UNIVERSIDAD DE COLIMA MAESTRIA EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGÍA EFECTO DEL ACEITE DE SARDINA SOBRE EL CONTENIDO DE COLESTEROL Y ÁCIDOS GRASOS ω-3 Y ω6 EN HUEVO DE GALLINA TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS, AREA BIOTECNOLOGÍA P R E S E N T A : ROSA MARIA CASTILLO DOMINGUEZ ASESORES: M.P.A. Silvia Carrillo Domínguez Dr. Fernando Pérez-Gil Romo COASESOR: Dr. Jaime Molina Ochoa Tecomán, Colima, Febrero de 2004 A Enrique, por acompañarme a recorrer este camino con confianza y respeto, gracias por todo tu amor y comprensión A mis hijas Olivia Elisa y Alma Lucía quienes me impulsan para seguir adelante, gracias por su ejemplo de tenacidad A Manuel y Margarita, mis adorados padres, sin su apoyo no hubiera logrado nada A Silvi por creer en mi, gracias por tus consejos Y sobre todo..... gracias a Dios por estar conmigo en todo momento AGRADECIMIENTOS Agradezco al Departamento de Nutrición Animal del Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutrición “Salvador Zubirán” por el apoyo brindado para la realización de este trabajo, así como al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca otorgada durante la realización de los estudios de maestría. Al Dr. Fernando Pérez-Gil, por la confianza que me ha brindado y por el apoyo otorgado durante mis estudios de maestría y la elaboración de esta tesis. A Silvia Carrillo Domínguez, por su apoyo incondicional, por su amistad, y sobre todo, por compartir sus conocimientos conmigo. A mis compañeros de trabajo, por los momentos que disfrutamos juntos y por su apoyo en las diferentes etapas del desarrollo de este trabajo. Al Dr. Ernesto Avila González por las facilidades otorgadas para el uso de las instalaciones del Centro de Enseñanza, Investigación y Producción Avícola (CEIEPA) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y a todas aquellas personas que contribuyeron en la etapa experimental del trabajo de tesis. Al Departamento de Ciencia y Tecnología de alimentos del INCMNSZ por facilitar las instalaciones para la realización de las pruebas de evaluación sensorial, especialmente a la Q.F.B. Lorena Cassis Nostas por sus sugerencias para la realización de dichas pruebas. Y a todas aquellas personas que de alguna u otra forma estuvieron conmigo y contribuyeron a la culminación de este trabajo. INDICE ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................. iii ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................. iv RESUMEN ............................................................................................................... v ABSTRACT............................................................................................................... vi 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1 HIPÓTESIS .......................................................................................................... 3 OBJETIVOS ......................................................................................................... 3 2. ANTECEDENTES ................................................................................................ 4 2.1Enfermedades cardiovasculares, problema de salud pública en México ........ 4 2.2 Ácidos grasos ................................................................................................. 5 2.3 Colesterol ....................................................................................................... 11 2.4 Valor nutritivo del huevo de gallina ................................................................ 12 2.5 Ensayos que se han hecho para modificar la composición de lípidos en el huevo de gallina ......................................................................................... 13 2.6 Metabolismo de los lípidos en las gallinas ponedoras ................................... 16 2.7 Aceite de pescado .......................................................................................... 17 3. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................... 19 3.1 Obtención del aceite de sardina ..................................................................... 19 3.2 Formulación y preparación de las dietas ....................................................... 19 3.3 Ensayo experimental ...................................................................................... 21 3.4.1 Variables de producción y calidad del huevo de gallina ........................ 21 3.4.2 Composición química del huevo de gallina ........................................... 22 i 3.4.3 Evaluación sensorial ............................................................................. 23 3.4 Análisis estadístico ......................................................................................... 24 4. RESULTADOS ..................................................................................................... 25 4.1 Composición en ácidos grasos de aceites y dietas ....................................... 25 4.2 Composición lipídica del huevo de gallina ...................................................... 27 4.3 Evaluación sensorial ...................................................................................... 31 4.4 Variables de producción ................................................................................. 32 4.5 Calidad del huevo .......................................................................................... 33 5. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 35 5.1 Lípidos totales y colesterol en el huevo de gallina .......................................... 35 5.2 Ácidos grasos en el huevo de gallina .............................................................. 36 5.3 Evaluación sensorial ...................................................................................... 39 5.4 Variables de producción ................................................................................. 42 5.5 Calidad del huevo .......................................................................................... 44 6. CONCLUSIONES ................................................................................................ 45 7. RECOMENDACIONES ......................................................................................... 46 8. LITERATURA CITADA ........................................................................................ 47 ANEXO 1. Diagrama de flujo ................................................................................... 58 ANEXO 2. Cuestionario para la evaluación sensorial .............................................. 59 ii ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Consumo recomendado de ácidos grasos para adultos con una ingesta diaria de 2,000 kcal .................................................................. 11 Cuadro 2. Composición de las dietas para gallinas ponedoras en donde se incluyeron diferentes porcentajes de aceite de sardina ......................... 20 Cuadro 3. Contenido de ácidos grasos del aceite vegetal mixto y del aceite de sardina usados en las dietas ............................................................. 25 Cuadro 4. Contenido de lípidos totales y ácidos grasos en las dietas suministradas a las gallinas ponedoras ................................................. 26 Cuadro 5. Contenido de lípidos totales y colesterol en el huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina ........................................... 27 Cuadro 6. Contenido de ácidos grasos en el huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina ................................................................. 28 Cuadro 7. Variables de producción de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina .................................................................................. 33 Cuadro 8. Calidad del huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina ................................................................................................. 34 iii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura de un triglicérido ...................................................................... 5 Figura 2. Estructura química de los ácidos grasos omega 3 ................................... 7 Figura 3. Metabolismo de los ácidos grasos esenciales, elongación y desaturación de los AGω3 y AGω6 ....................................................... 8 Figura 4. Total de ácidos grasos ω6 del huevo proveniente de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina............................................................. 30 Figura 5. Total de ácidos grasos ω3 del huevo proveniente de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina............................................................. 30 Figura 6. Proporción ω6/ω3 en el huevo proveniente de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina ..................................................................... 