Memorias Foro Intrauniversitario de

Universidad
Veracruzana
Memorias
Foro Intrauniversitario
de Investigación en Salud
2007
Universidad
Veracruzana
Memorias
Foro Intrauniversitario
de Investigación en Salud
2007
ISBN: 970-9939-02-5
Memorias
Foro Intrauniversitario
de Investigación en Salud
2007
Instituto de Salud Pública
Universidad Veracruzana
Primera edición, Xalapa, Ver.
Se imprimió en los talleres de
DOCUMASTER S.A de C.V
Av. Coyoacán 1450 Bis Col. Del Valle
CP. 03220 México DF.
El contenido de los artículos es
responsabilidad de los autores.
La edición se basó en los trabajos
originales proporcionados por ellos.
Se admite la reproducción parcial
o total de esta publicación con la
condición de que sea mencionada
la fuente.
Correspondencia:
Instituto de Salud Pública.
Universidad Veracruzana.
Av. Castelazo Ayala s/n. Col. Industrial Ánimas.
C.P. 91190. Xalapa, Ver.
Universidad Veracruzana
Comité Evaluador 2007
Dr. Raúl Arias Lovillo
Rector
Dr. Ricardo Corzo Ramírez
Secretario Académico
Dr. Ramón Flores Lozano
Secretario de la Rectoría
Lic. Víctor Aguilar Pizarro
Secretario de Administración y Finanzas
Dr. Jesús Samuel Cruz Sánchez
Director General de investigaciones
Dr. Porfirio Carrillo Castilla
Director General de Estudios de Posgrado
Dr. Agustín Aguirre Pitalúa
Director General del Área Académica
de Ciencias de la Salud
Mtra. Leticia Rodríguez Audirac
Directora General de Apoyo al Desarrollo Académico
Área Biomedicina
Comité Organizador 2007
Alejandro Cuervo Vera
Coordinación de Especialidades Médicas
Enrique Hernández Guerson
Instituto de Salud Pública
María Del Carmen Soto Olivares
Dirección General de Investigaciones
Patricia Pavón León
Instituto de Ciencias de la Salud
Patricia Rosa Linda Trujillo Mariel
Instituto de Medicina Forense
Federico Roesch Dietlen
Instituto de Investigaciones Médico-Biológicas
María Cristina Ortiz León
Instituto de Salud Pública
Graciela Mendoza Margain
Coordinación de Especialidades Médicas
Daniel Reyna Méndez
Coordinación de Especialidades Médicas
Gustavo Adolfo Vargas Merino
Instituto de Salud Pública
Juan Santiago García
Enrique Juárez Aguilar
Fabio Alfredo García García
Mario Caba Vinagre
Roberto Zenteno Cuevas
Área Clínica
María Graciela Carrillo Toledo
Jairo Carrasco Rivas
Israel Castañeda Andrade
Sonia Rojas Carrera
Magdalena Domínguez
Jesús Manuel Flores González
Área Salud Pública
Sandra Areli Saldaña Ibarra
Gabriel Riande Juárez
Edit Rodríguez Romero
Cecilia Sofía Cortes Salazar
María Del Pilar González Arroyo
Evangelina Montes Villaseñor
Comité Editorial
Dra. Dulce María Cinta Loaiza
Editor
Dr. Jaime Morales Romero
Co- Editor
Mtra. Elsa Ladrón de Guevara Morales
Mtra. Edit Rodríguez Romero
Dra. Elizabeth Bonilla Loyo
Mtro. Manuel Salvador Luzanía Valerio
Administradora
C.P. Angélica Tapia Vázquez
Diseño Editorial
Lic. María Elena López Vázquez
Presentación
7
Capítulo I
Biomedicina
Ácido linoléico conjugado y síndrome
metabólico II
Membrana plasmática adipocitaria y acido
linoleico conjugado (CLA)
11
19
Presencia de Trypanosoma Cruzi en
localidades rurales del Municipio de Tezonapa;
Veracruz
31
Actividad amebicida y anti-inflamatoria del
extracto acuoso de Conyza Filaginoides
Análisis de la interacción entre el receptor tipo toll y
el virus de dengue 2 en monocitos humanos
“Efecto de la Estrategia de Visita de Profesores en la
Aptitud Clínica de Médicos Familiares”
Densidad prostática del ARNm del receptor a
estrógenos β en respuesta a la conducta sexual de la
rata
Análisis de los patrones de expresión de
metaloproteasas de matriz y sus inhibidores en
respuesta al activador farmacológico PMA en
fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo
39
47
61
69
79
Capítulo II Clínica
Índice CPOD en embarazadas y no
embarazadas adscritas a la UMF No. 19
87
Capítulo III
Salud Pública
Análisis de Cluster de Leucemia Aguda en
niños de la ciudad de México en el 2006
99
Prevalencia de obesidad abdominal en
adultos participantes al curso “Escuela sana”
107
“Incidencias de Hiperlipidemia y/o Hipertensión
y su probable correlación con el IMC y Diabetes
Mellitus 2 en personas que acuden al puesto de
sangrado del hospital general Córdoba, Veracruz”
113
“Determinación de un patrón somatométrico propio
de los recién nacidos sanos de término del Hospital
Regional de Poza Rica SES VER en el periodo 20042006”
119
Colposcopía asistida por computadora: un enfoque
temporal
125
.
Presentación
María Cristina Ortiz León
Instituto de Salud Pública
En el año 2007 se celebró el ”Primer Foro Intrauniversitario
de Investigación en Salud” con los objetivos de reconocer,
promover y difundir la investigación en el campo de la salud;
así como contribuir al fortalecimiento y consolidación de la
investigación al interior de la Universidad Veracruzana.
