potencial de nanopartículas de plata inmovilizadas mediante la

POTENCIAL DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA
INMOVILIZADAS MEDIANTE LA TÉCNICA DE ULTRASONIDO
RECUBIERTAS EN CORCHO GRANULAR COMO AGENTE
MICROBIANO
DANIEL PORTILLO ALEJO
INSTITUTO DE SOSTENIBILIDAD
Barcelona
2015
a
Trabajo de investigación para optar al título de Master en Sostenibilidad
Director:
D.Sc. Jordi Morato
INSTITUTO DE SOSTENIBILIDAD
Barcelona
2015
DANIEL PORTILLO ALEJO
b
“Prohibida la reproducción sin la autorización expresa del autor(a)”
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE CATALUÑA
Barcelona
2015
c
PREFACIO
La realización de éste trabajo fue hecho posible bajo el marco de la Cátedra
UNESCO de Sostenibilidad en Terrassa, Barcelona, España y dirigida por
el Doctor Jordi Morató, quien proveyó la coordinación, material e
instalaciones para el desarrollo de el mismo. De la misma manera, parte de
la investigación fue llevada a cabo dentro de las instalaciones de el Grupo
Biomolecular e Industrial cuyo laboratorio tiene su ubicación en Terrassa,
Barcelona, España y es dirigido por el Doctor Tzanko Tzanov, donde, bajo
un marco de colaboración, se obtuvo asesoría invaluable para éste
proyecto.
Dicho proyecto es la continuación del trabajo iniciado por el M.C. Lucas
Blandón bajo el mismo marco de colaboración.
El tema principal de éste trabajo de Tesis es acerca del “Potencial de
Nanopartículas de Plata Sintetizadas mediante la Técnica de Ultrasonido
Inmovilizadas en Corcho Granular como un Agente Antimicrobiano para
uso en Humedales Construidos”.
La especialización de este proyecto hecho durante el primer año del
programa de Master en Sostenibilidad es el primer enfoque del uso de
Nanopartículas de Plata recubiertas en Corcho Granular de desecho
encontrando en este material un uso importante y sostenible.
d
1. Agradecimientos
El escritor le gustaría expresar profunda gratitud a Lucas Blandón por toda
su ayuda, camaradería y buenos consejos. Agradecer también a Antonio
Francesko por el gran apoyo, guía y sabiduría que compartió, a todo el
Grupo de Biotecnología Molecular de la UPC por su paciencia y
amabilidad, así como también Tzanko Tzanov por haberme dado la
oportunidad de trabajar en y ser parte de su Grupo. Por último y no por eso
menos importante, quisiera agradecer a Jordi Morató por dejarme ser parte
de éste importante proyecto suyo, por darme la confianza y paciencia para
llevar a cabo el trabajo, compartir su visión, su invaluable ayuda, así como
los buenos consejos durante mi tiempo en La Cátedra UNESCO de
Sostenibilidad de la Universidad Politécnica de Cataluña.
A CONACYT por solventar todos los gatos referentes a mi formación
académica en el extranjero.
A mi familia, amigos y compañeros que nunca dejaron de creer en mi,
Gracias.
e
f
CONTENIDO LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... 9 LISTA DE ANEXOS ......................................................................................................... 12 LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................. 13 2. RESUMEN .............................................................................................................. 14 3. MARCO TEÓRICO ................................................................................................... 16 3.1 Introducción ................................................................................................................ 16 3.2 Nanopartículas de plata. .............................................................................................. 17 3.2.1 El ambiente y las nanopartículas de plata ................................................................... 18 3.2.2 Toxicidad de las nanopartículas de plata .................................................................... 19 3.3 Distintos métodos de Síntesis de AgNPs. ..................................................................... 21 3.3.1 Síntesis de AgNPs mediante reducción química .......................................................... 23 3.3.2 Síntesis de AgNPs mediante Ultrasonido .................................................................... 26 3.4 Uso de polímeros para la estabilización y modificación superficial de AgNPs. .............. 28 3.5 Uso del corcho como sustrato para inmovilización de AgNPs. ...................................... 29 3.6 Actividad antimicrobiana de las AgNPs ........................................................................ 32 4. OBJETIVOS ............................................................................................................. 33 4.1 Objetivo general: ......................................................................................................... 33 4.2 Objetivos específicos: .................................................................................................. 33 5. METODOLOGÍA ..................................................................................................... 34 5.1 Síntesis de AgNPs. ....................................................................................................... 34 5.1.1 Síntesis mediante reducción química con borohidruro de sodio. ............................... 34 5.1.2 Síntesis de AgNPs mediante Ultrasonido .................................................................... 35 5.2 Caracterización de AgNPs ............................................................................................ 38 5.2.1 Espectroscopía UV-­‐Visible. .......................................................................................... 38 5.2.2 Dispersión de luz dinámica. ......................................................................................... 39 5.2.3 Microscopia electrónica. ............................................................................................. 39 5.3 Cálculo de rendimiento de reacción de AgNPs ............................................................. 40 5.4 Inmovilización de AgNPs sobre residuos de corcho ...................................................... 40 5.4.1 Preparación de suspensiones de AgNPs ...................................................................... 40 5.4.2 Preparación del material de soporte ........................................................................... 42 7
5.4.3 Preparación y medición de actividad enzimática de Lacasa. ....................................... 42 5.4.4 Inmovilización del híbrido AgNP-­‐Polímero sobre corcho ............................................ 42 5.5 Evaluación antimicrobiana del corcho modificado. ...................................................... 44 5.6 Estudios de fitotoxicidad de AgNPs. ............................................................................. 45 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 47 6.1 Caracterización de AgNPs sintetizadas Ultrasónicamente teniendo como variables de estudio Temperatura y Tiempo. ....................................................................................... 47 6.1.1 Tamaño de partícula medido por DLS, ........................................................................ 47 6.1.2 Imágenes TEM ............................................................................................................. 48 6.2 Caracterización de AgNPs sintetizadas mediante Reducción Química. .......................... 50 6.2.1 Tamaño de partícula medido por DLS, ........................................................................ 50 6.3 Evaluación de fitotoxicidad. ......................................................................................... 54 6.4 Inmovilización de AgNPs sobre corcho. ........................................................................ 56 6.5 Evaluación antimicrobiana de AgNPs inmovilizadas sobre corcho ................................ 56 6.6 Costos de producción de AgNPs ................................................................................... 60 7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS .................................................................................. 62 8. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 65 9. TRABAJO A FUTURO .............................................................................................. 66 10. ANEXOS .............................................................................................................. 67 11. REFERENCIAS ....................................................................................................... 68 8
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Clasificación de nanomateriales en cuanto a su composición y la morfología. ... 17 Figura 2. Aplicaciones de AgNPs ........................................................................................ 18
Figura 3. Factores que favorecen la toxicidad intrísenca de las AgNPs... 14
Figura 4. Métodos de síntesis de AgNPs ............................................................................. 22 Figura 5. Etapas de la síntesis de AgNPs. ............................................................................ 23 Figura 6. Estructura propuesta para la Lignina. ................................................................... 23 Figura 7. Esquema general de formación de materiales nanométricos ................................ 34 Figura 8. Esquema de síntesis de AgNPs mediante reducción con NaBH4 ......................... 28 Figura 9. Ejemplo de equipo utilizado para la síntesis Ultrasónica de AgNPs .................... 29 Figura 10. Fotografía de AgNPs sintetizadas con técnica de Ultrasonido. .......................... 38 Figura 11. Esquema de la metodología para la inmovilización de AgNPs sobre corcho .... 43 Figura 12. Esquema de la metodología llevada a cabo para evaluar la actividad
antimicrobiana del corcho con AgNPs. ................................................................................ 37 Figura 13. Características de una semilla de rábano luego de un tiempo de germinación
de 5 días................................................................................................................................ 46 Figura 14. Imágenes TEM de AgNPs sintetizadas ultrasonicamente: AgNP 0.1 %
Quitosano 60 minutos (sup. derecha),
AgNP 0.1% Quitosano 30 minutos (sup.
Izquierda), AgNP 0.5% Quitosano 30 minutos (inf. Derecha), AgNP 0.5% Quitosano 60
minutos (inf. Izquierda). Todas las imágenes tienen una escala de 100 nm. ...................... 49 Figura 15. Tamaño de particular de AgNPs con y sin polímeros ........................................ 44 Figura 16. Espectros UV-Vis de AgNPs, (a) AgNPs-CS, (b) AgNPs-AC, (c) AgNPs sin
polímero, (d) Comparación AgNPs, AgNPs-CS y AgNPs-AC ........................................... 46 Figura 17. Longitud promedio de la radícula y el hipocótilo del rábano germinado para
cada una de las muestras evaluadas...................................................................................... 47 Figura 18. Ruta de reacción para la inmovilización de AgNPs sobre corcho ...................... 56
9
Figura 19. Captura de pantalla tomada del sitio www.sigmaaldrich.com. Se puede
observar
precio
estimado
de
solución
de
AgNPs................................................................................ 56
10
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Diferentes metodologías de reducción química para sintetizar AgNPs. ................ 26 Tabla 2. Resumen de Métodos de Síntesis de AgNPs. ........................................................ 27 Tabla 3. Algunos soportes usados para inmovilizar AgNPs. ............................................... 30 Tabla 4. Características de los polímeros usados para modificar AgNPs para inmovilizar
sobre corcho. ........................................................................................................................ 41 Tabla 5. Comparación de tamaños de partícula medidos por DLS. ..................................... 47 Tabla 6. Comparación de tamaño de partícula de AgNPs mediante UV-Vis, DLS y TEM 50 Tabla 7. Índice de germinación de rábano. .......................................................................... 55 Tabla 8. Actividad antimicrobiana de corcho modificado con AgNPs frente al
microorganismo E. Coli ....................................................................................................... 58 Tabla 9. Actividad antimicrobiana de corcho modificado con AgNPs sintetizadas
mediante técnica de ultrasonido y por reducción química, frente al microorganismo E.
Coli. ...................................................................................................................................... 59
Tabla 10. Reactivos utilizados para la producción de AgNPs con precios por Kg.............. 55
11
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Imágenes de platos petri para evaluación de actividad antimicrobiana de
AgNPs inmovilizadas sobre corcho................................................................................... 57 12
LISTA DE ABREVIATURAS
AgNPs: Nanopartículas de plata
NPs: Nanopartículas
M.O: Microorganismo
D.O: Densidad óptica
E. C Escherichia coli
S.A : Staphylococcus aureus
P. A Pseudomona aeruginosa
UFC: Unidades formadoras de colonia
ZEA: Zearalenona
NPM: Nanopartículas metálicas
AC: EDA-Amino celulosa
CS: Quitosán
DLS: Dispersión de luz dinámica
DPT: Distribución de tamaño de partícula
TEM: Microscopía electrónica de transmisión
Q: Carga
T: Temperatura
t: Tiempo
HLB: Balance hidrofílico-lipofílico
CMC: Concentración crítica micelar
13
2. RESUMEN
Las nanopartículas de plata (AgNPs) han sido ampliamente usadas en las últimas
décadas gracias a sus aplicaciones en áreas como la catálisis y la medicina. En catálisis,
los principales focos de estudio se basan en la oxidación de compuestos como metanol y
etanol, como propuesta para un posible método de obtención de hidrógeno molecular.
