EVALUACIN DE LA CAPACIDAD PROBIOTICA in vitro DE UNA

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PROBIOTICA in vitro DE UNA CEPA NATIVA
DE Saccharomyces cerevisiae
Angela Rocio Ortiz Camargo
Joanna Isabella Reuto Andrade
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Microbiología Industrial y Microbiología Agrícola y Veterinaria
Bogota D. C.
Julio de 2007
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PROBIOTICA in vitro DE UNA CEPA NATIVA
DE Saccharomyces cerevisiae
Angela Rocio Ortiz Camargo
Joanna Isabella Reuto Andrade
TRABAJO DE GRADO
para optar por el titulo de
Microbióloga Industrial y Microbióloga Agrícola y Veterinaria
Microbióloga Industrial
ANDREA AGUIRRE
Bacterióloga, MSc.
Director
GUSTAVO ARBELAEZ
Médico Veterinario, MSc. Ph.D
Codirector
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Microbiología Industrial y Microbiología Agrícola y Veterinaria
Bogota D. C.
Julio de 2007
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PROBIOTICA in vitro DE UNA CEPA NATIVA
DE Saccharomyces cerevisiae
Angela Rocio Ortiz Camargo
Joanna Isabella Reuto Andrade
ANDREA AGUIRRE
Bacterióloga, MSc.
Director
GUSTAVO ARBELAEZ
Médico Veterinario, MSc. Ph.D
Codirector
ANA KARINA CARRASCAL
Bacterióloga, MSc.
Jurado
ADRIANA PULIDO
Bacterióloga, MSc.
Jurado
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Microbiología Industrial y Microbiología Agrícola y Veterinaria
Bogota D. C.
Julio de 2007
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PROBIOTICA in vitro DE UNA CEPA NATIVA
DE Saccharomyces cerevisiae
Angela Rocio Ortiz Camargo
Joanna Isabella Reuto Andrade
APROBADO
ANGELA UMAÑA MUÑOZ, M Phill.
Decana Académica
Facultad de Ciencias
LUIS DAVID GOMEZ, MSc.
Director de carreras de Microbiología
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Microbiología Industrial y Microbiología Agrícola y Veterinaria
Bogota D. C.
Julio de 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Andrea Carolina Aguirre por la confianza y el apoyo incondicional que nos
brindo durante la elaboración de este proyecto.
A la Doctora Balkys Quevedo por su paciencia, disposición y colaboración.
Al laboratorio de Biotecnología Aplicada, a su directora Aura Marina Pedroza por permitirnos
llevar a cabo la realización de este proyecto.
A nuestros compañeros de laboratorio por su amistad y por la ayuda brindada.
Agradecimiento
especial
a
los
laboratorios
de
virología,
inmunología,
monitoria,
contaminación de aguas, microbiología especial, microbiología ambiental y de alimentos por
el préstamo de equipos y por la colaboración brindada.
A la Vicerrectoría académica de la Pontificia Universidad Javeriana por la financiación de
este proyecto.
A la Pontificia Universidad Javeriana y sus docentes por la formación integral brindada y por
permitirnos vivir una de las experiencias más gratificantes de nuestras vidas.
A Dios por haberme bendecido en estos años y por permitirme cumplir con este sueño de mi
vida.
A mi madre, mi abuelita Amelia y mi tío Jesús por el apoyo incondicional, el cariño, la
confianza que depositan en mi cada día y todo lo demás que me han brindado, porque sin
ustedes no sería ni la mitad de ser humano que he llegado a ser.
A mis amigos por su apoyo, por alegrar mis días, por inspirarme tantas cosas y por su
compañía durante estos años maravillosos.
Angela Rocío
Dedico este trabajo primeramente a Dios, fuente de vida, de sabiduría y de hermosas
bendiciones.
A mi Madre por ser mi guía, mi sostén incondicional, mi apoyo y mi consejera, a mi hermana
por ser mi más fiel amiga, a toda mi familia por estar siempre a mi lado sustentándome y
ayudándome a ser el ser humano que hoy soy.
A Andrés por enseñarme a amar sinceramente y apoyarme sin condiciones.
A mis amigas y amigos por todos los gratos momentos que hemos compartido y por arrancar
de mis labios mil sonrisas.
Joanna Isabella
TABLA DE CONTENIDO
Página
1. INTRODUCCION
16
2. MARCO TEORICO
2.1. PROBIÓTICOS
17
2.1.1. Probiosis
17
2.1.2. Mecanismos implicados en la probiosis
18
2.1.3. Composición y administración de probióticos
19
2.1.4. Obtención y conservación de cepas probióticas
20
2.1.5. Pruebas de capacidad probiótica in vitro
21
2.1.5.1. Tolerancia a sales biliares
22
2.1.5.2. Tolerancia a pH
22
2.1.5.3. Resistencia a jugos gástricos
23
2.1.5.4. Adhesión celular
23
2.1.5.4.1. Cultivos celulares
24
2.1.5.4.2. Líneas celulares
25
2.1.5.4.3. Ensayos de adhesión
26
2.1.5.5. Reducción del colesterol en presencia de sales biliares
27
2.1.6. Resistencia del probiótico a condiciones in vivo
28
2.1 7. Procesamiento de probióticos en productos terminados
28
2.2. PROBIÓTICOS PARA AVES DE CORRAL
29
2.2.1. Aves de corral y tracto gastrointestinal
29
2.2.2. La flora normal intestinal de aves de corral
31
2.2.3. Infecciones bacterianas tempranas en polluelos
31
2.2.4. Aplicación y evaluación de probióticos en aves de corral
32
2.3. Saccharomyces cerevisiae
33
2.3.1. Generalidades
33
2.3.2. Ciclo sexual y asexual
35
2.3.3. Cinética de crecimiento
35
2.3.4. Antecedentes de Saccharomyces cerevisiae como probiótico
36
2.4. INDUSTRIA AVÍCOLA EN COLOMBIA
40
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICION
42
3.1. Formulación del problema
42
3.2. Justificación
43
4. OBJETIVOS
44
ix
4.1. Objetivo general
44
4.2. Objetivos específicos
44
5. MATERIALES Y METODOS
45
5.1. Métodos
45
5.1.1. Obtención y conservación de Cepa A y Cepa B
45
5.1.2. Determinación de capacidad probiótica in vitro
45
5.1.2.1. Tolerancia a sales biliares
45
5.1.2.2. Tolerancia a pH
46
5.1.2.3. Determinación de resistencia a jugos gástricos
46
5.1.2.4. Reducción del colesterol en presencia de sales biliares
47
5.1.2.5. Prueba de adherencia
49
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
50
6.1. Control de calidad bancos cepa A y cepa B
50
6.2. Tolerancia a sales biliares
52
6.3. Tolerancia a rangos de pH
55
6.4. Resistencia a jugos gástricos
59
6.5. Reducción de colesterol en presencia de sales biliares
63
6.5.1. Determinación de reducción Colesterol en presencia de sales biliares
64
6.6. Ensayo de adhesión a células Caco – 2
69
7. CONCLUSIONES
76
8. RECOMENDACIONES
78
9. BIBLIOGRAFIA
79
10. ANEXOS
94
x
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura Nº 1. Células Caco – 2 en monocapa con coloración de Wrigth
26
Figura Nº 2. Análisis de adherencia por microscopio invertido de
Kluyveromyces lactis a células Caco-2 diferenciadas con coloración de Giemsa
26
Figura Nº 3. Microscopia electrónica de formación de yemas de
Saccharomyces cerevisiae
35
Figura Nº 4. Reproducción sexual y asexual de levaduras
36
Figura Nº 5. Curva de crecimiento de levaduras
36
Figura Nº 6. Consumo per cápita de pollo en Colombia (1970 – 2006)
40
Figura Nº 7. Producción de pollo (toneladas) en 2001 – 2006
41
Figura Nº 8. Fórmula porcentaje de asimilación de colesterol en muestras
de medio YPGCHO
48
Figura Nº 9. Fórmula Recuento (Levaduras/mL) en cámara de Newbauer
49
Figura Nº 10. Aspecto microscópico de la cepa nativa (estudio) de
Saccharomyces cerevisiae
Figura Nº 11. Curva de viabilidad expresada en recuento (UFC/mL)
50
de controles de calidad para cepa A (estudio) y cepa B (control)
50
Figura Nº 12. Recuentos (UFC/mL) en sales biliares para cepa A (estudio)
y cepa B (control)
53
Figura Nº 13. Recuentos (UFC/mL) en valores de pH de 2.0 – 5-0 para cepa
A (estudio) y cepa B (control).
57
Figura Nº 14. Recuentos (UFC/mL) en Jugos Gástricos de pH 2.0 – 2.3 para
cepa A (estudio) y cepa B (control)
60
Figura Nº 15. Recuentos (UFC/mL) en Jugos Gástricos de pH 7.0 – 7.2 para cepa
A (estudio) y cepa B (control)
62
Figura Nº 16. Curva patrón de colesterol
63
Figura N. 17. Reacción de Liebermann – Burchard para determinación de
Colesterol
67
Figura Nº 18. Recuentos (Levaduras/mL) de cepa A (estudio) expuesta
a sonicación
68
Figura Nº 19. Recuentos (Levaduras/mL) de cepa B (control) expuesta
a sonicación
69
Figura Nº 20. Células Caco – 2 en monocapa con coloración de Wrigth
70
Figura Nº 21. Análisis de adherencia por microscopio invertido de
Saccharomyces cerevisiae a células Caco-2 con colorante de Wright
xi
72
Figura Nº 22. Análisis de adherencia por microscopio invertido de
S. cerevisiae var. boulardii a células Caco-2 con colorante de Wright
72
Figura Nº 23. Gráfica de barras de Levaduras adheridas/ 100 células
Caco -2 de la cepa A (estudio) y Cepa B (control)
xii
73
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla Nº 1. Coloración de Gram y valores de Absorbancia620 nm de inóculos
de cepa A (estudio) y cepa B (control)
53
Tabla Nº 2. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
53
Tabla Nº 3. Coloración de Gram y valores de Absorbancia620 nm de inóculos
de cepa A (estudio) y cepa B (control)
56
Tabla Nº 4. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
57
Tabla Nº 5. Coloración de Gram y valores de Absorbancia620 nm de inóculos
de cepa A (estudio) y cepa B (control)
60
Tabla Nº 6. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
60
Tabla Nº 7. Coloración de Gram y valores de Absorbancia 620 nm de
inóculos y de cepa A (estudio) y cepa B (control)
64
Tabla Nº 8. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
65
Tabla Nº 9. Valores de colesterol degradado en 12 horas de incubación por
la cepa A (estudio) y la cepa B (control)
65
Tabla Nº 10. Porcentajes de asimilación de colesterol/12 horas de incubación
por la Cepa A (estudio) y la Cepa B (control)
66
Tabla Nº 11. Coloración de Gram y valores de Absorbancia 620 nm de inóculo
y Cepa A (estudio) y cepa B (control)
70
Tabla Nº 12 .Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
70
xiii
INDICE DE ANEXOS
Página
ANEXO Nº 1. ASPECTO MACROSCÓPICO DE S. cerevisiae y
S. cerevisiae var. boulardii
93
Anexo 1.1. Aspecto macroscópico de S. cerevisiae
93
Anexo 1.2. Aspecto macroscópico de S. cerevisiae var. boulardii
93
Anexo 1.3. Recuento en microgota de S. cerevisiae en Agar YPG
94
ANEXO Nº 2. TABLAS DE RESULTADOS OBTENIDOS PARA CONTROL
DE CALIDAD DE BANCOS DE CEPA A Y B
94
Anexo 2.1. Coloración de Gram de inóculos y colonias de cepa A (estudio)
y cepa B (control)
94
Anexo 2.2. Técnica: Siembra en superficie en agar YPG de control
de calidad de Cepa A (estudio) y Cepa B (control)
95
ANEXO Nº 3. TABLA RESULTADOS DE PRUEBA DE TOLERANCIA
A SALES BILIARES
95
ANEXO Nº 4. TABLA RESULTADOS DE PRUEBA DE TOLERANCIA A
RANGOS DE pH
96
ANEXO Nº 5. TABLA RESULTADOS DE PRUEBA DE RESISTENCIA
A JUGOS GÁSTRICOS
96
ANEXO Nº 6. TABLAS Y FIGURAS DE PRUEBA DE DETERMINACIÓN
DE REDUCCION DE COLESTEROL EN PRESENCIA DE SALES BILIARES
97
Anexo 6.1. Protocolo de elaboración de curva patrón de colesterol
97
Anexo 6.2. Curva patrón
97
Anexo 6.3. Valores de Absorbancia (550 nm) obtenidos en la determinación
de reducción de colesterol del medio YPGCHO por las cepa A y Cepa B
98
Anexo 6.4. Medio YPGCHO inoculado con la cepa A (estudio) después
de 12 horas de incubación
98
Anexo 6.5. Medio YPGCHO inoculado con la cepa B (control)
después de 12 Horas de incubación
99
Anexo 6.6. Separación de fases orgánica y acuosa en la extracción
de colesterol de las muestras (cepa A y B)
99
Anexo 6.7. Reaccion de Liebermann - Burchard para la determinación
de colesterol en medio YPGCHO (cepa A)
100
Anexo 6.8. Reaccion de Liebermann - Burchard para la determinación
xiv
de colesterol en medio ypgcho (cepa B)
100
ANEXO 7. FIGURAS DE ENSAYO DE ADHESION A CÉLULAS Caco – 2
101
Anexo 7.1. Análisis de adherencia por microscopio invertido de
Saccharomyces cerevisiae a células Caco-2 con colorante de Wright
101
Anexo 7.2. Análisis de adherencia por microscopio invertido de
Saccharomyces cerevisiae var. boulardii a células Caco-2 con
colorante de Wright
101
ANEXO 8. COMPOSICION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
102
Anexo 8.1. AGAR YPG
102
Anexo 8.2. CALDO YGC
102
Anexo 8.3. CALDO YPGCHO
103
Anexo 8.4. Reactivo de extracción de colesterol
103
Anexo 8.5. Medio Mínimo Esencial Eagle
103
Anexo 8.6. PBS
104
ANEXO 9. PROTOCOLO DE TRIPSINIZACION DE CÉLULAS Caco-2
104
ANEXO 10. TINCIÓN DE WRIGHT
104
ANEXO 11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
104
Anexo 11.1. Prueba de tolerancia a sales biliares
104
Anexo 11.2. Prueba de tolerancia a pH
105
Anexo 11.3. Prueba de tolerancia a jugos gástricos
105
Anexo 11.4. Prueba de reducción del colesterol en presencia de sales biliares
106
xv
RESUMEN
Los probióticos, son microorganismos vivos usados como suplementos alimenticios los
cuales afectan positivamente al huésped al mejorar el equilibrio microbiano en el tracto
gastrointestinal contribuyendo a la supresión del crecimiento de patógenos por competencia
por espacio y sustrato, modulando el sistema inmune, inhibiendo metabolitos tóxicos
producidos
por
otros
microorganismos,
transformando
compuestos
carcinogénicos,
aumentando la asimilación de nutrientes, entre otros. A través del tiempo se ha comprobado
que han desempeñado un papel muy importante en el control de enfermedades sin producir
efectos negativos.
En el presente estudio se evaluó la capacidad probiotica in vitro de una cepa nativa de
Saccharomyces cerevisiae comparada con una cepa comercial utilizada como probiótico. Se
realizaron pruebas “in vitro” como resistencia a sales biliares, tolerancia a rangos de pH y
jugos gástricos, donde no se observaron diferencias al medir el crecimiento entre la cepa de
estudio A y la cepa control B en los diferentes muestreos; reducción del colesterol en
presencia de sales biliares en la cual luego de 12 horas de incubación de la levadura en
medio con colesterol se obtuvo una reducción del 54% para la cepa A y 58% para cepa B y
prueba de adherencia en la que las dos cepas se consideraron adherentes a las células
Caco-2. Con los resultados obtenidos se concluye que la cepa A presenta las características
apropiadas para ser empleada como probiótico en nutrición animal.
1. INTRODUCCION
Los probióticos, son suplementos alimenticios a base de microorganismos vivos que
benefician al huésped mejorando el equilibrio microbiano intestinal, contribuyendo a la
supresión del crecimiento de patógenos y favoreciendo los procesos metabólicos del mismo.
A través del tiempo se ha comprobado que desempeñan un papel muy importante en el
control de enfermedades sin producir efectos negativos.
Dentro de los microorganismos probióticos más estudiados, se encuentran las Bacterias
Ácido Lácticas y Bifidobacterium, ya que se ha comprobado su efecto benéfico en la salud
humana y animal, representando el 90% de la flora intestinal. Por esta razón, se han usado
ampliamente para reducir los trastornos de origen intestinal en el hombre, como lo reportó
Metchnikoff en 1970. Adicionalmente, se han reportado estudios en especies animales como
terneros, cerdos, aves y conejos, entre otros, que resaltan la importancia de la
administración de estos microorganismos, al obtener resultados positivos y benéficos en los
animales en estudio.
Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiada como integrante de la dieta en pollos de
engorde, demostrando que su uso frecuente reduce la carga de enteropátogenos como
Salmonella spp y E. coli y en menor proporción de Pseudomonas sp, S. aureus, y de virus,
parásitos y hongos. Esto lo consigue, al corregir el balance de la población microbiana,
mejorar la asimilación de nutrientes generando una ganancia de peso importante en estos
animales de engorde y al tener una acción estimulante de la inmunidad del animal, por lo
que su uso como probiótico es útil y prometedor.
En el presente estudio se evaluó la capacidad próbiotica de una cepa nativa de
Saccharomyces cerevisiae por medio de pruebas in vitro como tolerancia a concentraciones
de sales biliares, determinación de resistencia a jugos gástricos, tolerancia a rangos de pH,
reducción de colesterol en presencia de sales biliares y pruebas de adherencia en células
Caco-2.
16
2. MARCO TEORICO
2.1 PROBIÓTICOS
El término probiótico, es derivado del significado griego ¨ Para la vida ¨ y ha tenido diversos
significados a través de los años. Primero fue usado por Lilley y Stillwell en 1965 para
describir sustancias secretadas por un microorganismo que estimulaba el crecimiento de
otro. Esta definición no persistió y fue subsecuentemente usado por Sperti en 1971 para
describir extractos de tejido que estimulaban el crecimiento microbiano. No fue, sino hasta
1974 que Parker los definió como: Organismos y sustancias que contribuyen al balance
microbiano intestinal. Fuller en 1989 redefinió los probióticos como “Suplemento alimenticio
microbiano vivo que afecta benéficamente al animal huésped mejorando su balance
microbiano intestinal”. En 1992, Havenaar y Huis In’t Veld consideraron los próbioticos como
aquellos que al ser suministrados a animales o humanos, producen efectos benéficos en el
hospedero por el incremento de las actividades de la microbiota nativa. Con base en los
recientes avances en este campo, Salminen et al (1999) propusieron una definición mas
apropiada: Los probióticos son preparaciones o componentes de células microbianas que
tienen un efecto benéfico en la salud del hospedero. Sin embargo, considerando las
definiciones anteriores, Schrezenmeier y De Vrese (2001) proponen la definición: “
Preparación de un producto que contiene microorganismos viables en suficiente número, los
cuales alteran la microflora (por implantación o colonización) en un compartimiento del
huésped provocando efectos beneficiosos sobre la salud del mismo" como la más acertada
para el término probiótico.