La sede del evento fue la Unidad de Servicios
Bibliotecarios y de Información <USBI-Xalapa> con video
transmisión en las zonas restantes. Los días del 29 de
noviembre al 1° de diciembre de 2007
Dirigido a docentes, investigadores y estudiantes de
nivel de pregrado y posgrado del área de Ciencias de la
Salud y de otras áreas que hubieran desarrollado trabajos
de investigación directamente relacionados con la salud. La
convocatoria se extendió a las cinco zonas que conforman la
Universidad Veracruzana.
Las áreas dentro del campo de la salud que se
consideraron fueron:
• Investigación Biomédica: Se incluían todas las
investigaciones dirigidas a un mejor conocimiento de los
mecanismos moleculares y celulares de funcionamiento
del ser humano y de sus alteraciones en circunstancias
patológicas.
• Investigación Clínica: Dirigido a aquellos estudios sobre
la eficacia de procedimientos preventivos, diagnósticos
y terapéuticos, que incluya la participación de seres
humanos.
• Investigación en Salud Pública: Se consideraron aquellos
trabajos caracterizados por mejorar, promover, proteger o
restaurar la salud de la población por la acción colectiva
y, que abarcaran alguna de las Funciones Esenciales de
la Salud Pública.
Se recibieron un total de 97 resúmenes, el 48% de
éstos fueron del área de la Salud Pública. Vislumbrando un
futuro prometedor, ya que el 42% de los trabajos recibidos
fueron de estudiantes de licenciatura, quienes posiblemente
se dediquen a la investigación en este campo.
Participaron 17 evaluadores, los cuáles seleccionaron 24
trabajos para ser expuestos en modalidad oral, participando
por ocho primeros lugares (en cada área convocada), los
cuáles recibieron un premio en efectivo.
Respecto de los trabajos que se recibieron, se
pudo observar que los escenarios de investigación
fueron sumamente diversos, tanto por los sitios como
por las temáticas que se desarrollaron, así como por sus
protagonistas. En cuanto a los sitios, fueron sujeto de estudio:
comunidades, unidades médicas de primer nivel, hospitalarias
y laboratorios, por solo mencionar algunos. Con referencia a
los temas, se presentaron desde procesos educativos hacía
personal médico, estudios experimentales que descubrieron
diversas relaciones en virus o membranas, hasta el estudio
de diversas técnicas de diagnóstico y tratamiento en seres
humanos, entre otros. En relación a los protagonistas,
fueron estudiantes que junto con docentes e investigadores
empiezan a conformar grupos de investigación.
De los 24 trabajos finalistas, se invitó a los autores a
participar en la publicación del presente libro, de los cuáles
14 aceptaron esta invitación:
Área de Biomedicina:
· Ácido linoléico conjugado dietario y síndrome metabólico
II
· Membrana Plasmática Adipocitaria y CLA.
· Presencia de Trypanosoma Cruzi en localidades rurales
del municipio de Tezonapa, Veracruz.
· Actividad Amebicida y Anti-inflamatoria del extracto
acuoso de Conyza Filaginoides
· Análisis de la interacción entre el receptor Tipo Toll y el
virus de Dengue 2 en Monocitos Humanos
· Efecto de la estrategia de visita de profesores en la aptitud
clínica de los médicos familiares
· Densidad prostática del ácido ribonucleico mensajero del
receptor a estrógenos beta en respuesta a la conducta
sexual de la rata
· Análisis de los patrones de expresión de metaloproteasas
de matriz y sus inhibidores en respuesta al activador
farmacológico PMA en fibroblastos de ratón C3H10T1/2
en cultivo
Área Clínica:
· Índice CPOD en embarazadas y no embarazadas
adscritas a la UMF no. 19, Banderilla, Ver.
Área de Salud Pública:
· Análisis de Cluster de Leucemia Aguda en niños de la
ciudad de México en 2006.
· Prevalencia de obesidad abdominal en adultos
participantes al curso “Escuela Sana”
· Incidencia de hiperlipidemia y/o hipertensión y su probable
correlación con el IMC Y Diabetes Mellitus 2 en personas
que acuden al puesto de sangrado del Hospital general
Córdoba, Veracruz
· “Determinación de un patrón somatométrico propio de los
recién nacidos sanos de término del hospital regional de
Poza Rica SESVER en el periodo 2004 - 2006”
· Colposcopía asistida por computadora: un enfoque
temporal.
7
Capítulo I
Biomedicina
Ácido linoléico conjugado y síndrome
metabólico II
Pulido, E.1, López, J.2, Hernández, G.3, Alexander, A.4, Soto, I.5, y García, H.6
1
Egresada. Facultad de Bioanálisis. Universidad Veracruzana
2
Técnico Histipatólogo. Facultad de Medicina Universidad Cristobal Colón
3
estudiante de Doctorado. UNIDA. Instituto Tecnológico de [email protected]
4
Técnico Académico. Facultad de Bioanálisis. Universidad Veracruzana. [email protected]
5
Técnico Académico. Facultad de Bioanálisis. Universidad Veracruzana. [email protected]
6
Profesor Investigador. UNIDA. Instituto Tecnológico de Veracruz. [email protected]
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN
El síndrome metabólico (SM) es un problema de
salud que aparece de forma simultánea o secuencial en
un mismo individuo, cuyas manifestaciones clínicas y
metabólicas favorecen la intolerancia a los glúcidos, la
disminución de colesterol HDL, el aumento de lipólisis
y la resistencia a la insulina; esta última, propicia
disfunción endotelial y conduce a la hipertensión arterial,
a la vasoconstricción y a la formación de aterosclerosis.