31 Figura 7. Preferencia por el color, olor y sabor del huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina............................................................. 32 iv RESÚMEN Los aceites de pescado son una fuente de ácidos grasos omega-3 (AGω3). El objetivo del estudio fue evaluar el efecto del aceite de sardina (AS), incluido en dietas para gallinas ponedoras a diferentes concentraciones, sobre el contenido de colesterol y AGω3 en el huevo, así como las variables productivas, calidad del huevo y el sabor del mismo. Se emplearon 144 gallinas Leghorn de 50 semanas de edad, distribuidas en 4 tratamientos: 0 %, 0.5 %, 1.5 % y 3 % de AS. Después de cinco semanas, se tomaron 12 huevos de cada tratamiento y se liofilizaron para su análisis. El contenido de lípidos totales, colesterol, variables productivas y calidad del huevo no presentaron diferencias significativas entre tratamientos (P>0.5). La concentración de AGω3 se incrementó 300 % en el tratamiento con 3 % de AS (P<0.5). La inclusión de AS en la dieta de las gallinas ponedoras, incrementa la deposición de AGω3 en el huevo, aunque al incluirlo en más de 1.5 %, afecta negativamente su sabor. Palabras clave: ácidos grasos ω3, aceite de sardina, huevo de gallina v ABSTRACT Fish oils are high in fatty acids ω3. The aim of this study was to evaluate the effect of the sardine oil (SO) on egg cholesterol, fatty acids ω3 (FAω3) deposition, productive variables, egg quality and egg flavor, when sardine oil is incorporated into laying hens ration to different concentrations.144 Leghorn hens of 50 weeks old were distributed in 4 treatments: 0 %, 0.5 %, 1.5 % and 3 % of sardine oil. After five weeks of experimentation 12 eggs from each treatment were taken and freeze-dried for analysis. Lipids and cholesterol content as well as productive variables and egg quality among treatments did not show significant differences (P>0.05). Fatty acid ω3 deposition increased up to 300 % with 3 % SO. Inclusion of sardine oil in hens ration produced an enhancement of yolk FA ω3 content, although egg flavor was negatively affected with 1.5 % and 3 % of fish oil. Key words: fatty acids, sardine oil, egg laying hens vi 1. INTRODUCCIÓN Según la Organización Mundial de la Salud, las enfermedades cardiovasculares son responsables del 31 % del total de muertes a nivel mundial; son la principal causa de mortandad en los países desarrollados y se está convirtiendo en un importante problema de salud pública en los países en desarrollo, llegando a ser la principal causa de muerte en México y en otros países como Argentina, Chile, Cuba y Uruguay, entre otros (World Health Statistics, 2000). Diversos estudios señalan que los ácidos grasos omega-3 (AGω3) desempeñan un papel importante en la prevención de enfermedades cardiovasculares como la hipertensión, arteriosclerosis e infarto al miocardio (Simopoulos, 1991); reducen el riesgo de padecer desórdenes inflamatorios y autoinmunes (Craig-Schmidt et al., 1987; Boundreau et al., 1991; Wander y Patton, 1991; García y Albalá, 1998) y artritis reumatoide (Holub, 1992). Asimismo son de gran importancia durante el desarrollo fetal humano y en el desarrollo del cerebro y tejido de la retina en los infantes recién nacidos (Connor et al., 1991; Sargent, 1997) y tienen la propiedad de reducir las concentraciones de colesterol en la sangre (Simopoulos, 1991). El pescado, particularmente especies grasosas como el salmón (Oncorhynchus spp.), el atún (Thunnus spp,) la macarela (Scomber spp.), el sábalo (Tarpon spp.), el Menhaden (Brevoortia spp.), la anchoveta (Engraulis mordax) y la sardina (Sardinops sp.), son una excelente fuente de AGω3, principalmente del ácido eicosapentaenóico (EPA) y del ácido docosahexaenóico (DHA) (Simopoulos, 1991). Desafortunadamente, el consumo de productos marinos en México, está por debajo de lo recomendado, que es de 2 a 3 porciones de 100g a la semana. Por el contrario, el consumo del huevo es elevado (20.6 Kg per cápita) (UNA, 2002). Por lo tanto, una buena alternativa para hacer llegar a la población los beneficios de éstos AGω3, es 1 suministrar a las gallinas ponedoras como parte de su dieta, productos ricos en estos componentes para incrementar la concentración de AGω3 en el huevo. Para tal efecto se han empleado diversos ingredientes. En los Estados Unidos, Canadá y en algunos países europeos se han obtenido excelentes resultados al incorporar la linaza (Jiang y Sim, 1993; Ferrier et al., 1995; Scheidler y Froning, 1996; Chae et al., 1998) y aceite de pescado (Hargis et al., 1991; Oh et al., 1991; Van Elswyk, 1997a; Meluzzi et al., 1997; Baucells et al., 2000; González-Esquerra y Lesson, 2000; Meluzzi et al., 2000; González-Esquerra y Lesson, 2001). En México son pocos los estudios que se han realizado al respecto, se ha utilizado harina de anchoveta, harina de cabezas de camarón y harina de langostilla (Carrillo et al., 1999), para aumentar el contenido de los AGω3 en el huevo de gallina, obteniéndose buenos resultados. Dado que los aceites marinos concentran en una mayor proporción a los AGω3, principalmente EPA y DHA, se consideró conveniente probar con aceites de pescado nacionales. En este caso se eligió el aceite de sardina (Sardinops sagax), ya que ésta es una de las especies de mayor importancia comercial pesquera en México (Morrisey y Robles, 1992). 2 HIPÓTESIS Conforme se aumente el nivel de inclusión de aceite de sardina en la dieta de gallinas ponedoras, disminuirán los niveles de lípidos y colesterol en el huevo y aumentará la concentración de los ácidos grasos omega-3 (AGω3) en el mismo. OBJETIVOS GENERAL Evaluar el efecto del aceite de sardina sobre la concentración de colesterol, lípidos totales y los ácidos grasos ω3 del huevo, al incluirlo en diferentes concentraciones en las dietas para gallinas ponedoras. PARTICULARES • Cuantificar en el huevo, la concentración de colesterol, lípidos totales y los ácidos grasos: Linoléico (LA C18:2 ω6), α-linolénico (ALA C18:3ω3), Araquidónico (AA C20:4ω6), Eicosapentaenóico (EPA C20:5ω3) y Docosahexaenóico (DHA 22:6ω3) en el huevo, al incluir aceite de sardina en diferentes concentraciones en la dieta de gallinas ponedoras. • Evaluar el efecto del aceite de sardina sobre el olor y sabor del huevo, al incluirlo en diferentes concentraciones en la dieta de gallinas ponedoras. • Evaluar el efecto del aceite de sardina sobre las variables de producción, al adicionarlo a diferentes concentraciones en la dieta de gallinas ponedoras. • Evaluar el efecto sobre aspectos físicos de la calidad del huevo, al incluir aceite de sardina a diferentes concentraciones en la dieta de gallinas ponedoras. 3 2. ANTECEDENTES 2.1 ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES, PROBLEMA DE SALUD PÚBLICA EN MÉXICO La incidencia de enfermedades cardiovasculares como la hipertensión, la arteriosclerosis, el infarto al miocardio, la angina de pecho, etc., ha ido en aumento en los últimos años. Según la Organización Mundial de la Salud, estas enfermedades ocasionan el 31 % de las muertes a nivel mundial, y son la principal causa de muerte en México y en otros países como Argentina, Chile, Cuba y Uruguay entre otros (World Health Statistics, 2000). Estudios epidemiológicos, han demostrado la relación existente entre niveles altos de colesterol en sangre y la incidencia de enfermedades cardiovasculares (Renaud y De Lorgeril, 1994; Serra-Majem et al., 1999; American Heart Association, 2001) Simopoulos (2000) atribuye este efecto al hecho de que la dieta en los humanos, ha ido cambiando, menciona que anteriormente, ésta era menos calórica, mas alta en fibra, rica en frutas y vegetales, carne magra y pescado; por lo tanto, era una dieta baja en grasas saturadas y contenía cantidades aproximadamente iguales de ácidos grasos omega-3 (AGω3) y omega-6 (AGω6) (proporción 1-2:1). En la actualidad, las dietas son bajas en fibra, altas en grasas saturadas incluyendo el colesterol y con una proporción AGω6:AGω3 de 10-25:1. Groscolas (1994) señala que la dieta de los esquimales se basa casi exclusivamente en el consumo de pescado, foca y ballena, con una ingesta diaria de 3,400 calorías generadas a partir de 377 g de proteína y cerca de 162 g de grasa, y a pesar de todo esto, no padecen arteriosclerosis ni sus cardiopatías asociadas. Esto lo atribuye a que una gran proporción de las grasas de la dieta son poliinsaturadas, especialmente ricas en ácido eicosapentaenóico (EPA), lo que los protege de dichos padecimientos. 4 2.2 ÁCIDOS GRASOS Los ácidos grasos constituyen la base de los lípidos. Los lípidos son uno de los tres componentes de la alimentación, junto con los carbohidratos y las proteínas y son la principal forma en que la energía es almacenada en nuestro organismo. Se le denomina “grasa” a todos los triglicéridos sólidos de origen animal y “aceite” a las grasas líquidas que normalmente son de origen vegetal. La manteca de cerdo y los cebos son ejemplo de grasas sólidas de origen animal, aunque hay excepciones a esta regla como la grasa de caballo que por ser líquida a temperatura ambiente se le considera como si fuese un aceite, lo mismo ocurre con el aceite de pescado (Pourie, 1985; Voet y Voet, 1992). 2.2.1 Estructura y clasificación Los aceites y grasas están formados por triglicéridos, compuestos que representan más del 95 % del peso de casi todas las grasas y aceites alimenticios. Un triglicérido está formado por la condensación de una molécula de glicerina con tres ácidos grasos (Figura 1); por lo que las características físicas y químicas de las grasas y aceites dependen principalmente del tipo y cantidad de los ácidos grasos que la componen y su distribución en los triglicéridos. H H H H– C –C– C– H OH OH OH glicerina H – OOC – R1 + H – OOC – R2 3HOH H – OOC – R3 ácidos grasos Agua Figura 1. Estructura de un triglicérido 1 1 Mahan y Arlin (1995) 5 H H – C − OOC – R1 H – C − OOC – R2 H – C − OOC – R3 H Triglicérido Los ácidos grasos son cadenas de hidrocarburos que terminan en un grupo carboxilo en un extremo y un grupo metilo en el otro. Están formados por cadenas de 4 a 30 átomos de carbono, que pueden ser totalmente saturados, parcialmente insaturados o poliinsaturados, de acuerdo al número de dobles ligaduras presentes. Se les puede clasificar de la siguiente manera (Mahan y Scott-Stump, 1998): Por la longitud de su cadena: 1) AG de cadena corta, compuestos de 4 a 6 átomos de carbono 2) AG de cadena media que contienen de 8 a 12 átomos de carbono y, 3) AG de cadena larga con 14 ó más átomos de carbono Por el grado de saturación: 1) Saturados. Cuando no tienen dobles ligaduras en la cadena carbonatada. 2) Monoinsaturados. Cuando existe una doble ligadura en la cadena. 