2.1.1 Probiosis
La probiosis se encuentra basada en el concepto de exclusión competitiva, designada como
la actividad de la flora intestinal normal para limitar la colonización intestinal por varios
patógenos entéricos, al colonizar los mismos sitios del intestino que utilizarían los patógenos,
mediante la administración de cultivos de microorganismos benéficos para el huésped
(Jordan F. y Pattison M, 1998).
Animales que eran tratados con antibióticos generalmente mostraban una resistencia
reducida a la infección por patógenos intestinales. El factor protector en animales sanos es
normalmente atribuido a la flora bacteriana anaerobia. Los factores asociados a la avicultura
moderna, como la administración y composición de las vacunas, higiene excesiva y estrés,
17
alteran la flora intestinal normal aumentando la incidencia de infecciones. La higiene
excesiva en la cría de animales, resultante por ejemplo del uso exagerado de desinfectantes,
puede dificultar el desarrollo de la flora normal, permitiendo así la colonización del intestino
por parte de bacterias no deseadas. Durante el estrés el número de Lactobacilos tiende a
decrecer y el número de Coliformes, especialmente de Escherichia coli aumenta en las
regiones altas del intestino delgado (Acuña, 1995). En estas situaciones, la restauración de
la flora normal mediante el uso de probióticos es de gran valor porque minimiza desarreglos
digestivos ayudando a mantener la salud, previniendo trastornos intestinales, incluso
ayudando a mejorar el crecimiento y conversión de animales domésticos, mejorando el
metabolismo del colesterol e inhibiendo la carcinogénesis (Fuller, 1992).
2.1.2 Mecanismos implicados en la probiosis
Los probióticos pueden afectar de forma benéfica al animal modificando las interacciones
metabólicas que tienen lugar en el intestino. Esto puede suceder por medio de la supresión
de reacciones generadoras de metabolitos tóxicos; ejemplo de esto es la presencia de
proteína no digerida o con aminoácidos no absorbidos o mal absorbidos en el intestino
grueso, resultando en un cambio de la flora intestinal. Microorganismos como
Enterobacterias o Clostridium sp, comienzan a dominar y a romper las proteínas generando
cadaverina, putrescina, tiramina e histamina. Estos compuestos, pueden generar una
irritación de la pared intestinal, produciendo un daño en el epitelio llevando a una mala
absorción por lo que el valor osmótico del contenido intestinal aumenta, resultando en la
atracción de líquidos por el intestino que conduce a diarrea. Adicional a lo anterior, la
histamina entra a la corriente sanguínea y actúa como un tipo de veneno, ya que dosis
elevadas de este compuesto en la sangre causa edemas (Otero, 1997). Cuando el probiótico
se encuentra presente en el sistema digestivo se controla la presencia de esta flora dañina,
evitando así la producción de estos metabolitos. Adicionalmente, los microorganismos
probióticos puede potenciar reacciones de detoxificación, estimulando la digestión mediante
sustitución de deficiencia de enzimas digestivas o sintetizando vitaminas u otros nutrientes
no disponibles en la dieta, mejorando la absorción de los nutrientes, resultante en un
aumento de peso, especialmente benéfico en animales de engorde (Fuller, 1992).
Los probióticos pueden actuar benéficamente al alterar el metabolismo bacteriano intestinal
directamente a través de sus propias actividades metabólicas o bien de forma indirecta
desplazando o influenciando las actividades metabólicas de otros grupos microbianos, así
como la propiedad de influenciar en el sistema inmune del animal, ya que el uso de los
18
probióticos es una manera de reforzar la capacidad de defensa natural de la flora bacteriana
normal contra los patógenos (Fuller, 1992).
2.1.3 Composición y administración de probióticos
Los probióticos pueden contener una o más cepas bacterianas. Se han utilizado
Lactobacilos, Bifidobacterias, Estreptococos, Enterococos, Escherichia coli no patógenos,
Pediococos, Propionibacterias, levaduras y especies de Bacillus y Leuconostoc. Tissier
(1906) aisló por primera vez en el Instituto Pasteur de París, Bífidobacterias en las
deposiciones de los lactantes alimentados con leche materna y estableció una relación con
el hecho de que los lactantes alimentados con leche materna sólo padecían diarrea en raras
ocasiones. Por ello recomendó la ingestión oral de Bífidobacterias al suponer que éstas eran
capaces de eliminar las bacterias responsables de las diarreas.
En cuanto a las levaduras, una de las mas estudiadas es Saccharomyces boulardii, debido
a que tiene varias ventajas, como su crecimiento a una temperatura relativamente alta (37
ºC), sin que se vea afectado su metabolismo y la resistencia a varios antibióticos (Buts,
2005). Al ser administrada en forma liofilizada, se reactiva en el
tracto gastrointestinal,
generando una respuesta benéfica en la salud y fisiología del huésped (McFarland et al,
1993), Entre otras ventajas de este microorganismo, se encuentra el no ser tan sensible al
calor y poder sobrevivir a exposiciones cortas de calor o largas de enfriamiento (Toma et al,
2005).
El estudio de la capacidad probiótica de levaduras ha sido más limitado y en menor
proporción (Guslandi et al, 2003), ya que Lactobacillus sp. y Bifidobacterium son parte
predominante de la flora normal del tracto gastrointestinal de humanos y otros vertebrados
(Kumura et al, 2004), lo que ha generado que se realicen amplios estudios sobre estos dos
géneros (Boriello et al, 2003).
Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiada como un suplemento en la dieta de animales,
debido a que mejora la digestibilidad de nutrientes (Agarwal et al, 2000). Newbold et al
(1995), observó que diferentes cepas de esta levadura tenían efectos benéficos en terneros
actuando en las células de epitelio intestinal, al resistir factores como presencia de lisosimas,
enzimas pancreáticas, bajo pH, ácidos orgánicos y sales biliares presentes en estos
animales, manteniéndose metabólicamente activas. Mathew et al (1998), observó que la
adición de levaduras en la dieta basal de cerdos, tendía a generar un aumento de peso en
estos animales, comparado con aquellos a los que no se les suministraba.
19
Un probiótico debe ser capaz de ejercer un efecto benéfico sobre el huésped y no ser
patógeno ni toxico, debe normalmente estar presente en forma viable o por lo menos como
células metabólicamente activas, capaces de sobrevivir en el intestino, además debe
permanecer viable y estable por largos periodos de almacenamiento. Los probióticos deben
actuar produciendo compuestos antibacterianos, incluidos ácidos que reducen el pH
intestinal, compitiendo por nutrientes o lugares de adhesión, alterando el metabolismo
microbiano o estimulando el sistema inmune. Para que se establezcan de forma
permanente, habría que administrarlos al poco tiempo de nacer. En el animal adulto los
efectos tienden a durar tanto como el tratamiento, por eso el mejor método de administración
es el continuo. La implantación de probióticos depende de la duración de la fase de
crecimiento, la cual puede ser influenciada por la capacidad de asociación a la pared
intestinal y de utilización de nutrientes disponibles. Los probióticos se pueden administrar
junto con prebióticos, a menudo oligosacáridos, los cuales se cree ayudan a su crecimiento
y establecimiento en el intestino (Fuller, 1992).
2.1.4. Obtención y conservación de cepas probióticas
Cuando se realiza un estudio sobre obtención de nuevas cepas con capacidad probiótica, el
primer paso es el muestreo, el cual debe realizarse en lugares en lo que probablemente se
encuentre el microorganismo de acuerdo a su ecología y metabolismo. Una vez obtenidas
las cepas aisladas del medio donde se encuentran de acuerdo a la ecología y características
de crecimiento, se procede por un lado a realizar pruebas bioquímicas e incluso moleculares,
que permitan caracterizar el microorganismo y por otro, realizar pases en medios adecuados
según el tipo de microorganismo, que permitan obtener un cultivo axénico (Thomas, 2002).
Una vez se ha obtenido el microorganismo, se debe realizar la conservación de la cepa. Los
denominados bancos de cepas son un conjunto de alícuotas homogéneas de un cultivo
microbiológicamente puro que se almacenan bajo condiciones que garanticen su viabilidad,
pureza, actividad y características fenotípicas y genotípicas. La finalidad de estos bancos es
mantener un registro detallado y actualizado de la cepa, conservar microorganismos de
producción, mantener colección para estudios comparativos y disponibilidad para otros
laboratorios (Cameotra, 2007)
Existen varios métodos para la conservación de cepas entre los que se encuentran los
métodos a corto, mediano y largo plazo. El primer método permite la conservación de la
cepa por un lapso máximo de 15 días; se realizan subcultivos o pasajes celulares periódicos
en caja, siendo una herramienta que garantiza un acceso inmediato al microorganismo. Sin
20
embargo, se presentan problemas como la variabilidad genética que pueden sufrir los
microorganismos y contaminación, lo que aumenta el riesgo de perder la cepa. El segundo
método, permite una conservación por espacio de 3 a 6 meses; los medios líquidos son
preferibles a los sólidos, ya que en microorganismos como las levaduras, evitan la formación
de ascosporas, que disminuyen la estabilidad de la cepa. En bacterias y levaduras, son
comúnmente usados la solución salina, agua peptonada, buffer fosfato, entre otros; para
hongos filamentosos y actinos, se usa compuestos como avena, arena, agua y aceite
mineral (Chang et al, 1986). El tercer método permite la conservación de la cepa por un
intervalo de tiempo más amplio, son los más recomendados, debido a que detiene el
crecimiento de las células microbianas garantizando así al máximo su estabilidad genética.
Dentro de este se encuentran los métodos de congelación o criopreservación, método simple
y usado para la preservación de las cepas. Debe ser añadido un agente crioprotector
(anticongelante biológico), que debe ser adicionado al cultivo y cuya finalidad es reducir la
injuria de las células al no ser tóxico, ser altamente permeable, de fácil penetración en la
membrana celular y ayudar a disminuir los efectos nocivos de la congelación (Marín, 2003).
Las temperaturas de almacenamiento deben encontrarse por debajo de los – 20 ºC. Las
células deben ser centrifugadas y posteriormente se les debe adicionar glicerol al 20 ó 30 %
(v/v) o Dimetil Sulfóxido (DMSO) al 5% (v/v), para ser dispensadas en viales y refrigeradas;
mediante este método la viabilidad de los microorganismos puede mantenerse de 3 a 5 años
(Marín, 2003). Otro método de conservación a largo plazo es la liofilización, que implica la
remoción de agua de las células por sublimación bajo presión. Es uno de los métodos más
efectivos de preservación y necesita criopreservantes como leche en polvo al 20 % (p/v) o
sacarosa al 12% (p/v). Las cepas pueden ser preservadas por un período de 10 a 20 años.
Este método es muy usado cuando se necesita transportar constantemente los
microorganismos (Chang et al, 1986)
2.1.5. Pruebas de capacidad probiótica in vitro
Cuando el microorganismo ya se ha obtenido, aislado y se han realizado procesos de
conservación y de caracterización que permitan su identificación, es necesario realizar
pruebas de capacidad probiótica in vitro, que permitan evaluar la resistencia del
microorganismo a condiciones características del tracto gastrointestinal, ya que los
probióticos deben ser tolerantes a la presencia de ácido y de bilis (Valerio, 2006). Estas
pruebas pueden ser cualitativas o cuantitativas (Kumura et al, 2004) y permitirán
correlacionar la actividad de las cepas con su capacidad probiótica in vivo.
21
2.1.5.1. Tolerancia a sales biliares
La bilis, es una solución acuosa verde – amarillenta cuyos mayores componentes son ácidos
biliares, colesterol, fosfolípidos y el pigmento biliverdina. Es sintetizada en los hepatocitos
pericentrales del hígado, almacenada y concentrada en la vésicula biliar y liberada al
duodeno después de la ingesta de comida. La bilis es un detergente biológico que emulsiona
y solubiliza los ácidos grasos de cadena larga y los mono y diacilglicéridos resultantes de la
acción de las lipasas intestinales, formando micelas y por lo tanto juega un rol esencial en la
digestión de grasas. Esta propiedad de detergente, también le confiere actividad
antimicrobiana, al generar la disolución de las membranas bacterianas (Beagley, 2006).
Los ácidos biliares primarios, el ácido cólico y quenodeoxicólico, son sintetizados del
colesterol de novo en el hígado. Los ácidos biliares son eficientemente conservados bajo
condiciones normales, por un proceso de recirculación enteropática. Microorganismos como
Lactobacillus spp, poseen enzimas hidrolasas (BSH) que generan la deconjugación de las
sales biliares, que hidrolizan el enlace amida y liberan glicina y taurina de la base esteroide,
mecanismo por el cual pueden resistir concentraciones de sales biliares en pruebas in vitro y
el paso por el TGI en animales (Moser, 2001). Para evaluar la tolerancia a esta sales, se
suplementa el medio de cultivo, según el tipo de microorganismo a evaluar, con diferentes
concentraciones de sales biliares, generalmente desde 0.1% a 3.5% (p/v) y se incuba por
períodos de 24 horas, realizando posteriormente determinaciones de viabilidad mediante
turbidez o recuento (Gillilland et al, 1990).
2.1.5.2. Tolerancia a pH
En cuanto al pH, microorganismos como Saccharomyces cerevisiae bajo condiciones
aeróbicas, pueden usar ácidos orgánicos de cadena corta como ácido acético y láctico como
fuentes de carbono, mediante el uso de vías anabólicas, enzimas y mecanismos específicos
de transporte (Casal et al., 1996). Una vez en el interior de la célula, estos compuestos
generan una acidificación de citoplasma. En general, las células eucarióticas mantienen el
pH intracelular a pesar de las variaciones de pH extracelular. Para mantener los valores
adecuados dentro de un rango óptimo del metabolismo, las células expulsan protones a
expensas de ATP, lo que resulta en la disminución del rendimiento de consumo con respecto
a la glucosa, generándose un aumento del pH intracelular, permitiéndole a la levadura
resistir rangos amplios (2.4 a 8.6) de pH ácidos (Rose, 1987). La prueba de resistencia a pH,
22
se realiza virando hacia la acidez el medio mediante el uso de HCl, para obtener valores de
1.0 a 5.0, incubando por períodos de 24 horas y realizando la determinación de la viabilidad
del microorganismo (Thomas et al 2002).
2.1.5.3. Resistencia a Jugos gástricos
Los jugos gástricos son producidos en el estómago, son sustancias muy ácidas cuya función
es la de degradar el alimento. Los jugos gástricos están compuestos por agua (98%), sales,
ácido clorhídrico, mucoproteínas, enzimas proteolíticas, factor intrínseco o glucoproteína,
secreciones endocrinas e inmunoglobulinas. Dentro de estas sustancias se destaca el HCl
(ácido clorhídrico), secretado por las células gástricas parietales, que mantiene el pH
necesario, ablanda la fibrina y el colágeno, controla el paso de bacterias al intestino y
estimula la secreción de secretina, estimulador a su vez de la secreción pancreática y biliar.
Contiene enzimas como la pepsina que en medio ácido inicia la digestión de las proteínas,
la renina que sirve para cuajar la leche, y la lipasa que inicia la digestión de grasas. Estas
son características comunes para animales monogástricos. (Lesson et al, 1990). La
evaluación in vitro se realiza elaborando un jugo gástrico artificial, incubando por 24 horas y
realizando determinación de la viabilidad del microorganismo (Spencer et al, 2001).
2.1.5.4. Adhesión celular
Los cultivos de tejidos celulares se han desarrollado desde los últimos años del siglo XX, con
el objetivo de reproducir las condiciones in vivo que permitan el crecimiento de las células,
manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Los cultivos
celulares permiten evaluar diferentes tópicos o mecanismos celulares, tales como actividad
intracelular, interacciones celulares (Fresney, 1990) y la adherencia celular en la selección
de nuevas cepas con potencial probiótico.
La importancia de la adhesión a células epiteliales del intestino para el establecimiento de
microorganismos probióticos en el ecosistema del tracto gastrointestinal ha sido demostrada
en estudios clínicos (Alander et al, 1997). La adhesión a la mucosa intestinal es importante
para la modulación de la respuesta inmune del huésped y la exclusión de patógenos tales
como Helycobacter pilori, Salmonella sp, Listeria sp o Clostridium sp. (Alander et al, 1999).
La habilidad de adherencia al tracto gastrointestinal de niños y adultos, ha sido estudiada en
microorganismos como Lactobacillus rhamnosus (Goldin et al, 1992, Millar et al, 1993).
Además in vitro, se han realizado estudios de la inhibición de la adherencia de patógenos
23
como E. coli, Salmonella typhimurium y Enterococcus faecalis, por bacterias ácido lácticas
(Todokiri et al, 2001). McFarland et al (1994) reportó la disminución en la incidencia de
diarrea causada por Clostridium sp. al administrar levaduras (Saccharomyces cerevisiae var.
boulardii;, sin embargo para este año no se había dilucidado si el mecanismo de adhesión y
por lo tanto exclusión era usado por el probiótico para evitar la colonización del patógeno.
Sin embargo, Gedek (1999) reportó que cepas de E.coli enteropatogénica y de Salmonella
typhimurium y Salmonella enteritidis se unían a S. cerevisiae por receptores tipo lectina
dependiente de manosas o derivados de estas presentes en la pared celular de la levadura,
resultados comparables con los hallados por Pérez et al (2005) en que se observó la
adherencia de cepas de Salmonella sp. a levaduras, verificando que este es un mecanismo
usado por algunos microorganismos probióticos para evitar la colonización de la mucosa del
intestino por parte de patógenos.
2.1.5.4.1. Cultivos celulares
Para poder realizar cultivos celulares es importante tener en cuenta la curva de crecimiento
celular en la que se evidencia la adaptación a cultivos, a condiciones ambientales y a la
viabilidad física del substrato o del suplemento necesario para poder generarse nuevas
células.
Las fases de crecimiento celular que se presentan en los cultivos son:
- Fase de latencia (lag): en esta fase no hay división celular, su duración depende del
tiempo y la densidad celular.
- Fase logarítmica (log): esta es una fase de proliferación activa, el número de células
se eleva exponencialmente. El porcentaje de viabilidad de las células puede llegar a se
de un 90 a 100%.
- Fase estacionaria: se da división, pero mucha más lenta. El porcentaje de división
tiende a balancearse con la tasa de muerte y la viabilidad baja a un 0 a 10%.
- Fase declinativa: es un periodo de caída reflejado en el número de células
compensadas por la muerte celular (Fresney, 1990).
Dentro de los medios de cultivo mas utilizados para la realización de cultivos celulares, se
encuentra el Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM), que provee nutrientes básicos a las
células, ya sea que se en encuentren en solución o ligados a proteínas, favoreciendo o
24
estimulando el crecimiento celular, los factores de adhesión y propagación en los cuales se
proporciona el transporte de hormonas, vitaminas, minerales y lípidos (Sambuy et al., 2005).
Se emplea de manera generalizada una adición al 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado
(SFB), con el fin de destruir inmunoglobulinas que puedan llevar a la lisis celular; este SFB
es una mezcla de biomoléculas pequeñas que promueven el crecimiento celular al contener
glucosa, nitrógeno, albúmina, fibronectina, ácido búrico, creatina, hemoglobina, entre otros
(Fresney, 1990). Adicionalmente, el medio debe ser suplementado con L-Glutamina, que es
un aminoácido esencial para las células en cultivo, debido a que actúa como la principal
fuente de carbono, al ser precursor para posteriores biosíntesis y como fuente de energía al
participar en el ciclo de Krebs (Mathews, 2003). Además se debe suplementar el medio con
antibióticos como Penicilina y Estreptomicina, que eviten contaminación microbiana, pero
que no inhiban el crecimiento celular, ni se vean envueltos en el metabolismo de las células
(Fresney, 1990).