Se ha demostrado que el ácido linoléico conjugado
(CLA), es un ácido graso de cadena larga poliinsaturada
con propiedades benéficas en la salud al actuar como
regulador metabólico con efectos hipocolesterolémicos,
antiaterogénicos, anticarcinogénicos y antioxidantes.
El objetivo de este estudio fue determinar los efectos
histológicos del ácido linoléico conjugado dietario en
aorta e hígado de ratas con SM. Se utilizaron 16 ratas
Wistar macho espontáneamente hipertensas formando
dos grupos, uno con una dieta de aceite de girasol 7.5%,
y el otro con (CLA) 7.5%. El grupo testigo se integró
por 10 ratas Kyoto Wistar machos alimentadas con una
dieta rica en aceite de girasol 7.5%. Después de ocho
semanas de experimentación los animales se sacrificaron
y la aorta y el hígado se fijaron en formaldehído al 10 %,
procesándose con las técnicas de H-E y de Aceite de
Rojo Oleoso para lípidos. La tinción de H-E reveló en el
tejido de la aorta del grupo de animales que recibieron
la dieta de aceite de girasol una proliferación de fibras
elásticas y de colágena en las capas íntima y media.
La técnica de Aceite de Rojo oleoso evidenció células
adiposas en la capa adventicia. En este mismo grupo, se
evidenció fibrosis, engrosamiento del epitelio de la vena
central hepática e hiperplasia hepatocitica y, con la tinción
de aceite de Rojo oleoso, se observó ligera esteatosis.
Estos hallazgos histológicos no se encontraron ni en el
grupo de animales alimentados con CLA, ni en el grupo
testigo. Se concluye que el (CLA) mejora la disfunción
endotelial, reduce la esteatosis y la hiperplasia celular
en ratas con SM.
1.1. Origen y causas del Síndrome Metabólico
La evolución de la forma de vida de la raza
humana cambió las condiciones de salud en nuestros
antecesores, cuando se convirtieron de nómadas a
sedentarios; de incivilizados a civilizados y de incultos
a cultos. Los cambios se produjeron fundamentalmente
por el sedentarismo, un exceso de comida y factores
socioculturales se desarrollaron e implementaron con
el tiempo; además una predisposición genética se hizo
manifiesta al menos en los últimos cinco a 10 mil años1.
La evidencia que han dejado los habitantes de las
cavernas de esas épocas, permite apreciar en dibujos
rupestres la existencia del problema de la obesidad.
Posteriormente en épocas más recientes, en pinturas
o esculturas se muestra como el exceso de comidas
y bebidas, sobre todo en personajes económicamente
pudientes desarrollan obesidad, y muertes prematuras1.
Por ello, la obesidad es quizá el trastorno metabólico
y nutricional más antiguo que se conoce en la historia
de la humanidad. Los cambios del estilo de vida que
promueven la escasa actividad física ocasiona un
incremento de peso y depósito de grasa corporal, el cual,
en la actualidad es considerado un factor de riesgo para
la salud, tanto en la población de países industrializados
como en los que se encuentran en desarrollo2.
En nuestro país la ingesta calórica ha aumentado en
los últimos 40 años. Este aumento obedece a un elevado
consumo de grasas así como a la poca actividad
física, que alcanza el 90%. No es de extrañar, por
ello, que el 60% de nuestra población presente sobrepeso
u obesidad lo que promueve un aumento en problemas de
salud, tales como diabetes, hipertensión y dislipidemia3.
El síndrome metabólico (SM) fue reconocido hace
más de 80 años; en la literatura médica ha recibido
diversas denominaciones a través del tiempo. En las
primeras descripciones de este síndrome asociaban
diversas situaciones clínicas, como la diabetes mellitus,
11
la hipertensión arterial, y la dislipidemia. Sin embargo,
es hasta 1988 cuando Reaven4 establece que estos
factores tenían que presentarse en un mismo individuo
en forma de un síndrome que denominó “síndrome X”.
Actualmente lo podemos definir como una condición
patológica asociada a la resistencia a la insulina e
hiperinsulinemia que presenta un alto riesgo de desarrollar
diabetes mellitus tipo 2 y enfermedad cardiovascular
aterosclerótica5 Figura 1.
Colesterol HDL bajo
< 40 mg/dL o < 1,03 mmol/L
en hombres y < 50 mg/dL o <
1,4 mmol/L en mujeres
Hipertensión arterial
=130/=85 mmHg
Hiperglucemia en
ayuno
=110mg/dL o 6,1 mmol/L
La prevalencia del síndrome metabólico depende
de la definición empleada para determinarla, así como
de la edad, el sexo, el origen étnico y el estilo de vida.
Cuando se emplean criterios semejantes a los de la
OMS, la prevalencia del síndrome metabólico varía del
1,6 al 15 % dependiendo de la población estudiada y del
rango de edad. En poblaciones de alto riesgo, donde un
familiar o varios son diabéticos, la prevalencia aumenta
considerablemente hasta el 50 %, alcanzando el 80 % en
personas diabéticas y el 40 % en personas con intolerancia
a la glucosa7. En México aunque existe una limitada
información acerca de la prevalencia de este síndrome
se ha logrado establecer por medio de la Encuesta
Nacional de Enfermedades Crónicas8 que incluyó 14,
682 sujetos con edades entre 20 y 69 años, que cerca de
14 millones de individuos pueden ser catalogados como
afectados por el síndrome metabólico.