3) Poliinsaturados. Cuando hay más de una doble ligadura en la cadena Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA’s) están formados por largas cadenas carbonatadas y se emplean notaciones cortas para expresarlos, indicando el número de carbonos, el número de enlaces y la posición en que se encuentra la primera doble ligadura. La letra griega omega (ω) es usada para indicar la localización de la primera doble ligadura a partir del carbón metílico (CH3) terminal de la molécula del ácido graso (Figura 2); van de ω-1 hasta ω-12. Las familias más importantes son los AGω3 y los AGω6 ya que sus ácidos grasos son considerados como esenciales en la dieta humana porque no se sintetizan en el cuerpo y tienen que ser suministrados a través de la dieta (Mahan y Scott-Stump, 1998). Dentro de los ácidos grasos omega-3 (AGω3) están el ácido α-linolénico (ALA C18:3), el ácido eicosapentaenóico (EPA 20:5) y el ácido docosahexaenóico (DHA 22:6) (Figura 2). El ácido linoléico (LA C18:2) y el ácido araquidónico (AA C20:4) pertenecen a los omega-6 (AGω6) (Mahan y Arlin (1995). 6 1 3 4 6 7 9 10 12 14 16 18 COOH CH3 2 5 8 11 13 15 17 Ácido linolénico (ALA C18:3 ω-3) 1 3 4 6 7 9 10 12 13 15 16 18 20 CH3 COOH 2 5 8 11 14 17 19 Ácido eicosapentaenóico (EPA C20:5 ω-3) 1 3 4 6 7 9 10 12 13 15 16 18 19 21 CH3 COOH 2 5 8 11 14 17 20 22 Ácido docosahexaenóico (DHA C22:6 ω-3) Figura 2. Estructura química de los ácidos grasos omega 3 (AGω3) 2 El ácido linoléico (LA) es metabolizado a ácido araquidónico (AA) y el ácido αlinolénico (ALA) a ácido eicosapentaenóico (EPA) y a ácido docosahexaenóico (DHA), aumentando el largo de la cadena y el grado de insaturación al agregar más dobles ligaduras al grupo carboxilo (Simopoulos, 1991) (Figura 3). 2 Simopoulos (1991) 7 2.2.2 Fuentes El ALA está presente en el aceite de linaza y en los vegetales de hojas verdes. El EPA y el DHA se encuentran principalmente en peces de aguas frías, en sus aceites y en las algas marinas. El LA es abundante en casi todas las semillas de las plantas como el maíz, cacahuate, algodón, frijol de soya; es abundante por lo tanto, en aceites vegetales como el de maíz, de soya o el de girasol. El AA se encuentra principalmente en el cacahuate y es componente importante en los fosfolípidos de animales alimentados con granos (Sargent, 1997). Serie Linoleato Serie Linolenato C18:2 ω-6 Ácido linoléico (LA) Enzima ▲6 Desaturasa C18:3 ω-3 C18:3 ω-6 Ácido gama-linolénico C18:4 ω-3 C20:3 ω-6 Ácido dihomo-gama linolénico C20:4 ω-3 Enzima ▲5 Desaturasa Ácido α-linolénico (ALA) Enzima ▲6 Desaturasa Enzima ▲5 Desaturasa C20:4 ω-6 Ácido araquidónico (AA) C20:5 ω-3 Ácido eicosapentaenóico (EPA) C22:4 ω-6 Acido docosatetraenóico Enzima ▲4 Desaturasa C22:5 ω-3 Ácido docosapentaenóico (DPA) Enzima ▲4 Desaturasa C22:5 ω-6 Acido docosapentaenóico C22:6 ω-3 Ácido docosahexaenóico (DHA) Figura 3. Metabolismo de los ácidos grasos esenciales, elongación y desaturación de los AGω3 y AGω6 3 3 Simopoulos (1991) 8 2.2.3 Efectos benéficos de los ácidos grasos ω3 El DHA es esencial para el adecuado desarrollo del cerebro y los ojos, por lo tanto una deficiencia de DHA durante el desarrollo temprano puede resultar en anormalidades en la vista (Connor et al., 1991; Sargent, 1997). El AA y el EPA son precursores de eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos). Cuando una dieta contiene altos niveles de LA, bajos niveles de ALA y muy bajos de EPA y DHA, la conversión de LA a AA dentro del cuerpo compite con la conversión de ALA a EPA y a DHA, generándose un exceso relativo del AA produciendo mayor cantidad de la prostaglandina I2 (PGI2) y del tromboxano A2 (Tx A2), los cuales están relacionados con algunos desórdenes cardiovasculares y condiciones inflamatorias. La producción de este tipo de eicosanoides es normalmente reducida por la presencia de EPA en la dieta, ya que este ácido produce otro tipo de eicosanoides, la PGI3 y el TXA3, que tienen gran importancia para mantener la estructura de las membranas celulares y tienen efectos antitrombóticos (Simopoulos, 2000). El EPA y El DHA presentan funciones muy variadas y diversos efectos favorables sobre las células de los tejidos blandos, la agregación plaquetaria, la permeabilidad y contractabilidad de los vasos sanguíneos, en los procesos inflamatorios y de respuesta del sistema inmunológico. Grandes dosis de AGω3 tienen efecto sobre la disminución de la hipertensión e inflamaciones y otras enfermedades como infarto al miocardio y artritis reumatoide. Estudios clínicos han demostrado que entre la gente que frecuentemente consume pescado se reduce la mortalidad por enfermedades del corazón como hipertensión, obesidad y elevado colesterol en la sangre. Estos beneficios se han atribuido a la presencia de los AGω3 en el pescado (Craig-Schmidt et al., 1987; Boundreau et al., 1991; Oh et al, 1991; Simopoulos, 1991; Wander y Patton, 1991; Holub, 1992; Nettleton, 1991; García y Albalá, 1998; Simopoulos, 2000). 9 Otros estudios indican que el consumo de aceite de pescado, puede tener efectos inhibitorios en cánceres incluyendo el de colon, piel, páncreas y próstata. La función más notable de los AGω3 consiste en reducir el nivel de lípidos en la sangre, lo que consiguen modificando el metabolismo de los ácidos grasos y de los triglicéridos en el hígado, su consumo en cantidades mínimas podría simultáneamente limitar la obesidad abdominal (Nettleton, 1993; Holub, 1992; Simopoulos, 2000). 2.2.4 Consumo recomendado de AGω ω3 y AGω ω6 Van Elswyk (1995) sugiere que al consumir 2 raciones de 100g de pescado a la semana, se reduce en un 50 % el riesgo de padecer enfermedades coronarias. En el hombre, el consumo diario de unos pocos gramos de EPA reduce en aproximadamente un 40 % la concentración sanguínea de los triglicéridos y de un 10 a un 15 % la de colesterol (Harris et al., 1989). Desafortunadamente la realidad es que en México y en otros países, se consume menos de una ración de pescado por semana o ninguna, ya sea por la disponibilidad, el costo o simplemente las preferencias del consumidor. Según Avila et al. (1997) sólo el 18.7 % de las familias mexicanas consume pescado una o dos veces por semana, ya sea por el precio del producto (31.9 %), por la disponibilidad (39.1 %) o simplemente porque no les gusta el pescado (9.5 %). Para esta gente que casi no consume pescado, es que algunos especialistas en la nutrición han buscado alternativas para ofrecer estos beneficios a la salud a través del enriquecimiento con AGω3, de algunos productos que se consumen a diario como es el huevo. En el Cuadro 1, se presentan las recomendaciones diarias de ácidos grasos. Aunque, al hacer recomendaciones dietarias, es importante considerar que infantes prematuros, personas mayores, personas hipertensas y algunos diabéticos pierden su habilidad de sintetizar EPA y DHA a partir del ALA (Simopoulos, 1991). 10 Cuadro 1. Consumo recomendado de ácidos grasos para adultos con una ingesta diaria de 2,000 Kcal 4 Ácido graso Recomendaciones g/día LA 4.44 ALA 2.22 EPA 0.22 DHA 0.22 EPA + DHA 0.65 2.3 COLESTEROL El colesterol pertenece al grupo esterol de las grasas, es una molécula de 27 carbones, provenientes de la Acetil Coenzima A (Acetil-CoA). Es un componente esencial de las membranas celulares, un producto del metabolismo animal. Todas las células tienen la capacidad de sintetizarlo y se encuentra por lo tanto en los alimentos de origen animal como la carne, el hígado, los sesos y la yema del huevo. Es precursor de otros esteroides como los ácidos biliares y de ciertas hormonas como los andrógenos, estrógenos, la progesterona y hormonas adrenocorticoides. El colesterol en el organismo se obtiene de la dieta (exógeno), o bien puede ser sintetizado por el mismo cuerpo (endógeno) (McNamara y Nicolosi, 1999). El colesterol es transportado en la sangre a través de las lipoproteínas. Estas son de dos tipos: lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las de alta densidad (HDL). Las LDL son responsables de la fijación del colesterol sobre las paredes de los vasos y de la obturación de las arterias provocando angina de pecho, infarto de miocardio, 4 Simopoulos (2000) 11 trombosis arterial, etc. En cambio, las HDL tienen una función de protección contra el riesgo de enfermedades cardíacas por lo que se le dice el “buen colesterol” (Cervelle-Zonca, 1985). La cantidad de colesterol dietético no tiene relación clara con los niveles de colesterol en la sangre. En el lumen intestinal se producen de 300 a 500 mg de colesterol, a partir de los productos de origen animal consumidos; mientras que el colesterol biliar aporta diariamente de 800 a 1200 mg (McNamara y Nicolosi, 1999). Las recomendaciones actuales en países desarrollados indican la conveniencia de reducir el consumo de colesterol a menos de 200-250 mg diarios (Serra-Majem et al., 1999). Igualmente, Bourges (2001) sugiere que la ingestión diaria de colesterol no sea mayor a 120 -130 mg/1000 Kcal en la dieta. El huevo tiene un alto contenido de colesterol, por lo que a muchas personas les preocupa consumirlo, a pesar de su alto valor nutritivo y su bajo precio. 2.4 VALOR NUTRITIVO DEL HUEVO DE GALLINA El huevo de gallina forma parte importante en la alimentación de la población mexicana. El consumo de huevo durante el 2001 fue de 20.6 Kg per cápita. A nivel mundial, México ocupa el primer lugar como consumidor de huevo y el sexto como productor (UNA, 2002). Un huevo de aproximadamente 60 g contiene 39.5-41.5 g de agua, 6.4-7.0 g de proteína, 6.1-6.9 g de grasa y 88-95 Kcal. Del total de grasas, 22.3-2.5 g son saturadas, 3.5-4.0 g insaturadas y 0.24-0.27 g de colesterol (Sauveur, 1993). Los minerales que contiene son: calcio (29 mg), fósforo (120 mg), hierro (1.1 mg), magnesio (6 mg), sodio (72 mg) y potasio (73 mg). También contiene algunas vitaminas como la A (150-400 UI), D (20-80 UI), E (0.6-2 mg), tiamina (52 µg), 12 rivoflavina (200 µg), piridoxina (68 µg), biotina (10 µg), ácido fólico (15 µg) y cobalamina (0.5 µg) (Sauveur, 1993). 