En cuanto a las aplicaciones médicas, se ha probado que las AgNPs pueden reducir
significativamente muchas infecciones bacterianas. Con este tipo de nanopartículas se
han realizado estudios de actividad antibacterial con bacterias como Streptococcus
mutans, Escherichiacoli y Staphylococcus aureus.
Entre los métodos usados para sintetizar estos materiales se destacan: la reducción
química y la síntesis ultrasónica. La primera de ellas requiere poco instrumental y es
relativamente económica, mientras que la segunda presenta algunas ventajas sobre los
otros métodos debido a la sencillez en cuanto al control de las variables de síntesis, y la
posibilidad de controlar eficientemente fenómenos de nucleación, crecimiento y
velocidad de reacción, mediante la modificación de variables experimentales como el
potencial eléctrico y la densidad de corriente.
En el proceso de síntesis, independiente de cuál sea, juega una vital importancia el tipo
de sistema usado para la síntesis (electrolitos, surfactantes, solventes, etc), así como la
velocidad a la que se lleve a cabo la reacción. Para el caso de la síntesis mediante
reducción química, el tipo de agente reductor es una de las variables a tener en cuenta,
así como el tipo de agente estabilizante que se use. Para el caso de la reacción
electroquímica para la síntesis de AgNPs depende de variables como la densidad de
corriente, el electrolito y los electrodos usados y el tiempo de reacción.
Teniendo en cuenta lo anterior, en el presente trabajo se planteó como objetivo
principal, sintetizar AgNPs por método ultrasónico y mediante reducción química en
pro de evaluar diferentes aplicaciones de estos materiales las áreas de catálisis así como
en el área de la biomedicina, como agente antimicrobiano. Para esto, esta investigación
se centró en primera instancia, en la puesta a punto de un método de síntesis química,
basados en los reportes de la literatura, usando como agente reductor borohidruro de
sodio (NaBH4) y en presencia de diferentes polímeros cuya función era la de estabilizar
14
y modificar superficialmente las AgNPs. Por otra parte, se realizó también un método
ultrasónico para la síntesis de AgNPs, usando un sistema de electrodo en el que se
evaluó el efecto de la sonificación, la temperatura de síntesis y el tiempo de exposición
en el sistema. Los materiales sintetizados fueron caracterizados mediante DLS, TEM y
espectrofotometría UV-Vis. Se correlacionó la relación entre la carga obtenida y la
concentración de AgNPs así como la relación entre diferentes parámetros obtenidos por
UV-Vis con el tamaño de partícula medido por DLS y por TEM. Los materiales
obtenidos presentaron buenas características en cuanto a su morfología y su distribución
de tamaño de partícula, obteniéndose en todos los casos, diámetros inferiores a 100 nm.
Se evaluó la actividad antimicrobiana de AgNPs en suspensión frente a diferentes
microorganismos de interés, y se probó la viabilidad para inmovilizar AgNPs sobre
residuos de corcho. Los materiales obtenidos presentaron un buen desempeño en cuanto
a la actividad antimicrobiana, obteniéndose concentraciones mínimas inhibitorias
inferiores a 1 mg/L de AgNPs en suspensión e inhibición de hasta 90% cuando éstas se
inmovilizaron sobre corcho.
15
3. MARCO TEÓRICO
3.1
Introducción
En una conferencia impartida en 1959 por algunos de los mejores científicos del siglo
pasado, el premio Nobel en física Richard Feynman, predijo que "había mucho espacio
al fondo" (el título original de la conferencia fue “There’splenty of room at the bottom”)
y auguraba una gran cantidad de nuevos descubrimientos si se pudiera fabricar
materiales de dimensiones atómicas o moleculares [1]. Hubo que esperar hasta la
década del 80 para tener verdaderos avances en el área de la nano ciencia, pero a partir
de ahí la cantidad de producciones científicas en esta área creció de manera casi
exponencial. Los estudios iniciales en nanopartículas se enfocaron principalmente en las
propiedades que derivaban de su gran área superficial y a la posibilidad de confinar
carga eléctrica, mientras que actualmente estos trabajos se han enfocado en el ensamble
controlado de materiales a nivel nanométrico para usos en diferentes áreas tecnológicas
como optoelectrónica, sistemas de almacenamiento de energía y de información,
catálisis, electrónica, entre otras áreas [2]
La clasificación de los materiales nanométricos, es un tema en el que los autores no
logran ponerse de acuerdo. Algunos, concuerdan en que un material se considera
nanométrico cuando por lo menos una de sus dimensiones es inferior a 100 nm. En
general, estos materiales se pueden clasificar según el tipo de dimensión (1, 2 o 3
dimensiones) y su composición. En esta última, se diferencian principalmente tres tipos
de materiales: los de carbono y basados en carbono, que incluyen toda la gama de
partículas poliméricas, nanotubos de carbono, etc; nanopartículas cerámicas que se
obtienen a partir de materiales cerámicos (inorgánicos no metálicos) teniendo
temperaturas de fusión y resistencias mecánicas bastante elevadas; y las
nanopartículas metálicas las cuales a su vez se clasifican en dos clases, las de valencia
cero y las que se encuentran en forma oxidada [3]. Las nanopartículas metálicas tienen
aplicaciones en optoelectrónica, sistemas de almacenamiento de energía, catálisis,
marcación biológica, fotografía y fabricación de baterías [4-7].
Tradicionalmente los métodos de fabricación de nanopartículas metálicas son: molienda
mecánica, pirolisis de pulverización, precipitación química y deposición por vapor [8],
16
sin embargo, en los últimos años se han desarrollado nuevos métodos de síntesis que
utilizan reductores fuertes, descomposición térmica, ablación por láser, irradiación con
microondas, síntesis sonoquímica y métodos electroquímicos, dependiendo del tipo de
nanopartícula que se desea producir [2].
A partir de estos materiales, se pueden obtener diferentes morfologías que pueden ser
empleadas en distintos usos. Estas morfologías en general se pueden obtener a partir de
cualquiera de los materiales mencionados anteriormente. Los tipos de nanopartículas,
así como las morfologías más comunes que se obtienen, se muestran en la Figura 1.
Figura 1. Clasificación de nanomateriales en cuanto a su composición y la morfología.
3.2
Nanopartículas de plata.
Las nanopartículas de plata están clasificadas como nanopartículas metálicas (NPM) y a
su vez hacen parte de los metales nobles entre los cuales se encuentran además oro,
platino y paladio. Pueden ser usadas como agentes antibacterianos, materiales ópticos,
superconductores, catalizadores, entre otras aplicaciones [2, 6, 7]. La eficiencia de
las AgNPs en estas áreas está relacionada con el tamaño de partícula y con su
morfología. Generalmente, el tamaño y la morfología se controlan ajustando las
condiciones de reacción según el método de síntesis utilizado [9]. Una de las ventajas
que tiene las AgNPs es la posibilidad de realizar la síntesis en condiciones ambientales,
17
usando medios acuosos u orgánicos gracias a la estabilidad que tiene este metal cuando
presenta valencia cero. En la Figura 2 se muestra algunas de las aplicaciones que tienen
las AgNPs.
Figura 2. Aplicaciones de AgNPs
3.2.1 El ambiente y las nanopartículas de plata
Las nanopartículas de plata han sido conocidas por su capacidad desinfectante y
antimicrobiana. En los hospitales, se utiliza para ayudar a las víctimas de quemaduras,
para combatir gérmenes en catéteres e incluso para acabar con "supe bacterias"
peligrosas que han crecido resistentes a los antibióticos tradicionales.
Un tema anteriormente recurrido basado en los efectos de las partículas de plata en el
ambiente, es su impacto negativo en el mismo, especialmente en los organismos
importantes, ya que, una vez que las nanopartículas de plata están en el ambiente es
posible se puedan mover de un lugar a otro, por ejemplo, de agua a sedimentos, del
suelo a agua subterránea, de agua a microorganismos. Las nanopartículas de plata
pueden incluso interactuar con otros compuestos en el ambiente, tomando parte, de
cierta manera en reacciones químicas y biológicas. Las implicaciones de esto aún son
inciertas, tanto mmás al poner a las nano partículas de plata al uso generalizado podría
18
representar riesgos, ya que los efectos derivados, a la salud humana o al ecosistema, de
la exposición crónica a las nano partículas de plata aun no son conocidos en su plenitud
[64].
Cosméticos, productos de aseo personal, productos de limpieza en el hogar entre otros,
contribuyen al esparcimiento de las nanopartículas de plata cuando estos son lavados.
La plata elimina gérmenes cuando se oxida y libera iones de plata, que son letales a las
bacterias. Las civilizaciones antiguas utilizaron el metal para el tratamiento de heridas
abiertas, y los pioneros americanos arrojaron monedas de plata en barriles de
almacenamiento de agua para mantener el agua fresca.
Las nanopartículas de plata, que pueden ocurrir naturalmente, son más poderosas que
las partículas más grandes debido a su gran superficie en relación con su masa aumenta
el número de iones liberados.
La industria de la plata, sin embargo, aboga porque las preocupaciones sobre las
nanopartículas de plata son infundadas, así mismo, la historia de la plata apunta como
un agente antibiótico eficaz y tomando nota de que la mayoría de las aplicaciones
utilizan cantidades muy pequeñas.
3.2.2 Toxicidad de las nanopartículas de plata
Existe un creciente interés en la comprensión de la relación entre las propiedades físicas
y químicas de los nanomateriales y su riesgo potencial para el medio ambiente y la
salud humana. La disponibilidad de las nanopartículas, donde el tamaño, forma, y
superficie de son controlados permite la mejor correlación de propiedades de las
nanopartículas a sus efectos toxicológicos. Conjuntos de mono dispersas, no agregados,
nanopartículas con características físicas y químicas definidas con precisión
proporcionan a los investigadores material que puede ser utilizado para comprender
cómo las nanopartículas interactúan con los sistemas biológicos y el medio ambiente.