1.2. Atención
metabólico
Recientemente, el Instituto Nacional de Salud de los
Estados Unidos, a través del III Panel de Tratamiento del
Adulto (ATP IIl) del Programa Nacional de Educación en
Colesterol (NCEP) presentó una tercera versión de las
guías para el diagnóstico y atención de las dislipidemias,
donde se considera al síndrome metabólico como una
entidad separada y establece una definición clínica
basada en los factores de riesgo (Tabla 1) que resulta de
muy fácil aplicación tanto en estudios epidemiológicos
como en la práctica clínica diaria, pues a diferencia de la
definición del grupo de trabajo de la Organización Mundial
para la Salud no necesita demostrarse directamente la
resistencia a la insulina.
DEFINICIÓN
Obesidad abdominal
Circunferencia de la cintura >
102 cm
(40 pulg) en hombres y > 88 cm
(35 pulg)
en mujeres
Triglicéridos altos
del
Síndrome
La atención terapéutica del síndrome metabólico
comprende dos fases íntimamente relacionadas: a) para la
reducción de la obesidad, se contempla promover cambio
en el estilo de vida saludables que se traducen en una
alimentación apropiada asi como estimular la actividad física
y b) un tratamiento para disminuir el riesgo cardiovascular de
los pacientes con síndrome metabólico que de acuerdo con
su evolución puede considerarse el uso de fármacos. Esto
comprende un control de la hiperglicemia en los diabéticos
y de la presión arterial en los hipertensos. Del mismo modo
para el tratamiento de la dislipidemia actualmente se recurren
a medidas no farmacológicas con dieta baja en carbohidratos
y evitando bebidas alcohólicas, asi como el tabaquismo. Sin
embargo, si no se logra la disminución de los triglicéridos se
debe proponer una terapia combinada de fármacos con estricta
vigilancia médica5. Generalmente el tratamiento farmacológico
se inicia con estatinas, y de ser necesario puede combinarse
con fibratos y derivados del ácido nicotínico7.
Tabla 1. Identificación clínica del síndrome metabólico
propuesta por el ATPIII6
FACTOR DE RIESGO
terapéutica
1.3. Aspecto socioculturales de la alimentación
México
Analizando la evolución del síndrome metabólico en
nuestro país se puede constatar que uno de los factores
= 150 mg/dL o = 1,7 Mohs/L
12
asociados con un mayor riesgo de desarrollar este
síndrome es el sobrepeso. Hasta principios y mediados del
siglo pasado se consideraba a la desnutrición como una de
las primeras cinco causas de mortalidad infantil9; aunado a
esto, otros trabajos señalan que la obesidad en nuestro país
se encuentra en franco ascenso ya que más de la mitad de
la población tiene sobrepeso y más del 15 % son obesos,
demostrando que esta tendencia se está acentuando entre
los niños. Esto se constata con los datos de la Encuesta
Nacional de Salud3, que registró que en mujeres de 20-59
años la prevalencia de sobrepeso y obesidad fue de 36%
y 28% y en los hombres de mismo del mismo grupo etáreo
fue de 41% y 19%. Una de las causas que permiten explicar
el fenómeno de sobrepeso y obesidad en la población
mexicana son los cambios demográficos, esto es que a
principios del siglo XX la población rural del país era del 75
al 80% y la urbana era de tan solo un 20 a 25%. Pero en
la mitad del mismo siglo la proporción se había invertido ya
que sólo un 20 % de la población continuaba habitando en
zonas rurales. Otros factores asociados a la presencia de
sobrepeso y obesidad son los relacionados con cambios
socioculturales, debido en gran medida, a la creciente
incorporación de nuestro país a un modelo económico
internacional, mismo que obliga a la población a adoptar
un nuevo estilo de vida poco saludable, ya que se advierte
una tendencia al sedentarismo y la adopción de patrones
de alimentación basados en el consumo de productos de
origen animal como fuente principal de proteína y productos
industrializados ricos en grasas y azúcares refinados, lo
que limita el consumo de alimentos con un aporte de fibra
digestiva como los vegetales y las frutas10.
Desde el punto de vista de Casanueva11 la dieta
de los mexicanos es en promedio equilibrada El
predominio de cereales y leguminosas, asi como el
consumo abundantes frutas y verduras acompañada
de pequeñas cantidades de alimentos de origen animal
la hacen mas recomendable que la comida industrial,
constituida principalmente por productos de origen
animal, cereales refinados y productos energéticos.
Sin embargo, actualmente existe en nuestra sociedad
una tendencia a la promoción de un nuevo concepto
de alimento y de dieta, fomentada principalmente por
la economía consumista y por diferentes instrumentos
publicitarios. Por último la creciente urbanización somete
a los individuos a un ritmo de vida acelerado limitando la
posibilidad de realizar actividades físicas que coadyuven
a mejorar su salud y calidad de vida.
cadenas hidrocarbonadas de entre cuatro y 36 carbonos.
Su clasificación se realiza de acuerdo al número
de carbonos y a la presencia o no de ligaduras entre
cadenas hidrocarbonadas. En algunos ácidos grasos,
la cadena se encuentra totalmente saturada, por lo que
se denominan ácidos grasos saturados; o bien, pueden
presentarse dobles ligaduras y se les llama ácidos grasos
insaturados. Son ejemplos de ácidos grasos saturados
el palmítico (16 átomos de C) y el esteárico (18 átomos
de C) que suelen ser sólidos a temperatura ambiente.
