Pleurotus ostreatus, P. pulmonarius, P. djamor (Salmones et al., 2005), P. eryngii, P. ostreatus, Volvariela volvacea (Philippoussis et al., 2001), Agrocybe cylindracea (= A. aegerita) (Uhart et al., 2008, Philippoussis et al., 2001), y Lentinula edodes (Gaitán‐Hernández et al., 2006), P. tenuiculus, sin embargo, obtuvo el mejor rendimiento en aserrín de sauce suplementado. Además, estos resultados confirmarían que el uso de suplementos normalmente provee los nutrientes necesarios, tales como: nitrógeno, fósforo, potasio y carbohidratos que son utilizados con el fin de incrementar el rendimiento y reducir el tiempo de formación de primordios (Gaitán‐Hernández et al., 2006; Yildiz et al., 2002; Royse & Sánchez, 2007; Philippoussis et al., 2007). Promedio de EB (%)
100
80
PT
PTs
AS
AS1
d
c
b
bc
b
b
60
a
a
40
20
0
Cepas de P. tenuiculus
Fig. 16. Eficiencia biológica de dos cepas de P. tenuiculus (ICFC 233/00 y 383/00) cultivadas en paja de trigo y aserrín de sauce con y sin suplemento. Se utilizaron letras para destacar la significancia estadística. Cabe destacar que el efecto de la adición de un suplemento sobre el rendimiento dependió de la cepa utilizada (genotipo); la cepa de P. tenuiculus ICFC 383/00 rindió un 33 % más que la cepa ICFC 233/00. Este resultado concuerda con los publicados P á g i n a | 59 por Ko et al. (2005), quienes enfatizaron la importancia de testear la capacidad de aprovechar diferentes suplementos en cultivo de distintas cepas de Hericium erinaceum. Estos resultados permitieron encontrar la combinación de cepa y sustrato que obtuvo el mayor rendimiento; concluyendo que el aserrín suplementado (S1) y la cepa ICFC 383/00, resultaron la mejor combinación por lo que fueron seleccionados para continuar con los demás experimentos de cultivo. 3.3.2. Efecto del suplemento en el rendimiento Se estudió el efecto del uso de aserrín de sauce con diferentes composiciones de suplementos (AS1, AS2 y AS3) en el rendimiento de la cepa de P. tenuiculus ICFC 383/00 (Fig. 17), con el objetivo de establecer una metodología de producción capaz de soportar una actividad agro‐económica relevante. Como se puede observar en la Fig. 17, la menor EB se obtuvo cuando esta cepa se cultivó en aserrín sin suplementar (45,8 %) y difirió significativamente con los rendimientos obtenidos en los bloques que tenían algún tipo de suplemento (p< 0,05). Los mayores rendimientos se obtuvieron cuando el sustrato fue suplementado. Comparando con la condición no suplementada, el rendimiento fue incrementado un 30% con avena arrollada y harina de soja (AS3); 37% con harina de soja, salvado de trigo y semillas de mijo (AS2) y 40% con harina de soja y salvado de trigo (AS1). No se observaron diferencias significativas en los valores de EB promedio entre los distintos suplementos utilizados. Tal como se informó en el punto 3.3.1., el uso de suplementos incrementó el rendimiento de cultivo de, sin importar la composición de los suplementos utilizados. Trabajos previos realizados con otras especies de hongos comestibles tales como P. ostreatus, Grifola frondosa, Lentinula edodes, Lentinus tigrinus y Hericium sp. donde utilizaron aserrín suplementado, han demostrado tener el mismo resultado (Lechner & Albertó, 2007; Royse & Sanchez‐Vazquez, 2003; Shen & Royse, 2001; Yildiz et al., 2002; Ko et al., 2005). P á g i n a | 60 100
Promedio de EB (%)
80
AS
AS 1
AS 2
AS 3
b
b
b
60
a
40
20
0
AS
AS 1
AS 2
AS 3
P. tenuiculus ICFC 383/00
Fig. 17. Eficiencia biológica de P. tenuiculus ICFC 383/00 cultivadas en aserrín de sauce sin y con el agregado de distintos suplementos. Se utilizaron letras para destacar la significancia estadística. La EB obtenida sobre aserrín de sauce, la relativamente alta temperatura de fructificación, y técnicas de cultivo sencillas, indican que podría ser una especie interesante para la producción comercial, sobre todo para áreas tropicales y subtropicales. Favorecido además, por el incremento en el consumo mundial de madera, actividad que produce acumulo creciente de desechos ambientales (110000 ton/año, dato de http://www.fao.org), los cuales podrían ser destinados al cultivo de hongos comestibles. 3.3.3. Efecto de tratamientos de inducción en la precocidad y el rendimiento Se analizó el efecto de la aplicación de dos tratamientos de inducción, shock térmico (ST) y exposición a la luz (EL), en la precocidad (aparición de primordios) y en el rendimiento de la cepa de P. tenuiculus ICFC 383/00 cultivada en aserrín de sauce sin suplementar (AS) y con dos tipos de suplementos (AS1 y AS2). La precocidad tuvo variaciones con la aplicación de los tratamientos de inducción (Tabla 9). Cuando los bloques de sustrato fueron trasferidos a la sala de fructificación P á g i n a | 61 sin la aplicación de un tratamiento de inducción, los primordios tardaron entre 5 y 13 días en surgir. Con la aplicación de algún tratamiento (EL o ST) los primordios tardaron entre 10 y 17 días. Esto significa que los bloques que fueron transferidos directamente (SI) de la sala de incubación a la de fructificación desarrollaron los cuerpos de fructificación más tempranamente que aquellos que recibieron algún tratamiento, independiente de la composición del sustrato. Cabe destacar que cuando los sustratos recibieron el ST, se logró una sincronización en la aparición de la primer oleada similar a lo que ocurre con L. edodes (Przybylowicz & Donoghue, 1988). Esto significa que la aparición de primordios fue disparada al mismo tiempo en todos los bloques de sustrato. La sincronización de los bloques es por lo general un rasgo deseado para cultivadores ya que facilita el manejo del cultivo. Además, no se encontró correlación entre el uso de algún tratamiento y la formación de manchas (“spots”) sobre la superficie de los bloques. Igualmente, no se pudo encontrar una correlación entre la EB y el porcentaje de manchas siendo AS el sustrato donde se registraron los mayores porcentajes de manchas (datos no mostrados). Tabla 9. Rendimiento, tiempo de aparición de primordios, distribución del rendimiento en oleadas y número de cuerpos fructíferos de P. tenuiculus ICFC 383/00 cultivado en aserrín de sauce con y sin suplementar sometidos o no a tratamientos de inducción. Distribución del rendimiento por oleada (%) Nº Cuerpos Total EB %a fructíferos b Sustratos Tratamiento Precocidad (días) AS S 8 51.06 22.98 15.04 9.70 8.00 ‐ 45.3±19.4a 231±12,97a, 1 AS EL 13 42.03 35.13 18.72 14.47 ‐ ‐ 23.1±12.6 105 ± 3,74a, 1 AS ST 14 50.52 33.12 18.10 11.70 ‐ ‐ 31.2±13.9a 130 ± 6,37a, 2 AS1 S 8 41.19 22.21 14.22 9.70 7.85 8.79 71.18±16 440 ± 8,00b, 1 AS1 EL 11 51.14 22.41 14.48 11.97 ‐ ‐ 69.8 ±12.5b 354 ± 5,26b, 1 AS1 ST 13 47.93 17.51 15.43 13.91 13.35 ‐ 63±16.4b 212 ± 5,16b, 2 AS2 S 10 40.13 25.90 18.00 13.08 10.66 ‐ AS2 EL 14 34.31 26.61 18.00 13.31 10.65 AS2 ST 13 54.96 21.10 13.74 6.13 4.07 primera segunda
tercera
cuarta
quinta
sexta a
b
b
69.45±15.8 378 ± 8,32b, 1 ‐ 82.7±17.2b 495 ± 6,20b, 1 ‐ 60.86±22.8b 230 ± 5,28b, 2 Valores promedio de ocho replicas, se utilizaron letras para destacar la significancia estadística entre los valores tomados en los tres tratamientos para cada sustrato, y números para destacar la significancia estadística entre los valores de los distintitos tratamientos en cada sustrato. Los valores que no comparten letras/números son significativamente diferentes a p< 0,05. Sustratos: AS: Aserrín de sauce; AS1: Aserrín de sauce + salvado de trigo + harina de soja; AS2: Aserrín de sauce +salvado de trigo+ harina de soja + mijo. Tratamientos: S: sin tratamiento, EL: exposición a la luz, ST: shock térmico. a, b P á g i n a | 62 El número de oleadas obtenidas a lo largo de los 90 días de cultivo varió entre 4 y 6 (Tabla 9). En la condición no suplementada el número de oleadas fue generalmente 4, mientras que en los sustratos suplementados fue principalmente 5. Las oleadas estuvieron separadas por 13 o más días en los cuales no se observaron fructificaciones. Cabe destacar que los sustratos suplementados aumentaron el número de oleadas, generalmente de 4 a 5, lo cual contribuyó al incremento en el rendimiento. Este efecto también fue observado con tres cepas de Agrocybe cylindracea por Uhart et al. (2008), en las cuales el número de oleadas aumentó de 2 a 3 cuando se utilizaron sustratos suplementados. Por otro lado, la aplicación de algún tratamiento de inducción (EL o ST) no tuvo efectos significativos en el rendimiento a diferencia de lo que ocurre con la especie Lentinula edodes, donde se recomienda la aplicación de shock térmico para la eficiente inducción de la fructificación (Pire, 2000). El mayor rendimiento fue obtenido con AS2, aunque no mostró diferencias significativas con AS1, tal como se ha demostrado en los ensayos anteriores (3.3.1/.2). Cabe destacar que la elección del uso de aserrín suplementado como sustrato para producción y los resultados obtenidos, concuerdan con trabajos previos realizados en otras especies de hongos comestibles, donde se informó que era un sustrato conveniente para ser utilizado en cultivo (Lechner & Albertó, 2007; Royse & Sanchez‐
Vázquez, 2003; Shen & Royse, 2001; Zhang et al., 2002). La EB obtenida en aserrín sin suplementar fue 0,3 a 2,6 veces significativamente menor con respecto a los sustratos suplementados (p< 0,05). En lo que respecta a la distribución del rendimiento en las distintas oleadas, éstas tienen un patrón similar independientemente de la composición del sustrato o aplicación de algún tratamiento de inducción. Además, se pudo determinar que en las primeras dos oleadas se obtiene más del 65 % del total del rendimiento. En cuanto al porcentaje de rendimiento de hongos cosechados por oleada, P. tenuiculus tuvo un comportamiento similar que L. edodes (Gaitán‐Hernández et al., 2006; Philippoussi et al., 2007), P. ostreatus, P. pulmonaius y P. eringii (Philippoussis et al., 2001), obteniendo valores promedios en la primer oleada de 45,92 % y en la segunda de 25,55 %. Como fue previamente informado por Philippoussis et al. (2001), la distribución del rendimiento no es homogénea, ya que la fracción más importante del rendimiento sucede en las dos primeras oleadas (> al 50 %). Las dos primeras oleadas P á g i n a | 63 ocurren durante los primeros 26 días de cultivo, cuyo máximo fue fijado en 90 días; esto significa que el descarte de los bloques de producción luego de la cosecha de las dos primeras oleadas puede ser una excelente solución para los problemas de espacio y/o contaminación de bloques viejos en las salas de fructificación, favoreciendo al mismo tiempo el aumento de la productividad. El número total de cuerpos de fructificación obtenidos varió entre 105 y 495, encontrándose diferencias significativas con respecto al tratamiento aplicado y al uso de suplementos. Los bloques de aserrín suplementado, AS1 y AS2, obtuvieron un número significativamente mayor de fructificaciones (p<0,05). Por otro lado, el menor número de fructificaciones se obtuvieron cuando los bloques de sustrato fueron expuestos al ST (p<0,05). Nuestros resultados demuestran que la aplicación de tratamientos de inducción en esta especie no tiene efecto alguno sobre el rendimiento. Por el contrario, la suplementación del sustrato afecta en gran medida la producción, aumentando el número de fructificaciones obtenidas. 3.3.4. Efecto del suplemento y tratamientos de inducción en las características de las fructificaciones Se evaluó el efecto de la aplicación de tratamientos de inducción y el uso de suplementos en los bloques de sustrato, y su influencia en las características (peso y diámetro) de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus. La morfología de los cuerpos de fructificación obtenidos en cultivo tuvo un desarrollo normal comparado con los especimenes colectados de la naturaleza. Como se puede observar en la Tabla 10, los valores promedios de diámetro de los píleos variaron entre 5,9 ± 0,57 y 8,1 ± 1,4 cm., mostrando diferencias significativas sólo a nivel de sustratos (p<0,05). El diámetro de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus se incrementó con la adición de mayor porcentaje de suplemento, los cosechados en AS2 fueron de mayor tamaño y significativamente diferentes a los cosechados de AS1 y AS (p<0,05) a diferencia de lo informado por Yildiz et al. (2002), donde obtuvieron píleos mas grandes de P. ostreatus empleando aserrín no suplementado. Philippoussis et al. (2007) por el contrario, no encontraron diferencias significativas en el diámetro de los P á g i n a | 64 píleos de L. edodes producidos mediante el empleo de diferentes sustratos suplementados. Por otro lado, se pudo observar que la aplicación de algún tratamiento de inducción no tuvo un efecto significativo en el tamaño de los hongos cosechados. También se determinó el peso fresco promedio de los cuerpos de fructificación mediante el cociente entre el peso fresco total de los hongos cosechados de cada sustrato y tratamiento, sobre el número total de fructificaciones obtenidas. Este valor oscila en promedio entre 4,01 y 6,36 g (Tabla 10). Tabla 10. Peso y diámetro promedio del píleo de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus cultivados sobre aserrín de sauce con y sin suplemento sometidos o no a tratamientos de inducción. Sustrato AS AS AS S1 S1 S1 S2 S2 S2 Tratamiento S EL ST
S
EL
ST S EL ST
Diám. de basidiocarpoa 6,02 ± 0,64 a 6,08 ± 0,59 a 6,71 ± 1,10 a 6,10 ± 0,37 a 5,90 ± 0,57 a 6,20 ± 0,18 a 7,30 ± 0,50 b 6,30 ± 0,60 b 8,10 ± 1,40 b Peso promedio basidiocarpo (g) 5,81 4,01 4,23
5,21
4,67
4,28 6,01 4,41 6,36
a Valores promedio de ocho replicas, se utilizaron letras para destacar la significancia estadística entre los tres sustratos. Los valores que no comparten letras son significativamente diferentes a p< 0,05. Sustratos: AS: Aserrín de sauce; AS1: Aserrín de sauce + salvado de trigo + harina de soja; AS2: Aserrín de sauce +salvado de trigo+ harina de soja + mijo. Tratamientos: S: sin tratamiento, EL: exposición a la luz, ST: shock térmico. Cuando los basidiocarpos fueron agrupados según tres tamaños predeterminados (G1, G2 y G3), se pudo comprobar que más del 78 % de los cuerpos de fructificación cosechados correspondieron a los grupos G1 y G2 para todos los sustratos y tratamientos ensayados (Tabla 11). Estos resultados indican que P. tenuiculus (ICFC 383/00) se caracterizó por presentar la mayoría de los cuerpos de fructificación con tamaños de diámetro menores a 9,5 cm. Cuando se utilizó AS y AS1 se obtuvo una producción del 91 % de píleos pertenecientes a G1 y G2, mientras que con AS2 se obtuvo una producción del 78 %. Por lo tanto consideramos que los valores de G (y no los valores medios de los diámetros) podrían ser un parámetro recomendable para P á g i n a | 65 caracterizar el diámetro de los píleos de las cepas y brindar información sobre la distribución de tamaño de los cuerpos de fructificación de una forma sencilla y válida. Tabla 11. Distribución de tamaño de cuerpos de fructificación de P. tenuiculus cosechados de los distintos sustratos y tratamientos de inducción ensayados. Producción de cada grupo (%)a Sustrato Tratamiento G1 G2 G3 AS S 49.6 42.3 8.1 AS EL 52.7 39.9 7.4 AS ST 43.9 41.4 14.6 S1 S 47.7 46.5 6.7 S1 EL 53.6 38.4 7.1 S1 ST 47.3 44.3 8.3 S2 S 41.6 48 10.4 S2 EL 56.6 30.1 13.3 S2 ST 38.5 39.9 21.5 a Grupos de tamaños de cuerpos de fructificación agrupados de acuerdo a sus diámetros: G1 < 5.4 cm; G2 5.5 ‐ 9.4 cm., G3 > 9.5 cm. Sustratos: AS: Aserrín de sauce; S1: Aserrín de sauce + salvado de trigo + harina de soja; S2: Aserrín de sauce + salvado de trigo + harina de soja + semilla de mijo. Tratamientos: S: Sin inducción; ST: Shock térmico; EL: Exposición a la luz. Los resultados obtenidos con la cepa de P. tenuiculus ICFC 383/00 cultivada sobre aserrín de sauce suplementado, indican que es posible obtener fructificaciones de buen tamaño y peso, sin la necesidad de la aplicación de tratamientos de inducción, lo que simplifica el proceso de cultivo y asegura una buena producción. 3.3.5. Uso de residuos de la industria de los aceites esenciales como sustrato en el rendimiento de P. tenuiculus y P. ostreatus Se evaluó el uso del desecho producto de la destilación de plantas aromáticas para la obtención de aceites esenciales (laurel, eucalipto, y dos especies de orégano) para el cultivo de dos especies de hongos comestibles (P. tenuiculus y P. ostreatus) con el fin de poder reciclar estos desechos utilizándolos como sustrato para el cultivo de hongos P á g i n a | 66 comestibles, y de esta manera poder obtener un uso integral de los mismos reduciendo el impacto en el ambiente. Se observó que durante la etapa de incubación, los bloques de sustratos inoculados con P. ostreatus y P. tenuiculus mostraron un óptimo crecimiento del micelio, colonizando completamente todos los sustratos formado un bloque compacto, en un período de 45 y 30 días, respectivamente. Como se puede observar en la Tabla 12, P. ostreatus desarrolló las fructificaciones más precozmente que P. tenuiculus. Una vez que los bloques de sustrato se pasaron a la sala de fructificación, P. ostreatus cultivado en PT y L, requirió 3 días para desarrollar los primordios y entre 4 a 5 días en los bloques de E, OxA y OV; mientras que necesitó entre 12 y 14 días. Cuando se evaluó el rendimiento, se encontraron diferencias significativas entre las especies, sustratos y en la interacción especie*sustrato. En la Fig. 18 se muestran los valores promedios de EB de ambas especies en los diferentes sustratos; P. ostreatus fue significativamente mayor que P. tenuiculus principalmente cuando fue cultivado en PT, L, OxA y OV (p<0,05), pero no se observaron diferencias significativas con los valores de EB de P. tenuiculus cuando se usó residuo de E. Aunque P. tenuiculus cultivado en PT fue al menos 0,7 veces superior en el rendimiento con respecto a los valores obtenidos en L, OxA y OV, no se encontraron diferencias significativas, mientras que si fue significativamente diferente con el rendimiento obtenido en E (p<0,05). P. ostreatus rindió significativamente más que cuando fue cultivado sobre PT, con una EB de 127,62 %. Por otra parte, fue posible comprobar que tanto el L, E, OxA y OV pueden ser utilizados como sustratos para cultivo de ambas especies de hongos comestibles obteniendo menores rendimientos que en PT. P. ostreatus cultivado en L, OxA y OV permitió obtener una EB del 78,54, 79,36 y 61,59%, mientras que alcanzó una EB con valores menores al 21%. Los rendimientos de ambas especies cultivadas en E fueron los más bajos: 23,55 % para P. ostreatus y 13,02 % para. Cabe destacar que, los desechos producto del destilación del laurel, O. x applii y O. vulgare son buenos sustratos para cultivar P. ostreatus, ya que los valores promedio de las EB tuvieron un resultado comparable con los valores medios obtenidos por otros investigadores en el cultivo de diferentes especies de Pleurotus como P. cornucopiae, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. eryingi (Philippoussis et al., 2001; Yildiz et al., 2002; Royse et al., 2004). P á g i n a | 67 140
Promedio de EB (%)
120
100
d
Eucalipto
Laurel
O. x applii
O. vulgare
Paja de trigo
c
c
80
c
60
b
40
20
a
ab
ab ab ab
0
P. tenuiculus
P. ostreatus
Fig. 18. Eficiencia biológica obtenida sobre diferentes sustratos gastados provenientes de la industria y paja de trigo para P. ostreatus y P. tenuiculus. Se utilizaron letras para destacar la significancia estadística. Además, es importante resaltar que muchas plantas medicinales y aromáticas y sus aceites esenciales (AE) fueron investigados por la presencia de ciertos componentes activos, capaces de controlar bacterias y hongos patógenos. Müller‐Riebau (1995) demostraron el efecto antifúngico de varias plantas aromáticas (Thymbra spicata, Satureja thymbra, Salvia fruticosa, Laurus nobilis, Mentha pulegium, Inula viscosa, Pimpinella anisum, Eucaliptus camaldulensis, y Origanum minitiflorum) contra varias especies de hongos patógenos. A pesar de estos efectos, los residuos de AE presentes en los diferentes desechos de plantas aromáticas empleados en el cultivo podrían haber afectado drásticamente la producción de hongos comestibles, lo cual no ocurrió. Los resultados obtenidos, nos permiten poder recurrir a diferentes residuos de plantas aromáticas ya sea como componente principal del sustrato o bien formando parte del mismo, como un porcentaje o suplemento, y de esta manera se podría proteger al sustrato y/o a las fructificaciones de posibles contaminantes fúngicos. Durante los 60 días que permanecieron los bloques de sustrato en la sala de cultivo, P. ostreatus produjo de 2 a 3 oleadas en todos los sustratos ensayados con una separación (tiempo de recuperación) de 7 días o más. También produjo de 2 a 3 P á g i n a | 68 oleadas durante el ciclo de cultivo, pero éstas estuvieron separadas por un lapso de tiempo mayor (13 o más días). Sin bien se han publicado varios trabajos previos donde utilizan diferentes sustratos alternativos presentes en cada región, tales como: pulpa de café, jacinto de río, bagaso de caña de azúcar, malta, etc. (Zervaskis et al., 1996; Salmones et al., 2005; Ragunathan & Swaminathan, 2003; Zheng & Swaminathan, 2000; Rolz et al., 1986), para el cultivo de hongos comestibles sólo hemos encontrado un registro donde se utilizan desechos de plantas aromáticas para evaluar el rendimiento (Martinez‐Carrera et al., 1986). Los autores en él evaluaron la EB de P. ostreatus cultivado sobre hojas de desecho de zacate limón (Cymbopogon citratus), canela (Cinnamomun zeylanicum) y pimienta negra (Piper nigrum), obteniendo al menos 3 cosechas con valores de rendimiento de 113,0; 81,85 y 56,79%, respectivamente. Con los resultados obtenidos se pudo comprobar que es posible el uso de los desechos producidos por la industria de los AE (E. cinerea, L. nobilis, O. x applii y O. vulgare) para el cultivo de ambas especies de hongos, reciclando los residuos y evitando su acumulación luego que son desechados por la industria. 3.3.6. Efecto del uso de residuos de la industria de los aceites esenciales en la morfología de las fructificaciones Se evaluó el contenido de humedad, el peso fresco y el diámetro de los píleos de y P. ostreatus cultivados en paja de trigo y residuos gastados de laurel, eucalipto y las dos especies de orégano (OxA y OV). Como se puede observar en la Tabla 12, los cuerpos de fructificación de P. ostreatus tuvieron mayor contenido de humedad que los de (p<0,05); éste parámetro no mostró diferencias significativas entre los diferentes sustratos ensayados. P. ostreatus tuvo en promedio un contenido de humedad del 94,24 %, mientras que P. tenuiculus del 91,67 %. Estos valores obtenidos son acordes a aquellos reportados por Manzi et al. (1999) quienes obtuvieron valores promedio de humedad del 90.7 % en cuerpos de fructificación de P. ostreatus, y Ponmurugan et al. (2007) informaron valores promedios del 92.22 % en fructificaciones de P. florida. Al parecer, el contenido de P á g i n a | 69 humedad es exclusivamente dependiente de cada especie de hongo o condiciones ambientales y el tipo o calidad de sustrato no tendría ningún efecto (Breene, 1990). Se registraron diferencias significativas entre las especies, sustratos y en la interacción especie*sustrato. P. ostreatus registró los mayores valores de peso fresco sobre todo cuando fue cultivado en L y E (p<0,05). Mientras que obtuvo los valores más bajos de peso fresco cuando fue cultivado en E y OxA (p<0,05). Tabla 12. Parámetros de producción y calidad de fructificaciones cosechadas de P tenuiculus y P. ostreatus obtenidos en los diferentes sustratos. P. ostreatus PT L E OxA OV 3 3 5 4 5 Peso fresco
cosechado (g) 670,00
439,95
128,00
323,00
194,10
P.tenuiculus PT L E OxA OV 14 12 13 13 12 186,00
103,44
70,80
101,45
98,67
Especies Precocidad
Sustratos (días)
Contenido de
humedad CF (%)a 93,70±0,60a
94,90±0,38a
95,60±1,15a
92,80±0,38a
94,22±0,69a
Promedio peso fresco CF (g)b 5,38±0,41ab 11,20±2,75c 8,65±1,30c 6,40±2,80ab 5,77±0,76ab Diámetro
píleo (cm.)c
4,52±1,14a
5,87±1,38c
4,50±1,30ab
4,81±1,08ab
4,94±1,06bc
90,60±0,81b
92,40±1,68b
91,10±1,91b
92,67±0,43b
92,24±0,96b
5,26±2,07ab 4,14±1,10ab 2,90±0,80a 3,76±1,31a 5,00±1,18ab 4,59±1,29a
5,69±1,20c
5,10±1,36ab
4,95±1,29ab
5,68±1,74bc
a, b, c Valores promedio de cinco replicas, los valores dentro de una columna que no comparten letras son significativamente diferentes a p < 0,05. CF: cuerpo de fructificación. La morfología y el desarrollo de los cuerpos de fructificación cosechados de los sustratos aromáticos tuvieron un desarrollo normal comparado con los especimenes colectados en paja de trigo y los demás ensayos con aserrín. Como se puede observar en la Tabla 12, los valores promedios de diámetro de los píleos variaron entre 4,50 y 5,87 cm. Estos valores fueron muy similares entre las especies y no tuvieron significancia estadística, sin embargo mostraron diferencias significativas entre los distintos sustratos ensayados. Los cuerpos de fructificación de mayor diámetro en ambas especies fueron cosechados en L (p<0,05) y no tuvieron diferencias significativas con los cosechados de OV, mientras que los ejemplares de menor diámetro fueron cosechados en PT (p<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que P á g i n a | 70 la composición del sustrato podría influir en el tamaño del diámetro de los cuerpos fructificación ya que está relacionada con la capacidad que tienen los hongos de acceder a las sustancias nutritivas. De la misma manera, Yildiz et al. (2002) obtuvieron una variación en el diámetro de los cuerpos de fructificación cuando utilizaron diferentes desechos lignocelulósicos como materia prima para el cultivo de P. ostreatus. Cuando los basidiocarpos fueron agrupados según tres tamaños predeterminados (G1, G2 y G3), se pudo comprobar que la producción predominante en PT, E y OV correspondió al G1 (< 5 cm.), mientras que en L y OxA la distribución de tamaños de basidiocarpos fue más uniforme, obteniéndose valores similares en los tres grupos de tamaño (Tabla 13). Por otra parte, es interesante poder remarcar que los tamaños obtenidos en el diámetro de los píleos para cosechados en este experimento, son al menos un 30 % menor que los informados para el ensayo en aserrín de sauce (ver apartado 3.3.4), esto podría deberse a que la composición del sustrato pueda influir en el desarrollo de los píelos o bien también podría ser adjudicado a la influencia del tamaño de los bloques utilizados, ya que los bloques de sustrato utilizados en este experimento fueron menor peso (0,350 Kg.) y por ende, menor tamaño comparado con los bloques utilizados en el experimento con aserrín de sauce (ver apartado 3.3.4), donde los bloques fueron de 1 k.o. y por ende de mayor tamaño. Tabla 13. Distribución de tamaño de cuerpos de fructificación de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de los distintos sustratos. Especies P. ostreatus Sustratos PT
L
E
OxA
OV
PT
L
E
OxA
OV
Producción de cada grupo de tamaño (%) ª G1
G2
G3 57,1
14,3
28,6 26,8
39,0
34,2 64,4
22,2
13,3 44,2
44,2
11,6 65,7
28,6
5,7 56,0
32,0
12,0 28,6
38,1
33,3 77,5
12,5
10,0 50,0
35,7
14,3 47,8
33,3
18,9 ª Grupos de tamaño de sombrero de acuerdo a su diámetro: G1 < 5 cm., G2: 5 ‐ 6.4 cm., G3: > 6,5 cm. P á g i n a | 71 3.3.7. Cultivo de P. tenuiculus en troncos 3.3.7.1. Cultivo sobre troncos de Populus alba y Eucalyptus camaldulensis y su efecto en el rendimiento Los troncos de álamo y eucalipto inoculados con las cepas de P. tenuiculus, ICFC 233/00 y 383/00, tuvieron un seguimiento mensual durante toda su etapa de incubación, con el objeto de observar la colonización del micelio. Luego de 12 meses, se pudo observar el micelio en la superficie de los troncos, debajo de la corteza y principalmente en los extremos, signos que implican el final de esta etapa (Przybylowicz & Donoghue, 1988). Posteriormente, fueron desenterrados y trasladados a la sala de fructificación, donde recibieron riego y luz, permaneciendo a temperatura ambiente. Las fructificaciones comenzaron a aparecer a los 30 días aproximadamente de haber sido trasladados. Se obtuvieron fructificaciones de las dos cepas en la mayoría de los troncos de P. alba durante toda la etapa de cultivo, sin embargo, los troncos de Eucaliptus camaldulensis, no registraron cosechas (Fig. 19). A) B) C) Fig. 19. Basidiocarpos creciendo en los troncos, de las dos cepas de P. tenuiculus ensayadas. A) tronco de E. cinerea y B), C) tronco de álamo. P á g i n a | 72 Nuestros resultados han demostrado que troncos inoculados con tardaron aproximadamente de 12 a 13 meses en fructificar. Este mismo comportamiento lo observó Stamets (2005) con A. cylindrica. Campbell & Racjan (1999), informaron que Lentinula edodes (Shiitake) cultivado en troncos de roble en condiciones semicontroladas (5‐26 ºC; 70 a 100 % de humedad), la aparición de los primordios fue luego de 18 meses de incubación. Es probable que la duración del período de incubación haya estado influenciada por las temperaturas experimentadas, las que fueron muy bajas durante el invierno. Para reducir el tiempo de duración de esta etapa se debería realizar mediante una incubación manteniendo la temperatura controlada a 25ºC, tal como se realizó con los bloques de sustratos. En la Fig. 20 se compararon las EB de dos cepas de P. tenuiculus, ICFC 233/00 y 383/00, cultivadas en troncos de P. alba, éstas tuvieron bajos rendimientos, entre 7,5 y 11,7 % respectivamente, comparados con los valores conseguidos en los bloques de sustrato (ver apartados 3.3.1/2/3 y 3.3.5) y no mostraron diferencias significativas entre ellas, debido principalmente a la gran dispersión de los datos. Trabajos realizados con L. edodes cultivado sobre Quercus sp. evidenciaron valores más altos en los rendimientos comparado con nuestros valores, favorecido además porque el período de producción se extendió durante tres años (Campbell & Racjan, 1999). Royse (2001) informó que en el caso de Shiitake (Lentinula edodes) cultivado sobre troncos se podían obtener EB del 33% logrando el 75% de la producción durante el segundo y tercer año de cultivo. 25
Promedio de EB (%)
20
ICFC 233/00
ICFC 383/00
a
15
a
10
5
0
Cepas de P. tenuiculus
Fig. 20. Porcentaje promedio de la EB de dos cepas de P. tenuiculus (ICFC 233/00 y 383/00) cultivada en troncos de Populus alba. P á g i n a | 73 El ciclo de cultivo se extendió por 2 años, registrándose fructificaciones únicamente durante la primavera y verano, donde las temperaturas medias oscilaron entre 25±5 ºC. El número de oleadas variaron en ambas cepas entre 1 y 3 durante todo el cultivo. 3.3.7.2. Efecto del cultivo en troncos en la morfología de las fructificaciones Se evaluó el peso y el diámetro de los píleos de P. tenuiculus (ICFC 233/00 y 383/00) cosechados en troncos de álamo. El peso fresco promedio de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus, no mostró variaciones entre las dos cepas, el peso promedio de basidiocarpos de la cepa ICFC 383/00 fue de 5,52g y el de la cepa 233/00 fue de 4,98 g (Tabla 14). Estos valores son similares a los obtenidos en los bloques de sustrato (apartado 3.3.4 y 3.3.6). La morfología de los cuerpos de fructificación tuvo un desarrollo normal comparado con los especimenes colectados de los bloques de sustratos o los coleccionados en la naturaleza. Como se puede observar en la Tabla 14, los valores promedios de diámetro de los píleos de ambas cepas de P. tenuiculus no tuvieron diferencias significativas. Estos valores son 0,2 veces superiores con los obtenidos en los bloques de sustrato formulados con aserrín de sauce (As, AS1 y AS2). Tabla 14. Parámetros de producción y calidad de cuerpos de fructificación de dos cepas de P. tenuiculus cultivadas en troncos de Populus alba. Cepas 383/00
233/00
a
Peso fresco
cosechado (g)
Peso promedio
CF (g)
Diámetro
píleo(cm.)a
Nº cuerpos fructíferos 1087 553 5,52±1,34a 4,73±1,66a 7,00 ±1,86 a 6,57±2.69 a 197 117 Valores seguidos de letras diferentes, indican diferencias significativas p = 0,05. CF: cuerpos de
fructificación Cuando los basidiocarpos fueron agrupados según tres tamaños predeterminados (G1, G2 y G3), se pudo comprobar que más del 84 % de los cuerpos de fructificación cosechados correspondieron a los grupos G1 y G2 en ambas cepas. Sin embargo, fue el P á g i n a | 74 grupo de tamaño comprendido entre 5,4–9,4 cm. (G2) el que obtuvo los mayores porcentajes de fructificaciones cosechadas (Tabla 15). Este resultado se diferencia de lo obtenido con los bloques de sustratos donde por lo general predomina el grupo de tamaño G1. Esto podría significar que en troncos si bien la EB es menor, por lo general predominan ejemplares de tamaños intermedios. .Tabla 15. Distribución de tamaños de cuerpos de fructificación de dos cepas de P. tenuiculus cosechadas de Populus sp.