2.1.5.4.2. Líneas celulares
Existen diversas líneas celulares con las que se puede trabajar según el tipo de estudio que
se quiera realizar. Para estudios de adherencia celular de probióticos, una de las líneas mas
usadas en probióticos es la Caco-2 aisladas por J. Fogh a partir de un tumor primario de
colón de humano, en medio mínimo esencial de Eagle en presencia de 5 – 10% de CO2 y un
pH de 7.4 (ATCC, 1992) ya que, al cultivarse por un proceso de diferenciación espontánea
se permite la formación de la monocapa como se observa en la Figura 1, expresando varias
características morfológicas y funcionales típicas de los entericitos maduros (Sambuy et al,
2005), como la similitud en la organización de microvellos en el lado apical de estas células,
blanco donde actúan estos microorganismos (Zweibaum et al, 1991), uniones tight entre
células adyacentes y actividad de enzimas hidrolasas presentes en el intestino delgado. Las
células en edad temprana muestran un efecto citopático, tornándose estas más redondeadas
y en forma de racimos (Willicocks, 1990). En la membrana de estas células se encuentran
receptores de membrana polarizadas para factores de crecimiento y actividades de
transporte de azúcares, vitaminas, ácidos biliares, micronutrientes como metales pesados y
nucleósidos (Sambuy et al, 2005)
25
Figura Nº 1. Células Caco – 2 en monocapa con coloración de Wrigth.
Fuente (Autores, 2007)
2.1.5.4.3. Ensayos de adhesión
Estos ensayos se llevan a cabo para verificar la exclusión competitiva de patógenos y
bacterias indeseables, exponiendo cultivos celulares a los microorganismos y verificando la
adhesión por microscopía usando la coloración de Giemsa, ya que permite observar a los
microorganismos (probióticos) frente a las células como se observa en la Figura 2, al ser una
coloración diferencial que evidencia la adherencia y hace posible realizar un conteo
expresado en número de microorganismos adheridos a 100 células (Kumura et al, 2004).
Figura 2. Análisis de adherencia por microscopio invertido de
Kluyveromyces lactis a células Caco-2 diferenciadas con coloración de Giemsa.
Fuente (Kumura et al, 2004)
26
2.1.5.5. Reducción del colesterol en presencia de sales biliares
Se pueden realizar pruebas de reducción de colesterol, ya que microorganismos como
Lactobacillus sp, llevan a cabo una conversión metabólica del colesterol a una forma más
asimilable y menos dañina. Esta es una propiedad importante, debido a que en condiciones
de estrés se puede afectar el metabolismo de lípidos, afectando la calidad del pollo y sus
derivados (Endo, 1999). Estudios relevantes de la asimilación de colesterol por levaduras en
condiciones típicamente encontradas en el tracto gastrointestinal no han sido aún
reportados; sin embargo, varios estudios han indicado que durante su crecimiento pueden
remover colesterol de medios suplementados con micelios de colesterol (Taylor and Parks,
1981).
El método de extracción que se utiliza es el propuesto por Fleutoris et al (1998) para la
determinación de colesterol en leches y sus derivados con algunas modificaciones
propuestas por Spencer (2001). Este protocolo se utiliza ya que la precisión y correlación de
los datos, han demostrado que es adecuado, debido a que los resultados obtenidos
demuestran un 98.6% de recuperación del colesterol de las muestras analizadas, adicional a
la pequeña cantidad de analito que se necesita y al corto tiempo de determinación
comparado con otros métodos (Fleutoris et al, 1998).
La primera parte de la determinación consiste en la saponificación directa, en la cual el
colesterol esterificado debe ser liberado del complejo de lipoproteínas e hidrolizado. La
adición de solventes, es importante, ya que el colesterol en la solución de saponificación no
se emulsiona, por lo que la adición de estos compuestos, libera la muestra a analizar,
evitando resultados erróneos. Inicialmente, se debe aplicar una solución de KOH metanólica
o etanol al 95% seguido de KOH al 50%, seguido de calor (60 ºC a 80 ºC) de 10 a 15
minutos.
Una vez se ha llevado a cabo esta parte del protocolo, sigue la extracción, en la que se
adicionan solventes polares como el hexano que ha mostrado ser excelente, debido a que es
menos tóxico que otros compuestos y no forma emulsiones ni peróxidos que podrían
interactuar con el colesterol , alterando los resultados (Fenton, 1992). La adición de agua en
este proceso es importante, debido a que en presencia de este compuesto se puede hacer
una extracción cuantitativa, eliminando la necesidad de una segunda extracción, al producir
un aumento de la polaridad de la fase donde se encuentra el KOH metanólico, por lo que el
colesterol es forzado a transferirse a la fase menos polar, donde se encuentra el hexano
27
(Anexo Nº 6.6). Posteriormente, se analiza la muestra por cromatografía de gas (Fleutoris et
al, 1998) o por la reacción de Liebermann – Burchard (Skoog, 1988).
Dentro de la determinación de la reducción de colesterol es recomendable realizar
sonicación que es un mecanismo de ruptura celular que genera la lisis de la membrana o
pared por la intensa agitación producida al transmitir corrientes eléctricas a un sistema
mecánico que genera vibraciones de alta energía produciendo ondas de ultrasonido que
forman burbujas microscópicas que se expanden y colapsan contra las células causando la
ruptura de la membrana, fenómeno conocido como cavitación (Ruiz et al, 1999); con el fin de
determinar si el microorganismo probiótico asimila el colesterol a su estructura confiriéndole
mayor resistencia a condiciones adversas que puedan llegar a generar la lisis de la célula,
comparado con aquellos que no lo incorporan a su membrana (Psomas et al, 2005).
2.1.6. Resistencia del probiótico a condiciones in vivo
Después de la administración del probiótico, los microorganismos no deben morir debido a
los mecanismos de defensa del huésped (Netherwood, 1999). Dependiendo de los sitios de
administración del probiótico, deben resistir condiciones específicas: significa, por ejemplo
que aquellos que son suministrados por vía oral deben resistir enzimas de la cavidad bucal e
intestinal como amilasas, lisosimas o lipasas, así como pH bajo debido a la alta
concentración de acido clorhídrico en el estómago, a la bilis, jugo pancreático
y la
mucosidad del intestino delgado (García, 1995). Para realizar la selección de una cepa
apropiada para ser usada como probióticos se deben tener en cuenta los ensayos realizados
previamente con el microorganismo in vitro, como los mencionados anteriormente, para
poder correlacionar los resultados con su capacidad probiótica in vivo. (Fuller, 1992).
2.1.7. Procesamiento de probióticos en productos terminados
Al determinar que un microorganismo tiene capacidad probiótica in vitro e in vivo, es
importante estudiar la viabilidad y resistencia de los microorganismos durante el
procesamiento al que serán sometidos, para su comercialización. El propósito para el cual
los probióticos van a ser utilizados determina el método de administración. Para cada
método de administración se debe considerar el procesamiento del producto así como las
propiedades de los microorganismos probióticos. Durante el proceso de selección se deben
determinar las características específicas de cada cepa de microorganismo.
28
Uno de los primeros pasos para la producción de probióticos es el cultivo, que debe
realizarse en medios que sean específicos para el tipo de microorganismo a trabajar y que
deben favorecer su crecimiento, teniendo en cuenta la concentración que se desea obtener
para posteriormente realizar un lavado y secado de los mismos. Muchas de la bacterias
ácido lácticas comúnmente usadas como probióticos pueden ser cultivadas a gran escala en
fermentadores en condiciones aerobias y luego ser sometidas a un proceso de
centrifugación. Los probióticos para animales pueden ser incluidos en el pienso o dosificados
directamente en forma de pasta, polvos, gránulos o capsulas (Peña, 2000).
Se han desarrollado varios procesos industriales para mantener los probióticos en un estado
estable y viable (Fuller, 1992), tales como la microencapsulación o inmovilización (Ferreira et
al, 2004), que consiste en introducir las células en una matriz o sistema de pared, con el
objetivo de protegerlos de la luz o el oxígeno, que pueden afectarlos negativamente
disminuyendo su viabilidad. Al estar encapsulado, las células se van liberando gradualmente,
obteniendo mejores resultados al extender su vida útil y facilitando su uso (Chang, 2000).
Dentro de las técnicas se encuentran aquellas que son físicas como la extrusión o emulsión
en materiales de soporte como alginato de sodio, aceite de girasol (Ré, 1996).
El método de la extrusión es el más común y consiste en la formación de cápsulas con
hidrocoloides. El polisacárido alginato de sodio ha sido una de las herramientas de
microencapsulación mas usadas (Park et al., 2000). Este forma un gel al entrar en contacto
con calcio y cationes multivalentes (Fennema, 2000). Las micropartículas de alginato son
estables en condiciones de pH bajo. Cuando los probióticos se incluyen en algunos
alimentos, el alginato de calcio ofrece una buena protección para microorganismos como
Lactobacillus bulgaricus durante la refrigeración en helados, para Bifidobacteria que
inmovilizado en este compuesto es más resistente a valores de pH ácidos comparado con
células libres en alimentos como mayonesa (Khalil et al., 1998).
Una técnica comúnmente usada en la industria de alimentos es la compresión en pellets del
probiótico, pero esto hace que durante este proceso la viabilidad baje dramáticamente. Otro
aspecto a tener en cuenta son los aditivos que son incorporados al alimento y que puedan
afectar a los microorganismos probióticos, sustancias que se incluyen al alimento para evitar
contaminación o suplementos como sulfato de hierro, óxido de hierro, sulfato de cobalto, que
deben ser adicionadas con cuidado teniendo en cuenta las cantidades que pueden ser
perjudiciales para los probióticos (Fuller, 1992).
29
2.2 PROBIÓTICOS PARA AVES DE CORRAL
2.2.1. Aves de corral y el tracto gastrointestinal
La fisiología del sistema digestivo de las aves es similar en términos generales al de los
cerdos y los humanos. Todos ellos, animales monogástricos con poca capacidad para digerir
la celulosa y otros carbohidratos complejos en comparación con los animales herbívoros
rumiantes.
El aparato digestivo de las aves es más ligero, más corto y el alimento lo recorre con mucha
mayor rapidez que en especies no rumiantes (Rose, 1997).
- En la boca presenta un pico córneo característico que suele ser cortante y puntiagudo,
dispone de una lengua no flexible que solamente se mueve hacia atrás y pasa las partículas
del alimento rápidamente hacia la faringe. La saliva escasa, produce poca descomposición
enzimática del alimento en la boca.
- El buche es un saco dilatable que funciona almacenando alimentos. Dispone de una
población de bacterias residentes, principalmente Lactobacillus, que fermentan parte de los
carbohidratos a ácido láctico, por lo que desciende el pH del alimento durante su retención
en el buche.
- El proventrículo o verdadero estómago, se distingue por su gruesa membrana mucosa
glandular. Las glándulas segregan ácido clorhídrico y pepsinógeno. La acidez del alimento
es reducida hasta un pH que permite la formación de pepsina que cataliza la hidrólisis de las
proteínas.
- En la molleja se realiza la mayor parte de la hidrólisis de la proteína catalizada por la
pepsina. Debido a su forma de esfera aplastada rodeada de músculos potentes, se provoca
una presión intensa en su interior. Adicional, ya que se retienen partículas de arena, se
genera una superficie abrasiva, que ayuda en la molturación de los alimentos.
- En el intestino delgado las partículas penetran al duodeno donde se vierte la bilis y las
enzimas pancreáticas. El antiperistaltismo resulta particularmente importante para que sea
máxima la hidrólisis y la absorción de lípidos. La acidez de la molleja no aporta el pH
adecuado para que actúe la lipasa, aunque las sales biliares no son dependientes el pH y
continuarán emulsionando los glóbulos de grasa.
- El colón y el recto son muy cortos. Los ciegos son los órganos en que se produce la
fermentación bacteriana del material alimenticio no digerido en la mayoría de los animales
rumiantes.
30
- En la cloaca los residuos alimenticios no digeridos se acumulan en esta parte desde son
excretados. La orina se acumula también en la cloaca y se mezclará con las heces antes de
ser eliminadas del cuerpo de las aves.
2.2.2. La flora intestinal normal de aves de corral
La microflora intestinal de aves de corral es compleja y las interacciones entre los diferentes
tipos de organismo son complicadas. Las interacciones que son mejor comprendidas son
probablemente las más simples. Sin embargo el conocimiento de la flora intestinal de pollos
aumenta continuamente.
Los microorganismos predominantes son Lactobacilos que producen principalmente acido
láctico y acético de manera que el buche de un pollo saludable presenta valores de pH entre
4 y 5; de esta manera microorganismos menos acidúricos no crecen en la misma cantidad.
El pH del proventrículo y la molleja es mas bajo (de 1 a 2) (Fuller, 1992) y la sobrevivencia
microbiana depende de la resistencia a ácidos.
En el ciego se encuentran anaerobios facultativos que incluyen enterobacterias como E. coli,
Citrobacter sp., Salmonella sp., Proteus sp. y Klebsiella sp. y otros microorganismos en
menor proporción como Pseudomonas sp. y levaduras. En polluelos el tracto alimentario es
estéril por lo que es rápidamente colonizado por anaerobios facultativos principalmente
Coliformes y Estreptococos, incluso algunos Clostridios pueden estar presentes (Fuller,
1992).
2.2.3. Infecciones bacterianas tempranas en polluelos
Las bacterias amenazan a los pollitos tanto en la incubación natural o en la artificial. Cuanto
mayor es el grupo, con más facilidad se diseminan los microorganismos en la población.
Estos microorganismos patógenos pueden proceder de la madre o bien, tener su origen en
deficientes condiciones del entorno. Determinadas acciones ambientales, como la existencia
de corrientes de aire o de temperaturas inadecuadas en los gallineros, favorecen la
multiplicación de microorganismos en las aves y aumentan la propensión de estas a sufrir
enfermedades. Entre los patógenos, se debe tener en cuenta principalmente a las
Salmonelas (Salmonella pullorum, Salmonella enteritidis). Por eliminarse en las heces,
ingresan rápidamente por el pico hacia el tracto gastrointestinal de otros pollitos, ya en la
31
incubadora, pero también por vía respiratoria con el aire que contiene partículas de
excrementos (Woernle, 1996).
2.2.4 Aplicación y evaluación de probióticos en aves de corral.
Los probióticos para pollos son diseñados para reemplazar organismos benéficos que no se
encuentran en el tracto alimenticio o para proveer al pollo de los efectos benéficos de los
mismos (Abdudrahim, 1999). Estos microorganismos pueden estar ausentes porque los
métodos actuales de crianza previenen el contacto entre el polluelo y su progenitor
previniendo la transferencia vertical rápida de bacterias benéficas o por prácticas de manejo
que pueden alterar la microecologia intestinal; adicionalmente, la producción de corticoides
endógenos por estrés, deprimen la respuesta inmune del animal, desencadenando un
desequilibro en la flora luminar del tubo digestivo. En el caso de los pollitos que son criados
lejos de sus madres y adquieren del medio ambiente su flora, trae como consecuencia que la
flora intestinal de los polluelos recién eclosionados “modernos” sea deficiente comparado
con la de los pollos incubados por sus madres biológicas (Fuller, 1992).
Existen dos grupos grandes de preparaciones de probióticos: aquellas que primariamente
son efectivas en el buche (en esta parte del TGI se encuentra gobernado el mecanismo de
colonización, ya que allí se lleva a cabo la multiplicación de la flora bacteriana y
posteriormente esta migra para colonizar las partes bajas del sistema digestivo) y regiones
anteriores del tracto alimenticio y aquellas cuyo efecto es principalmente en el intestino
ciego. Sin embargo ambas preparaciones pueden ser efectivas a través de todo el sistema
digestivo (Fuller, 1992). Si se proporciona microflora a las aves, por lo común de contenido
de ciegos, se produce una alta protección estable 32 horas después, lo cual limita con
eficiencia la prevalencia de la infección de Salmonella sp. La exclusión competitiva funciona
contra la exposición animal continua elevada y con frecuencia, previene las infecciones
cuando existe contaminación con Salmonella sp. en bajas cantidades (Jordan F. y Pattison
M, 1998).
Aunque un número de observaciones empíricas ha sugerido que, algunas preparaciones
que contienen bacterias son probióticos efectivos, el uso de organismos vivos es enfatizado
para muchos productos debido a que la colonización intestinal es esencial para la eficacia
del mismo (Fuller, 1992). De la misma manera, se ha estudiado la posibilidad de
proporcionar a los pollitos un cultivo de heces proveniente de pollos adultos, como
32
alternativa al uso de antibióticos para controlar Salmonella sp, ya que mediante este método
el patógeno puede no ser eliminado y generar resistencia (Oliveira et al, 2000).
Según Tortuero (1973), en pollos de engorde, la administración de probióticos fue tan
benéfica como la de un promotor de crecimiento convencional en lo que hace referencia al
incremento de peso y al índice de conversión. Dilworth y Day en 1978 condujeron
experimentos evaluando probióticos en la dieta de pollos de engorde. Se obtuvo un
significativo mejoramiento en el peso y la eficiencia del alimento. Para 1979, Crawford
encontró que un cultivo probiótico en la proporción de 454 g por tonelada de alimento,
mejoró la conversión alimenticia en pollos sometidos a la prueba desde el nacimiento hasta
el día del sacrificio. En 1978 Couch agregó un probiótico a un alimento para pollos de
engorde obteniendo un incremento en los promedios de peso, decreciendo la mortalidad en
un 4% (Fuller, 1992).
Para asegurar la habilidad de colonizar, el probiótico debe adherirse al epitelio del buche,
crecer en el medio ambiente del intestino y resistir mecanismos inhibitorios naturales o
innatos. La tolerancia a bajos rangos de pH también es importante para permitir la
colonización del intestino delgado y la sobrevivencia al medio ambiente de la molleja.
Factores adicionales tales como temperatura óptima de crecimiento y resistencia a ácidos
grasos insaturados pueden ser también significantes en la colonización (Fuller, 1992).
2.3. Saccharomyces cerevisiae
2.3.1. Generalidades
Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos, incluyendo tanto
especies patógenas para plantas y animales, como especies no solamente inocuas sino de
gran utilidad. Se encuentran clasificadas dentro de los Ascomicetes y Basidiomicetes
pertenecientes
al
orden
Endomicetales.
Las
levaduras
constituyen
el
grupo
de
microorganismos mas íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. La
membrana celular consta de polisacáridos y muy poca quítina. Tienen glucógeno como
sustancia de reserva y contienen también numerosas vitaminas (Barnett, 1990).
Saccharomyces cerevisiae es un anaerobio facultativo: transformando azúcar a la misma
velocidad, la levadura aeróbica produce dióxido de carbono, agua y una producción
relativamente alta de nueva levadura, mientras que crecida anaeróbicamente tiene una
33
velocidad relativamente lenta de crecimiento, que se acopla a una alta conversión de azúcar
en alcohol y dióxido de carbono. Dentro de sus requerimientos nutricionales se encuentra el
carbono, como el mayor compuesto encontrado en la célula, utilizando para su metabolismo
glúcidos como hexosas, disacáridos y trisacáridos. El nitrógeno, es utilizado en forma de ión
amonio y es utilizado en aminoácidos, vitaminas y nucleótidos. Otros elementos como
fósforo, azufre, potasio, magnesio, calcio, zinc y manganeso son importantes dentro de su
metabolismo (Bouix, 2000).
