indice de contenidos - Repositorio Académico

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
"Construcción de vacunas de ADN de Salmonella
enterica serovar Enteritidis y evaluación de la respuesta
inmune generada en un modelo murino"
Tesis para Optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica
Área de Especialización: Bioquímica Ambiental
Memoria para Optar al Título de Bioquímico
PAULA ELIZABETH VELOZO HERMOSILLA
Directores de Tesis
Dra. Lucía Inés Contreras Osorio
Dr. Carlos Alberto Santiviago Cid
SANTIAGO- CHILE
2010
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE MAGISTER
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas que la Tesis de Magister presentada por el candidato:
PAULA ELIZABETH VELOZO HERMOSILLA
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar
al grado de Magister en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental
y al título de Bioquímica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día
_____________________del 2010.
Directores de Tesis:
Dra. Lucía Inés Contreras Osorio
___________________________
Dr. Carlos Alberto Santiviago Cid
___________________________
Comisión Informante de Tesis:
Dr. Javier Puente (Presidente)
___________________________
Dra. Daniela Seelenfreund
___________________________
Dr. Roberto Vidal
___________________________
"Los animales no se comunican con el fin de exhibirse, sino con el fin de la
gestión de un entorno social."
West y King
Ecology and evolution of acoustic communication in birds
Agradecimientos
Esta memoria representa el término de largos años de estudio, durante los
cuales he recibido el apoyo y confianza de familiares y amigos que me han
acompañado en cada momento.
Ha sido el proceso de crecer como persona, aprender valores,
conocimientos y desafíos. No podría haber llegado a esta etapa de investigación si
no hubiese sido por el apoyo siempre presente de todos ellos.
Quiero expresar mis agradecimientos personales en primera instancia a mis
padres y hermanos, quienes han sido un pilar fundamental en todo aspecto de mi
vida, por su continuo apoyo y esfuerzo, entregándome toda la energía y ánimo
para continuar en los momentos difíciles.
Agradecer a la Dra. Inés Contreras y al Dr. Carlos Santiviago por permitirme
trabajar bajo su dirección, por su apoyo y preocupación constante, formación y
cariño.
A la Profesora Mercedes Zaldívar y al Dr. Sergio Álvarez por su disposición
y ayuda.
Agradecer también a la Dra. Cecilia Toro por permitirme realizar el trabajo
de tesis es su laboratorio.
A mis amigas y compañeras Alicia Marcoleta, Verónica Bravo, Ruby
Carrasco y Valeria Caballero por su guía, consejos y todos los gratos momentos
compartidos.
También quiero mencionar a mis grandes amigos Valentina Parra y Ernesto
Muños, quienes han estado conmigo todos estos años y son parte importante de
todo este largo proceso.
Finalmente, quiero agradecer a todos mis compañeros de carrera y grandes
amigos, ya que gracias a ellos las intensas horas de estudio... no se hicieron tan
intensas.
Esta tesis se realizó en el laboratorio de Biología Molecular del Programa
de Microbiología y Micología del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Facultad
de Medicina de la Universidad de Chile, bajo la dirección de los profesores Dres.
Inés Contreras O. y Carlos Santiviago C. El trabajo asociado a ratones se realizó
en conjunto con el profesor Dr. Ángel Oñate C. en el laboratorio de Inmunología
Molecular del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad de Concepción. Financiada por el Proyecto Anillo de
Investigación en Ciencia y Tecnología ADI 08/2006.
INDICE DE CONTENIDOS
Pág.
INDICE DE CONTENIDOS
vi
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
ix
ABREVIATURAS
xi
RESUMEN
xiii
SUMMARY
xv
1. INTRODUCCION
1
1.1 Epidemiología de Salmonella enterica serovar Enteritidis
1
1.2 Salmonella Enteritidis en aves y su transmisión zoonótica al hombre
2
1.3 Mecanismos moleculares de patogenicidad de S. Enteritidis
3
1.4 Inmunidad frente a Salmonella
4
1.5 Estrategias de control de la infección por S. Enteritidis
4
1.6 Nuevas estrategias de protección inmune. Vacunas de ADN
5
1.7 Genes inmunogénicos de S. Enteritidis
6
1.7.1 Isla genómica SPI-19
6
1.7.2 Isla genómica ΦSE14
7
1.8 Hipótesis
9
1.9 Objetivo General
9
1.10 Objetivos Específicos
9
2. MATERIALES Y METODOS
10
2.1 Reactivos
10
2.2 Cepas bacterianas
12
2.3 Líneas celulares
12
2.4 Modelo animal
12
2.5 Medios y condiciones de cultivo bacteriano
13
2.6 Medios y condiciones de cultivo celular
13
2.7 Plasmidios
14
2.8 Partidores
14
vi
2.9 Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag
15
2.9.1 Extracción de ADN plasmidial
15
2.9.2 Cuantificación de ADN
16
2.9.3 Electroforesis en gel de agarosa
16
2.9.4 Digestión con enzimas de restricción
16
2.9.5 Obtención de productos de PCR
17
2.9.6 Reacciones de ligación
17
2.9.7 Transformación por electroporación
18
2.9.8 Purificación de ADN desde gel de agarosa
18
2.10 Construcción de vectores de expresión
19
2.10.1 Extracción de ADN genómico
19
2.10.2 Obtención de los genes SEN1395 y SEN1002 para el
19
clonamiento
2.11 Evaluación de la producción de proteínas recombinantes en E. coli
20
2.11.1 Ensayo de inducción con IPTG
20
2.11.2 Separación electroforética de proteínas
20
2.11.3 Tinción de gel de proteínas con azul de Coomassie
21
2.11.4 Western blot
21
2.11.5 Extracción de proteína recombinante
21
2.11.6 Cuantificación de proteínas
22
2.12 Evaluación de producción proteica in vitro en células eucariontes
22
2.12.1 Estandarización de la técnica de transfección
22
2.12.2 Ensayo de transfección en células HEK
23
2.12.3 Lisis celular
23
2.13 Caracterización de vacunas in vivo en ratones BALB/c
2.13.1 Vacunación de ratones BALB/c
24
24
2.13.1.1 Extracción de plasmidio a gran escala
24
2.13.1.2 Inmunización
25
2.13.2 Linfoproliferación
25
2.13.3 Cuantificación de citoquinas
25
2.13.4 Desafío
26
vii
2.14 Análisis estadístico
3. RESULTADOS
3.1 Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag
3.1.1 Construcción de los plasmidios intermediarios pLTS y
pVAXFlag/bla.
3.1.2 Eliminación de gen bla y generación del vector pVAXFlag.
3.2. Construcción de vectores de expresión. Vacunas de ADN
26
27
27
27
28
30
3.2.1 Preparación de insertos (genes SEN1002 y SEN1395).
30
3.2.2 Clonamiento de SEN1002 y SEN1395 en pVAXFlag.
Construcción de vacunas.
31
3.3. Evaluación de expresión de proteínas in vitro.
37
3.3.1 Expresión de proteínas en bacteria.
37
3.3.2 Expresión de proteínas en células eucariontes.
37
3. 4. Caracterización de las vacunas in vivo en ratones BALB/c
41
3.4.1 Planificación temporal de los ensayos.
41
3.4.2 Respuesta inmune
42
3.4.2.1 Linfoproliferación
43
3.4.2.2 Cuantificación de citoquinas secretadas
43
3.4.3 Desafío con LK5 de ratones BALB/c inmunizados
46
4. DISCUSION
47
5. CONCLUSIONES
53
6. REFERENCIAS
54
viii
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Pág.
Tabla 1
Cepas bacterianas utilizadas en la presente Tesis
12
Tabla 2
Líneas celulares utilizadas en esta Tesis
12
Tabla 3
Grupos de ratones Balb/c utilizados en esta Tesis
13
Tabla 4
Plasmidios utilizados en esta Tesis
14
Tabla 5
Partidores utilizados en esta Tesis
14
Tabla 6
Secuenciación de pVAXFlag
34
Tabla 7
Secuenciación de pVAXFlag/SEN1002
35
Tabla 8
Secuenciación de pVAXFlag/SEN1395
36
Tabla 9
Condiciones de estandarización de transfección
39
Tabla 10
Recuento de Salmonella enterica LK5 a partir del bazo de
46
ratones vacunados
Figura 1
Ciclo infectivo de Salmonella enterica serovar Enteritidis
2
Figura 2
Esquema representativo de una vacuna de ADN
6
Figura 3
Esquema de la organización genética de la isla genómica
7
SPI-19 en S. Enteritidis
Figura 4
ΦSE14
8
Figura 5
Diagrama de residuos antigénicos de la proteína SEN1395
8
Figura 6
Diagrama de la deleción del gen de resistencia a kanamicina
27
del plasmidio pSUB11 y la construcción del plasmidio pLTS
Figura 7
Diagrama de vectores de expresión
28
Figura 8
Comprobación de la correcta construcción de los plasmidios
29
Figura 9A
Esquema de partidores de PCR para clonamiento
30
Figura 9B
Productos de PCR para clonamiento
30
Figura 10
Esquema de clonamiento del fragmento de interés en
31
pVAXFlag y la proteína recombinante generada por la
transcripción y traducción en procariontes y eucariones
Figura 11
PCR de confirmación de la transformación en DH5α con los
32
plasmidios construidos
ix
Figura 12
Confirmación de las construcciones por tamaño plasmidial
33
Figura 13
Expresión de proteínas recombinantes en bacteria
38
Figura 14
Estandarización del ensayo de transfección en células
40
HEK293 con pVAXFlag/GFP
Figura 15
Expresión de proteínas recombinantes en HEK293
41
Figura 16
Planificación temporal de ensayos
42
Figura 17
Ensayo de Linfoproliferación
44
Figura 18
Cuantificación de citoquinas
45
Figura 19
Secuencia de pVAXFlag, nucleótidos 661 al 960
48
x
ABREVIATURAS
AL
:
Agar Luria
Amp
:
Ampicilina
C
:
Celsius
CL
:
Caldo Luria
DO
:
Densidad óptica
g
:
Gramos
g/l
:
Gramos por litro
IM
:
Intramuscular
IN
:
Intranasal
IPTG
:
Isopropil-β-D-tiogalactósido
Kan
:
Kanamicina
kb
:
Kilobases
kDa
:
Kilodalton
KZ
:
Kozak
l
:
Litros
M
:
Molar
mg
:
Miligramos
min
:
Minutos
ml
:
Mililitros
ng
:
Nanogramos
p/v
:
Peso/volumen
pb
:
Pares de bases
RBS
:
Sitio de unión a ribosoma (Ribosome Binding Site)
rpm
:
Revoluciones por minuto
SC
:
Subcutánea
SD
:
Shine-Dalgarno
SDS
:
Dodecilsulfato sódico (sodium dodecyl sulfate)
seg
:
Segundos
SFB
:
Suero fetal bovino
u/μl
:
Unidades por microlitro
xi
UV
:
Ultra Violeta
V
:
Volts
v/v
:
Volumen/volumen
μg
:
Microgramos
μl
:
Microlitros
xii
RESUMEN
Salmonella enterica serovar Enteritidis es el principal agente etiológico de la
salmonelosis, una enfermedad de transmisión alimenticia que afecta a diversas
especies animales y se transmite al hombre a través del consumo de productos
avícolas contaminados, principalmente huevos. La salmonelosis constituye en la
actualidad un problema global de salud pública y un riesgo importante para la
economía asociada a la producción animal. Por este motivo se han desarrollado
estrategias de control para S. Enteritidis que incluyen terapias antimicrobianas y
vacunación de las aves de postura con bacterias muertas o atenuadas. Sin embargo,
la creciente resistencia a antibióticos por parte de algunas cepas de Salmonella y la
limitada eficacia de las vacunas existentes han impulsado el estudio de los
mecanismos moleculares de patogenicidad de la bacteria para desarrollar nuevos
métodos de control.
La isla de patogenicidad ΦSE14 (presente sólo en S. Enteritidis) contiene 21
ORFs, dentro de los cuales se encuentra SEN1395, que codifica una proteína con
dominios pertenecientes a una nueva superfamilia de lisozimas. Por su parte, la isla
SPI-19 (presente en los serovares Enteritidis, Agona, Dublin y Gallinarum) contiene
una serie de genes que codifican proteínas asociadas a un sistema de secreción tipo
6 (T6SS). Entre estos genes se encuentra SEN1002, que codifica la proteína Hcp
que posee propiedades inmunogénicas. En este trabajo, se escogieron los genes
SEN1002 y SEN1395 de S. enterica serovar Enteritidis para desarrollar vacunas de
ADN. De esta manera, se postuló la hipótesis “Vacunas de ADN diseñadas a partir
de los genes SEN1002 y SEN1395 de S. Enteritidis inducen una respuesta inmune
protectora en ratones BALB/c”.