Cepas 383/00 233/00 Producción de cada grupo (%) ª
G1
G2
G3
22,2
28,2
70,7
56,3
7,1
15,5
ª Grupos de tamaños de cuerpos de fructificación agrupados de acuerdo a sus diámetros: G1: < 5,4 cm.; G2: 5.5 – 9,4 cm.; G3: > 9,5 cm. 3.3.7.3. Cultivo sobre troncos de Eucalyptus cinerea y su efecto en el rendimiento Los troncos de eucalipto inoculados con la cepa ICFC 383/00 de P. tenuiculus, tuvieron un seguimiento mensual durante la etapa de incubación, y al igual que ocurrió con los troncos de álamo, el período de incubación fue de 12 meses. Una vez cumplida ésta etapa, fueron desenterrados y trasladados a la sala de fructificación, donde recibieron riego y luz a temperatura ambiente. Las fructificaciones comenzaron a aparecer a los 30 días aproximadamente de haber sido trasladadas a la sala de fructificación. Se obtuvieron fructificaciones en la mayoría de los troncos de E. cinerea durante toda la etapa de cultivo. En la Fig. 21 se compara las EB de la cepa ICFC 383/00 de P. tenuiculus cultivada en troncos de E. cinerea con los valores obtenidos en P. alba. Es posible observar que si bien en los troncos de E. cinerea se obtuvieron bajos rendimientos (12,49 %), cuando es comparado con la EB obtenida por la misma cepa en P. alba no se encontraron diferencias significativas. Estos resultados fueron inesperados ya que en general éste árbol no es un buen sustrato para cultivar hongo. Además, existen pocas especies de hongos comestibles que crecen sobre eucaliptos, en forma saprofítica, tal como Gymnopylus spectabilis var pampeanus o Laetiporus P á g i n a | 75 sulphureus (Deschamp, 2002; Wright & Deschamps, 1975). En los últimos años se han realizado numerosas investigaciones con el fin de poder utilizar madera de especies de árboles disponibles en la zona, tal como el Eucaliptus sp para el cultivo de Shiitake (Queiroz et al., 2004; Pire, 2000; Albertó, 2008). El hecho de que se hayan obtenido fructificaciones en E. cinerea y no en E. calmadulensis puede deberse a las características nutricionales o compuestos presentes de cada una de las especies, a que la baja fertilidad de suelo donde fue cultivado produzca una madera pobre en sustancias nutritivas, importantes para el desarrollo del hongo (Queiroz et al., 2004). Tal como sucedió con las muestras de álamo, el ciclo de cultivo se extendió por 2 años, registrándose fructificaciones durante la primavera y verano, donde las temperaturas medias oscilaron entre 25 ± 5 ºC; el número de oleadas obtenidas variaron entre 1 y 3 durante todo el cultivo. 30
25
Eucaliptus cinerea
Populus alba
a
EB promedio (%)
a
20
15
10
5
0
ICFC 383/00 de P. tenuiculus
Fig. 21. Promedio del porcentaje de EB de P. tenuiculus (ICFC 383/00) cultivada en troncos de Eucaliptus cinerea y comparado con el valor obtenido en P. alba. 3.3.7.4. Efecto del cultivo en troncos en la morfología de las fructificaciones Se evaluó el peso y el diámetro de los píleos de la cepa ICFC 383/00 de P. tenuiculus cosechados en troncos de E. cinerea. La morfología de los cuerpos de fructificación tuvo un desarrollo normal comparado con los especimenes colectados de los bloques de sustratos y los obtenidos en troncos P á g i n a | 76 de álamo. Como se puede observar en la Tabla 16, los valores promedios de diámetro de los píleos de P. tenuiculus fueron de 7,24 cm. y no tuvieron diferencias significativas cuando se compararon con los valores promedios para esta cepa obtenidos en tronco de álamo. Se determinó el peso fresco promedio de los cuerpos de fructificación, el cual tuvo un valor promedio de 9,2 g y no mostró variaciones con los valores obtenidos en los especimenes de esta cepa colectados de tronco de álamo. Tabla 16. Parámetros de producción y distribución de tamaños de los cuerpos de fructificación la cepa ICFC 383/00 de P. tenuiculus cultivadas en troncos de E. cinerea. Peso fresco cosechado (g) 383/00 341 Cepa Nº CF* 37 Peso promedio
CF* (g)
9,2
Diámetro Distribución de tamaño CF (%)
píleo (cm.)
G1
G2 G3
7,24 ± 2,09
24,3
64,9 10,8
* CF: cuerpos de fructificación. Cuando los basidiocarpos fueron agrupados según tres tamaños predeterminados (G1, G2 y G3), se pudo comprobar que el 89 % de los cuerpos de fructificación cosechados correspondieron a los grupos G1 y G2, siendo el grupo de tamaño comprendido entre 5,4–9,4 cm. el que obtuvo los mayores porcentajes de fructificaciones cosechadas (Tabla 16). Por último, es importante resaltar que los resultados obtenidos del cultivo en troncos de álamo y E. cinerea han demostrado que ambas especies de árboles pueden ser utilizadas para cultivo de P. tenuiculus siendo éste un método de producción de bajo costo permitiendo obtener fructificaciones mediante un sistema semi controlado. Por otro lado, el cultivo de hongos comestibles sobre troncos presenta una ventaja sobre el cultivo en bloques de sustrato ya que técnicamente no exige y, por lo tanto no requiere, de personal especializado y entrenando en técnicas de laboratorio. Además, este método de cultivo es ecológico, ya que asegura el reciclaje de los desechos de madera, de bajo costo, que no es utilizada por la industria forestal pues se usa el “despunte”. Al mismo tiempo, constituye una alternativa interesante para los productores rurales ya que permitiría diversificar sus productos mediante el uso de materia prima de muy bajo costo y de fácil acceso. El cultivo de hongos en troncos es P á g i n a | 77 un proceso que dura varios años (de 2 a 5), por lo que los datos presentados hipotéticamente corresponden a la mitad del ciclo de cultivo; en la actualidad se siguen registrando datos hasta poder determinar el máximo de producción y el tiempo de cultivo hasta que los troncos sean improductivos. P á g i n a | 78 4. CONCLUSIONES 1‐ Fue posible determinar las condiciones óptimas para el cultivo de P. tenuiculus, siendo el primer reporte mundial sobre el cultivo de esta especie en residuos lignocelulósicos. 2‐ Se demostró que dos de las tres cepas ensayadas, ICFC 233/00 y 383/00, tuvieron un óptimo crecimiento del micelio a 25 ºC y 30ºC. 3‐ P. tenuiculus evidenció la producción de enzimas celulolíticas y ligninolíticas mediante la decoloración de los medios de cultivo con CMC y Poly R‐478, respectivamente. Este hecho indica que fisiológicamente es capaz de utilizar residuos agroindustriales ricos en lignina y celulosa como fuente de carbono. 4‐ El Aserrín de sauce fue el sustrato más adecuado para el cultivo de P. tenuiculus ya que se obtuvieron mejores rendimientos que con paja de trigo. 5‐ El uso de suplemento afecta en gran medida los parámetros de producción, especialmente el rendimiento y el tamaño de las fructificaciones. 6‐ Se determinó como fórmula óptima para el cultivo el aserrín de sauce suplementado con harina de soja (15 %) y salvado de trigo (5%), con la que se obtuvo el mejor rendimiento, con 82,7% de EB. 7‐ La aplicación de tratamientos de inducción no tuvo efecto sobre el rendimiento, la precocidad y el diámetro de las fructificaciones. Sin embargo con la aplicación del shock térmico se logró una sincronicidad en la aparición de los primordios, rasgo deseado por cultivadores de hongos comestibles ya que facilita el manejo del cultivo. P á g i n a | 79 8‐ Se demostró que es posible el empleo de desechos provenientes de la industria de los aceites esenciales para el cultivo de hongos comestibles. Se obtuvieron buenos rendimientos en P. ostreatus cuando se utilizó laurel, y las dos especies de orégano, aunque menores que en paja de trigo. Además, influyeron positivamente en el peso y diámetro de los cuerpos de fructificación cosechados de ambas especies, sobre todo cuando se cultivaron en laurel, obteniendo una distribución de tamaños homogénea con valores que van de < a 5 cm. a > a 6,5 cm. 9‐ Se demostró que es posible obtener fructificaciones de P. tenuiculus sobre troncos de álamo y E. cinerea, luego de 13 meses de incubación pero con bajos rendimientos, que varían de 7 a 12,5 %. La morfología de los cuerpos de fructificación tuvo un desarrollo normal comparado con los especimenes colectados en bloques de sustrato con predominio de ejemplares de tamaños intermedios (5,4 – 9,4 cm.). P á g i n a | 80 CAPITULO II Calidad nutricional y composición de volátiles de Polyporus tenuiculus P á g i n a | 81 1. OBJETIVOS Considerando que: • Hay poca información científica y que las investigaciones están enfocadas principalmente a la composición de nutrientes y volátiles de las especies más consumidas tales como A. bisporus, P. ostreatus y L. edodes. • Los compuestos de aroma de los hongos no juegan un papel esencial en la nutrición, pero estimulan el apetito y le brindan a los platos realizados con hongos un aroma característico. • Las evaluaciones cuantitativas del valor nutritivo y de la composición de volátiles de los hongos comestibles están sujetas a muchas variables incluyendo diferencias entre especies/cepas, en las condiciones de cultivo, sustratos utilizados, estado de desarrollo e inexactitudes inherentes en los diferentes métodos de análisis. • En gran parte como consecuencia de la continua demanda de la industria de alimentos por ingredientes y sabores naturales, los hongos están recibiendo una creciente atención como fuente de compuestos de aroma y sabor. se plantea para este capítulo el siguiente Objetivo General: Evaluar la composición nutricional y de volátiles de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus cosechado de diferentes sustratos lignocelulósicos. y los siguientes objetivos específicos: 1‐ Determinación de la composición nutricional y los compuestos volátiles de cuerpos de fructificación de P. tenuiculus cultivado en varios sustratos lignocelulósicos tradicionalmente utilizados en el cultivo de hongos comestibles. P á g i n a | 82 2‐ Determinación de la composición nutricional de cuerpos de fructificación de P. tenuiculus y P. ostreatus cultivados en varios sustratos provenientes de desechos de la industria de los aceites esenciales. 3‐ Evaluar el perfil de ácidos grasos de P. tenuiculus y P. ostreatus cultivados en varios sustratos provenientes de desechos de la industria de los aceites esenciales y paja de trigo. P á g i n a | 83 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Evaluación de la calidad nutricional 2.1.1. Especies utilizadas Para realizar estos ensayos, se utilizaron cuerpos de fructificación de P. tenuiculus (ICFC 383/00) y P. ostreatus (ICFC 153/99), cosechados de diferentes sustratos lignocelulósicos: paja de trigo, aserrín de sauce y desechos de plantas aromáticas utilizadas en la industria: laurel (L) y eucalipto (E), obtenidos según se indica en el apartado 2.1.6 del capítulo 1. Los cuerpos de fructificación de P. ostreatus fueron utilizados como control sólo cuando se emplearon como sustratos los desechos de plantas aromáticas. 2.1.2. Análisis proximal de la composición nutricional de P. tenuiculus cosechados de sustratos tradicionales y desechos de la industria de los aceites esenciales Se colectaron cuerpos de fructificación de P. tenuiculus (250g de una combinación de basidiocarpos jóvenes y maduros) de los bloques de sustrato (PT, PTs, AS, AS1, L y E). La composición proximal de las muestras de hongos (expresadas en porcentaje de muestra seca) fue realizada por triplicado. Se realizaron las siguientes determinaciones según la metodología propuesta por AOAC, 1990: i) Humedad: secando en estufa a 100 ºC hasta peso constante, ii) Cenizas: por incineración en una mufla a 550±15 ºC, iii) Grasa cruda: extracción por Soxhlet utilizando hexano como solvente, iv) Fibra bruta: digestión con ácido y álcali y v) Proteína: se cuantificó mediante la determinación de nitrógeno total por el método de Kjeldhal utilizando como factor de conversión el valor de 4,38 (Miles & Chang, 1997). La fracción de Extractivos No Nitrogenados (ENN), la cual incluye carbohidratos solubles, fue calculada por diferencia entre 100 menos todos los demás resultados obtenidos en el análisis proximal (Barros et al., 2008). P á g i n a | 84 2.2. Determinación de la composición de ácidos grasos de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus y P. ostreatus cultivados sobre desechos provenientes de la industria de los aceites esenciales Se utilizaron muestras de cuerpos de fructificación de P. tenuiculus (ICFC 383/00) y de P. ostreatus (ICFC 153/00) cosechados de PT, L, E, Origanum x applii (OxA) y Origanum vulgare (OV). 2.2.1. Extracción y esterificación de ácidos grasos de los cuerpos de fructificación Se utilizaron muestras de hongos frescos (1 g) de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de PT, L, E, OxA y OV las cuales fueron colocadas en un tubo de cultivo de 17 ml, suspendidas en 2 ml de metanol, tratadas con 0,5 ml de una solución acuosa de hidróxido de sodio 2 M y los tubos fueron inmediatamente sellados con cinta de teflón y con tapa a rosca. Luego, los tubos de cultivo fueron colocados dentro de botellas plásticas de 250 ml con tapa. Esta combinación fue colocada en el centro de un microondas que operó a 2450 MHz y 750 W, máxima potencia y calentados al 50 % de su poder durante 20 s, dos veces. Los tubos se dejaron enfriar, se removieron de las botellas de plástico y se agregó hexano (2 ml), se agitó (vortex) y se descartó la fase superior (este paso se repitió 2 veces). Luego, se agregó 0,5 ml de H2SO4 (2M) en metanol en los tubos de cultivo y fueron colocados nuevamente dentro de botellas plásticas de 250 ml con tapa y colocadas en el centro de un microondas que operó a 2450MHz y 750 W, máxima potencia y calentados al 50 % de su poder durante 20 s, dos veces. Los tubos se dejaron enfriar, se removieron de las botellas de plástico y se agregó hexano (2 ml), se agitó (vortex) y se colectó la fase superior (este paso se repitió 2 veces). Los extractos combinados de hexano fueron evaporados a la sequedad y luego llevados a volumen apropiado (1000 mL) con hexano antes del análisis. 2.2.2. Separación e Identificación de Ácidos Grasos por Cromatografía Gaseosa Los ésteres metílicos fueron analizados en un cromatógrafo de gas PERKIN‐ELMER Clarus 500 equipado con detector de ionización de llamas. Se utilizó una columna P á g i n a | 85 capilar HP‐INNO‐Wax (30m x 0.32 mm x 0.5 nm, con polietilen glicol, USA) AT‐ WAX. La temperatura de la columna fue de 180ºC a 230ºC (2 ºC/min.). La temperatura de inyección fue 250 ºC. Como gas transportador se usó nitrógeno con una velocidad de flujo de 0.8 mL/min. Se usó una mezcla conteniendo los estándares de los ésteres metílicos de ácidos grasos (Sigma Chemical Co), para obtener los tiempos de retención e identificar los picos correspondientes en las muestras en estudio. La concentración de cada ácido graso fue determinada como proporción relativa de la composición total usando el éster metílico del ácido heptadecanoico (Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri, USA) como estándar interno. 2.3. Evaluación de la composición de compuestos volátiles de cuerpos de fructificación 2.3.1. Especies utilizadas Para realizar estos ensayos, se utilizaron cuerpos de fructificación de P. tenuiculus (ICFC 383/00), cosechados de diferentes sustratos lignocelulósicos (PT, PTs, AS y AS1, Tabla 1). 2.3.2. Análisis de volátiles de cuerpos de fructificación por CG­EM Las muestras de los cuerpos de fructificación cosechados (50 g) fueron depositadas en recipientes de vidrio cerrados herméticamente. Los compuestos volátiles fueron analizados por SPME (Microextracción en fase sólida), utilizando una fibra de PDMS (Polidimetilsiloxano) ya que brinda un perfil más completo de los compuestos a analizar, porque es más selectiva. Los viales cerrados fueron puestos a baño maría (40 ºC) en agitación, por 20 min. Luego de la extracción, los volátiles de la fibra SPME fueron desorvidos en el puerto de inyección del cromatógrafo gaseoso acoplado a un espectrómetro de masa (HP 5890II‐ HP 5971 MSD, Hewlett‐Packard), con un potencial de 70eV para la ionización por impacto de electrones. El inyector y el detector de P á g i n a | 86 temperatura fueron de 200 y 270 ºC, respectivamente. La temperatura de la columna fue programada de la siguiente manera: 50 ºC (2 min.) a 200 ºC (3 ºC/ min.). El gas conductor fue helio con un flujo constante de 0.9 mL/min. Los compuestos fueron resueltos en un columna DB‐5 (25 m de largo x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm espesor de capa) e identificados en base a comparación de su masa espectral con estándares auténticos de la biblioteca Willey (275.1) y NIST 98. 2.4. Análisis estadístico Todos los datos fueron analizados utilizando el programa INFOSTAT, versión 1.1 (Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba). Se calcularon promedios y desvíos estándar, y se realizaron análisis de varianza con test posterior Tukey (α = 0.05) para detectar diferencias significativas entre las muestras para las variables nutricionales estudiadas. P á g i n a | 87 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Evaluación de la composición nutricional 3.1.1. Determinación de la composición nutricional de P. tenuiculus cosechados de sustratos tradicionales En la tabla 17 se presentan los valores del contenido de humedad, proteína, fibra bruta, cenizas, grasa cruda y carbohidratos solubles de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus cosechados de diferentes sustratos lignocelulósicos (PT, PTs, AS y AS1). Tabla 17. Composición proximal de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus cosechados de diferentes sustratos lignocelulósicos (en base al peso seco). Componentes (%) Cenizas Grasa cruda Proteína Carbohidratos Fibra bruta Humedad PT Sustratos* PTs AS AS1 5,7 ± 0,2a 6,6 ± 1,1b 6,5 ± 0,2b 8,6 ± 0,1c 10,8 ± 0,3a 5,2 ± 0,1a 15,8 ± 0.6b 9,2 ± 0,2d 10,6 ± 0,2a 6,6 ± 0,1b 5,7 ± 0,4b 15,4 ± 0,3b 47,2 ± 0,9a 12,1 ± 0,2c 89,1 ± 0,7a 48,2 ± 1.0a 7,5 ± 0.4a 90,0 ± 0.2a 51,6 ± 0,7c 7,6 ± 0,2a 89,9 ± 0.3a 48,2 ± 0,2a 8,3 ± 0,4b 90,8 ± 0.1a * Valores expresados como porcentaje, promedios de tres réplicas. Se utilizaron letras para destacar la significancia estadística entre los valores obtenidos para cada sustrato en cada componente (p<0,05). Proteína: N x 4,38. PT: paja de trigo; PTs: paja de trigo suplementada con harina de soja (5%) y salvado de trigo (15%); AS: aserrín de sauce; AS1: aserrín de sauce trigo suplementado con harina de soja (5%) y salvado de trigo (15%) El contenido de humedad de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus no mostró diferencias significativas entre las muestras obtenidas de los diferentes sustratos, obteniendo un valor promedio de 90,0 %, confirmando el alto contenido de humedad de estos productos (Breene, 1990). Los resultados obtenidos en P. tenuiculus son similares a los informados por otras especies de hongos comestibles, tales como, P. ostreatus, P. eryngii, P. pulmonarius P. florida, P. sajor­caju y Lentinula edodes, los cuales P á g i n a | 88 varían entre 85,2 y 93,5 % (Ponmurugan et al., 2007; Manzi et al., 1999; Bonati et al., 2004). Según Bano & Rajarathnam (1988), ésta variabilidad es exclusivamente dependiente de la especie de hongo, de la temperatura y la humedad relativa durante el crecimiento. El contenido de cenizas de los basidiocarpos cosechados de los diferentes sustratos mostró diferencias significativas, el valor más bajo fue obtenido en PT (5,7%; p<0,05). Tal como fue informado para P. ostreatus y P. sajor­caju, el contenido de cenizas fue afectado por la composición del sustrato (Bonati et al., 2004). En la literatura se han citado valores 0,3 veces más altos para P. ostreatus cosechados de paja de trigo suplementada con remolacha (Manzi et al., 1999). Es importante resaltar que los sustratos ricos en N2 (Pts y AS1) afectaron positivamente el contenido de cenizas, provocando un aumento del mismo. Este hecho implicaría un incremento de la biodisponibilidad de minerales que pueden ser ingeridos al consumir los hongos con la dieta (Silva et al., 2007). El contenido de proteína se cuantificó mediante la determinación de nitrógeno total por el método de Kjeldhal utilizando como factor de conversión el valor de 4,4 (Breene, 1990). El rango de valores obtenidos varió entre 10,6 y 15,9 % (Tabla17), siendo los sustratos suplementados (PTs y AS1) los que obtuvieron los mayores porcentajes de este componente (p<0,05). Estos valores están dentro del rango informado para P. ostreatus, P. sajor­caju, L. edodes, aunque existe una gran variabilidad en estos valores debido principalmente a la variación entre las distintas especies y cepas utilizadas (Bonati et al., 2004; Manzi et al., 1999). Por lo tanto, podríamos sugerir que para P. tenuiculus el tipo de sustrato utilizado para cultivo podría tener una influencia en la composición nutricional de los cuerpos de fructificación, ya que incrementó el contenido de proteína cuando se emplearon sustratos suplementados. Este mismo comportamiento fue observado en especies del género Pleurotus, cuya composición nutricional varió dependiendo de la cepa, composición del sustrato y estado de desarrollo del cuerpos de fructificación (Silva et al., 2007; Valencia del Toro et al., 2006; Shashirekha et al., 2005). El contenido de grasa cruda fue mayor en los sustratos no suplementados, siendo el AS el que obtuvo el mayor valor (p<0,05). Por otro lado, el AS1 tuvo mayor porcentaje de grasa cruda que la PTs (p<0,05). El contenido de grasa cruda de P. tenuiculus fue similar al informado para otras especies (P. ostreatus y P. sajor­caju), donde además se P á g i n a | 89 encontraron diferencias en este componente entre los diferentes sustratos empleados (Ortega et al., 1993; Bonatti et al., 2004). En la Tabla 17 se observa que cuando el contenido de proteína aumenta en los sustratos suplementados, el contenido de grasa cruda disminuye, al igual que lo informado por Silva et al. (2007) para P. sajor­caju cultivado con sustratos con diferente composición de N2. En cuanto al contenido de fibra bruta, los valores más altos fueron obtenidos en los basidiocarpos cosechados de PT (p<0,05). Cuando se utilizó aserrín de sauce como sustrato, el mayor contenido de fibra bruta fue obtenido en AS1 (p<0,05), mientras que en paja de trigo, la adición de suplementos disminuye los valores de este componente (p<0.05). Este comportamiento puede deberse a las diferencias de componentes que tienen la paja de trigo y el aserrín de sauce. Los valores de fibra bruta informado para P. tenuiculus fueron inferiores comparados con los encontrados en la literatura, los cuales varían entre 20,0‐34,8% en P. ostreatus cultivado en paja de trigo (Justo et al., 1999; Ragunathan & Swaminathan, 2003). Por otro lado, se han registrado valores de fibra bruta similares para varias especies del género Pleurotus cultivados en diferentes residuos agro‐industriales, comprendidos entre 7,6‐18,0% (Patrabansh & Madan, 1997; Bonati et al., 2004; Valencia del Toro et al., 2006). El amplio rango de valores reportados por diversos autores podría ser explicado por la influencia del sustrato empleado para cultivo y por las diferencias debidas a que son especies distintas. El contenido de carbohidratos solubles tuvo los valores más altos en los cuerpos de fructificación obtenidos de AS (p<0.05). Por el contrario, los menores valores de este componente fueron obtenidos de hongos cosechados de paja de trigo (PT). El contenido de carbohidratos solubles obtenido en P. tenuiculus cosechado en PT fue similar al informado para otras especies del género Pleurotus cultivadas sobre diferentes residuos agro‐industriales, comprendidos entre 42,8‐47,7 % (Patrabansh & Madan, 1997; Ragunathan & Swaminathan, 2003). Estos resultados son similares a los obtenidos por otros investigadores en donde los sustratos utilizados afectaron las características nutricionales de los hongos comestibles. En el caso de P. tenuiculus, el cultivo sobre residuos lignocelulósicos suplementados (PTs y AS1) permitiría obtener cuerpos de fructificación con un alto contenido de proteína, bajas cantidades de grasa y carbohidratos. Por otra parte, el contenido de fibras y cenizas presentaron algunas variaciones entre ambos tipos de sustratos (PT‐PTs y AS‐AS1). Según Sturion & Oetterer (1995), el valor nutricional de P á g i n a | 90 los hongos puede ser enormemente afectado por el sustrato utilizado para el cultivo, tal como sucedió con nuestros resultados. Al ser comparado con valores de composición nutricional de las especies más consumidas, tal como Agaricus bisporus, Lentinula edodes y Pleurotus ostreatus, P. tenuiculus sobresale por su mayor contenido en fibras (2.5 veces mayor, aproximadamente); y con respecto al contenido de proteínas es similar al informado para L. edodes y P. ostreatus, y menor que el informado para A. bisporus (Chang et al., 1993). Estos resultados señalan a P. tenuiculus como un alimento especialmente rico en dichos componentes contribuyendo a la nutrición humana. 3.1.2. Determinación de la composición nutricional de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados sobre sustratos provenientes de la industria de los aceites esenciales En la tabla 18 se presentan los valores del contenido de humedad, proteína, cenizas, grasa cruda y carbohidratos solubles de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de diferentes sustratos de la industria de los AE (Paja de trigo, laurel y eucalipto). Tabla 18. Composición proximal de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de sustratos provenientes de la industra de los aceites esenciales y paja de trigo. Componentes (%) Grasa Proteína Especies Sustratos Humedad (x4,38) cruda Cenizas Carbohidratos P. ostreatus E 93,9±0,1b
32,0±0,8c
2,6±0,1b
7,3±0,5b 50,0±1,1b
L 94,4±0,5b
30,5±1,2c
3,1±0,6b
7,8±0,2b 51,0±1,6ab
PT 95,1±0,4b
21,0±0,9a
1,6±0,1a
6,4±0,1a 64,6±1,4d
P. tenuiculus E 91,5±0,04a
24,8±1,4b
8,6±0,02d 8,5±0,1b 51,0±0,3ab
L 92,5±0,3a
27,7±0,8bc 7,8±0,01cd 7,5±0,1b 49,5±0,4a
PT 90,2±0,03a
20,9±0,3a
7,6±0,1c 6,9±0,02a 54,8±0,2c