Algunas especies de levaduras del género Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el
proceso de fermentación, propiedad que se ha explotado desde hace muchos años en la
producción de pan y de bebidas alcohólicas. El estudio de las levaduras como modelo
biológico ha contribuido de manera muy importante a dilucidar los procesos básicos de la
fisiología celular. (González, 2000). En años recientes se ha implementado su uso como
probiótico, entre las que se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum y
Saccharomyces cerevisiae var. boulardii (Arora, 1991).
Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y el
microorganismo eucariote más estudiado. Así, desde fines del siglo XIX se reconocieron
algunas de las ventajas que ofrece el uso de esta levadura como biológico en la
investigación: por un lado, la facilidad con la que se obtienen grandes cantidades de este
microorganismo debido a su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular
(aproximadamente dos horas); y por otro, el hecho de que S. cerevisiae posee un ciclo de
vida que al incluir una fase sexual, permite abordar estudios con las herramientas que
provee la genética formal (González, 2000).
Por medio de receptores anclados a la membrana celular, esta levadura puede responder a
la presencia de moléculas que actúan como señales en una condición fisiológica
determinada, estas señales se traducen por un sistema de señalización en el que participan
cinasas denominadas “proteín-cinasas”, que le permiten resistir exposiciones a alta o baja
osmolaridad, la presencia de una alta o baja concentración de sal en el medio de cultivo o de
pH, por lo que se genera una señal, que al interaccionar con un receptor específico, pasa a
través de una serie de moléculas intermediarias hasta modificar un determinado regulador
transcripcional, que es capaz de activar o reprimir la expresión de un gen o grupos de genes.
Esto le permite a la célula transcribir de manera selectiva un grupo de genes específicos,
cuya traducción resultará en la síntesis de los productos que le permitan contender de
manera eficiente con la condición fisiológica en la que se encuentra, y por tanto mantener la
34
viabilidad, esporular, crecer en forma de filamentos, etc. Así se han descrito en S. cerevisiae
distintas cascadas que responden a estímulos ambientales diferentes y específicos
(González, 2000)
2.3.2. Ciclo asexual y sexual de Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae se divide por gemación y puede tener una reproducción asexual cuando se
encuentra en su forma haploide. Durante la fase vegetativa, la levadura se divide por
gemación como se observa en la Figura 2. En la parte asexual, la célula hija inicia su
crecimiento formando una yema en la célula madre, posteriormente ocurre la división
nuclear, la síntesis de la pared y finalmente la separación de las dos células. Durante
muchos años se consideró que a diferencia de los hongos denominados filamentosos, S.
cerevisiae era incapaz de formar hifas o filamentos y que su crecimiento vegetativo, a través
de la gemación, únicamente resultaba en la formación de células esféricas denominadas
levaduras. Sin embargo, en estudios recientes se encontró que Saccharomyces era capaz
de formar hifas (pseudohifas), denominadas así debido a que por la fisión binaria se generan
cilindros que terminarán en elongaciones y la formación de un septo, por donde se dividirá la
célula (González, 2000).
Figura Nº 3. Microscopia electrónica de formación de yemas de Saccharomyces
cerevisiae. Fuente (www.bath.ac.uk/bio-sci/wheals2.htm)
En la parte del ciclo sexual, a partir de un cigoto se forma un asca que contiene cuatro
ascosporas haploides, generadas cuando la célula diploide se divide por meiosis. S.
cerevisiae posee dos tipo sexuales: a y α, determinados por un par de alelos heterocigos:
MATa y MATα, que al combinarse, dan origen a las nuevas células diploides (González,
2000) que se observan en la Figura 4.
35
Figura Nº 4. Reproducción sexual y asexual de Saccharomyces cerevisiae.
Fuente (Tuité, 2001)
2.3.3. Cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae
Cuando se adicionan levaduras a un medio adecuado que supla los requerimientos
nutricionales y metabólicos del microorganismo, se puede observar la cinética del
crecimiento, representado en una curva, con diferentes fases como se observa en la Figura
5. Esta curva es de gran utilidad, ya que permite obtener una población de células de
número conocido, incubando durante un tiempo determinado (Barnnet, 1990).
Figura Nº 5. Curva de crecimiento de levaduras.
Fuente((http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm)
36
- Fase de latencia: al inocular la levadura a medio fresco, el crecimiento no se da
inmediatamente, sino después de cierto tiempo. Es una fase de adaptación al medio, ya sea
porque deben sintetizar enzimas que les permitan degradar los componentes del mismo, o
porque han sufrido algún tipo de injuria o proceso como conservación.
- Fase exponencial: la velocidad de crecimiento es lenta inicialmente, pero después se
incrementa constantemente. Debido a la rápida reproducción de la células, los nutrientes son
consumidos rápidamente y es importante que las condiciones de crecimiento referentes a
temperatura y agitación, para intercambio de gases, se encuentre controlada.
- Fase estacionaria: no hay incremento neto (o decremento) del número de células, sin
embargo todavía ocurren muchas funciones celulares, incluyendo el metabolismo energético
y algunos procesos sintéticos. En esta fase, se da un agotamiento de los nutrientes
presentes en el medio o por producción de sustancias tóxicas.
- Fase de muerte: el número de células disminuye, por la ausencia total de nutrientes, puede
incluso generarse lisis celular, la disminución es exponencial, pero la velocidad de muerte no
es tan rápida como el crecimiento exponencial.
2.3.4. Antecedentes de Saccharomyces cerevisiae como probiótico
Al encontrarse activa o viable con un conteo de 10 mil a 20 mil millones de células vivas por
gramo, esta levadura se utiliza principalmente como probiótico, algunas de sus funciones
son:
-
Promotor de crecimiento
-
Aumenta la producción de vitamina B.
-
Mayor ganancia de peso.
-
Rápida digestión de algunos alimentos.
-
Acción estimulante de la inmunidad.
-
Mejora la asimilación de nutrientes.
-
Corrige el balance de la población microbiana (Agarwal et al, 2000).
Dentro de las levaduras, la especie S. cerevisiae var. boulardii ha sido la más ampliamente
estudiada en ensayos clínicos, ya que ha mostrado estar asociada a la prevención de
diarrea, aunque el mecanismo aun no se encuentra bien definido. Este microorganismo fue
aislado inicialmente de frutas que eran usadas en la medicina popular. En Francia, en 1950
37
se introdujo un producto que contenía la levadura y en la actualidad es comercializada de
manera liofilizada en Europa, Africa y Suramérica. No es encontrada como parte de la flora
habitual del tracto gastrointestinal y debe ser administrada continuamente, para asegurar su
permanencia y colonización de enterocitos (Toma et al, 2005).
Esta levadura puede secretar una proteasa que digiere dos exotoxinas, toxina A y toxina B,
que están implicadas en la diarrea y la colitis causada Clostridium difficile. (Surawicz et al,
1989). Basados en estudios experimentales se han propuesto 3 posibles mecanismos de
acción por el que esta levadura puede controlar la diarrea i) actividad antagónica in vitro
contra varias bacterias patógenas (Brugier and Patte, 1975) y especies de Candida
(Ducluzeau and Bensaada, 1982); ii) estimulación de una secreción de inmunoglobulinas
intestinales, defensa ante infecciones (Machado-Caetano et al, 1986; Buts et al, 1990); iii)
reducción de la producción o acción de varias toxinas bacterianas (Massot et al, 1982); y iv)
aumento de la actividad de disacáridos en la mucosa intestinal en ratas y humanos (Buts et
al, 1986).
Según Rodrigues et al (1996) la actividad antagónica de la levadura se observó in vivo
contra Candida sp., pero no contra Salmonella typhimurium, Shigella flexneri y Escherichia
coli. Otro mecanismo posiblemente envuelve el sistema inmune como responsable de la
protección conferida por S. cerevisiae var. boulardii contra estos enteropatógenos. Toma et
al (2005), encontró que probablemente S. boulardii puede estar implicada en la conversión
de diferentes compuestos tóxicos tales como agentes mutágenicos en productos no
reactivos, característica que junto la resistencia a temperatura y acidez (Fietto et al, 2004) y
la resistencia a antibióticos, genera un panorama muy prometedor para el uso de este
microorganismo comparado con otros probióticos.
S. cerevisiae es un microorganismo probiótico que ha sido estudiado en especies como
cerdos, bovinos y caballos en los que se ha utilizado como promotor del crecimiento (Medina
et al, 2002). En el estudio de Dann et al (2003), se observó que se mejoraba la producción
de leche cuando se suministraba la levadura en la dieta de bovinos, En animales como
terneros se ha mostrado que se mejora la absorción de nutrientes y se mejora la producción
de los animales a los que se suministra en la dieta (Kung et al, 1997).
Saccharomyces contiene grandes cantidades de ß-glucanos en su pared celular, que actúan
como promotores de la activación inespecífica del sistema inmune. Estos compuestos, son
polímeros de glucosa con uniones beta-(1-3) que se pueden encontrar en forma de
38
partículas o en forma soluble y tienen capacidad inmunoestimulante, mediante la
estimulación de macrófagos y neutrófilos y de esta manera protegiendo al huésped de
infecciones, ya que en situaciones de estrés se producen y liberan corticoides endógenos,
que deprimen la respuesta inmune y se genera un desequilibrio en la flora intestinal,
situación propicia para la colonización por patógenos (Pelizon et al, 2003).
El valor nutritivo de la levadura varía dependiendo del sustrato utilizado para su crecimiento
y también del proceso industrial al cual es sometida (Alvarez y Valdivia, 1980). Existen
reportes que indican que cantidades del 10 al 15 % de levadura, como sustituto parcial de la
harina de soya en raciones de pollos de engorde, no afecta el comportamiento productivo de
las aves (Murakami et al., 1993). Las levaduras no son parte de la flora normal de los
monogástricos, sin embargo al estar situadas en bajo ciertas condiciones anaerobias pueden
aportar enzimas como lipasas, proteasas, vitamina B, aminoácidos, minerales, iones
metálicos y otros cofactores (Pardio, 1996).
Al consumir el oxígeno debido a su metabolismo, pueden estimular el crecimiento de
microorganismos anaerobios característicos del tracto gastrointestinal. Al encontrarse
adheridas a enterocitos, y debido la absorción celular que tiene en su pared, esta levadura
puede ser fuente y reserva de zinc, potasio y cobre. Pueden aportar factores de crecimiento,
vitaminas del grupo B, inhiben toxinas y debido a la producción de ácido glutámico aumentan
el gusto de los alimentos (Dawson, 1987).
En Cuba se han realizado estudios que incluyen S. cerevisiae, con bagazo de caña de
azúcar en concentraciones de 10%, 15% y 20 % (p/p) a la dieta tradicional suministrada a los
polluelos para evidenciar los beneficios que genera en el animal, encontrando que después
del período de evaluación, la levadura puede constituir portadores de nutrientes con
características favorables, aumentando el peso del pollo en un período de tiempo aceptable
y a la vez disminuyendo los costos de producción (Solano et al, 2005).
Los beneficios que ofrece este microorganismo para los pollos radica en lo enumerado
anteriormente y además porque se señala que su utilización como probiótico, reduce
algunos enteropatógenos, produce cambios favorables en la mucosa intestinal y mejora el
comportamiento productivo con raciones bajas en proteína (Kumprechtová et al., 2000) por
lo que la evaluación de este microorganismo se hace muy importante como mecanismo para
verificar que las cepas en estudio pueden ser suministradas al polluelo, y resisten las
condiciones del tracto gastrointestinal.
39
2.4. INDUSTRIA AVÍCOLA EN COLOMBIA
La crianza de aves útiles al hombre se origina en la antigüedad, por lo que la avicultura
moderna no es más que la modernización de los métodos, ya que las aves son animales
cuyas necesidades nutricionales y técnicas han alcanzado un alto grado de demanda, lo que
ha generado un mayor perfeccionamiento, generando mejores niveles de calidad, pero
asimismo aumentando los costos de mantenimiento En Colombia, los años 80’s generaron
que el desarrollo tecnológico en esta área se disparara y ya para el año 1991, la avicultura
generaba un 2 % del PIB total del país (Molina, 2002). En la actualidad, la industria avícola
ha aumentado notablemente la producción al registrarse un crecimiento de 10.6% para el
2006, el doble del alcanzado en el 2005 (5.4%), con lo cual este sector sigue consolidándose
como el más dinámico de la economía nacional. En el 2006 se presentó un consumo anual
de 849.557 toneladas de pollo, siendo el consumo per cápita de 19.9 Kg/año (Figura 6),
aumentando notoriamente sobre el consumo per cápita de carne bovina o porcícola
(FENAVI, 2006).
CONSUMO PER CÁPITA DE POLLO EN COLOMBIA (1970 -2006)
(kilogramos / año)
25,0
19,8
20,0
18,1
15,6
15,2
14,8
13,8
13,3
12,9
12,0
12,0
11,7
11,2
10,6
9,7
15,0
10,0
7,7 8,1 7,6 7,9 7,8
8,6
6,9
4,7
5,0
2,8 2,9
2,4 2,6
1,9 2,2
1,6 1,8
1,3
1,2
1,0
5,2 5,3
5,8
3,6
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1999
1998
1997
1996
1995
1994
1993
1992
1991
1990
1989
1988
1987
1986
1985
1984
1983
1982
1981
1980
1979
1978
1977
1976
1975
1974
1973
1972
1971
1970
0,0
Figura Nº 6. Consumo per cápita de pollo en Colombia (1970 – 2006).
Fuente (FENAVI, 2006)
La oferta total de pollo en canal registró en el primer semestre del año un crecimiento de 8%:
de una producción en igual periodo del 2005 de 367.709 toneladas, se pasó a 397.197
40
(Figura 7). Esto quiere decir que desde el 2000 se ha mantenido un crecimiento de 5.1%
promedio anual (FENAVI, 2006). La incidencia económica de la industria avícola en
Colombia es importante, ya que es uno de los sectores con mayor crecimiento, la
exportación para 2006 en pollitos de 1 día generó ingresos de U$ 105’110.000 y con una
tendencia al aumento de la demanda, condiciones que crean el escenario perfecto, para que
el uso de probióticos disminuya las pérdidas de polluelos, reduciendo los costos de
producción, ya que para el año 2006 estos costos presentaron un aumento del 8.7%;
beneficiando en primer lugar a la empresa y es segundo al consumidor, que deberá pagar un
valor menor por un producto de calidad.
Figura Nº 7. Producción de pollo (toneladas) en 2001 – 2006.
Fuente (FENAVI, 2006)
41
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.1. Formulación del problema
Las levaduras utilizadas como probióticos ofrecen beneficios tales como la capacidad de
resistir el pasaje a través del tracto gastrointestinal sin que presenten pérdidas significativas
de viabilidad debido a que, activan mecanismos para tolerar condiciones de estrés como la
exposición a sales biliares, jugos gástricos, ácidos orgánicos y enzimas digestivas, así como
la competencia con microbiota propia del huésped (Holzapfel et al, 1998). Adicionalmente, se
han reconocido ventajas de su uso ya que en especies como bovinos, aves, cunícola y
porcícola ayuda a la promoción del crecimiento al mejorar la digestión del animal, al
aumentar la absorción de nutrientes, producir cambios favorables en la mucosa intestinal, así
como disminuir o reducir notablemente la presencia de microorganismos patógenos
(Perdomo et al, 2004) como Salmonella sp. (Mantilla y Suá 2000), Pseudomonas sp, S.
aureus, Clostridium perfringes y Clostridium botulinum (Woernle, 1996); generar efectos
anticarcinogénicos, anticolesterémicos e inmunoestimulatorios (Oyetayo et al, 2005), así
como el crecimiento a una temperatura relativamente alta (37 ºC) y la resistencia a varios
antibióticos (Buts, 2005).
A pesar de todas las ventajas que ofrece el uso de levaduras como probióticos, los
microorganismos más estudiados y utilizados para tal fin pertenecen a los géneros
Lactobacillus s.p, Bifidobacterium y en menor proporción levaduras debido a que estas no
hacen parte de la flora intestinal de animales monogástricos (Otero, 1997). Aunque se han
realizado estudios preliminares de capacidad probiótica especialmente de Saccharomyces
boulardii como los mencionados anteriormente, aún existen interrogantes sobre los
mecanismos de tolerancia de este microorganismo a condiciones características del tracto
gastrointestinal, que le permitirán sobrevivir para llegar a las células blanco y afectar
benéficamente al huésped.
Debido a lo anterior, en este proyecto se pretende evaluar la capacidad probiótica in vitro de
una cepa nativa de Saccharomyces cerevisiae como futuro suplemento probiotico en la dieta
de polluelos u otras especies de uso zootécnico, con el fin de comprobar que este
microorganismo cumple con los requerimientos necesarios para su administracion por via
oral para animales monogástricos.
42
3.2. Justificación
En Colombia, se han producido grandes cambios tecnológicos en la industria avícola, los
cuales se han ido materializando en aves genéticamente más resistentes. Nuevas formas de
manejo y de cría han llevado a obtener aves precoces desarrolladas en incubadoras con
ambientes controlados y limpios. Estas aves, son criadas en ambientes más tecnificados,
eficientes y aislados que permiten mayor concentración de aves por metro cuadrado. En
consecuencia, se están criando aves cada vez más susceptibles a estrés que presentan un
establecimiento tardío en la flora intestinal normal, generando como resultado una defensa
natural disminuida contra las enfermedades bacterianas de origen intestinal (Barrow, 1992).
A pesar de que en países desarrollados existen varias formulaciones con microorganismos
probióticos para mejorar e incrementar la tasa de supervivencia en pollos u otros animales
monogástricos, en Colombia aún no existe un biopreparado a partir de cepas de levaduras
nativas útil en la alimentación animal. En trabajos previos se ha demostrado in vitro la
capacidad probiótica de levaduras nativas como una alternativa biotecnológica válida ya que
haría la producción a gran escala menos dependiente de productos importados que generan
mayor inversión (Aguirre, 2003).
En el presente estudio se ha planteado la utilización de una cepa nativa, evaluando la
capacidad probiótica in vitro de Saccharomyces cerevisiae, mediante pruebas de tolerancia a
sales biliares, tolerancia a rangos de pH, resistencia a jugos gástricos, reducción del
colesterol en presencia de sales biliares y ensayos de adhesión celular a células Caco-2;
comparada con una cepa de Saccharomyces cerevisiae var. boulardii utilizada actualmente
como un probiotico comercial, con el fin de cumplir con la etapa preliminar de formulación de
un producto probiotico destinado a ser un suplemento para dietas del sector avícola
43
4. OBJETIVOS
• 4.1 Objetivo General
Evaluar la capacidad probiótica in vitro de una cepa nativa de Saccharomyces cerevisiae.
• 4.2 Objetivos Específicos
• Determinar la capacidad probiótica de la cepa estudio (cepa A) y de la cepa control (cepa
B) por medio de pruebas de tolerancia a sales biliares en concentraciones de 0.5% a 3.0%
(p/v).