Debido a la creciente prevalencia de nanopartículas de plata en productos de consumo,
hay un gran esfuerzo internacional en curso para verificar la seguridad de
nanopartículas de plata y para entender el mecanismo de acción para los efectos
antimicrobianos. La plata coloidal se ha consumido durante décadas para su percibir sus
19
beneficios en materia de salud, pero estudios detallados sobre su efecto en el medio
ambiente han apenas comenzado. Los estudios iniciales han demostrado que los efectos
sobre las células y los microbios se deben principalmente a un bajo nivel de liberación
de iones de plata de la nanopartícula superficie [69]. La tasa de liberación de iones es
una función del tamaño de nanopartículas (partículas más pequeñas tienen una tasa de
liberación más rápida), la temperatura (temperaturas más altas aceleran la disolución), y
la exposición al oxígeno, azufre, y la luz. En todos los estudios hasta la fecha, la
toxicidad de nanopartículas de plata es mucho menor que la carga de masa equivalente
de sales de plata.
Figura 3. Factores que favorecen la toxicidad intrísenca de las AgNPs
Aunque en la actualidad existe poca información en general sobre la toxicidad de las
nanopartículas de plata, el hecho de que posean dimensiones pequeñas y ciertas
propiedades específicas provocan que puedan ser un riesgo potencial para organismos
mayores. Nanomateriales con dimensiones entre 50 – 70 nm pueden penetrar células y
pulmones, mientras que las de 30 nm podrían incluso llegar al cerebro [70].
20
En al Figura 3 podemos observar algunos factores que afectan la toxicidad intrínseca de
las AgNPs, siendo el tamaño una de las propiedades más importantes de las NPs, y en
general efectos tóxicos han sido observados con las AgNPs más pequeñas. La superficie
específica y el tamaño de las AgNPs están en estrecha relación, ya que, conforme
disminuye el tamaña, la superficie específica aumenta dejando un mayor número de
átomos expuestos que estarán disponibles para reacciones redox. Los productos
aglomerados, al tener una estructura relativamente compacta, el área superficial es
menor y por tanto su toxicidad también lo será. Respecto a la forma, se ha encontrado
que formas de triángulo truncado son más tóxicas que las esféricas y/o alargadas, ya que
poseen más caras, por tanto más reactivas. La solubilidad en fluidos biológicos es otro
factor importante, cuando las NPs se disuelven pierden su estructura y las propiedades
específicas de éstas, por último, existen estudios donde se ha observado una correlación
directa entre la carga superficial y la toxicidad de las AgNPs, donde AgNPs
estabilizadas con citrato con cargas superficiales negativas fueron menos tóxicas que las
AgNPs con cargas superficiales positivas.
Aunque actualmente no existe una legislación oficial específica sobre la nanotecnología
los materiales, dado el uso amplio que se tiene de las nanopartículas de plata y su
controversia acerca de sus daños potenciales que puedan presentar en cualquiera de sus
formas, es necesario continuar en la investigación con la intención de discernir sobre los
posibles efectos tanto para el medio ambiente como para el ser humano.
3.3
Distintos métodos de Síntesis de AgNPs.
Los métodos de síntesis de AgNPs se pueden clasificarse en procesos físicos y
químicos. Entre los primeros se encuentra, por ejemplo, la ablación laser, la molienda y
la descomposición térmica, mientras que en los segundos se pueden resaltar la síntesis
mediante reducción química, electroquímica y asistida por ultrasonido. La Figura 4
resume algunos de los métodos de síntesis usados para la obtención de estos materiales.
21
Figura 4. Métodos de síntesis de AgNPs.
Los procesos químicos de síntesis se basan en la reducción de iones Ag+, la cual desde
el punto de vista cinético y termodinámico, depende fuertemente de procesos de
nucleación y de crecimiento. Si bien ambos procesos ocurren simultáneamente, se
pueden estudiar por separado a fin de realizar una buena aproximación al proceso de
formación de AgNPs.
La nucleación puede dividirse en primaria, en la cual los las partículas (o cristales)
comienzan a formarse en ausencia de otras partículas sólidas (formación de núcleos) y
secundaria en la que se requiere la presencia de estos núcleos [10]. El proceso de
crecimiento de las partículas es controlado por la adición de otras partículas en las
diferentes caras de las partículas primarias mediante interacciones químicas.
El proceso de nucleación y crecimiento de cristales puede ser descrito mediante
diferentes teorías que se basan en el potencial químico. Para el caso de formación de
una fase sólida en una fase líquida, la fase sólida se forma si se cumple que el potencial
químico del componente disuelto es menor que el potencial químico del material en
solución. En el caso de NPM, mediante estudios experimentales, siguiendo la reacción
por técnicas como espectrofotometría UV-Vis y dispersión de rayos X de bajo ángulo,
se ha comprobado que para favorecer menores tamaños de partícula, los procesos de
22
nucleación han de ser rápidos y los procesos de crecimiento lentos y por poco tiempo
[11, 12]. Sin embargo controlando estas dos variables, es posible modular el tamaño de
partícula que se quiere obtener. La Figura 5 muestra las diferentes etapas que tienen
lugar durante la síntesis de AgNPs.
Figura 5. Etapas de la síntesis de AgNPs.
Dentro de las posibilidades para sintetizar AgNPs, el presente trabajo propone la
utilización de: síntesis mediante reducción química y síntesis electroquímica.
3.3.1 Síntesis de AgNPs mediante reducción química
Este método de síntesis es ampliamente utilizado para la obtención de suspensiones
estables tanto en solventes orgánicos como acuosos, usando diferentes tipos de agentes
reductores, estabilizantes y medios [13]. Como agentes reductores para la síntesis de
AgNPs se han probado numerosas opciones entre las que se encuentran reductores
fuertes como borohidruro de sodio (NaBH4) o hidrógeno elemental, reductores
moderados como citrato y ascorbato de sodio [14] y reductores débiles como glucosa y
fructosa [12]. Tanto la morfología como el tamaño de partícula de las AgNPs se pueden
moderar, variando condiciones experimentales. Los agentes reductores fuertes,
conllevan a la formación de NP de menor tamaño debido a que la velocidad de reacción
en la etapa de nucleación es mayor [12, 14]. Algunos métodos de síntesis mediante
reducción química se describen a continuación
23
Método de Tollens.
En este método se obtienen AgNPs con un tamaño controlado en un proceso de
un paso. El método de síntesis de Tollens se basa en la reacción de un aldehído usando
el reactivo de Tollens como agente reductor. Esta reacción se muestra a continuación.
En el método de síntesis la reducción de la plata se realiza usando sacáridos en
presencia de amoniaco obteniéndose películas de AgNPs entre 50-200 nm e hidrosoles
con tamaños de partícula entre 20-50 nm. En ión Ag(NH3)+2 es un complejo estable
debido a la buena afinidad del amoniaco y el ión plata por lo que las variables
estudiadas son principalmente el pH del sistema y el tipo de sacárido usado [15].
Síntesis coloidal a partir de microemulsiones.
Otros métodos de precipitación química utilizan suspensiones coloidales que se
preparan en sistemas donde la fase continua es agua o un solvente orgánico. Estos
métodos son utilizados generalmente en la síntesis de
nanopartículas poliméricas
utilizadas para la encapsulación de medicamentos pero se pueden extrapolar a la síntesis
de partículas metálicas.
El procedimiento para generar nanopartículas de plata a partir de éste método consiste
en mezclar dos microemulsiones, una con una sal de plata y la otra con el agente
reductor. Luego de mezclar estas dos microemulsiones las colisiones entre las
microgotas de agua dispersas dan lugar a la reacción de la plata iónica con el agente
reductor. El modelo propuesto para esta síntesis se lleva a cabo mediante los siguientes
pasos:
1) Difusión browniana de las micelas.
2) Apertura de la capa de surfactante causada por las colisiones efectivas y la
coalescencia e las micelas.
3) Difusión de las fases acuosas resultante del intercambio entre micelas.
24
4) Reacción entre el agente reductor y la plata iónica y la posterior formación de un
núcleo de plata.
5) Difusión de los agregados para retornar a la forma micelar.
Reducción en fase acuosa con borohidruro de sodio.
Cuando se usa borohidruro de sodio como agente reductor, la reacción que se lleva a
cabo es la siguiente:
BH4
-
+
6Ag
+
+
-
8OH
BO 2
-
+
6H2O
+
6Ag(s)
El procedimiento general consiste en poner en contacto el agente reductor y el
estabilizante y a estos, adicionarle la solución con la sal de plata [13]. Bajo esta
metodología, es posible sintetizar AgNPs a altas concentraciones y generar
suspensiones estables. Los tipos de estabilizantes que se usan pueden ser polímeros de
alto o bajo peso molecular, cargados o sin carga, así como estabilizantes iónicos o
neutros. La proporción estabilizante/AgNPs, dependerá del tipo de sustancia que se use
y de la concentración NP en el sistema.
En los métodos antes mencionados, y otros métodos publicados en la literatura, se
puede modular el tamaño de partícula y la morfología de las AgNPs mediante el control
experimental de variables como la velocidad de adición del agente reductor, la
concentración de las especies activas, la temperatura de síntesis, agente estabilizante,
entre otras variables. En la Tabla 1 se muestran algunos métodos empleados, y los
resultados obtenidos en cuanto a morfología y tamaño de partícula.
25
Tabla 1. Diferentes metodologías de reducción química para sintetizar AgNPs.
Solvente/Agente
reductor
Agente estabilizante
Morfología y
tamaño de la
partícula
H2O/Citrato de sodio
Citrato de sodio
Nanohilos
(30nm de
diámetro)
[16]
N, N
Dimetilformamida
Polivinilpirrolidona
Nanoprismas
y nanoesferas
[17]
H2O/NaBH4
Dodecanetiol
Nanoesferas
[18]
H2O/Reactivo
deTollens
No
Nanoesferas
(20–50 nm)
[19]
Acetonitrilo
Polivinilpirrolidona
Partículas
dendríticas
[20]
3.3.2
Referencia
Síntesis de AgNPs mediante Ultrasonido
Los métodos de ultrasonido para la síntesis de materiales, en éste caso AgNPs han
venido teniendo auge debido a que, es posible obtener nuevas propiedades usando
viejos y reconocidos materiales tan solo con reducir su tamaño de partícula. El costoso
precio que compañías comerciales necesitan pagar por introducir nuevos materiales al
mercado ha contribuido de igual manera. De ésta forma, el interés en nanomateriales ha
llevado al desarrollo de muchos métodos sintéticos para su fabricación. [2]. Dicho esto,
la sonoquímica es el área de investigación en la cuál las moléculas son sometidas a una
reacción química debido a un poder de ultrasonido (20 kHz – 10 MHz). Ofrece grandes
posibilidades para el desarrollo de nanotamaño y nanoestructura de materiales,
básicamente por que permite el control de su estructura y morfología.