Para construir las vacunas de ADN se amplificaron los ORFs y se clonaron en
el vector comercial pVAX1 modificado por la inserción del gen que codifica el epítope
3xFlag (pVAX1-FLAG). Los ORFs SEN1002 y SEN1395 se clonaron de tal forma que
este epítope quedara fusionado al extremo 3’ de las proteínas recombinantes,
pudiendo ser detectadas con el anticuerpo comercial anti-Flag M2.
xiii
Una vez construidas las vacunas, se detectó la producción de las proteínas
recombinantes fusionadas a Flag (SEN1002/Flag y SEN1395/Flag) tanto en bacterias
(E. coli BL21 (DE3)) como en células eucariontes (HEK293) mediante Westernblot,
comprobándose la funcionalidad de los vectores.
Las vacunas se probaron en un modelo in vivo (ratones BALB/c). Para esto, se
inocularon seis ratones vía subcutánea, intramuscular e intranasal en las semanas
cero, dos y tres del ensayo, respectivamente, con 100 μg de plasmidio o con PBS
solo, mientras que la inoculación con bacterias se realizó vía oral con 108 unidades
formadoras de colonias en los mismos tiempos. Al cabo de dos semanas se
obtuvieron los bazos de los ratones inmunizados, se preparó una suspensión celular
y posterior a la estimulación con SEN1002/Flag, SEN1395/Flag, PBS, vector vacío o
lisado de bacteria, se midió la linfoproliferación mediante la incorporación de timidina
tritiada (H3) y se cuantificó mediante ELISA la secreción de las citoquinas IFNγ e IL-4.
Los resultados mostraron que en un cultivo in vitro de linfocitos obtenidos de
ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1002, se produjo un aumento en la
proliferación luego de ser estimulados con la proteína SEN1002/Flag. En estos
linfocitos,
y
también
en
los
obtenidos
de
los
ratones
vacunados
con
pVAXFlag/SEN1395 (estimulados con SEN1395/Flag), se detectó un aumento
considerable en los niveles de INFγ secretados, así como bajas cantidades de IL-4,
demostrando que las construcciones son capaces de generar una respuesta inmune
de tipo celular Th1. No obstante, en las condiciones estudiadas en este trabajo, esta
respuesta no fue capaz de generar protección frente a un desafío con LK5 en ratones
inmunizados.
xiv
SUMMARY
Salmonella enterica serovar Enteritidis is the main cause of salmonellosis, a
food-borne disease that affects several animal species. This disease is transmitted
from poultry to humans through the consumption of contaminated poultry products,
where eggs are the main vehicle of infection. Nowadays, Salmonellosis is a global
public health issue and a significant risk in the economy associated with animal
production. To affront this situation, control strategies for S. Enteritidis have been
developed, including antimicrobial therapy and vaccination of laying hens with killed
or attenuated bacteria. However, the growing resistance to antibiotics by some strains
of Salmonella and the limited effectiveness of existing vaccines has motivated the
study of the molecular mechanisms of bacterial pathogenicity to develop new control
methods.
ΦSE14 pathogenicity island (only present in S. Enteritidis) has 21 ORFs. One
of these is SEN1395 that encodes a protein containing a domain from a new
superfamily of lysozymes. On the other hand, SPI-19 pathogenicity island (present in
Enteritidis, Agona, Dublin and Gallinarum serovars) contains several genes that
encode type 6 secretion system associated proteins (T6SS). Within these genes,
SEN1002 encodes Hcp, a protein with immunogenic properties.
In this work, genes SEN1002 and SEN1395 were selected to develop DNA
vaccines. The following hipótesis was proposed: “DNA vaccines designed from S.
Enteritidis SEN1395 and SEN1002 genes induce a protective immune response in
BALB/C mice.”
To construct the DNA vaccines, the corresponding ORFs were amplified by
PCR and cloned into commercial vector pVAX1 modified by the insertion of the gene
encoding the 3xFlag epitope (pVAX1-FLAG). Orfs SEN1002 and SEN1395 were
cloned in such a way that 3xFlag epitope was fused to the 3’ end of the recombinant
protein, to be later detected by the anti-Flag M2 antibody.
After vaccines were constructed, the expression of the Flag fused recombinant
proteins (SEN1002/Flag y SEN1395/Flag), both in bacteria (E. coli BL21 (DE3)) and
xv
eukaryotic cells (HEK293), were assessed by Western blot, confirming the
functionality of the constructs.
The vaccines were assayed in an in vivo model using BALB/c mice. To do this,
six mice were inoculated intradermically, intramuscular and intranasally at weeks
zero, two and three, respectively, with 100 μg of each plasmid or with PBS while the
bacteria inoculation was done by oral way with 108 colony forming units, at the same
time points. After two weeks, the mice were sacrified, their spleens were removed
and homogenized. The cell suspensions were stimulated with SEN1002/Flag,
SEN1395/Flag, PBS, empty vector or bacterial lysate, and linfoproliferation was
measured by H3 incorporation. The production of IFNγ and
IL-4 was quantified by
ELISA.
The results showed an increased proliferation of linfocites obtained from mice
vaccinated with pVAXFlag/SEN1002 when stimulated with the recombinant protein
SEN1002/Flag. Also, linfocites obtained from these mice, as well as those obtained
from mice vaccinated with pVAXFlag/SEN1395 (stimulated with SEN1395/Flag)
produced high levels of IFNγ, but low levels of IL-4. These results indicate that
recombinant DNA vaccines constructed in this study were able to induce a Th1
cellular immune response. However, under the tested conditions, this response was
not able to give protection against a challenge in LK5 mmunized mice.
xvi
Introducción
1. INTRODUCCION
1.1 Epidemiología de Salmonella enterica serovar Enteritidis
La salmonelosis es una enfermedad de transmisión alimenticia, asociada
principalmente a productos de origen animal, que constituye un problema global de
salud pública y un riesgo importante para la economía asociada a la producción
animal. Su incidencia aumenta mundialmente y se estima que cerca de 400.000
personas mueren anualmente de salmonelosis aguda, principalmente niños,
ancianos y personas inmunocomprometidas, especialmente en países en vías de
desarrollo (Dunkley y cols., 2009).
Esta enfermedad es causada por bacterias del género Salmonella, el cual
comprende dos especies (S. bongori y S. enterica) y agrupa a más de 2500
serovares (Popoff y cols., 2003, Brenner y cols., 2000). Entre los principales
serovares de S. enterica se destaca el serovar Enteritidis, el cual es capaz de infectar
un amplio rango de hospederos que incluye roedores, aves de corral, reptiles y
humanos, entre muchos otros.
Para los humanos, el principal vehículo de infección por S. Enteritidis son los
huevos de las aves de corral (Galan y cols., 1996, Hidalgo-Vila y cols., 2007, Dunkley
y cols., 2009), infección cuya principal manifestación clínica es una enterocolitis
(inflamación de intestino y colon) y/o gastroenteritis (inflamación del estómago e
intestinos) con diarrea, fiebre y dolor abdominal, que se asocian a una incorrecta
manipulación y consumo de productos avícolas contaminados (Luber, 2009). Desde
hace ya más de 10 años, S. Enteritidis es la principal causa de la salmonelosis en los
humanos (Fica y cols., 2001, Dunkley y cols., 2009). En Chile, este serovar aparece
como la Salmonella aislada con mayor frecuencia en muestras clínicas humanas,
dejando atrás a S. typhi (Prat y cols., 2001, Fica y cols., 2001, Prado y cols., 2002).
1
Introducción
1.2 Salmonella Enteritidis en aves y su transmisión zoonótica al hombre
El ciclo infectivo de S. Enteritidis se inicia con la contaminación de gallineros a
través de diversos vectores, incluyendo roedores e insectos. La bacteria sobrevive y
se multiplica en el corral, infectando a las gallinas por vía oral. En ellas, S. Enteritidis
coloniza e invade el epitelio intestinal y órganos internos, principalmente bazo,
hígado y oviductos. En este último, se presentan dos posibles rutas de
contaminación del huevo. Una de ellas es la transmisión vertical, que consiste en la
contaminación directa de yema, clara y membranas de la cáscara, mientras que la
otra alternativa es la transmisión horizontal, asociada al contacto de los huevos con
heces fecales de la gallina durante o después de la postura (Gantois y cols., 2009,
Callaway y cols., 2008).
En aves adultas (más de dos semanas de vida), la infección por S. Enteritidis
es asintomática y crónica, mientras que en animales jóvenes se genera una
enfermedad sistémica severa que conduce a la muerte debido a una combinación de
anorexia y deshidratación causada por una diarrea difusa. Esto es debido a que a
una edad temprana, las aves carecen de una flora intestinal adecuada para competir
con S. Enteritidis (Guard-Petter, 2001).
En la Figura 1 se muestra un esquema de la infección de aves por S.
Enteritidis y su transmisión zoonótica al hombre.
Figura 1. Ciclo infectivo de
Salmonella enterica serovar
Enteritidis. Transmisión zoonótica al
hombre.
2
Introducción
1.3 Mecanismos moleculares de patogenicidad de S. Enteritidis
Los mecanismos moleculares de patogenicidad de la especie Salmonella
enterica son complejos e involucran una gran variedad de genes, generalmente
agrupados en regiones denominadas islas genómicas (IGs). Estas islas se definen
como segmentos de ADN adquiridos por transferencia horizontal que se insertan en
el cromosoma bacteriano, usualmente mediado por la acción de elementos genéticos
móviles como bacteriófagos (Groisman y Ochman, 1996). Estas secuencias pueden
codificar factores de virulencia o vías metabólicas entre otros, otorgando
características que le permitan realizar un ciclo infectivo exitoso o directamente
contribuir a la virulencia. En este caso particular, las IGs se denominan islas de
patogenicidad.
Para alcanzar el sitio de colonización, S. Enteritidis tiene mecanismos
evolucionados de evasión de los mecanismos de defensa de su hospedero
basándose principalmente en proteínas reguladoras, chaperonas, factores de
transcripción y traducción, proteínas de envoltura y fimbrias (Foley y cols., 2008,
Dunkley y cols., 2009). Luego, es capaz de colonizar el intestino, donde accede a las
células epiteliales normalmente no fagocíticas a través de un sistema de secreción
tipo III (T3SS) codificado en la Isla de Patogenicidad 1 de Salmonella (SPI-1). Este
sistema inyecta proteínas efectoras al citoplasma de la célula epitelial, produciendo
un reordenamiento del citoesqueleto que promueve la internalización de la bacteria
(McGhie y cols., 2009, Galan, 1999). Una vez en el interior de la célula, Salmonella
prolifera en el fagosoma para luego ser liberada al subepitelio, donde es fagocitada
por macrófagos y células dendríticas residentes.
En humanos, la bacteria genera normalmente una inflamación local debido a la
liberación de citoquinas proinflamatorias por los macrófagos, las cuales reclutan
neutrófilos polimorfonucleares que finalmente eliminan la infección. No obstante, en
niños, ancianos e individuos inmunocomprometidos puede ocurrir una infección
sistémica. En este caso, la bacteria prolifera en el interior de las células fagocíticas,
alcanza los nódulos linfáticos mesentéricos y desde ellos ingresa al torrente
sanguíneo, alcanzando los tejidos linfoides principales (bazo, hígado). En contraste,
S. Enteritidis genera una infección sistémica persistente y asintomática en aves.
3
Introducción
1.4 Inmunidad frente a Salmonella
Ante una infección por Salmonella, el hospedero desencadena tanto la
respuesta inmune humoral como celular, siendo esta última de mayor importancia
(Tam y cols., 2008). En el primer caso, las inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM
producidas en la mucosa intestinal y suero, se ven incrementadas durante la
salmonelosis (Lillehoj y cols., 2007). Desde el punto de vista de la inmunidad celular,
las citoquinas de la respuesta proinflamatoria Th1 son cruciales para la inmunidad
protectora frente a una infección primaria (Barrow, 2007). En este sentido, TNF-α e
IFN-γ juegan un papel importante en el control de la infección debido a la capacidad
de reclutamiento de células mononucleares y de activación de macrófagos,
respectivamente (Mastroeni y cols., 1998, Barrow, 2007). En la respuesta
inmunosupresora Th2, IL-4 e IL-10 son capaces de inhibir la defensa contra el
patógeno, por lo que se ven cuantitativamente disminuidas (Eckmann y cols., 2001,
Lin y cols., 2008). Cabe hacer notar que se ha descrito un aumento en la
linfoproliferación en respuesta a la vacunación de algunas aves con flagelina y LPS
de S. Enteritidis, indicando el desarrollo de la respuesta de memoria de células T
CD4+ específicas para los antígenos (Lillehoj y cols., 2007).
