reacciones generales de caracterización de aminoácidos y proteínas.

Prácticas de Bioquímica I
Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
REACCIONES GENERALES DE
CARACTERIZACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y
PROTEÍNAS.
Objetivos
Al terminar esta práctica el estudiante estará en capacidad de:
-
Aplicar pruebas químicas para la determinación cualitativa de aminoácidos.
-
Conocer la importancia de los grupos R en la determinación cualitativa de los
aminoácidos.
-
Emplear reacciones específicas para la caracterización de proteínas.
Introducción
Los aminoácidos son las unidades estructurales más simples (monómeros) que
componen la estructura de las proteínas; están constituidos por un grupo amino (NH2
o NH3+), un grupo carboxilo (COOH o COO-) unido al carbono 2 de la molécula, un
átomo de hidrógeno y una cadena radical conocida también como grupo R. Esta
última es específica para cada aminoácido y contribuyen a la identificación de los
mismos.
La presencia de estos grupos químicos en la estructura de los aminoácidos es
lo que determina que estas moléculas intervengan en un gran número de reacciones
químicas.
Las reacciones pueden ir de lo general, como es el caso de la reacción de la ninhidrina
o la de Biuret, hasta lo muy específico como veremos en el desarrollo de este trabajo
práctico.
1
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Prácticas de Bioquímica I
Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
MATERIALES Y REACTIVOS
-
Tubos de ensayo
-
Pipetas graduadas de 1, 2 y 5 mL
-
Baños de María
-
Goteros
-
Pinzas para tubo de ensayo
-
Cilindro graduado
-
Soluciones al 0,2% de los aminoácidos disponibles en el laboratorio.
-
Solución de albúmina al 0,5 %
-
Reactivo de ninhidrina: preparada al 0,1 % en etanol
-
Acetato de plomo al 10 %
-
NaOCl al 10 %
-
NaOH al 30 %
-
HNO3 Concentrado
-
Reactivo de Millon: disolver 40 g de mercurio metálico en 57 mL de HNO3 y
aforar con cuidado a 100 mL con agua destilada
-
Reactivo de Biuret: puede presentarse como una mezcla, combinando
previamente sulfato de cobre e hidróxido de sodio. En dicho caso se usarán 0,5
mL de dicha mezcla
Reacción de la Ninhidrina
Consiste en la reacción del grupo amino y/o carboxilo libre de los aminoácidos
y las proteínas con la ninhidrina. Esta es una de las reacciones de uso frecuente en el
estudio químico de los aminoácidos, péptidos y proteínas. Se fundamenta en la
reacción de la ninhidrina frente a las moléculas que poseen funciones amínicas y
carboxílicas libres, formándose un compuesto final de color violáceo.
En esta reacción, cada equivalente de aminoácido reacciona con dos
equivalentes de ninhidrina. Aunque la reacción de la ninhidrina con aminoácidos y
proteínas es de fácil ejecución, esta lleva implícita varias etapas:
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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
1. Condensación de la Ninhidrina con el aminoácido:
O
O
OH
H2O
O
H3N+ CHC OR
O
O
NCHC OH
aminoácido
OH
O
O
R
O
O
2. Formación de la base de Schiff:
O
O-
R
N CHR
NCHC OH
O
O
+ CO2
O
3. Formación del dicetohidrindeno:
O-
ON CHR
H2O
NH2
+ CHO R
O
O
4. Condensación del amino-dicetohidrindeno con otra molécula de ninhidrina:
O
ONH2
O
O
ON
+ O
O
O
O
El último compuesto en esta cadena de reacciones es de color azul violáceo, e
indica la presencia de grupos carboxilo y/o amino libres en la muestra analizada.
Experimento 1
Prueba de la Ninhidrina.
En tres tubos de ensayo rotulados (1, 2 y 3) coloque 2 mL de aminoácido (tubo 1), de
proteína (tubo 2) y de compuesto desconocido (tubo 3). Agregue a cada tubo 10 gotas
de reactivo de ninhidrina y agite suavemente.
Coloque los tubos en baño de agua hirviente durante al menos 10 minutos.
En caso positivo la solución se tornará violeta lo que indica la presencia de
aminoácidos y/o proteínas con grupos amino o carboxilo libres
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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
Reacción de Biuret:
Es una reacción general para la identificación de péptidos y/o proteínas. Se le
da ese nombre debido a que el color que se produce en esta reacción, es similar al de
la condensación de dos moléculas de urea (H2N=C=NH2), conocido en alemán como:
Biuret. Se fundamenta en la formación de un compuesto azul violeta por la reacción
del ión cúpicro con el péptido o proteína en medio alcalino. Este ión forma un enlace
covalente coordinado con los enlaces peptídicos (ver reacción).
La reacción dará resultado positivo si el compuesto analizado posee al menos
dos enlaces peptídicos en su estructura. En el caso de los aminoácidos y dipéptidos la
reacción es negativa. Si se observa la reacción se verá claramente porqué hacen falta
dos enlaces:
C
O
N H
2
O
Cu
CH
C
C
R
OH
CH
Cu
-
O
N H
CH
R
C
O
++
C
H N
E nlaces Peptídicos
O
NH
H N
++
R
O
C
N H
Enlace covalente coordinado
Experimento 2
Prueba de Biuret
En tres tubos de ensayo debidamente rotulados (1, 2 y 3) agregue 2 mL de cualquier
aminoácido disponible (tubo 1), de albúmina (tubo 2) y de compuesto desconocido
(tubo 3).