Los ácidos grasos insaturados los cuales tienen uno o
varios enlaces dobles, denominándose poliinsaurados,
están representados por el ácido oléico (18 átomos de
C y un doble enlace) y el linoléico (18 átomos de C y
dos dobles enlaces) suelen ser líquidos a temperatura
ambiente. Los mamíferos son capaces de sintetizar sus
propios ácidos grasos saturados y monosaturados, pero
no los poliinsaturados, por lo que estos últimos suelen
denominarse ácidos grasos esenciales o ácidos grasos
dietarios esenciales. Este tipo de ácidos grasos incluyen
a dos familias la familia n-6 cuyo precursor es el ácido
linoléico (18:2 n-6) y la familia n-3, en donde el precursor
es el ácido α linolénico (18:3 n-3)12. Los ácidos grasos
dietarios de la familia n-6 se encuentran principalmente
en las grasas vegetales como los aceites de maíz, girasol
y soya; están presentes también en carne y pescados,
pero en cantidades mínimas. Los ácidos grasos dietarios
de la familia n-3 se encuentran en animales marinos con
un elevado contenido de grasas13.
1.5.Características
conjugado
de
ácido
linoléico
La mayoría de los ácidos grasos poliinsaturados de
los tejidos animales tienden a distribuir sus dobles enlaces
guardando una distancia de 3 carbonos entre dos dobles
enlaces, existiendo un carbono intermedio que no participa
en ningún doble enlace como por ejemplo es ácido linoléico.
Sin embargo, en algunas circunstancias, asociado a
procesos de hidrogenación de los ácidos grasos, estos
dobles enlaces se pueden ubicar a una distancia de tan solo
dos carbonos, de tal manera que existen cuatro carbonos
consecutivos que participan en los dobles enlaces; a este
tipo de doble enlace se le denomina conjugado. El ejemplo
más claro de este tipo de ácido graso es el ácido linoléico
conjugado (CLA)14, término que generalmente refiere a una
mezcla posicional y geométrica conjugada de isómeros
diénicos del ácido linoléico. Los dos isómeros de CLA
más estudiados son cis-9, trans-11 y trans-10, cis-12; los
cuales se producen en el rumen de los rumiantes por la
biohidrogenación bacteriana de los ácidos linolénico y
linoléico. Se puede encontrar en otros alimentos como por
1.4. Ácidos grasos
Los constituyentes más abundantes de las grasas y
los aceites son los ácidos grasos, ácidos carboxílicos con
13
ejemplo granos, forrajes y aceites de origen vegetal, sin
embargo su cantidad es mínima15.
de 23°C. Después de una semana de aclimatación los
animales fueron divididos aleatoriamente en 3 grupos
experimentales; de las 16 ratas Wistar macho hipertensas
espontáneas (HSR) se formaron dos grupos. Al primer
grupo de ratas hipertensas espontáneas se le administró
una dieta de aceite de girasol 7.5%, y al segundo grupo
se le ofreció una dieta con (CLA) 7.5%. El grupo testigo
(KW) se integró por 10 ratas Kyoto Wistar machos
alimentadas con una dieta en aceite de girasol 7.5%.
Todos los animales recibieron la dieta y agua ad libitum
durante un período de ocho semanas (Tabla 2).
1.6. Aspectos biológicos del CLA
Las cualidades beneficiosas del CLA para la salud
han sido atribuidas principalmente a dos de los sus
isómeros: el cis9-trans 11 y el trans10-cis-12. La forma
más común de analizar los efectos biológicos del CLA
es utilizando los isómeros puros, aplicándolos a modelos
in vitro (cultivo de células) o in vivo en animales ó en
estudios clínicos en humanos16. La función biológica
del CLA y sus beneficios para la salud datan desde los
80´s, cuando Ha y colaboradores17 observan que éste
ácido inhibe el desarrollo de cáncer en la piel de ratones.
Este descubrimiento da pauta para que en estudios
posteriores se examine un efecto protector del CLA en
cáncer, modulación del sistema inmune, aterosclerosis,
asi como efectos antidiabéticos y antiobesidad.
Siendo la obesidad y la diabetes dos de los factores
de riesgo mas relevantes en el diagnóstico del síndrome
metabólico, se han diseñado estudios en modelos
animales que permiten analizar si el CLA ejerce algún
cambio beneficio en la salud de ratas que manifiestan
obesidad e hiperglicemia; sin embargo, se desconoce el
efecto por el consumo de CLA en tejidos histológicos de
ratas con síndrome metabólico. Por tanto el objetivo del
presente estudio fue determinar los efectos histológicos
del ácido linoléico conjugado dietario en riñón y encéfalo
de ratas con síndrome metabólico.
En base a los antecedentes se considera que el CLA
dietario tiene efecto benéfico sobre los tejidos de la aorta
e hígado en ratas con síndrome metabólico.
Tabla 2. Descripción de la dieta administrada a los
grupos experimentales
2.3. Procesamiento de las muestras
Al término de las ocho semanas de administrar las
diferentes dietas a los animales estos se sacrificaron por
punción cardiaca con el propósito de recuperar todos los
tejidos; la sangre se centrifugó a 1086xg por 10 minutos
para separar el suero mismo que se dividió en alícuotas
de 100µl, conservándose en tubos ependorff a -70°C.