* Valores expresados como porcentaje, promedios de tres réplicas. Se utilizaron letras para destacar la significancia estadística entre los valores obtenidos para cada sustrato y cepa en cada componente (p<0,05). Sustratos: E: eucalipto; L: laurel; PT: paja de trigo. P á g i n a | 91 El contenido de humedad fue menor en las muestras de P. tenuiculus (p<0,05) y no se observaron diferencias significativas entre los sustratos utilizados para cultivo, obteniendo un valor promedio de 91,4 %, confirmando el alto contenido de humedad de estos productos (Breene, 1990). Los resultados obtenidos en tanto en P. tenuiculus como en P. ostreatus son similares a los informados por otras especies de hongos comestibles, tales como, P. ostreatus, P. eryngii, P. pulmonarius P. florida, P. sajor­caju y L. edodes, los cuales varían entre 85,2 y 93,5 % (Ponmurugan et al., 2007; Manzi et al., 1999; Bonati et al., 2004). Confirmando que la variabilidad en los contenidos de humedad no sólo depende de las condiciones durante el cultivo, sino también por ser especies diferentes (Bano & Rajarathnam, 1988). El contenido de cenizas mostró diferencias significativas entre los cuerpos de fructificación obtenidos de los diferentes sustratos, el valor más bajo para fue obtenido en PT (P. tenuiculus 6,9% y P. ostreatus 6,4%; p<0,05). Al igual que los resultados obtenidos para P. tenuiculus cultivado sobre paja de trigo y aserrín (PT, PTs, AS, AS1) el contenido de cenizas fue afectado por la composición del sustrato (Bonati et al., 2004). En la literatura se han citado valores 0,3 veces más altos para P. ostreatus cosechados de paja de trigo suplementada con remolacha (Manzi et al., 1999). Es importante resaltar que los sustratos provenientes de la industria de los AE (E y L) afectaron positivamente el contenido de cenizas, provocando un aumento del mismo (p<0,05). El contenido de proteína se cuantificó mediante la determinación de nitrógeno total por el método de Kjeldhal utilizando como factor de conversión el valor de 4,38 (Breene, 1990). El rango de valores obtenidos varió entre 21 y 32%, siendo P. ostreatus cosechado de E y L el que obtuvo los mayores valores (p<0,05; Tabla18). Estos valores están dentro del rango informado para P. ostreatus, P. eryngii, y P. pulmunarius, aunque existe una gran variabilidad en estos valores debido principalmente a la variación entre las distintas especies y cepas utilizadas (Manzi et al., 1999). También fue posible determinar que las muestras de P. tenuiculus cosechadas de E y L, tuvieron mayor contenido de proteína que las obtenidas en PT (p<0,05). Por lo tanto, podríamos sugerir que en ambas especies el tipo de sustrato utilizado para cultivo podría tener una influencia en la composición nutricional de los cuerpos de fructificación, además que de presentar variaciones que son dependientes de las cepas y estado de desarrollo del cuerpos de fructificación (Silva et al., 2007; Valencia del Toro et al., 2006; Shashirekha et al., 2005). Por último, estos valores fueron superiores a los informados P á g i n a | 92 para las muestras de P. tenuiculus cosechadas de los sustratos tradicionales (PT, PTs, AS y AS1). Este hecho puede estar vinculado con diferencias del equipamiento utilizado para realizar estas determinaciones. El contenido de grasa cruda fue mayor en las muestras de P. tenuiculus, principalmente de las cosechadas de E (p<0,05). Aunque para ambas especies fue similar al informado para otras (P. ostreatus y P. sajor­caju), donde además se encontraron diferencias en este componente entre los diferentes sustratos empleados para su cultivo (Ortega et al., 1993; Bonatti et al., 2004). El contenido de carbohidratos solubles determinados en ambas especies tuvo los valores más altos en los cuerpos de fructificación obtenidos de PT (p<0.05). Contrariamente a los resultados informados en el apartado 3.1 de éste capítulo, donde el valor más bajo de este componente fue obtenido en PT. Estos resultados son similares a los obtenidos por otros investigadores en donde los sustratos utilizados afectaron las características nutricionales de los hongos comestibles. El cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus sobre desechos de la industria de los AE (L y E) permitió obtener cuerpos de fructificación con un alto contenido de proteína, cenizas y menor contenido de carbohidratos. Según Sturion & Oetterer (1995), el valor nutricional de los hongos puede ser enormemente afectado por el sustrato utilizado para el cultivo, tal como sucedió con nuestros resultados. 3.2. Determinación de la composición de ácidos grasos de las fructificaciones de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados sobre desechos de la industria de los aceites esenciales En la Tabla 19, se observan los resultados de la composición de ácidos grasos de los Cuerpos de fructificación de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de los diferentes sustratos provenientes de la industria de los AE y de paja de trigo, mostrando diferencias significativas entre las especies y entre los sustratos (p<0,05). Fue posible la identificación de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y polinsaturados, además se muestran los porcentajes de tres ácidos grasos que aún no han sido identificados. En general en las muestras de P. tenuiculus el mayor porcentaje fue para el NC 1 (no conocido) con el 37‐61 %, le siguen el ácido oleico con 15‐29 % (18:1 át de P á g i n a | 93 C), el ácido linoleico con el 7‐11 % (18:2 át de C) y el ácido palmítico (16:0 át de C) con el 7‐11 %. En las muestras de P. ostreatus, el mayor porcentaje fue para el NC 1, con el 21‐39 %, le siguen el ácido linoleico con el 13‐25 % (18:2 át de C), el acido NC3 con le 10‐22 %, el ácido palmítico (16:0 át de C) con el 14‐19 % y el ácido oleico con 1‐9 % (18:1 át de C). Tabla 19. Composición de ácidos grasos de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus P. ostreatus cosechados de sustratos provenientes de la industra de los aceites esenciales y paja de trigo. Especie Sustrato 16:0 16:1 P. ostreatus OxA 14,8±1,2bc 0,5±0,4 OV 19,5±1,4c 0,3±0,3 E 14,9±3,6bc 0,3±0,07 PT 14,9±3,0bc 0,2±0,2 P. tenuiculus OxA 7,2±1,7a 0,2±0,05 OV 11,6±1,7ab 0,3±0,03 E 7,9±0,8a 0,2±0,1 PT 8,4±1,2a 0,2±0,03 Composición de ácidos grasos 18:0 18:1 18:2 3,0±0,5b 3,3±1,0b 2,2±0,4b 2,9±0,6b 3,9±3,8ab 1,2±0,4a 3,8±2,8ab 9,7±4,9abc
2,2±1,1a 2,9±0,7a 1,4±0,5a 1,4±0,5a 18,7±1,2cd
7,3±1,7a 29,8±9,2d 11,2±1abc 16,6±2,8bc 10,5±1,4ab 15,8±3,0bc 10,9±1,2abc
(%) 20:0 20:1 NC 1 NC 2 NC 3 21,8±2,2d 1,6±1,1b 0 28,9±2,0a 5,0±0,5b 22,4±2,1d 25,1±1,1d 0,02±0,01a 0,04±0,03 34,7±2,1a ‐ 15,9±2,1c 13,8±2,0bc 0,1±0,05a 0,1±0,05 36,5±13,3ab ‐ 10,4±1,1bc
15,5±0,8c 0,4±0,3ab 0,2±0,05 39,3±5,8abc 4,1±0,8b 12,9±2,9c 0,1±0,04a 0,1±0,05a 0,2±0,1a 0,1±0,01a 0,2±0,1 0,4±0,1 0,2±0,1 0,2±0,1 61,4±4,8c ‐ 37,9±11,1ab ‐ 61,4±5,2c ‐ 57,5±6,2c 1,1±0,2a
2,9±0,7a 5,6±1,7ab ‐ 4,4±0,3a * Valores expresados como porcentaje, promedios de tres réplicas. Se utilizaron letras para destacar la significancia estadística entre los valores de los ácidos grasos obtenidos por cada especie y sustrato (p<0,05). Sustratos: OxA: Origanum x applii; Ov: Origanum vulgare; E: Eucaliptus cinerea; PT: paja de trigo. El ácido palmítico (16:0 át de C) tuvo diferencias significativas vinculadas principalmente a nivel de sustrato, el mayor valor lo obtuvo P. ostreatus en OV (p<0,05). El ácido esteárico (18:0 át. de C) sólo mostró diferencias en la composición entre las especies, P. tenuiculus tuvo el menor porcentaje (p<0,05). El ácido oleico (18:1 át de C) tuvo diferencias significativas principalmente entre las especies, P. ostreatus obtuvo los menor porcentajes (p<0,05). P. tenuiculus cultivado en OV tuvo el mayor valor de ésta compuesto, 29,8 % (p<0,05). El ácido linoleico de 18:2 át de C tuvo diferencias significativas entre las especies y sustratos, P. tenuiculus tuvo los menores porcentajes de este compuesto sobre todo en las muestras de OxA, 7,3 % (p<0,05). En ácido araquídico (20:0 át de C) fue significativamente mayor en las muestras de P. ostreatus cultivadas en OxA y PT (p<0,05). Estos resultados evidenciaron cambios en los porcentajes de algunos de los ácidos grasos demostrando la influencia de la P á g i n a | 94 composición del sustrato tal como fue posible demostrarlo con la composición nutricional de estas dos especies en el apartado 3.2 de este capítulo. Además fue posible determinar la presencia de tres ácidos grasos de más de 20 át de C, los cuales no han sido identificados aún. El porcentaje determinado del ácido graso NC 1 (no conocido) fue significativamente mayor en P. tenuiculus, sobre todo cuando fue cultivado en OxA, E y PT (p<0,05). En el caso del ácido graso NC 2, sólo se determinó su presencia en P. ostreatus cultivado sobre OxA y PT y P. tenuiculus cultivado sobre PT, siendo la primer especie la que obtuvo el mayor porcentaje (p<0,05). Los resultados obtenidos para el ácido graso NC 3, indicaron que las muestras de P. tenuiculus obtuvieron el menor porcentaje (p<0,05). En general, el ácido oleico y linoleico son los dos ácidos grasos predominantes (con valores de hasta el 75 %) en los cuerpos de fructificación de diferentes especies de hongos estudiadas tales como, Pleurotus florida, Agaricus bisporus, Boletus edulis, Macrolepia sp., Sarcodon imbricatus, Tricholoma sp., Cantharellus cibarius, Lepista nuda, Ramaria botrytis (Diez & Alvarez, 2001; Barros et al., 2007; Barros et al., 2008; Shashirekha et al., 2005). Además de los principales ácidos grasos descriptos, en las muestras de P. tenuiculus y P. ostreatus se identificaron y cuantificaron 3 más que aún no fueron determinadas sus estructuras. Uno de los principales motivos de que los hongos son considerados importantes para la nutrición humana es debido a su abundancia de ácidos grasos insaturados y sus propiedades hipocolesterolémicas (Rajarathnam et al., 1992). En nuestros resultados fue posible determinar que ambas especies presentan predominio de ácidos grasos insaturados. El ácido linoleico, es conocido por ser un ácido graso esencial, no sintetizado por el cuerpo humano (Bano & Rajarathnam, 1988). Además es importante ya que sirve como base para la producción y la transformación de componentes de sabor de los hongos (Rajarathnam et al., 1990). 3.3. Evaluación de la composición de volátiles de cuerpos de fructificación cosechados a partir de sustratos tradicionales Las familias químicas de lo compuestos volátiles identificados en los cuerpos fructificación de P. tenuiculus cosechados de sustratos lignocelulósicos (PT y AS) consistieron en: ácidos, ésteres, alcoholes, hidrocarburos, aldehídos y cetonas. La P á g i n a | 95 Tabla 20 muestra los 39 compuestos volátiles identificados, sus índices de retención (IRs) y los porcentajes relativos (basado en el área del pico cromatográfico del CG/EM). En todas las muestras obtenidas el componente volátil mayoritario identificado fue 1‐octen‐3‐ol. Este compuesto volátil es conocido en la literatura por poseer olor característico "a hongo" (Combet et al., 2006; Chiron & Michelot, 2005) y contribuye fuertemente con la intensidad del aroma. Es frecuente en muchas especies de hongos tales como A. bisporus, Polyporus betulinus, Fomitopsis pinicola, Cantharellus cibarius, Tricholoma sulfureum, Volvariella volvacea, Pleurotus ostreatus, P. florida, Hericium erinaceum, Boletus edulis (Guendes De Pinho et al., 2008; Rösecke et al., 2000; Combet et al., 2006; Chiron & Michelot, 2005; Maga, 1981; Zawirska‐Wojtasiak, 2004; Rapior et al., 1998; Mau et al., 1997; Wood et al., 2000). El aroma en estas especies está vinculado con la presencia de compuestos alifáticos de ocho carbonos, aunque también contribuyen al mismo otros compuestos. El ácido linoleico es el precursor de la formación de los volátiles de 8 carbonos (1‐octen‐3‐ol, 1‐
octen‐3‐ona y 3‐octanol), actuando como sustrato para la lipoxigenasa, seguido por el ataque de una hidroxiperóxido liasa (Combet et al., 2006). Este proceso ocurre con regularidad en la fase tardía del cultivo, indicando un incremento del contacto de la enzima con el sustrato como consecuencia del aumento en la lisis celular (Abraham & Berger, 1994). En A. bisporus, se ha comprobado que el 1‐octen‐3‐ol también puede formarse por la reducción enzimática o autoxidación de la 1‐octen‐3‐ona (Chen & Wu, 1984, Assaf et al., 1995). El 1‐octen‐3‐ol tiene dos isómeros ópticos, siendo la forma enantiomérica (‐) la que posee el aroma característico a hongo y mientras que la (+), posee aroma a pasto húmedo (Mosandl et al., 1986). Además, se identificaron varios compuestos con valores de porcentajes bajos a intermedios, tales como el ácido (Z,Z)‐9,12‐octadecadienoico metil éster; ácido (Z)‐9‐
octadecenoico metil éster; ácido (Z,Z)‐9,12‐octadecadienoico; ácido hexadecanoico, los cuales son precursores de la formación del 1‐octen‐3‐ol. Tal como se informó para A. bisporus, el 1‐octen‐3‐ol proviene de una serie de reacciones enzimáticas a partir de la peroxidación del ácido (Z,Z)‐9,12‐octadecadienoico, por medio de una hidroperoxi liasa (Chiron & Michelot, 2005, Combet et al., 2006, Wu et al., 2005). P á g i n a | 96 Tabla 20. Composición de volátiles de los cuerpos de fructificación frescos de P. tenuiculus cosechados de diferentes sustratos lignocelulósicos. Compuestos Ácido 2‐metillbutanoico metil ester Hexanal Ácido 2‐metil propanoico 4‐hidroxy‐4‐metil‐2‐pentanona 4‐hexan‐3‐ona Ácido 3‐metilbutanoico 5‐(1‐metiletilideno)‐1,3‐ciclopentadieno
γ ‐butirolactona Ácido hexanoico metil ester γ‐valerolactona 2‐heptenal benzaldehído Ácido 2‐metilhexanoico 1‐octen‐3‐ona 3‐octanona 1‐octen‐3‐ol Octanal 3‐octanol Ácido hexanoico metil ester 1‐octanol Nonanal 2‐Feniletanol 2‐octenol Ácido fenilacético Ácido nonanoico hexadecano Ácido 1‐metiletil ester dodecanoico heptadecano octadecano Ácido pentadecanoico metil ester Ácido pentadecanoico Ácido (Z)‐9‐hexadecenoico metil ester Ácido hexadecanoico metil ester Ácido hexadecanoico eicosano Ácido (Z,Z)‐9,12‐octadecadienoico metil ester Ácido (Z)‐9‐octadecenoico metil ester Ácido (Z,Z)‐9,12‐octadecadienoico Ácido octadecanoico IR DB‐5 AS AS1 770 785
793 809
811 850
858
870 911
918 930
935 941 952
960 970
980 984 990
1063 1085
1088 1153 1248
1273 1602
1618 1702 1802
1814 1857
1890 1916 1958
2002 2079
2087 2126 2157
tr 3.0
tr tr
tr 1.0
tr
0.4 tr
0.2 tr
0.2 tr 0.4
12.0 39.2
tr 6.0 tr
1.0 0.7
0.5 tr 5.0
0.9 tr
tr tr tr
tr tr
tr tr 7.2
tr 3.3
3.3 10.0 1.0
tr tr
0.3 tr
0.5 0.1
tr
0.2 tr
0.1 tr
0.1 0.1 1.1
8.5 41.1
tr 9.0 0.2
2.8 0.4
0.2 4.6 2.0
0.8 tr
tr tr tr
0.1 tr
tr 0.9 4.8
tr 8.1
0.9 10.1 tr
%¹ PT tr tr 0.3 tr 0.5 0.1 tr 0.1 tr 0.2 tr 0.3 0.1 0.4 10.7 38.0 tr 8.1 0.2 3.6 0.1 0.4 5.3 1.8 0.4 tr tr tr tr 0.3 tr 0.3 0.4 6.4 tr 7.7 0.7 11.4 tr PTs 0.3 0.3 0.3 tr tr tr tr tr tr tr tr tr tr tr 11.1 43.9 0.8 10.9 tr 2.2 3.6 tr tr tr 1.7 tr tr tr tr 3.2 tr tr 0.1 tr tr 9.7 0.8 9.0 0.3 1Porcentages relativos de los volátiles identificados en base a los picos del área cromatográfica del GC‐
MS. Sustratos: AS, aserrín de sauce; AS1, aserrín de sauce suplementado con harina de soja (5%) y salvado de trigo (15%); PT, paja de trigo; PTs, paja de trigo suplementado con harina de soja (5%) y salvado de trigo (15%) Entre los volátiles identificados en los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus, se encontraron dos compuestos benzoicos los cuales poseen un aroma agradable, el benzaldehido y el ácido fenilacético (fragancia floral débil), ambos en muy bajo porcentaje en todas las muestra cosechadas de los diferentes sustratos. Una razón del escaso número y la poca cantidad de aldehídos encontrados podría deberse a la rápida oxidación por diferentes sistemas de enzimas oxidativas, tal como han sido P á g i n a | 97 mencionados, en particular, para los hongos de pudrición blanca (Abraham & Berger, 1994). Además, es importante destacar que se identificó un ácido de graso de cadena larga impar, el ácido pentadecanoico, y su metil éster en cantidades trazas, y tal como se informó para en Polyporus sulfureus, estos compuestos son poco probable en la naturaleza (Wu et al., 2005). Los basidiocarpos de P. tenuiculus cosechados de los sustratos suplementados (PTs y AS1) mostraron un pequeño incremento en el porcentaje del 1‐octen‐3‐ol. El empleo de suplementos como salvado de trigo y harina de soja para el cultivo de hongos, podría contribuir con los precursores de este el alcohol de ocho carbonos, aumentando su concentración relativa. Shashirekha et al. (2005) observaron que el total de lípidos mostró un aumento del 35 % en sustratos suplementados, siendo el ácido linoleico, el ácido graso insaturado predominante. Por otra parte, varios autores afirmaron que el perfil de compuestos de aroma varía dependiendo de las especies y cepas, de las partes utilizadas para el análisis (sombrero/pie), así como también con las condiciones de cultivo (Cho et al., 2008; Cho et al., 2007; Wu et al., 2005). Es bien sabido, que los ácidos grasos juegan un papel crítico en la formación de aroma, tanto en microorganismos, en plantas, así como también en productos de origen animal. No sólo contribuyen al olor, sino que además, actúan como precursores mediante la oxidación enzimática, decarboxilación o en reacciones de esterificación. El perfil y los cambios de los ácidos grasos en hongos contribuyen considerablemente a la formación y la transformación de compuestos volátiles (Wu et al., 2005). Conocer la composición de volátiles puede ser importante desde el punto de vista quimitaxonómico. Callac & Guinberteau (2005), examinaron los componentes volátiles de varias especies de Agaricus, compararon las proporciones de los compuestos benzoicos con los compuestos volátiles de ocho carbonos, y fueron capaces de identificar una relación entre la proporción y la cercanía filogenética, indicando una potencial importancia de los compuestos volátiles como un marcador taxonómico. Además, es interesante poder tener un perfil de los principales compuestos y de esta manera poder realizar un uso biotecnológico aplicado en fermentadores mediante la adición al medio de los precursores de los compuesto de interés. Tal como fue realizado por Liu et al. (2004), quienes incrementaron el contenido del 1‐octen‐3‐ol mezclando Agaricus bisporus fresco y triturado, junto con un hidrolizado de semillas P á g i n a | 98 de soja, y tras varios pasos de extracción y concentración le agregaron la matriz o sistema pared (dextrinas, aceites hidrogenados, ceras, almidones y gomas) para luego realizar una microencapsulación del aroma por secado por aspersión con el fin de poder utilizarlo como componente de alimentos. P. tenuiculus muestran un amplio espectro de compuestos volátiles, los cuales podrían ser de interés biotecnológico para la producción de compuestos de aroma "natural" a hongo. Por lo tanto podemos concluir que los componentes responsables del aroma de P. tenuiculus son principalmente el 1‐octen‐3‐ol, 3‐octanol, 1‐octanol, 3‐octanona, ya que se encontraron en mayor porcentaje. P á g i n a | 99 4. CONCLUSIONES 1‐ Se pudo demostrar que P. tenuiculus cultivado sobre residuos lignocelulósicos (PT, PTs, AS y AS1), es un alimento que contribuirá a la formulación de una dieta bien equilibrada debido a su abundancia en proteína y al bajo contenido de grasa, además de contribuir con cenizas, fibras y carbohidratos. 2‐ La adición de suplementos contribuye positivamente con el incremento del porcentaje de cenizas (6,6 %) y proteína (15,8‐15,4 %) y menor contenido de grasa (5,2‐5,7%), fibra (7,5‐8,3%) y carbohidratos (48, 2%). 3‐ El uso de sustratos provenientes de la industria de los aceites esenciales para cultivar P. tenuiculus y P. ostreatus contribuye positivamente con un incremento en el porcentaje de proteína (24‐32%) y cenizas (7,3‐8,5%) y con bajos contenidos de carbohidratos (49‐50%). 4‐ La composición de ácidos grasos de P. tenuiculus y P. ostreatus cultivados sobre sustratos provenientes de la industria de los AE y paja de trigo fue mayoritariamente predominante en ácidos grasos insaturados. 5‐ Se estableció el perfil de volátiles de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus. 6‐ El compuesto volátil mayoritario fue el 1‐octen‐3‐ol (38‐43,9%), luego le siguen, (Z,Z)‐9,12‐ácido octadecadienoico metil éster (3,3‐8,1%), (Z,Z)‐9,12‐
ácido octadecadienoico (9‐12,4%), 3‐octanona (8,5‐12%), 3‐octanol (6‐10,9%), ácido hexadecanoico (4,8‐7,2%), entre los más destacados. No se observaron diferencias apreciables entre los dos sustratos. 7‐ Los volátiles de 8‐carbonos le dan el aroma característico a P. tenuiculus tal como ocurre en la mayoría de los Basidiomicetes y lo posicionan como una P á g i n a | 100 especie potencialmente importante en la industria alimenticia, mediante la microencapsulación del 1‐octen‐3‐ol, para reproducir el aroma a hongo en distintos alimentos envasados (sopas). P á g i n a | 101 CAPITULO III Evaluación sensorial y cualidades organolépticas de P. tenuiculus P á g i n a | 102 1. OBJETIVOS Considerando que: • La "Evaluación Sensorial" es una disciplina científica mediante la cual se evalúan las propiedades organolépticas empleando los sentidos humanos lo que permite conocer que opina el consumidor sobre un determinado alimento, su aceptación o rechazo. • Las propiedades organolépticas se tienen en cuenta en la formulación y desarrollo de nuevos productos. • Los consumidores tienen poca información sobre las características organolépticas que ofrecen los hongos. • Sería interesante contribuir al conocimiento de la calidad sensorial de P. tenuiculus y de esta manera brindar al consumidor información sobre las características de esta nueva especie cultivable. se plantea para este capítulo el siguiente Objetivo General: Evaluar comparativamente los atributos sensoriales de P. tenuiculus fresco y deshidratado cultivado en distintos sustratos. y los siguientes objetivos específicos: 1‐ Evaluar comparativamente con un panel de jueces entrenados los atributos sensoriales de muestras de hongos comestibles deshidratadas de las especies, P. tenuiculus y P. ostreatus, cultivados de diferentes sustratos. 2‐ Determinar si el uso como sustratos de residuos de la industria de los aceites esenciales (laurel y eucalipto) afectan las características sensoriales de los hongos percibidas por los jueces entrenados. P á g i n a | 103 3‐ Evaluar comparativamente y cuantificar con un panel de consumidores la aceptabilidad y la intensidad de los atributos sensoriales de muestras frescas de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechadas de los diferentes sustratos (laurel y eucalipto). 4‐ Evaluar comparativamente y cuantificar con un panel de consumidores la aceptabilidad y la intensidad de los atributos sensoriales de muestras frescas de P. tenuiculus y compararlas con las especies de hongos más consumidas A. bisporus y P. ostreatus.. P á g i n a | 104 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Análisis descriptivo cuantitativo de la calidad sensorial de hongos deshidratados cosechados de diferentes sustratos. 2.1.1 Muestras utilizadas Se utilizaron muestras de basidiocarpos de P. tenuiculus (ICFC 383/00) y P. ostreatus (ICFC 153/99) cosechados de los siguientes sustratos: laurel, eucalipto y paja de trigo obtenidos como se indicó en el apartado 2.1.6 del Capítulo 1. Todas las muestras de hongos fueron deshidratadas en una estufa a 60 ºC hasta peso constante y luego evaluadas. 2.1.2. Análisis sensorial de hongos deshidratados Se utilizó un método de análisis descriptivo para caracterizar muestras de hongos deshidratados. Se identificaron cualitativa y cuantitativamente los atributos sensoriales presentes en cada una de las muestras (perfil sensorial). Para tal fin se utilizó un panel de jueces que fueron previamente entrenados de acuerdo a lo recomendado por Lawless y Heymann (1999) y por lo realizado sobre productos de maní por Grosso & Resurreccion (2002) y Nepote et al. (2004 y 2006). 2.1.2.1. Procedimiento La prueba descriptiva de hongos deshidratados, fue realizada por un grupo de 11 jueces entrenados (7 mujeres y 4 hombres), reclutados según los siguientes criterios (Plemmons & Resurreccion, 1998): ‐
Interesados en participar. ‐
Disponibles para cada sesión (tanto para el entrenamiento como para la evaluación). P á g i n a | 105 ‐
Que estén capacitados para expresarse verbalmente sobre el producto. ‐
Consumidores de hongos o sus subproductos al menos una vez al mes. ‐
Edad entre 18 y 65 años. ‐
No fumadores. ‐
Sin alergia alimentaria. ‐
Con buena dentición. Todos los jueces obtuvieron puntaje perfecto en la prueba de sensibilidad y habilidad para identificar 5 de 7 sabores comunes antes de ser seleccionados. 2.1.2.2. Entrenamiento Los 11 jueces fueron entrenados y calibrados en 4 sesiones de entrenamiento durante 4 días. Cada sesión tuvo una duración de 2 h. El entrenamiento para el análisis descriptivo fue realizado en base a lo descrito por Meilgaard et al. (1991) y Grosso & Resurreccion (2002). Los jueces evaluaron las muestras utilizando un método descriptivo “híbrido” entre el Análisis Descriptivo Cuantitativo (Tragon Corp., Redwood City, Calif., USA) y el Método de Análisis Spectrum TM (Sensory Spectrum, Inc, Chatham, N.J., USA). Se utilizó una escala lineal no estructurada de 150 mm (Tabla 21). Se les presentó al panel las muestras de hongos deshidratados (P. tenuiculus y P. ostreatus) cosechadas de los diferentes sustratos. Los panelistas identificaron los atributos apariencia, “flavour”, gusto, factor sensación y textura, los cuales fueron utilizados para describir las muestras de hongos deshidratados. Luego de esto, los panelistas trabajaron juntos para desarrollar un lenguaje para describir los atributos percibidos en las muestras de hongos, sobre la base de trabajos previos realizados en hongos deshidratados (Liu et al., 2005; Cuppett et al., 1998). Posteriormente, definieron los atributos que describían la apariencia, “flavour”, gusto, factor sensación y textura de los hongos. Durante las sesiones de entrenamiento se confeccionó una lista con las definiciones, los valores de intensidad de las muestras utilizadas en el “warm up” (referencia de entrenamiento) y de las referencias de cada atributo (Tabla 22). Finalmente, se les presentó a cada panelista muestras de champiñones enlatado (Agaricus bisporus) para ser empleados como referencia o “warm‐up”, las cuales P á g i n a | 106 Tabla 21. Planilla empleada por los jueces para el análisis descriptivo de los hongos deshidratados. ANALISIS SENSORIAL DESCRIPTIVO
MUESTRA: HONGOS DESHIDRATADOS
ATRIBUTOS: Color marrón 0 Fecha: ……………………..