1.5 Estrategias de control de la infección por S. Enteritidis
La transmisión horizontal en el huevo es fácil de prevenir con medidas de
limpieza y desinfección de los huevos. No así la transmisión vertical, que requiere
disminuir la colonización intestinal o erradicar la bacteria del reservorio avícola. Una
vez infectado el ser humano, en la mayor parte de los casos la salmonelosis se
presenta como una enfermedad localizada y de corta duración, por lo que sólo se
combate la deshidratación. No obstante, en su forma más grave se requiere además
una terapia antimicrobiana, estrategia que se ha visto afectada debido al creciente
aumento de la resistencia a antibióticos por algunas cepas de Salmonella enterica
(Arlet y cols., 2006, Threlfall y cols., 2006, Velge y cols., 2005). Por estos motivos, el
control de la infección por S. Enteritidis se ha abordado mediante el diseño de
vacunas para aves de postura, utilizando estrategias convencionales como
generación de mutantes vivas atenuadas o bacterias muertas. En el primer caso, se
4
Introducción
ha demostrado la inducción de respuesta inmune celular, mientras que en el
segundo, se induce mayormente una respuesta inmune humoral. Sin embargo,
ambas alternativas sólo han tenido un éxito relativo debido a que no alcanzan a
proteger durante todo el período de producción avícola, que puede llegar a un
máximo de 25 meses (Covacevic y cols. 2008, Babu y cols., 2004, Betancor y cols.,
2005, Cerquetti y cols., 2000).
Los antecedentes mencionados nos presentan un panorama en el que se
hace indispensable la generación de nuevas vacunas, que otorguen una protección
efectiva y de larga duración, para prevenir la infección aviar y la transmisión de S.
Enteritidis al hombre.
1.6 Nuevas estrategias de protección inmune. Vacunas de ADN
En el campo del desarrollo de vacunas, una nueva e importante estrategia son
las vacunas de ADN, que consisten en ADN plasmidial que contiene un gen
codificante para una proteína inmunogénica de un patógeno (Figura 2). Este
plasmidio se inocula en un hospedero, donde el gen mencionado es transcrito y
traducido para inducir una respuesta inmune específica.
Estas vacunas tienen muchas ventajas por sobre los métodos tradicionales
como su fácil manipulación, bajos costos de producción, seguridad y flexibilidad. Esta
última relacionada a la posibilidad de utilizar diferentes tipos de genes
inmunogénicos, así como combinarlos simultáneamente para generar vacunas
multivalentes. Por otra parte, las desventajas del uso de estas vacunas consisten en
la posible integración al genoma del hospedero y activación de proto-oncogenes. Sin
embargo, estas desventajas sólo son teóricas, pues aún no han sido probadas
(Dhama y cols. 2008).
5
Introducción
Figura 2. Esquema representativo de
una vacuna de ADN. El plasmidio
recombinante
posee
un
promotor
eucarionte, un gen inmunogénico, una
secuencia señal de poliadenilación, un
origen de replicación bacteriano (ori) y un
gen de resistencia a antibiótico. Estos
dos últimos para permitir el crecimiento y
selección del plasmidio en bacterias
(modificado de Dhama y cols. 2008).
1.7 Genes inmunogénicos de S. Enteritidis
En este proyecto de Tesis se propone diseñar y evaluar la capacidad
protectora de dos posibles vacunas contra S. Enteritidis utilizando un modelo de
salmonelosis murina. Estas consisten en vacunas de ADN, diseñadas a partir de las
secuencias genómicas de marcos de lectura abiertos (ORFs) conservados,
presentes en dos islas genómicas de esta especie. Estas islas, identificadas como
SPI-19 e ΦSE14, se describen a continuación.
1.7.1 Isla genómica SPI-19
La isla genómica SPI-19, identificada por nuestro laboratorio mediante un
análisis bioinformático, está presente sólo en los serovares Agona, Dublin,
Weltevreden, Gallinarum y Enteritidis. En este último serovar, esta isla tiene una
extensión de ~14kb (Figura 3) y su secuencia presenta genes que codifican algunos
componentes de un sistema de secreción tipo 6 (T6SS). Entre estos, se encuentra el
gen SEN1002 que codifica una proteína de 28 kDa denominada “haemolysin coregulated protein” (Hcp) (Williams y cols., 1996). Esta proteína, descubierta en Vibrio
cholerae, polimeriza formando anillos hexaméricos que generan nanotubos. Se
piensa que estas estructuras forman parte del sistema de secreción (Ballister y cols.,
2008, Filloux, 2009). Está descrito que la proteína Hcp de Burkholderia mallei es un
6
Introducción
buen inmunógeno en ratones, caballos y humanos, por lo que es un buen candidato
para desarrollar una vacuna (Bingle y cols., 2008, Schell y cols., 2007).
Figura 3. Esquema de la organización genética de la isla genómica SPI-19 en S. Enteritidis.
1.7.2 Isla genómica ΦSE14
S. Enteritidis presenta además una isla genómica específica para dicho
serovar (Figura 4). Esta isla, denominada ΦSE14, contiene 21 genes que codifican
mayormente proteínas de fago cuyas funciones aún son desconocidas (Santiviago y
cols., 2010). Entre ellos se encuentra el gen SEN1395, que según nuestros análisis
bioinformáticos codifica una proteína que posee dos dominios conservados: DUF847
(presente en proteínas con actividad lisozima) y PG_binding_3 (dominio de unión a
peptidoglicán). Esta característica es de gran relevancia, ya que esta proteína sería
parte
de
la
superfamilia
de
lisozimas
"COG3926/DUF847",
descubierta
recientemente (Pei y cols., 2005), abriendo campo a un nuevo grupo de proteínas
cuya secuencia dista ampliamente de las lisozimas clásicas. Esta familia de
lisozimas, sin embargo, adopta la misma estructura secundaria, manteniendo los
mismos residuos catalíticos y localización del sitio activo.
7
Introducción
Figura 4. ΦSE14. Isla genómica específica de S. Enteritidis identificada mediante análisis
bioinformático.
Como se muestra en la Figura 5, tras una predicción de sitios antigénicos
(http://www.bioinformatics.org/JaMBW/3/1/7/) se determinó que la proteína SEN1395
posee múltiples regiones antigénicas a lo largo de la cadena polipeptídica,
ajustándose a las características necesarias para su uso en el desarrollo de una
vacuna.
Figura 5. Diagrama de residuos antigénicos de la proteína SEN1395. En el esquema
se observa la variación del índice de antigenicidad en función de los aminoácidos de la
proteína. Mientras mayor es el índice, mayor es la probabilidad de que dicho grupo de
residuos
sea
reconocido
por
anticuerpos
(Diagrama
obtenido
en
http://www.bioinformatics.org/JaMBW/3/1/7/). En rojo, se muestran algunas de las zonas
potencialmente antigénicas.
8
Introducción
En este trabajo se construyeron dos nuevas vacunas de ADN a partir de los
genes SEN1002 de SPI-19 y SEN1395 de ΦSE14 y se analizó su capacidad de
generar respuesta inmune en un modelo de salmonelosis murina, así como su
capacidad inmunoprotectora frente a un desafío con la cepa virulenta S. Enteritidis
LK5.
1.8 Hipótesis
Vacunas de ADN diseñadas a partir de los genes SEN1002 y SEN1395 de S.
Enteritidis inducen una respuesta inmune protectora en ratones BALB/c.
1.9 Objetivo General
Caracterizar la respuesta inmune inducida por vacunas de ADN diseñadas a
partir de los genes SEN1002 y SEN1395 de S. Enteritidis y evaluar la efectividad de
la protección inmune en ratones BALB/c.
1.10 Objetivos Específicos
Para verificar la hipótesis se llevaron a cabo los siguientes objetivos
específicos:
1.- Generar vacunas de ADN diseñadas a partir de los genes SEN1002 y
SEN1395 de S. Enteritidis.
2.- Evaluar la respuesta inmune generada por las vacunas de ADN en ratones
BALB/c.
3.- Evaluar la capacidad protectora de las vacunas de ADN frente a un desafío
con la cepa virulenta LK5 de S. Enteritidis.
9
Materiales y Métodos
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Reactivos
A continuación se indican proveedores y los productos que de ellos se
obtuvieron:
Biorad (CA, EEUU): Solución Acrilamida/bisacrilamida 40%, membrana de
nitrocelulosa poro 0,45μm.
Difco Laboratories (MI, EEUU): Triptona, extracto de levadura, Bacto-Agar.
Drag Pharma (STGO, CHILE): Ketamina (Ketostop®), acepromacina
(Pacifor®).
e-Bioscience (CA, EEUU): Mouse IL-4 ELISA kit, Mouse INF-γ ELISA kit.
IDT (IO, EEUU): Todos los oligonucleótidos partidores utilizados.
Fermentas (MD, EEUU): Estándares de peso molecular GeneRuler 100pb,
100pb plus y 1kb, enzimas de restricción, estándar de proteínas preteñido
PageRuler, High Fidelity DNA polimerasa, RNAsa.
Gibco BRL (NY, EEUU): Bromuro de etidio, agarosa, dodecilsulfato de sodio
(SDS).
Invitrogen Life Technologies (CA, EEUU): Lipofectamina 2000, N,N,N’,N’tetrametiletilendiamina
(TEMED),
anticuerpo
Anti
IgG
de
ratón
(conjugado
peroxidasa), RPMI 1640, penicilina, estreptomicina.
ISCONOVA (UP, SUECIA): Adjuvante AbISCO®.
10
Materiales y Métodos
J. T. Baker Chemical Co. (NJ, EEUU): Tween-20, glicerol.
Merck Química Chilena Soc. Ltda (STGO, CHILE): Cloruro de sodio, citrato
de
sodio,
glucosa,
cloroformo,
cloruro
de
potasio,
cloruro
de
magnesio
hexahidratado, cloruro de litio, ácido clorhídrico, isopropanol, ácido acético glacial,
hidróxido de sodio, amoniaco, formaldehído 37%, etanol absoluto, propionato de
potasio, bicarbonato de potasio, cloruro de amonio, buffer TAE 50x, Tritón X-100,
Tris-base, Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamilico, MOPS.
Promega (WI, EEUU): T4 DNA ligasa, dNTPs, Go-Taq DNA polimerasa.
Qiagen (CA, EEUU): “QlAquick PCR purification kit”, “QlAprep Spin Miniprep
kit”, “Gel extraction kit”,
Roche (STGO, CHILE): Mezcla de inhibidores de proteasa Complete Mini
EDTA-free.
Sigma Chemical Co (MO, EEUU): Kanamicina, ampicilina, azul de
bromofenol, ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA), β-mercaptoetanol, glicina,
persulfato de amonio (APS), desoxicolato de sodio, azul de Coomassie Brilliant Blue
R, kit de extracción de ADN genómico “GenElute Bacterial Genomic DNA”,
concanavalina A, lisozima, timidina (H3).
Stratagene (CA, EEUU): Anticuerpo monoclonal anti-Flag M2.
Thermo Scientific (HyClone) (IL, EEUU): Dulbecco’s Modified Eagle Medium
(DMEM) PBS 10x, films fotográficos CL-X, sustratos quimioluminiscentes para
peroxidasa de rábano (HRP) Super Signal West Pico.
11
Materiales y Métodos
2.2 Cepas bacterianas
Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en la presente Tesis.
Cepa
Genotipo / Fenotipo relevante
Fuente
S. Enteritidis NCTC13349
Fagotipo PT4, Cepa silvestre
Stock de Laboratorio
S. Enteritidis LK5
Fagotipo PT8, Cepa silvestre
Stock de Laboratorio
Salmonella enterica serovar
Enteritidis
Escherichia coli
endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA
DH5α
relA1 del(lac-argF)U169 deoR phi80
Stock de Laboratorio
del(lac)M15
endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA
DH5α λ pir
relA1 del(lac-argF)U169 deoR phi80
Stock de Laboratorio
del(lac)M15 λpir
BL21(DE3)
ompT gal dcm lon hsdSB λ(DE3)
Dr. J.C.Salazar
2.3 Líneas celulares
Tabla 2. Líneas celulares utilizadas en esta Tesis.