El hígado y la aorta se retiraron para fijarse en dos
soluciones fijadoras; la mitad de los órganos de cada grupo
se fijaron en formol neutro al 10% y la otra mitad se fijó en
una solución formol 10% diluido en una solución al 2% de
acetato de calcio. Los órganos fijados en formol neutro se
incluyeron en parafina para obtener cortes de 4-6 micras
con ayuda de un micrótomo Minot (American Optical), y
posteriormente se tiñieron con la técnica de Hematoxilina
– eosina. Con los hígados y las aortas conservados en
formol 10% diluido en una solución al 2% de acetato de
calcio se realizaron cortes (12-15 micras) por congelación
en un criostato marca MICROM 505 y posteriormente se
procesaron con la técnica histoquímica de Aceite de Rojo
Oleoso, la cual es una técnica específica para lípidos19. La
observación e interpretación de los cambios histológicos
se realizó con un microscopio marca Olympus BX51
equipado con una cámara digital (Camedia C3040ZOOM,
2. METODOLOGÍA
2.1 Material
Todos los solventes y reactivos químicos fueron
grado analítico; los colorantes y reactivos se solicitaron a
Sigma (Mexico, DF.). Diez ratas macho de la cepa KyotoWistar (KW) y 16 ratas macho de la cepa hipertensas
espontáneas (SHR) junto con los ingredientes para la
dieta de estos animales se solicitaron a Harlan Teklad
(Madison, WI, USA).
2.2 Diseño experimental
Los 26 animales se conservaron en condiciones
de bioterio como lo describe la NOM. 062-ZOO-199918;
se ubicaron en jaulas de aluminio individuales con un
ciclo de luz obscuridad 12/12 hrs a una temperatura
14
Olympus America, Melville, NY). Cabe señalar que todas
las imágenes se tomaron con un aumento de 10X y 50X.
Figura 2. Efecto de diferentes dietas (Control, Aceite
de girasol y CLA) (d) Aorta en el grupo testigo (KW); (e)
evidencia de depósitos de lípido en la capa media(e),
(m) en el grupo vegetal (AG) y (f) ausencia de lípidos en
el endotelio (e) y capas media (m) y adventicia (a) en el
grupo CLA. Aceite de Rojo Oleoso 50X.
3. RESULTADOS
La tinción de H-E reveló en el tejido de la aorta del
grupo de animales que recibieron la dieta de aceite de
girasol una proliferación de fibras elásticas y de colágena
en las capas del endotelio y media, como se puede
apreciar en la Figura 1-b; Con la técnica de Aceite de
Rojo oleoso se evidenció en la aorta de este mismo grupo
de animales, depósito de lípidos en la capa adventicia,
(Figura 2-e). En el tejido hepático del grupo alimentado
con aceite de girasol, se evidenció inflamación lobulillar
y portal, caracterizada por un infiltrado inflamatorio
predominantemente de neutrófilos con algunos linfocitos,
macrófagos y con hepatocitos de forma globosa, (Figura 3
h-i). Del mismo modo se observó fibrosis, engrosamiento
del epitelio de la vena central hepática (esclerosis central),
hiperplasia hepatocitica y esteatosis caracterizada
por hepatocitos cargados de grasa, (Figura 4-l). Estos
hallazgos histológicos no se evidenciaron ni en el grupo
de animales alimentados con CLA, ni en el grupo testigo,
como se aprecia en las imágenes correspondientes a este
grupo de animales en las Figuras del 1- 4.
d
f
Figura 1. Efecto de diferentes dietas (Control, Aceite
de girasol y CLA) (a) Aorta en el grupo testigo (KW);
(b) evidencia de fibrosis en las capas del endotelio y
media(e), (m) en el grupo vegetal (AG) y (c) recuperación
del endotelio (e) y capas media (m) y adventicia (a) en el
grupo CLA. H-E 50X.
a
e
Figura 3. Efecto de diferentes dietas (Control, Aceite
de girasol y CLA) (g) vena porta (VP) y parénquima
hepático normal en el grupo testigo (KW); (h) evidencia
de infiltrado inflamatorio (II) y hepatocitos globosos (HG)
y (i) esteatosis en el grupo vegetal (AG) (j) vena porta
(VP) y recuperación del parénquima hepático en el grupo
CLA. H-E 50X.
g
h
i
j
b
c
15
ácido poliinsaturado beneficia la funcionalidad celular
y disminuye el estado de resistencia a la insulina22.
Esta aseveración, permite suponer la ausencia de un
proceso aterogénico y una recuperación de la aorta de
los animales enfermos alimentados con CLA. Asimismo,
Arzaba23 reportó en ratas hipertensas que el CLA provoca
cambios estructurales que influyen en las propiedades
fisicoquímicas de la membrana del adipocito mejorando
su fluidez y viscosidad. Estos cambios estructurales
de la membrana, también pudieron limitar la formación
del ateroma, en los animales del grupo CLA, como se
demuestra en las Figuras 1-c y 2-f. Aunado a lo anterior,
se ha demostrado que el consumo de CLA dietario
disminuye la presión arterial23, lo que sugiere que el CLA
participa en la regulación de la presión arterial y que ello,
repercute mejorando la disfunción endotelial.
Por otro lado, en la patogenia observada en el
parenquima hepático de los animales experimentales
alimentados con aceite de girasol (Figura 3 hi) caracterizada por un infiltrado inflamatorio
predominantemente de neutrófilo; se han propuesto
como factores etiológicos, un aumento en la oxidación
mitocontrial hepática de los ácidos grasos libres, asi como
un aumento del estrés oxidativo; este último proceso, se
caracteriza por secreción de las células inflamatorias
presentes en el parénquima hepático de óxido nítrico que
dilata la microvascularización y promueve la relajación
del músculo liso modificando el “tono” vascular de los
vasos sanguíneos que irrigan al hígado. Del mismo
modo promueve la peroxidación lipídica de la membrana
celular provocada principalmente por efecto de los
radicales libres de oxígeno24.