Juez: ……………………….
Nº MUESTRA:
150
Dulce
Salado Amargo Acido Sabor a
cereal/maÍz Sabor a
hongo Astringencia
Picante
Dureza
Gomosidad
Fibrosidad fueron utilizadas por cada panelista como muestra inicial durante el entrenamiento en las sesiones de evaluación y las sesiones de prueba. Los jueces fueron calibrados obteniendo un valor promedio del panel con un desvío estándar inferior a 10% en relación al promedio y los que no tuvieron un valor promedio ± 10 puntos, tuvieron que re‐evaluar las muestras y ajustar sus valores hasta que alcanzaron un consenso. Los panelista se consideraron calibrados cuando obtuvieron un valor promedio del panel con un desvío estándar inferior a 10% (Plemmons & Resurreccion, 1998). P á g i n a | 107 Tabla 22. Definición de los atributos sensoriales y rango de intensidades de referencias estándares utilizados por los jueces para el análisis descriptivo de muestras de hongos deshidratados. Atributoª
Apariencia
Color marrón
Definición
Referencias estándares
Intensidad b
65
Apariencia asociada al color Color marrón Nº 4861 (tabla de colores "Alba",
marrón.
Argentina)
Champignon envasadoc
35
Gusto en la lengua asociado 2.0 % solución de glucosa
con el azúcar.
5.0 % solución de glucosa
10 % solución de glucosa
Champignon envasadoc
20
50
100
21
Salado
Gusto en la lengua asociado 0.2 % solución NaCl
con una solución de cloruro de 0.35 % solución NaCl
sodio.
0.5 % solución NaCl
Champignon envasadoc
25
50
85
35
Amargo
Gusto en la lengua asociado 0.05 % solución de cafeína
con una solución amarga como 0.08 % solución de cafeína
la cafeína.
0.15 % solución de cafeína
Champignon envasadoc
20
50
100
6
Acido
Gusto en la lengua asociado 0.05 % solución de ácido cítrico
con agentes ácidos como una 0.08 % solución de ácido cítrico
solución de ácido cítrico.
0.15 % solución de ácido cítrico
Champignon envasadoc
20
50
100
7
Gusto y aroma asociado a Granos de maíz amarillo enlatado ("La
granos de cereal enlatados.
Campagnola", Mendoza, Argentina)
Mendoza, Argentina)
60
Gustos básicos
Dulce
Flavour
Cereal
"Hongo"
Gusto y aroma asociado a
hongos secos.
Champignon envasadoc
37
Champignon envasadoc
42
Factor sensación
Astringente
Sensación de sequedad en la Té (infusion of té "La Virginia", Bs As,
boca o superficie de la lengua. Argentina,
5 saquitos en 1 l de agua a 90 ºC por 2 h)
Picante
Textura
Dureza
45
Champignon envasadoc
Sensación de cosquilleo o calor Aceite de oliva extra virgen (Variedad
en la lengua.
Arbequina, "Olevita", San Juan, Argentina.
San Juan, Argentina)
Champignon envasadoc
15
Fuerza
necesaria
para Almendras ("Grandiet", Córdoba, Argentina)
comprimir el alimento entre los Champignon envasadoc
molares.
74
20
40
7
Fibrosidad
Cantidad de fibra detectada
durante la masticación
Champignon envasadoc
31
Gomosidad
Grado en el cual la muestra
retorna a su forma original
después de ser masticada por
los molares.
Champignon envasadoc
28
a Lista de atributos en el orden como fueron percibidos por los panelistas. b Valores de intensidad basados en una escala lineal no estructurada de 150 mm. c Referencia de entrenamiento: champiñón enlatado, Agaricus bisporus, marca comercial: “Great value”, elaborado por Xiamen Aihe Trade Co Ltd, Xiamen, China. P á g i n a | 108 2.1.2.3. Evaluación de las muestras Todas las muestras fueron evaluadas por duplicado por cada panelista en “box” individual con luz fluorescente a temperatura ambiente. Se colocó 1 g de cada muestra en tazas de plástico, con tapa, codificadas con números de 3 dígitos al azar. Cada juez evaluó 6‐7 muestras por día además de la muestra de “warm‐up”. En cada sesión de evaluación, se les entregó, además, la lista con las definiciones y las intensidades de las referencias y las de “warm‐up”. Las muestras fueron analizadas utilizando un diseño de bloques completos al azar. Los datos fueron registrados en planillas con escalas lineales 0‐150. 2.2. Prueba de aceptabilidad con consumidores 2.2.1. Muestras utilizadas Se cosecharon muestras de P. tenuiculus (ICFC 383/00) y Pleurotus ostreatus (ICFC 153/99), las cuales fueron cultivadas sobre diferentes sustratos, siguiendo la metodología indicada en el apartado 2.1.6 del capítulo 1. Estas muestras fueron utilizadas para realizar dos pruebas de aceptabilidad. Para un primer análisis con consumidores, se utilizaron cuerpos de fructificación frescos de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de diferentes sustratos: laurel, eucalipto y paja de trigo. Se eligió P. ostreatus ya que es la segunda especie más cultivada en nuestro país y cuyo consumo se encuentra en aumento. Para un segundo análisis con consumidores, se utilizaron cuerpos de fructificación frescos de tres especies de hongos comestibles: P. tenuiculus y P. ostreatus fueron cosechados en paja de trigo y se seleccionó Agaricus bisporus, ya que es la especie más consumida en nuestro país y las muestras frescas fueron adquiridas en un comercio de la ciudad de Chascomús con el fin de poder conocer la aceptabilidad de los consumidores. P á g i n a | 109 2.2.2. Prueba de aceptabilidad de hongos frescos Para realizar este test se utilizó la metodología propuesta por Meilgaard et al. (1991) que permite cuantificar el grado de aceptabilidad o satisfacción (cuanto les “gusta” o “disgusta”) de los jueces (potenciales consumidores) por el producto. 2.2.2.1. Procedimiento Para la prueba de aceptabilidad de las muestras de hongos frescos se utilizó un panel de 25 jueces no entrenados, de la ciudad de Chascomús, seleccionados de acuerdo a los siguientes criterios: -
Edades entre 22‐ 50 años -
No fumadores -
Sin alergias alimentarias -
Consumidores de hongos al menos una vez al mes 2.2.2.2. Preparación de las muestras Inmediatamente después que los cuerpos de fructificación fueron cosechados de los diferentes sustratos, se les cortó el píleo o sombrero del hongo descartando la porción del pie y se lavaron (Manzi et al., 2001). Luego, las muestras fueron cocinadas en una sartén durante 5 min., con el agregado de aceite de girasol y una pizca de sal (Manzi et al., 2004). Para el realizar el primer test de consumidores, las muestras frescas de P. tenuiculus y P. ostreatus, cosechados de paja de trigo (PT), laurel (L) o eucalipto (E) fueron cocinados de manera individual. Para la segundo evaluación sensorial, se utilizaron muestras frescas de tres especies de hongos, P. tenuiculus, P. ostreatus y A. bisporus, las cuales fueron cocinadas en sartenes individuales. P á g i n a | 110 2.2.2.3. Evaluación de las muestras Los consumidores realizaron las evaluaciones en una sala en el IIB‐INTECH. En el primer test con consumidores, se realizó el análisis de las muestras de P. tenuiculus y P. ostreatus, cosechados de PT, L y E. Durante la evaluación, cada juez recibió 6 contenedores individuales de papel donde se colocaron cada una de las muestras, codificados con números de 3 dígitos al azar, a temperatura entre 40‐45ºC. Además, los jueces contaban con agua para enjuague entre cada muestra y las planillas correspondientes (Tabla 23). La planilla fue confeccionada según a lo propuesto por Meilgaard et al. (1991). Entre una muestra y la siguiente hubo un lapsus de 15 a 30 segundos, donde cada juez debió enjuagar su boca con agua. Las muestras fueron presentadas a los jueces en distinto orden, distribuidos al azar. Se pidió a cada juez que contestara el primer punto de la planilla para evaluar la aceptabilidad (nivel de agrado), teniendo en cuenta una escala hedónica estructurada de 9 puntos, desde “1 = me disgusta extremadamente” a “9 = me gusta extremadamente” (Tabla 23). En segundo lugar se solicitó que se evaluara la intensidad percibida en cada muestra de los siguientes atributos, en una escala estructurada de 6 puntos: ­ Apariencia: Color (1 = claro, 6 = oscuro), ­ Flavor: Aroma (1 = sin aroma, 6 = intenso); Sabor (1 = insípido, 6 = intenso), ­ Textura: dureza (1 = blando, 6 = duro); gomosidad (1= elástico), 6 = no elástico), ­ Sensación: Picante (1= suave, 6=intenso) Para el segundo test con consumidores, se evaluaron las muestras frescas de P. tenuiculus, P. ostreatus y A. bisporus. Los consumidores recibieron 3 contenedores individuales de papel con un código de 3 dígitos y se prosiguió de la misma manera que en el test antes explicado. P á g i n a | 111 Tabla 23. Planilla empleada para el análisis con consumidores de hongos frescos. Se x o : F M
EV AL U A C ION SE N SO RIAL D E HO N G O S
Ed ad :
N º M U E ST RA
Fec h a
In s tru c c io n e s
1 . Ac ep ta bilid ad g en e ra l: m a rq u e c o n u n a X en e l c u ad ro q u e m e jor d e sc riba c u an to le g us ta el p ro d u cto .
M e g usta extrem a ‐
da mente
M e g us ta
m uch o
M e g usta b as ta nte
M e g us ta lig era m ente
Ni m e g usta ni me disg us ta
M e di sg usta li eram ente
M e d isg us ta ba s tan te
M e dis g usta
m ucho
M e dis gu sta ex trem a da m ente
2 . Ind iq u e c on u n a X la in te n sid ad q u e p e rsib e en el p ro d u cto d e ca d a u n o de lo s sigu ie nte s atrib uto s .
A p arie nc ia: C o lo r
cl aro
o scu ro
Fla vo r: A rom a
s in aro m a
in te ns o
Sab o r
i ns íp i do
in te ns o
bl an do
du ro
T extu ra : d u reza
go m o sid ad
n o e lás ti co
el as ti co
S en sa ció n : P ic an te
s u ave
i nte ns o
C o m e n ta rio s : M U C H AS G RA C IA S
2.2.3. Análisis estadístico Todos los datos fueron analizados utilizando el programa INFOSTAT, versión 1.1 (Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba). Se calcularon promedios y desvíos estándar, y se realizaron análisis de varianza con test posterior Tukey (α = 0,05) para detectar diferencias significativas entre las muestras para las variables sensoriales estudiadas. P á g i n a | 112 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Análisis descriptivo cuantitativo de la calidad sensorial de hongos deshidratados cosechados de diferentes sustratos. En la Tabla 24 se muestran los resultados obtenidos del análisis sensorial descriptivo de los cuerpos de fructificación deshidratados de las dos especies de hongos comestibles (P. ostreatus y P. tenuiculus) cosechados de PT, L y E. Se analizaron los atributos relacionados con la apariencia, flavour, gustos básicos, factor sensación y textura. De acuerdo al análisis estadístico realizado, ANOVA de dos vía, se pudo comprobar que los factores evaluados, “especies”, “sustratos” e interacción “especies*sustratos”, mostraron diferencias significativas en varios atributos sensoriales. La intensidad del color marrón en las muestras de los hongos deshidratados mostró diferencias significativas entre ambas especies (p<0,0001), siendo P. tenuiculus la que presentó mayor intensidad (p<0,0001). Por otro lado, cuando se compararon las muestras cosechadas de los diferentes sustratos, los hongos cosechados de PT tuvieron la menor intensidad de color, mientras que las muestras cosechadas de L tuvieron la mayor intensidad en ambas especies (p<0,05). Además, como se observa en la Tabla 24, se encontraron diferencias significativas en la interacción especie*sustrato. Las muestras de P. tenuiculus cosechado de L y E y las de P. ostreatus cosechados de L presentaron la mayor intensidad de color. Aparentemente, el uso como sustrato para cultivo de hongos comestibles de los desechos de la industria de aceites esenciales aumentaría la intensidad del color marrón. Cuppett et al. (1998) encontraron diferencias de color en las muestras de P. sajor­caju cosechadas de distintos sustratos, observando un incremento en el color dorado cuando le adicionaron granos de maíz partido (50 %) al sustrato. El color es por lo general el primer parámetro que un consumidor juzga en un producto alimenticio antes de la comprar (Dunkwal et al., 2007). Por lo tanto, este atributo podría ser considerado relevante para describir a los hongos deshidratados. El uso de diferentes sustratos o suplementos podrían ser uno de los instrumentos utilizados para desarrollar diferencias en la intensidad de color de los hongos. P á g i n a | 113 Tabla 24. Valores medios, desvíos estándares (DE) y resultados del Anova de dos vía de la intensidad de los atributos sensoriales evaluados en las dos especies de hongos (P. ostreatus y P. tenuiculus) cultivados de diferentes sustratos. Variables sensoriales Efecto * Especies Po Pt ** E Sustratos L PT ** Po­E Interacción Especies x Sustrato Po­L Po­PT Pt­E Pt­L Pt­PT Color 41.41a # 45.73b 67.82c 38.91a 62.09c 61.18c 43.91ab
marrón Media 50.82a 55.73b # 53.91b 64.5c DE 13.89 11.89 11.61 8.65 6.20 7.86 5.65 4.57 8.61 10.05 6.79 Dulce Media 12.39 11.24 ns 11.32 11.55
12.59 ns 12.27
12.91
12 10.36 10.18
13.18
DE 2.28 3.26 3.09
2.72
2.68
3.17
1.97
1.48 2.84 2.75
3.49
Salado Media 28.00 26.21 ns 26.64 27.73 26.95 ns 26.45 28.36 29.18 26.82 27.09 24.73 DE 3.89 6.05 4.93 5.82 4.74 4.63 3.47 3.25 5.44 7.62 5.06 35
37.45
39.45 32.09 36.27
36
Amargo Media 37.30 34.79 ns 33.55a 36.86ab 37.73b #
DE 5.14 6.35 5.88
6.89
3.82
6.4
4.34
3.72 5.19 8.95
3.19
31.77 ns 37.64c 31.91ab 33.18bc 27.09a 30.82ab 30.36ab
Ácido Media 34.24b 29.42a # 32.36 31.36 DE 5.17 6.11 7.72 5.55 4.99 5.92 3.75 4.07 5.39 7.07 5.59 47.59 ns 42.73
47.82
42.45 50.64 50.27
52.73
Cereal Media 44.33a 51.21b # 46.68 49.05
DE 6.08 10.25 9.35
8.07
9.91
7.14
5.23
4.46 9.9 10.3
11.32
64.27 ns 88.55c 73.55b 66.18ab 58.82a 68.00ab 62.36ab
Hongo Media 76.09b 63.06a # 73.68 70.77 DE 18.72 11.50 20.48 12.57 15.58 15.76 11.74 21.19 12.1 13.3 7.27 Astringencia Media 41.18 38.70 ns 42.64 38.55
38.64 ns 44.27
39.18
40.09 41 37.91
37.18
DE 5.28 8.62 7.51
7.31
6.27
5.2
6.08
2.98 9.24 8.62
8.3
29.77 ns 36.45 41.45 41.55 17.55 17.73 18 Picante Media 39.82b 17.76a # 27.00 29.59 DE 5.92 5.07 11.69 12.80 13.02 7.51 5.43 2.73 5.84 2.2 6.59 30.05b #
22.09ab
19.45a 23.45ab 25.64b 30.91c 36.64d
Dureza Media 21.67a 31.06b # 23.86a 25.18a
DE 3.47 7.91 4.87
8.33
8.23
3.08
3.39
2.91 5.78 7.88
6.17
55.36 ns 49.64 49.64 45.09 60.09 57.27 65.64 Fibrosidad Media 48.12a 61.00b # 54.86 53.45 DE 6.14 11.56 8.87 10.44 14.20 6.47 5.89 5.39 7.96 12.73 12.74 41.50a #
45.36bcd 40.45bc 33.18a 46.45cd 39.55b 49.82d
Gomosidad Media 39.67a 45.27b # 45.91b 40.00a
DE 6.79 9.73 6.72
6.35
11.57
5.46
4.46
3.92 8.02 8.03
10.67
* Efectos del Anova de dos vía: “Especies”, 2 niveles: Pleurotus ostreatus (Po) y Polyporus tenuiculus (Pt); “Sustratos”, 3 niveles: residuos de Eucaliptus cinerea (E), residuos de Laurus nobilis (L) y paja de trigo (PT). **Significancia del efecto: # Significativo p < 0.05; ns: no significativo. a, b, c, d Valores medios seguidos por diferentes letras en cada fila indica diferencias significativas para cada efecto (Anova de dos vías, Test de Tukey, α = 0.05). Los resultados obtenidos para los gustos básicos fueron en general de baja intensidad. P. tenuiculus y P. ostreatus no tuvieron diferencias significativas para los atributos dulce y salado (Tabla 24). El gusto dulce fue el atributo que obtuvo la menor intensidad seguido del gusto salado. En cambio, Cho et al. (2007) y Liu et al. (2005), encontraron diferencias en la intensidad del gusto dulce, tanto en las muestras frescas de cuatro grados diferentes de desarrollo de Tricholoma matsutake, como en las muestras re‐hidratadas de P. sajor­caju cosechado de sustratos con y sin suplementar. Además, informaron valores de intensidad más altos para los gustos dulce y salado (Cho et al., 2007; Liu et al., 2005). Sólo el gusto amargo, mostró diferencias significativas entre los distintos sustratos (p<0,05). Los valores de intensidad de las muestras obtenidas en PT y E no difirieron de los encontrados en L, aunque las muestras de ambas especies cosechadas en PT, obtuvieron valores de intensidad más **
# ns
ns ns
# ns
# ns
ns #
ns #
P á g i n a | 114 altos que las de E. El gusto ácido mostró diferencias significativas entre las especies y en la interacción especie*sustrato (p<0,05). P. ostreatus obtuvo los valores más altos de intensidad (0,4 veces más) en el gusto ácido que P. tenuiculus, sobre todo cuando fue cosechado de E. Ambas especies tuvieron diferentes valores de intensidad en los diferentes sustratos (p<0,05). En el análisis sensorial del sabor, a “hongo” y a “cereal”, se obtuvieron valores altos de intensidad en estos atributos y diferencias significativas especialmente entre las especies (Tabla 24). P. tenuiculus obtuvo el mayor valor de intensidad en el sabor cereal que P. ostreatus (p<0,05). Gallois et al. (1990) reportaron una fuerte intensidad en el sabor cereal en Perenniporia subacida. Cuando se evaluó el sabor “a hongo”, se obtuvieron diferencias significativas entre las especies y en la interacción especie*sustrato (p<0,05). Las muestras de P. ostreatus tuvieron mayor intensidad en el sabor a “hongo” que las de P. tenuiculus. Este atributo registró la mayor intensidad cuando P. ostreatus fue cultivado en E. Por el contrario, P. tenuiculus no registró diferencias significativas en el sabor a “hongo” cuando fue cultivado en los diferentes sustratos. Liu et al. (2005) obtuvieron valores bajos de intensidad en el sabor cereal en muestras de P. sajor­caju cosechado de diferentes sustratos, y valores más intensos para el sabor “a hongo”. Es importante destacar que la sensación de aroma está estrechamente asociada a la sensación de sabor percibido por jueces entrenados en los productos alimenticios. Bajo las condiciones normales de consumo de los alimentos se produce una percepción simultánea del aroma y el sabor, acoplado con sensaciones táctiles, y todo ello contribuye a una impresión total de sabor (Noble, 1996). Esto fue demostrado por Cho et al. (2007), quienes encontraron que los aromas típicos de las muestras frescas de T. matsutake, estaban relacionados con el sabor. Los principales volátiles que se están relacionados con el aroma a “hongo", son compuestos de ocho átomo de carbono, principalmente el 1‐octen‐3‐ol, siendo el porcentaje relativo informado para P. ostreatus de aproximadamente el 60‐78 % del total volátiles (Maga, 1981; Combet et al., 2006; Zawirska‐Wojtasiak, 2004). Mosandl et al. (1986) describieron por pruebas sensoriales realizadas con los enantiómeros (R)‐(‐)‐l‐octen‐
3‐ol y (S)‐(+)‐1‐octen‐3‐ol, que el olor característico “a hongo” fue exclusivamente obtenido por la antípoda (R)‐(‐). Aunque, Abraham & Berger (1994) encontraron que varias especies del género Polyporus tienen el olor característico “a hongo” y presencia de compuestos de ocho carbonos, no se ha informado nada aún sobre la proporción de P á g i n a | 115 la antípoda (R)‐(‐). En el caso de hongos deshidratados, la composición de volátiles es significativamente reducida, aunque se ha estudiado que otros compuestos tales como ácido glutámico libre, numerosos hidratos de carbono y la presencia de ácidos grasos insaturados podrían actuar como potenciadores del aroma durante el tratamiento de deshidratación. Además, los compuestos responsables del aroma de los hongos pueden variar radicalmente entre las especies, cepas y por las prácticas de cultivo (Liu et al., 2005; Maga, 1981; Chandravadana et al., 2005). La sensación picante fue el único factor sensación que obtuvo diferencias significativas entre las especies (p<0,05), siendo más intenso en las muestras de P. ostreatus (1,3 veces mayor) que en P. tenuiculus. Este atributo podría ser utilizado como una característica que permitiría distinguir las especies de hongos. Cuando se analizaron los atributos referidos a la textura se encontraron diferencias significativas en la dureza, entre las especies, sustratos y en la interacción especie*sustrato (p<0,05). P. tenuiculus fue la especie que obtuvo mayores valores de intensidad en la dureza que P. ostreatus (p<0,05). La mayor intensidad fue obtenida en las muestras de P. tenuiculus cosechadas de PT. Los altos valores de intensidad de dureza obtenidos en las muestras de hongos podrían ser atribuidos a diferentes causas. Kotwaliwale et al. (2007) encontraron que la dureza en las muestras de Pleurotus sp. deshidratado fue atribuida a la remoción de la humedad y el aumento en la concentración de otros componentes durante la deshidratación. Zivanovic et al. (2000) indicaron que el incremento en los valores de dureza en muestras frescas de Agaricus bisporus podría ser debido al aumento del contenido de quitina y a la formación de uniones de covalentes entre la quitina y R‐glucanos lo que causaría un aumento en la rigidez de pared de las hifas. La elevada intensidad de dureza encontrada en P. tenuiculus podría ser atribuida a la morfología de las hifas. Al revisar datos bibliográficos sobre la micro morfología de P. ostreatus con la de P. tenuiculus, encontramos que la primer especie tiene un sistema de hifas monomítico, con hifas generativas y la estructura de la pared celular estrecha, mientras que la segunda especie tiene un sistema de hifas anfimítico con hifas generativas y hifas de unión con una estructura de pared celular delgada y gruesa (Lechner et al., 2004; Largent et al., 1986; Borges Da Silveira & Wright, 2002). Como consecuencia los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus son duros y esta característica persiste después del proceso de deshidratación. P á g i n a | 116 También se registraron diferencias significativas en la fibrosidad, entre las especies (p<0,05). P. tenuiculus obtuvo valores más alto de intensidad que P. ostreatus (p<0,05). Liu et al. (2005) informaron valores de intensidad inferiores para este atributo en P. sajor­caju cosechadas de paja de trigo y cascarilla de soja. En los hongos, la pared de las hifas está compuesta principalmente por uniones de β‐glucanos y uniones β‐1,4 del homopolímero de N‐acetilglucosamina llamada quitina (Alexopoulus et al., 1996). Cuppett et al. (1998) informaron que el aumento en el contenido de proteína en los sustratos influía positivamente en el incremento del contenido de quitina en la pared celular y como consecuencia, los valores de fibrosidad en los cuerpos de fructificación de los hongos fueron amyores. Diferencias significativas entre las especies, sustratos y en la interacción especies*sustrato se observaron para la gomosidad (p<0,05). P. tenuiculus presentó mayores valores de gomosidad que P. ostreatus. Las muestras de P. tenuiculus cosechadas de L, tuvieron la intensidad más baja en este atributo, mientras que, en P. ostreatus fueron las muestras cosechadas en PT. Cuppett et al. (1998) obtuvieron diferentes intensidades en la gomosidad en muestras de hongos del género Pleurotus cultivados sobre diferentes sustratos. Al parecer, la gomosidad en los hongos podría depender no sólo de la especie, sino también del sustrato utilizado para su cultivo. Kotwaliwale et al. (2007) informaron que la gomosidad y la dureza en muestras deshidratadas de Pleurotus sp estarían relacionadas positivamente. Al comparar con nuestros resultados, se puede observar un comportamiento similar en las muestras de P. tenuiculus, pero no en las de P. ostreatus. Finalmente podemos concluir que las muestras de P. tenuiculus y P. ostreatus mostraron diferencias en algunos de los atributos sensoriales evaluados. La Fig. 22 muestra un gráfico de estrella con los valores promedios de los atributos, obteniéndose de esta manera un perfil sensorial de cada una de las especies. Las muestras de P. tenuiculus presentaron valores superiores en la intensidad percibida por los jueces entrenados en los atributos, sabor “cereal”, color, dureza, fibrosidad, y gomosidad que las muestras de P. ostreatus. Con estos resultados podemos afirmar que estas especies tienen atributos sensoriales diferentes que nos permitirían diferenciarlas claramente y que no han sido reportados en trabajos previos. Es importante comentar, que no han sido publicado, la intensidad percibida en los P á g i n a | 117 atributos ácido y la sensación picante como atributos sensoriales típicos de la especie P. ostreatus. color marrón
80
Gomosidad
Dulce
60
50
Fibrosidad
40
Salado
30
20
70
10
0
Dureza
Amargo
P. tenuiculus
P. ostreatus
Picante
Acido
Astringencia
Sabor "cereal"
Sabor "hongo"
Fig. 22. Perfil sensorial del análisis descriptivo de cada especie de hongo comestibles: P. tenuiculus y P. ostreatus. 3.2. Prueba de aceptabilidad con consumidores 3.2.1. Prueba de aceptabilidad de muestras frescas de P. tenuiculus y P. ostreatus cosechados de paja de trigo, laurel y eucalipto Se determinó la aceptabilidad por parte de los consumidores de dos especies de hongos comestibles, P. tenuiculus y P. ostreatus, cosechados a partir de diferentes sustratos. En la Tabla 25 se pueden observar las frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala hedónica de aceptabilidad, los promedios y los desvíos estándares de las dos muestras evaluadas por los consumidores. Tabla 25. Frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala hedónica, valores promedios y desvíos estándares de la prueba de aceptabilidad de las muestras de hongos comestibles. Frecuencias relativas (% de consumidores) Escala hedónica Pleurotus ostreatus Polyporus tenuiculus PT L E PT L E 1. Me disgusta extremadamente ‐ ‐ ‐ ‐ 5% 25% 2. Me disgusta mucho ‐ 10% 5% 5% ‐ 5% 3. Me disgusta bastante ‐ 5% ‐ 5% 5% 10% 4. Me disgusta ligeramente ‐
15%
10%
5%
15% ‐
5. Ni me gusta ni me disgusta ‐ 5% 5% 30% 35% 20% 6. Me gusta ligeramente 30%
25%
10%
30%
10% 10%
7. Me gusta bastante 30% 35% 60% 15% 15% 10% 8. Me gusta mucho 30% 5% 10% 10% 10% 20% 9. Me gusta extremadamente 10%
‐
‐
‐
5% ‐
Intensidad de aceptación c
abc
bc
ab
ab
7,20±1,10 5,55±1,79 6,35±1,50
5,60±1,50 5,45±1,88 4,65±2,72a