Línea celular
HEK293
Características
Células embrionarias de riñón humano,
>90% transfección
Fuente
Dr. A. Quest
2.4 Modelo animal
Se utilizaron ratones hembra BALB/c (7 a 8 semanas de edad) obtenidos del
Instituto de Salud Pública (ISP). Estos animales se distribuyeron aleatoriamente entre
los grupos experimentales (Tabla 3) y tuvieron acceso a comida y agua ad libitum.
12
Materiales y Métodos
Tabla 3. Grupos de ratones Balb/c utilizados en esta Tesis
Grupo
Número de animales
pVAXFlag/SEN1002
11
pVAXFlag/SEN1395
11
pVAXFlag
11
PBS
11
Total
66
2.5 Medios y condiciones de cultivo bacteriano
Las cepas bacterianas se cultivaron a 37°C en Caldo Luria (CL, triptona 10 g/l,
extracto de levadura 5 g/l, cloruro de sodio 5 g/l) en forma aeróbica durante toda la
noche. En medio sólido se mantuvo el medio base y se agregó 15 g/l de Bacto agar.
En algunos casos, para la selección de cepas resistentes se utilizaron ampicilina
(Amp) y kanamicina (Kan) a las concentraciones finales de 100 μg/ml y 50 μg/ml,
respectivamente.
2.6 Medios y condiciones de cultivo celular
Las células embrionarias de riñón humano HEK293 se mantuvieron en
botellas de cultivo con medio DMEM (con L-glutamina, glucosa y piruvato de sodio)
suplementado con 10% de SFB en un incubador a 37°C con 5% CO2 95% aire. El
medio de cultivo se cambió por medio fresco cada 2 a 3 días. El día previo a los
ensayos, las células se desprendieron de la botella con tripsina/EDTA a 37°C durante
2 min, se lavaron con PBS estéril y se resuspendieron en medio fresco para ser
contabilizadas en una cámara de Neubauer. Finalmente, se sembraron en una placa
de 6 pocillos a una razón de 2 x 106 células por pocillo en 2 ml de DMEM
suplementado con suero, de modo de que formaran una monocapa celular con una
confluencia de aproximadamente 90 a 100%.
Para los ensayos de linfoproliferación, los esplenocitos (macrófagos y
linfocitos) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM,
10% SFB y 50 μl de penicilina-estreptomicina.
13
Materiales y Métodos
2.7 Plasmidios
Tabla 4. Plasmidios utilizados en esta Tesis.
Plasmidio
Características
Fuente
pVAX1
PCMV, PT7, BGH poliA, KanR, oripUC
Invitrogen
pSUB11
AmpR, KanR, 3xFlag epítopo
Stock de Laboratorio
pLTS
AmpR, 3xFlag epítopo
Este trabajo
pEGFP-C1
PCMV, EGFP, oriSV40, KanR/NeoR, oripUC
Dr. Andrew Quest
pVAXFlag/bla
pVAXFlag
pVAXFlag/SEN1002
pVAXFlag/SEN1395
PCMV, PT7, BGH poliA, KanR, oripUC, AmpR,
3xFlag epítopo
PCMV, PT7, BGH poliA, KanR, oripUC, 3xFlag
epítopo
Gen SEN1002 de S. Enteritidis NCTC13349
clonado en pVAXFlag
Gen SEN1395 de S. Enteritidis NCTC13349
clonado en pVAXFlag
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
pVAXFlag/GFP
Gen GFP de pEGFP-C1 clonado en pVAXFlag
Este trabajo
pET-15b/gluQ-rs
AmpR, oripBR22, PT7, His-Tag, LacI, gen gluQ-rs
Dr. Juan Carlos Salazar
2.8 Partidores
Tabla 5. Partidores utilizados en esta Tesis.
Nombre
Secuencia
Elementos
adicionales*
pSUB11_XbaI(F)
CATCCGGGGTCAGCACCGTT
-
pSUB11_XbaI(R)
CTGGATGATCCTCCAGCGCG
-
pLTS_BamHI(F)
AATTCGGGATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATT
BamHI
pLTS_XhoI(R)
CCGCTCGAGCGTGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTAC
XhoI
pLTS_bla(R)
AGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAG
-
14
Materiales y Métodos
pV3F_bla (F)
pV3F_bla_XhoI (R)
SEN1395_SD_Koz_Hind(F)
SEN1395_BamHI(R)2
SEN1002_SD_Koz_Hind(F)
SEN1002_BamHI(R)2
TCACGCTCGAGTCTAGAGGGCC
CCGCTCGAGAGCCTACATTACTATTTATC
CCCAAGCTTAAGGAGGCCACCATGAAACCGAAGGAC
GAAATTTTTG
ATTCGGGATCCTATCAATACGCGCTCTTTCATCCAG
CCCAAGCTTAAGGAGGCCACCATGGCCAATTTAATTT
ATTTAACACTGAACGGT
GACGGGATCCAAACACCCTCTCATCCCATAAACTGAA
TGC
XhoI
HindIII, SD, KZ
BamHI
HindIII, SD, KZ
BamHI
GFP_HindIII_SD (F)
CCCAAGCTTAAGGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGG
HindIII, SD
GFP_BamHI (R)
ATTCGGGATCCGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCC
BamHI
K1
CAGTCATAGCCGAATAGCCT
-
T7 (universal)
TAATACGACTCACTATAGGG
-
* Los elementos adicionales (subrayados en la columna secuencia) consideran
principalmente sitios de corte de enzimas de restricción, de modo de obtener
productos de PCR compatibles con el ligamiento en los vectores. De las secuencias
Shine-Dalgarno (SD) y Kozak (KZ) se hará mención más adelante.
2.9 Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag
2.9.1 Extracción de ADN plasmidial
A partir de un cultivo de E. coli en CL (100 μg/ml de Amp y/o 50 μg/ml de Kan)
durante toda la noche, se extrajo ADN plasmidial utilizando el kit para alto número de
copias “QlAprep Spin Miniprep” (Qiagen) de acuerdo al protocolo del fabricante,
eluyendo en 50 μl de H20 miliQ estéril. La muestra se mantuvo a 4°C hasta su uso.
15
Materiales y Métodos
2.9.2 Cuantificación de ADN
La cuantificación de los plasmidios se realizó mediante la medición de
absorbancia de la muestra a 260 nm en un espectrofotómetro. El valor obtenido se
transformó a concentración mediante la siguiente fórmula:
Concentración (μg/ml) = Abs260nm x factor de dilución x 50 μg/ml
2.9.3 Electroforesis en gel de agarosa
Los geles se prepararon con agarosa 1% en tampón TAE (Tris-acetato 0,04 M
pH 8,0; EDTA 1 mM). Las muestras a analizar se cargaron en el gel previa
incorporación de tampón Blue II 10x (glicerol 20% (v/v), azul de bromofenol 0,25%
(p/v), xileno-cianol 0,25% (p/v), EDTA 0,1 M). La electroforesis se realizó a 90 V
constantes y luego el gel se tiñó en una solución de bromuro de etidio (5 μg/ml)
durante 15 min. Las bandas de ADN se visualizaron y fotografiaron sobre un
transiluminador UV.
2.9.4 Digestión con enzimas de restricción
Las digestiones enzimáticas de plasmidios y productos de PCR de este trabajo
se realizaron utilizando los protocolos sugeridos por el proveedor de las enzimas
(Fermentas):
Agua
Tampón
ADN (0.5-1 μg/μl)
Producto de PCR
Enzima 10 u/μl
Volumen final
Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
Muestra de ADN
16 μl
2 μl
1 μl
1 μl
20 μl
37°C
2 horas
Producto de PCR
18 μl
2 μl
10 μl
1 μl
30 μl
37°C
2 horas
16
Materiales y Métodos
2.9.5 Obtención de productos de PCR
Las reacciones de PCR en este trabajo se realizaron bajo los siguientes
protocolos:
Protocolo PCR enzima High Fidelity:
Tampón
dNTPs 2 mM
MgCl2 25 mM
P1
10 µM
P2
10 µM
Enzima HF
H20
DNA
Volumen Final
2,5 μl
0,5 μl
1,875 μl
2 μl
2 μl
0,375 μl
40 μl
1,5 μl
50 μl
Programa de amplificación
Temperatura
Tiempo
94°
3min
94°
30 seg
55°
30 seg
72°
2,5 min
72°
7 min
4°
∞
30 ciclos
Protocolo PCR enzima GoTaq:
Tampón
dNTPs 2 mM
MgCl2 25 mM
P1
10 µM
P2
10 µM
Enzima GoTaq
H20
DNA*
Volumen Final
4 μl
0,4 μl
1,2 μl
0,4 μl
0,4 μl
0,1 μl
13 μl
0,5 μl
20 μl
Programa de amplificación
Temperatura
Tiempo
95°
2 min
95°
30 seg
55°
30 seg
72°
1 min
72°
5 min
4°
∞
30 ciclos
* Los ensayos de PCR de colonias bacterianas, se realizaron a partir de 0,5 μl de una suspensión de
dicha colonia en 50 μl de H20 destilada estéril.
Los productos obtenidos se purificaron con “QlAquick PCR Purification Kit”
(Qiagen), se confirmaron por electroforesis en gel de agarosa y se mantuvieron a 4°C
hasta su uso.
2.9.6 Reacciones de ligación
Las reacciones de ligación de vector-inserto o recircularización se realizaron
con la enzima ligasa de ADN del fago T4 (New England Biolabs) según el protocolo
sugerido por el fabricante:
17
Materiales y Métodos
H20 destilada
Tampón
ADN digerido
Vector
Inserto
Enzima
Volumen final
Temperatura de reacción
Tiempo de reacción
Ligación vector-inserto
8 μl
2,5 μl
2 μl
6 μl
1,5 μl
20 μl
22°C
2 horas
Recircularización
2 μl
1,5 μl
10 μl
1,5 μl
30 μl
22°C
2 horas
2.9.7 Transformación por electroporación
Los plasmidios construidos se purificaron con “QlAquick PCR Purification Kit”
(Qiagen) y luego se transformaron por electroporación en células de E. coli
competentes (DH5α o BL21(DE3), según correspondiese en la etapa de trabajo) a
1.800 V (60 μl de suspensión bacteriana con 5 μl de plasmidio en cubetas de 0,2 mm
de separación entre los electrodos). Las células se resuspendieron en 1 ml de CL y
se mantuvieron 90 min a 37°C. Pasado dicho tiempo, se centrifugaron y
resuspendieron en 100 μl de CL, volumen que se sembró en placas de Agar Luria
(AL) con el antibiótico correspondiente para selección, manteniéndolas durante toda
la noche a 37°C.
La presencia de los plasmidios en las colonias seleccionadas se confirmó
mediante PCR con GoTaq según el protocolo descrito previamente.
2.9.8 Purificación de ADN desde gel de agarosa
El ADN se sometió a electroforesis en gel de agarosa y posterior tinción con
bromuro de etidio. Luego, se cortaron las bandas de interés utilizando una hoja de
bisturí. El ADN se extrajo desde el trozo de del utilizando “QlAquick Gel Extraction
Kit” (Qiagen) de acuerdo al protocolo descrito por el fabricante, eluyendo en H20
miliQ estéril.
18
Materiales y Métodos
2.10 Construcción de vectores de expresión
2.10.1 Extracción de ADN genómico
Se cultivó la cepa S. Enteritidis NCTC13349 en 3 ml de CL durante toda la
noche a 37°C con agitación. Se centrifugó 1,5 ml de cultivo por 2 min a 13.000 rpm.
Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se sometió a extracción de ADN
genómico utilizando “Gen Elute Bacterial Genomic DNA kit” (Sigma) y el producto
obtenido se mantuvo a 4°C hasta su uso.
2.10.2 Obtención de los genes SEN1395 y SEN1002 para el clonamiento
El marco de lectura abierto de los genes SEN1395 y SEN1002 se amplificó
por PCR a partir del ADN genómico de S. Enteritidis NCTC13349 con las parejas de
partidores
SEN1395_SD_Koz_Hind(F)
-
SEN1395_BamHI(R)2
y
SEN1002_SD_Koz_Hind(F) - SEN1002_BamHI(R)2 respectivamente, con la enzima
High Fidelity.