Otro factor etiológico es la resistencia a la insulina,
fenómeno en el que se observa una disminución en la
sensibilidad de la misma o bien, una disminución en la
respuesta a la acción de esta hormona4. Los resultados
obtenido por Riviello25, muestran que la administración
dietaria de CLA normalizar los niveles de insulina lo
que permite proponer un mecanismo alternativo para
la disminución de niveles de triglicéridos, debido a que,
al disminuir la insulina disminuye la esterificación de
los ácidos grasos libres en triglicéridos en el hígado.
Este fenómeno permite explicar la esteatosis en el
tejido hepático de los animales que recibieron la dieta
de aceite de girasol (Figuras 3-h i y 4-l). Del mismo
modo, la presencia de lípidos en el citoplasma de
los hepatocitos de los hígados del grupo alimentado
con aceite de girasol, pudo deberse a cambios en la
permeabilidad de la membrana plasmática, ya que si en
su composición predominan los ácidos grasos saturados
la permeabilidad es menor. Esto se ha logrado demostrar
al comparar la composición de los ácidos grasos de la
Figura 3. Efecto de diferentes dietas (Control,
Aceite de girasol y CLA.) (k) vena porta (VP) y cordones
hepáticos normales (CP) en el grupo testigo (KW); (l)
evidencia de esteatosis por depósitos de lípidos (L) en
el grupo vegetal (AG) (m) vena porta (VP), cordones
hepáticos (CP) y recuperación del parénquima hepático
en el grupo CLA. Aceite de Rojo Oleoso 50X.
k
l
m
4. DISCUSIÓN
Los cambios histológicas observados en la aorta de
los animales del grupo de aceite de girasol (Figuras 1 y
2), coinciden con lo descrito por Libby y colaboradores20,
quienes señalan que el crecimiento de tejido fibroso se
debe a un exceso de partículas de LDL que se acumulan
en la pared arterial promoviendo la diferenciación de los
monocitos en macrófagos, y la proliferación de fibras de
colágena, las cuales posteriormente, encapsularán a los
macrófagos atrofiados favoreciendo los depósitos de
grasa y la formación del ateroma.
Se ha reconocido que las células endoteliales
liberan óxido nítrico el cual, relaja las células musculares
de las paredes de los vasos, permitiendo que la sangre
fluya con mayor libertad21. Algunos lípidos como el
ácido araquidónico, regulan y reducen el óxido nítrico
propiciando un inadecuado tránsito de sustancias a
través del endotelio; esto, puede explicar la presencia de
los depósitos de grasa en el endotelio de la aorta de los
animales alimentados con aceite de girasol (Figura 2-e).
En años recientes se ha observado que la
administración de grasas poliinsaturadas, como el CLA
en la dieta de animales con SM mejora los parámetros
bioquímicos del colesterol y triglicéridos, ya que este
16
membrana de adipocitos de grasa epididimal en ratas
hipertensas espontáneas, a las que se les ofrecieron
dos dietas diferentes, una con aceite de canola y otra
a base de aceite de pescado rica en ácidos grasos
omega 326; en los animales que recibieron esta dieta
se observó un aumento en la composición de ácidos
grasos poliinsaturados en la membrana plasmática de
los adipocitos de la grasa epididimal, mejorándose su
permeabilidad; además, la misma dieta permitió por un
lado, normalizar la presión arterial y por otro, disminuir
los niveles de ácidos grasos libres. En otro estudio23 se
observó que el CLA también promovió un efecto similar
sobre la composición de ácidos grasos en las membranas
de células adiposas, mejorando con ello su permeabilidad
y fluidez. Estos resultados permiten suponer que en las
células del tejido hepático del grupo que recibió la dieta
de CLA se promovió un efecto semejante, impidiendo
con ello la formación de esteatosis Figuras 3-j y 4-m.
En este mismo sentido, estudios recientes a nivel
molecular establecen que existen reguladores de genes
que pueden ser activados por ácidos grasos dietarios27,
por lo que probablemente la ausencia de esteatosis en
el parénquima hepático del grupo CLA, puedo deberse
también a que genes reguladores lograron activarse
ante la presencia de ácidos grasos poliinsaturados;
sin embargo, es necesario continuar con futuras
investigaciones que permitan demostrarlo.
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5. CONCLUSIÓN
En el modelo animal con SM utilizado en este estudio
se evidenció por medio del análisis histológico que la
administración dietario del CLA mejora la disfunción
endotelial, reduce la esteatosis y la hiperplasia celular
en ratas con SM.
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18
Membrana plasmática adipocitaria y
acido linoleico conjugado (CLA)
Arzaba Villalba A.1, Hernández Díaz G.2, Alexander Aguilera A.3, Soto Rodriguez I.4, García Galindo H.5
1,2,5
3
Instituto Tecnológico de Veracruz, Miguel Ángel de Quevedo 2779 Col. Formando Hogar, CP.91879, Veracruz, Ver. [email protected]
Universidad Veracruzana, Facultad de Bioanálisis, Iturbide s/n esq. Carmen Serdán, Col. Centro CP. 91700, Veracruz, Ver. Escuela de Medicina,
Universidad Cristobal Colón. Campus Calasanz, Veracruz, Ver.
4
Universidad Veracruzana, Facultad de Bioanálisis, Iturbide s/n esq. Carmen Serdán, Col. Centro CP. 91700, Veracruz, Ver.