Tanto el tamaño, estabilidad, morfología, así como las propiedades físicas y químicas de
nanopartículas metálicas están fuertemente relacionadas con las condiciones
experimentales tales como la interacción de iones metálicos con agentes reductores y
estabilizantes. El diseño de fabricación en el cuál el tamaño, estabilidad, morfología y
26
propiedades son controladas ha llegado a ser el más importante e interesante campo en
la nanotecnología. Éstas interesantes propiedades de los nanomateriales fuertemente
dependen en el tamaño, forma de las nanopartículas, la interacción con sus agentes
estabilizantes y los medios circundantes, así como también el método para su
preparación. Por lo tanto, el control de la síntesis de las nanopartículas es un reto clave
para obtener éstas características mejoradas. Hoy en día, los agentes inorgánicos
antimicrobianos han atraído especial interés por el uso en el control de los diferentes
materiales tales como cerámicos o biocerámicos donde se inmovilizan por medio de
metales antimicrobianos (i.e. Ag y Cu).
Entre los nanomateriales, las AgNPs han sido ampliamente usadas para el área de la
higiene y propósitos médicos, aunque su mecanismo no ha sido completamente
entendido aún [21].
Nanopartículas de Plata (AgNPs), como hemos visto a través de éste capítulo pueden
ser fabricadas por métodos físicos y por reducción química. Sin embargo, no existe
mucha literatura disponible sobre su preparación sobre corcho granular en el campo del
Ultrasonido. En éste trabajo se tratará un método experimental para el comportamiento
antimicrobiano de las AgNPs recubiertas en corcho granular mediante técnica de
Ultrasonido
Tabla 2. Resumen de Métodos de Síntesis de AgNPs.
Método
Diferentes Agentes
Reductores
Referencia
Síntesis Química
Trisodium Citrate, Ethylene
Glycol, Borohidruro de Sodio
[65]
Síntesis Física
Descomposición Térmica, Haz
de iones, Ultrasonido, Descarga
de Arco Eléctrico
[66]
Síntesis Fotoquímica
UV, Quitosano
Carboximetilado
[67]
Síntesis Biológica
Lactobcillus, Shewanella
oneidensis, Fungus T. Viride,
Dacus Carota
[68]
27
3.4
Uso de polímeros para la estabilización y modificación superficial de AgNPs.
A pesar de que las AgNPs pueden ser estables en el tiempo sin la presencia agentes
estabilizantes [24], los procesos de coalescencia de estos materiales comienzan a ser
importantes cuando el material se encuentra suspendido a altas concentraciones
(superiores a 10 mg/L). De acuerdo a esto, se hace necesario el uso de algún agente
estabilizante que prevenga la aglomeración de AgNPs durante la síntesis y el
almacenamiento. Es ampliamente reportado el uso de compuestos orgánicos para
estabilizar AgNPs, los cuales tienen como principal función pasivar la superficie de las
partículas y evitar los fenómenos de coalescencia que terminan induciendo agregación
de estos materiales y como consecuencia la pérdida de sus propiedades características.
Estos estabilizantes pueden ser moléculas simples o polímeros, con características
surfactantes o no, los cuales interaccionan a través de sus segmentos hidrofóbicos con la
superficie de las partículas de plata [13, 22, 29, 32]. Algunos de los compuestos con los
cuales se ha reportado buenos resultados para estabilizar AgNPs son: bromuro de
cetiltrimetilamonio
(CTAB)
[13],
acetato
de
tetrabutilamonio
[25],
poli(vinilpirrolidona) [29], Pluronics® [32], quitosan [22], entre otros.
Específicamente para el uso polímeros como agentes estabilizantes, es importante tener
en cuenta algunas propiedades como el peso molecular, morfologia, la naturaleza, y el
carácter hidrofílico-lipofílico (HLB) del polímero, así como la interacción polímerosolvente, la concentración critica micelar (en el caso de los polímerosanfifílicos) y la
relación en peso polímero-AgNPs.
Debido a su gran versatilidad de los polímeros, además de usarlos como agentes
estabilizantes estos pueden ser empleados para la modificación de AgNPs mediante el
recubrimiento de estas con dichos polímeros. El quitosan y la poli(alilamina) (PAA) han
sido usados para modificar AgNPs, gracias a la presencia de grupos amino en su
estructura, lo cual les confiere la posibilidad de protonarse dependiendo del pH [22, 33,
34]. El primero de ellos tiene además, la propiedad de ser biocompatible y
biodegradable, por lo que se ha usado para modificar AgNPs para incorporar estos
materiales híbridos, en fibras textiles que tengan actividad antimicrobiana [33].
28
Otros polímeros utilizados para estabilizar AgNPs son los Pluronic®, los cuales son
copolímeros tribloque anfifilicos, biocompatibles y de carácter neutro, compuestos de
óxido de polietileno (EO) y oxido de propileno (PO) con una arquitectura tipo EOxPOy–EOx; donde el HLB está determinado por la longitud de cada segmento de la
cadena.
De acuerdo a lo anterior, es claro que los polímeros presentan grandes ventajas para
estabilizar y modificar AgNPs, gracias a la diversidad de estructuras y características
que presentan estos materiales. En el presente trabajo, se usaron varios tipos de
polímeros para la preparación de materiales híbridos polímero-AgNPs con el objetivo
de ser usados para diferentes aplicaciones
3.5
Uso del corcho como sustrato para inmovilización de AgNPs.
Teniendo en cuenta la gran cantidad de aplicaciones que tienen las AgNPs, es necesario
diseñar estrategias para sacar el máximo provecho a estos materiales. Una de ellas es la
inmovilización de AgNPs sobre diferentes sustratos; esto debido a que si bien cuando se
tienen AgNPs en suspensión, estas cuentan con mayor actividad fisicoquímica debido a
que tienen toda el área superficial expuesta. Estando así, se hace más difícil su
utilización, ya que se presentan problemas para recuperar el material después de usarse
y debido a que algunas aplicaciones necesitan que la interacción fisicoquímica se lleve a
cabo heterogéneamente. En la Tabla 3 se muestran algunos soportes usados para
inmovilizar AgNPs y la aplicación buscada en cada caso.
Para la evaluación catalítica y antimicrobiana de AgNPs, se usaron como soportes,
electrodos de carbono vítreo (CGE) y residuos de corcho provenientes de la corteza del
alcornoque (Quercus suber). Las características de estos sustratos se explicarán más a
fondo en las secciones de actividad catalítica y actividad antimicrobiana de AgNPs.
29
Tabla 3. Algunos soportes usados para inmovilizar AgNPs.
Soporte
Aplicación
Referencia
Hidroxiapatita
Materiales biocompatibles con
características antimicrobianas
[37]
Titanio
Superficies antimicrobianas
[38]
Hidrocalcita
Catálisis oxidativa de alcoholes
[39]
Sílicas mesoporosas
Catálisis redox de aldehídos,
alquinos y aminas
[40]
Electrodos de pasta de
nanotubos de carbono de
pared simple
Oxidación catalítica de metanol
[41]
Nanotubos de carbono de
múltiple pared/GCE
Sensores electroquímicos para
peróxido de hidrógeno
[42]
El corcho es uno de los principales productos agrícolas de los países mediterráneos. La
producción mundial de corcho se calcula en 340.000 toneladas anuales siendo Portugal
el principal país productor con el 52%, seguido de España e Italia con 30% y 6%
respectivamente. La composición química reportada para el corcho, depende del lugar
de origen pero en general se tiene entre 40 % y 60% de suberina, 10 % y 50% de
lignina, 5 % y 15% de polisacáridos y 10 % y 25% de compuestos extraíbles [47]. La
sostenibilidad económica del corcho depende, por tanto, estrechamente de la preferencia
pública para tapones de corcho en detrimento de los materiales sintéticos, de ésta
manera, regiones como las España, Portugal y las mayoría de los países del
Mediterráneo son ideales para la adaptación de humedales construidos, una tecnología
que va incrementando mundialmente el interés comparada con los sistemas domésticos,
donde la más común configuración es la de flujo horizontal subsuperficie, sistemas
usados para la remoción de BOD y sólidos suspendidos de las aguas de desecho.
Sistemas con de flujo horizontal subsuperficie promueven el paso de el agua de desecho
a través del medio poroso en el cual plantas acuáticas están creciendo. El corcho gracias
a su estructura porosa y su orígen sostenible al ser un material de reciclaje, posee un
30
potencial interesante que podría innovar el concepto de tratamiento de aguas residuales
en humedales construidos usando la cantidad adecuada. La Figura 6 muestra una
propuesta de lo que sería la estructura de la lignina. Como se observa, esta molécula
tiene una gran cantidad de compuestos fenólicos que son propensos a ser modificad.
Figura 6. Estructura propuesta para la Lignina.
Una metodología propuesta para la modificación de estos compuestos fenólicos es la
oxidación enzimática que puede realizarse usando catálisis enzimática, y en este campo,
una de las enzimas utilizadas para llevar a cabo este tipo de procesos es la Lacasa. El
mecanismo propuesto para esta oxidación propone que la molécula de fenol se convierte
en una molécula de quinona.
Teniendo en cuenta que AgNPs pueden modificarse superficialmente con polímeros con
diferentes grupos funcionales, se propone entonces, que es posible usar polímeros con
grupos amino, que presentan buenas características como nucleófilos, para que pueden
31
reaccionar con las quinonas producidas por la oxidación enzimática, con lo cual puede
darse la formación de un enlace covalente entre los compuestos fenólicos y los grupos
amino de los polímeros.
3.6
Actividad antimicrobiana de las AgNPs
Desde el punto de vista de las aplicaciones en el campo de la salud, la plata se ha
utilizado desde hace siglos como agente para tratar enfermedades infecciosas. Este uso
de las AgNPs ha sido ampliamente estudiado y se han publicado resultados
satisfactorios de estos materiales en la inhibición de crecimiento de poblaciones
bacterianas que tienen graves implicaciones para la salud de las personas [23-26]. Los
mecanismos de acción antibacterial de las AgNPs aun no son claros pero parece existir
una dependencia entre el tamaño de la partícula con la actividad antimicrobiana, por lo
que la investigación en esta área apunta principalmente a métodos de síntesis
eficientes, y además amigables ambientalmente [9, 43].
Con AgNPs se han realizado estudios de actividad antibacterial en bacterias como
Streptococcus mutans responsable de la caries dental [44], Escherichiacoli responsable
de algunas infecciones intestinales y extra-intestinales [45], Staphylococcus aureus
causante de infecciones de piel y partes blandas [46], entre otras muchas bacterias de
interés clínico.
Los estudios realizados parecen indicar que las AgNPs presentan una actividad
antibacterial mayor que las sales de plata gracias a su gran área superficial. Se plantea
que cuando las AgNPs entran en la célula bacteriana, atacan el sistema respiratorio
celular, interfieren en el proceso de división celular y finalmente acaban causando la
muerte celular [46].