• Comprobar la capacidad probiótica de la cepa estudio (cepa A) y de la cepa control (cepa
B) por medio de pruebas de tolerancia a rangos de pH de 2.0 a 5.0 y resistencia a jugos
gástricos.
• Determinar la capacidad in vitro de reducción de colesterol en presencia de sales biliares
de la cepa estudio en comparación con la cepa control.
• Evaluar la adhesión de las levaduras (Cepa A y B) a las células Caco-2.
44
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Métodos
5.1.1. Obtención y conservación de Cepa A y Cepa B
La Cepa A (Saccharomyces cerevisiae) fue previamente aislada a partir de cultivos de vid y
la Cepa B (Saccharomyces cerevisiae var. boulardii) fue obtenida a partir de un probiótico
comercial. Ambas cepas fueron conservadas en un banco de células en medio YPG
adicionado de glicerol 30% (v/v) y mantenidas a -70 ºC. Para cada banco se realizó un
control de calidad cada dos meses, por medio de la técnica de recuento en placa.
5.1.2. Determinación de capacidad probiótica in vitro
Cada una de las pruebas de capacidad probiótica se realizó por triplicado, tanto para la cepa
en estudio como para la cepa control.
5.1.2.1. Tolerancia a Sales Biliares
• Producción del inóculo
En erlenmeyer relación 1/5 se realizó el inóculo de la cepa A y cepa B, incubándose en
condiciones de operación de 30ºC, 150 rpm durante 12 horas como mínimo hasta obtener un
valor de absorbancia620nm de 0,80. Finalizado el tiempo se verificó la pureza mediante
coloración de Gram (Aguirre, 2003).
El caldo YPG fue suplementado con Bile Oxgall (Difco®) hasta obtener una concentración
final de 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25% y 0.3% respectivamente. Posteriormente, el
mdeio fue esterilizado a 121 ºC durante 20 min (Spencer, 2001).
1.0 mL de la suspensión de las levaduras previamente obtenidas fue inoculado en 9 mL de
caldo YPG suplementado con sales biliares. Posteriormente, fueron incubados a 30 ºC
durante 24 h.
Finalizado el tiempo de incubación, se realizaron recuentos en placa de la siguiente manera:
de cada concentración de caldo YPG adicionado de sales biliares se realizaron diluciones
45
seriadas en solución salina al 0.85% (p/v). Las diluciones fueron sembradas por el método
de microgota tomando 20 ųl de cada muestra y depositándolos en agar YPG, desde una
altura no mayor de 2 cm, dividiendo la caja en cuatro cuadrantes y sembrando en cada uno
dos réplicas de las diluciones realizadas. Después de la incubación se escogieron las placas
que tenían colonias aisladas en un rango entre 10 – 20 colonias, el número de colonias
obtenido fue multiplicado por el factor de corrección (50) para completar el recuento al
mililitro y finalmente, por el factor de dilución empleado. El recuento se reportó en UFC/ mL
(Collins, 1989).
5.1.2.2. Tolerancia a pH
• Producción del inóculo
En este procedimiento se utilizó un inóculo preparado de la misma manera, que el descrito
en el numeral 5.1.2.1
Al caldo YPG de pH 5.0 se le adicionó HCl sin diluir para disminuir el pH a valores de 2.0,
2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 y 5.0. Posteriormente se esterilizó a 121 ºC durante 15 minutos.
1.0 mL de la suspensión de las levaduras previamente obtenidas fue inoculado en 9 mL de
caldo YPG con pH ajustado. Posteriormente, fueron incubados a 30 ºC durante 24 h.
Finalizado el periodo de incubación, se realizaron recuentos en placa de la siguiente manera:
de cada caldo YPG con pH ajustado, se realizaron diluciones seriadas en solución salina al
0.85% (p/v) y se sembraron por el método de microgota descrito anteriormente.
5.1.2.3. Determinación de resistencia a Jugos Gástricos
• Producción del inóculo
En este procedimiento se utilizó un inóculo preparado de la misma manera, que el descrito
en el numeral 5.1.2.1
Para la elaboración del jugo gástrico se tomó NaCl (0.2g) y pepsina (0.32g), ajustando a pH
final de 2-2.3 ± 0.2 con HCl sin diluir, se completó a 100 mL con agua destilada estéril. Como
control, se ajustó jugo gástrico artificial a un pH de 6.5-7.0 ±0.2 con NaOH 5N.
46
Posteriormente, se esterilizó por filtración con filtros de membrana de 0.22µm (Spencer,
2001
Se inoculó 1 mL de la suspensión con levaduras previamente preparado, en 9 mL del jugo
gástrico artificial pH 2 - 2.3 y pH 6.5 - 7.0 (control). Se
incubaron
a 30 ºC, tomando
muestras a las hora 0, 1, 2, 3, 4 y después de las 24 horas para observar la viabilidad celular
(Spencer, 2001).
De cada una de las muestras tomadas en cada hora se realizaron diluciones y recuentos en
placa por el método de microgota descrito anteriormente.
5.1.2.4. Reducción del colesterol en presencia de sales biliares
• Elaboración curva patrón
La curva patrón se realizó por duplicado. Se tomaron valores conocidos de colesterol, (60,
70, 80, 90, 100, 110, 120 y 130 μg/mL), y se siguió el protocolo de extracción descrito a
continuación para las muestras. Con los datos obtenidos se graficaron los valores de
Absorbancia (550 nm) obtenidos contra las concentraciones conocidas y se halló la ecuación
de la recta para determinar de los valores de absorbancia obtenidos posteriormente la
concentración de colesterol en el medio para la cepa A y B.
• Producción del inóculo
En este procedimiento se utilizó un inóculo, preparado de la misma manera que el descrito
en el numeral 5.1.2.1
Medio para la determinación de reducción de colesterol
Medio para la reducción de colesterol (Caldo YPGCHO): Se adicionaron 0.3 g de Bile Oxgall
(Difco ®) a 100 mL de caldo YPG y se esterilizó a 121 ºC durante 20 minutos(Spencer,
2001). Posteriormente se adicionaron 224μg/mL de Lipids Colesterol Rich (Sigma ®) ). La
solución se mantuvo almacenada a 4 ºC (Psomas et al, 2003)
47
• Determinación de la reducción de colesterol
Se inocularon 20 mL del medio anterior con 0.2 mL (1% (v/v)) de un cultivo de levaduras
tras 12 horas de incubación, la mezcla se llevó a incubar a 30ºC durante 12 horas. Como
control se uso caldo YPGCHO sin inocular. Posteriormente se realizó una centrifugación a
8000g por 15 min. El sobrenadante (muestra) fue colocado en tubo al cual se le adicionaron
3 mL de etanol al 95% (v/v), seguido por 2 mL de hidróxido de potasio al 50% (v/v), agitando
en vórtex después de la adición de cada componente. Posteriormente se calentó el tubo en
baño maría a 60ºC durante 10 minutos, luego se enfrió hasta los 20ºC, a continuación se
adicionaron 5 mL de hexano agitando en vórtex durante 20 segundos. Finalmente,se
adicionaron 3 mL de agua destilada y se repitió el mezclado con vórtex.
La muestra fue durante 15 minutos o más mantenida a temperatura ambiente hasta que se
evidenció la fase de separación. De la fase acuosa (capa de hexano) se transfirieron 2.5 mL
a un tubo limpio y se evaporó en un horno a 60ºC. El residuo formado se resuspendió en 4
mL de reactivo 0-phthalaldehido, esta muestra se mantuvo a temperatura ambiente por 10
minutos, luego de los cuales se le adicionaron 2 mL de ácido sulfúrico concentrado agitando
vigorosamente. Luego de 10 minutos de reposo se procedió a medir la absorbancia a 550
nm contra el reactivo blanco expresando los resultados en μg de colesterol/mL.
Con estos resultados se determinó la cantidad de colesterol residual y los porcentajes de
asimilación para cada cepa de acuerdo a la fórmula:
Figura Nº 8. Fórmula porcentaje de asimilación de colesterol en muestras de medio
YPGCHO. Fuente (Autores, 2007)
Donde:
%AC = Porcentaje de asimilación de colesterol
Ci = Concentración inicial de colesterol del medio YPGCHO
Cf = Concentración final de colesterol en la muestra/12 horas de incubación
48
• Sonicación
Se inocularon 10 mL de medio YPGCHO con 0.1 mL (1% (v/v)) de un cultivo de levaduras
tras 12 horas de incubación, el control usado fue caldo YPG sin colesterol, la mezcla se llevó
a incubar a 30ºC durante 12 horas. Posteriormente, se tomaron 2 mL que fueron
centrifugados y resuspendidos en PBS. Las muestras fueron sometidas a sonicación en
tiempos de 0, 1, 2 y 3 minutos, se realizaron diluciones de 10-1 hasta 10-2, se realizó
coloración supravital con azul de lactofenol y recuento en Cámara de Newbauer (Psomas et
al, 2003) donde se expresó el resultado como Levaduras/mL, de acuerdo a la siguiente
fórmula:
Figura Nº 9. Fórmula Recuento (Levaduras/mL) en cámara de Newbauer.
Fuente (Madigan et al, 1998)
5.1.2.5. Prueba de adherencia
La línea celular Caco-2 se incubo 37ºC a una atmósfera de 5% CO2 - 95% aire, utilizando un
medio mínimo esencial hasta observar la monocapa. Posteriormente, las células fueron
lavadas tres veces con PBS. La cepa de la levadura se incubó en medio YPG a 30 oC
durante 12 horas a 150 rpm; las levaduras se centrifugaron y se lavaron dos veces con
medio basal, 0.8 mL de estos fueron inoculados a las células Caco-2. A continuación este
montaje se dejo a 37oC por 90 minutos a una atmósfera de 5% CO2 - 95% aire, para ser
posteriormente lavada con PBS cuatro veces y realizando posteriormente una coloración con
1 mL de colorante de Wrigth (Anexo 10) mas metanol por 5 minutos, y lavando nuevamente
con agua destilada hasta retirar el exceso de colorante. Las células fueron observadas en el
microscopio invertido contando el número de levaduras adheridas a las células Caco-2 en 20
campos microscópicos aleatorios. La capacidad de adhesión se expresó como el número de
levaduras adheridas a 100 células Caco- 2 (Kumura et al, 2004).
49
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1. Control de calidad bancos cepa A (estudio) y cepa B (control).
De los inóculos y de las colonias crecidas en YPG, que presentaron la morfología
macroscópica de levaduras, es decir, colonias grandes de aproximadamente 1 a 2 mm de
diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos, brillantes (Anexo 1.1), se realizó coloración
de Gram donde se observaron las levaduras en gemación, como se evidencia en la Figura
Nº 10 y se reporta en el Anexo 1.1.
Figura Nº 10. Aspecto microscópico de la cepa A (estudio)
En la Figura Nº 11, se grafican los resultados de los recuentos obtenidos para los controles
de calidad de los bancos de la Cepa A y B en función del tiempo.
10,00
Log (UFC/mL)
9,00
8,00
Cepa A
7,00
Cepa B
6,00
5,00
4,00
0
1
2
3
4
5
6
Controles
Figura Nº 11. Curva de viabilidad (UFC/mL) en función del tiempo para cepa A
(estudio) y cepa B (control).
50
Al observar los resultados presentados en la Figura anterior y el Anexo 2.2, se aprecia que la
viabilidad del banco de la cepa A decayó drásticamente a partir del tercer mes de haberse
realizado. En la cepa B también se observó disminución en los recuentos, sin embargo se
mantuvo en el mismo ciclo logarítmico (108 UFC/mL).
La disminución en la viabilidad pudo deberse a varios factores, por ejemplo al realizarse el
congelamiento a una velocidad mas alta que la óptima se incrementa el daño celular al
producirse la formación de cristales de hielo intracelularmente; también se puede presentar
injuria cuando en el proceso de congelación se da la precipitación de las proteínas solubles
de la membrana plasmática o cuando se presenta una denaturación en su estructura
terciaria, debilitando las uniones hidrofóbicas, la cual puede llegar a ser irreversible si existe
la formación de hielo extracelular que genera la deshidratación celular (Marín, 2003).
Otra posible razón por la cual pudo haberse presentado la disminución de la viabilidad, es el
cambio que se presentó en la temperatura de congelamiento en la que se mantuvo este
banco, ya que inicialmente se encontraba a -70oC y posteriormente los viales fueron
transferidos a un congelador a -20oC, temperatura no aconsejable, ya que debido a la gran
concentración de solutos que existen en la suspensión celular, el punto de congelación baja,
por lo que se requiere de una menor temperatura para llegar al punto de congelación lo que
puede aumentar la posibilidad de la pérdida en los niveles de viabilidad (Marín, 2003).
Otra de las posibles causas de este efecto en las células, es el descongelamiento de manera
lenta lo que pudo llegar a ocasionar daños a nivel celular (Marín, 2003), lo que coincide con
el estudio realizado por Dumont et al, 2003 donde al someter a la levadura S. cerevisiae a
cuatro rangos de congelación a diferentes tiempos se evidenció que la congelación lenta
provocaba una alta mortalidad en la cepa de estudio al comprobar su recuperación, mientras
que a tiempos de congelación rápida se preservaba la viabilidad celular. Sin embargo se
recomienda una velocidad de congelación intermedia la cual beneficia la viabilidad de las
levaduras, ya que contribuye a que la salida de agua de la célula ocurra de manera lenta
previniendo la congelación al interior de la levadura ocasionando la formación de cristales de
hielo al interior de la misma (Dumont et al, 2004).
En lo referente a la pureza del banco, para cada cepa se realizaron coloraciones de Gram
después del tiempo de incubación, en donde se evidenció la morfología microscópica
característica de este microorganismo. Al realizar la coloración de las colonias típicas
crecidas en agar YPG, se obtuvieron los mismos resultados. Fue posible evidenciar que la
51
obtención del microorganismo conservado es buena, ya que inoculado el vial a un medio que
le brinda condiciones favorables de crecimiento a la levadura, como el caldo YPG y la
posterior siembra en caja, se evidenció el crecimiento de este microorganismo, es decir, que
sigue conservando su funciones metabólicas sin sufrir alteración.
Se puede atribuir la conservación de las levaduras, a que en bajas temperaturas, S.
cerevisiae, aumenta la expresión del gen OLE1 que codifica una desaturasa (Ole1p), que
convierte los ácidos grasos palmítico y esteárico en los correspondientes ácidos grasos
monoinsaturados (ácido palmitoleico y ácido oleico), lo que aumenta la instauración de la
membrana, alterando la fluidez de la membrana en respuesta a diferentes tipos de estrés,
incluido la disminución de temperatura (Sturkie et al, 1989).
El crioprotectante usado en la preservación del banco (glicerol al 30% (v/v)), también
preserva las células. El glicerol ha demostrado ser una de las mejores sustancias por cuanto
sus características moleculares le permiten simular una vitrificación alrededor del
microorganismo, lo cual impide que la formación de cristales de hielo lesione las membranas
citoplasmáticas (Dumont et al, 2004, Sánchez et al, 2005).
Adicionalmente, al no ser un preservante iónico evita la excesiva formación de hielo,
reduciendo el riesgo de daño celular. Se puede concluir que, bajo condiciones controladas
de congelamiento el glicerol es un buen preservante ya que la disminución en la viabilidad se
presentó por problemas en la temperatura de almacenamiento y adicional a lo anterior, se
puede inferir que la concentración usada 30% (v/v), es óptima ya que al almacenar los viales
a temperatura de -70ºC se observan resultados que demuestran que la viabilidad se
mantiene, por encima de los valores que se consideran ideales (mínimo 106 UFC/mL), lo que
se corrobora con el trabajo realizado por Monroy et al (2004), donde se evaluó durante 6
meses la estabilidad a tiempo real de cuatro cepas criopreservadas en 10% (v/v) de glicerol
entre las que se encontraba una cepa de la levadura en estudio S. cerevisiae y en donde se
observó que la levadura mantuvo una viabilidad del 95%.
6.2. Tolerancia a sales biliares
• Recuento inicial de inóculo: El inóculo inicial se mantuvo en 106 UFC/mL durante 12 horas
a 30 ºC, 150 rpm para cada cepa. Se realizó coloración de Gram para verificar pureza como
se observa en la Tabla 1, en donde se evidenció la morfología característica de esta
levadura sin contaminación.
52
Tabla Nº 1. Coloración de Gram y valores de Absorbancia620 nm de inóculos de
cepa A (estudio) y cepa B (control)
Absorbancia
Cepa
Microscopía observada a partir de la coloración de Gram
del inóculo
620nm
A
Levaduras sin contaminación microbiana
0.881
B
Levaduras sin contaminación microbiana
0.892
Después del período de incubación, en el agar YPG, se evidenciaron colonias grandes de
aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos y brillantes.
Los recuentos obtenidos se observan en la Tabla 2.
Tabla Nº 2. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A (estudio) y cepa
B (control)
CEPA
UFC/mL
A
1.70 E+07
B
2.20 E+07
• Recuentos de Prueba de Tolerancia en Sales Biliares: Los resultados obtenidos se
observan en la Figura 12 y en el Anexo Nº 3, en donde se reportan los recuentos (UFC/mL)
obtenidos para la cepa estudio (A) y la cepa control (B).
7,50
Log (UFC/mL)
7,00
6,50
Cepa A
6,00
Cepa B
5,50
5,00
4,50
0,05%
0,10%
0,15%
0,20%
0,25%
0,30%
Concentracion de sales biliares
Figura Nº 12. Recuentos (UFC/mL) en sales biliares para cepa A (estudio) y cepa B
(control)
53
Después del período de incubación (24 horas), en las condiciones previamente establecidas,
los resultados para las dos cepas, muestran que el género Saccharomyces es capaz de
crecer en diferentes rangos de concentraciones de sales biliares similares presentes en el
sistema digestivo sin que se altere o afecte su metabolismo. No existió diferencia para
concentraciones de 0.05% a 0.3 % (p/v) en los recuentos obtenidos.
Para la cepa A, se evidenció que el crecimiento fue constante y estable, manteniéndose en
106 UFC/mL, resultados similares a los presentados para la cepa B (control), ya que no se
observó
una
diferencia
estadísticamente
significativa
(p
>
0.05).
Para
ambos
microorganismos se evidencia una disminución del crecimiento para la concentración de
0.3% (p/v) de sales biliares, sin embargo se encuentra en el mismo ciclo logarítmico, de lo
que se puede deducir que la reducción en la viabilidad, incluso en la mayor concentración no
es drástica debido a que, aunque la levadura está activando los mecanismos de resistencia
a estos compuestos, como acumulación de polioles y glicerol, el valor es muy alto y tiende a
retardar el metabolismo de la cepa, al disminuir la tasa de producción de metabolitos para su
funcionamiento (Rose, 1987).
Fietto et al (2004) reportó que se presentó una mejor tolerancia por parte de S. cerevisiae a
las sales biliares, soportando un máximo de 0.15% (p/v) comparado con S. cerevisiae var.
boulardii, que mostró ser muy sensible incluso a bajas concentraciones, por lo que deduce
que ninguna de las cepas en estudio tienen tolerancia a estos compuestos, ya que según
Gilliland et al (2004), la concentración que debe resistir un microorganismo probiótico es de
0.3% (p/v) y la mayoría de las especies de levadura crecen incluso en presencia de 0.75%
de sales biliares. Sin embargo, para el presente estudio se encontró que hasta en la mayor
concentración se presentó crecimiento de las levaduras en 24 horas de incubación, por lo
que la cepa A (estudio), cumple con los requerimientos de un microorganismo probiótico.