2.5 ENSAYOS QUE SE HAN HECHO PARA MODIFICAR LA COMPOSICIÓN DE LÍPIDOS EN EL HUEVO DE GALLINA Varios investigadores se han abocado a la tarea de reducir el contenido de colesterol en el huevo, además de incrementar su contenido de AGω3 y de esta manera hacer llegar a la población los beneficios de consumir dichos ácidos grasos. Algunos han intentado disminuir el colesterol en el huevo a través de fármacos como el Lovastatin (Elkin y Rogler, 1989), Probucol (Waldroup et al, 1986) y Triparonol (Weiss et al, 1967), pero a pesar de que con el empleo de estos productos farmacéuticos las reducciones de colesterol han sido interesantes, tienen poca probabilidad de ser útiles en la producción comercial debido a su elevado costo y a la posibilidad de dejar residuos en el huevo. Otros han empleado ingredientes naturales como harina de alfalfa (McNaughton, 1978) y harina de cebada (Beyer y Jensen, 1993), pero no detectaron efectos significativos sobre el contenido de colesterol en el hígado, en el tejido de la pechuga, en plasma ni en yema. El ácido orótico usado en gallinas disminuyó el colesterol en el huevo pero también redujo significativamente el peso de las aves y en ratas causó hígado graso severo (Beyer y Jensen, 1991). Mengue et al. (1974), adicionaron celulosa pura a las dietas para gallinas pero no se detectó disminución en el contenido del colesterol. Otros estudios han tenido como objetivo reducir el colesterol y al mismo tiempo aumentar la concentración de AGω3 en el huevo. García y Albalá (1998), observaron que los huevos obtenidos de gallinas alimentadas con harina de pescado y grasas 13 marinas, contienen significativamente menos colesterol, más triglicéridos y menos fosfolípidos que aquellos provenientes de gallinas alimentadas solo con productos de origen vegetal; también notaron que se modificó el perfil de los ácidos grasos en el huevo, aumentando los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA’s), sobre todo el eicosapentaenóico (EPA) y el docosahexaenóico (DHA). Hargis et al. (1991) realizaron un experimento en el que durante 126 días las gallinas fueron alimentadas con 3 % de aceite de Menhaden (especie de arenque), y encontraron que el contenido de AGω3 en yema se incrementó significativamente, la incorporación máxima fue después de la tercera semana y conforme se incrementaron los AGω3 disminuyeron los AGω6. Obtuvieron huevos con un total de 235 mg de AGω3, de los cuales 89 % era EPA y DHA, sin embargo, se presentó infiltración grasa en hígado. Oh et al. (1991) utilizaron 10 % de aceite de pescado para producir huevos con alto contenido de AGω3, sin embargo, encontraron que estos huevos eran desagradables en cuanto a sabor. Van Elswyk et al. (1992), también realizaron un experimento de 4 semanas, incorporando 3 % de aceite de Menhaden a las raciones para gallinas y encontraron que los AGω6 disminuyeron en un 70 % y los AGω3 aumentaron en un 75 % y señalan que el sabor de los huevos fue aceptado por los consumidores. Marshall et al. (1994b), realizaron un experimento durante 4 semanas, en el que las gallinas fueron alimentadas con raciones que incluían 1.5 % de aceite de Menhaden, encontrando un aumento en los niveles de los AGω3, EPA y DHA; mientras que el contenido de AA disminuyó. Por otro lado, Van Elswyk et al. (1994), incluyó 1.5 % de aceite de Menhaden en una ración de gallinas ponedoras obteniendo una deposición de aproximadamente 180 mg del total de AGω3 por yema, cantidad semejante a la encontrada en una ración de pescado, lo que quiere decir que un huevo conteniendo esta concentración de AGω3, podría sustituir una ración de pescado en cuanto a su contenido en ácidos grasos. 14 En otro estudio realizado por Herber y Van Elswyk (1996), se probaron durante 4 semanas dietas con 1.5 % de aceite de Menhaden y 2.4 % de una microalga (rica en DHA). Se obtuvo un total de AGω3 de 9.4 y 9.5 mg/g de yema respectivamente, de los que 8.1 y 8.8 mg fueron de DHA, esto equivale a un contenido total de AGω3 de 155 a 165 mg/huevo en el primer tratamiento y 160-170 mg en el segundo. Cuando se evaluaron sensorialmente ambos tratamientos, el huevo fue aceptado; sin embargo, al incorporar 3 % de aceite de Menhaden en la dieta de gallinas ponedoras, los panelistas detectaron un ligero sabor desagradable en el huevo. Arellano et al. (1999) al incluir 3, 6 y 9 % de harina de cabezas de camarón y de anchoveta en raciones para ponedoras encontraron que el contenido de colesterol en el huevo no se modificó; pero los niveles de AGω3 sí se elevaron considerablemente, sobre todo con la harina de anchoveta. Carrillo et al. (1998), emplearon algas marinas en niveles de 6 y 9 % del alga café Sargassum sinicola en la ración de ponedoras y en este caso sí se logró una reducción en el contenido del colesterol en el huevo, pero no lograron incrementar la concentración de los AGω3. Otro ingrediente que se ha probado es la harina de langostilla (Pleuroncodes planipes) en niveles de inclusión de 3 y 6 % en la dieta de gallinas ponedoras, logrando incrementar la concentración de AGω3 pero sin lograr reducir el contenido de colesterol en el huevo (Carrillo et al. 1999). Baucells et al. (2000) incorporaron hasta 4 % de aceite de pescado y encontraron que pequeñas porciones de aceite de pescado en la dieta, daban como resultado valores bajos de ácidos grasos saturados, altos valores de AGω-6 y bajas concentraciones de AGω-3. González-Esquerra y Lesson (2000) utilizaron 2, 4 y 6 % de aceite de Menhaden regular y deodorizado. Encontraron que el peso del huevo disminuyó linealmente conforme se aumentó el nivel de inclusión del aceite de pescado, y el total de AGω3 15 aumentó considerablemente. En cuanto al sabor del huevo, no encontraron diferencias entre el huevo de gallinas alimentadas con aceite deodorizado y el que no lo estaba, pero en ambos casos sí disminuyó la preferencia en cuanto a sabor con respecto al testigo. 2.6 METABOLISMO DE LOS LÍPIDOS EN GALLINAS PONEDORAS El metabolismo de los lípidos es un proceso en el que los ácidos grasos se convierten en energía para la producción de huevo y almacenamiento de grasa corporal. Los ácidos grasos LA y ALA son ácidos grasos esenciales para las aves. Una vez consumidos, estos ácidos grasos son reesterificados por la acción de la enzima acetil-CoA-ligasa que se encuentra en el retículo endoplásmico de las células de la mucosa intestinal (Leeson y Summers, 2001). Estos ésteres reesterificados, se mueven hacia el aparato de Golgi, donde el colesterol, las proteínas y los fosfolípidos son añadidos formando las lipoproteínas. Las lipoproteínas sintetizadas en las células del intestino, se llaman portamicrones debido a que son transportadas a través de la vena porta hasta el hígado. Una vez sintetizados, los triglicéridos son incorporados a las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), estas lipoproteínas son muy importantes en gallinas ponedoras ya que son el vehículo de transporte de las grasas entre el hígado y los tejidos extrahepáticos como el ovario, donde son utilizadas para la formación de la yema del huevo (Klasing, 1998; Leeson y Summers, 2001). El consumo de otros ácidos grasos poliinsaturados omega-3 reduce los requerimientos de ALA. Los ácidos grasos poliinsaturados LA, AA y DHA son almacenados en los fosfolípidos de las membranas y en los lípidos de la yema y sirven como precursores de eicosanoides, prostaglandinas, leucopenos y tromboxanos. En las aves, los eicosanoides regulan casi todo el sistema fisiológico 16 incluyendo la ovoposición, el desarrollo embrionario, el crecimiento, la inmunidad, el desarrollo de huesos, la termorregulación y el comportamiento (Klasing, 1998). Las necesidades están dadas por el rango de crecimiento y producción de huevo. Las deficiencias de LA provocan una baja tasa de crecimiento y acumulación de grasa en el hígado; un síntoma de deficiencia crónica es la susceptibilidad a las infecciones; en la reproducción afecta a la espermatogénesis en los machos y baja la producción de huevo en las hembras (NRC, 1994; Klasing, 1998). 2.7 ACEITE DE PESCADO El aceite de sardina es una excelente fuente de AGω3, principalmente EPA y DHA. La producción de aceites de pescado en México, fue de 6,843 toneladas en 1999. El aceite se extrae tanto de pescado entero como de los desperdicios resultantes de las líneas de congelación y enlatado de productos pesqueros, pero principalmente se obtiene de la anchoveta (Engraulis mordax) y de la sardina Monterrey (Sardinops sagax caerulea), siendo el Golfo de California la principal zona de captura y producción del aceite de pescado (Anuario Estadístico de Pesca, 2000). Este aceite, hasta 1980 solo se utilizaba para usos industriales pero debido a la creciente necesidad de una fuente de energía en la industria alimentaria se ha diversificado su empleo, dándole uso principalmente en acuicultura y un poco en alimentación de aves como fuente de lípidos. En su composición predominan los ácidos grasos esterificados y en menor proporción ácidos grasos libres, vitaminas, colorantes, esteroles, etc. Su composición química depende de diversos factores como el tipo de ácidos grasos de los aceites, los cuales varían en función de la especie, de la composición de su alimento y de la época del año. Todos los aceites de pescado contienen ácidos grasos saturados e insaturados de las series C20, C22 y C24, y difieren considerablemente de los aceites 17 vegetales, ya que los aceites de pescado contienen una gran variedad de ácidos grasos insaturados y los ácidos grasos linoléico (LA) y α-linolénico (ALA) pueden estar presentes en cantidades muy pequeñas, pero son ricos en los ácidos grasos poliinsaturados EPA y DHA (Ackman, 1988). En el presente estudio, se consideró conveniente probar aceite de sardina, ya que ésta es una de las especies de mayor importancia comercial pesquera en México y podría llegar a ser un recurso potencial en la alimentación de las aves, dado su alto contenido de AGω3, los cuales al depositarse en el huevo pueden aportar beneficios al consumidor. 18 3. MATERIAL Y METODOS El presente estudio se realizó en el Departamento de Nutrición Animal del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán como parte del proyecto “Aprovechamiento de recursos marinos y vegetales para incrementar el contenido de ácidos grasos omega 3 en el huevo y carne de pollo”. En el anexo 1 se presenta un diagrama de flujo de todo el procedimiento que se siguió. 