Una estrategia que se ha venido implementando para aprovechar las características
antimicrobianas de AgNPs, es su inmovilización sobre diferentes sustratos dependiendo
de la aplicación deseada. Se ha mencionado anteriormente que es posible inmovilizar
estos materiales sobre soportes como titanio para generar superficies con actividad
antimicrobiana. Así mismo, se comentó también la posibilidad de inmovilizar AgNPs
sobre residuos de corcho.
32
4. OBJETIVOS
En la actualidad, como fue mencionado anteriormente, muchos métodos se han
reportado para la síntesis de AgNPs mediante el uso de rutas químicas, físicas,
fotoquímicas y biológicas. Cada método tiene ventajas y desventajas como son
problemas comunes de costes, escalabilidad, tamaños de partículas y distribución de
tamaños. Entre los métodos existentes, los métodos químicos se han utilizado más
ampliamente en la producción de AgNPs. Los métodos químicos proporcionan una
manera fácil de sintetizar AgNPs en solución acuosa. Se pretende evaluar la eficacia
antimicrobiana de AgNPs sintetizadas químicamente con las AgNPs sintetizadas por
ultrasonido.
Se pretende evaluar también si el corcho como sustrato con nano partículas de plata
podría tener un porcentaje de desinfección en el futuro, y de ésta manera cumplir con la
primera etapa para utilizar corcho como sustrato en humedales construidos.
4.1
Objetivo general:
Evaluar el potencial antimicrobiano de nanopartículas de plata sintetizadas mediante
reducción química y ultrasónica.
Recubrir e inmovilizar las AgNPs provenientes de ambos métodos de sintetización
(Reducción química y ultrasónica) en corcho, posteriormente evaluar potencial
antimicrobiano.
4.2
Objetivos específicos:
•
Comprobar la actividad antimicrobiana de las AgNPs en suspensión, frente a los
microorganismos: Esclerichia coli gram negativo
•
Evaluar el potencial antimicrobiano de AgNPs inmovilizadas sobre residuos de
corcho respectivamente.
33
5. METODOLOGÍA
5.1
Síntesis de AgNPs.
En la figura 3 se muestra un esquema en el cual se observa que la síntesis de
nanopartículas se puede obtener de dos métodos: el primero de ellos se basa en partir
del material macro y comenzar a reducir su tamaño, generalmente mediante
tratamientos físicos (growthdown). La segunda metodología se basa en el ensamble de
partículas partiendo generalmente del compuesto iónico y realizando un tratamiento
químico para hacer crecer el material hasta lograr el tamaño deseado (growth up).
Figura 7. Esquema general de formación de materiales nanométricos
5.1.1 Síntesis mediante reducción química con borohidruro de sodio.
La síntesis química de AgNPs se realizó en medio acuoso mediante reducción partir de
nitrato de plata (AgNO3) y borohidruro de sodio (NaBH4).
Se usaron como agentes estabilizantes, diferentes polímeros para la inmovilización
sobre corcho. El procedimiento se realizó mediante la adición rápida por inyección de
34
una solución de nitrato de plata sobre una mezcla de NaBH4 y agente estabilizante tal
como se muestra en la Figura 7.
Figura 8. Esquema de síntesis de AgNPs mediante reducción con NaBH4
5.1.2 Síntesis de AgNPs mediante Ultrasonido
La síntesis de AgNPs fue desarrollada usando un método de precipitación-homogéneo
empleando sonificación. Para éste propósito, 10 ml de solución acuosa de nitrato de
plata (AgNO3 100 mg/l) se utilizó. Para la formación de las partículas metálicas a cada
una de éstas soluciones se le añadió 20 ml de polímero (quitosano) en concentraciones
variadas (0.1%, 0.5% y 1%). Se optó por utilizar quitosano como polímero en el estudio
de la síntesis de AgNPs al mostrar mayor estabilidad a la hora de el análisis, y dada la
falta de tiempo solo fue posible experimentar con un tipo de polímero para el caso de la
síntesis por Ultrasonido.
35
Se aplicaron los siguientes parámetros ultrasónicos:
-
P = 600 W
-
Frecuencia de campo = 20 kHz
-
Tiempo efectivo de sonificación por impulsos = 1h and 0.5h
Los experimentos se realizaron utilizando un procesador ultrasónico para aplicaciones
de alto volumen, VCX 750, Newtown, Connecticut, EE.UU..
Para demostrar el papel de plata para la prueba antibacteriana, se prepararon cuatro
tipos diferentes de soluciones:
a) Tipo 1: contenido solo de 100 ppm de AgNO3
b) Tipo 2: contenido de 100 ppm AgNO3 y quitosano 0.1%
c) Tipo 3: contenido de 100 ppm AgNO3 y quitosano 0.5%
d) Tipo 4: contenido de 100 ppm AgNO3 y quitosano 1%
Las AgNPs se sintetizaron usando una celda sonoquímica de un electródo, aplicando un
potencial constante. Las soluciones fueron expuestas a irradiación ultrasónica de alta
intensidad bajo condiciones ambientales y a distintos periodos de irradiación ultrasónica
(30 minutos y 60 minutos). El ensayo ultrasónico se llevó a cabo con un procesador
(celda) de líquidos ultrasónico directamente inmerso en la solución reactiva. El ejemplo
del equipo utilizado se muestra en la Figura 9. Se evaluaron las siguientes variables:
temperatura, potencial, tiempo de síntesis, frecuencia de campo y volumen de la
muestra.
36
Las soluciones coloidales de AgNPs sintetizadas bajo el proceso ultrasónico fueron
caracterizadas usando espectrofotometría ultravioleta (UV-vis) y microscopia de
transmisión de electrones (TEM). El tamaño de partícula fue determinado usando el
equipo Cordouan DL 135.
Figura 9. Ejemplo de equipo utilizado para la síntesis
Ultrasónica de AgNPs
Se estudio la variable del tiempo de sonificación, para esto se propuso 60 y 30 minutos
continuos de sonificación, con polímero en la solución y de igual manera sin polímero
en la solución conteniendo únicamente lo que posteriormente obtendríamos, AgNPs.
Cada síntesis se realizó por duplicado y la evaluación de las mejores condiciones
experimentales se realizó con base en los resultados obtenidos de UV-Vis, tamaño de
partícula y TEM.
Para efectos comparativos, se realizaron algunos ensayos más con diferentes tiempos de
sonificación: 15 minutos y 45 minutos. En la Figura 10 se muestra como dependiendo
del tiempo de exposición, la solución puede mostrar un espectro de luz oscuro en escala
de color amarillo.
37
Figura 10. Fotografía de AgNPs sintetizadas con técnica de Ultrasonido.
5.2
Caracterización de AgNPs
Como se mencionó en secciones pasadas, las propiedades fisicoquímicas de los
materiales a escala nanométrica, dependen en gran medida de su tamaño de partícula,
así como de su morfología y estructura. Para conocer estas propiedades, se cuenta con
algunos métodos convencionales para caracterizar AgNPs, que se presentan a
continuación:
5.2.1 Espectroscopía UV-Visible.
El fenómeno mediante el cual se puede caracterizar partículas nano metálicas por este
tipo de espectroscopía es conocido como plasmones superficiales.
Los plasmones superficiales son ondas electromagnéticas de polarización p ligadas a
interfaces dieléctrico-metal, que se originan por oscilaciones del plasma electrónico del
metal debido a la alta densidad electrónica que tienen estos materiales. En este caso el
electrón se trata como onda y no como partícula, y el modelo más básico para entender
el fenómeno se basa en suponer un plasma de electrones que se mueven con cierta
frecuencia en el interfaz metal-ambiente. Este plasma de electrones que viaja paralelo al
metal, con una frecuencia definida y se mueve a través de una red de cationes. La
consecuencia de esto es que la forma de la superficie controle el tipo de plasmones
38
superficiales dependiendo de la morfología (rugosidad o forma) de la partícula [35].
Trabajos teóricos y experimentales muestran que existe una dependencia entre el tiempo
de reacción con la intensidad de la señal así como con la longitud de onda a la que
aparece. Así mismo, el tiempo de reacción se puede relacionar con la distribución de
tamaño de partícula (DTP) [12, 35].
5.2.2 Dispersión de luz dinámica.
La dispersión de luz dinámica (DLS por sus siglas en inglés) relaciona el inverso del
tamaño de partícula con el movimiento browniano que tienen las partículas dispersas en
determinado medio. Para esta técnica es necesario conocer la viscosidad de la fase
dispersante así como mantener la temperatura constante durante toda la medición.
El radio hidrodinámico es afectado por los iones presentes en el medio y las
modificaciones superficiales ya que esto varía la velocidad de difusión de las partículas
dispersas. Las medidas de tamaño de partícula mediante dispersión de luz dinámica son
ampliamente utilizadas ya que permite medir tamaños de partícula inferiores a 1 nm,
requiere muestras menos concentradas, en menor cantidad y no es una técnica
destructiva [36].
5.2.3 Microscopia electrónica.
En la microscopía electrónica, a diferencia de la óptica, se utilizan electrones en lugar
de fotones para formar las imágenes. Mediante la microscopía electrónica es posible
alcanzar una capacidad de aumento muy superior comparada con la microscopía óptica,
debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los
fotones. Los microscopios electrónicos más utilizados son el microscopio electrónico de
barrido (SEM) y el de transmisión (TEM).
Las AgNPs se caracterizaron midiendo el tamaño de partícula por dispersión de luz
dinámica (DLS), microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectroscopía UVVis. El tamaño de partícula se midió en un equipo Cordouan DL 135. Los espectros
UV-Vis se realizaron en espectrofotómetro Jenway 640 UV/Vis.
39
5.3
Cálculo de rendimiento de reacción de AgNPs
El rendimiento de reacción se calculó mediante la relación entre la transferencia de
masa obtenida durante la síntesis, de acuerdo a la ecuación de Faraday (Ecuación 2) y la
concentración calculada a partir de la curva de calibración construida con estándares de
AgNPs.
5.4
Inmovilización de AgNPs sobre residuos de corcho
5.4.1 Preparación de suspensiones de AgNPs
Para la inmovilización de AgNPs sobre corcho, éstas se sintetizaron AgNPs mediante
reducción con NaBH4 (síntesis química) y mediante agitación magnética, en presencia
de los polímeros 6-Deoxi-6-(ω-aminoetil)amino celulosa (AC) y quitosano purificado
por diálisis (CS). Se le ajustó el pH hasta 5 adicionando HCl 2 %. La preparación de
CS se llevó a cabo pesando 0,8 g del polímero, disolviéndolo en 50 ml de HCl 2%,
posteriormente se ajustó el pH hasta 5 con NaOH 5% y se aforó hasta 100 ml con agua
desionizada. En la Tabla 4 se muestran algunas propiedades de los polímeros usados.