Añada a todos los tubos 5 gotas de CuSOa 1 % y 5 gotas de NaOH 30%.
Agite suavemente y observe la aparición de un color violeta que indica la presencia de
péptidos o proteínas. El color celeste indica que el resultado es negativo.
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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
Reacción de Sullivan
En esta reacción se detecta la presencia de aminoácidos azufrados (portadores
de grupos sulfhidrilos (-SH) y disulfuros (-S-S) como la cisteína y la cistina
respectivamente.
Se basa en la alcalinización de la muestra que contiene el azufre produciéndose Na2S
el cual en presencia de acetato de plomo forma un precipitado negruzco de sulfuro de
plomo (PbS).
Las proteínas que contengan estos grupos también darán positiva esta reacción. La
misma se desarrolla de la siguiente manera:
1.
O
O
+
H3N
CH C
O-
+
+ 2NaOH
H3N
CH C
CH2
CH2
SH
OH
O-
+ Na2S + H2O
serina
Cisteina
2.
Na2S + (CH3COO) 2Pb
2CH3COONa
+ PbS
Experimento 3
Prueba de Sullivan
En tres tubos de ensayo rotulados 1, 2 y 3 agregue: 2 mL de cisteína (tubo 1),
albúmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3). Adicione con cuidado 1 mL de
NaOH al 30% y 5 gotas de acetato de plomo al 10% a todos los tubos.
Mezclar y calentar a 100 °C de 2 a 3 minutos.
En caso positivo se formará un precipitado negruzco de PbS.
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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
Reacción de Sakaguchi
Está reacción es específica para la identificación del grupo guanidino. Se
fundamenta en la condensación del grupo guanidino con el α-naftol en un medio
altamente oxidante, con la posterior producción de un compuesto de color rojo
intenso.
Esta prueba da positiva frente a la arginina así como a las proteínas que contienen este
aminoácido.
O
H3N CH C OCH2
CH2
CH2
+
H3N CH C O
+
CH2
CH2
CH2
OH
+
NH
O
C NH2
alfa naftol
NH
C NH
NH2
Cromógeno rojo
Arginina
Experimento 4
Prueba de Sakagushi
En tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) agregue 2mL de arginina
(tubo 1), albúmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3).
Añada 3 gotas de NaOH al 30% a cada uno y agite suavemente.
Agregar 3 gotas de α-naftol al 0,5 % en etanol a todos los tubos y mezcle bien.
Posteriormente agregue a los tubos 1 mL de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 14%.
La positividad de la reacción se observará de inmediato en los tubos que contengan
arginina, bien sea libre o como parte de la estructura de una proteína.
Reacción
Xantoproteica:
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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
Permite identificar aminoácidos que tienen anillo bencénico en su estructura,
tales como la fenilalanina o la tirosina. En esta reacción el aminoácido reacciona con
ácido nítrico concentrado, ocurriendo la nitración del anillo aromático Como
productos finales de la reacción se forman nitroderivados de color amarillo.
O
+
H32N
CH C
CH2
O
-
O
+
+
H32N
CH C
O-
CH2
HNO3
NO2
OH
OH
Tirosina
Tisosina nitrada
(amarillo)
Experimento 5
Prueba xantoproteica
En tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) coloque 2 mL de tirosina
(tubo 1), albúmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3).
Agregue 2 mL de HNO3 concentrado a cada tubo y caliente los tubos en un baño de
agua hirviendo de 1 a 3 minutos.
La aparición de un color amarillo indica una
reacción positiva para aminoácidos aromáticos.
Reacción de Millon:
Tiene especificidad para detectar la presencia de tirosina o de proteínas que la
contengan. Es una variante de la reacción xantoproteíca, identifica los compuestos que
contienen un grupo -OH ligado al anillo bencénico. En dicha reacción además de la
nitración del anillo fenólico, se incorpora a su estructura el mercurio (Hg++)
produciéndose un derivado mercúrico de nitrotirosina de color rojo.
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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
O
+H N
3
CH C
O
O-
+H
CH2
3N
CH C
O-
CH2
+ HgNO2
N O
OH
OHg
Tirosina
Compuesto mercúrico
de Tirosina
Experimento 6
Prueba de Millon
Coloque en tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) 2 mL de tirosina
(tubo 1), de albúmina (tubo 2) y de compuesto desconocido (tubo 3).
Añada a cada tubo 0,2 mL de reactivo de millon.
Calentar cuidadosamente sin llegar a ebullición. En caso positivo se observará una
coloración rojiza.
Auto evaluación
1. Explique porque aminoácidos como la cistina dan una reacción positiva a la
reacción de Sullivan.
2. Explique el fundamento de la reacción de Biuret.
3. Diga las aplicaciones de la reacción xantoproteica.
4. ¿Cómo cree usted que resultaría la reacción de Biuret si la
aplicamos a un
dipéptido?
5.- ¿Porque un aminoácido resulta negativo a la reacción de Biuret?
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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas
Bibliografía
Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España 1.983.
Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory
techniques. Saunders editores. 1976.
Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981.
Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.
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