Los partidores en 5’ (Forward) poseen un sitio de corte para la enzima HindIII
y las secuencias SD y KZ para mejorar la eficiencia de traducción en procariontes y
eucariontes, respectivamente. Los partidores 3’ (Reverse) poseen un sitio de corte
para la enzima BamHI como se muestra en la Tabla 5.
El producto de PCR obtenido en ambos casos se confirmó por electroforesis
en geles de agarosa al 1% y se sometió a digestión con las enzimas de restricción
BamHI y HindIII, para luego ligar independientemente en el vector pVAXFlag y
transformar en E. coli DH5α. El correcto clonamiento se confirmó mediante PCR de
colonias con GoTaq.
19
Materiales y Métodos
2.11 Evaluación de la producción de proteínas recombinantes en E. coli
2.11.1 Ensayo de inducción con IPTG
Los
plasmidios
pVAXFlag/SEN1002
y
pVAXFlag/SEN1395
fueron
transformados en la cepa BL21(DE3) para evaluar la producción de las proteínas
SEN1002 y SEN1395, respectivamente. Para ello, de un cultivo durante toda la
noche de las cepas con plasmidio (en presencia de 50 μg/ml Kan y 1% glucosa) se
tomó una alícuota de 1 ml y se dispuso en 9 ml de CL (50 μg/ml Kan y 1% glucosa).
Esta dilución se cultivó a 37°C con agitación constante hasta alcanzar una densidad
óptica a 600nm (DO600) de 0,6. Luego de ello, la muestra se centrifugó a 13.000 rpm
en una microcentrífuga durante 1 min y se resuspendió en 10 ml de medio fresco, de
los cuales se separaron dos fracciones de 3 ml. Una de ellas se mantuvo
suplementada con 50 μg/ml Kan y 1% glucosa (condición represora) y la otra con 50
μg/ml Kan y 1 mM de IPTG (condición inductora), ambas a 37°C con agitación
constante durante 1 hora. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron a 13.000 rpm
durante 1 min y el sedimento se resuspendió en 200 μl de tampón de carga de
proteínas 1x (Tris-HCl 0,06 M; SDS 2% (p/v); glicerol 14% (v/v); azul de bromofenol
5%; β-mercaptoetanol 0,02%; pH 6,8). Estas muestras se hirvieron a 100°C durante
5min y luego se congelaron a -20°C hasta su uso.
Como controles se utilizaron E. coli BL21(DE3) transformada con el vector
vacío pVAXFlag (control negativo) y E. coli BL21(DE3) transformada con
pET-15b/gluQ-rs (control positivo de inducción)
2.11.2 Separación electroforética de proteínas
Se depositaron alícuotas de 15 μl dentro de los bolsillos de un gel de
poliacrilamida al 5% y se cubrieron con tampón de corrida (Tris 0,025 M; glicina
1,44% (p/v); SDS 0,1% (p/v); pH 8,3). La separación electroforética se inició con la
aplicación de 80 V hasta que el azul de bromofenol alcanzó el gel de separación
20
Materiales y Métodos
(12% de concentración). Luego se aplicó 100 V durante aproximadamente 150 min
hasta que la muestra llegó al final del gel separador.
2.11.3 Tinción de gel de proteínas con azul de Coomassie
Una vez finalizada la electroforesis, el gel se dispuso en un recipiente con
solución de tinción (azul de Coomassie 0,1%; metanol 50%; ácido acético 10%)
durante 30 min a temperatura ambiente y agitación continua. Para desteñir, el gel se
sumergió en solución de destinción (metanol 20%; ácido acético 15%) y se mantuvo
en agitación constante con renovación frecuente de la solución hasta evidenciar las
bandas de proteína color azul y el fondo casi transparente.
2.11.4 Western blot
Las proteínas fueron transferidas vía húmeda a membranas de nitrocelulosa
empleando tampón de transferencia (Tris-HCl 20 mM; glicina 150 mM; isopropanol
20% (v/v); SDS 0,05% (p/v)) a 100 V durante 70 min. Luego, las membranas se
lavaron en PBS (NaCl 8 g/l; KCl 0,2 g/l; Na2HPO4 2,7 g/l; KH2PO4 0,2 g/l; pH 7,4) y
bloqueadas con leche descremada 3% en PBS (solución de bloqueo) durante toda la
noche a 4°C. A continuación, se realizó una incubación con el anticuerpo primario
anti-Flag M2 (Stratagene) diluido 1:15.000 en solución de bloqueo, durante 1 hora a
temperatura ambiente. Luego se realizaron 3 lavados de 10 min cada uno con PBS-T
(PBS; Tween-20 1%, pH 7,4) y se incubó con el anticuerpo secundario (1:15.000 en
PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron 3 lavados de
10 min cada uno con PBS-T y se reveló por quimioluminiscencia (West Pico).
2.11.5 Extracción de proteína recombinante
La cepa E. coli BL21(DE3) con el plasmidio se cultivó en 3 ml de CL
suplementado con Kan y glucosa durante toda la noche. Con este cultivo se inoculó
200 ml de CL con Kan y glucosa (dilución 1/100) y se mantuvo a 37°C con agitación
21
Materiales y Métodos
durante 4 horas. A continuación se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 min y el
sedimento se resuspendió en 50 ml de CL fresco suplementado con Kan e IPTG
1 mM y se mantuvo a 37°C con agitación durante 90 min. Luego, se centrifugó y el
sedimento se lavó con 5 ml de PBS 1x para centrifugar nuevamente y mantener el
sedimento a -20°C por 18 horas. Posteriormente la muestra se resuspendió en 1 ml
de tampón de lisis (PBS 1x; inhibidor de proteasas) y se sometió a sonicación.
Finalmente, se centrifugó a 8.000 rpm por 3 min y el sobrenadante se mantuvo a
-20°C hasta su uso.
2.11.6 Cuantificación de proteínas
Se empleó el método de cuantificación de proteínas de Bradford, en el cual se
incuban 50 μl de extracto de proteínas con 200 μl de reactivo de Bradford (azul de
Coomasie G-250) y 750 μl de solución de dilución (NaCl 0,15 M), durante 5 min a
temperatura ambiente. Luego se midió la absorbancia a 595 nm. Para la curva de
calibración se usó albúmina de suero bovino. Cada muestra se midió por duplicado.
2.12 Evaluación de producción proteica in vitro en células eucariontes
2.12.1 Estandarización de la técnica de transfección
Para optimizar las condiciones de transfección, se utilizó el plasmidio
pVAXFlag/GFP en distintas variantes de la reacción. Se evaluaron concentraciones
de plasmidio y lipofectamina, así como cantidad de células y tiempo de reacción.
Finalizada las transfecciones, las células se lavaron cuidadosamente con
500 μl de PBS frío y luego se fijaron con formaldehido 4% (en PBS) durante 10 min a
temperatura ambiente y en oscuridad. A continuación, las células fijadas se lavaron
con PBS y se mantuvieron a 4°C en oscuridad hasta su observación al microscopio.
22
Materiales y Métodos
2.12.2 Ensayo de transfección en células HEK
El día anterior al ensayo (~24 horas antes), se sembraron 2 x 106 células por
pocillo en una placa de 6 pocillos, de modo que formaran una monocapa celular con
una confluencia de aproximadamente 90 a 100% al momento del ensayo.
Cuando las células alcanzaron la confluencia esperada, se lavaron con 500 μl
de PBS estéril y resuspendieron en 2 ml de DMEM sin suero. Luego, a cada pocillo
se agregó 100 μl de una mezcla 1:2 de plasmidio y Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y
se mantuvo en incubación (37°C, 5% CO2, 95% aire). A las 5 horas de reacción, se
agregó 1 ml de medio DMEM suplementado con suero y se continuó con incubación
hasta completar las 24 horas.
2.12.3 Lisis celular
Una vez terminado el ensayo de transfección, las células se lavaron
cuidadosamente con 500 μl de PBS frío y luego se soltaron en 500 μl de tampón
RIPA (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1% Tritón X-100; 0,5% desoxicolato de sodio;
0,1% SDS) con inhibidor de proteasas (Complete, Mini, EDTA-free; Protease Inhibitor
Cocktail Tablets; Roche). A continuación, cada muestra se transfirió a un tubo
eppendorf, se agitaron en vortex durante 30 seg y se mantuvieron a 4°C durante 30
min. Finalmente, se les agregó 100 μl de tampón de carga de proteínas 1x, se
hirvieron a 100°C durante 5 min y se mantuvieron a -20°C hasta su posterior análisis
mediante SDS-PAGE y Western blot.
23
Materiales y Métodos
2.13 Caracterización de vacunas in vivo en ratones BALB/c
2.13.1 Vacunación de ratones BALB/c
2.13.1.1 Extracción de plasmidio a gran escala
La cepa E. coli DH5α con el plasmidio se cultivó durante toda la noche en 5 ml
de CL suplementado con Kan. Con este cultivo se inoculó 2 litros de CL con Kan
(dilución 1/500) y se mantuvo a 37°C con agitación durante 18 horas. A continuación
se centrifugó a 10.000 rpm en una centrífuga SORVALL durante 10 min, se descartó
el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 50 ml de la Solución I (Glucosa 50
mM; Tris-HCl 25 mM, pH 8, EDTA 10 mM, pH 8) y 2 mg/ml de lisozima y se incubó
durante 30 min en hielo. Luego se agregó 50 ml de Solución II (NaOH 0,2 N, SDS
1%) y finalmente 50 ml de Solución III (KC2H5O2 3M) con una incubación de 15 min
en hielo después de cada dilución. Posteriormente, se centrifugó a 10.000 rpm
durante 20 min a 4°C y el sobrenadante se traspasó a un tubo limpio, al que se
agregó isopropanol frío (1:1) y se incubó en hielo durante 10 min. Luego se
centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min a 4°C y el sedimento se resuspendió en 5 ml
de agua nanopura. Se agregó 5 ml de LiCl 4 M (1:1) e incubó en hielo durante 5 min,
para luego centrifugar a 10.000 rpm durante 5 min a 4°C y recuperar el
sobrenadante, muestra que se incubó en baño termorregulado a 65°C durante 5 min.
A continuación se agregó 10 ml de agua nanopura y se precipitó el ADN mediante la
adición de 20 ml isopropanol (1:1) e incubación a -20°C durante 18 horas. Luego se
centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min a 4°C y el sedimento se resuspendió en agua
nanopura y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Posteriormente se
adicionó Tritón X-100 y se calentó a 37°C durante 10 min. Luego se centrifugó y se
sometió a separación con Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para purificar la fase
acuosa. Seguidamente, se precipitó el ADN en una solución de etanol frío y acetatoMOPS (CH3COONa 0,1 M; MOPS 0,005 M, pH 8), se centrifugó a 12.000 rpm
durante 10 min a 4°C y se lavó el sedimento con alcohol 80%. Para finalizar, se
resuspendió en 300 μl de agua nanopura y se mantuvo a -20°C hasta su uso.
24
Materiales y Métodos
2.13.1.2 Inmunización
Se utilizaron ratones hembra BALB/c (7 a 8 semanas de edad) obtenidos del
Instituto de Salud Pública (ISP). Estos animales se distribuyeron aleatoriamente entre
los grupos experimentales (Tabla 3) y se inmunizaron vía subcutánea (SC),
intramuscular (IM) e intranasal (IN) en las semanas cero, dos y tres del ensayo,
respectivamente, con 100 μg de plasmidio y 12 μg de adjuvante (AbISCO®) por ratón
en PBS, en un volumen final de 100 μl en SC e IM, mientras que 50 μl en IN. Para
esta última vía, los ratones fueron anestesiados previamente con una mezcla de
ketamina y acepromacina. Como grupo control, seis ratones se inmunizaron con
PBS.
2.13.2 Linfoproliferación
Luego de dos semanas posterior a las inmunizaciones, seis ratones de cada
grupo experimental se sacrificaron por dislocación cervical y se les extrajo el bazo en
condiciones asépticas. A partir de los órganos removidos, se preparó una suspensión
celular de acuerdo a protocolos estándar (Oñate y cols., 1999) y los glóbulos rojos se
lisaron con solución ACK (150 mM NH4Cl; 1 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA; pH 7,3). Las
células de bazo se cultivaron en una placa de 96 pocillos a 37°C y 5% CO2 a una
concentración de 4 x 105 células/pocillo, en presencia de la proteína recombinante
(20 μg/ml), o la bacteria S. Enteritidis NCTC13349 muerta por calor (20 μg/ml), o
concanavalina A (10 μg/ml, control positivo de linfoproliferación) o sin estimulación
(control negativo) durante 3 días. Posteriormente, se dio un pulso de 8 horas con 0,4
μCi de timidina tritiada (H3) por pocillo y la radiactividad incorporada en el ADN se
midió en un contador de centelleo líquido.