Según Kumura et al (2004), al exponer diversas levaduras a presencia de bilis, estos
microorganismos fueron capaces de crecer, siempre y cuando se incubaran a 27ºC, sin
embargo las cepas
de Saccharomyces sp que fueron estudiadas podían crecer en
presencia de sales biliares a 37ºC, temperatura en la que otras levaduras ya se inhibían.
Esta es una de las ventajas que se observa de la levadura frente a otros microorganismos
probióticos como es la capacidad de crecer a 37 ºC, temperatura relativamente alta para
este género, sin que se vea afectado su metabolismo.
54
Según el estudio de Kühle et al (2005), las cepas de S. cerevisiae y S. cerevisiae var.
boulardii mostraron resistencia a concentraciones de 0.3 % (p/v), demostrando la
sobrevivencia al ser expuestas a concentraciones de sales biliares. En el estudio se observó
que el 65% de las cepas de S. cerevisiae y todas las cepas de S. cerevisiae var. boulardii
crecían incluso después de las 4 horas de incubación, lo que se pudo verificar en este
proyecto ya que el tiempo de incubación fue de 24 horas, obteniéndose recuentos que
mostraron que no disminuyó drásticamente la viabilidad de las cepas.
El inóculo del que se partió, para ambas cepas se encontraba en 107 UFC/mL, y se
evidenció la disminución en una unidad logarítmica después del tiempo de incubación. Los
microorganismos probióticos que hacen parte de un biopreparado comercial deben
encontrarse en 106 – 108 UFC/mL, al llegar a las células blanco, para asegurar que puedan
actuar sobre el huésped (Cavazzoni, 1998), lo que sugiere que es necesario para una
evaluación in vivo, partir de un inóculo con una concentración mayor de biomasa, para
asegurar que las levaduras al ser enfrentadas a sales biliares, que tienen actividad
antimicrobiana, disminuyan en un porcentaje la viabilidad celular, pero se conserven la
concentración microbiana necesaria que puedan afectar benéficamente al huésped
(Salminen et al, 1999).
Los ácidos grasos insaturados juegan un rol esencial en las características de la membrana
celular y determinan la función de las proteínas unidas a membrana, que es esencial en la
resistencia a las sales biliares (Begley, 2006). Se ha encontrado la presencia de vesículas
similares a las encontradas en mamíferos en las levaduras, que pueden internalizar las sales
para su posterior degradación (St. Pierre et al, 1994). Una de las reacciones ya
caracterizadas en microorganismos como Lactobacillus sp, Listeria sp y Bifidobacterium, es
la presencia de enzimas hidrolasas, que actúan sobre el enlace amida liberando glicina y
taurina de la base esteroide; este proceso es conocido como deconjugación, dando lugar a
los ácidos biliares deconjugados (Begley, 2006).
La actividad de transporte dependiente de ATP es esencial para la translocación de muchos
componentes de la bilis. Existe un tipo de proteínas unidas a ATP (proteínas ABC), que
hacen parte de una familia de proteínas integrales de membrana, responsables de la
translocación a través de la misma, de una enorme variedad de substratos que se
encuentran presentes desde las bacterias hasta el hombre. La expresión de las proteínas
ABC, denominadas MDR1, MDR2 y MRP1, han sido estudiadas en S. cerevisiae, ya que se
encuentran implicadas en el transporte de ácidos biliares y sus conjugados. La translocación
55
de glutionato (ácido deconjugado) es mediado por una proteína dependiente de ATP
denominada Ycf1p, que se encuentra en una vacuola de la levadura; este organelo es un
compartimiento acídico, rico en enzimas catabólicas que juega un rol importante en la
acumulación y homeostasis de calcio, fosfato y aminoácidos (Ortiz, 1997), lo que genera una
acumulación intravesicular de ácidos biliares (St. Pierre et al, 1994).
Estas proteínas ABC, pueden transportar eficientemente ácidos biliares conjugados que
deconjugados (Ortiz, 1997). Otros de los mecanismos por el cual la levadura es resistente a
altas concentraciones de sales biliares, se centra en la acumulación de polioles y glicerol
para regular la presión osmótica de la célula con el medio externo. El glicerol acumulado es
expulsado al medio, una vez las sales han sido excluidas del citoplasma (Rose, 1978).
Se puede deducir, que la cepa nativa de S. cerevisiae es un microorganismo que es capaz
de tolerar concentraciones de sales biliares desde 0.05% (p/v) hasta 0.3% (p/v), pudiendo
desarrollar actividades metabólicas, sin verse inhibida o alterada, característica necesaria
para la formulación de un biopreparado probiótico dirigido a animales monogástricos,
especialmente pollos.
6.3. Tolerancia a rangos de pH
Recuento inicial de inóculo: El inóculo inicial se mantuvo en 106 UFC/mL en las condiciones
establecidas inicialmente para cada cepa. Se realizó coloración de Gram para verificar
pureza como se observa en la Tabla 3, en donde se evidenció la morfología característica de
esta levadura sin ningún tipo de contaminación.
Tabla Nº 3. Coloración de Gram y valores de Absorbancia620 nm de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
Absorbancia
Cepa
Microscopía observada a partir de la coloración de Gram
del inóculo
620nm
A
Levaduras sin contaminación microbiana
0.821
B
Levaduras sin contaminación microbiana
0.854
56
Después del período de incubación, en el agar YPG, se evidenciaron colonias grandes de
aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos y brillantes.
Los recuentos obtenidos se observan en la Tabla 4.
Tabla Nº 4. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A (estudio) y cepa
B (control)
UFC/mL
CEPA
A
1.40 E +07
B
6.30 E +07
• Recuentos de prueba de tolerancia a pH: de cada una de las cepas se realizaron
recuentos después de 24 horas de incubación en los diferentes valores de pH (2.0, 2.5, 3.0,
3.5, 4.0, 4.5 y 5.0).
8,00
Log (UFC/mL)
7,00
6,00
5,00
Cepa A
4,00
Cepa B
3,00
2,00
1,00
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
pH
Figura Nº 13. Recuentos (UFC/mL) en valores de pH de 2.0 – 5.0 para cepa
A (estudio) y cepa B (control).
De acuerdo a los resultados presentados en la Figura 13 y en el Anexo Nº 4, se puede
evidenciar que las dos cepas, presentaron estabilidad en cuanto a los recuentos realizados a
diferentes pH. Asimismo, no se observó una diferencia estadísticamente significativa (p >
57
0.05) entre ambas cepas. A diferencia de la cepa B, la cepa A mantuvo valores de
crecimiento en la escala logarítmica de 106 UFC/mL en todos los pH evaluados. La cepa
control, desde el pH 2 hasta el pH 4 reportó valores más bajos (105 UFC/mL), y sólo cuando
subió el valor de pH a 4.5 pudo aumentar el crecimiento, incluso en 107 UFC/mL a pH de 5.0
debido a que en rangos de pH ácidos, no activa los mecanismos de tolerancia, lo que influye
en su metabolismo generando pérdida de viabilidad, y sólo cuando el pH se acerca al
óptimo, puede aumentar su crecimiento.
La tolerancia a diferentes pH pudo deberse a los antiportadores de Na+/H+ que poseen la
levaduras; estos son proteínas encontradas en la membrana citoplasmática así como en las
membranas de los organelos de las células. Estas proteínas catalizan el intercambio de
cationes monovalentes (Na+ o K+) y H+ a través de las membranas, de tal modo que regulan
las concentraciones de cationes y pH a nivel citoplasmático y de organelos (Mitsui et al,
2005).
En S. cerevisiae, se han identificado dos tipos de antiportadores de Na+/H+. Uno de los
antiportadores es Nha1p, encontrado en la membrana plasmática y el otro es Nhx1p, que se
localiza en el compartimiento endosomal prevacuolar (Ohgaki et al, 2005). El antiportador de
Na+/H+ Nha1p ubicado en la membrana plasmática es codificado por el gen NHA1. Este
antiportador participa en la regulación de las concentraciones intracelulares de Na+ o de K+
usando el gradiente electroquímico de H+ a través de la membrana plasmática; esto elimina
exceso de los cationes en el citosol (Sychrova et al, 1999, Brett et al, 2005, Mitsui et al,
2005).
Otro de los posibles mecanismos de la levadura para regular el pH y la concentración de
iones es una ATPasa, codificada por el gen PMA1 y localizada igual que el antiportador
Nha1p en la membrana citoplasmática, esta puede crear un gradiente electroquímico de
protones que conduce al transporte secundario de solutos, que esta implicado en el
mantenimiento del pH cercano a la neutralidad y que además de ser un componente crítico
para la adaptación de la levadura a ácidos, es útil para muchas funciones fisiológicas en la
levadura como la toma de nutrientes y la regulación intracelular de la concentración de
diferentes cationes y aniones (Viegas et al, 1998, Sychrova et al, 1999, Thomas et al, 2002).
Ejemplo de lo anterior, es cuando en condiciones de fermentación el pH externo es de 3.0,
S. cerevisiae puede mantener el pH 5.5 y 5.75; igualmente, cuando el pH externo varía entre
6.0 y 10.0, la levadura mantiene el pH entre 5.9 y 6.75 ± 0.2 (Thomas et al, 2002). Para
mantener los valores adecuados dentro de un rango óptimo de pH, las células expulsan
58
protones a expensas de ATP, lo que genera la disminución del rendimiento de consumo con
respecto a la glucosa que genera un aumento en el pH intracelular, permitiéndole a la
levadura resistir rangos amplios (2.4 a 8.6) de pH ácidos (Rose, 1987).
En el estudio realizado por Narendranath et al, 2001, se encontró que S. cerevisiae era más
resistente a la adición de ciertos ácidos al medio de cultivo, debido posiblemente a que los
componentes presentes en el medio de cultivo utilizado (YPG) como extracto de levadura,
peptona y glucosa pueden conferirle cierta protección a la levadura bajo condiciones de
estrés, lo que pudo también haber contribuido para que los recuentos realizados a los
diferentes pH en el presente estudio se mantuvieran estables, a pesar de las condiciones de
acidez en el medio.
Aunque ambas levaduras toleraron los pH ácidos y presentaron mecanismos que les
permiten regular el pH interno, la cepa en estudio demostró una mayor resistencia a esta
condición, que la cepa control, resultados que se pueden observar y comparar en el estudio
llevado a cabo por Kuhlé et al (2005), en el que el crecimiento a pH de 2.5 fue observado en
el 44% de las cepas de S. cerevisiae aisladas a partir de alimentos, a diferencia de S.
cerevisiae var. boulardii que no pudo replicarse muy bien en estas condiciones. Sin
embargo, todas las levaduras demostraron que podían sobrevivir incluso después de 4 horas
de incubación en un pH de 2.5.
Los resultados obtenidos para este proyecto, muestran que la cepa en estudio y control
pueden tolerar, incluso pH de 2.0, por períodos de incubación de 24 horas, sin que la pérdida
de viabilidad sea drástica. Los resultados obtenidos son adecuados, ya que por referencia
bibliográfica, un microorganismo probiótico debe encontrarse en 108 UFC/mL al ser
suministrado y al llegar a los enterocitos, debe encontrarse viable, con una pérdida máxima
de viabilidad en dos unidades logarítmicas (Cavazzoni, 1998).
6.4. Resistencia a jugos gástricos
• Recuento inicial de inóculo: El inóculo inicial
se mantuvo en 106 UFC/mL
en las
condiciones establecidas inicialmente para cada cepa. Se realizó coloración de Gram para
verificar pureza como se observa en la Tabla 5, en donde se evidenció la morfología
característica de esta levadura sin contaminación.
59
Tabla Nº 5. Coloración de Gram y valores de absorbancia620 nm de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
Absorbancia
Cepa
Microscopía observada a partir de la coloración de Gram
del inóculo
620nm
A
Levaduras sin contaminación microbiana
0.866
B
Levaduras sin contaminación microbiana
0.874
Después del período de incubación, en el agar YPG, se evidenciaron colonias grandes de
aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos y brillantes.
Los recuentos obtenidos se observan en la Tabla 6.
Tabla Nº 6. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de Cepa A (estudio) y Cepa
B (control)
CEPA
UFC/mL
A
2,20E+07
B
1,50E+07
• Recuentos de prueba de tolerancia a jugos gástricos: de cada una de las cepas se
realizaron recuentos durante 24 horas, tomando muestras a la hora 0, 1, 2, 4 y 24; del jugo
gástrico de pH 2.0 – 2.3 y del control (jugo gástrico pH 7.0 -7.2)
6,50
Log (UFC/mL)
6,00
5,50
Cepa A
Cepa B
5,00
4,50
4,00
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo de muestreo (h)
Figura Nº 14. Recuentos (UFC/mL) en Jugos Gástricos de pH 2.0 – 2.3 para Cepa
A (estudio) y Cepa B (control)
60
Para el caso de estudio, la cepa control (B) y la cepa estudio (A) presentaron una buena
viabilidad (105 UFC/mL) durante el tiempo de muestreo (hora 0 hasta hora 24) para el jugo
gástrico artificial de pH 2.0-2.3, resultados que se observan en la Figura 14 y Anexo Nº 5.
Los recuentos obtenidos en las 4 primeras horas de muestreo, permanecieron similares para
ambas cepas (siendo ligeramente mayor para la cepa B), ya que no se observó una
diferencia estadísticamente significativa entre ambas cepas (p >0.05) sin embargo, la cepa
en estudio tuvo recuentos superiores a partir de la cuarta hora de mantenimiento en
condiciones simuladas para jugos gástricos y para la hora 24 este valor siguió aumentando
como se observa en la Figura 12, resultados que al ser comparados con el estudio realizado
por Fietto et al (2004) en el que al exponer las levaduras (S. cerevisiae y S. cerevisiae var
boulardii) a jugos gástricos por un tiempo de 60 minutos, no se observaron diferencias en la
viabilidad de las cepas, sin embargo, después de 15 minutos, S. cerevisiae var boulardii
presentó mayor resistencia, incluso manteniendo la viabilidad en un 75%, mientras que S.
cerevisiae presentó una disminución cercana al 30% después de 60 minutos; demuestran
que la cepa en estudio presenta una muy buena resistencia a jugos gástricos, porque incluso
a las 24 horas de incubación, pudo mantener su metabolismo y la pérdida de viabilidad no
fue drástica (105 UFC/mL). Este autor notó que las levaduras (S.cerevisiae var. boulardii)
expresan proteínas específicas en respuesta a condiciones de estrés, incluida la resistencia
a jugos gástricos, lo que sugiere la relación con la adaptación celular y la sobrevivencia en
este ambiente (Fietto et al, 2004).
Estos resultados, tienen correlación con los datos observados en la Figura 10 para la prueba
de tolerancia a rangos de pH, ya que S. cerevisiae var. boulardii (control), presentó un menor
crecimiento hasta pH de 4.5, comparada con la cepa estudio, deduciendo que la levadura
nativa, presenta mejores mecanismos de resistencia a condiciones adversas como valores
ácidos de pH, a pesar de que la levadura administrada en una sola dosis, se aloja y
permanece en el tracto gastrointestinal, pero en concentraciones menores (5 x 107 células/g
heces) a las que se albergan en los microorganismos naturales de la flora intestinal
dominante, lo que demuestra la capacidad de esta levadura para adaptarse a las
condiciones fisicoquímicas del medio (Bunts, 2005).
La primera barrera que un microorganismo tiene que atravesar después de ser ingerido es
un pH extremadamente ácido, producto de la digestión gastrointestinal. El jugo gástrico que
es secretado diariamente posee un pH de aproximadamente 2.0 y la resistencia a un pH bajo
como se explicó anteriormente pudo deberse a la presencia de antiportadores que ayudan al
61
intercambio de cationes monovalentes a través de las membranas, regulando el pH a nivel
citoplasmático y de organelos, así como de una ATPasa la cual cumple con la misma
función (Thomas, 2002).
Adicionalmente, el jugo gástrico presenta una concentración de sales de aproximadamente
0,5% (p/v), que generan la activación de mecanismos de resistencia como los mencionados
en el numeral 6.2, debido a proteínas de membrana que internalizan estas sales y a
vacuolas que participan en su posterior degradación. Esta secreción presenta a su vez una
barrera enzimática compuesta principalmente por enzimas proteolíticas; todos estos factores
forman una barrera que puede llegar a ser letal para la mayoría de los microorganismos
(Martins et al, 2005). Debido a lo anterior, si un organismo sobrevive a estas condiciones
extremas se puede considerar que puede llegar a tener potencial para ser usado como
probiótico.
6,50
Log (UFC/mL)
6,00
5,50
Cepa A
Cepa B
5,00
4,50
4,00
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo de muestreo (h)
Figura Nº 15. Recuentos (UFC/mL) en Jugos Gástricos de pH 7.0 – 7.2 para Cepa
A (estudio) y Cepa B (control)
A diferencia de los resultados obtenidos anteriormente, para el jugo gástrico control de pH
7.0-7.2, se observó un mayor crecimiento de la cepa B, comparada con la A, como se
observa en la Figura 15 y en el Anexo Nº 4. Sin embargo, no se observó una diferencia
estadísticamente significativa (p > 0.05) entre ambas cepas. En las primeras horas los
recuentos se mantuvieron similares para cada cepa, sin embargo, desde la hora 4 la cepa
control incrementó su viabilidad, mientras que la de la cepa estudio se mantuvo estable, lo
que confirmó que la cepa control (S. cerevisiae var. boulardii), crece mejor en pH cercanos a
62
la neutralidad, ya que en condiciones ácidas se disminuye su viabilidad, comparado con la
cepa en estudio que tanto en el jugo gástrico de pH 2.0 – 2.3 como en el control de pH 7.0 –
7.2, mantuvo su viabilidad en valores similares, sin observarse diferencias en los recuentos
(UFC/mL) obtenidos, como se reporta en el Anexo Nº 5.
6.5. Reducción de colesterol en presencia de sales biliares.
•
Elaboración curva patrón de colesterol: Para la determinación de la curva patrón, se
midió la absorbancia550mn de cada solución con concentración de colesterol conocida (60 –
130 μg/mL), de acuerdo al principio en el cual las sustancias tienen propiedad para absorber
o emitir una longitud de onda (Chang, 1999). Esta determinación se realizó a 550 nm, que es
el valor máximo de absorción.
Ya que los datos se agruparon alrededor de la línea y para obtener la ecuación de la recta
de acuerdo a la ecuación de la línea recta: y=mx+b, se aplicó el método matemático
denominado regresión lineal, que correlaciona los datos. La gráfica relaciona los valores de
absorbancia (eje Y) y la concentración de colesterol (eje X) y se hace evidente la Ley de
Lambert - Beer, según la cual existe una relación directa entre ambas funciones, al ser
directamente proporcionales, ya que ningún valor excedió los límites de lectura (0.1 – 0.9
absorbancia).