40
Tabla 4. Características de los polímeros usados para modificar AgNPs para inmovilizar
sobre corcho.
Polímero
Estructura
Peso
molecular
Tipo de
polímero
20kDa
Catiónico
25 kDa
Catiónico
OH
OH
Quitosano
HO
HO
OH
O
H
NH2
O
HO
O
O
H
HO
NH2
O
H
n
OH
NH2
NH2
EDAAminocelulosa
NH
.
HO
O
O
tosylate
.
n
Para la síntesis de AgNPs en presencia de los polímeros, se prepararon soluciones de 10
mg/L, 30 mg/L y 100 mg/L de Ag+ a partir de AgNO3. En varios recipientes, se
adicionaron 1 ml de NaBH4 con una concentración de 100 mg/L y 12,5 ml de cada
polímero. Luego se adicionó por inyección las soluciones de diferentes concentraciones
de plata hasta ajustar 100 ml (Figura 11), manteniendo el sistema en agitación constante
y a temperatura ambiente.
Para la reducción homogénea de precipitación de AgNPs mediante ultrasonido en
presencia de quitosano, se preparó solución de 100mg/L de Ag+ a partir de AgNO3. Para
distintas muestras se adicionó 20 ml de polímero quitosano a diferentes concentraciones
(0.1%, 0.5% y 1%) aforando hasta 30 ml con la solución de AgNO3, llevándolo a ultra
sonificación a distintos tiempos, 30 y 60 minutos, para diferente muestra, manteniendo
parámetros de potencia de campo ultrasónico de 600 w, frecuencia de campo de 20 kHz
y temperatura de 18 oC.
41
5.4.2 Preparación del material de soporte
Antes de realizar el procedimiento de inmovilización de AgNPs sobre corcho, éste se
lavó para eliminar los compuestos removibles. Primero se realizo un lavado con HCl a
pH 2, posterior a esto, se realizó un lavado con NaOH a pH 10 y finalmente el corcho
lavó con etanol y se secó a 60 ºC durante 12 horas.
5.4.3 Preparación y medición de actividad enzimática de Lacasa.
La enzima Lacasa, se preparó a partir de un reactivo comercial que contenía 0,08 g
Lacasa/g de polvo. Previo a la modificación del corcho, se prepararon 40 mL de la
enzima a una concentración efectiva de 700 mg/L.
La medición de la actividad enzimática se determinó mediante la oxidación de ácido
2,2'- azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico) (ABTS). Se preparó una mezcla 5 mM
de ABTS y 600 mg/L de enzima en una buffer de ácido succínico a pH 5. Se siguió la
oxidación de ABTS espectroscópicamente, siguiendo el incremento en la absorbancia a
420 nm a una temperatura de 50 ºC. Para realizar la medición, se tomaron 1,9 ml de
solución de ABTS y cuando la temperatura se estabilizó a 50ºC, se adicionó 0,1 ml de la
solución de Lacasa. La actividad enzimática se expresó en unidades de enzima oxidada
por cada µmol de ABTS en un minuto.
5.4.4 Inmovilización del híbrido AgNP-Polímero sobre corcho
La modificación del corcho con AgNPs se llevó a cabo por dos metodologías: Mediante
agitación magnética y usando un equipo de calentamiento controlado Ahiba IR® Pro.
La Figura 11 muestra el esquema de la metodología para la inmovilización de AgNPs
sobre corcho. Ambas reacciones se llevaron a cabo por una hora a 50ºC. Los
experimentos realizados mediante agitación magnética se llevaron a cabo en frascos
cubiertos con papel aluminio.
42
Figura 11. Esquema de la metodología para la inmovilización de AgNPs sobre corcho
Para llevar a cabo la modificación, se mezclaron 18 mL de suspensión de AgNPs, 18
mL de buffer de ácido succínico, 4 mL de et anol, 0,5 mL de lacasa (700 mg/mL) y se
adicionaron 20 piezas de corcho lavado. Luego de la reacción, el corcho se filtró, se
lavó 2 veces con abundante agua desionizada y se secó a 50 ºC por 12 horas. Se
prepararon las siguientes combinaciones:
1) Corcho
2) Corcho + AgNP
3) Corcho + AgNP-AC
4) Corcho + AgNP-CS
5) Corcho + AC
6) Corcho + CS
43
5.5
Evaluación antimicrobiana del corcho modificado.
La evaluación antimicrobiana se realizó frente al microorganismo gram-negativo
Escherichiacoli,
usando la prueba de agitación dinámica ASTM E 2149-01. Las
muestras de corcho se esterilizaron mediante exposición a luz UV 2 horas previas al
ensayo. Los cultivos de bacterias se incubaron durante la noche a 37 ºC en medio de
cultivo nutritivo MuellerHinton. Al día siguiente se transfirieron a medio de cultivo
nuevo y se ajustó la densidad óptica (DO) de la suspensión a 0,1 (medido a 600 nm). Se
incubó esta dispersión hasta obtener una DO de 0,3 en fase de crecimiento exponencial
(aproximadamente 2 horas). La suspensión de MO se lavó y se centrifugó con NaCl 0,9
% estéril dos veces y luego se adicionó NaCl 0,9 % hasta obtener una DO de 0,1.
Figura 12. Esquema de la metodología llevada a cabo para evaluar la actividad
antimicrobiana del corcho con AgNPs.
Luego de esto, se tomaron viales con 2,3 ml con solución de NaCl 0,9 %. La suspensión
de bacterias se diluyó 1000 veces y se adicionaron 0,2 ml al vial para completar 2,5 ml.
Se tomaron 0,1 ml de cada vial y se sembraron en discos de Petri con medio de cultivo
nutritivo para tomar el tiempo cero. Después, se adicionaron 10 piezas de corcho a cada
44
vial y se llevaron a incubar durante 2 horas a 37 ºC y 170 rpm. Pasadas las dos horas, se
tomó de cada vial 0,1 ml muestra y se llevó a platos de petri con medio nutritivo. Los
platos inoculados se incubaron a 37 ºC durante 24 horas y se realizó conteo de unidades
formadoras de colonia (UFC). En la figura 12 se puede apreciar un esquema de la
metodología llevada acabo para evaluar la actividad antimicrobiana del corcho con
AgNPs. La actividad antimicrobiana se expresó como el porcentaje de reducción de
microorganismos luego de estar en contacto con el corcho en comparación con el
tiempo cero mediante la ecuación 1:
Ecuación 1
𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑐𝑖ó𝑛(%) =
𝐵−𝐴
×100
𝐵
Donde A representa el número de bacterias que sobrevivieron (UFC/ml) por cada vial
tratado luego de estar en contacto con el corcho, y B representa el número de bacterias
(UFC/ml) en el tiempo cero.
5.6
Estudios de fitotoxicidad de AgNPs.
Los estudios de fitotoxicidad se realizaron usando rábano (Raphanussativus) como
modelo biológico. Se prepararon suspensiones de AgNPs (muestras 25F6030NPt,
40P4030NPt y 256030NPt) de 10 y 5 mg/L de concentración y soluciones de los
polímeros sin AgNPs a concentraciones de 1x10-5M.
Se prepararon cajas de Petri con papel filtro dentro y a cada caja se introdujeron 20
semillas de rábano y se adicionó 5 mL de cada sistema a evaluar y cada uno se evaluó
por duplicado. En el día 3 posterior al inicio del experimento, se realizó un conteo de la
cantidad de semillas de rábano que germinaron, para medir el índice de germinación. En
el día 5, a cada semilla que germinó, se le midió la longitud de la radícula y el
hipocotíleo. En la Figura 13 se muestra una imagen de un rábano germinado en donde
se señalan las partes de la planta a las que se le mide la longitud.
45
Figura 13. Características de una semilla de rábano luego de un tiempo de germinación
de 5 días.
46
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1
Caracterización de AgNPs sintetizadas Ultrasónicamente teniendo como
variables de estudio Temperatura y Tiempo.
6.1.1 Tamaño de partícula medido por DLS,
En la Tabla 5 se muestran los tamaños de partícula medidos por DLS y su comparación
con los valores calculados mediante la Ecuación 2.
Tabla 5. Comparación de tamaños de partícula medidos por DLS.
Muestra
Tamaño promedio
de partícula por
DLS (nm) 30 min
Sonificación
Tamaño promedio
de partícula por
DLS (nm) 60 min
Sonificación
AgNPs (Sin
polímero)
60
55
AgNPs 0.1%
Quitosano
65
60
AgNPs 0.5%
Quitosano
120
110
AgNPs 1%
Quitosano
270
230
En la Tabla 5 observamos que con el incremento de tiempo en los ensayos de
ultrasonido es posible obtener un tamaño de partícula menor. Entre mayor sea la
concentración de polímero en la solución, mayor será el tamaño de partícula.
47
Ecuación 2
𝑦 = 84,08 − 21,26𝑥
La correlación entre los resultados obtenidos por DLS y por UV-Vis presentó una
dispersión de datos considerable, con un coeficiente de correlación de 0,75222 y un
valor P del modelo de 0,0421, con lo cual se puede considerar que el ajuste es
adecuado. Por otra parte, hay que mencionar que el diámetro promedio de partícula que
aparece en la Ecuación 2 fue medido mediante microscopia TEM. Teniendo en cuenta
que UV-Vis es una técnica de mayor accesibilidad podría usarse para obtener
información relevante de la muestra obtenida con un bajo costo económico asociado.
6.1.2 Imágenes TEM
Para concluir con la caracterización de AgNPs sintetizadas, se tomaron imágenes TEM
de algunos de los materiales obtenidos. De acuerdo a los resultados obtenidos DLS, las
muestras seleccionadas para tomar las imágenes TEM fueron AgNP 0.1% chitosan a 30
y 60 minutos de sonificación y AgNP 0.5% chitosan a 30 y 60 minutos de sonificación
ya que fueron las que presentaron tamaños promedio de partícula menores. Las
imágenes TEM para estas muestras se muestran en la Figura 14.
Como se observa, todas las imágenes obtenidas muestran AgNPs con geometría
aproximadamente esférica y con tamaños inferiores y/o alrededor a los 100 nm. Las
menores polidispersidades se observan para las muestras AgNPs 0.5% quitosano 30
minutos y AgNPs 0.5% quitosano 60 minutos . Sin embargo hay una mayor densidad de
partículas por unidad de área en esta última.
48
Figura 14. Imágenes TEM de AgNPs sintetizadas ultrasonicamente: AgNP 0.1 %
Quitosano 60 minutos (sup. derecha), AgNP 0.1% Quitosano 30 minutos (sup.