3.1 Obtención del aceite de sardina El aceite de sardina se obtuvo de la empacadora "Selecta de Guaymas” en el estado de Sonora, México. Era aceite purificado, no deodorizado y estabilizado con antioxidante BHT (Butil-Hidroxitolueno). A este aceite, así como al aceite vegetal mixto que se usó en la preparación de la dieta testigo, se les determinó la concentración de los ácidos grasos linoléico (LA), α-linolénico (ALA), araquidónico (AA), eicosapentaenóico (EPA) y docosahexaenóico (DHA), por cromatografía de gases (Castro et al., 2001). 3.2 Formulación y preparación de las dietas Las dietas se formularon en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Avícola de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, con ayuda del programa NUTRION (1999). Las 4 dietas fueron isocalóricas e isonitrogenadas (Cuadro 2), cubriendo las necesidades nutrimentales para gallinas ponedoras indicadas por la National Research Council (NRC, 1994). Los tratamientos consistieron en la inclusión de 0, 0.5, 1.5 y 3 % de aceite de sardina, sustituyendo parcialmente al aceite vegetal mixto. 19 Cuadro 2. Composición de las dietas para gallinas ponedoras, en donde se incluyeron diferentes porcentajes de aceite de sardina INGREDIENTE 0% 0.5 % 1.5 % 3% Sorgo 61.07 61.07 61.07 61.07 Soya (46 % PCT*) 23.74 23.74 23.74 23.74 Carbonato de calcio 9.57 9.57 9.57 9.57 Aceite vegetal mixto 3.39 2.89 1.89 0.39 Aceite de sardina 0.00 0.50 1.50 3.00 Fosfato de calcio 1.14 1.14 1.14 1.14 0.29 0.29 0.29 0.29 0.25 0.25 0.25 0.25 D-L-Metionina 0.15 0.15 0.15 0.15 Premezcla de Minerales 2 0.12 0.12 0.12 0.12 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05 0.05 0.05 0.05 Antioxidante BHT 0.04 0.04 0.04 0.04 Bacitracina Zinc 0.05 0.05 0.05 0.05 Cloruro de colina 60 % 0.04 0.04 0.04 0.04 Fungicida (Purimold) 0.05 0.05 0.05 0.05 16.00 2.90 4.00 0.33 16.00 2.90 4.00 0.33 16.00 2.90 4.00 0.33 16.00 2.90 4.00 0.33 (g/100g de muestra) Sal Premezcla de Vitaminas Avired 1 3 Avelut amarillo 3 Aporte Calculado: Proteína cruda (%) (N x 6.25) Energía bruta (Kcal/100 g) Calcio (mg/100 g) Fósforo disponible (mg/100 g) * PCT = Proteína cruda total 1 Dado en kg de la dieta: vitamina A, 12000 UI; vitamina D3, 2500 UIP; vitamina E, 30 UI; vitamina K3, 2 mg; tiamina, 2.25 mg; riboflavina, 7.5 mg; vitamina B6, 3.5 mg; vitamina B12, 0.02 mg; niacina, 45 mg; ácido pantoténico, 12.5 mg; biotina, 0.125 mg; ácido fólico, 1.5 mg 2 Dado en mg/kg de la dieta: Zinc, 50; cobre, 12; yodo, 0.3; cobalto, 0.2; hierro, 110; selenio, 0.1; manganeso, 110 3 Cortesía de Pigmentos Vegetales S.A. de C.V. 20 A cada una de las dietas se les determinó: a) Lípidos totales según el método de Folch et al. (1957) b) Ácidos grasos: linoléico (LA C18:2 ω6), α-linolénico (ALA C18:3ω3), araquidónico (AA C20:4ω6), eicosapentaenóico (EPA C20:5ω3) y docosahexaenóico (DHA 22:6ω3), por cromatografía de gases (Castro et al., 2001). 3.3 Ensayo experimental La fase experimental se llevó a cabo en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Avícola (CEIEPA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en la Ciudad de México. Se utilizaron 144 gallinas ponedoras Leghorn de 50 semanas de edad, distribuidas completamente al azar en 4 tratamientos con 4 repeticiones de 9 aves cada una. Los tratamientos se asignaron aleatoriamente. El experimento tuvo una duración de 5 semanas, suministrándoles agua y alimento a libre acceso. 3.3.1 Variables de producción y calidad del huevo de gallina Con el propósito de vigilar que la incorporación de este nuevo ingrediente en las dietas de las aves, no afectara negativamente las variables de producción ni las características físicas de la calidad del huevo, se realizaron las siguientes mediciones. Diariamente se registró el peso y el número de huevos producidos en cada repetición y semanalmente se calculó la cantidad de alimento consumido (alimento proporcionado – alimento rechazado). Al final de la quinta semana del experimento, se resumieron, por tratamiento, los datos de producción de huevo (No de huevos/No. de aves X 100), peso promedio del huevo, consumo de alimento, 21 índice de conversión alimenticia (total de alimento consumido/No. de huevos) y la masa del huevo (peso promedio del huevo X producción de huevo). Asimismo, al final del ensayo, se midieron algunos parámetros para determinar la calidad del huevo. Se tomaron al azar 6 huevos de cada repetición, a cada uno se les midió el peso del huevo entero y del cascarón en una balanza digital; el grosor del cascarón con un vernier; el color de la yema con el abanico colorimétrico Roche (1993); la altura de albúmina con un trípode. Posteriormente se calcularon las unidades Haugh que es la altura de la albúmina, expresada logarítmicamente y corregida con el peso del huevo (Quintana, 1999). 3.3.2 Composición química del huevo de gallina Al final de la quinta semana de experimentación, se tomaron al azar 9 huevos de cada repetición, se liofilizaron individualmente para posteriormente cuantificar las concentraciones de colesterol, lípidos totales, y los ácidos grasos linoléico (LA), αlinolénico (ALA), araquidónico (AA), eicosapentaenóico (EPA) y docosahexaenóico (DHA). La determinación de colesterol se realizó por la técnica de saponificación directa de Fenton y Sim (1991) y se cuantificó en un cromatógrafo de gases marca Varian, modelo 3400CX, equipado con un detector de ionización de flama (FID) y una columna capilar DB-5 (J&W 122-5033) de 3 m de longitud y 0.25 mm de diámetro interno. Para calibrar el equipo y establecer el tiempo de retención, se preparó una mezcla con estándar de colesterol (SIGMA C-8667) y 5 α-colestano (SIGMA C8003). Este último se utilizó como estándar interno en cada una de las muestras. Las condiciones cromatográficas que se usaron son las siguientes: la temperatura del inyector fue de 280°C, la del detector de 300°C y se utilizó un gradiente de 22 temperatura en la columna, la temperatura inicial fue de 180°C, y se aumentó 40°C/minuto hasta llegar a 280°C. Se utilizó Nitróg eno como gas acarreador. La extracción de lípidos totales, se realizó por el método de Folch et al. (1957). Para cuantificar los ácidos grasos, los lípidos obtenidos fueron metilados y esterificados con trifluoruro de Boro metanólico (SIGMA B-1252) como lo indica la técnica de Castro et al. (2001). Para identificar los tiempos de retención, se usó una mezcla de estándares de los ésteres metílicos de cada uno de los ácidos mencionados y ácido Miristoléico (SIGMA M-3650) como estándar interno. Posteriormente se cuantificaron en un cromatógrafo de gases marca Varian, modelo 3400 CX, equipado con detector de ionización de flama (FID) y una columna capilar DB-23 (J&W 122-2332) de 30 m de longitud y 0.25 mm de diámetro interno. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: la temperatura del inyector fue de 250°C, la del detector de 300°C y se utilizó un gradiente de temperatura en la columna en donde la temperatura inicial fue de 140°C, se aumentó 10°C/minuto hasta llegar a 200°C, se sostuvo durante 1 minuto y nuevamente se aumentó 5°C/min hasta llegar a 230°C donde se mantuvo duran te 7 minutos. Se utilizó Nitrógeno como gas acarreador. 3.3.3. Evaluación sensorial La evaluación sensorial del huevo se realizó al término de la quinta semana del experimento. Participaron 30 jueces no entrenados, consumidores habituales de huevo, a quienes se les aplicó una prueba de nivel de agrado para los atributos: color de la yema y olor y sabor del huevo, con una escala hedónica de 5 puntos en la que 5 correspondía a “disgusta mucho” y 1 a “gusta mucho” (Ver Anexo 2) (Pedrero y Pangborn, 1989). 23 En la evaluación del color de la yema de huevo fresco, cada tratamiento fue codificado con números aleatorios de 3 dígitos. Los huevos se colocaron en recipientes individuales transparentes, ofreciéndolos a los jueces en una charola con fondo blanco para una mejor apreciación. Se les pidió a cada uno de los jueces que observara cada una de las muestras e indicara en la hoja de evaluación el nivel de agrado de cada una de ellas. Para el caso de la evaluación del olor y del sabor, se tomaron al azar 6 huevos de cada tratamiento, se mezclaron y se cocinaron sin condimentos, únicamente con un poco de grasa para evitar que se pegaran a la sartén. Las muestras se presentaron en series de 4, codificadas con números aleatorios de 3 dígitos. Se les pidió a cada uno de los jueces que probaran cada una de las muestras, tomando entre muestra y muestra un poco de pan y agua para eliminar el sabor residual entre las muestras e indicaran en la hoja de evaluación correspondiente el agrado o desagrado de cada una de las muestras (Pedrero y Pangborn, 1989). 3.4 Análisis estadístico Los resultados obtenidos en variables de producción, calidad de huevo, y composición química se analizaron por medio del paquete estadístico SAS® (SAS Institute, 1994) utilizando el análisis de varianza para un diseño completamente al azar y las diferencias entre tratamientos se compararon por medio de la prueba de Tukey, con un nivel de significancia de P<0.05 (Steel y Torrie, 1988). Los resultados obtenidos en la evaluación sensorial fueron analizados utilizando el análisis de varianza, con un solo criterio de clasificación por rangos de Kruskal-Wallis y la prueba de Tukey para comparación de medias con un nivel de significancia de P<0.05 (Daniel, 1980). 