A bsorbancia (550 nm )
0,5
0,4
0,3
y = 0,0045x - 0,1564
2
0,2
R = 0,9937
0,1
0
50
70
90
110
130
150
Concentración colesterol (μg/ml)
Figura Nº 16. Curva patrón de colesterol (60μg/mL – 130μg/mL)
63
Esta ley sólo es aplicable a soluciones diluidas de las especies absorbentes, que no
sobrepasen dicho límite, puesto que la presencia de muestras con concentraciones muy
altas, origina la desviación lineal entre la absorbancia y la concentración del analito (Skoog,
1988). De acuerdo a esto, la ecuación de la recta que se obtuvo al relacionar las dos
funciones de los ejes X y Y, fue y= 0.0045x + (- 0.1564) y R2 =0.9937, resultados observados
en la Figura 16 y en el Anexo Nº 6.2, en donde se observan los resultados obtenidos en las
réplicas y el promedio de los valores de absorbancia.
Lo anterior se confirma con el R2 obtenido de la regresión lineal, igual a 0.9937, que es el
valor de correlación de los datos y muestra que tan dispersos o no son los valores alrededor
de la línea. Este debe ser igual a 1 o cercano a este número, para que la ecuación obtenida
pueda ser usada, De acuerdo al valor obtenido para la curva patrón elaborada, se deduce
que si es posible su uso para la determinación de la reducción del colesterol en presencia de
las cepas.
6.5.1. Determinación de reducción Colesterol en presencia de sales biliares
• Recuento inicial de inóculo: El inóculo inicial
se mantuvo en 106 UFC/mL
en las
condiciones establecidas inicialmente para cada cepa. Se realizó coloración de Gram para
verificar pureza como se observa en la Tabla 7, en donde se evidenció la morfología
característica de esta levadura sin contaminación
Tabla Nº 7. Coloración de Gram y valores de absorbancia 620 nm de inóculos y de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
Cepa
Microscopía observada a partir de la coloración de Gram
Absorbancia
del inóculo
620nm
A
Levaduras sin contaminación microbiana
0.866
B
Levaduras sin contaminación microbiana
0.874
Después del período de incubación, en el agar YPG, se evidenciaron colonias grandes de
aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos y brillantes.
Los recuentos obtenidos se observan en la Tabla 8.
64
Tabla Nº 8. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A (estudio) y cepa
B (control)
•
CEPA
UFC/mL
A
5.00E +07
B
4.10E +07
Reducción del colesterol: Se determinó la concentración inicial de colesterol
experimental midiendo el valor de absorbancia550nm el cual fue de (0.839), este fue
reemplazado en la ecuación de la recta y se obtuvo un dato correspondiente a 221,2 μg/mL.
Posteriormente, se procesaron las muestras de la cepa A (estudio) y la cepa B (control),
encontrándose para la primera un valor promedio de absorbancia de 0.303 y de 0.265 para
la segunda y no se observó diferencia estadísticamente significativa (p > 0.05) entre ambas
cepas. Estos valores fueron despejados en la ecuación de la recta obtenida de la curva
patrón y se obtuvieron datos correspondientes al colesterol residual en la muestra, siendo de
102 μg/mL (cepa A) y de 93.64μg/mL (cepa B). Con estos valores se determinó el colesterol
degradado restando de la concentración inicial experimental (221.2 μg/mL).
Posteriormente, se procesaron las muestras de la cepa A (estudio) y la cepa B (control),
encontrándose para la primera un valor promedio de absorbancia de 0.303 y de 0.265
respectivamente, valores que se reportan en el Anexo Nº 6.3. Estos valores fueron
despejados en la ecuación de la recta obtenida de la curva patrón (y =0.0045x – 0.1564, R2=
0.9937) y se obtuvieron datos correspondientes al colesterol residual en la muestra, siendo
de 102 μg/mL (cepa A) y de 93.64μg/mL (cepa B). Con estos valores se determinó el
colesterol degradado, como se observa en la Tabla 9.
Tabla Nº 9. Valores de colesterol degradado en 12 horas de incubación por la cepa A
(estudio) y la cepa B (control)
Colesterol degradado / 12 horas de incubación
Cepa A
119.2μg/mL
Cepa B
127.56 μg/mL
65
•
Porcentajes de asimilación de colesterol: después de determinar la cantidad de
colesterol degradado, se determinó el porcentaje de asimilación de cada cepa, de acuerdo a
la fórmula del numeral 5.1.2.4.
Los resultados obtenidos se observan en la Tabla Nº 10.
Tabla Nº 10. Porcentajes de asimilación de colesterol/12 horas de incubación por la
Cepa A (estudio) y la Cepa B (control)
Cepa
Porcentaje de
asimilación/12 horas
A
54%
B
58%
De acuerdo a lo que se presenta en los resultados se puede observar que las dos cepas de
levaduras en evaluación fueron capaces de asimilar más del 50% del colesterol presente en
el medio en 12 horas de incubación. Esto se corrobora con estudios como el realizado por
Psomas et al (2003) en donde varias cepas de S. cerevisiae luego de 48 horas de
incubación a 37oC mostraron un porcentaje de asimilación del 100 %.
Los resultados obtenidos muestran que la cepa en estudio es capaz de reducir el colesterol,
característica que es deseable, ya que para humanos la hipercolesteremia o elevados
niveles de colesterol en la sangre, es considerada como el mayor riesgo del desarrollo de
enfermedades al corazón y en animales, la menor presencia de colesterol genera mejores
carnes, de elevada calidad y de mayor demanda, al encontrarse libres de grasas. La
administración de probióticos ha demostrado que puede reducir notablemente los niveles de
colesterol (De Smet et al, 1998, Du Tuit et al, 1998, Taranto et al, 1998).
Es importante la adición de las sales biliares al medio de cultivo adicionado de colesterol, ya
que cuando estuvieron ausentes, no fue posible realizar la extracción de las muestras para la
curva patrón. Lo anterior debido a que las sales biliares se encuentran presentes en el
organismo en actividades de emulsión, solubilización y absorción de lípidos en el intestino
(Begley, 2006).
Los métodos de determinación del colesterol incluyen el analizar las muestras por
cromatografía de gas, al ser un método confiable, rápido y eficaz (Fleutoris et al, 1998). Sin
embargo, cuando no se cuenta con esta opción existe un protocolo basado en la reacción de
Liebermann – Burchard, en la que posterior a la adición del hexano, se adiciona ácido glacial
66
acético el cual reacciona con el grupo C3 hidroxilo del colesterol en presencia de ácidos
fuertes (ácido sulfúrico concentrado) y forma el complejo azul-verdoso y en su defecto
rojo/café que se evidenció durante el montaje como se observa en la Figura Nº 17 (Skoog,
1998).
De lo anterior, se concluye que este protocolo de extracción es adecuado, ya que permitió
obtener valores de colesterol en relación a los valores de Absorbancia (550 nm), ya que al
realizar la curva patrón se obtuvo un R2 igual a 0.9937, lo que evidenció que los datos se
relacionaban entre sí, además los resultados obtenidos en la determinación de la reducción
del colesterol pudieron ser correlacionados con el reportados por Psomas et al (2003).
Figura Nº 17. Reacción de Liebermann – Burchard para determinación de
Colesterol. Fuente (Autores, 2007)
• Sonicación: Las levaduras en Medio YPGCHO y caldo YPG después de 12 horas de
incubación fueron sometidas a sonicación por períodos de 0, 1, 2 y 3 minutos, posterior al
periodo de incubación se realizaron recuentos en cámara de Newbauer. El objetivo de esta
prueba fue verificar si efectivamente las levaduras asimilaban el colesterol a su membrana
alterando su estructura y confiriéndole mayor resistencia a condiciones de estrés tal como la
lisis celular generada por este protocolo, por lo que al exponer el microorganismo a este
método de disrupción, se esperaba que las levaduras inoculadas en medio mas colesterol
cambiarán la morfología de la membrana presentando recuentos más altos en comparación
con aquellos que no fueron inoculados en medio suplementado.
67
Log Levaduras/mL
8
7
6
5
Cepa A con colesterol
4
Cepa A sin colesterol
3
2
1
0
0
1
2
3
Tiempo (minutos)
Figura Nº 18. Recuentos (Levaduras/mL) de Cepa A (estudio) expuesta a sonicación
En ambas cepas se observaron recuentos mayores (Levaduras/mL) cuando estas habían
sido inoculadas en medio YPGCHO en comparación con los recuentos de levaduras que
habían sido inoculadas en medio sin suplemento de colesterol. Para la cepa A, como se
observa en la Figura 18, se obtuvieron valores en la escala de 106 levaduras/mL para el
tiempo 0, lo que confirma que el microorganismo sigue viable tanto en el medio con
colesterol o sin ser suplementado, sin embargo al ser expuesta S. cerevisiae a la sonicación
por 1 y 2 minutos se observó que la viabilidad de la cepa disminuye en una unidad
logarítmica, ya que se reportan valores de 105 levaduras/mL, siendo levemente más altos los
valores de la cepa inoculada en Medio YPGCHO; para el tiempo 3 incluso disminuye
drásticamente la viabilidad hasta 102 levaduras/mL en el caldo inoculado sin suplemento de
colesterol a diferencia de la levadura en medio suplementado, que sigue conservando la
viabilidad en 105 levaduras/mL.
Resultados similares se observan en la Figura 19, para los recuentos de la cepa B,
presentándose disminución en la viabilidad tras la sonicación, siendo siempre más altos los
valores de S. cerevisiae var. boulardii (cepa B) inoculada en Medio YPGCHO, que en caldo
YPG sin adición de colesterol, para el último tiempo se observa igual la disminución hasta
102 levaduras/mL.
68
Log Levaduras/mL
8
7
6
5
Cepa B con colesterol
4
Cepa B sin colesterol
3
2
1
0
0
1
2
3
Tiempo (minutos)
Figura Nº 19. Recuentos (Levaduras/mL) de Cepa B (control) expuesta a sonicación
De acuerdo al estudio realizado por Psomas et al (2003) se sabe que posiblemente la
reducción del colesterol en un medio con levaduras, se deba a que estos microorganismos
asimilan el colesterol para incorporarlo a su estructura, reportándose que las levaduras
expuestas a medio de cultivo enriquecido con colesterol eran más difíciles de lisar tras ser
sometidas a sonicación que las levaduras que no crecían en el medio enriquecido con
colesterol, lo que sugiere un posible cambio morfológico en la pared (Kollár et al, 1997), ya
que el microorganismo al incorporar este esterol a su estructura se hace más resistente a la
lisis celular, comparado con los que no lo que no lo incorporan.
6.6. Ensayo de adhesión a células Caco – 2
•
Recuento inicial de inóculo: El inoculo se mantuvo en 106 UFC/mL en las condiciones
establecidas inicialmente. Se realizó coloración de Gram para verificar pureza como se
observa en la Tabla 11, en donde se evidenció la morfología característica de las levaduras
sin contaminación.
69
Tabla Nº 11. Coloración de Gram y valores de absorbancia 620 nm de inóculos y de cepa
A (estudio) y cepa B (control)
Cepa
Microscopía observada a partir de la Coloración
de Gram
Absorbancia del
inoculo
620nm
A
Levaduras sin contaminación microbiana
0.890
B
Levaduras sin contaminación microbiana
0.861
En el agar YPG se evidenciaron colonias grandes de aproximadamente 1 a 2 mm de
diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos y brillantes. Los recuentos obtenidos se
observan en la Tabla 12.
Tabla Nº 12. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A (estudio) y cepa
B (control)
CEPA
RECUENTO (UFC/mL)
A
9.80E +07
B
8.80E +07
• Obtención de la monocapa: fue posible obtener la monocapa de las células Caco – 2 al
ser cultivadas en Medio Mínimo esencial de Eagle’s (Sigma ®) adicionado de SFB al 10%,
Penicilina y L-Glutamina 4.4 mM. Al ser fijadas y teñidas con el colorante de Wrigth
adicionado de metanol (Anexo 10) y observar en microscopio invertido, se evidenció la
morfología de las células redondeadas como se detalla en la Figura 20.
Figura Nº 20. Células Caco – 2 en monocapa con coloración de Wrigth.
70
Al cultivar células es importante tener en cuenta factores como el tiempo de cultivo y la
densidad, ya que esto puede influir en la replicación y diferenciación y deben ser
estandarizados para obtener modelos experimentales reproducibles y comparables. El medio
de cultivo puede influir en las características físico – químicas y su composición puede
modular funciones de las células como proliferación, diferenciación, permeabilidad e incluso
su morfología. La adición de Glutamina es un factor importante, ya que esencial para el
mantenimiento de la homeostasis del intestino, así como en la estimulación de factores de
crecimiento necesarios para la células como proteínas y moléculas de adhesión tales como
integrinas y E-cadherinas (Sambuy et al, 2005).
Adicional a esto, se observó que la presencia de SFB es importante para el crecimiento de
las células, ya que al mantenerlas con medio suplementado con Glutamina y Penicilina pero
sin suero, se observó que la formación de la monocapa no se daba y las células se
observaban desprendidas; esto debido a que este compuesto es una mezcla de
biomoléculas pequeñas que promueven el crecimiento celular al contener glucosa, nitrógeno,
albúmina, fibronectina, ácido búrico, creatina y hemoglobina (Fresney, 1990), Se puede
concluir que el medio utilizado para el cultivo de esta línea celular es adecuado, ya que
permitió un buen crecimiento de las células, permitiendo obtener la monocapa necesaria
para poder realizar los ensayos de adhesión.
• Ensayo de adhesión: El colorante de Wright permitió observar la monocapa formada por
las células Caco – 2 ya esta es una tinción de tipo Romanowsky que consiste en la
utilización de azul de metileno y eosina Y o eosina B. La acción combinada de estos
colorantes da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos
neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B
y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares
y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico. La eosina Y, colorante
ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas
básicas.
Se observó entonces la coloración púrpura de acuerdo a la unión de los componentes del
colorante a las diferentes estructuras de las células Caco – 2 y de las cepas en las Figuras
21y 22.
71
Figura 21. Análisis de adherencia por microscopio invertido de Saccharomyces
cerevisiae a células Caco-2 con colorante de Wright.
Figura 22. Análisis de adherencia por microscopio invertido de S. cerevisiae var.
boulardii a células Caco-2 con colorante de Wright.
De este total, se reportaron, de 100 células Caco -2 cuantas presentaron adhesión por parte
del microorganismo. Para la cepa A (estudio), se evidenciaron 73 Levaduras adheridas/100
células Caco – 2, a diferencia de la cepa B (control) donde se observaron 41 Levaduras
adheridas/100 células Caco – 2, resultados que se pueden observar y comparar en la Figura
23.
72
Levaduras adheridas/100 células
Caco-2
80
70
60
50
40
30
20
10
0
A
B
Cepa
Figura Nº 23. Gráfica de barras de Levaduras adheridas/ 100 células Caco -2 de la cepa
A (estudio) y Cepa B (control)
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede observar que ambas cepas presentaron
adherencia a la línea celular Caco -2, sin embargo la cepa estudio A presentó mayor
adhesión que la cepa B, resultados comparables con los encontrados por Jacobsen et al
(1999), estudio en el que se realizaron ensayos de adhesión a células Caco-2 con varias
cepas de Lactobacillus, determinando que las cepas que presentaban un recuento de
adhesión menor a 40 microorganismos en los 20 campos contados al azar se consideraban
como no adherentes, entre 41 y 100 microorganismos como adherentes y mas de 100
microorganismos como fuertemente adherentes. Adicional a este estudio, se pueden
comparar los resultados con los encontrados por Kumura et al (2005), en el que las cepas en
estudio de Saccharomyces cerevisiae presentaron adhesión a células Caco – 2, aunque en
niveles bajos. Kühle et al (2005) reportó que se presentó la capacidad de adhesión más alta
para las cepas de S. cerevisiae var. boulardii,en porcentajes del 16.2% y 28.0% y para S.
cerevisiae en un 13.6% en células IPEC-J2. Por lo tanto para el presente estudio se puede
concluir que ambas cepas, tanto la cepa de estudio como la control se pueden considerar
como adherentes a la línea celular Caco-2.
Un criterio importante para una cepa probiótica es su habilidad para adherirse a las
superficies de la mucosa de tracto gastrointestinal, por lo cual se requiere de estudios in vitro
de adherencia los cuales permitan confirmar que una cepa de microorganismos es capaz de
cumplir con este criterio. Lo anterior constituye el primer mecanismo de defensa contra la
invasión de patógenos. El paso a través del intestino delgado es muy rápido (2.5 horas) y
73
disminuye conforme va llegando al ano. Por lo tanto, para que el microorganismo se pueda
multiplicar es necesario que se adhiera a la mucosa y/o epitelio del intestino. Como el
epitelio está constantemente regenerándose (cada 3-4 días), las cepas probióticas pueden
colonizarlo solo si la tasa de generación es mayor que la tasa de recambio celular (Jonnson
et al, 1962).
El primer contacto del microorganismo con el huésped en el intestino, es la capa mucosa
que recubre al epitelio intestinal y que tiene un grosor variable entre 50 y 450 mm (Lesson et
al, 1990). Tiene diferentes funciones, entre las que se encuentran inhibir la adhesión de
ciertas bacterias, al mismo tiempo que provee un hábitat para otras (Ouwehand et al, 1996).
El principal componente del mucus es agua, mientras que el componente orgánico más
importante es la mucina, responsable de la viscosidad del mucus. Las mucinas (MUC) son
glicoproteínas de alta masa molecular (0.25-2 megadaltones) constituidas de esqueletos
polipeptídicos cuya parte central está altamente glicosilada con O-glicanos principalmente,
en grupos de secuencias repetitivas, mientras que los extremos amino y carboxilo presentan
una menor glicosilación. Los tipos de mucinas que se encuentran mayormente en el intestino
delgado y grueso son MUC2 y MUC3 producidas por las células globosas (Lesson et al,
1990).
Mediante diferentes mecanismos los microorganismos se mantienen en el tracto intestinal en
contra del flujo del peristaltismo. Uno de los mecanismos usados por Saccharomyces
cerevisiae para adherirse a las células epiteliales son las manoproteínas constituyentes de la
membrana celular. Estas manoproteinas son un grupo heterogéneo de proteoglicanos con
diferentes pesos moleculares y son mejor conocidas como adhesinas (Tuite et al, 1991). Las
adhesinas se unen a aminoácidos específicos o residuos de azúcares
presentes en la
superficie de otras células. (Verstrepen et al, 2006). Las denominadas tipo lectina o
sensibles a azúcares, son aquellas que dependen de la unión a un residuo de estos
compuestos en la superficie de la célula; en este caso reconocen glicoconjugados
específicos en las células epiteliales intestinales, carbohidratos presentes en las mucinas
que pueden funcionar como receptores tanto para bacterias patógenas como probióticas,
ocurriendo así una competencia por los sitios de adhesión. Esos receptores pueden ser Dgalactosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina o ácido N-acetilneuramínico asociado
a las glicoproteínas intestinales. (Giannasca et al, 1996, Verstrepen et al, 2006).
Adicionalmente en S. cerevisiae la adherencia de este tipo se puede dividir en dos
subcategorías, una se denomina Flo1 y la otra nuevo Flo, la primera se une a manosa,
74
mientras la segunda se une a azúcares como manosa, glucosa y oligómeros de glucosa
como maltosa (Verstrepen et al, 2006).