Izquierda), AgNP 0.5% Quitosano 30 minutos (inf. Derecha), AgNP 0.5% Quitosano 60
minutos (inf. Izquierda). Todas las imágenes tienen una escala de 100 nm.
Ninguna de las muestras presentó una distribución normal, sin embargo, todas
mostraron una mayor frecuencia para tamaños de partícula inferiores a 20 nm. La
muestra AgNP 0.1 % Quitosano 60 minutos mostró partículas con tamaños superiores a
150 nm y una polidispersidad mayor que el resto de muestras, mientras que AgNP 0.5%
Quitosano 30 minutos, aunque no presentó polidisperdidad, tuvo partículas con tamaños
superiores a 60 nm.
49
Tabla 6. Comparación de tamaño de partícula de AgNPs mediante UV-Vis, DLS y TEM
Tamaño de partícula (nm)
Muestra
AgNPs 0.1%
Quitosano (30 min)
AgNPs 0.1%
Quitosano (60 min)
AgNPs 0.5%
Quitosano (30 min)
AgNPs 0.5%
Quitosano (60 min)
DLS
TEM
60
18,56
65
16,74
120
27,96
110
22,05
La Tabla 6 muestra también una diferencia significativa entre los tamaños de partícula
medidos por DLS y por TEM. Esto se debe a que cuando se realizan mediciones por
DLS, se mide el radio hidrodinámico de la partícula, lo que implica que la DTP
aumente, debido a que este radio hidrodinámico incluye el polímero y el agua de
hidratación que rodea la partícula de plata, mientras que cuando se mide el tamaño a
partir de las imágenes TEM, se toma el diámetro efectivo de ésta y por ende, el valor
disminuye.
6.2
Caracterización de AgNPs sintetizadas mediante Reducción Química.
6.2.1 Tamaño de partícula medido por DLS,
Se realizó la síntesis de AgNPs con y sin polímero. La Error! Reference source not
ound. 14 muestra el tamaño promedio de partícula obtenido mediante DLS, Como se
observa, las AgNPs sintetizadas sin polímeropresentan un radio hidrodinámico
considerablemente menor que sus homólogas con polímero, Esto se debe a que cuando
se recubren las AgNPs, se da un aumento en el radio hidrodinámico de la partícula, lo
que genera un aumento en el tamaño de partícula medido. Teniendo en cuenta las
desviaciones obtenidas, se puede considerar que para AgNPs a 10 mg/L y 30 mg/L los
50
tamaños de partícula son del mismo orden y esto está relacionado con que el peso
molecular de CS y de AC es similar. En el caso de 100 mg/L, se da una diferencia en el
tamaño de partícula de AgNPs-CS y AgNPs-AC debido posiblemente a que a esta
concentración, el sistema es más difícil de estabilizar por lo que pueden darse
aglomeraciones que aumentan dicho tamaño, En todos los casos se observa que el
tamaño de partícula obtenido para AgNPs sin polímero es prácticamente el mismo.
AgNPS
AgNPs-CS
AgNPs-AC
400
350
300
250
200
Tamaño promedio de partícula (nm)
450
150
100
50
0
10 mg/L
30 mg/L
100 mg/L
Figura 15. Tamaño de particular de AgNPs con y sin polímeros
La Figura 15 muestra los espectros realizados a las diferentes suspensiones de AgNPs
sintetizadas. La Figura 16 (b) muestra la banda característica de AgNPs en 420 nm que
aumenta proporcionalmente a la concentración de AgNPs. El espectro de AgNPs-AC 10
mg/L no muestra esta banda lo que puede indicar que no se formaron AgNPs a esta
concentración o que el polímero recubre totalmente las partículas impidiendo que estas
interaccionen con la luz, pero a medida que se aumenta la concentración de AgNPs, la
banda comienza a aumentar, lo que podría deberse a que la proporción AgNPs-Polímero
comienza a disminuir permitiendo que las partículas interaccionen con la luz lo que
ocasiona la aparición de la banda de plasmones superficiales. La Figura 16 (c) muestra
51
la banda de plasmones superficiales para todas las concentraciones de AgNPs, Sin
embargo, la banda correspondiente a la concentración de 100 mg/L es la menor de
todas, debido probablemente a que a esta concentración, la suspensión es muy inestable
por lo que las partículas se aglomeraron y precipitaron, ocasionando la disminución en
la intensidad de la banda. La Figura 16 (a) por el contrario, no presenta la esta banda a
ninguna de las concentraciones medidas, Aparece una banda alrededor de 250 nm para
las concentraciones de 30 mg/L y 100 mg/L, que no puede relacionarse con AgNPs. Si
bien es cierto que las mediciones de tamaño de partícula mostraron la presencia de
partículas en suspensión, no puede garantizarse que hayaAgNPs mediante las
mediciones UV-Vis. Puede ser que el polímero recubra totalmente las partículas
impidiendo que estas no interaccionen con la luz, sin embargo es necesario otro tipo de
caracterización para ratificar esta hipótesis. La comparación de los espectros obtenidos
a 10 mg/L en los diferentes sistemas (Figura 16 (d)) muestra la diferencia que hay entre
AgNPs sin modificar con AgNPs-Polímero. Este resultado muestra que debe haber una
interacción entre AgNPs-polímero ya que la banda de plasmones superficiales no
aparece.
52
(a )
5,0
AgNPs-CS 10 mg/L
AgNPs-CS 30 mg/L
AgNPs-CS 100mg/L
4,5
4,0
4,0
3,5
3,5
3,0
3,0
2,5
2,5
Abs
Abs
AgNPs-AC 10 mg/L
AgNPs-AC 30 mg/L
AgNPs-AC 100 mg/L
(b)
4,5
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
-0,5
200
300
400
500
600
700
-0,5
800
200
300
400
λ (nm)
4,0
3,5
(c )
3,5
A g N P s 10 m g /L
A g N P s 30 m g /L
A g N P s 100 m g /L
3,0
500
600
700
800
λ(nm)
(d)
AgNPs 10 mg/L
AgNPs-CS 10 mg/L
AgNPs-AC 10 mg/L
3,0
2,5
2,5
Abs
Abs
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
200
300
400
500
λ (nm)
600
700
800
-0,5
200
300
400
500
600
700
λ (nm)
Figura 16. Espectros UV-Vis de AgNPs, (a) AgNPs-CS, (b) AgNPs-AC, (c)
AgNPs sin polímero, (d) Comparación AgNPs, AgNPs-CS y AgNPs-AC
Los espectros mostrados para la muestra AgNPs-CS (Figura 16 (a)) no presentaron la
banda de plasmones superficiales característica de las nanopartículas de plata, por lo
que se había planteado la posibilidad de que no se hubieran formado nanopartículas o
que la interacción polímero-partícula impidiera la interacción de ésta última con la luz.
53
800
6.3
Evaluación de fitotoxicidad.
En la Figura 17 se muestra la longitud promedio de la radícula y el hipocótilo de los
rábanos germinados en la evaluación fitotóxica de las muestras estudiadas. Teniendo en
cuenta las desviaciones estándar obtenidas para cada una de las medias, se tiene que las
longitudes medidas para cada una de las partes del rábano se pueden considerar iguales,
tanto el blanco, como para los polímeros sin AgNPs, las muestras con AgNPs y la
muestra sin surfactante. De lo anterior se puede afirmar que las muestras estudiadas no
presentan ninguna actividad fitotóxica a las concentraciones evaluadas. Así mismo, la
Tabla 7 muestra el índice de germinación de semillas para las muestras evaluadas, en
donde se observa que para todos los casos, se obtuvo más del 95% de germinación.
54
Figura 17. Longitud promedio de la radícula y el hipocótilo del rábano
germinado para cada una de las muestras evaluadas.
Tabla 7. Índice de germinación de rábano.
Muestra
Semillas
Semillas sin
germinadas germinar
Índice de
germinación
(%)
Blanco
59,00
1,00
98,33
Pluronic F127
59,00
1,00
98,33
Pluronic P123
60,00
0,00
100,00
25F6030NPt (5 mg/L)
59,00
1,00
98,33
25F6030NPt (10 mg/L)
60,00
0,00
100,00
40P4030NPt (5 mg/L)
60,00
0,00
100,00
40P4030NPt (10 mg/L)
58,00
2,00
96,67
256030NPt (5 mg/L)
59,00
1,00
98,33
256030NPt (10 mg/L)
60,00
0,00
100,00
55
6.4
Inmovilización de AgNPs sobre corcho.
La ruta de reacción que se propuso para la inmovilización de AgNPs sobre corcho se
basa primero en la oxidación enzimática de los grupos fenólicos de la lignina para
producir quinona y posteriormente, la adición nucleofílica de los grupos aminos
presentes en los polímeros sobre el doble enlace que se encuentra en posición β al
carbonilo. La Figura 18 muestra un esquema de la propuesta el mecanismo propuesto
(para la modificación de corcho con AgNPs.
Figura 18. Ruta de reacción para la inmovilización de AgNPs sobre corcho
6.5
Evaluación antimicrobiana de AgNPs inmovilizadas sobre corcho
La Tabla 8 muestra los resultados obtenidos de todas la muestras realizadas en la
evaluación antimicrobiana del corcho modificado con AgNPs. En la Tabla 9 se puede
apreciar la comparación de los resultados de evaluación antimicrobiana de los métodos
de obtención de AgNPs (reducción química y ultrasónica). Como se observa, el corcho
sin AgNPs presenta una muy baja reducción de crecimiento del microorganismo. Así
mismo, corcho-AgNPs tampoco tuvo una reducción de UFC, lo que indica que para que
56
el material tenga actividad antimicrobiana, es necesario que AgNPs estén modificadas
con los polímeros, Esto se confirma cuando se observan los resultados obtenidos con
AgNPs-CS y AgNPs-AC que obtuvieron respectivamente 88,28 % y 99,45 % de
reducción de crecimiento.
Para confirmar que la actividad antimicrobiana sea debido a AgNPs, se realizaron
reacciones con polímero en ausencia de las nanopartículas. Los resultados muestran un
porcentaje de reducción de crecimiento importante para Corcho-CS, sin embargo, este
polímero ha sido reportado como agente antimicrobiano por lo que no es extraño que se
presente este comportamiento. Corcho-AC presenta un porcentaje de reducción muy
bajo, por lo que puede decirse en este caso, que la actividad antimicrobiana es debida a
la presencia de AgNPs.