(promedio±DE) * Letras diferentes en las columnas indican diferencias significativas (ANOVA y test Tukey, α = 0.05). Sustratos utilizados: PT, paja de trigo; L, laurel; E, eucalipto. Se destaca en color dentro de cada sustrato los mayores valores. De las muestras de P. tenuiculus se obtuvieron los siguientes resultados: los especimenes cosechados en L obtuvieron el mayor porcentaje de consumidores (35%) que eligieron la categoría 5 (ni me gusta ni me disgusta); las muestras de PT presentaron un alto porcentaje de consumidores (30%) que eligieron las categorías 6 (me gusta ligeramente) y 5 (ni me gusta ni me disgusta); mientras que las muestras cosechadas de E presentaron un importante porcentaje de consumidores (25%) que P á g i n a | 119 escogieron la categoría 1 (me disgusta extremadamente), sin embargo muchos consumidores (20%) las ubicaron en la categoría 5 (ni me gusta ni me disgusta) y en la 8 (me gusta mucho; 20%). Estos resultados indicarían que para la especie P. tenuiculus el valor más alto de aceptabilidad fue obtenido con muestras cultivadas en PT. Las muestras obtenidas en PT y L obtuvieron valores cercanos a 6, mientras que E tuvo valores cercanos a 5, aunque, al analizar los promedios de aceptabilidad, no se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos. (Tabla 25). Los resultados obtenidos con las muestras de P. ostreatus indicaron que, los hongos cosechados de E presentaron el mayor porcentaje de consumidores (60%) que eligieron la categoría 7 (me gusta bastante); las muestras de hongos cosechadas de L presentaron un alto porcentaje de consumidores (35%) que les asignó la categoría 7 (me gusta bastante); mientras que las muestras cosechadas de PT tuvieron el mismo porcentaje de consumidores (30%) en las categorías 8 (me gusta mucho), 7 (me gusta bastante) y 6 (me gusta ligeramente). Esto indicaría que para la especie P. ostreatus el valor más alto de aceptabilidad fue obtenido con hongos que fueron cultivados en PT (categoría 8), aunque es posible observar que los hongos cosechados de E y L también presentaron una alta aceptabilidad. Al analizar los promedios de aceptabilidad, no se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos. Si se comparan los promedios de aceptabilidad de las especies, P. ostreatus y P. tenuiculus, se encontraron diferencias significativas, siendo la primera la de mayor aceptabilidad promedio sobre todo en PT (7,2; p<0,05). Los valores de P. tenuiculus cosechados en E presentaron el menor valor de aceptabilidad. En la tabla 26, se muestras los valores de las frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala de intensidad, los valores promedios y desvíos estándares de los atributos evaluado (color, aroma, sabor, dureza, gomosidad y sensación picante) en las muestras de P. ostreatus y P. tenuiculus cosechados de los diferentes sustratos. Para el atributo “color”, en las muestras de P. tenuiculus la distribución de los promedios fue similar para los tres sustratos. El mayor porcentaje de consumidores (50‐40%) destacaron que las muestras cosechadas de PT y L presentaron valores bajos de intensidad de color (categoría 1). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en los promedios de intensidad de color entre los tres sustratos. Sólo se P á g i n a | 120 encontraron diferencias significativas entre las especies, siendo P. tenuiculus la que obtuvo la menor intensidad de color (p<0,05). Para los atributos “aroma” y “picante”, no se observaron diferencias significativas entre las muestras. En cuanto al “sabor”, el mayor porcentaje de consumidores eligieron la categoría 5 de intensidad para las muestras de P. ostreatus (PT y L) y P. tenuiculus (L y E). Cuando se analizaron los promedios de intensidad se encontraron diferencias significativas entre las muestras obtenidas de los distintos sustratos y entre las especies. P. ostreatus presentó mayor intensidad de sabor que P. tenuiculus (p<0,05). Además, Las muestras cosechadas de E presentaron mayor intensidad de sabor (p<0,05), que las muestras cosechadas en PT y L. Tisdale et al. (2005) informaron diferencias en intensidad del sabor en muestras de P. ostreatus cultivadas sobre aserrín de diferentes especies de árboles, además de su alta intensidad, y en cuanto al aroma, la composición del sustrato no tuvo ningún efecto. Cuando jueces entrenados evaluaron muestras (deshidratas) de estas dos especies cosechadas de los mismos sustratos fueron capaces de encontrar diferencias en el sabor a nivel de especies, y en la interacción especie*sustrato. De acuerdo a nuestros resultados, se podría sugerir que según el tipo de sustrato utilizado para cultivo, se podría modificar la intensidad del sabor de los hongos. Aunque para confirmar esta afirmación sería necesario realizar más ensayos con el fin de obtener conclusiones más definidas sobre el efecto del sustrato en esta característica y si los consumidores realmente son capaces de percibir las diferencias. Para los atributos de “dureza” y “gomosidad”, se observaron distribuciones de frecuencia diferentes entre los distintos sustratos. Los promedios de intensidad indicaron que la “dureza” fue significativamente diferente entre las muestras de las dos especies. P. tenuiculus tuvo mayor intensidad de este atributo que P. ostreatus (p<0,05) no observándose diferencias entre los distintos sustratos. P á g i n a | 121 Tabla 26. Frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala de intensidad, promedios y desvíos estándares de los atributos sensoriales evaluados en las muestras de P. ostreatus y P. tenuiculus cosechados de diferentes sustratos. Especies P. ostreatus P. tenuiculus Frecuencias relativas (% de consumidores)
Sustratos Intensidad Apariencia Flavour
color
aroma
sabor
1 5% 20% ‐ PT 2 15%
35%
15%
3 15% 20% 15% 4 35%
15%
20%
5 30% 10% 30% 6 ‐ ‐ 20% Prom±DE 3,70±1,22b 2,60±1,27 4,25±1,37b 1 ‐ 10% ‐ L 2 20%
25%
20%
3 20% 40% 15% 4 30% 10% 15% 5 25%
15%
40%
6 5% ‐ 10% Prom±DE 3,75±1,21b 2,95±1,19 4,05±1,36ab 1 10% 20% ‐ E 2 10% 25% ‐ 3 40%
25%
20%
4 10% 25% 30% 5 30%
5%
25%
PT L E 6 Prom±DE 1 2 3 4 5 6 Prom±DE 1 2 3 4 5 6 Prom±DE 1 2 3 4 5 6 ‐ ‐ 3,40±1,31b 2,70±1,22
50% 5% 25%
45%
15% 25% 10%
10%
‐ 15% ‐ ‐ 1,85±1,04a 2,85±1,18
40% 25% 35%
25%
15% 20% 10% 25% ‐
5%
‐ ‐ 1,95±1,00a 2,60±1,27
25% 15% 35% 10% 20%
30%
20% 20% ‐
25%
‐ ‐ 25% 4,55±1,10b 5% 25%
35% 15%
10% 10% 3,30±1,38a 10% 10%
20% 25% 30%
5% 3,70±1,42ab 5% 5% 5%
10% 40%
35% Textura dureza 30% 30% 15% 20% 5% ‐ 2,40±1,27a 25% 35% 25% 10% 5% ‐ 2,35±1,14a 20% 40% 35% 5% ‐
Sensación
gomosidad Picante
10% 55% 25% 40%
35% 5% 25% ‐
5% ‐ ‐ ‐ 2,85±1,14a 1,45±0,60
15% 25% 30% 45%
15% 10% 20% 5% 20% 5%
‐ 10% 3,00±1,41a 2,50±1,57
25% 60% 10% 10% 20% 20%
25% ‐ 20% ‐
‐ 2,25±0,85a ‐ 15% 20% 10% 45% 10% 4,15±1,31b ‐ 15% 20% 20% 40% 5% 4,00±1,21b 10% 20% 20% 30% 15% 5% ‐ 10% 3,05±1,50a 2,00±1,59
10% 50% 10% 25%
30% 10% 10% 10%
20% 5% 20% ‐ 3,80±1,64b 1,95±1,23
5% 50% 15% 15%
5% 15% 20% 15% 35% 5%
20% ‐ 4,30±1,56b 2,10±1,33
15% 30% 5% 30% 15% 10%
45% 10% 15% 20%
5% ‐ Prom±DE 2,35±1,09a 3,30±1,38 4,80±1,40b 3,35±1,39b 3,55±1,39b 2,60±1,54
* Superíndice con letras diferentes en las columnas indican diferencias significativas (ANOVA y test Tukey, α = 0.05). Escalas de intensidad de cada atributo: Color (1= claro, 6= oscuro); Aroma (1= sin aroma, 6= intenso); Sabor (1= insípido, 6= intenso); Dureza (1= blando, 6= duro); Gomosidad (1= no elástico, 6= elástico); Picante (1= suave, 6= intenso). Se destaca en color dentro de cada sustrato los mayores valores P á g i n a | 122 En cuanto a la “gomosidad”, se observaron diferencias significativas entre las especies, las muestras de P. tenuiculus presentaron la mayor intensidad (p<0,05). Los resultados obtenidos por los consumidores para los atributos relacionados con la textura, son acorde a los que se obtuvieron en el análisis sensorial descriptivo con el panel de jueces entrenados. En ambos análisis sensoriales se encontraron diferencias entre las especies, principalmente debido a sus características morfológicas (Lechner et al., 2004; Largent et al., 1986; Borges Da Silveira & Wright, 2002). Es importante destacar que debido a que los juicios que emiten los consumidores están influenciados por diversos factores propios del individuo, es de esperarse una variación grande entre ellos, sin embargo los resultados obtenidos son de un gran valor ya que nos dan una idea de las preferencias y de la manera de cómo califican el producto de nuestro interés. 3.2.2. Prueba de aceptabilidad de muestras frescas de P. tenuiculus, P. ostreatus y Agaricus bisporus Se realizó un test con consumidores utilizando tres especies diferentes de hongos para determinar el grado de aceptabilidad de P. tenuiculus, con respecto a las especies más consumidas en nuestro país. Se utilizaron dos especies de hongos comestibles, A. bisporus o champiñón (la especie más reconocida por los consumidores) y P. ostreatus o gírgolas (la segunda especie más consumida). En la Tabla 27 se observan las frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala hedónica de aceptabilidad, los promedios y los desvíos estándares para cada punto de la escala hedónica de las muestras evaluadas por los consumidores. Las muestras de P. tenuiculus presentaron iguales porcentajes en los valores promedios de consumidores (20%) que eligieron la categoría 4 (me disgusta bastante), 6 (me gusta ligeramente) y 7 (me gusta bastante), mientras que las muestras de P. ostreatus, presentaron el mayor porcentaje de consumidores (40%) que eligieron la categoría 5 (ni me gusta ni me disgusta) de la escala hedónica, sin embargo A. bisporus fue la especie que presentó el mayor porcentaje de consumidores (40%) en la categoría 8 (me gusta mucho). Si se comparan los promedios de aceptabilidad de las especies, las muestras de A. bisporus tuvieron el mayor promedio de aceptabilidad P á g i n a | 123 (7,45), mientras que las muestras de P. tenuiculus tuvieron el menor promedio (5,55), con diferencias significativas entre ellas (p<0,05). P. ostreatus presentó una aceptabilidad intermedia (6,40), pero sin diferencias significativas con las otras dos especies. Estos resultados indicarían que los consumidores mostraron mayor preferencia por el champiñon, esto puede ser atribuido a que esta especie lleva mas de 50 años de comercialización en nuestro país y los consumidores están mas adaptados a su sabor (Albertó et al., 2008). Tabla 27. Frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala hedónica, promedios y desvíos estándares de la prueba de aceptabilidad de las muestras de hongos comestibles. Escala hedónica Frecuencias relativas (% de consumidores) Polyporus
Pleurotus
Agaricus ostreatus tenuiculus bisporus 1. Me disgusta extremadamente
‐
‐
‐
2. Me disgusta mucho ‐ ‐ ‐ 3. Me disgusta bastante ‐
15
‐
4. Me disgusta ligeramente ‐ 20 5 5. Ni me gusta ni me disgusta 40 10 ‐ 6. Me gusta ligeramente 10
20
10 7. Me gusta bastante 20 20 30 8. Me gusta mucho 30
15
40 9. Me gusta extremadamente ‐ ‐ 15 Intensidad de aceptación 6,40±1,31ab 5,55±1,73a 7,45±1,19b (promedio±DE) * Superíndice con letras diferentes en las columnas indican diferencias significativas (ANOVA y test Tukey, α = 0.05). Se destaca en color dentro de cada sustrato los mayores valores. Se destaca en color dentro de cada sustrato los mayores valores. En la tabla 28 se muestras los valores de las frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala de intensidad, los promedios y los desvíos estándares de cada atributo evaluado (color, aroma, sabor, dureza, gomosidad y sensación picante) de las muestras de P. tenuiculus, P. ostreatus y A. bisporus. Para el atributo color, el mayor porcentaje de consumidores destacó que las muestras de P. tenuiculus y A. bisporus presentaron valores bajos de intensidad (categoría 2), mientras que las muestras de P. ostreatus el mayor porcentaje de consumidores les asignaron valores más altos de intensidad de color (categoría 3 y 4). A pesar de estos resultados, al analizar los promedios de intensidad, se observó que las muestras de P. P á g i n a | 124 tenuiculus fueron las de menor intensidad y significativamente diferentes con las otras dos especies (p<0,05). Al igual que en los resultados obtenidos en el punto 3.2.1 de la prueba de consumidores realizada con muestras de P. tenuiculus y P. ostreatus obtenidas de diferentes sustratos, los consumidores destacaron que P. tenuiculus resultó ser el de menor intensidad. Tabla 28. Frecuencias relativas (% de consumidores) para cada punto de la escala de intensidad, promedios y desvíos estándares de cada atributo sensorial evaluado en las muestras de hongos comestibles. Frecuencias relativas (% de consumidores) Especies Intensidad Apariencia
Flavour
textura Sensación
Color
Aroma
sabor
Dureza gomosidad Picante
1 10 30 ‐ 25 15 65 2 25 45 15 30 20 30 3 25
15
40
30
25 5
Pleurotus ostreatus 4 25 5 30 10 20 ‐ 5 15
5
15
5
20 ‐
6 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Prom±DE 3,10±1,25b 2,10±1,07a 3,45±0,94a 2,40±1,44a 3,10±1,37b 1,40±0,60a
1 25 20 ‐ ‐ 10 35 2 45
30
10
5
10 5
3 25 25 15 20 10 30 4 5
10
35
25
20 15
Polyporus tenuiculus 5 ‐ 10 35 30 30 10 6 ‐ 5 5 20 20 5 Prom±DE 2,10±0,84a 2,75±1,44a 4,10±1,07ab 4,40±1,19b 4,10±1,62b 2,75±1,59b
1 15
10
‐
25
40 65
2 35 40 ‐ 40 35 20 3 30 15 20 10 10 ‐ 4 15
15
30
25
15 10
Agaricus bisporus 5 ‐ 20 25 ‐ ‐ ‐ 6 5
‐
25
‐
‐ 5
Prom±DE 2,60±1,09ab 2,95±1,36a 4,55±1,10b 2,35±1,14a 2,00±1,08a 1,75±1,37a
* Superíndice con letras diferentes en las columnas indican diferencias significativas (ANOVA y test Tukey, α = 0.05). Escalas de intensidad de cada atributo: Color (1=claro, 6=oscuro); Aroma (1=sin aroma, 6=intenso); Sabor (1=insípido, 6=intenso); Dureza (1=blando, 6=duro); Gomosidad (1=no elástico, 6=elástico); Picante (1=suave, 6=intenso). Se destaca en color dentro de cada sustrato los mayores valores. Los resultados obtenidos para los atributos que se relacionan con el “flavour” (aroma y sabor) indicaron que en el caso del aroma, las tres especies de hongos comestibles presentaron baja intensidad ya que el mayor porcentaje de consumidores (30‐45%) eligieron la categoría 2. Cuando se compararon los promedios de intensidad de aroma, no se encontraron diferencias significativas entre las tres especies de hongos. En cuanto al sabor, las muestras de P. tenuiculus presentaron iguales porcentajes de P á g i n a | 125 consumidores (35%) que eligieron las categorías 4 y 5, de mayor intensidad. Para las muestras de A. bisporus, un importante porcentaje de consumidores (30%) les asignó la categoría 4, mientras que las muestras de P. ostreatus presentaron los valores más bajos en este atributo, la mayoría de los consumidores (40%) eligieron la categoría 3. Al analizar los promedios de intensidad, las muestras de P. tenuiculus y A. bisporus, presentaron mayor intensidad de sabor y fueron significativamente diferentes que las muestras de P. ostreatus (p<0,05). Al comparar estos valores con los obtenidos por los jueces entrenados con muestras deshidratadas, encontramos diferencias en los resultados, ya que los jueces le asignaron a P. ostreatus la mayor intensidad de sabor, contrariamente a lo obtenido con los consumidores. Este hecho podría ser debido a las variaciones en los juicios de los consumidores, para lo cual sería necesario poder realizar nuevos ensayos con mayor número de participantes. Para los atributos de “dureza” y “gomosidad”, se observaron distribuciones de frecuencia similares en estos atributos entre las tres especies de hongos. Los promedios de intensidad indicaron que la “dureza” fue significativamente diferente entre las muestras de las especies. Las muestras más duras resultaron ser las de P. tenuiculus, mostrando diferencias significativas con las muestras de A. bisporus y P. ostreatus (p<0,05). Los resultados son acordes a los obtenidos en el análisis sensorial descriptivo con el panel de jueces entrenados. En cuanto a la “gomosidad”, se observaron diferencias significativas entre las especies, las muestras de P. tenuiculus y P. ostreatus presentaron los mayores valores de intensidad y fueron significativamente diferentes que A. bisporus (p<0,05). Para el atributo gomosidad, se obtuvieron resultados diferentes al test anterior (apartado 3.2.1.), ya que los consumidores no fueron capaces de encontrar diferencias entre las muestras de P. tenuiculus y P. ostreatus. Este hecho puede estar relacionado, al aumento del número de especies a evaluar y a que los consumidores encuentren similitudes y no puedan emitir un juicio objetivo. En cuanto a la sensación picante, las tres especies de hongos comestibles presentaron altos porcentajes de consumidores (35‐65%) que eligieron la categoría 1, la de menor intensidad. Con respecto a este atributo, cabe destacar que al comparar con los resultados obtenidos con jueces entrenados, los consumidores no fueron capaces de distinguir esta sensación presente en las muestras de P. ostreatus. Esto podría deberse P á g i n a | 126 a que este atributo fue evaluado en último lugar por parte de los consumidores y tal vez no le hayan prestado la atención suficiente. Podemos destacar entonces que P. tenuiculus, en general, tuvo altas intensidades de dureza, gomosidad y sensación picante, con respecto a las otras especies (p<0,05). Mientras que P. ostreatus, resultó con mayor intensidad de color y menor intensidad de sabor, dureza y sensación picante. Por último, A. bisporus tuvo las menores intensidades de dureza, gomosidad y sensación picante con respecto a las otras dos especies evaluadas. Posiblemente, estos atributos tengan una influencia negativa en la aceptabilidad por los consumidores. Como se indicó anteriormente, los juicios que emiten los consumidores están influenciados por diversos factores propios del individuo, es de esperarse una variación grande entre ellos, sin embargo son de un gran valor ya que nos dan una idea de las preferencias y de la manera de cómo califican el producto de nuestro interés. P á g i n a | 127 4. CONCLUSIONES Respecto al análisis de la calidad sensorial de hongos deshidratados: 1‐ El uso de diferentes residuos agrícolas e industriales como PT, E y L usado para el cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus afectaron algunas características sensoriales de las muestras deshidratadas. 2‐ El panel de jueces expertos fue capaz de percibir que las muestras de hongos cosechadas de L y E, tuvieron un incremento en la intensidad del color marrón, del gusto ácido, del sabor a “hongo” y de la gomosidad, mientras que percibieron una menor intensidad del gusto amargo y en la dureza. 3‐ Los panelistas pudieron reconocer y caracterizar ambas especies de hongos, siendo las muestras de P. tenuiculus reconocidas por su sabor a cereal, dureza, fibrosidad y gomosidad mientras que las de P. ostreatus lo fueron por su sabor a “hongo”, sensación picante y gusto ácido. 4‐ El L resultó ser el residuo más apropiado ya que además de influir en algunos atributos sensoriales como color, dureza y gomosidad, es un sustrato que no sólo tuvo buenos rendimientos en cultivo sino que produjo hongos de mejor calidad. Respecto al del análisis sensorial de consumidores de las muestras frescas: 5‐ Las muestras de hongos en general tuvieron aceptabilidad positiva, es decir que no fueron rechazados por los consumidores, con resultados mayores a 5 (ni me gusta ni me disgusta) y cercanos a la categoría 6 (me gusta ligeramente) de la escala hedónica de 9 puntos. 6‐ La aceptabilidad de los consumidores por las muestras de las dos especies de hongos cosechadas no varió con los sustratos empleados. P á g i n a | 128 7‐ La especie con mayor aceptabilidad por los consumidores fue P. ostreatus. 8‐ Los atributos color, dureza y gomosidad fueron diferentes entre las dos especies de hongos comestibles, siendo las muestras de P. tenuiculus las que presentaron menor intensidad de color y mayor dureza y gomosidad que las muestras de P. ostreatus. 9‐ El atributo sabor fue diferente en las muestras cosechadas de los distintos sustratos (PT, L y E). Las muestras de hongos (P. ostreatus y P. tenuiculus) cosechados de E fueron las que presentaron mayor intensidad de sabor. Respecto al análisis sensorial de las tres especies de hongos son: 10‐Las muestras de las tres especies de hongos comestibles en general tuvieron aceptabilidad positiva, es decir que no fueron rechazados por los consumidores, con resultados ubicados entre la categoría “5: ni me gusta ni me disgusta” y “7: me gusta bastante” de la escala hedónica de 9 puntos. 11‐La aceptabilidad de los consumidores fue diferentes entre las tres especies (P. ostreatus, P. tenuiculus y A. bisporus), siendo A. bisporus la de mayor aceptabilidad. 12‐Los atributos dureza, gomosidad y sensación picante presentaron diferencias significativas entre las tres especies de hongos comestibles. Las muestras de P. tenuiculus presentaron mayor intensidad en estos atributos. P á g i n a | 129 CAPITULO IV Biodegradación y biotransformación de los sustratos utilizados para el cultivo P á g i n a | 130 1. OBJETIVOS Considerando que: • Los desechos producidos por la agricultura, la industria de los alimentos y la forestal son fácilmente asimilables por los hongos, y han sido empleados para la producción industrial de compuestos de alto valor económico. • Existe una abundante generación de desechos producidos por la industria de los aceites esenciales con residuos de aceite que quedan atrapados en los tejidos que no son aprovechados. • Los compuestos de aroma producidos por los hongos se originarían por la síntesis de novo o biotransformación de los presentes en los sustratos y que hasta la fecha no hay registros de lo que sucede con los desechos de plantas aromáticas. • La biotransformación de terpenos utilizando enzimas, extractos celulares o células enteras de varios organismos han permitido la producción de aromas y fragancias enantioméricamente puras bajo condiciones de reacción controladas, y sus productos considerados “naturales”. se plantea para este capítulo el siguiente Objetivo General: Evaluar la capacidad de biodegradación y biotransformación de varios sustratos agroindustriales empleados en el cultivo de P. tenuiculus. y los siguientes objetivos específicos: 1‐ Evaluar la capacidad de degradación de P. tenuiculus cuando se emplea como sustrato para su cultivo aserrín de sauce con o sin la adición de suplementos. 2‐ Determinar la capacidad que tienen P. tenuiculus y P. ostreatus para biotransformar compuestos aromáticos presentes en los residuos P á g i n a | 131 provenientes de la industria de los aceites esenciales, mediante fermentación en estado sólido (FES). 3‐ Identificar la formación de nuevos compuestos volátiles a partir de los aceites esenciales extraídos residuales presentes en los sustratos utilizados para el cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus. 4‐ Comprobar la formación de esos nuevos compuestos mediante el cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus en medio líquido, utilizando los compuestos mayoritarios (terpenos) presentes en cada sustrato aromáticos utilizado para cultivo 5‐ Identificar los nuevos compuestos volátiles obtenidos en medio líquido por CG/EM. P á g i n a | 132 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Evaluación de la biodegradación en aserrín 2.1.1. Cepa utilizada Se empleó la cepa de P. tenuiculus ICFC 383/00 por su buen rendimiento en cultivo (Tabla 6). 2.1.2. Sustratos utilizados Se utilizó como sustrato aserrín de sauce (Salix sp.) con y sin el agregado de suplementos (AS, AS1 y AS2, Tabla 2). Para la preparación de los sustratos se siguió la metodología propuesta en el apartado 2.1.5 del capítulo 1. Se realizaron 20 réplicas por cada formulación de sustrato. 2.1.3. Análisis de los cambios en la composición del sustrato Para determinar los cambios en la composición de los sustratos durante el cultivo de P. tenuiculus se tomaron tres muestras por sustrato (bloques de sustrato) al azar que fueron removidas en cuatro etapas diferentes durante el ciclo de cultivo, definidas como: 1) Condición inicial o tiempo cero: bloques esterilizados, sin inocular (día 0); 2) Etapa de incubación: 40 días después de la inoculación; 3) Etapa de fructificación: después de la primer oleada (68‐74 días después de la inoculación) y 4) Final de cultivo o sustrato gastado: luego de la última cosecha (180 días después de la inoculación). Los bloques de sustrato removidos, fueron secados en estufa a 60 ºC, molidos y tamizados. Con estas muestras se realizaron las siguientes determinaciones en cada uno de las etapas de ciclo de cultivo: i) materia seca: se realizó por diferencia del peso del bloque del sustrato antes y después de ser secado en estufa a 60 ºC por 5 días. Este P á g i n a | 133 valor fue expresado como porcentaje; ii) contenido de fibra: determinado por el método de Goering & Van Soest (1970), mediante la extracción de fibra de detergente neutro (NDF) y fibra de detergente ácido (ADF). La hemicelulosa se calculó aritméticamente como NDF – ADF. El contenido de lignina se determinó por el método de ácido sulfúrico (72%). El contenido de celulosa fue estimado directamente por diferencia: ADF – lignina. Los valores de estos componentes fueron expresados como porcentaje de pérdida y presentados en base a materia seca. 2.2. Biotransformación de compuestos presentes en el sustrato utilizado para cultivo: uso de desechos de la industria de aceites esenciales 2.2.1. Cepas y sustratos utilizados Se utilizaron dos cepas, P. tenuiculus, ICFC 383/00 y Pleurotus ostreatus, ICFC 153/99, ésta última fue elegida por ser una especie ampliamente cultivada en forma comercial (Tabla 6). Se emplearon como sustratos para cultivo distintos residuos provenientes de la industria de los aceites esenciales (Eucaliptus cinerea, Origanum vulgare y Origanum x applii). Las dos especies de hongos fueron cultivados según la metodología propuesta en el apartado 2.1.6.2 del Capítulo 1. 