2.13.3 Cuantificación de citoquinas
La presencia de las citoquinas IFN-γ e IL-4 se determinó mediante ELISA. Para
ello, se recolectó el sobrenadante de los cultivos de esplenocitos del ensayo de
25
Materiales y Métodos
linfoproliferación después de 24 horas de estimulación y analizó usando los sistemas
comerciales Mouse INF-γ ELISA y Mouse IL-4 ELISA, respectivamente. La
concentración de las citoquinas se calculó usando regresión polinómica a partir de
los valores de absorbancia obtenidos de muestras estándar a DO450.
2.13.4 Desafío
Cinco ratones de cada grupo experimental se desafiaron con la cepa virulenta
LK5. Para ello, dos semanas luego de la última inmunización los ratones se
inocularon vía intraperitoneal (IP) con 104 UFC de S. Enteritidis LK5. Dos semanas
después, se sacrificaron y se les extrajo el bazo, órgano que fue homogenizado en
3 ml de PBS estéril y plaqueado en diluciones seriadas para determinar el número de
UFC de Salmonella por bazo.
2.14 Análisis estadístico
Los resultados de linfoproliferación y cuantificación de citoquinas se analizaron
comparando la muestra experimental (pVAXFlag/SEN1002 o pVAXFlag/SEN1395,
según correspondiese) con los controles negativos pVAXFlag y PBS.
Para analizar dichos resultados, se realizó el test ANOVA y los valores de p
obtenidos menores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
26
Resultados
3. RESULTADOS
3.1. Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag
3.1.1 Construcción de los plasmidios intermediarios pLTS y pVAXFlag/bla.
A partir del vector comercial pVAX1 (Invitrogen) se construyó pVAXFlag/bla,
un vector que manteniendo las características originales permite dar seguimiento a
las proteínas producidas debido a la fusión de los genes de interés con el epítopo
3xFlag.
Para obtener este vector, se eliminó el gen de resistencia a kanamicina del
plasmidio pSUB11 mediante la amplificación por PCR del plasmidio con los
partidores pSUB11_XbaI(F) y pSUB11_XbaI(R). Luego, se realizó una digestión con
la enzima de restricción XbaI y finalmente recircularización, obteniendo un plasmidio
que denominamos pLTS (Figura 6).
Figura 6. Diagrama de la deleción del gen de resistencia a kanamicina del plasmidio pSUB11 y la
construcción del plasmidio pLTS.
Usando pLTS como templado, se realizó una amplificación por PCR de 3xFlag
y el gen bla (resistencia a ampicilina) con los partidores pLTS_BamHI(F) y
pLTS_XhoI(R) que poseen sitios de corte en sus extremos 5’ (BamHI) y 3’ (XhoI)
27
Resultados
para realizar una inserción dirigida dentro del sitio de múltiple clonamiento del vector
pVAX1 (Figuras 7A y 7B). El producto de ligación (pVAXFlag/bla) se transformó en
E. coli DH5α y se seleccionaron cepas resistentes a kanamicina y ampicilina
simultáneamente.
A
B
C
Figura 7. Diagrama de vectores de expresión. A: vector comercial pVAX1 (Invitrogen). B:
pVAXFLAG/bla, pVAX1 con una inserción del epítopo 3xFlag asociado al gen bla para su seguimiento,
extraído de la construcción pLTS. C: vector final pVAXFlag.
3.1.2 Eliminación de gen bla y generación del vector pVAXFlag.
Dado que el gen de resistencia a Amp presente en pVAXFlag/bla genera un
distanciamiento cercano a 1kb entre el codón stop y la zona de poliadenilación, se
procedió a eliminar este fragmento mediante amplificación por PCR de todo
pVAXFlag/bla a excepción del gen bla con los partidores pV3F_bla(F) y
pV3F_bla_XhoI(R). El producto se digirió con la enzima de restricción XhoI y luego
se ligó para obtener el vector final y transformar en E. coli DH5α (Figura 7C).
Debido a la baja eficiencia del proceso, posterior a la ligación la muestra se
sometió a digestión doble con las enzimas EcoRI y PstI para eliminar todo el
templado remanente (pVAXFlag/bla) y aumentar la eficiencia de transformación del
nuevo plasmidio generado.
Luego de la transformación, se seleccionaron cepas resistentes a kanamicina
y sensibles a ampicilina, cepas que se confirmaron por PCR usando el partidor de
inserción 5’ (pLTS_BamHI(F)) y un partidor interno del vector pVAX1 (K1).
28
Resultados
Los productos amplificados con estos partidores que se esperan para cada
construcción son los siguientes:
Plasmidio templado
Tamaño del plasmidio
Tamaño del producto esperado
pVAXFlag
3.030 pb
597 pb
pVAXFlag/bla
4.200 pb
1.716 pb
pVAX1
3.000 pb
No amplifica
En la Figura 8A se muestran los productos de amplificación resueltos en un
gel de agarosa 1%, donde en cada caso se obtuvo un producto de amplificación del
tamaño esperado. Igualmente ocurre para los plasmidios (Figura 8B) en donde se
correlacionan el patrón de migración en un gel de agarosa 1% con el tamaño
esperado.
Figura 8. Comprobación de la correcta construcción de los plasmidios. A: Productos de
PCR de confirmación resueltos en un gel de agarosa 1%. B: ADN plasmidial de dos clones
independientes por cada cepa resueltos en un gel de agarosa 1%. En todos los casos se obtuvieron
bandas correspondientes al tamaño esperado.
29
Resultados
3.2. Construcción de vectores de expresión. Vacunas de ADN
3.2.1 Preparación de insertos (genes SEN1002 y SEN1395).
Se diseñaron partidores de PCR para amplificar los genes SEN1002 y
SEN1395 a partir del ADN genómico de Salmonella Enteritidis PT4. Los partidores en
5’ (SEN1002_SD_Koz_Hind(F) y SEN1395_SD_Koz_Hind(F)) poseen un sitio de
corte para la enzima HindIII (AAGCTT) y las secuencias Shine-Dalgarno
(TAAGGAGG) y Kozak (GGCCACCATG) para mejorar la eficiencia de traducción en
procariontes
y
eucariontes,
respectivamente.
Los
partidores
3’
(SEN1002_BamHI(R)2 y SEN1395_BamHI(R)2) poseen un sitio de corte para la
enzima BamHI (GGATCC), como se muestra en la Figura 9A.
El producto de PCR obtenido en ambos casos se confirmó por electroforesis
en geles de agarosa al 1% y se sometió a digestión con las enzimas de restricción
BamHI y HindIII (Figura 9B).
A
B
Figura 9. Esquema de partidores y productos de
PCR para clonamiento. (A) Partidores utilizados para amplificar
los genes SEN1002 y SEN1395. Secuencias adheridas: KOZAK
(rojo), Shine-Dalgarno (negro), sitios de corte HindIII y BamHI
(azul). (B) Productos de PCR generados con los partidores
recién descritos. Ambos corresponden al tamaño esperado de
501 pb (SD.KZ.1002) y 564 pb (SD.KZ.1395) como se observa
en la fotografía de un gel de agarosa 1%.
30
Resultados
3.2.2 Clonamiento de SEN1002 y SEN1395 en pVAXFlag. Construcción de
vacunas.
Los productos de PCR de SEN1002 y SEN1395 digeridos se clonaron
independientemente en el vector pVAXFlag entre los sitios HindIII (5’) y BamHI (3’)
del sitio de múltiple clonamiento, quedando en fase con la secuencia 3xFlag y
permitiendo la generación de una proteína fusionada a este epítopo.
La Figura 10 muestra un esquema de clonamiento de los insertos en
pVAXFlag y de la proteína recombinante que se espera obtener luego de los
procesos de transcripción y traducción tanto en células procariontes como
eucariontes.
SD
KOZAK
Inserto
3xFlag
BamHI
HindIII
Transcripción y
Traducción
H2N
Fragmento de interés
3xFlag
COOH
Figura 10. Esquema de clonamiento del fragmento de interés en pVAXFlag (arriba) y la
proteína recombinante generada por la transcripción y traducción en procariontes y eucariones
(abajo). Las secuencias SD y KZ mejoran la eficiencia de traducción del ARN mensajero, mas no
afectan la constitución de la proteína producida. Así mismo, la secuencia de corte BamHI, no genera
desfase en la traducción y permite la mantención del marco de lectura.
31
Resultados
Los plasmidios, generados en la ligación entre productos de PCR y vector, se
transformaron en E. coli DH5α y las colonias obtenidas se confirmaron por PCR
usando
el
partidor
de
inserción
5’
(SEN1002_SD_Koz_Hind
o
SEN1395_SD_Koz_Hind, según correspondiese) y el partidor interno del vector
pVAXFlag (K1). Para cada caso, se esperan productos de PCR de 1.092 pb (vacuna
SEN1002) y 1.155 pb (vacuna SEN1395), lo que se ve reflejado en la fotografía de
un gel de agarosa 1% de la Figura 11.
Figura 11. PCR de confirmación de la transformación en DH5α con los plasmidios
construidos. En la fotografía se muestran los productos obtenidos de la reacción de PCR de
confirmación a partir de las colonias obtenidas de la transformación, resueltos en geles de agarosa al
1%. A la izquierda, se observan los productos obtenidos de 7 colonias distintas de la vacuna
SEN1395. A la derecha, se observan los productos de 8 colonias distintas de la vacuna SEN1002. En
ambos casos, los tamaños observados corresponden a lo esperado.
De aquellas colonias en que se confirmó la presencia de los plasmidios, se
seleccionó aleatoriamente una de cada vacuna y se extrajo el ADN plasmidial. Cada
una de estas muestras más el vector vacío pVAXFlag, se analizaron en un gel de
agarosa 1%. Los resultados se muestran en la Figura 12. En este caso, los tamaños
esperados corresponden a los observados en el gel.
Finalmente, los plasmidios obtenidos (pVAXFlag, pVAXFlag/SEN1002 y
pVAXFlag/SEN1395) se secuenciaron para confirmar la correcta construcción y
32
Resultados
descartar modificaciones perjudiciales para nuestro estudio. Dichos resultados
describen dos mutaciones puntuales; una en la secuencia del epítopo 3xFlag que se
mantiene en todas las construcciones y otra en la región 3’ de la secuencia de
SEN1395 (Tablas 6, 7 y 8).
Plasmidio
Tamaño
pVAXFlag
3.030 pb
pVAXFlag/SEN1002
3.506 pb
pVAXFlag/SEN1395
3.569 pb
Figura 12. Confirmación de las construcciones por
tamaño plasmidial. Una alicuota de 3 μl de cada extracción
plasmidial se resolvió en un gel de agarosa 1%. (Arriba)
Tamaño esperado de los plasmidios construidos. (Izquierda) En
la fotografía se observan los plasmidios con un patrón de
migración que corresponde al tamaño esperado.
33
Resultados
Tabla 6. Secuenciación de pVAXFlag. Las secuencias corresponden a la real entregada por
Macrogen (superior) y a los nucleótidos esperados (inferior). En gris se describen las coincidencias
entre ambas secuencias. El fragmento que corresponde al epítopo 3xFlag se describe dentro del
encuadre negro y las mutaciones se especifican con un asterisco (*).
34
Resultados
Tabla 7. Secuenciación de pVAXFlag/SEN1002. Las secuencias corresponden a la real entregada
por Macrogen (superior) y a los nucleótidos esperados (inferior). En gris se describen las
coincidencias entre ambas secuencias. El fragmento que corresponde al epítopo 3xFlag se describe
dentro del encuadre negro, mientras que la secuencia SEN1002 se describe en el encuadre con línea
punteada. Las mutaciones se especifican con un asterisco (*).
35
Resultados
Tabla 8. Secuenciación de pVAXFlag/SEN1395. Las secuencias corresponden a la real entregada
por Macrogen (superior) y a los nucleótidos esperados (inferior). En gris se describen las
coincidencias entre ambas secuencias. El fragmento que corresponde al epítopo 3xFlag se describe
dentro del encuadre negro, mientras que la secuencia SEN1395 se describe en el encuadre con línea
punteada. Las mutaciones se especifican con un asterisco (*).