57
Tabla 8. Actividad antimicrobiana de corcho modificado con AgNPs frente al
microorganismo E. Coli
Reducción
CFU, mL-1
%
Muestra
0h
2h
Corcho
6,1 x 106
5,9 x 106
3,28
Corcho-AgNPs
3,7 x 106
54,4 x 106
0
Corcho-AgNPs- Quitosano
3,6 x 106
4,3 x 103
88,28
Corcho –AgNPs-AC
3,3 x 106
2,0 x 104
99,45
Corcho-AC
3,5 x 106
3,3 x 106
5,7
Corcho-Quitosano
3,3 x 106
2,5 x 106
28,7
Corcho-AgNPs- CS 0.1% - US 30 min
3,5 x 106
0
100
Corcho-AgNPs- CS 1% - US 30 min
3,6 x 106
2,0 x 104
99,73
Control
6,1 x 106
6,3
0
58
Tabla 9. Actividad antimicrobiana de corcho modificado con AgNPs sintetizadas
mediante técnica de ultrasonido y por reducción química, frente al microorganismo E.
Coli.
% Eficacia Antimicrobiana
Muestra
Reducción química
Ultrasonido
Corcho
3.28
0
Corcho+AgNPs
0
0
Corcho+AgNPs+Chitosan
88.28
99.73
Corcho+Chitosan
0
0
Control
0
0
Como es posible apreciar en la Tabla 9, el porcentaje de eliminación de
microorganismos es muy alto para la muestra de corcho con chitosan y AgNPs
obtenidas tanto, por método de reducción química como por ultrasonido. Se puede
observar que en la muestra de corcho más AgNPs no hubo un porcentaje de reducción,
así como tampoco para la muestra que incluía solo el polímero (chitosan), por lo cuál,
puede decirse en éste caso, que la actividad antimicrobiana es posible si se utiliza una
solución de AgNPs modificada con un polímero (en éste caso chitosan), ya sea por
método de reducción química o por ultrasonido como fue realizado en éste estudio.
En el Anexo 2 se muestran las imágenes de los diferentes platos de petri donde se
evaluó la actividad antimicrobiana del corcho modificado con AgNPs.
59
6.6
Costos de producción de AgNPs
Para la producción de las AgNPs se utilizaron una serie de reactivos y materiales con
diversos precios en el mercado:
Tabla 10. Reactivos utilizados para la producción de AgNPs con precios por Kg
Concepto
Precio euros por Kg
Borohidruro de Sodio
21
Nitrato de plata
1070
Quitosano
802
Lacasa
445
Se tomo como base para el cálculo de coste de producción así como para la comparativa
en el mercado una solución de 25 ml de AgNPs con tamaño de partícula de
aproximadamente 100 nm con un recubrimiento de quitosano al 1% a partir de una
solución de nitrato de plata de 100 mg/L. El precio estimado fue de 2 euros.
60
Figura 19. Captura de pantalla tomada del sitio www.sigmaaldrich.com. Se puede
observar precio estimado de solución de AgNPs
La información para la estimación del coste de materiales, así como para la
comparación de coste de producción con una solución de características equivalentes a
la antes mencionada (Figura 19) , fue tomada de la página www.sigmaaldrich.com. En
el mencionado sitio podemos encontrar precios estimados de soluciones de AgNPs. En
la figura 19 observamos una solución de 25 ml de AgNPs de 100 nm medidos con TEM
con citrato de sodio como estabilizador en un precio aproximado de 117 euros, coste
enormemente superior al de producción que presentamos arriba con una solución de
características similares y, cabe destacar que en éste trabajo añadimos el recubrimiento
con polímero quitosano al 1% de concentración.
Para el tema del corcho como sustrato, dado que es un material de desecho
teóricamente, es posible apelar por convenios de reutilización de corcho residual como
los establecidos por la Cátedra UNESCO de Sostenibilidad con el Instituto Catalán del
Corcho, instituciones con trayectoria de trabajo en conjunto, lo que podría traducirse en
ahorro de costos en la adquisición del corcho como material granular.
61
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los resultados de DLS mostraron una clara interacción que se da entre las AgNPs y los
polímeros usados. El uso de polímeros mostró ser como una estrategia adecuada para
brindar estabilidad a las suspensiones, así como para realizar modificaciones
superficiales a las AgNPs. La modificación de AgNPs con quitosano y de la
aminocelulosa es un ejemplo claro de la importancia de los polímeros en la
funcionalización de los nanomateriales, ya que sin ésta, no hubiese sido posible la
inmovilización de AgNPs sobre dicho sustrato. Cuando se usó quitosano para realizar la
modificación, se obtuvo un mayor porcentaje de reducción en cuanto al crecimiento de
microorganismos.
La comparación de los resultados de tamaño de partícula de TEM con DLS mostraron
una diferencia significativa, aún cuando la muestra analizada fue la misma, esto se
debió a la diferencia en el principio de análisis de cada técnica, en éste cado la técnica
de DLS analiza la partícula completa o radio hidrodinámico de la partícula en solución,
dándonos un tamaño de partícula menor en el análisis de TEM el cual podríamos tomar
como el más acertado.
Los resultados de UV-Vis nos dieron la pauta para comprobar la presencia de AgNPs en
la solución y la efectividad de el polímero en recubrir dicha partícula, mientras que
muestras de soluciones de plata sin modificación con polímero mostraban la banda
característica de presencia de plata, las soluciones con polímeros no lo hacían, lo que
nos lleva a creer que hay un recubrimiento efectivo del polímero en las nanopartículas.
Debido a que puede controlarse de manera sencilla, ajustando variables como las
propuestas en este trabajo, la metodología de síntesis de nanopartículas de plata por
ultrasonido mostró ser una técnica adecuada. El tiempo fue la variable más crítica a la
hora de controlar el proceso de síntesis, al incrementar el tiempo de la solución bajo
ultrasonido, se tuvo mayor formación de nanopartículas de plata distinguiéndose por el
característico color amarillo que la solución se torna, mayor intensidad del color de la
solución, mayor concentración de las nanopartículas de plata. De la misma manera se
comprobó el aumento de la eficiencia de reacción cuando se realizó la síntesis bajo
mayor tiempo de sonificación con menor cantidad de polímero dando un menor tamaño
62
de partícula, resultado que una vez más, entra en controversia por el tema toxicológico,
siendo por un lado, las nanopartículas con menor tamaño de partícula más eficientes,
por otro lado y como hemos leído anteriormente, las nanopartículas de plata con el
menor tamaño son las que pueden traer mayores efectos negativos a los sistemas
naturales, aunque no hay suficientes estudios que determinen el daño que pueden
causar.
Por otra parte, la metodología usada para realizar la síntesis mediante reducción
química, tuvo ventajas con respecto a la ultrasónica en cuanto a la reproducibilidad de
los resultados, aunque no por simplicidad experimental. Para desarrollar la síntesis por
ultrasonido es posible incluso reducir tiempos de preparación ahora que sabemos a
través de pruebas la concentración ideal de AgNO3 por ejemplo, la cantidad de solución
ideal a sintetizar, etc. Para la síntesis por reducción química es necesario más cuidado
en la preparación, así como la preparación de más soluciones como el borohidruro de
sodio, además de utilizar mayor instrumentación de laboratorio, esto en comparación de
la síntesis por ultrasonido.
Para la actividad antimicrobiana, alto potencial de desinfección fue encontrado para
algunas de las muestras.
Las AgNPs que fueron sintetizadas con alguno de los polímeros y a su mismas vez
recubiertas sobre corcho residual mostraron tener una capacidad de desinfección muy
alta al alcanzar porcentajes de 99% y 88% de desinfección, sin embargo, todas aquellas
muestras que no contenían una combinación de nanopartículas de plata y polímero, no
presentaron una actividad antimicrobiana significativa. Esto debido a que, el polímero,
como asumimos en un principio, proporciona el enlace necesario para que las
nanopartículas de plata puedan quedar adsorbidas en el corcho completamente y
entonces, al estar en contacto con agua, no se disuelvan y puedan proporcionar las
propiedades que se buscan.
Ninguna otra de las muestras, solo nanopartículas de plata, solo polímero, mostraron
porcentaje significativo de desinfección, lo que nos da como conclusión que solo las
soluciones híbridas de nanopartículas de plata con alguno de los polímeros con los que
se experimento en este trabajo, presentan actividad antimicrobiana al ser recubiertas en
corcho residual frente al organismo E. Coli. El quitosano, al ser un compuesto natural,
63
biodegradable, biocompatible y con grupos aminos, lo hacen el polímero ideal para
trabajar y el que manifestó resultados más estables y sistemáticos.
Se analizo los costos de preparación de una solución de 25 ml de nanopartículas de plata
con tamaños de partícula alrededor de los 100 nm. El costo que estimamos de
preparación en el laboratorio fue de 2 euros, cuando en el mercado fue alrededor de los
117 euros, una diferencia muy grande, aunque nosotros no tomamos en cuenta el costo
por la utilización de los equipos para la caracterización de las nanopartículas de plata
como el TEM, aún así, la diferencia en el costo de preparación por nosotros en el
laboratorio y el precio que la solución esta en el mercado es suficientemente grande
para creer que es una solución económicamente viable.
64
8. CONCLUSIONES
•
La síntesis por Ultrasonido de nanopartículas de plata mostró ser una
metodología adecuada para obtener estos nanomateriales.
•
Debido al incremento de la exposición humana a AgNPs, se requieren estudios
integrales para entender mejor la toxicidad asociada con la exposición a las
AgNPs.
•
Ambas metodologías de síntesis de AgNPs con costes estimados muy por debajo
a los encontrados en el mercado, así como el corcho adquirido como material
reciclado, lo hace un método económicamente viable.
•
La metodología propuesta para la inmovilización de AgNPs sobre residuos de
corcho es novedosa y podría tener buenas aplicaciones en el área de depuración
de aguas como alternativa sostenible, y como material base en humedales
construidos.
65
9. TRABAJO A FUTURO
Si bien el estudio mecanismo de acción antimicrobiana no era un objetivo de este
trabajo, se plantea para trabajos futuros, la evaluación de la relación entre los polímeros
y la actividad antimicrobiana, ya que esto podría dar lugar a entender mejor el tipo de
mecanismo de estos nanomateriales.
El objeto de estudio fue caracterizar el potencial de desinfección de las AgNPs
obtenidas por dos diferentes métodos de reducción, así como también estabilizar dichas
AgNPs sobre corcho y de ésta manera evaluar
la capacidad antimicrobiana, un
siguiente paso sería reproducir el ensayo sobre un humedal construido a escala de
laboratorio, utilizando como sustrato corcho modificado con AgNPs.
Esta metodología podría incluso ser extrapolada a otros residuos vegetales con
composiciones químicas similares como el aserrín.
66
10. ANEXOS
Anexo 1. Imágenes de platos petri para evaluación de actividad
antimicrobiana de AgNPs inmovilizadas sobre corcho.
67
11. REFERENCIAS
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