2.2.2. Evaluación de la biotransformación de terpenos presentes en los sustratos de plantas aromáticas empleados para cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus Se estudió la biotransformación de compuestos aromáticos presentes en los residuos provenientes de la industria de los aceites esenciales (AE), los cuales fueron utilizados como sustrato para el cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus. Se tomaron muestras (por triplicado) de cada sustrato y cepa utilizada, en dos etapas del ciclo de cultivo: i) etapa de incubación (luego de 25 días de inoculación), y ii) etapa de fructificación (después de la primer oleada, 50‐60 días luego de la inoculación). Se eligió este diseño de muestreo en base a trabajos previos que demostraron que la producción y actividad de las enzimas fúngicas difieren según la etapa del ciclo de P á g i n a | 134 cultivo, las especies de hongos y la naturaleza del sustrato (Shashirekha & Rajarathnam, 2007; Mata & Savoie, 1998). Se utilizaron como control muestras de sustratos sin inocular (control 1), cuya composición fue descripta en el apartado 2.1.6.2 del Capítulo 1 y semillas de trigo inoculadas con cada una de las cepas fúngicas (control 2). Cada bloque de sustrato fue hidrodestilado durante 1 h para extraer el mayor contenido de AE. El equipo utilizado para la extracción de los AE fue del tipo Clevenger. Se recuperó el líquido de destilación y se mezcló con cloruro de metileno (40% v/v) en una ampolla de decantación, se agitó enérgicamente y se dejó reposar por unos minutos para que se separen las fases. Luego se recuperó la fase orgánica (CH2Cl2), que contiene el AE y se agregó sulfato de sodio anhidro para deshidratarlo. Se filtró la fase orgánica (solvente y AE) y se lo guardó en heladera hasta su análisis (López et al., 2004). Previo al análisis, la fase orgánica (solvente) se separo del AE por evaporación en un rotavapor a 37 ºC. La determinación de terpenos de las muestras se realizó por CG y por CG‐EM. 2.2.2.1. Análisis de terpenos por CG Los terpenos fueron analizados en un cromatógrafo gaseoso con un detector de ionización de llama (Perkin Elmer Clarus 500). El inyector y el detector de temperatura fueron de 200 y 270 ºC, respectivamente. La temperatura de la columna fue programada de la siguiente manera: 50 ºC (2 min.) a 200 ºC (3 ºC/ min.). El gas conductor fue helio con un flujo constante de 0.9 mL/min. Los compuestos fueron resueltos en un columna DB‐5 (25 m de largo x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm espesor de capa) y una Supelcowax 10 (25 m de largo x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm espesor de capa) sucesivamente e identificados en base a comparación con estándares auténticos. 2.2.2.2. Análisis de terpenos por CG­EM P á g i n a | 135 Los terpenos fueron analizados en un cromatógrafo gaseoso acoplado a un espectrómetro de masa (HP 5890II‐ HP 5971 MSD, Hewlett‐Packard), con un potencial de 70eV para la ionización por impacto de electrones. El inyector y el detector de temperatura fueron de 200 y 270 ºC, respectivamente. La temperatura de la columna fue programada de la siguiente manera: 50 ºC (2 min.) a 200 ºC (3 ºC/ min.). El gas conductor fue helio con un flujo constante de 0.9 mL/min. Los compuestos fueron resueltos en un columna DB‐5 (25 m de largo x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm espesor de capa). Los productos transformados fueron identificados por comparación con bibliotecas de CG/EM (NIST, Adams y Wiley). También se utilizaron los índices de retención, calculados sobre una serie homóloga de hidrocarburos en el rango de C6 a C20. 2.3. Evaluar la capacidad biotransformadora de P. tenuiculus y P. ostreatus en medio de cultivo líquido utilizando terpenos 2.3.1. Preparación del medio de cultivo e inoculación de cepas El medio de cultivo líquido utilizado fue preparado siguiendo la metodología propuesta por Onken & Berger (1999). Para preparar 1 L del medio de cultivo, se agregó 30 g de D‐glucosa monohidratada, 4,5 g de L‐asparagina monohidratada, 3 g de extracto de levadura, 1,5 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4·H2O y 1 ml de solución de elementos trazas (80 mg l‐1 de FeCl3·6H2O, 90 mg l‐1 de ZnSO4·7H2O, 30 mg de MnSO4·H2O, 5 mg l‐1 de CuSO4·5 H2O y 0,4 g l‐1 de EDTA. El pH del medio fue ajustado a 6 utilizando una solución de KOH 1 N previamente a ser esterilizado en autoclave a 1 atm (121 ºC, durante 20 min.). Para realizar los cultivos fúngicos, se utilizaron elermeyer de 100 ml conteniendo 30 ml del medio de cultivo. Éstos fueron inoculados con 5 cilindros de agar de 0,5 cm. de diámetro de 7 días de cultivo en placa de petri con medio PDA de las cepas de P. tenuiculus (ICFC 383/00) y P. ostreatus (ICFC 153/99). Los cultivos fueron colocados en un shaker orbital a 180 rpm y 24 ºC. Luego de 7 días fueron homogenizados mediante el uso de una minipimer para ser empleados como inóculo. Se sembró 1,5 ml por elermeyer de 100 ml conteniendo 30 ml del medio del cultivo líquido y se incubó en un shaker orbital a 180 rpm y 24 ºC. P á g i n a | 136 2.3.3. Biotransformación de terpenos en medio líquido. Se realizó con el objetivo de comprobar la capacidad de P. tenuiculus y/o P. ostreatus de biotransformar los compuestos mayoritarios de los AE presentes en los sustratos utilizados para cultivo, como se indicó en el apartado 2.2.2 de éste capítulo. Para ello, después de 60 h. (2,5 días) de inoculado el medio como se indicó en el apartado 2.3.3, se incorporó de manera directa 0,1 % (v/v) de cada terpeno puro (1,8‐
cineol y timol). Los cultivos fueron incubados a 24 ºC en un shaker orbital a 80 rpm, durante 15 días. Se tomaron muestras por triplicado a los 7, 9 y 12 días de inoculado (4,5, 6,5 y10,5 días después de la incorporación del terpeno). 2.3.4. Análisis e identificación de compuestos volátiles en el medio de cultivo El contenido de los elermeyer fue centrifugado (5000 x g, 20 min.), para separar el micelio del medio líquido. Se le realizó una extracción del sobrenadante con solvente (cloruro de metileno) en una ampolla de decantación, se agitó enérgicamente y se dejó reposar por unos minutos para que se separen las fases. Luego se recuperó la fase orgánica (CH2Cl2) y el AE. Se agregó sulfato de sodio anhidro para deshidratarlo, se filtró y se lo guardó en heladera hasta su análisis (López et al., 2004). Los compuestos presentes, en el medio de cultivo, fueron posteriormente identificados por CG y CG‐EM tal como se indicó en los apartados 2.2.2.1 y 2.2.2.2 de este capítulo. 2.4. Análisis estadístico Antes de realizar el análisis estadístico, se aplicaron los test de Kolmogorov‐Smirno y el de Levene Median a fin de verificar si los datos cumplían las condiciones de normalidad e igualdad de varianza respectivamente (Statistica 6.0, Stat soft Inc.). Los grupos de datos que no cumplieron dichas condiciones fueron transformados mediante funciones logaritmo natural (ln) y reevaluados. Las diferencias entre las P á g i n a | 137 medias de los tratamientos (sustratos, estadios) fueron analizadas mediante un ANOVA de dos factores seguido de un procedimiento de comparación de todos los pares (test post­doc). Se utilizó el método de Holm‐Sidak para detectar diferencias (p<0,05) entre medias e interacciones entre factores (Statistica 6.0, Stat soft Inc.). Se aplicó análisis de ANOVA, de componente principal (PCA) y correlación de Pearson para los porcentajes relativos de los compuestos aromáticos con el fin de clarificar la relación entre las muestras del sustrato control 1 y los tratamientos (Statistica 6.0, Stat soft Inc.). P á g i n a | 138 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Evaluación de la biodegradación en aserrín: Análisis de los cambios de la composición del sustrato En la Tabla 34 se muestran los valores de la pérdida de materia seca y del contenido de fibras de los sustratos durante los diferentes etapas del ciclo de cultivo de P. tenuiculus. Tabla 34. Cambios en la composición de materia seca y fibras en aserrín de sauce con y sin suplemento durante el cultivo de P. tenuiculus. Pérdida de materia seca Celulosaa Hemicelulosaa Ligninaa Sustrato Etapa (%)a 1 0,00 49,75 ± 1,72 14,25 ± 0,35 23,25 ± 0,35 2 9,45 ± 1,84 41,02 ± 0,96 13,43 ± 2,04 20,52 ± 0,94 AS 3 25,48 ± 3,78 34,52 ± 0,94 5,59 ± 1,62 16,02 ± 1,62 4 61,45 ± 1,91 16,29 ± 1,22 2,79 ± 0,68 9,16 ± 0,95 1 0,00 44,00 ± 2.12 15,75 ± 0,35 21,5 ± 1,41 2 18,15 ± 1,88 32,19 ± 0,62 12,28 ± 0,00 18,28 ± 1,25 AS1 3 21,72 ± 2,48 31,70 ± 1,57 8,88 ± 2,60 17,22 ± 1,17 4 69,06 ± 2,10 11,21 ± 0,55 2,20 ± 1,64 7,27 ± 0,66 1 0,00 45,00 ± 2,12 16,00 ± 1,06 21,00 ± 0,00 2 12,16 ± 3,66 35,35 ± 0,96 11,45 ± 2,24 18,74 ± 1,34 AS2 3 32,37 ± 0,99 26,59 ± 1,03 8,57 ± 0., 2 15,05 ± 0,23 4 66,08 ± 1,08 12,04 ± 0,24 2,56 ± 0,22 7,80 ± 0,40 a Todos los valores son medias ± desviación estándar de tres réplicas. AS: Aserrín de sauce; AS1: Aserrín de sauce + salvado de trigo + harina de soja; AS2: Aserrín de sauce + salvado de trigo + harina de soja + semilla de mijo. Etapas: 1, condición inicial, tiempo cero; 2, etapa de incubación; 3, etapa de fructificación (68‐74 días después de la inoculación y 4, Final de cultivo o sustrato gastado (180 después de la inoculación). Con respecto a la pérdida de materia seca, se evidenció un incremento significativo en el porcentaje de pérdida en todos los sustratos durante las 4 etapas evaluadas (p<0,05). Como era de esperar, los bloques tuvieron el máximo valor de pérdida de materia seca en la etapa 4, sin mostrar diferencias significativas entre los distintos sustratos, evidenciando que el hongo actúa degradando en forma continua el sustrato. Además, se pudo comprobar que el porcentaje de pérdida de materia seca de los bloques de aserrín se correlaciona con el incremento observado en la EB (ver Tabla 9, P á g i n a | 139 Capítulo 1). Los resultados obtenidos indicarían que la bioconversión sería más eficiente en los sustratos suplementados (AS1 y AS2). Presumiblemente, podríamos decir que la materia seca perdida sería en parte asimilada en los cuerpos de fructificación, y en parte perdida como dióxido de carbono por la respiración de los hongos (Zhang et al., 2002). Por otra parte, cuando se determinaron los cambios ocurridos en los principales componentes de los sustratos, observamos que P. tenuiculus tuvo una gran capacidad para degradar el aserrín de sauce, causando una disminución del 67,26 al 74,52 % en el contenido de celulosa, del 80,42 al 86,03 % en el contenido de hemicelulosa y del 60,62 al 66,19 % en el contenido de lignina en los tres sustratos ensayados al final del ciclo de cultivo (5 meses). Los valores obtenidos son altos si los comparamos con los alcanzados en otras especies de hongos comestibles. En trabajos previos Nazareth & Sampy (2003), informaron que la disminución en el contenido de lignina y celulosa de aserrín de madera dura causada por Panus tigrinus (= Lentinus tigrinus) después de un período de incubación de 4 meses fue del 56,00 y 64,00 % respectivamente. En cambio, Lechner & Papinutti (2006) indicaron que la disminución en el contenido de lignina y celulosa en bloques de paja de trigo inoculados con P. tigrinus fue del 21,49 y 53,26 %, respectivamente, durante el mismo período de tiempo, evidenciando una capacidad diferente de degradación dependiendo del sustrato y no menos importante, de la cepa empleada. En P. tenuiculus, el contenido de celulosa obtenido demostró tener diferencias significativas entre los sustratos y las etapas evaluados (p<0,05). La degradación de celulosa fue más evidente en los bloques de aserrín suplementado (AS1 y AS2) que en los bloques sin suplementar (p<0,05). En la etapa 2 (luego de 40 días de incubación), se observó una reducción significativa en el contenido de celulosa en los sustratos suplementados (AS1 y AS2), entre el 21,44 y 26,83 %, mientras que en el sustrato sin suplementar esa disminución fue 0,2 veces menor (p<0,05). Con respecto al contenido de hemicelulosa, se evidenciaron diferencias significativas en los tres sustratos durante las cuatro etapas del ciclo de cultivo (p<0,05). Luego de 40 días de incubación (etapa 2), este componente tuvo una disminución importante en los sustratos suplementados, AS1 y AS2, siendo 22,04 y 28,45 % respectivamente (p<0,05). En el aserrín sin suplementar, este componente sólo disminuyó el 5,75 % entre la etapa 1 y 2. La disminución en el contenido de hemicelulosa fue P á g i n a | 140 significativamente mayor entre la etapa 1 y 4 en los tres sustratos ensayados (p<0,05), a su vez fue relativamente mayor con respecto al contenido de celulosa y lignina, implicando que P. tenuiculus podría utilizar la hemicellulosa como una fuente de energía más fácilmente digerible. Mukherjee & Nandi (2004) han informado patrones similares de utilización de los componentes lignocelulósicos del sustrato durante la degradación de biomasa de jacinto de río por especies de Pleurotus luego de 48 días de FES. Los valores del contenido de lignina en P. tenuiculus, revelaron diferencias significativas entre los sustratos y las cuatro etapas evaluadas (p<0,05). Este componente tuvo una disminución del 10,77 a 14,98 % entre la primera y segunda etapa, y del 60,62 a 66,19 entre la primera y cuarta etapa, en todos los sustratos, siendo la lignina, el componente que menos se ha consumido durante todo el ciclo de cultivo. Cuando se compararon los cambios de contenido de lignina entre los sustratos, sólo se registraron diferencias significativas entre los bloques de aserrín de sauce sin suplementar y los que contenían un 25 % de suplemento (AS2; p<0,05). La lignina, es una molécula compleja, los microorganismos son incapaces de utilizarla en forma exclusiva como fuente de carbono y energía por lo cual constituye una barrera (Kirk et al., 1976). Los hongos de pudrición blanca, como P. tenuiculus, tienen la capacidad de poder degradar lignina y de esta manera poder alcanzar otras fuentes de carbono presentes en la madera (celulosa y hemicelulosa). Con respecto a esta capacidad, hemos podido observar que hacia el final del ciclo de cultivo, los bloques de sustratos cambiaron su coloración a marrón oscuro, con la producción de un fluido también muy oscuro que podría posiblemente deberse a la alta concentración de lignina en su composición tal como lo informó Wainright (1992). Es importante destacar que, en nuestros experimentos, los sustratos suplementados (AS1 y AS2) mostraron disminuciones más elevadas en el contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina a lo largo del ciclo de cultivo que en AS. Este resultado es acorde a lo informado por Philippoussis et al. (2003), quien señaló que éste comportamiento podría ser atribuido a la existencia de hidratos de carbono más fácilmente metabolizables, provenientes de los suplementos orgánicos presentes en los sustratos, tales como el salvado de trigo y el mijo. Esto podría explicar el mayor rendimiento y biodegradación obtenido con P. tenuiculus cuando fue cultivado en AS1 y AS2. Por otra parte, Myoson & Verachtert (1991) demostraron que la descomposición del sustrato por L. edodes está P á g i n a | 141 inicialmente asociada con el contenido de hemicelulosa. La variabilidad observada en la capacidad de degradación de los componentes lignocelulósicos presentes en los sustratos es debido en parte a la naturaleza del sustrato, a la influencia de factores exógenos y, más precisamente, por poseer factores genéticos diferentes entre especies o entre las cepas de la misma especie (Blanchette, 1991). Estos resultados indicarían que P. tenuiculus tendría una gran capacidad lignocelulolítica y un potencial uso en la degradación de otros residuos lignocelulósicos como ha sido demostrado con otras especies tales como, P. ostreatus (Kerem et al., 1992), Trametes versicolor (Valmaseda et al., 1991), y Lentinus tigrinus (Lechner & Papinutti, 2006). Por otra parte, además de reducir el impacto ambiental que producen los desechos, este proceso de bioconversión representaría una estrategia económicamente sana de convertir agro‐
residuos en alimento con calidad nutricional. También, los resultados obtenidos de la biodegradación de los componentes presentes en el aserrín son interesantes ya que se podría determinar su potencial para la producción de bioetanol. Finalmente, fue posible observar que los componentes lignocelulósicos presentes en los sustratos decrecen considerablemente durante el ciclo de cultivo de P. tenuiculus. La EB obtenida en aserrín de sauce, la elevada temperatura de fructificación, y técnicas de cultivo sencillas indican que P. tenuiculus podría ser una especie interesante para su producción comercial, especialmente en áreas tropicales y subtropicales. 3.2. Evaluación de la biotransformación de compuestos presentes en el sustrato utilizado para cultivo. Se estudió la capacidad que tienen P. tenuiculus y P. ostreatus para biotransformar terpenos, presentes en los desechos de la industria de los AE utilizados como sustratos para cultivo. Para ello se emplearon residuos de E. cinerea, O vulgare y O. x applii. 3.2.1. Biotransformación de terpenos utilizando como sustrato de cultivo Eucaliptus cinerea P á g i n a | 142 Se analizaron las diferentes muestras de AE de los bloques de sustrato de E. cinerea sin inocular (control 1) y los tratamientos: P. tenuiculus o P. ostreatus en dos etapas del ciclo: incubación y fructificación. También se analizaron los volátiles presentes en el inóculo formado por semillas de trigo y micelio de cada especie (control 2) para descartar posibles compuestos aportados por el hongo al medio. Los resultados muestran (Fig. 32 A) los cromatogramas obtenidos por CG del AE del sustrato control 1, y de AE de uno de los tratamientos (sustrato+micelio de hongo). En el Fig. 32 B se puede observar la aparición de tres picos los cuales podrían ser compuestos productos de biotransformación por la acción fúngica. De todos los compuestos presentes en los AE de E. cinerea, sólo fue biotransformado por P. ostreatus y P. tenuiculus el 1,8‐cineol. Estos compuestos biotransformados no se observaron en ninguno de los controles. Posteriormente, se realizó la determinación de volátiles de las muestras de AE extraídos con cloruro de metileno de los tratamientos y del sustrato control 1 por CG‐
EM. Se identificaron 30 compuestos volátiles correspondientes a la fracción de terpenos, incluyendo 17 monoterpenos oxigenados, 2 monoterpenos hidrocarburos, 2 ésteres, 3 sesquiterpenos oxigenados y 6 sesquiterpenos hidrocarburos. En la Tabla 35 se muestran los promedios de sus porcentajes relativos, calculados como porcentaje del área del pico cromatográfico del CG. P á g i n a | 143 A B Fig. 32. Cromatogramas obtenido a partir de los AE extraídos de los sustratos, mediante CG. A) sustrato control 1: sin la acción fúngica, y B) Después del tratamiento con P. tenuiculus (sustrato+ micelio de hongo). P á g i n a | 144 Tabla 35. Porcentajes relativos de volátiles identificados en los AE de los sustratos inoculados con P. tenuiculus y P. ostreatus (etapa de incubación y fructificación) y del sustrato control 1 (E. cinerea). Compuestos volátiles p cimeno Limoneno 1,8‐cineol Oxido de cis linalol hidrato de sabineno mircenol alcanfor isoborneol pinocarvona 4‐terpineol cis pinocarveol alfa terpineol 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo [2.2.2]octan‐6‐ol 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo [2.2.2]octan‐6‐ona No conocido 1 verbenona trans carveol piperitona metil nerolato alfa terpenil acetato eugenol longifoleno beta cariofileno allo aromadendreno gama gurjuneno valenceno viridifloreno globulol alfa cadinol drimenol P. ostreatus RI a incubación 1025
0,52 1029
1,29 1031
7,55
1087
0,44
1098
0,99 1123
0,35 1146
0,07
1162
1,37
1165
0,07 1177
2,83 1184
0,1
1189
36,81
1192
1,87 1197
4,94 1201
3,19 1205
1,77
1217
0
1253
0 1283
1,2 1349
17,41
1359
0
1408
2,47 1419
1,01 1460
1,21
1477
0,68
1496
2,2 1497
1,23 1585
1,1
1654
0,77
1767
1,5 Porcentaje relativo(%) b P. tenuiculus P. ostreatus P. tenuiculus E. cinerea incubación fructificación fructificación control 0,1 0,48 0,25 0,60 0,48 1,18 0,76 0,90 7,46
6,28 7,72
1,83
0,07
0,49 0,1
0,30
0,07 0,43 0,07 0,01 0,07 0,44 0,13 0,10 0,6
0,03 0,6
1,10
1,44
0,98 1,51
2,00
2,67 0,73 2,85 3,40 3 1,95 3,03 4,83 2,19
0,07 1,52
2,20
43,09
36,2 42,61
38,30
2,23 1,75 2,38 0,00 6,11 5,11 5,93 0,00 2,57 3,38 2,63 0,00 0,59
0,67 0,3
0,55
0
0 0 0,7
0 0 0 0,56 0,1 0,94 0,1 2,21 14,38
16,99 13,95
13,52
0
0 0 0,31
1 2,88 1,26 4,23 1,41 1,05 0,84 0,32 0,84
1,29 0,87
1
0,85
1,02 0,93
2
2,03 2,18 1,72 1,7 1,16 1,8 1,01 2,51 0,34
1,83 0,34
5,91
0,34
0,81 0,35
2,89
0,35 1,7 0,28 0,3 Índice de retención.bPorcentaje relativo de los volátiles identificados en base al área del pico cromatográfico CG/EM. nd: no detectado. Traza: tr < 0,01%. a Las determinaciones realizadas por CG‐EM de los AE de los tratamientos y control 1, permitieron la identificación tentativa de 2 de los 3 nuevos compuestos, productos de la biotransformación fúngica en los AE de los tratamientos (Fig. 33 y 34). Sus estructuras fueron identificadas por comparación con la base de datos de las bibliotecas Nist y Wiley, mostrando un alto porcentaje de coincidencia (> al 95 %) respecto a los compuestos citados en las bibliotecas. Estos compuestos fueron el 1,3,3‐
trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ol y 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ona (Fig. 33 y 34), mientras que la estructura del tercer compuesto aún no fue posible de P á g i n a | 145 identificar. Estos productos de biotransformación fueron los mismos en ambas especies de hongos. Fig. 33. Espectro de masa del 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ol obtenido por CG/EM A) Espectro del compuesto obtenido mediante biotransformación por P. tenuiculus y P. ostreatus. B) Espectro de masas de CG/EM obtenido de la biblioteca Nist; C) Espectro de masas de CG/EM obtenido de la biblioteca Wiley. P á g i n a | 146 Fig. 34. Espectro de masa del 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ona obtenido por CG/EM, A) Espectro del compuesto obtenido mediante biotransformación por P. tenuiculus y P. ostreatus. B) Espectro de masas de CG/EM obtenido de la biblioteca Nist; C) Espectro de masas de CG/EM obtenido de la biblioteca Wiley. P á g i n a | 147 Los porcentajes relativos de estos compuestos no mostraron diferencias significativas entre las especies, ni entre las dos etapas del ciclo de cultivo evaluados. La biotransformación del 1,8‐cineol fue comprobada mediante los experimentos llevados a cabo en medio de cultivo líquido inoculados con P. tenuiculus o P. ostraetus en presencia del 1,8‐cineol. Después de 12 días de cultivo (fase estacionaria, datos no mostrados) fue posible aislar por extracción con cloruro de metileno del medio de cultivo los siguientes compuestos: 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ol y 1,3,3‐
trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ona y el tercer compuesto cuya estructura no fue posible determinar por comparación con compuestos de la biblioteca del CG/EM. De esta manera, hemos podido demostrar que tanto P. tenuiculus como P. ostreatus son capaces de biotransformar el 1,8‐cineol, dando como productos estos tres compuestos (Fig. 33 y 34). Las reacciones involucradas en la biotransformación de compuestos orgánicos, como en el caso del 1,8‐cineol, incluyen oxidaciones, reducciones, hidroxilaciones, esterificaciones, metilaciones, isomerizaciones, hidrólisis y glicosidaciones, éstas últimas ocurren principalmente en las células vegetales (Ishihara et al., 2003; Rodriguez et al., 2006; Niku‐Paavol & Viikari, 2000). Esto va a depender del agente biotransformador. Shimoda et al. (2006) informaron que cultivos de células vegetales de Eucalyptus perriniana en presencia de timol, carvacrol o eugenol generaron productos glicosidados y no detectaron otras productos transformados en el medio. Contrariamente, experimentos realizados con cultivos celulares de Achillea millefolium, evidenciaron la capacidad de biotransformar monoterpenos y sesquiterpenos, por ejemplo convirtieron el timol exógeno, en limoneno, carvacrol y 1‐8‐cineol, mientras que una parte minoritaria de los productos fueron compuestos glicosidados (Figueredo et al., 1996). MacRae et al. (1979) informaron que Pseudomonas flava creciendo sobre hojas de eucalipto, fue capaz de utilizar el 1,8‐cineol como fuente de carbono, además, observaron que cuando crecían en medio de cultivo en presencia de este compuesto, obtenían productos de oxidación del C2 (véase compuestos 2, 3 y 4 en Fig. 35). P á g i n a | 148 Fig. 35. Estructura química del 1,8‐cineol y sus productos biotransformados por Pseudomonas flava y Rhodococcus sp. (Rodriguez et al., 2006). Más recientemente, Rodriguez et al., (2006) obtuvieron los mismos productos de biotransformación del 1,8 cineol (2‐endo‐hidroxi‐1,8‐cineol; 2‐exo‐hidroxi‐1,8‐cineol y 2‐oxo‐1,8‐ cineol) realizando cultivos líquidos con cepas de Rhodococcus sp., determinando además, que el tamaño del inóculo influye positivamente con la mayor producción de estos nuevos compuestos. Estos productos fueron los mismos que los identificados en los AE de los tratamientos con P. ostreatus y P. tenuiculus, aunque en nuestros resultados no fue posible determinar si el OH está en posición ecuatorial o axial, como en el caso de los compuestos 2 y 3, Fig. 35. Cultivos líquido de Aspergillus niger en presencia de 1,8‐cineol, evidenciaron dos nuevos alcoholes como productos de oxidación, el 3‐exo y el 3‐endo hidroxicineol y al igual que nuestros resultados, entre los productos de biotransformación obtuvieron el 1,3,3­trimetil­2­oxabiciclo[2.2.2]octan­6­ol (Nishimura et al., 1982). Por último, es posible sugerir que exista una selección en el ingreso del 1,8‐cineol a las células fúngicas, y que ésta sea una molécula fácilmente biotransformable por el propio mecanismo de detoxificación fúngica (Aleu & González Collado, 2001; Kaspera et al., 2005). Tal como fue analizado anteriormente, hasta el momento no se ha publicado la biotransformación del 1,8‐cineol utilizando como agente biotransformador a P. ostreatus y/o P. tenuiculus. Estas especies fueron capaces de producir tres compuestos, P á g i n a | 149 dos de los cuales tienen una estructura conocida y un tercer compuesto el cual no ha sido identificado con las herramientas utilizadas en nuestro trabajo (índice de retención, estándar o similitud con espectros de masas de las bibliotecas anteriormente mencionadas). De él solo podemos decir que es un monoterpeno oxigenado de peso molecular similar a los dos compuestos biotransformados. El empleo de microorganismos para llevar a cabo reacciones de biotransformación constituye un gran avance sobre los procesos de síntesis orgánica clásica ya que se utilizan reactivos biodegradables, y son generalmente estero selectivos resultado en la producción de compuestos óptimamente puros, además, los productos obtenidos pueden ser comercializados como naturales (Faber, 1995). Así, los productos derivados de la oxidación del 1,8‐cineol tienen un gran potencial de aplicaciones en la industria de los aromas. Varios trabajos se realizaron sobre la producción de aroma mediante la FES utilizando diferentes residuos agroindustriales y microorganismos. Por ejemplo, cuando se empleó cascarilla de café inoculada con Ceratocystis fimbriata, la naturaleza e intensidad de los aromas detectados estuvieron vinculados con la concentración de glucosa adicionada al sustrato, además tuvo una influencia directa en la vía metabólica y en la naturaleza de los compuestos volátiles producidos. También se observó que la adición de leucina provocó un incremento en la producción total de volátiles especialmente en la producción de ésteres que tienen una fuerte intensidad de aroma a banana (Souares et al., 2000; Lanza et al., 1979; Christen et al., 1994). Este comportamiento se obtuvo con la utilización de otros sustratos tales como el bagazo de yuca, bagazo de caña de azúcar y salvado de trigo (Christen et al., 1997; Bramorski et al., 1998). Como se observa en la Fig. 36 a, los porcentajes relativos de algunos compuestos presentes en las muestras de AE de los tratamientos tuvieron un incremento significativamente mayor con respecto a los presentes en el control 1, coincidente con lo observado por Caovilla et al., 2008; Leão Lana et al., 2006. El contenido de 1,8‐cineol determinado en los AE de los tratamientos, fue significativamente mayor con respecto al control (p<0,05), podría deberse por la isomerización del alfa terpineol (Leão Lana et al., 2006), o bien por la liberación de este compuesto de los tejidos vegetales por acción enzimática (Weinberg et al., 1999). P á g i n a | 150 El hidrato de sabineno y drimenol, aumentaron significativamente sólo en las muestras de P. ostreatus (incubación y fructificación; p<0,05). La verbenona se incrementó en P. ostreatus incubación (p<0,05). Esto podría deberse a la actividad de enzimas oxigenasas sobre el limoneno, alfa y/beta pineno (Caovilla et al., 2008). En el caso del alfa terpineol, alfa terpenil acetato, beta cariofileno, alloaromadendreno, y valenceno, si bien se observa un incremento, no tuvieron diferencias. A)
Cambios en el porcentaje relativo
6
5
4
3
P. ostreatus incubación
2
P. tenuiculus incubación
1
P. ostreatus fructificación
0
P. tenuiculus fructificación
‐1
‐2
‐3
B)
Cambios en el porcentaje relativo
6
4
2
P. ostreatus Incubación
P. tenuiculus incubación
0
‐2
P. ostreatus fructificación
P. tenuiculus fructificación
‐4
‐6
Fig. 36. Porcentajes relativos de los compuestos volátiles obtenidos en las muestras de AE de P. ostreatus y P. tenuiculus en las diferentes etapas de cultivo empleando E. cinerea. A) Incremento del porcentaje respecto al control; B) Disminución del porcentaje respecto al control. P á g i n a | 151 El incremento en las cantidades relativas de algunos compuestos, todos ellos monoterpenos y sesquiterpenos oxigenados, especialmente observado en P. ostreatus, podría ser debido a la acción de sus enzimas ligninolíticas, que al digerir los tejidos vegetales liberarían los terpenos atrapados en ellos, debido a que la técnica de arrastre de vapor utilizada por la industria no fue capaz de hacerlo completamente (Dudai et al., 2001; Weinberg et al., 1999). La naturaleza del material lignocelulósico y los métodos empleados en el cultivo de hongos comestibles son factores que determinan la expresión de su potencial lignocelulósico, así como también parecen determinar el tipo, la variación en la cantidad y actividad de enzimas producidas por los hongos (Elisashvili et al., 2008; Manubens et al., 2003; Reddy et al., 2003; Moredo et al., 2003). Este aumento en los porcentajes en los compuestos presentes en los AE de los tratamientos, podría ser explicado por la capacidad que tienen los hongos de poder sintetizar de novo compuestos a partir de precursores presentes en el sustrato tal como se ha comprobado para Pycnoporus cinnabarinus, Rhizopus oryzae, Bjerkandera adusta (Lesage‐Meessen et al., 1999; Thibault et al., 1998; Bramorski et al., 1998; Lapadatescu et al., 2000). Por último, Breheret et al. (1997) identificaron en los cuerpos de fructificación de varias especies de hongos cosechados de la naturaleza, la presencia del 1,8‐cineol (Amanita rubescens, Boletus erythoropus, Gomphidius glutinosus y Paxillus involutus) y de hidrato de sabineno (Amanita ovoidea) entre otros monoterpenos. Esto le llevó a sugerir a Breheret et al. (1997) y Guendes del Pinho et al. (2008) que estos terpenos producidos por el hongo y dada su presencia específica, podrían ser utilizados en quimiotaxonomía. Esta observación se contrapone con los resultados de Kahlos et al. (1994), quienes estudiaron los compuestos volátiles de cuerpos de fructificación y de cultivos celulares de Gloeophyllum odoratum en medio con extracto de malta o cultivo líquido, utilizando quitosan, quitina o D‐(+)‐glucosamina como estimulantes (elicitor) y observaron cambios en la composición del aroma por el desarrollo del hongo en diferentes sustratos. Contrariamente, en la Fig. 36 B, se muestra que algunos compuestos disminuyeron su concentración, entre los que se destacan, el alcanfor, globulol y alfa cardinol (p<0,05). Se ha demostrado que en cultivos celulares de Eucalyptus perriniana, el alcanfor puede sufrir glicosidaciones por oxidación. En nuestros resultados no fue posible la P á g i n a | 152 determinación de estos productos por el método de extracción de los AE utilizado (Orihara et al., 1994). Por otra parte, el p‐cimeno, metil nerolato y longifoleno mostraron una disminución significativamente mayor en las muestras de P. tenuiculus (incubación y fructificación) con respecto a los presentes en P. ostreatus. La situación inversa la observamos para la pinocarvona y cis pinorcaveol. El 4‐terpineol mostró una mayor disminución en las muestras de P. ostreatus en la etapa de fructificación (p<0,05). En el caso del alfa terpineol, gama gurjeno y viridifloreno no mostraron diferencias significativas. La disminución de los porcentajes de los terpenos en los sustratos durante el cultivo puede ser explicado no sólo por su posible conversión metabólica, sino también debido a la adsorción en (o absorción dentro) del micelio, esto fue comprobado en cultivos de Chaetomium globosum en presencia de valenceno (Kaspera et al., 2005). Donde, un oxígeno (átomo polar) se fija a una molécula altamente lipofílica que es luego transportada a través de la pared celular por un sistema de transporte activo. Esto es un mecanismo de detoxificación bien conocido (o respuesta inmediata al estrés químico), y éste mecanismo está citado como una estrategia en la detoxificación de terpenos utilizado por bacterias y hongos (Onken & Berger, 1999). Además, una fracción de esos terpenos podrían ingresar al metabolismo primario y servir como fuente de carbono y energía (Kaspera et al., 2005). Este comportamiento también fue observado para otras especies de hongos (MacRae et al., 1979; Lanza et al., 1976). Es posible proponer que la disminución en los porcentajes de estos compuestos en los AE de los tratamientos sea debido a que sufrieron una biotransformación con baja producción de metabolitos y no se haya podido demostrar mediante la técnica empleada. Además, es posible que los productos formados hayan sido citotóxicos, provocando daño celular y la biotransformación no prosiguió (Kaspera et al., 2005). La mayoría de los compuestos que disminuyeron su concentración son mono y sesquitepenos oxigenados. Debido a que proceso de destilación llevado a cabo por la industria no tiene un 100% de recuperación de los AE, ya que la técnica de arrastre por vapor de agua no es capaz de extraerlos completamente, quedan residuos de AE atrapados en los tejidos de las plantas aromáticas (Tabla 35). Es interesante sugerir que el empleo de estos desechos P á g i n a | 153 para el cultivo de hongos comestibles mediante la FES puede ser empleado no sólo para producir un alimento (hongos comestibles), sino para obtener nuevos compuestos de aroma y el incremento en el porcentaje de otros presentes en el sustrato (1,8‐cineol, hidrato de sabineno, drimenol y verbenona), con potencial aplicación en la industria de los alimentos y farmacéutica. Nuestros resultados son alentadores y permitiría sugerir trabajar en la optimización de la biotransformación en medio sólido y en el estudio del sistema enzimático involucrado en la bioconversión del 1,8‐cineol. Sería posible lograr una buena producción de los compuestos biotransformados por estas dos especies de hongos a partir de desechos de la industria de los AE, así como también el empleo de residuos generados por la industria forestal y mejorar los rendimientos mediante la adición de suplementos nutricionales, tal como fue estudiado para Ceratocystis fimbriata. A pesar que los terpenos son producidos por estas plantas aromáticas como un mecanismo de defensa química contra microorganismos fitopatógenos (Müller‐Riebau et al., 1995), nuestro sistema de cultivo tuvo buenos resultados tanto en lo referente a la producción de hongos como en la recuperación y obtención de nuevos compuestos con potencial uso en la industria (Vazquez et al., 2001). 3.2.1.1. Análisis de componentes principales Se realizó un análisis de componentes principales (ACP) de los porcentajes relativos de los compuestos determinados por CG‐EM, para determinar los terpenos que caracterizan las muestras de AE de los tratamientos y del sustrato control. El ACP es un método que no requiere de ningún conocimiento de los datos, y que reduce la dimensionalidad de los datos multivariados mientras preserva la varianza entre ellos. Los resultados obtenidos de los dos primeros componentes del ACP, explicaron el 64 % del total de la variabilidad de las muestras de los tratamientos y el control 1. La dispersión de los puntos indicó que el eje de mayor variabilidad permite separar las especies, y no se observó el efecto producido por las distintas etapas de cultivo (Fig. 37). P á g i n a | 154 6,50
CP 2:31,5
4,08
1,65
-0,78
-3,21
-2,98
-0,10
2,78
5,66
8,54
CP 1: 32,7
Control
P. ostreatus
P. tenuiculus
Fig. 37. Diagrama de componentes principales de los compuestos volátiles (variables) obtenidos en los AE de de P. tenuiculus y P. ostreatus (incubación y fructificación) y del control 1. Los 2 componentes principales explican el 64 % del total de la varianza. Se muestra la proyección del efecto de las especies en dos componentes principales (CP1 y CP2), los cuales explicaron el 64% del total de la varianza. El CP1 explicó el 32,7% de la variación y el CP2, explicó el 31,5% de la variación. El CP1 permitió separar a las muestras de las especies de hongos entre sí y a éstas del control 1. Las variables que más aportaron al CP1 fueron principalmente el alcanfor, pinocarvona, cis pinovarveol, carveol trans, piperitona, alfa terpenil acetato y eugenol. El análisis de correlación de Pearson para el CP1 indicó una correlación positiva para el alcanfor (r=0,89), pinocarvona (r=0,83), cis pinovarveol (r=0,81), carveol trans (r=0,76), piperitona (r=0,76), eugenol (r=0,76) y una correlación negativa para el alfa terpenil acetato (r=‐0,74), entre los más destacados (Tabla 36). El CP2, también nos permitió separar las muestras de las especies de hongos entre sí y a éstas del control. Las variables que más aportaron al CP2 fueron: p‐cimeno, alfa terpineol, metil nerolato, longifoleno, globulol y alfa cardinol. El análisis de correlación de Pearson para el CP2 indicó una correlación positiva para el p‐cimeno (r=0,91), P á g i n a | 155 globulol (r=0,78), metil nerolato (r=0,88), longifoleno (r=0,84) y alfa cardineol (r=0,76) y una correlación negativa para el alfa terpineol (r=‐0,74), entre otras (Tabla 36). Tabla 36. Coeficientes de correlación de Pearson entre los compuestos volátiles para los dos componentes principales. Coeficiente de correlación significativos*
Compuestos volátiles CP1 CP2 alcanfor 0,89
‐
pinocarvona 0,83 ‐ cis pinocarveol 0,81 ‐ trans carveol 0,76
‐
piperitona 0,76
‐
eugenol 0,76 ‐ alfa terpenil acetato ‐0,74 ‐ 1,8‐cineol ‐0,65
‐0,62
hidrato de sabino
‐0,69
‐
4‐terpineol 0,61 ‐ drimenol ‐0,64 ‐ p‐cimeno ‐
0,91
globulol ‐
0,78
metil nerolato ‐ 0,88 longifoleno ‐ 0,84 oxido de cis linalol
‐
0,66
alfa terpineol
‐
‐0,74
alfa cardineol ‐ 0,76 * Coeficientes de correlación de Pearson significativos: valor p< 0.05 en la prueba de hipótesis. 3.2.2. Biotransformación de terpenos utilizando como sustrato de cultivo Origanum x applii
Se analizaron las diferentes muestras de AE de los bloques de sustrato de O. x applii sin inocular (control 1), los tratamientos: P. tenuiculus o P. ostreatus en dos etapas del ciclo: incubación y fructificación. También se analizaron los volátiles presentes en el inóculo formado por semillas de trigo y micelio de cada especie (control 2) para descartar posibles compuestos aportados por el hongo al medio. Cuando se compararon los cromatogramas de los AE de los tratamientos, control 1 y 2, no fue posible identificar nuevos compuestos. Posteriormente, se realizó la determinación de volátiles de las muestras de AE extraídos con cloruro de metileno de los tratamientos y del sustrato control 1 por CG‐
EM (Tabla 37). P á g i n a | 156 Tabla 37. Porcentajes relativos de volátiles identificados en los AE de los sustratos inoculados con P. tenuiculus y P. ostreatus (etapa de incubación y fructificación) y del sustrato control O. x applii (control). Compuestos volátiles alfa pineno
Sabineno beta mirceno alfa terpineno p‐cimeno Limoneno delta 3‐careno beta E ocimeno gama terpineno cis hidrato de sabineno hidrato de sabineno Borneol 4‐terpineol alfa terpineol metil eter de timol metil eter de carvacrol Timol Carvacrol acetato de terpin‐4‐ol beta bourboneno beta cariofileno alfa humuleno gama muuroleno biciclogermacreno delta cadineno espatulenol oxido de cariofileno RI a 939
975
991
1017
1025
1029
1032
1050
1060
1070
1098
1169
1177
1189
1235
1245
1290
1299
1233
1388
1419
1455
1480
1500
1523
1578
1583
P. ostreatus
incubación 2,85
3,9 0,01 0,01
27,41
21,82 0,71 0,59
2,84
0,58 10,32 3,39
2,51
3,25 0 0
4,6
0,98 2,69 0,36
0
0,01 4,4 0,04
0,01
0,13 0,13 Porcentaje relativo(%) b P. tenuiculus
P. ostreatus
incubación fructificación 0,01
2,49
0,31 2,69 0,01 0,01 8,39
0,01
16,19
27,97
0,89 21,9 0,01 1,83 0,01
0,44
1,3
0,97
0,01 0,24 0,29 12,79 0,01
4,65
3,69
2,98
5,52 2,49 0 0 0
0
46,85
1,68
7,51 1,68 0,29 1,72 0,01
0
0,01
0
0,01 0,01 0,31 5,33 0,21
0,1
0,01
0,01
0,18 0,04 0,22 0,04 P. tenuiculus O. x applii
fructificación control 0,01 0,76
0,01 3,27 0,01 1,73 1,42 2,35
1,86 5,13
1,88 2 0,21 0,32 0,01 0,74
0,01 3,4
0,01 3,14 0,01 19,75 0,01 0,38
4,25 5,32
8,41 3,67 0 0,79 0 3,09
51,31 19,96
22,95 1 0,01 0,63 0,01 0,46
0,01 3,71
0,01 0,31 0,65 3,92 0,57 1,46
0,01 0,45
0,13 0,48 0,1 0,58 a Índice de retención.bPorcentaje relativo de los volátiles identificados en base al área del pico cromatográfico CG/EM. nd: no detectado. Traza: tr < 0,01%. Se identificaron 27 compuestos volátiles correspondientes a la fracción de terpenos, incluyendo 9 monoterpenos oxigenados, 10 monoterpenos hidrocarburos, 2 sesquiterpenos oxigenados y 6 sesquiterpenos hidrocarburos. En la Tabla 37 se muestran los promedios de sus porcentajes relativos, calculados como porcentaje del área del pico cromatográfico del CG. Las determinaciones realizadas por CG‐EM de los AE de los tratamientos y el control 1, permitieron confirmar que no se identificaron productos de biotransformación del principal componente de este sustrato, el timol. A diferencia de lo informado para las muestras de AE de los tratamientos empleando E. cinerea donde se obtuvieron tres nuevos compuestos derivados del 1,8‐cineol. Estos resultados fueron confirmados mediante los experimentos llevados a cabo en medio de cultivo líquido inoculados con P. tenuiculus o P. ostreatus en presencia de timol. Los extractos obtenidos con cloruro de metileno del medio de cultivo de ambas especies, luego de 12 días de cultivo fueron P á g i n a | 157 analizados por CG/EM y revelaron ausencia de productos de biotransformación del timol. Shimoda et al. (2006) informaron que en cultivos de células de Eucalyptus perriniana en presencia de timol o carvacrol, no fue posible obtener productos de su biotransformación, sin embargo observaron que estos compuestos sufrieron glicosidaciones. En nuestro caso, no pudimos determinar productos glicosidados ya que la técnica empleada para extraer los AE por arrastre de vapor agua rompe las uniones glicosídicas. Como se observa en la Fig. 38 A, los porcentajes relativos de algunos compuestos presentes en las muestras de AE de los tratamientos tuvieron un incremento significativamente mayor con respecto a los presentes en el control 1. El porcentaje relativo del alfa terpineol y carvacrol fue significativamente mayor en P. tenuiculus en la etapa de fructificación (p<0,05). En el caso del aumento observado en el primero, varios autores indicaron que es un producto derivado de la bioconversión del limoneno (Mariёt et al., 1999; Tan & Day, 1998; Cadwallader et al., 2006). Esta teoría se podría sugerir para P. tenuiculus ya que muestra una disminución del porcentaje relativo del limoneno, no así en P. ostreatus; esto evidenciaría que todas las especies no tienen la misma capacidad de producir bioconversiones. Además, existen otras vías metabólicas que derivarían en un incremento del porcentaje del alfa terpineol. Yoo et al. (2001) informaron que cepas de Pseudomonas sp son capaces de bioconvertir el alfa pineno en alfa terpineol. El timol aumentó significativamente sólo en las muestras de ambas especies en la etapa de fructificación (p<0,05). Contrariamente el p‐cimeno incrementó su porcentaje principalmente en la etapa de incubación (p<0,05). Mientras que el limoneno, gama muuroleno y borneol incrementaron significativamente su porcentaje sólo en P. ostraetus (incubación y fructificación; p<0,05). Tal como sucedió en los AE de los tratamientos con E. cinerea, el incremento en las cantidades relativas de algunos compuestos, todos ellos monoterpenos hidrocarburos y oxigenados, podrían ser debido a que estas especies estén utilizando su maquinaria enzimática para liberar estos compuestos del material vegetal (Dudai et al., 2001; Weinberg et al., 1999). Por otro lado, como se mencionó anteriormente, este incremento podría ser explicado por la capacidad que tienen los hongos de poder P á g i n a | 158 sintetizar de novo compuestos a partir de precursores presentes en el sustrato tal como se ha comprobado para Pycnoporus cinnabarinus, Rhizopus oryzae, Bjerkandera adusta (Thibault et al., 1998; Bramorski et al., 1998; Lapadatescu et al., 2000; Lesage‐
Meessen et al., 1999). A)
35
Cambios en el porcentaje relativo
30
25
20
15
P. ostreatus incubación
10
P. tenuiculus incubación
5
P. ostreatus fructificación
0
P. tenuiculus fructificación
‐5
‐10
‐15
‐20
B)
10
Cambios en el porcentaje relativo
5
0
P. ostreatus incubación
P. tenuiculus incubación
‐5
P. ostreatus fructificación
P. tenuiculus fructificación
‐10
‐15
‐20
Fig. 38. Porcentajes relativos de los compuestos volátiles obtenidos en las muestras de AE de P. ostreatus y P. tenuiculus en las diferentes etapas de cultivo empleando O. x applii. A) Incremento del porcentaje con respecto al control; B) Disminución del porcentaje con respecto al control. P á g i n a | 159 Por el contrario, en la Fig. 38 B, se muestra que la gran mayoría de los compuestos disminuyeron su concentración, entre los que se destacan, el beta mirceno, hidrato de cis sabino, metil éter de timol, metil éter de carvacrol, beta cariofileno, biciclogermandreno, delta cardineno (p<0,05). Los porcentajes del el alfa pineno, sabineno, delta 3‐careno, hidrato de trans sabineno fueron significativamente menores en P. tenuiculus (p<0,05). Por el contrario en P ostreatus disminuyeron significativamente el alfa terpineno y el 4‐terpineol (p<0,05). Algunos compuestos mostraron mayor disminución de su porcentaje en las muestras de AE obtenidas con P. tenuiculus o P. ostraetus en ambas etapas del ciclo de cultivo. Este hecho podría estar vinculado a la actividad de las enzimas de cada especie. En el caso del timol, sólo las muestras de P. ostreatus mostraron un gran decrecimiento en los valores de su porcentaje relativo en ambas etapas del ciclo de cultivo, este hecho puede estar vinculado con el uso como fuente de carbono o en algún otro proceso que no pudo ser demostrado por la metodología que se empleó (Shimoda et al., 2006). 3.2.2.1. Análisis de componentes principales Se realizó un análisis de componentes principales (ACP) de los porcentajes relativos de los compuestos determinados por CG‐EM, para determinar los terpenos que caracterizan las muestras de AE de los tratamientos y del sustrato control. Los resultados obtenidos de los dos primeros componentes del ACP, explicaron el 84,5 % del total de la variabilidad de las muestras de los tratamientos y el control 1. La dispersión de los puntos indicó que el eje de mayor variabilidad permite separar las especies, y no se observó el efecto producido por las distintas etapas de cultivo (Fig. 39). Se muestra la proyección del efecto de las especies en dos componentes principales (CP1 y CP2), los cuales explicaron el 84,5% del total de la varianza. El CP1 explicó el 47% de la variación, mientras que el CP2, el 37,5% de la variación. El CP1 permitió separar a las muestras de las especies de hongos de las muestras del control 1. Las variables que más aportaron al CP1 fueron principalmente: beta mirceno, hidrato de cis sabino, metil éter de timol, carvacrol metil éter, beta cariofileno, alfa humuleno, biciclogermacreno, delta cadineno, espatulenol y óxido de P á g i n a | 160 cariofileno. El análisis de correlación de Pearson para el CP1 indicó una correlación positiva para el beta mirceno (r=0,99), hidrato de cis sabino (r=0,94), metil éter de timol (r=0,99), metil éter de carvacrol (r=0,99), beta cariofileno (r=0,99), alfa humuleno (r=0,86), biciclogermacreno (r=0,99), delta cadineno (r=0,99), espatulenol (r=0,91) y óxido de cariofileno (r=0,96), entre los más destacados (Tabla 38). 13,00
CP 2 (37,5%)
6,50
0,00
-6,50
-13,00
-13,00
-6,50
0,00
6,50
13,00
CP 1 (47,0%)
Con trol
P. o straetus
P. ten uiculus
Fig. 39. Diagrama de componentes principales de los compuestos volátiles (variables) obtenidos en los AE de P. tenuiculus y P. ostreatus (incubación y fructificación) y del control 1. Los 2 componentes principales explican el 84,5 % del total de la varianza. El CP2, separa a las muestras de las especies de hongos entre sí y a éstas del control 1. Las variables que más aportaron al CP2 fueron el alfa pineno, sabineno, p‐cimeno, hidrato de trans sabineno, borneol, alfa terpineol, timol, carvacrol, acetato de terpin‐4‐
ol y gama muuroleno. El análisis de correlación de Pearson para el CP1 indicó una correlación positiva para el alfa pineno (r=0,96), sabineno (r=0,94), p‐cimeno (r=0,95), trans hidrato de sabineno (r=0,82), borneol (r=0,90), acetato de terpin‐4‐ol (r=0,74) y gama muuroleno(r=0,89) y una correlación negativa para el alfa terpineol (r=‐0,91), timol (r=‐0,96), carvacrol (r=‐0,87) entre los más destacados (Tabla 38). P á g i n a | 161 Tabla 38. Coeficientes de correlación de Pearson entre los compuestos volátiles para los dos componentes principales. Coeficiente de correlación significativos* Compuestos volátiles CP1 CP2 beta mirceno 0,99
‐
alfa terpineno 0,68 ‐0,66 cis hidrato de sabineno 0,94 ‐ metil éter de carvacrol
0,99
‐
4‐terpineol 0,63
‐0,68
metil éter de timol 0,99 ‐ beta cariofileno 0,99 ‐ alfa humuleno 0,86
‐
biciclogermacreno 0,99
‐
delta cadineno 0,99 ‐ espatulol 0,91 ‐ oxido de cariofileno 0,96
‐
gama muuroleno ‐
0,89
acetato de tepin‐4‐ol ‐ 0,74 carvacrol ‐ ‐0,87 timol ‐
‐0,96
alfa pineno ‐
0,96
alfa terpineol ‐ ‐0,91 borneol ‐ 0,90 trans hidrato de sabineno
‐
0,82
limoneno ‐
0,92
p‐cimeno ‐ 0,95 sabineno ‐ 0,94 * Coeficientes de correlación de Pearson significativos: valor p< 0,05 en la prueba de hipótesis. 3.2.3. Biotransformación de terpenos utilizando como sustrato de cultivo Origanum vulgare Se analizaron las diferentes muestras de AE de los bloques de sustrato de O. vulgare sin inocular (control 1) y los tratamientos: P. tenuiculus o P. ostreatus en dos etapas del ciclo: incubación y fructificación. También se analizaron los volátiles presentes en el inóculo formado por semillas de trigo y micelio de cada especie (control 2) para descartar posibles compuestos aportados por el hongo al medio. Cuando se compararon los cromatogramas de los AE de los tratamientos, control 1 y 2, no fue posible identificar nuevos compuestos. Posteriormente, se realizó la determinación de volátiles de las muestras de AE extraídos con cloruro de metileno de los tratamientos y del sustrato control 1 por CG‐