Cuando se habla de adhesión por parte de los microorganismos con capacidad probiótica a
las células epiteliales se pone en manifiesto el uso otra ventaja de los probióticos: la
exclusión competitiva, esta implica la prevención de la entrada o el establecimiento de una
población bacteriana al tracto gastrointestinal debido a la competencia por sustrato y por
espacio generado por el grupo de microorganismos que ocupa los potenciales sitios de
adhesión. Los microorganismos probioticos compiten directamente o afectan la adhesión de
patógenos a los receptores específicos de la mucosa del tracto gastrointestinal (Maija et al,
2006). En microorganismos como Bifidobacterias, la adhesión al intestino ocurre por la
asociación de las bacterias con la mucosa o por adherencia al epitelio y se debe a la
interacción de fuerzas atractivas y repulsivas entre las superficies participantes. La
composición de la pared celular bacteriana, así como la naturaleza de la superficie a la cual
se adhiere, afectan este fenómeno (Fontaine et al, 1994).
Teniendo en cuenta que en las pruebas de tolerancia a sales biliares, pH, jugos gástricos y
en la de reducción del colesterol en presencia de sales biliares no se observaron diferencias
estadísticamente significativas (p > 0.05) entre la cepa A (estudio) y la cepa B (control), y
que sólo en la prueba de adherencia a la línea celular Caco -2 se observó un mayor
porcentaje de adhesión por parte de la Cepa A en comparación con la Cepa B, se puede
concluir que la cepa nativa de estudio de Saccharomyces cerevisiae presenta
las
características necesarias para que pueda llegar a ser empleada en un futuro como
suplemento probiótico en la nutrición de animales monogastricos como pollos.
75
7. CONCLUSIONES
• Las pruebas de conservación de cepas con glicerol 30% (p/v) demostraron que hacia el
tercer mes de haberse realizado el banco la viabilidad disminuyó significativamente.
• Se determinó la tolerancia a sales biliares en concentraciones desde 0.5% a 3.0% (p/v) de
la cepa estudio (cepa A) y de la cepa control (cepa B), evidenciándose que el género
Saccharomyces sp. es capaz de crecer a todas las concentraciones de sales evaluadas.
• En la prueba de tolerancia a pH, se encontró que tanto la cepa A (estudio) como la cepa B
(control), presentaron estabilidad y viabilidad celular en los rangos de pH evaluados (2.0 a
5.0)
• En la prueba de resistencia a jugos gástricos, ambas cepas demostraron estabilidad y
viabilidad celular manteniéndose en una concentración de 105 UFC/mL durante los tiempos
evaluados.
• Se determinó la capacidad de reducción del colesterol para ambas cepas, en donde luego
de 12 horas de incubación en un medio suplementado con colesterol se evidencio una
reducción del 54% para la cepa A y del 58% para la cepa B.
• Se realizó la prueba de sonicación para las dos cepas A y B crecidas en medio con y sin
colesterol, en donde se comprobó que las levaduras crecidas en medio con colesterol son
más resistentes a la lisis producida por este método de disrupción celular.
•En la prueba de adherencia realizada con la línea celular Caco-2, fue posible determinar la
habilidad de adherencia por parte de la cepa de estudio A y la cepa control B, siendo ambas
cepas consideradas como adherentes.
• Se observó que no existió diferencia estadísticamente significativa entre la cepa A y B en
las pruebas de tolerancia a sales biliares, pH, jugos gástricos y reducción del colesterol en
presencia de sales biliares.
76
• De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas realizadas para el presente estudio
se puede inferir que la cepa nativa de Saccharomyces cerevisiae en estudio, cumple con los
requisitos para ser usada como suplemento en probiótico en nutrición animal.
77
8. RECOMENDACIONES
• Se recomienda la realización de estudios in vivo a partir de los cuales se pueda determinar
los verdaderos efectos de un futuro suplemento probiótico con Saccharomyces cerevisiae
en modelos animales específicos.
• Al observarse una reducción de colesterol mayor al 50% en 12 horas de incubación por
parte de las dos cepas usadas en este estudio, se recomienda la evaluación a tiempos
superiores a las 12 horas para determinar si se logra alcanzar una reducción del 100%.
• Se recomienda la evaluación de la actividad de la enzima hidrolasa que actúa sobre las
sales biliares en
Saccharomyces cerevisiae, la cual ha sido encontrada en otros
microorganismos con capacidad probiótica como mecanismo de tolerancia.
• Se recomienda el estudio de la formulación de un suplemento nutricional usando
Saccharomyces cerevisiae como microorganismo probiótico, determinando la concentración
y forma más apropiada para su administración en animales monogastricos.
• Se recomienda que para el mantenimiento de la viabilidad de las cepas de estudio y la
estabilidad del banco de conservación de las mismas la temperatura de almacenamiento se
mantenga estable siendo esta preferiblemente de -70oC.
78
9. BIBLIOGRAFIA
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93
10. ANEXOS
ANEXO Nº 1. ASPECTO MACROSCÓPICO DE S. cerevisiae y S. cerevisiae var.
boulardii
• Anexo 1.1.
Figura Nº 1.1. Aspecto macrocópico de S. cerevisiae var. boulardii en Agar YPG
• Anexo 1.2.
Figura Nº 1.2. Aspecto macrocópico de S. cerevisiae en Agar YPG
94
• Anexo 1.3.
Figura Nº 1.3. Recuento en microgota de S. cerevisiae en Agar YPG
ANEXO Nº 2. TABLAS DE RESULTADOS OBTENIDOS PARA CONTROL DE CALIDAD
DE BANCOS DE CEPA A Y B
• Anexo 2.1.
Tabla Nº 2A Coloración de Gram de inóculos y colonias de cepa A (estudio) y
cepa B (control)
Cepa
A
Gram
Gram
inóculos
colonias
Levaduras
Levaduras
sin
sin contaminación
contaminación
B
Levaduras
Levaduras
sin
sin
contaminación
contaminación
95
• Anexo 2.2.
Tabla Nº 2B Técnica: Siembra en superficie en agar YPG de control de calidad de Cepa
A (estudio) y Cepa B (control)
Mes
Cepa A
Cepa B
1
5,6E+08
4,5E+08
2
9,0E+08
9,8E+08
3
6,5E+07
6,0E+08
4
5,0E+05
4,0E+08
5
1,7E+08
1,8E+08
ANEXO Nº 3. TABLA RESULTADOS DE PRUEBA DE TOLERANCIA A SALES BILIARES
Tabla Nº 3. Técnica: Siembra en microgota en agar YPG suplementado con sales
biliares para cepa A (estudio) y cepa B (control)
Concentración
Cepa A
Cepa B
(% p/v)
UFC/mL
UFC/mL
0.05 %
6,60E+06
7,90E+06
0.10 %
7,30E+06
7,90E+06
0.15 %
6,80E+06
7,50E+06
0.20 %
5,00E+06
8,80E+06
0.25 %
8,20E+06
8,00E+06
0.30 %
5,50E+06
5,00E+06
Sales Biliares
96
ANEXO Nº 4. TABLA RESULTADOS DE PRUEBA DE TOLERANCIA A RANGOS DE pH
Tabla Nº 4 Técnica: Siembra en microgota en agar YPG de pH para cepa A (estudio) y
cepa B (control)
Valor
Cepa A
Cepa B
pH
UFC/mL
UFC/mL
2.0
3,20E+06
5,80E+05
2,5
2,20E+06
2,60E+05
3.0
2,90E+06
3,30E+05
3,5
3,60E+06
4,80E+05
4.0
6,30E+06
1,50E+05
4,5
3,30E+06
7,00E+06
5.0
8,80E+06
6,50E+07
ANEXO Nº 5. TABLA RESULTADOS DE PRUEBA DE RESISTENCIA A JUGOS
GÁSTRICOS
Tabla Nº 5. Técnica: Siembra en microgota en agar YPG de jugos gástricos para cepa
A (estudio) y cepa B (control)
CEPA A
CEPA B
MUESTREO
Jugo
Gástrico
pH 2.0 – 2.3
Jugo Gástrico Jugo Gástrico
pH 7.0 – 7.2
pH 2.0 – 2.3
Jugo Gástrico
pH 7.0 – 7.2
Horas
UFC/mL
UFC/mL
UFC/mL
UFC/mL
0
6,40E+05
6,00E+05
7,40E+05
8,80E+05
1
5,30E+05
7,00E+05
8,50E+05
7,80E+05
2
6,00E+05
7,30E+05
9,20E+05
9,30E+05
3
6,30E+05
5,30E+05
7,30E+05
6,50E+05
4
7,30E+05
7,40E+05
6,80E+05
8,00E+05
24
9,50E+05
6,90E+05
5,00E+05
9,50E+05
97
ANEXO Nº 6. TABLAS Y FIGURAS DE PRUEBA DE DETERMINACIÓN DE REDUCCION
DE COLESTEROL EN PRESENCIA DE SALES BILIARES
Anexo 6.1. Protocolo de elaboración de curva patrón de colesterol
-
Se parte del reactivo Lipids Colesterol Rich (Sigma ®) con una concentración inicial
de colesterol de 9 – 11 g/L y se realiza la conversión a microgramos/mililitro, es decir la
concentración inicial del reactivo es 9000 a 11000 μg/mL
-
Se toma como concentración inicial el promedio, es decir 10000 μg/mL.
-
Se aplica la fórmula
V1 * C1 = V2 * C2
Donde:
V1= Volumen inicial de Lipids Colesterol Rich (mL)
C1= Concentración inicial (10000 μg/ml)
V2= 20 mL de caldo YPG
C1= Diferentes concentraciones conocidas de colesterol (60μg/mL – 130 μg/mL)
Anexo 6.2. Curva patrón
Tabla Nº 6.2. Valores de Absorbancia (550 nm) obtenidos en la elaboración de la réplicas
de la curva patrón para la determinación de colesterol
Absorbancia (550 nm)
Absorbancia (550 nm)
Absorbancia (550 nm)
colesterol (μg/mL)
Réplica 1
Réplica 2
Promedio
60
0.123
0.101
0.112
70
0.178
0.145
0.1615
80
0.206
0.204
0.205
90
0.266
0.233
0.2495
100
0.271
0.301
0.286
110
0.366
0.347
0.3565
120
0.387
0.398
0.3925
130
0.416
0.422
0.419
Concentración
98
Anexo 6.3.
Tabla Nº 6.3. Valores de Absorbancia (550 nm) obtenidos en la determinación de
reducción de colesterol del medio YPGCHO por las cepa A y Cepa B
Cepa A
Cepa B
Réplicas
Absorbancia (550 nm)
Absorbancia (550 nm)
1
0.319
0.258
2
0.308
0.261
3
0.282
0.277
Promedio
0.303
0.265
Medio YPGCHO
Anexo 6.4.
Figura Nº 6.4. Medio YPGCHO inoculado con la cepa A (estudio) después de 12
horas de incubación
99
Anexo 6.5.
Figura Nº 6.5. Medio YPGCHO inoculado con la cepa B (control)
después de 12 Horas de incubación
Anexo 6.6.
Figura Nº 6.6. Separación de fases orgánica y acuosa en la extracción de
colesterol de las muestras (cepa A y B)
100
Anexo 6.7.
Figura Nº 6.7. Reaccion de Liebermann - Burchard para la determinación de
colesterol en medio YPGCHO (cepa A)
Anexo 6.8.
Figura Nº 6.8. Reaccion de Liebermann - Burchard para la determinación de
colesterol en medio YPGCHO (cepa B)
101
ANEXO 7. FIGURAS DE ENSAYO DE ADHESION A CÉLULAS Caco – 2
Anexo 7.1.
Figura 7.1. Análisis de adherencia por microscopio invertido de Saccharomyces
cerevisiae a células Caco-2 con colorante de Wright.
Anexo 7.2.
Figura 7.2. Análisis de adherencia por microscopio invertido de Saccharomyces
cerevisiae var. boulardii a células Caco-2 con colorante de Wright.
102
ANEXO 8. COMPOSICION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Anexo 8.1. Agar YPG
TABLA Nº 6.1, Composición (g/L) de Medio YPG
Componente
Gramos/Litro
Peptona
20
Glucosa
20
Extracto de levadura
10
Agar
15
Preparación: Se disuelven los componentes en un litro de agua desmineralizada por
calentamiento. Tratar en autoclave (15 minutos, 120oC, 15 libras de presión).
pH 6.6
2 a 25 oC.
Anexo 8.2. Caldo YGC
TABLA Nº 6.2, Composición (g/L) de Caldo YGC
Componente
Gramos/Litro
Peptona
20
Glucosa
20
Extracto de levadura
10
Cloramfenicol
0.1
Preparación: Se disuelven los componentes en un litro de agua desmineralizada por
calentamiento. Tratar en autoclave (15 minutos, 120oC, 15 libras de presión). pH 6.6 ± 2 a
25 oC.
103
Anexo 8.3. Caldo YPGCHO
TABLA Nº 6.3. Composición (g/L) de Caldo YPGCHO
Componente
Gramos/Litro
Peptona
20
Glucosa
20
Extracto de levadura
10
Bile Oxgall (Difco ® )
0.1
Lipids Colesterol Rich (Sigma ®)
Según uso
Preparación: Se disuelven la peptona, glucosa, extracto de levadura y las sales biliares (Bile
Oxgall) en un litro de agua desmineralizada por calentamiento. Tratar en autoclave (15
minutos, 120oC, 15 libras de presión). En el momento del uso suplementar con el reactivo
Lipids Colesterol Rich (Sigma ®), según uso para elaborar curva patrón o determinación de
reducción de colesterol por microorganismos probióticos.
Anexo 8.4. Reactivo de extracción de colesterol.
• Etanol 95 % (v/v): preparado al momento de usar o refrigerado a 4 ºC.
• Hidróxido de Potasio 50% (p/v): preparado al momento de usar o con antelación dejando
en temperatura ambiente.
• Hexano: debe ser puro y dejarse refrigerado a 4 ºC.
• O – phthaldehído (Sigma ®): este reactivo debe mantenerse refrigerado y al momento de
usar, se pesan 0.5 mg y se disuelven en 1 mL de Ácido Glacial Acético.
Anexo 8.5. Medio Mínimo Esencial Eagle
El medio debe suplementarse con una solución que contiene 0.6436 gramos de Glutamina
(4.4 mM), 0.006 gramos de Penicilina y 100 mg de Estreptomicina llevados a 10 mL de agua
destilada y posteriormente debe esterilizarse con filtros de membrana de 0.22 μm. Esta
solución se adiciona a 1 Litro de Medio Mínimo Esencial Eagle. Adicionalmente, se debe
104
inactivar el Suero Fetal Bovino (30 minutos a 57ºC en baño termostatado) y filtrar de la
manera descrita anteriormente. Se debe adicional 100 mL de SFB por cada Litro de Medio
de Cultivo.
Anexo 8.6. PBS
Se deben pesar 8 gramos de NaCl, 0.2 gramos de KCl, 0.51 gramos de KH2PO4 y 1.6
gramos de Na2HPO4 y llevarlos a 1000 mL con agua destilada, ajustando el pH con HCl 1 N
a 7.1 – 7.2 y posteriormente esterilizar en autoclave 121ºC durante 20 minutos y almacenar
a 4ºC.
ANEXO 9. PROTOCOLO DE TRIPSINIZACION DE CÉLULAS Caco-2.
- Se toma una caja con células confluentes crecidas en medio mínimo esencial Eagle con
15% se suero fetal bovino.
- Se retira el medio mínimo esencial
- Las células son lavadas con 3 mL de solución de PBS la cual es posteriormente retirada.
- Se adiciona 0.5 mL de Tripsina a 37oC para humedecer la monocapa y subsecuentemente
desprender las células.
- Una vez las células se vean individuales, se golpea suavemente el frasco para desprender
las células del mismo.
- A continuación las células son resuspendidas en 5 mL de medio mínimo esencial con
suero fetal bovino al 15%.
ANEXO 10. TINCION DE WRIGHT
Se pesan 0.5 g de bicarbonato sódico y 1 g de azul de metileno en 100 ml de agua destilada.
La mezcla se calienta a 100º C durante 1 hora. Se enfría y se añade una solución de eosina
al 1%. El precipitado se recoge en un filtro, se seca y disuelve en alcohol metílico en la
proporción de 0.5 g/litro de alcohol.
ANEXO 11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para las pruebas llevadas a cabo en este estudio, se realizó una Prueba t - student.
Teniendo en cuenta que se plantean hipótesis donde:
Ho: Hipótesis nula
Hi: Hipótesis alterna
105
Y se tiene que:
Si P < 0.05 Se rechaza Ho
Si P > 0.05 Se acepta Ho
Anexo 11.1. Prueba Tolerancia a Sales Biliares.
Ho: La tolerancia a las concentraciones de sales biliares evaluadas (0.05% - 0.3%) por parte
de la cepa A (estudio) es igual a la presentada por la cepa B (control).
Hi: La tolerancia a las concentraciones de sales biliares evaluadas (0.05% - 0.3%) por parte
de la cepa A (estudio) es no es igual a la presentada por la cepa B (control).
P = 0.214
Por lo tanto se acepta la hipótesis nula y se concluye que no existe evidencia
estadísticamente significativa para afirmar que hay diferencia entre las medias de los
recuentos (UFC/mL) de ambas cepas.
Anexo 11.2. Prueba Tolerancia a pH.
Ho: La tolerancia a los diferentes valores de pH (2.0 – 5.0) por parte de la cepa A (estudio)
es igual a la presentada por la cepa B (control).
Hi: La tolerancia a los diferentes valores de pH (2.0 – 5.0) por parte de la cepa A (estudio) no
es igual a la presentada por la cepa B (control).
P = 0.523
Por lo tanto se acepta la hipótesis nula y se concluye que no existe evidencia
estadísticamente significativa para afirmar que hay diferencia entre las medias de los
recuentos (UFC/mL) de ambas cepas.
Anexo 11.3. Prueba Tolerancia a Jugos gástricos.
Jugo Gástrico pH 2.0 – 2.3
Ho: La tolerancia al jugo gástrico artificial (pH 2.0 – 2.3) por parte de la cepa A (estudio) es
igual a la presentada por la cepa B (control).
106
Hi: La tolerancia al jugo gástrico artificial (pH 2.0 – 2.3) por parte de la cepa A (estudio) no es
igual a la presentada por la cepa B (control).
P = 0.517
Por lo tanto se acepta la hipótesis nula y se concluye que no existe evidencia
estadísticamente significativa para afirmar que hay diferencia entre las medias de los
recuentos (UFC/mL) de ambas cepas.
Jugo Gástrico pH 7.0 – 7.2
Ho: La tolerancia al jugo gástrico artificial (pH 7.0 – 7.2) por parte de la cepa A (estudio) es
igual a la presentada por la cepa B (control).
Hi: La tolerancia al jugo gástrico artificial (pH 7.0 – 7.2) por parte de la cepa A (estudio) no es
igual a la presentada por la cepa B (control).
P = 0.833
Por lo tanto se acepta la hipótesis nula y se concluye que no existe evidencia
estadísticamente significativa para afirmar que hay diferencia entre las medias de los
recuentos (UFC/mL) de ambas cepas.
Anexo 11.4. Prueba reducción de colesterol en presencia de sales biliares.
Ho: La reducción de colesterol en presencia de sales biliares por parte de la cepa A (estudio)
es igual a la presentada por la cepa B (control).
Hi: La reducción de colesterol en presencia de sales biliares por parte de la cepa A (estudio)
no es igual a la presentada por la cepa B (control).
P = 0.154
Por lo tanto se acepta la hipótesis nula y se concluye que no existe evidencia
estadísticamente significativa para afirmar que hay diferencia entre las medias de los
valores de absorbancia 550 nm medidos para ambas cepas.
107