24 4. RESULTADOS 4.1 Composición en ácidos grasos de los aceites y las dietas En el Cuadro 3 se observa que, el aceite de sardina (AS) presentó un alto contenido de AGω3, principalmente EPA y DHA; por el contrario, el aceite vegetal mixto (AVM) mostró un bajo contenido de éstos, pero alta concentración de ácido linoléico (LA). Cuadro 3. Contenido de ácidos grasos del aceite vegetal mixto y del aceite de sardina usados en las dietas ACEITE AS (mg/100g de muestra) AVM ÁCIDO GRASO Ácido linoléico (LA 18:2 ω-6) 11,455.00 ± 1344 758.00 ± 41 Ácido araquidónico (AA 20:4 ω-6) 9.05 ± 1 1,051.00 ± 59 Ácido α-linolénico (ALA 18:3 ω-3) 210.00 ± 6 412.00 ± 26 Ácido eicosapentaenóico (EPA 20:5 ω-3) 473.00 ± 54 7,423.00 ± 559 Ácido docosahexaenóico (DHA 22:6 ω-3) 139.00 ± 21 6,183.00 ± 4 TOTAL ω-6 11,464.00 1,809.00 TOTAL ω-3 822.00 14,018.00 Proporción ω6/ω3 13.95 0.13 Se presenta la media y error estándar de 3 repeticiones 25 En todas las dietas, el contenido de lípidos totales fue aproximadamente de 3 % (Cuadro 4), pero en aquellas que incluían aceite de sardina, el LA y el ALA mostraron una relación inversa al nivel de inclusión de este ingrediente, mientras que los ácidos AA, EPA y DHA, aumentaron en forma proporcional a la inclusión del mismo. Cuadro 4. Contenido de lípidos totales y ácidos grasos en las dietas suministradas a las gallinas ponedoras TRATAMIENTO Lípidos totales 1 Ácidos grasos 0% 0.5 % 1.5 % 3% 3.13 ± 0.47 3.51 ± 0.64 3.52 ± 0.40 3.03 ± 0.51 836.98 ± 117 400.11 ± 39 345.85 ± 84 240.92 ± 10 2 Ácido Linoléico (LA 18:2 ω-6) Ácido araquidónico (AA 20:4 ω-6) 1.03 ± 0.22 3.98 ± 1.36 5.11 ± 0.27 Ácido α-linolénico (LA 18:3 ω-3) 33.38 ± 4.87 14.03 ± 2.28 14.59 ± 4.52 10.18 ± 0.09 Ácido eicosapentaenóico (EPA 20:5 ω-3) 4.29 ± 0.55 18.57 ± 1.35 28.49 ± 8.81 32.34 ± 1.71 Ácido docosahexaenóico (DHA 22:6 ω-3) 4.14 ± 0.57 17.99 ± 0.72 28.51 ± 6.30 35.48 ± 2.09 1.96 ± 0.18 TOTAL ω6 838.01 402.07 349.83 246.03 TOTAL ω3 41.81 51.15 71.03 78.00 Proporción ω6/ω3 20.04 7.86 4.92 3.15 1 Los lípidos se expresan en g/100g de muestra Los ácidos grasos se expresan en mg/100g de muestra Se muestra la media y error estándar de 3 repeticiones 2 26 4.2 Composición lipídica del huevo de gallina Al final de las cinco semanas de experimentación, el contenido de lípidos totales encontrado en el huevo deshidratado de los diferentes tratamientos, presentó valores de entre 28.3 y 29.9 %. Aunque se observó una ligera reducción en los tratamientos con 1.5 y 3 % de AS, no se detectaron diferencias significativas entre tratamientos (P>0.05) (Cuadro 5). Cuadro 5. Contenido de lípidos totales y colesterol en el huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina. Tratamiento Lípidos totales (g/100g de huevo deshidratado) Colesterol (mg/100g de huevo deshidratado) a 0% 0.5 % 1.5 % 3% 29.39 a ± 0.52 29.89 a ± 0.75 29.04 a ± 0.84 28.30 a ± 0.71 1498.4 a ± 29.56 1481.9 a ± 22.03 1426.6 a ± 17.67 1441.2 a ± 16.57 en cada renglón, literales distintas indican diferencia significativa entre tratamientos (P<0.05) n = 36 En cuanto al contenido de colesterol en el huevo, en el tratamiento con 1.5 % de AS se obtuvo una reducción aparente con respecto a los otros tratamientos pero las diferencias no fueron significativas (P>0.05) (Cuadro 5). Respecto al contenido de ácidos grasos en el huevo, se puede observar que la concentración de LA y de AA se redujo significativamente en los tratamientos con 1.5 % y 3 % de AS, con respecto al testigo (Cuadro 6) (P<0.05). 27 Cuadro 6. Contenido de ácidos grasos en el huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina (mg/100 g de huevo deshidratado) Tratamiento 0% 0.5 % 1.5 % 3% 2437.82ab ±57.84 2612.91a ±76.97 2221.43bc ±66.09 1973.37c ±74.98 Ácido araquidónico (AA 20:4 ω-6) 288.73a ±7.69 289.75a ±9.51 192.71b ±7.02 159.03c ±6.85 Ácido α-linolénico (ALA 18:3 ω-3) 39.01a ±1.13 46.55b ±1.54 52.02b ±1.87 60.10c ±2.23 Ácido eicosapentaenóico (EPA 20:5 ω-3) 8.86a ±1.21 20.98b ±1.00 49.65c ±2.30 89.51d ±3.28 Ácido docosahexaenóico (DHA 22:6 ω-3) 169.04ª ±13.19 399.84b ±11.21 587.39c ±21.54 717.95d ±19.77 TOTAL ω-6 2726.55 2902.66 2414.14 2132.4 TOTAL ω-3 216.91 467.37 689.06 867.56 Proporción ω6/ω3 12.57 6.21 3.50 2.46 Ácido graso Ácido linoléico (LA 18:2 ω-6) a, b, c, d en cada renglón, literales distintas indican diferencia significativa (P<0.05) n = 36 Respecto a los ácidos grasos omega-3 (AGω3), el comportamiento observado fue contrario a lo sucedido con los omega-6 (AGω6). Las concentraciones del ALA, EPA y DHA en el huevo, se vieron incrementadas conforme aumentó el nivel de inclusión de AS en las dietas. En el caso del ALA, este incremento fue significativamente superior (P<0.05) en todos los tratamientos que incluyeron aceite de sardina con respecto al grupo testigo (Cuadro 6). 28 Respecto al EPA, el tratamiento con 1.5 % de AS, mostró un valor superior al obtenido en el grupo testigo, pero en el tratamiento con 3 % de AS, el incremento fue todavía mucho mayor. Las diferencias fueron significativas entre todos los tratamientos (P<0.05) (Cuadro 6). La concentración de DHA en el huevo fue mayor en los tratamientos que incluían aceite de sardina, observando un incremento lineal al nivel de inclusión de éste en las dietas. Hubo diferencias estadísticas entre todos los tratamientos (P<0.05). En la Figura 4, se observa que conforme aumentó la inclusión de AS en las dietas, la deposición del total de AGω6 disminuyó. Por el contrario, los AGω3 presentaron un incremento significativo y directamente proporcional a la inclusión de AS en las dietas (Figura 5). La deposición mas alta del total de AGω3 en el huevo deshidratado, fue de 867.56 mg/100 g en el tratamiento con 3 % de AS, de los cuales el 11 % es EPA y el 81 % es DHA. La proporción ω6:ω3 también disminuyó considerablemente conforme aumentó el nivel de inclusión de AS, encontrando un balance de 2.5:1 en el tratamiento con 3 % (Figura 6). 29 mg/100 g muestra 3000 2500 2000 1500 1000 0% 0.5% 1.5% 3% aceite de sardina Figura 4. Total de ácidos grasos ω6 del huevo proveniente de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina mg/100 g de muestra 1000 800 600 400 200 0 0% 0.5% 1.5% 3% aceite de sardina Figura 5. Total de ácidos grasos ω3 del huevo proveniente de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina 30 14 12 ω6/ω3 10 8 6 4 2 0 0% 0.5% 1.5% 3% aceite de sardina Figura 6. Proporción ω6/ω3 en el huevo proveniente de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina 4.3 Evaluación sensorial En cuanto a la preferencia por el color de las yemas, no se detectaron diferencias estadísticas entre tratamientos (P>0.05), ubicándose las evaluaciones entre “gusta mucho” y “gusta poco” (Figura 7), En el caso del olor del huevo, tampoco se detectaron diferencias significativas (P>0.05), entre los cuatro tratamientos, y la calificación estuvo dentro de la escala “gusta poco” (Figura 7). Los resultados obtenidos en cuanto al sabor del huevo, mostraron una notable diferencia (P<0.05) entre el testigo y el tratamiento con 3 % de aceite de sardina, presentándose en éste último, un evidente rechazo por parte de los jueces. La preferencia se ubicó entre “gusta poco” y “es indiferente” (Figura 7). 31 5 0% 0.5% 1.5% 3% nivel de agrado 4 3 2 a a a a a a a a bc a c ab 1 0 color olor sabor Escala hedónica: 1 = gusta mucho, 2 = gusta poco, 3 = es indiferente, 4 = disgusta poco, 5 = disgusta mucho a, b, c = en cada renglón, literales distintas indican diferencia significativa entre tratamientos (p<0.05) Figura 7. Preferencia por el color, olor y sabor del huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina 4.4 Variables de producción Aparentemente la producción diaria de huevo se vio favorecida con la inclusión de aceite de sardina en la dieta de las gallinas ponedoras, sin embargo, estos incrementos no fueron estadísticamente significativos (P>0.05) (Cuadro 7). 32 Respecto al peso promedio del huevo, el tratamiento con 3 % AS, mostró una reducción significativa con respecto al testigo (P<0.05) (Cuadro 7). En cuanto al consumo de alimento, las diferencias entre tratamientos no fueron significativas (P>0.05). El índice de conversión alimenticia y la masa de huevo tampoco mostraron diferencias entre tratamientos (P>0.05). Cuadro 7. Variables de producción de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina Tratamiento 0% 0.5 % 1.5 % 3% Producción de huevo (%) 82.67a ±1.09 86.77ª ±1.45 86.88ª ±1.06 87.14ª ±1.5 Peso promedio de huevo (g) 64.07ª ±0.27 63.76ª ±0.39 63.56ª ±0.22 62.14b ±0.36 Consumo de alimento (g) 102.50ª ±1.44 102.74ª ±2.14 103.14ª ±1.29 99.76ª ±1.94 Indice de conversión 1.94ª ±0.03 1.86ª ±0.04 1.87ª ±0.02 1.84ª ±0.03 Masa de huevo (g) 52.97ª ±0.75 55.34ª ±1.03 55.22ª ±0.69 54.20ª ±1.10 a, b en cada renglón, literales distintas indican diferencia significativa entre tratamientos (P<0.05) 4.5 Calidad de huevo En la altura de albúmina, las Unidades Haugh, el peso del cascarón y el grosor del mismo no se encontraron diferencias estadísticas (P>0.05) entre tratamientos (Cuadro 8) a las 5 semanas de experimentación. 33 En cuanto al color de la yema, la mayor coloración obtenida fue con 1.5 % de AS, resultando diferente estadísticamente al grupo testigo (P>0.05) (Cuadro 8). Cuadro 8. Calidad del huevo de gallinas en cuya dieta se incluyó aceite de sardina Tratamiento 0% 0.5 % 1.5 % 3% Altura de albúmina (mm) 9.44ª ± 0.30 9.68ª ± 0.22 9.96ª ± 0.25 9.72ª ± 0.21 Color de yema 11.13ª ± 0.18 11.37ab ± 0.12 11.75b ± 0.12 11.62ab ± 0.12 Unidades Haugh 98.83ª ± 1.57 96.17ª ± 1.09 97.96ª ± 1.36 97.04ª ± 1.01 Peso de cascarón (g) 9.71ª ± 0.23 9.21ª ± 0.23 9.79ª ± 0.22 9.45ª ± 0.17 Grosor de cascarón (mm) 0.36 ª ± 0.01 0.35 ª ± 0.01 0.35 ª ± 0.01 0.35 ª ± 0.01 a, b en cada renglón, literales distintas indican diferencia significativa entre tratamientos (P>0.05) n = 24 34 5. DISCUSION 5.1 Lípidos Totales y colesterol en el huevo de gallina El contenido de lípidos totales en el huevo que fue de aproximadamente 30 % en todos los tratamientos, concuerda con lo reportado por García y Albalá (1998), quienes alimentaron gallinas con 9.4 % de harina de pescado y 2.5 % de una mezcla de grasas marinas, y no encontraron diferencias significativas en cuanto a la concentración de lípidos en el huevo. Igualmente, Hargis et al. (1991), al incorporar 3 % de aceite de Menhaden a las dietas, tampoco encontraron diferencias significativas en el contenido de lípidos totales entre tratamientos. Esto indica que la inclusión de aceite de sardina en las dietas, no afecta la concentración de lípidos totales en el huevo. Aunque la reducción del contenido de colesterol en el huevo con 3 % de AS no fue significativa, coincide con los resultados obtenidos por Hargis et al (1991), quienes al incorporar 3 % de aceite de Menhaden a las dietas, encontraron que el contenido de colesterol sí se redujo significativamente, pero hasta las semanas 12 y 14, lo que indica que si se prolongara el experimento con AS, mas allá de las 5 semanas, es probable encontrar una disminución mas notable en el contenido de colesterol. García y Albalá (1998), reportan que el contenido de colesterol total de la yema es significativamente menor en los huevos provenientes de gallinas alimentadas con productos marinos pero no mencionan durante cuanto tiempo se les suministraron dichos productos a las aves. De cualquier manera, es importante mostrar cautela al tratar de reducir sustancialmente el colesterol en el huevo, ya que esto podría traer como resultado que la gallina disminuyera la producción de huevo, debido a que el contenido de colesterol en la yema podría ser menor al necesario para sostener la embriogénesis (Van Elswyk et al., 1994). 