36
Resultados
3.3. Evaluación de expresión de proteínas in vitro.
3.3.1 Expresión de proteínas en bacteria.
Para determinar la funcionalidad de las construcciones y la producción de las
proteínas recombinantes SEN1002/FLAG y SEN1395/FLAG, los plasmidios se
transformaron en E. coli BL21(DE3), cepa que contiene el gen de la RNA polimerasa
del fago T7 inducible por IPTG. De este modo, la adición del compuesto permite la
transcripción del gen de interés contenido en el vector de expresión.
Con la cepa transformada se realizó un ensayo de inducción con IPTG 1 mM y
otro de represión con glucosa 1% durante 1 hora. Se utilizó el vector vacío como
control negativo y un derivado del plasmidio pET-15b que tiene clonado el gen
gluQ-rs como control positivo de inducción. Posteriormente, se recolectó el
sedimento de bacterias y las proteínas recombinantes se detectaron mediante
inmunoblot usando anticuerpos monoclonales anti-Flag.
Como se observa en la Figura 13, las bacterias trasformadas con
pVAXFlag/SEN1002 y pVAXFlag/SEN1395 expresaron fuertemente las proteínas
recombinantes codificadas en las vacunas, las que incluso en condiciones de
represión fueron producidas en cantidades detectables (Figura 13, derecha).
3.3.2 Expresión de proteínas en células eucariontes.
Para confirmar la producción de las proteínas recombinantes en células
eucariontes, se utilizaron células embrionarias humanas de riñón HEK 293 debido a
su alta eficacia en transfección. Estas células se cultivaron en medio DMEM
suplementado con suero fetal bovino (10% SFB) hasta el ensayo de transfección con
lipofectamina 2000.
37
Resultados
Figura 13. Expresión de proteínas recombinantes en bacteria. E. coli BL21(DE3) produce las
proteínas recombinantes codificadas en las vacunas en condiciones de cultivo estándar de inducción
(IPTG 1 mM) y represión (glucosa 1%). Izquierda, Fotografía SDS-PAGE 12% teñido con azul de
Coomassie. Derecha, fotografía del revelado de Western blot.
Para estandarizar la técnica utilizamos la construcción pVAXFlag/GFP, en que
se clonó el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) proveniente del plasmidio
pEGFP-C1 en nuestro vector pVAXFlag. Este plasmidio permite determinar
rápidamente la producción de la proteína recombinante GFP/FLAG por microscopía
de fluorescencia y, por consiguiente, la funcionalidad de los constructos en células
eucariontes.
Este plasmidio se utilizó en distintas variantes de la reacción. Se evaluaron
concentraciones de plasmidio y lipofectamina, así como cantidad de células y tiempo
de reacción, como se muestra en la Tabla 9.
38
Resultados
Tabla 9. Condiciones de estandarización de transfección
HEK
Plasmidio
(pVAXFlag/GFP)
Lipofectamina
Tiempo de reacción
Figura 14
2x106
400 ng
1 μg
2 horas
B
6
2x10
400 ng
1 μg
4 horas
C
2x106
400 ng
1 μg
24 horas
E
6
2x10
800 ng
2 μg
24 horas
F
2x106
400 ng
1 μg
48 horas
H
6
2x10
800 ng
2 μg
48 horas
I
HEK
Plasmidio (pVAXFlag)
Lipofectamina
Tiempo de reacción
Figura 14
2x106
400 ng
1 μg
4 horas
A
6
2x10
800 ng
2 μg
24 horas
D
2x106
800 ng
2 μg
48 horas
G
En la Figura 14, se muestran 9 imágenes provenientes de células con
diferentes condiciones de transfección. Es posible observar que las condiciones
evaluadas generan diversos efectos en la eficiencia de transfección, siendo la
condición F la de mayor rendimiento (2x106 células por pocillo con 800 ng de
plasmidio y 2 μg de lipofectamina durante 24 horas de reacción).
39
Resultados
Figura 14. Estandarización del ensayo de transfección en células HEK293 con pVAXFlag/GFP.
Se evaluaron distintas condiciones de reacción para optimizar la transfección (Tabla 9). En las
fotografías (A), (B), (C), (E) y (H) se transfectó con 400 ng del vector, mientras que en (D), (F), (G) e
(I) se transfectó con 800 ng del plasmidio. (Barra: 2 mm)
Utilizando el protocolo con mejor rendimiento (Figura 14F), se realizó un
ensayo
de
transfección
con
los
plasmidios
pVAXFlag/SEN1002
y
pVAXFlag/SEN1395 para determinar la producción de proteínas. Como controles se
utilizaron pVAXFlag/GFP (control positivo) y el vector vacío pVAXFlag (control
negativo). Finalizado el ensayo, las células se recuperaron y lisaron con tampón
RIPA y tampón de carga de proteínas 1x para realizar una separación electroforética
40
Resultados
de proteínas y Western blot. El resultado de estos ensayos se muestra en la Figura
15, donde se observa la presencia de las proteínas estudiadas y con tamaño
conforme a lo esperado.
Figura 15. Expresión de proteínas recombinantes en HEK293. Las células
eucariontes HEK293 son capaces de producir las proteínas recombinantes codificadas
en las vacunas. La imagen muestra una fotografía del revelado de westernblot. Como
controles se utilizaron pVAXFlag/GFP (producción de GFP/Flag; 30 kDa) y el vector
vacío pVAXFlag (control negativo). Además se comparó con la proteína SEN1395/Flag
(23,7 kDa) producida en bacteria. Los dos carriles SEN1395/Flag y SEN1002/Flag
(21 kDa) corresponden a dos ensayos independientes de transfección bajo las mismas
condiciones en HEK293.
3.4. Caracterización de las vacunas en ratones BALB/c
3.4.1 Planificación temporal de los ensayos
A continuación se presenta un esquema de la planificación temporal de los
ensayos con ratones (Figura 16). En primer lugar se realizó la inmunización de los
grupos de ratones especificados en la Tabla 3, en tres dosis vías SC, IM e IN en los
tiempos cero, dos y tres semanas. Luego, de cada grupo experimental se utilizaron 6
ratones para los ensayos de linfoproliferación y cuantificación de citoquinas, mientras
41
Resultados
que los ratones restantes (5 de cada grupo) fueron utilizados para los ensayos de
desafío.
Figura 16. Planificación temporal de ensayos. Todos los ratones fueron inmunizados con tres dosis
a las semanas 0, 2 y 3, por las vías subcutánea (SC), intramuscular (IM) e intranasal (IN)
respectivamente. Durante la quinta semana se realizaron los ensayos de linfoproliferación de
citoquinas. Durante la quinta y sexta semana se realizaron los ensayos de desafío.
3.4.2 Respuesta inmune
Frente a una infección bacteriana, la respuesta inmune de tipo celular es
crucial para la inmunidad protectora de un hospedero. En este tipo de respuesta
existen dos tipos de células T ayudantes (Th, del inglés T helper) llamadas Th1 y
Th2, donde la interacción entre uno u otro tipo celular está fuertemente mediada por
la secreción de citoquinas. Las células de tipo Th1 secretan interleuquina 2 (IL-2) e
interferón-γ (IFN-γ) generando la activación de macrófagos y reclutamiento de
células mononucleares, mientras que aquellas del tipo Th2 secretan interleuquinas 4
y 10 (IL-4 e IL-10), responsables de una fuerte respuesta por anticuerpos e inhibición
de muchas funciones de los macrófagos. Las respuestas Th1 se desarrollan
preferentemente durante las infecciones por patógenos intracelulares (como es el
caso de S. Enteritidis), mientras que las células del tipo Th2 otorgan mayor
42
Resultados
protección frente a patógenos extracelulares (Fishman y Perelson, 1999, Lin y cols.,
2008). Por esta razón, se determinó el perfil de secreción de las citoquinas IFN-γ e
IL-4 para determinar el tipo de respuesta generada por la inmunización. Además, se
evaluó la linfoproliferación, efecto relacionado directamente con la generación de
memoria en las células efectoras del sistema inmunológico.
3.4.2.1 Linfoproliferación
Para evaluar el efecto de las vacunas sobre el sistema inmune del ratón, se
realizó un ensayo de linfoproliferación, en donde una suspensión de células de bazo
de cada grupo experimental (descrito previamente) se expuso a la proteína
recombinante o a la bacteria S. Enteritidis PT4 muerta por calor. Frente a este
estímulo, se evaluó la proliferación celular mediante la cuantificación de
radioactividad incorporada en el ADN (Figura 17).
Según los resultados obtenidos, se puede observar un aumento en la
linfoproliferación en el grupo de ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1002
respecto de los grupos controles vacunados con el vector vacío y solución salina,
efecto que se aprecia tanto en inducción con la proteína recombinante SEN1002/Flag
como en la inducción con la bacteria muerta por calor (Figura 17 A-B). En contraste,
esta respuesta no ocurre en los ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1395 (Figura
17 C-D).
3.4.2.2 Cuantificación de citoquinas secretadas
La cuantificación de citoquinas se realizó mediante kits ELISA y se ajustó la
absorbancia a valores de concentración en pg/ml mediante una curva de calibración
con muestras estándar.
Según se observa en la Figura 18, los sobrenadantes de los cultivos de
esplenocitos, tanto de ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1002 como con
pVAXFlag/SEN1395, contienen altos niveles de IFN-γ respecto de sus controles
43
Resultados
negativos. En contraste, los niveles de IL-4 se mantuvieron bajos en todos los
grupos.
Figura 17. Ensayo de Linfoproliferación. Cuatro grupos de ratones BALB/c se inmunizaron
independientemente con pVAXFlag/SEN1002, pVAXFlag/SEN1395, pVAXFlag o PBS.
Los esplenocitos obtenidos de los ratones de cada grupo se estimularon con distintos
antígenos: (A) proteína recombinante SEN1002/Flag (20 μg/ml), (B y D) S. Enteritidis PT4 muerta por
calor (4 μg/ml) y (C) proteína recombinante SEN1395/Flag (20 μg/ml). Cada barra equivale a las
cuentas por minuto emitidas por los cultivos celulares, evaluada por triplicado más la desviación
estándar (barras de error). *, P < 0,05 comparado con ambos controles del grupo A (vector vacío y
PBS); ** P < 0,05 comparado con ambos controles del grupo B (vector vacío y PBS).
44
Resultados
Figura 18. Cuantificación de citoquinas. Análisis mediante ELISA de las citoquinas IFN-γ e IL-4
secretadas in vitro por linfocitos estimulados con las proteínas recombinantes SEN1002-Flag (A) o
SEN1395-Flag (B) durante 24 horas. Las barras representan la concentración en pg/ml de las
citoquinas analizadas, obtenidas de un experimento por cada grupo experimental.
45
Resultados
3.4.3 Desafío con LK5 de ratones BALB/c inmunizados
Los ensayos de desafío se realizaron inoculando vía intraperitoneal a cinco
ratones de cada grupo experimental con 104 UFC de la cepa virulenta S. Enteritidis
LK5 y luego de dos semanas se determinó la cantidad de UFC de Salmonella por
bazo. Los resultados son expresados como Log10 de UFC contabilizadas.
En la Tabla 10 se observa que no hay diferencias significativas entre la
cantidad de UFC cuantificadas en los grupos experimentales y sus controles. Por
otra parte, en las placas sembradas con el grupo experimental pVAXFlag/SEN1395
no hubo crecimiento de bacterias.
Tabla 10. Recuento de Salmonella enterica LK5 a partir del bazo de
ratones vacunados. Para todos los grupos se realizó estadística con n=5.
Vacuna
Log10 UFC de S. enterica LK5 en
bazo (promedio ± SD)
Control salino, PBS
3,37 ± 0,18
Control pVAXFlag
3,36 ± 0,85
pVAXFlag/SEN1002
3,81 ± 0,42
pVAXFlag/SEN1395
Sin crecimiento
46
Discusión
4. DISCUSION
En esta tesis se propuso desarrollar nuevas vacunas contra S. Enteritidis que
otorguen una protección efectiva y de larga duración para prevenir la infección aviar y
la transmisión de la bacteria al hombre.