EM (Tabla 39). Se identificaron 15 compuestos volátiles correspondientes a la fracción de terpenos, incluyendo 5 monoterpenos oxigenados, 9 monoterpenos hidrocarburos y 1 sesquiterpenos hidrocarburos. En la Tabla 39 se muestran los promedios de sus porcentajes relativos, calculados como porcentaje del área del pico cromatográfico del CG. P á g i n a | 162 Tabla 39. Porcentajes relativos de volátiles identificados en los AE de los sustratos inoculados con P. tenuiculus y P. ostreatus (etapa de incubación y fructificación) y del sustrato control O. vulgare (control). Porcentaje relativo (%) b P. ostreatus P. tenuiculus
P. ostreatus
P. tenuiculus O. vulgare
Compuestos volátiles RI a incubación incubación fructificación fructificación control sabineno 975
0,35
0,3
0,33
0,24 0,57 beta pineno 979 1,35 1,08 2,45 1,26 2,24 beta mirceno 991 0,87 0,99 1,06 1,11 1,85 alfa terpineno 1017
0
0
0
0 0,97 p‐cimene 1025
5,46
8,05
5,8
7,22 8,04 limoneno 1029 9,85 4,21 6,19 4,05 3,03 1,8‐cineole 1031 0 0 0 0 0,28 gama terpineno 1060
1,2
2,41
1,05
2,89 2 hidrato de cis sabineno 1070
0,17
0,22
0,17
0,24 0,38 terpinoleno 1089 0,53 0,32 0,57 0,32 0,61 hidrato de trans sabineno 1098 0,15 0,16 0,12 0,14 0,16 4‐terpineol 1177
0
0
0
0 0,55 alfa terpineol 1189
0
0
0
0 0,49 timol 1290 76,14 78,28 79,14 78,91 72,65 beta cariofileno 1419 0,38 0,18 0,62 0,36 1,99 a Índice de retención. b Porcentaje relativo de los volátiles identificados en base al área del pico cromatográfico GC/MS. nd: no detectado. Traza: tr < 0,01%. Cuando se compararon los cromatogramas de los AE de los tratamientos, control 1 y 2, no fue posible identificar nuevos compuestos. A continuación, se realizó la determinación de volátiles de las muestras de AE extraídos con diclorometano del sustrato control 1 y de los tratamientos por CG‐EM (Tabla 39). Se identificaron 15 compuestos volátiles correspondientes a la fracción de terpenos, incluyendo 9 monoterpenos hidrocarburos, 5 monoterpenos oxigenados, 1 sesquiterpenos hidrocarburos. En la Tabla 40 se muestran los promedios de sus porcentajes relativos, calculados como porcentaje del área del pico cromatográfico del CG. Las determinaciones realizadas por CG‐EM de los AE de los tratamientos y el control 1, permitieron confirmar que no se identificaron productos de biotransformación del principal componente de este sustrato, el timol. A diferencia de lo informado para las muestras de AE de los tratamientos empleando E. cinerea donde se obtuvieron tres nuevos compuestos derivados del 1,8‐cineol. Estos resultados fueron confirmados mediante los experimentos llevados a cabo en medio de cultivo líquido inoculados con P. tenuiculus o P. ostraetus en presencia de timol. Los extractos obtenidos con cloruro de metileno del medio de cultivo de ambas P á g i n a | 163 especies, luego de 12 días de cultivo fueron analizados por CG/EM y revelaron ausencia de productos de biotransformación del timol. Shimoda et al. (2006) informaron que en cultivos de células de Eucalyptus perriniana en presencia de timol o carvacrol, no fue posible obtener productos de su biotransformación, sin embargo observaron que estos compuestos sufrieron glicosidaciones como ya señalamos en el apartado 3.2.2 de este capítulo. En nuestro caso, no pudimos determinar productos glicosidados ya que la técnica empleada para extraer los AE por arrastre de vapor agua rompe las uniones glicosídicas. Como se puede observar en la Fig. 40, sólo el limoneno presente en las muestras de los AE de P. ostraetus incrementó significativamente su porcentaje con respecto al control 1. Esto permite sugerir que estos hongos pueden ser capaces, al igual que fue descripto para Weinberg et al. (1999) y Dudai et al. (2001), de poder utilizar su maquinaria enzimática para liberar los AE de los tejidos vegetales. Además, como se ha mencionado para otros terpenos, este incremento podría estar vinculado con una bioconversión de otros compuestos presentes en el sustrato o bien que esta especie pueda realizar una síntesis de novo a partir de precursores presentes en el sustrato, tal como fue mencionado para el caso de E. cinerea y O x applii (Lesage‐Meessen et al., 1999). Contrariamente a lo ocurrido con E. cinerea y O. x applii, la gran mayoría de los compuestos disminuyeron su concentración en los AE de los tratamientos, entre los que se destacan, el sabineno, beta pineno, alfa terpineno y beta cariofileno (Fig. 40). Este hecho podría vincularse con el uso de estos compuestos como fuente de carbono o en algún otro proceso metabólico que no pudo ser demostrado por la metodología que se empleó. P á g i n a | 164 7
6
Cambios en el porcentaje relativo
5
4
3
P. ostreatus incubación
P. tenuiculus incubación
2
1
P. ostreatus fructificación
P. tenuiculus fructificación
0
‐1
‐2
‐3
Fig. 40. Porcentajes relativos de los compuestos volátiles obtenidos en las muestras de AE de P. ostreatus y P. tenuiculus en las diferentes etapas de cultivo empleando O. vulgare. 3.1.3.1. Análisis de componentes principales Se realizó un análisis de componentes principales (ACP) de los porcentajes relativos de los compuestos determinados por CG‐EM, para determinar los terpenos que caracterizan las muestras de AE de los tratamientos y del sustrato control. Los resultados obtenidos de los dos primeros componentes del ACP, explicaron el 60,6 % del total de la variabilidad de las muestras de los tratamientos y el control 1. La dispersión de los puntos indicó que el eje de mayor variabilidad permite separar las especies, y no se observó el efecto producido por las distintas etapas de cultivo (Fig. 41). La Fig. 41 muestra la proyección del efecto de las especies en dos componentes principales (CP1 y CP2), los cuales explicaron el 60,6% del total de la varianza. El CP1 explicó el 32,7% de la variación, mientras que el CP2, el 27,9% de la variación. P á g i n a | 165 9,00
CP 2 (17,0%)
4,50
0,00
-4,50
-9,00
-9,00
-4,50
0,00
4,50
9,00
CP 1 (42,6%)
Control
P. ostraetus
P. tenuiculus
Fig. 41. Diagrama de componentes principales de los compuestos volátiles (variables) obtenidos en los AE de P. tenuiculus y P. ostreatus (incubación y fructificación). Los 2 componentes principales explican el 60,6 % del total de la varianza. Sólo el CP1 permitió separar a las muestras de los AE de los tratamientos de las del control 1. Las variables que más aportaron al CP1 fueron principalmente: sabineno, beta pineno, alfa terpineno y beta cariofileno. El análisis de correlación de Pearson para el CP1 indicó una correlación positiva para el sabineno (r=0,92), alfa terpineno (r= 0,87) y beta cariofileno (r= 0,87), entre las más destacadas (Tabla 40). Contrariamente, el CP2 no permitió separar las muestras de los tratamientos de las del control 1. Tabla 40. Coeficientes de correlación de Pearson entre los compuestos volátiles para los dos componentes principales. Coeficiente de correlación significativos* Compuestos volátiles
CP1
sabineno 0,92
beta pineno 0,54
beta mirceno 0,59 alfa terpineno 0,87 1,8cineol 0,69
4‐terpineol 0,64
alfa terpineol 0,71 beta cariofileno 0,87 * Coeficientes de correlación de Pearson significativos: valor p< 0,05 en la prueba de hipótesis. P á g i n a | 166 4. CONCLUSIONES 1‐ Fue posible observar que los componentes lignocelulósicos de los sustratos disminuyeron considerablemente durante las diferentes etapas del ciclo de cultivo. 2‐ Se comprobó que el porcentaje de pérdida de materia seca de los bloques de aserrín se correlaciona con el incremento observado en la EB de cada sustrato, indicando mayor eficiencia de bioconversión en los sustratos suplementados. 3‐ P. tenuiculus demostró tener una gran capacidad para degradar el aserrín de sauce, causando una disminución del 67,2 al 74,5 % en el contenido de celulosa, del 80,4 al 85,7 % en el contenido de hemicelulosa y del 60,6 al 66,2 % en el contenido de lignina en los tres sustratos ensayados (AS, AS1 y AS2) al final del ciclo de cultivo (5 meses), siendo esta disminución más evidente en los sustratos suplementados. 4‐ Fue posible la recuperación de terpenos presentes en los AE de los bloques de sustratos inoculados con P. tenuiculus y P. ostreatus confeccionados con desechos de plantas aromáticas provenientes de la industria. 5‐ Ambas especies de hongos cultivadas en E. cinerea fueron capaces de producir tres compuestos productos de la biotransformación del 1,8‐cineol. 6‐ Las determinaciones realizadas por CG‐EM de los AE de los tratamientos permitieron identificar dos de los tres compuestos biotransformados provenientes del 1,8‐cineol: el 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ol y el 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ona. P á g i n a | 167 7‐ El uso como sustrato de O. x applii y O. vulgare para el cultivo de P. tenuiculus y P. ostreatus., no permitió la obtención de nuevos compuestos productos de la biotransformación fúngica. P á g i n a | 168 CAPITULO V Ensayo preliminar para el uso de P. tenuiculus como bioadsobente de metales pesados P á g i n a | 169 1. OBJETIVOS Considerando que: • Los efluentes originados por las industrias constituyen un serio problema que afectan el medio ambiente e implican un riesgo para la salud humana. • Dentro de los contaminantes industriales, los metales pesados, no son degradados por medios naturales y se acumulan en el suelo, el agua, sedimentos, y pueden ser incorporados por los organismos vivos. • Es necesaria la aplicación de tecnologías limpias para su tratamiento y de esta manera contribuir al cuidado del planeta. • Los metales pesados pueden ser removidos del medio acuosos utilizando material biológico, de bajo costo tales como algas, hongos y bacteria. • La utilización de biadsorbentes presenta ventajas ya que reducen al mínimo los volúmenes de químicos empleados, presentan un bajo costo de conservación, transporte y manipuleo. • Al finalizar el proceso de biosorción, se pueden recuperar los metales pesados para su posterior reutilización, empleando soluciones ácidas o hidróxidos. se plantea para este capítulo el siguiente Objetivo General: Evaluar la eficiencia de la masa deshidratada del hongo Polyporus tenuiculus para la remoción de metales pesados divalentes. y el siguiente objetivo específico: 1‐ Evaluar la capacidad de sorción de Cu+2, Pb+2 y Cd+2 en solución acuosa. P á g i n a | 170 2. MATERIALES Y METODOS 2.1. Muestras utilizadas Se utilizaron cuerpos de fructificación de P. tenuiculus obtenidas en cultivo sobre aserrín de sauce, empleando las técnicas se expuso en el capítulo 1. Estas muestras fueron liofilizadas y pulverizadas y se almacenaron en ambiente anhidro a temperatura ambiente. 2.2. Sorción de metales en solución acuosa: cobre, plomo y cadmio Se prepararon las soluciones de los metales pesados (Cu, Pb y Cd) en una concentración de 10 mg l‐1, en agua Milli‐Q, a partir de sales de pureza 99.9 %: CuSO4, Pb (NO3)2, CdCl2 para cada metal. Se analizó la sorción de la biomasa deshidratada de P. tenuiculus para Cu+2, Pb+2, Cd+2 La masa seca de P. tenuiculus (0,200 g), fue suspendida en una solución de 100 ml, conteniendo 10 mg l‐1 de Cu+2, Pb+2 o Cd+2, y se agitó en una envase cerrado durante 1,5 h con agitador magnético a alta velocidad, a temperatura ambiente, con el fin de determinar cual es el tiempo óptimo de reacción. Al final del período de agitación, las muestras se filtraron al vacío usando una membrana Millipore de 0,45 µm. Para todas las muestras se analizó un blanco realizado en las mismas condiciones, suspendiendo la biomasa de hongo en agua Milli‐Q y determinándose en esta solución la presencia del metal a estudiar. El tiempo de agitación se optimizó para Cu+2 en las mismas condiciones y se agitó en un envase cerrado durante 1,5, 2, 2,5 y 22 h con agitador magnético a alta velocidad, a temperatura ambiente. Luego con el tiempo óptimo se evaluó la adsorción para Cu+2, Pb+2 o Cd+2. Se determinó la concentración inicial y final de cada metal en la solución acuosa y la biomasa por ICP‐EMISIÓN (Perkin‐ Elmer, Optima 2000 DV) mediante la técnica de ICP‐OES (Inductively Coupled Plasma‐Optical Emission Spectroscopy) estandarizadas (APHA, 1993). Las determinaciones fueron realizadas por duplicado con un error P á g i n a | 171 relativo < 1,0 %. Además se determinó el pH inicial y final utilizando un Universal indikator 0‐14 (Merck). Los parámetros utilizados en la determinación se muestran en la Tabla 35. Para la integración de los picos se utilizó el método MSF (Multicomponent Spectral Fitting). Las longitudes de onda utilizadas para la determinación se muestran en la Tabla 36. Para la calibración del equipo se utilizaron materiales de referencia con certificado de trazabilidad (Perkin Elmer). Tabla 35. Parámetros instrumentales ICP‐OES Potencia 1400 W
Flujo de Ar nebulizador
0,5 mL/min
Flujo de Ar de plasma
15 mL/min.
Flujo de Ar auxiliar
0,7 mL/min.
Caudal de nebulización
1,2 mL/min.
Tabla 36. Longitudes de onda usadas en ICP‐OES. Analito
Long. de onda (nm)
Na
589,592
Pb
220,353
Cd
226,502 y 228,801
Cu
324,752
P á g i n a | 172 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Adsorción de metales pesados utilizando biomasa deshidratada de P. tenuiculus Se estudió la capacidad de sorción de la biomasa no viva de P. tenuiculus para Cu+2, Pb+2, Cd+2. La cuantificación de los metales utilizando los parámetros establecidos, mostró en todos los casos que no hubo una variación del pH, siendo el pH inicial y el final de 5. Se analizaron distintos tiempos de reacción para Cu+2 (Tabla 37). Los resultados indican que cuando se emplean tiempos prolongados, no se observa mayor remoción sino un cierto grado de saturación. Esta tendencia en la unión de iones metálicos sugiere que la unión podría ser por interacciones con grupos funcionales localizados sobre la superficie del bioadsorbente. La rápida cinética observada tiene también una importancia práctica significativa ya que facilitaría llevar el proceso a escala de pequeños volúmenes en un reactor asegurando la eficacia y los costos. Los datos de valores de adsorción de iones de metales pesados por otros bioadsorbentes han mostrado un amplio rango de tiempos de adsorción. En Phanerochaete chrysosporum la tasa de adsorción de Hg+2 es rápida alcanzado la saturación en una 1 h (Wu & Yu, 2007). Pagnanelli et al. (2003) estudiaron la bioadsorción de Pb+2, Cu+2, Zn+2 y Cd+2, en sistema de un metal o multimetales utilizando biomasa de Sphaerotilus natans y el equilibrio de bioadsorción se alcanzó a los 30 min. de la reacción. P á g i n a | 173 Tabla 37. Porcentaje de remoción de Cu++ en solución de 10 ppm en función del tiempo Tiempo (horas) 1,5 h.
2h 2,5h 22 h % Cu+2 removido 32,3 26,5 16,6 10,2 Se realizó la cuantificación de los metales utilizando los parámetros que mostraron mejores resultados. Para ello se utilizaron soluciones de cada metal en una concentración de 10 ppm, con agitación durante 1 hora y media a 25 ºC, pH inicial 5; pH final 5 (Miresky et al., 2006). El pH de la solución tiene un rol importante en la reacción, ya que condiciona la eficiencia de la interacción entre el catión metálico y la superficie polar y/o cargada del absorbente (Bayramoğlu & Arıca, 2008). Los límites de detección para los metales son: Pb 0,012 mg/l; Cd 0,004 mg/l y el Cu 0,005 mg/l. El porcentaje de metal removido en las experiencias realizadas con soluciones de cada metal, muestran una capacidad de sorción para Cu+2 de 32,30 %, para Pb+2 de 74,10 % y para Cd+2 69,09% (Tabla 38). La biomasa de hongo libera al medio de reacción en el blanco pequeñas cantidades de Cu+2 no así de Cd+2 y Pb+2, aun así el promedio de remoción de este metal alcanza 15 % en distintas condiciones de concentración de metal. Los resultados demuestran una tendencia del Pb+2 de tener mayor capacidad como adsorbato. Dicha superioridad puede ser explicada en base al concepto de acidez de Lewis, definida como la relación masa: carga de determinado catión. Poseer una gran masa involucra tener un volumen adecuado que genera una separación eficiente de las cargas dentro del ión metálico, permitiendo una alta polaridad dentro del ión que minimiza las repulsiones electrón‐electrón entre adsorbente y adsorbato. En el caso de los cationes isovalentes, el ión de mayor peso atómico será mejor y más eficientemente adsorbido en comparación de los demás debido a su acidez, favoreciendo su interacción con el adsorbente (Pagnanelli et al., 2003; Mohapatra & Gupta, 2005). Según varios autores, la incorporación de metales por la biomasa fúngica (biosorción) pueden realizarse por varios procesos, entre ellos la adsorción, intercambio iónico o uniones covalente (Plaza et al., 1996). Los grupos polares de las proteínas, aminoácidos, lípidos y polisacáridos estructurales (quitina, quitosan o glucanos) P á g i n a | 174 pueden participar de la biosorción (Mar'in et al., 1997). La pared celular de la biomasa fúngica puede ser considerada como un mosaico de diferentes grupos funcionales donde se pueden formar complejos coordinados y/o el intercambio iónico con iones metálicos. Estos grupos funcionales pueden ser: carboxilo, fosfato, amida, tiol, y el hidróxido. Tabla 38. Porcentaje de remoción de metales en solución de 10 ppm c/u después de 1,5 h. Metales Blanco pH i Masa residual Cu Pb Cd 0.138 ±0.007
0.031±0.006
<0.002
5
5
5
6.77±0.030
2.59±0.030
2,84±0.040
% de absorción 32.30
74.10
69,09
Ref: LD (mg/l): Cd: 0.004; Pb: 0.012 y Cu: 0,005. LD: límite de detección. pH f 5 5 5 P á g i n a | 175 4. CONCLUSIONES 1. La biomasa deshidratada del hongo P. tenuiculus, puede ser empleada como biosorbente para la remoción de metales pesados de efluentes acuosos. 2. El Pb y el Cd fueron los más retenidos. P á g i n a | 176 CONCLUSIONES GENERALES P á g i n a | 177 1‐ Se determinaron las condiciones óptimas para el cultivo de Polyporus tenuiculus, siendo el primer reporte mundial sobre el cultivo de esta especie en residuos lignocelulósicos. 2‐ Los parámetros para su cultivo fueron 25 ºC, en oscuridad durante 60 días para la etapa de incubación y 20 ±2ºC, fotoperíodo de 9 h. luz/15h oscuridad, riego por aspersión para la etapa de fructificación. 3‐ El Aserrín de sauce suplementado fue el sustrato más adecuado para el cultivo de P. tenuiculus, siendo la fórmula óptima: aserrín de sauce (78%), harina de soja (15 %) y salvado de trigo (5%). 4‐ Fue posible el empleo de desechos provenientes de la industria de los aceites esenciales para el cultivo de hongos comestibles aunque se obtuvieron menores rendimientos. 5‐ Se demostró que es posible obtener fructificaciones de P. tenuiculus sobre troncos de álamo y eucalipto siendo necesario de 13 meses de incubación. 6‐ Nutricionalmente P. tenuiculus cultivado sobre residuos lignocelulósicos (PT, PTs, AS y AS1), aportó una importante cantidad de proteína y bajo contenido de grasa, además de contribuir con cenizas, fibras y carbohidratos; la adición de suplementos incrementó el porcentaje de cenizas y proteína y produjeron menor contenido de grasa, fibra y carbohidratos. 7‐ La composición de ácidos grasos de P. tenuiculus y P. ostreatus cultivados sobre sustratos provenientes de la industria de los AE y paja de trigo fue predominante en ácidos grasos insaturados. 8‐ El compuesto volátil mayoritario de los cuerpos de fructificación de P. tenuiculus. fue el 1‐octen‐3‐ol, luego le siguen en importancia, (Z,Z)‐9,12‐ácido P á g i n a | 178 octadecadienoico metil éster, (Z,Z)‐9,12‐ácido octadecadienoico, 3‐octanona, 3‐
octanol, ácido hexadecanoico, entre los más destacados. No se observaron diferencias apreciables entre los sustratos ensayados. 9‐ El análisis de la calidad sensorial de hongos deshidratados mostró que el uso de diferentes residuos agrícolas e industriales para el cultivo de P. tenuiculus y Pleurotus ostreatus afectaron algunas características sensoriales de las muestras. 10‐Las muestras de P. tenuiculus fueron reconocidas por su sabor a cereal, dureza, fibrosidad y gomosidad mientras que las de P. ostreatus lo fueron por su sabor a “hongo”, sensación picante y gusto ácido. 11‐El análisis sensorial de consumidores de las muestras frescas demostró que en general tuvieron aceptabilidad positiva, con resultados mayores a 5 y cercanos a la categoría 6 de la escala hedónica de 9 puntos y no varió con los sustratos empleados. 12‐Los atributos color, dureza y gomosidad de muestras frescas fueron diferentes entre las dos especies de hongos comestibles, siendo las muestras de P. tenuiculus las que presentaron menor intensidad de color y mayor dureza y gomosidad que las muestras de P. ostreatus. 13‐El atributo sabor fue diferente en las muestras frescas cosechadas a partir de los distintos sustratos siendo las cosechadas de eucalipto las que presentaron mayor intensidad. 14‐ El análisis sensorial de los consumidores de muestras frescas de P. tenuiuculus, P. ostreatus y Agaricus bisporus, demostró que A. bisporus fue la que tuvo mayor aceptabilidad y que P. tenuiculus presentó mayor intensidad en la dureza, gomosidad y sensación picante. P á g i n a | 179 15‐P. tenuiculus tuvo una gran capacidad para degradar el aserrín de sauce, causando una disminución del 67,2 al 74,5 % en el contenido de celulosa, del 80,4 al 85,7 % en el contenido de hemicelulosa y del 60,6 al 66,2 % en el contenido de lignina en los tres sustratos ensayados (AS, AS1 y AS2) al final del ciclo de cultivo, siendo más evidente en los sustratos suplementados. 16‐Fue posible la recuperación de terpenos presentes en los AE de los bloques de sustratos inoculados con P. tenuiculus y P. ostreatus confeccionados con desechos de plantas aromáticas provenientes de la industria. 17‐Ambas especies de hongos cultivadas en E. cinerea fueron capaces de producir tres compuestos productos de la biotransformación del 1,8‐cineol, de los cuales se identificaron por CG/EM dos de ellos: el 1,3,3‐trimetil‐2‐
oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ol y el 1,3,3‐trimetil‐2‐oxabiciclo[2.2.2]octan‐6‐ona. 18‐La biomasa deshidratada de P. tenuiculus, actuó como biosorbente para la remoción de metales pesados de efluentes acuosos, siendo más eficiente en la remoción de Pb y el Cd. P á g i n a | 180 PERSPECTIVAS FUTURAS P á g i n a | 181 A partir de esta Tesis se abren una seria de líneas de trabajo relevantes, algunas de las cuales se señalan a continuación: ‐ Ensayar otros suplementos que aumenten los rendimientos ‐ Estudiar la biodegradación de P. tenuiculus cultivados sobre paja de otros cereales y su potencial uso como alimento para ruminates. Con respecto a la composición de volátiles y biotransfromación: ‐ Dado que el análisis sensorial con el panel de jueces entrenados demostró diferencias entre el aroma de P. tenuiculus y P. ostreatus y entre las muestras de los distintos sustratos, sería interesante poder realizar una determinación de los compluestos volátiles por CG/EM. ‐ Determinación de la estructura química del compuesto no determinado producto de la biotransformación del 1,8‐cineol por medio de TLC y MNR. ‐ Optimización de la biotransformación en medio sólido y en el estudio del sistema enzimático involucrado en la bioconversión del 1,8‐cineol para lograr una buena producción de los compuestos biotransformados por estas dos especies de hongos a partir de desechos de la industria de los AE y mejorar los rendimientos mediante la adición de suplementos nutricionales. Dada la capacidad provada de P. tenuiculus como bioabsorvente sería interesante realizar otros ensayos tales como: ‐ Remoción simultánea de metales ‐ Remoción de otros metales tales como Ni+2, Cr+2 y Zn+2 ‐ Estudio de cinética en las soluciones multimetales probando distintos tiempos de reacción, con varias concentraciones inicial de los metales. P á g i n a | 182 BIBLIOGRAFÍA P á g i n a | 183 1. Abraham BG & Berger R. 1994. Higher fungi for generating aroma components through novel biotechnologies. J. Agric. Food Chem. 42: 2344‐2348. 2. Albertó, E. 2008. Cultivo Intensivo de los Hongos Comestibles. Hemisferio Sur. Buenos Aires. 265 pp. 3. Albertó E & Gasoni L. 2003. Perspectivas. Producción de hongos comestibles en la Argentina. Revista IDIA XXI 5: 70‐76. 4. Albertó E, Curvetto N, Deschamps J, González Matute R &Lechner B. 2008. Hongos Silvestres y de Cultivo en Argentina: Historia, regiones y sistemas de producción, hongos silvestres de valor económico, consumo, mercado interno y externo, legislación, oferta tecnológica e investigación y desarrollo. En Martínez Carrerra (Ed). Hacia un Desarrollo Sostenible del Sistema de Producción­Consumo de los Hongos Comestibles y Medicinales en Latinoamérica: Avances y Perspectivas en el Siglo XXI (ISBN 970‐9752‐01‐4). México, en prensa. 5. Alexandrino AM, Faria HG, Marques de Souza CG & Peralta RM. 2007. Aproveitamento do resíduo de laranja para a producão de enzimas lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack: Fr). Ciênc. Tecnol. Aliment. 27: 364‐368. 6. Alexopoulus CJ, Mims CW & Blackwell M. 1996. Introductory Mycology. 4 th edition. John Willy and Sons Inc., New York, pp. 860. 7. Aleu J & González Collado I. 2001. Biotransformations by Botrytis species. J. Mol. Catal. B: Enzym. 13: 77–93 8. APHA, 1993. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewaters. American Public Health Association, NW, Washington DC, 874 pp. 9. Assaf S, Hadar Y & Dosoretz CG. 1997. 1‐Octen‐3‐ol and 13‐hydroperoxylinoleate are products of distinct pathways in the oxidative breakdown of linoleic acid by Pleurotus pulmonarius. Enzyme Microb. Tech. 21: 484‐490. 10. Association of official Analytical Chemists (AOAC) 1990. 15th Ed. Virginia, USA 11. Azcón‐Bieto J & Taylor M. 2001. Fundamentos de fisiología vegetal. Mc Graw‐
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