35 5.2 Acidos grasos en el huevo de gallina Respecto al contenido de ácidos grasos en el huevo, los resultados obtenidos en el presente trabajo, coinciden con lo señalado por Van Elswyk et al. (1992), Hargis y Van Elswyk (1993), Van Elswyk et al. (1994), Herber y Van Elswyk (1996) Grobas et al. (1997) y Sanz et al. (1999) en el sentido de que la concentración de estos nutrimentos en el huevo, está muy relacionada con el contenido de los mismos en la dieta. González-Esquerra y Leeson (2001) mencionan que el incrementar la cantidad de aceite de pescado en la dieta de las gallinas, resulta en un incremento lineal en la deposición de AGω3 en el huevo. Simopoulos (2000), menciona que los recursos marinos, como el aceite de sardina, ofrecen el beneficio de incorporar directamente en el huevo el EPA y el DHA, los cuales son metabólicamente más importantes que el ALA para los humanos. La reducción en la concentración de LA en el huevo, observada en los tratamientos con 1.5 y 3 % de AS, seguramente se debió a que existe un reemplazo de AGω6 por AGω3, como lo señala Van Elswyk (1997a). Este mismo comportamiento se observó en el contenido de AA, el cual también disminuyó conforme aumentó el nivel de inclusión de aceite de sardina, aunque en las dietas aumentó como respuesta a la presencia de este ácido en el aceite. Según Van Elswyk (1997b), ésta disminución de AA en el huevo se da por la sustitución que ocurre en el huevo, de AA por los ácidos grasos ω3. Al respecto, Meluzzi et al. (1997) encontraron que al adicionar 2, 3 y 4 % de aceites de pescado refinados en la dieta de las aves, el contenido de AA en el huevo fue significativamente mas bajo (hasta 40 %), que en los grupos donde usaron grasa de cerdo. Este fenómeno puede deberse a que la enzima desaturasa se inclina a actuar sobre el ALA para la conversión a EPA y DHA, disminuyendo su acción sobre el LA por lo que disminuye la presencia de AA en el huevo. A pesar de que el aceite de sardina y las dietas contenían cantidades casi iguales de EPA y DHA (Cuadros 4 y 5), la deposición de DHA en el huevo es mucho mayor que 36 de EPA. Esto indica que en el huevo el DHA proviene de dos vías: el depósito directo a partir de la dieta y como resultado final de la elongación del ALA y EPA (Meluzzi et al., 1997), además del obtenido a través del metabolismo propio de las aves (González-Esquerra y Leeson, 2001). Esto explica también el hecho de que el contenido de ALA en el huevo, se incrementó conforme aumentó el nivel de inclusión del aceite marino en las dietas, a pesar de que el contenido de éste en las dietas era menor. Al respecto, González-Esquerra y Leeson (2001) hacen notar que a pesar de las altas concentraciones de EPA (11 %) en el aceite de Menhaden, en relación al DHA (9.1 %), la concentración de DHA encontrada en yemas de gallinas alimentadas con este aceite es mucho mayor que el EPA. Así, en aves alimentadas con 3 % de aceite de Menhaden, Huang et al. (1990) reportan un contenido de 29 y 192 mg/yema de EPA y DHA respectivamente. El mismo fenómeno ocurre cuando se incluye harina de pescado en la dieta de las aves. Nash et al. (1995) informa que gallinas alimentadas con 12 % de harina de Menhaden (10.2 % de la grasa total) presentaron concentraciones de 7 y 84 mg/yema de EPA y DHA respectivamente. La explicación a este hallazgo posiblemente se relaciona con el metabolismo de los AGω3 de las aves. Por otra parte, el incremento lineal en la deposición de los AGω3 en el huevo, observado en este estudio, coincide con lo señalado por González-Esquerra y Leeson (2000) quienes encontraron que existe una incorporación lineal de AGω3 en huevos de gallinas alimentadas con aceite de Menhaden en el rango de 0 a 6 %. Y resulta diferente a lo mencionado por Van Elswyk et al. (1995) y Van Elswyk (1997a) ya que ellos señalan que no hay apreciables diferencias en el enriquecimiento con AGω3 en huevos procedentes de gallinas alimentadas con 1.5 y 3 % de aceite de Menhaden. Adams et al. (1989) reportan concentraciones mas bajas de DHA en yemas de huevo procedentes de gallinas alimentadas con 6 % que con 3 % de aceite de Menhaden. Huang et al. (1990) encontraron más bajas concentraciones de DHA 37 en yemas procedentes de gallinas alimentadas con 2 % que con 3 % de aceite de Menhaden. La interferencia del metabolismo e incremento de otros componentes dietéticos ricos en AGω3, pueden explicar esta discrepancia (González-Esquerra y Leeson, 2001). En general, se observó que existe una tendencia a disminuir los AGω6 y a aumentar los AGω-3 conforme aumenta la inclusión del aceite de sardina, aunque los datos obtenidos fueron menores a los obtenidos en el trabajo de Van Elswyk (1997a). En un estudio realizado por Herber y Van Elswyk (1996), se probaron durante 4 semanas dietas con 1.5 % de aceite de Menhaden y 2.4 % de una microalga rica en DHA. Se obtuvo un total de AGω-3 de 9.4 y 9.5 % mg/g de yema, respectivamente de los que el 86 % es DHA. Esto equivale a un contenido total de AGω3 de 155 a 165 mg/huevo en el primer tratamiento y 160-170 mg en el segundo. Van Elswyk et al. (1994) con 1.5 % de aceite de Menhaden en una ración de gallinas ponedoras, obtuvo una deposición de aproximadamente 180 mg del total de ácidos grasos ω3 por yema. Esta misma autora menciona que esta cantidad es semejante a la encontrada en una ración de pescado, lo que quiere decir que un simple huevo proveniente de gallinas en cuya ración se incluyera aceite de pescado, podría sustituir una ración de pescado en cuanto a su contenido de ácidos grasos. Hargis et al. (1991), al incorporar AGω-3, en la yema del huevo como respuesta a un tratamiento de dos semanas, con una dieta enriquecida con 3 % de aceite de Menhaden, obtuvieron huevos con un promedio de 190 mg de AGω3, de los que el EPA y DHA componen el 89 % del total. En el presente trabajo, con 3 % de aceite de sardina, se obtuvieron 950 mg de AGω-3 en 100g de huevo liofilizado, equivalentes a 132 mg en un huevo de 60 g de los cuales el 93 % son EPA y DHA. 38 Con 1.5 % de aceite de sardina se encontró un total de AGω3 equivalente a 103 mg/huevo, de los que el 85 % es DHA. Estos datos coinciden con los encontrados por Van Elswyk (1997a), quien incorporó a las dietas 0.5, 1.5 y 3 % de aceite de Menhaden durante 4 semanas, obteniendo con 0.5 %, un total de 91, 146 y 132 mg de AGω-3 en yema durante la primera, tercera y cuarta semanas del estudio; con 1.5 % obtuvo 134, 178 y 210 mg/yema. Y por último, con 3 %, obtuvo 151, 234 y 232 mg/yema. La British Nutrition Foundation (2000) sugiere que, el consumo diario de 1 g de EPA+DHA, reduce las muertes por enfermedades cardiovasculares en un 20 %. El consumo de un huevo “enriquecido” con AGω3, proveniente de gallinas alimentadas con 3 % de aceite de sardina en sus dietas puede proveer el 16 % de este requerimiento diario y en niños casi el 30 % del requerimiento diario de DHA. La proporción ω6:ω3 obtenida en todos los tratamientos con aceite de pescado, es buena (Figura 6), tomando en cuenta que Simopoulos (2000) sugiere que la proporción ideal de es de 1 a 2:1 ya que tanto los ω6 como los ω3 están implicados en la producción de eicosanoides, prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, y aunque ambos grupos tienen efectos opuestos, un balance adecuado es esencial para mantener la salud, ya que este balance va a determinar el tipo y cantidad de eicosanoides en el organismo y de esta forma regular la respuesta inflamatoria. 5.3 Evaluación sensorial Respecto a la preferencia por el color de la yema, los resultados indican que este atributo no se vio afectado con la inclusión del aceite de sardina en la dieta de las aves. 39 En cuanto al olor del huevo, los resultados mostraron que para los panelistas este atributo les fue indiferente. Aunque el calor al que se exponen los huevos al momento de prepararlos, incrementa la volatilidad de compuestos característicos en los aceites de pescado (Hargis y Van Elswyyk, 1993), no hubo mucha percepción de tales compuestos por parte de los panelistas. Respecto al sabor, el huevo proveniente del tratamiento con 0.5 % de aceite de sardina fue aceptado totalmente por los panelistas, pero el de 3 % fue rechazado por algunos, expresando personalmente que percibieron un ligero sabor a pescado, pero sin llegar a ser desagradable según la escala hedónica, ya que no lo calificaron como “desagradable” en ningún caso. Este hecho coincide con lo encontrado por Van Elswyk (1995), quien al incluir 3 % de aceite de Menhaden en la ración de ponedoras, los panelistas detectaron un efecto negativo sobre el sabor del huevo reportado como “ligero sabor a pescado”. Van Elswyk (1997b) indica que el sabor a pescado se debe a la presencia de peróxidos, producto de la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados y que la presencia de estos compuestos amenaza el valor nutritivo del huevo, la vida de anaquel y su sabor. Esto es debido a que el incremento de AGω3 en el huevo, aumenta su susceptibilidad a la peroxidación, comprometiendo la estabilidad oxidativa del huevo. Por lo tanto, el riesgo de que se oxiden los lípidos es mayor en huevos enriquecidos con AGω3 que los que únicamente contienen altas cantidades de ácido linolénico. Van Elswyk et al. (1994), menciona que el depósito de ácidos grasos ω3 en más de 200 mg por yema, da como resultado alteraciones detectables en el sabor. En este estudio, la cantidad total de AGω3 obtenida en el tratamiento con 3 % de aceite de sardina, equivale 130 mg/huevo fresco, aún así, el sabor a pescado si fue detectado por algunos panelistas, posiblemente como consecuencia de una oxidación en el alimento o en el aceite de sardina utilizado. 