Desde esta perspectiva, se diseñó un nuevo vector de expresión a partir del
vector comercial pVAX1, al que denominamos pVAXFlag. Para obtener este
plasmidio, se clonó dentro de pVAX1 la secuencia 3xFlag asociada al gen de
resistencia a Amp (para su seguimiento por selección) desde el plasmidio pLTS, un
derivado de pSUB11 (Figura 6). En esta construcción, el gen de resistencia a Amp
genera un distanciamiento considerable entre el codón de stop de término de la
traducción y la zona de poliadenilación cercano a 1 kb de secuencia “inutilizable”, por
lo que se eliminó para descartar cualquier tipo de interferencia con la eficiencia del
proceso de transcripción (Figuras 7 y 8). De este modo, se sintetizó el vector
pVAXFlag de 3.030 pb, que posee:
•
Promotor de citomegalovirus (CMV) para un alto nivel de expresión de
proteínas en células eucariontes
•
Promotor del fago T7, secuencia que se emplea para amplificar y secuenciar
insertos en los vectores así como expresar genes en cepas bacterianas
adecuadas
•
Gen de resistencia a Kan para su selección en E. coli.
•
Señal de poliadenilación para un término eficiente de transcripción y
poliadenilación del ARN mensajero
•
Origen de replicación bacteriano pUC que permite la replicación en alto
número de copias en E. coli
•
Secuencia del epítopo 3xFlag, que posibilita la generación de una proteína
recombinante fusionada al epítopo, permitiendo la detección por Western blot
con el anticuerpo comercial anti-Flag M2.
Por otra parte, en el sitio de múltiple clonamiento de pVAXFlag se mantienen
algunos sitios de corte del plasmidio precursor que permiten fusionar el inserto a la
47
Discusión
secuencia 3xFlag (NheI, AflII, HindIII, Asp718I, KpnI y BamHI), así como sitios que
posibilitan la inserción de un fragmento aislado (XhoI, XbaI, DraII, ApaI) como se
muestra en la Figura 19.
Esta nueva construcción permite clonar una gran variedad de secuencias
inmunogénicas y facilita la detección de las proteínas recombinantes, simplificando el
desarrollo de nuevas vacunas de ADN.
Figura 19. Secuencia de pVAXFlag, nucleótidos 661 al 960. La secuencia 3xFlag
está inserta dentro del sitio de múltiple clonamiento de pVAXFlag.
Hemos identificado dos secuencias en Salmonella Enteritidis que, de acuerdo
a los antecedentes mencionados previamente, representan un blanco favorable en la
construcción de nuevas vacunas. Estos genes, SEN1002 y SEN1395, se
amplificaron desde la cepa NCTC13349 de S. Enterididis excluyendo en ambos
casos el codón de término de traducción para permitir la fusión al segmento 3xFlag.
Por otra parte, las secuencias SD y KZ se anexaron al extremo 5’ para mejorar la
eficiencia de traducción en procariontes y eucariontes, respectivamente. Estas
secuencias (SD y KZ) no interfieren en la estructura de la proteína, pues como se
observa en la Figura 10 no se expresan en la proteína recombinante, permitiendo en
tal condición que dicha proteína se pueda producir eficientemente y en altas
cantidades.
Estos productos de PCR se clonaron independientemente en pVAXFlag entre
los sitios HindIII y BamHI del sitio de múltiple clonamiento, permitiendo la fusión con
48
Discusión
la secuencia 3xFlag manteniendo el marco de lectura en fase, como se muestra en la
Figura 10.
Las construcciones se confirmaron por PCR y por el tamaño plasmidial, como
se observa en las Figuras 11 y 12, donde en ambas ocasiones se lograron patrones
de migración de acuerdo a los tamaños esperados (pVAXFlag 3.030 pb;
pVAXFlag/SEN1002 3.506 pb; pVAXFlag/SEN1395 3.569 pb). No obstante, la
confirmación final se realizó mediante la secuenciación de todas las construcciones,
de modo de descartar modificaciones que, pese a mantener el tamaño y la estructura
de los plasmidios, pudieran afectar su funcionalidad.
Como se observa en la Tabla 6, la secuencia del vector de clonamiento
pVAXFlag posee dos mutaciones puntuales marcadas con “*”. Una de ellas se
encuentra incluida en la secuencia del epítopo 3xFlag, produciendo un cambio de
aminoácido de histidina (CAU) a arginina (CGU) que se repite en todas las
construcciones (Tablas 8 y 9). La segunda mutación se encuentra alejada de las
secuencias de interés, siendo de menor importancia.
En la secuencia de pVAXFlag/SEN1002 no hay modificaciones a excepción de
la mutación correspondiente al vector original pVAXFlag (Tabla 7) como se mencionó
anteriormente, mientras que en pVAXFlag/SEN1395 sí se generó una mutación extra
(Tabla 8). Esta modificación produce un cambio del aminoácido 169 de serina a
leucina en la región carboxilo terminal de la proteína. Sin embargo, esta alteración no
debiera generar un debilitamiento en la capacidad inmunogénica de la proteína, pues
de acuerdo al diagrama de residuos antigénicos de la proteína SEN1395 (Figura 5)
este aminoácido se encuentra en una región de bajo índice, manteniendo intactas las
zonas de mayor índice de antigenicidad. Por otra parte, el largo de la proteína
permite generar distintas zonas de reconocimiento por anticuerpos, por lo que, si sólo
una se ve afectada, es posible que otras regiones generen igualmente la respuesta
inmune esperada.
Con lo anterior, se confirmó la construcción de todos los vectores, mas no la
funcionalidad. Para este propósito, y frente a la presencia del promotor del fago T7,
los plasmidios se transformaron en E. coli BL21(DE3), cepa bacteriana cuya RNA
polimerasa T7 es inducible por IPTG. Este sistema permite detectar rápida y
49
Discusión
fácilmente la producción de proteínas debido a las ventajas del trabajo con bacterias
(alta replicación del plasmidio, expresión inducible, bajo costo, fácil manipulación,
entre otras).
Las proteínas recombinantes producidas por estas bacterias correspondieron
al tamaño esperado de la fusión entre los genes de Salmonella y el epítopo 3xFlag
(21 kDa SEN1002/Flag y 23,7 kDa SEN1395/Flag), como se muestra en la Figura 13
(izquierda). Cabe hacer notar que el nivel de proteínas totales producido por la
bacteria disminuye en aquellos casos en que la producción de proteína recombinante
está inducida (IPTG). Esto es debido a que los vectores construidos son de alto
número de copias, por lo que en el proceso de inducción toda la maquinaria
transcripcional y traduccional es secuestrada para trabajar en nuestro sistema, dando
paso a la reducción en la producción de proteínas esenciales y por tanto muerte
celular.
Al detectar las proteínas mediante Western blot (Figura 13, derecha), además
de la producción de las proteínas, se comprobó la funcionalidad del epítopo, lo que
demostró que la mutación encontrada en dicha secuencia no afectó tal propiedad.
Por otra parte, las proteínas se detectaron aún en condiciones represoras,
demostrando que el sistema de expresión es altamente eficiente. En condiciones
inducidas se observó un bandeo de proteína detectado por Western blot, marcas que
se atribuyen posiblemente a la degradación de la proteína recombinante, detectables
debido a los altos niveles de producción.
Para los estudios en células eucariontes, y debido a la complejidad del ensayo
de transfección, se construyó el plasmidio pVAXFlag/GFP. Estructuralmente, esta
construcción es similar a las vacunas de Salmonella, debido a que se clonó con las
mismas características genéticas (SD, KZ, sin codón de stop) entre los mismos sitos
de corte (HindIII y BamHI) y posee un tamaño similar (GFP/Flag 30 kDa
aproximadamente). De esta manera, se pudo determinar cualitativamente que, bajo
determinadas condiciones (Figura 14F; 24 horas de reacción, 800 ng de plasmidio,
2 μg de lipofectamina y aproximadamente 100% de confluencia celular en una
superficie de 9,4 cm2) se obtiene una mayor producción de las proteínas codificadas
en pVAXFlag en células HEK 293.
50
Discusión
Con estos parámetros, se determinó la producción de las proteínas
SEN1002/Flag y SEN1395/Flag en dicho modelo celular (Figura 15) confirmando la
funcionalidad de las construcciones tanto para un sistema procarionte como
eucarionte. Adicionalmente, y debido a la correcta emisión de fluorescencia por parte
de la proteína GFP/Flag, es posible inferir que la fusión de la proteína silvestre al
marcador no interfiere en la función (estructura) de la proteína de interés.
Habiendo caracterizado las construcciones en modelos in vitro, se procedió a
estudiar la funcionalidad de las vacunas en ratones BALB/c.
El ensayo de linfoproliferación permite evaluar la respuesta inmune de
linfocitos T luego de las inmunizaciones. En este sentido, los ratones inmunizados
con pVAXFlag/SEN1002 fueron capaces de responder frente a la inducción tanto por
la proteína recombinante como por el lisado de bacteria (Figura 17 A-B), no así los
ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1395 que no proliferaron de manera
significativa respecto de los controles. Pese a esto, en ambos casos se detectaron
altos niveles de IFNγ secretados y bajas cantidades de IL-4 (Figura 18), datos que
indican que la inmunización con las vacunas construidas induce una respuesta
inmune celular Th1, esencial para la defensa frente a patógenos intracelulares como
S. Enteritidis.
Sin embargo, esta respuesta no fue suficiente para generar protección inmune
en los ratones desafiados con la cepa virulenta LK5 manteniendo inalterable la
magnitud de bacterias recuperadas (Tabla 10). No obstante, estos resultados son de
gran relevancia ya que al obtener la respuesta inmune de tipo celular Th1 como
esperábamos, es posible considerar que la estrategia utilizada en los desafíos no fue
la más adecuada, pudiendo modificar ciertos parámetros experimentales como
cantidad de inóculo y/o vía de inoculación, o bien replantear las tácticas de
inmunización en los mismos parámetros (concentración de plasmidio y/o vías de
inmunización).
Lejos de ser un resultado adverso, la estrategia desarrollada nos permitió
establecer una aproximación importante en la producción de vacunas de ADN para
Salmonella Enteritidis, hasta la fecha inexistentes en la literatura. En este sentido, la
única publicación relacionada refiere a una vacuna de ADN diseñada con el gen
51
Discusión
sopB contra S. enterica serovar Typhimurium en un modelo de ratones BALB/c
(Arvindhan y cols., 2009). Sin embargo, sólo ha sido estudiada de manera conjugada
con la bacteria atenuada y los resultados podrían atribuirse tanto a la vacuna de ADN
como a la bacteria, siendo este trabajo, en contraste, el primero en evaluar de
manera independiente la eficacia de vacunas de ADN contra Salmonella enterica.
Por otra parte, el vector que hemos desarrollado es una poderosa herramienta
para el campo de la inmunología, de fácil manipulación, detección y producción,
proporcionando un adelanto considerable ya que no sólo es útil para nuestro
patógeno, sino que puede ser ampliado a otros organismos en distintas áreas de
investigación.
52
Conclusiones
5. CONCLUSIONES
•
pVAXFlag es un nuevo vector de alto número de copias y fácil manipulación
que permite generar proteínas recombinantes potencialmente antigénicas para
su uso como vacunas de última generación. El clonamiento en este vector
genera proteínas fusionadas al epítopo 3xFlag lo que posibilita la detección de
cualquier fragmento producido con el anticuerpo comercial anti-Flag M2.
•
Los
plasmidios
construidos
expresan
correctamente
las
proteínas
recombinantes en células eucariontes in vitro. Además, dado que la proteína
GFP/FLAG codificada en el vector pVAXFlag/GFP mantiene la emisión de
fluorescencia, demuestra que el epítopo Flag no perjudica la funcionalidad de
los productos.
•
Las vacunas construidas (y el vector vacío) son inocuas para ratones BALB/c.
•
pVAXFlag/SEN1002 es capaz de inducir respuesta inmune en ratones BALB/c
pues produce un aumento en la linfoproliferación de esplenocitos, así como un
aumento
en
la
secreción
de
INFγ
y
disminución
de
la
citoquina
inmunosupresora IL-4. De manera similar, pVAXFlag/SEN1395 genera el
mismo patrón de secreción de citoquinas a pesar de no tener un efecto
evidente en linfoproliferación.
•
Si bien hubo respuesta inmune generada por ambas vacunas, en las
condiciones evaluadas en esta tesis, no fue posible generar algún efecto de
protección frente al desafío con LK5 de ratones inmunizados.
•
Las vacunas construidas proporcionan un adelanto considerable en el área
inmunológica, siendo éstas las primeras vacunas desarrolladas contra S.
enterica serovar Enteridis
53
Referencias
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