40 Oh et al., (1991) encontraron que, con 10 % de aceite de pescado, los huevos obtenidos eran desagradables en cuanto a sabor. Igualmente, Herber y Van Elswyk (1996), mencionan que al incorporar 6 % de aceite de Menhaden en la dieta de gallinas ponedoras los panelistas detectaron un ligero sabor desagradable en el huevo. Herber y Van Elswyk (1996), probaron durante 4 semanas dietas con 1.5 % de aceite de Menhaden, 2.4 % y 4.8 % de una microalga (rica en DHA); obteniendo concentraciones similares de AGω3, con 1.5 % de aceite de Menhaden y 2.4 % del alga (9.4 y 9.5 % mg/g de yema) y de DHA (8.1 y 8.8 mg/g de yema). Cuando se evaluaron sensorialmente, en ambos tratamientos el huevo fue aceptado por los consumidores. Estos autores concluyen que usando algas marinas a niveles de 4.8 %, se lograría una incorporación de AGω3 similares a las encontradas cuando se incorpora 3 % de aceite de Menhaden a las dietas pero no disminuye la calidad sensorial del huevo en cuanto al sabor. Los lípidos no son los únicos responsables del sabor a pescado, al parecer existe una fracción no lipídica que interactúa con algunos compuestos lipídicos produciendo ese sabor a pescado (Leskanich y Noble, 1997). Los compuestos volátiles aparentemente juegan un papel importante en la formación de olores y sabores en productos enriquecidos con AGω3 en general (González-Esquerra y Leeson, 2001). Van Elswyk et al. (1995) proponen que los cambios en las concentraciones de los compuestos volátiles pueden ser responsables del sabor a pescado en el huevo. Para probar cómo los volátiles pueden influenciar las características sensoriales del huevo, González-Esquerra y Leeson (2000) probaron huevos de gallinas alimentadas con 2 % de aceite de Menhaden deodorizado comparado contra la misma proporción de aceite de Menhaden regular. La deodorización es un proceso en que la mayoría de los volátiles son eliminados. Estos autores encontraron que la deodorización no 41 aminoró el típico sabor a pescado encontrado en huevos provenientes de gallinas alimentadas con aceite de Menhaden regular a esas concentraciones. Hay discrepancia entre los autores respecto a que niveles de aceite de pescado o harina de pescado puedan ser aceptables en términos de la calidad sensorial del huevo. González-Esquerra y Leeson (2001) consideran que es razonable usar niveles de 1 a 1.5 % de aceite de pescado para que el huevo sea aceptado, dependiendo de la región en que se consume. Así, por ejemplo, en Chile o China son aceptados altos niveles de harina de pescado en las dietas de las aves, consecuentemente los consumidores están habituados al sabor y olor de los productos con altas concentraciones de AGω3. Se puede decir que el huevo “ideal” enriquecido con AGω3 podría ser el que contenga las concentraciones mas altas posibles de AGω3, sin afectar su calidad sensorial (González-Esquerra y Leeson, 2001). 5.4 Variables de producción La producción de huevo obtenida en el presente estudio estuvo entre 83 a 87 %, lo que significa que la producción de huevo no fue afectada por la inclusión de aceite de sardina, hecho que coincide con lo reportado por Hargis et al. (1991), Baucells et al. (2000) y Meluzzi et al. (2000). Lo que quiere decir que la inclusión de aceite de sardina, hasta 3 %, no afecta la producción de huevo. En cuanto a la reducción en el peso del huevo observada en el tratamiento con 3 % de aceite de sardina. Hargis et al. (1991) y Van Elswyk et al. (1995), encontraron que el tamaño del huevo, especialmente el de la yema, disminuye al utilizar harinas o aceites de pescado en la dieta en comparación con el uso de aceites vegetales. Herber y Van Elswyk (1996), observaron un decremento en el peso del huevo en 42 gallinas alimentadas con 1.5 % de aceite de Menhaden. Van Elswyk et al. (1995) reportó huevos más chicos en gallinas alimentadas con 165 mg de DHA proveniente de algas marinas. Otros autores, como Marshal et al. (1994a), Van Elswyk et al. (1994) y Ayerza y Coates (1999), también han reportado cambios en el peso del huevo asociado con inclusión de AGω3 en la dieta. Van Elswyk (1997b) atribuye este fenómeno a que al haber un decremento en los triglicéridos del ave, debido a un mayor consumo de AGω3, se limita la disponibilidad de los lípidos para la formación de la yema, disminuyendo su tamaño y por lo tanto su peso. El consumo de alimento no fue afectado por la inclusión de aceite de sardina en las dietas. La disminución observada en el consumo de alimento en el tratamiento con 3 % de AS, pudo deberse a que el alimento, por su alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados sufrió una oxidación, provocando una disminución en la palatabilidad de las gallinas. El índice de conversión alimenticia fue mas bajo en el tratamiento con 3 % de AS posiblemente debido a que en este período fue menor el consumo de alimento. Baucells et al. (2000) al incorporar 4 % de aceite de pescado en las dietas encontró un índice de conversión alimenticia de 2.2 y reporta que este índice no fue alterado por la inclusión del aceite. La masa de huevo representa la producción de huevos en peso y no en cantidad ya que toma en cuenta el porcentaje de postura y el peso del huevo. En la quinta semana, la masa de huevo, fue ligeramente mas baja en el grupo testigo, seguramente como reflejo del porcentaje de postura encontrado. Este factor tampoco es influenciado por la presencia de aceite de sardina en las dietas. 43 5.5 Calidad de huevo La altura de albúmina está considerada como uno de los principales criterios de evaluación de la calidad interna del huevo una vez abierto, ya que la altura está dada por una mayor viscosidad de la albúmina, lo que es común en un huevo fresco de buena calidad (Quintana, 1999). Por lo tanto, los huevos obtenidos en el presente trabajo, en todos los tratamientos, reflejan características físicas aceptables para el consumidor que no fueron alterados por la presencia del aceite de sardina. La medición de las unidades Haugh es una forma de evaluar la calidad interna del huevo; se define como la altura de la albúmina, expresada logarítmicamente y corregida con el peso del huevo (Quintana, 1999). En el presente estudio, las Unidades Haugh no se vieron afectadas por la inclusión de aceite de sardina. Cabe mencionar que en todos los tratamientos, el huevo alcanzó valores superiores a las 79 unidades, por lo que de acuerdo a la clasificación que presenta Quintana (1999), estos huevos alcanzaron una clasificación de “AA” (excelente). El peso del cascarón y su grosor son dos factores importantes en la industria avícola ya que existen pérdidas cuantiosas debidas a cascarones débiles. En el presente estudio podemos observar que la presencia de AS no influyó en el peso ni en el grosor del cascarón. 44 6. CONCLUSIONES En este estudio y bajo las condiciones experimentales en que fue llevadas a cabo, se concluye lo siguiente: ♣ La inclusión de hasta 3 % de aceite de sardina en la dieta de las gallinas ponedoras no modifica la concentración de colesterol ni de los lípidos totales en el huevo. ♣ La inclusión de 1.5 y 3 % de aceite de sardina en las dietas de gallinas ponedoras, incrementa notablemente la concentración de AGω3 en el huevo pero afecta negativamente el sabor del mismo. ♣ La inclusión de hasta 3 % de aceite de sardina en la dieta de gallinas ponedoras no afecta las variables productivas ni la calidad del huevo. ♣ La inclusión de hasta 3 % de aceite de sardina en la dieta de gallinas ponedoras no afecta el olor del huevo ni el color de la yema. Por lo tanto, se sugiere incluir menos de 1.5 % de aceite de sardina en la dieta de gallinas ponedoras con el fin de obtener huevos enriquecidos con ácidos grasos ω3. 45 7. RECOMENDACIONES ♣ Sería conveniente prolongar durante mas tiempo el experimento con aceite de sardina para determinar si efectivamente este aceite disminuye las concentraciones de colesterol en el huevo de manera significativa. ♣ Es recomendable en futuros estudios controlar las condiciones de almacenamiento de las dietas de las aves para evitar la oxidación de las mismas. ♣ También sería recomendable monitorear la rancidez tanto del alimento como de las materias primas usadas en su elaboración. 46 8. LITERATURA CITADA Ackman, R. (1988). Oils and Fats Group International Lecture. The year of the fish oils. Chemistry and Industry. Pags. 139-145. Adams, R.L.; Pratt, D.E.; Lin, J.H. and Stadelman W.J. (1989). Introduction of omega3 polyunsaturated fatty acids into eggs. Poultry Science 68 (Suppl. 1:166 Abstract. American Heart Association (2001). Cardiovascular disease statistics. Heart and Stroke Guide. http://www.americanheart.org. Abril, 2001. Anuario Estadístico de Pesca (2000). 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PREPARACIÓN DE LAS DIETAS ENSAYO CON GALLINAS 0% 0.5 % 1.5 % 3% VARIABLES DE PRODUCCIÓN Y CALIDAD DE HUEVO ANÁLISIS QUÍMICO DEL HUEVO EVALUACIÓN SENSORIAL DEL HUEVO • Colesterol, Lípidos totales • • Color de la yema Ácidos grasos LA, ALA, • Olor y Sabor del huevo AA, EPA y DHA ANÁLISIS ESTADISTICO 58 ANEXO 2 PRUEBA DE NIVEL DE AGRADO PARA HUEVO NOMBRE__________________ FECHA _______________ Instrucciones: Califique las muestras según la escala que a continuación se les presenta: Gusta mucho ____________________ 1 Gusta poco ______________________ 2 Disgusta Poco ___________________ 4 Disgusta mucho __________________ 5 POR FAVOR TOME UN POCO DE PAN Y AGUA ENTRE MUESTRA Y MUESTRA MUESTRA nnn nnn nnn nnn PRODUCTO CRUDO COLOR PRODUCTO COCIDO COMENTARIOS OLOR SABOR ______________________________________ ______________________________________ GRACIAS 59