RESUMEN
plasmática como biomarcador de cambios dietarios como
dogma de la relación estructura-función de un organelo,
en este caso, un modelo animal de Síndrome Metabólico,
utilizando ratas hipertensas espontáneamente y el tejido
adiposo epididimal como material biológico para la
obtención de la membrana plasmática, la extracción de
los ácidos grasos y su análisis por cromatografía de gases
a partir de los cuales se establecieron las conclusiones
pertinentes del presente estudio.
El Síndrome Metabólico (SM) junto con sus
componentes como la Hipertensión y la obesidad
constituyen las primeras causas de muerte a nivel
mundial. El fenómeno fisiopatológico que determina las
manifestaciones clínicas del síndrome es la resistencia a
la Insulina (RI), que aparece años antes del síndrome.
Los mecanismos moleculares de la Resistencia a la
Insulina se llevan a cabo a diferentes niveles celulares
como son: la expresión génica, cascada de señalización
y cambios en la composición bioquímica de la membrana
plasmática de los tejidos bajo efectos dietarios.
Los cambios en la composición de la membrana
plasmática son utilizados como un biomarcador de efectos
dietarios como tratamiento alternativo del síndrome tanto
en animales como en humanos, esto se ha estudiado
con el aporte de ácidos de origen marino y de oliva pero
no del Ácido Linoléico Conjugado (CLA).
En base a lo anterior el presente trabajo tiene
como finalidad analizar el perfil de ácidos grasos de la
membrana plasmática de adipocitos de ratas con SM bajo
el efecto de CLA. Se obtuvieron cambios significativos
en la composición lipídica de membrana a nivel de ácidos
grasos y de manera particular el CLA en ratas alimentadas
con el mismo; aportando y contribuyendo al conocimiento
básico sobre los mecanismos moleculares de resistencia
celular a la insulina. Los resultados anteriores derivan
del trabajo de extracción de membrana plasmática de
tejido adiposo epididimal, extracción de ácidos grasos y
análisis por cromatografía de gases.
1.1 Síndrome Metabólico
Un síndrome es el conjunto de síntomas y signos
que en general se agrupan para definir un cuadro
clínico o una enfermedad. El síndrome metabólico es un
concepto clínico que se vincula fisiopatológicamente con
hiperinsulinemia por resistencia a la insulina, y cuyas
características clínicas se necesitan detallar ampliamente
para poder entender la complejidad de este síndrome.
El síndrome metabólico fue reconocido hace mas
de 80 años en la literatura médica y ha recibido diversas
denominaciones a través del tiempo1. Las primeras
descripciones de la asociación existente entre diversas
situaciones clínicas como la diabetes mellitus (DM), la
hipertensión arterial (HTA) y la dislipidemia (DLP) datan
de los años 20 del pasado siglo.2
Sin embargo, hace 15 años, Gerald Reaven describió
la asociación entre hiperinsulinemia y enfermedad
cardiovascular (ECV).3 Estos pacientes presentaban
lo que denominó síndrome X, formado por un conjunto
de alteraciones patológicas, destacando entre ellas la
intolerancia a la glucosa y la diabetes mellitus tipo 2,
hipertensión arterial y una dislipidemia caracterizada
por hipertrigliceridemia y niveles bajos de colesterol de
HDL (C-HDL)1. En los últimos años se han agregado
otros atributos: obesidad, visceroabdominal, aumento
de lipoproteínas LDL pequeñas y densas, hiperuricemia,
aumento del factor inhibidor del plasminógeno (PAI-1) y
del fibrinógeno, hiperandrogenismo y ovario poliquístico
en mujeres en edad fértil, hígado graso con esteatosis
no alcohólica, marcadores pro-inflamatorios y disfunción
endotelial (Fig. 1).4, 5
INTRODUCCION
En el presente trabajo de investigación se analizó
la composición lipídica de membrana plasmática de
adipocitos de ratas con síndrome metabólico bajo efecto
del Ácido Linoléico Conjugado como posible mecanismo
implicado en el desarrollo de resistencia celular a
la insulina, dada la importancia de este fenómeno
fisiopatológico en el desarrollo del Síndrome Metabólico.
Se abordan los aspectos teóricos de la membrana
19
y factores asociados al estilo de vida, especialmente la
sobrealimentación y la ausencia de actividad física; de
forma que el exceso de grasa corporal (particularmente la
abdominal) y la inactividad física favorecen el desarrollo
de resistencia a la insulina, así mismo algunos individuos
están genéticamente predispuestos a padecerla. 6,7
El interés por este síndrome esta dado
fundamentalmente por su asociación con la disminución
en la supervivencia, debido al aumento de el riesgo
de diabetes, ataques cardiacos y enfermedad
cerebrovascular.5
El incremento insidioso en los
elementos del SM, obesidad, insulinorresistencia (IR)
y dislipidemia, son los responsables de la actualmente
considerada epidemia mundial de diabetes tipo 2.8,9
Recientemente, el Instituto Nacional de Salud de
los EUA, a propósito del III Panel de Tratamiento del
Adulto (ATP III) del Programa Nacional de Educación
en Colesterol (NCEP) presentó una tercera versión de
las guías para el diagnóstico y atención de dislipidemias
donde, por primera vez se considera al SM como una
entidad separada y establece una definición clínica
basada en los factores de riesgo (Tabla 1) que resulta de
muy fácil aplicación tanto en estudios epidemiológicos
como en la práctica clínica diaria, pues a diferencia de
la definición del grupo de trabajo de la OMS no necesita
demostrar directamente la resistencia a la insulina.1
1.2 Criterios diagnósticos del SM
En 1998, un grupo consultor de la OMS propuso
que se denominara síndrome metabólico (SM) sugirió
una definición de trabajo que seria la primera definición
unificada del mismo, “regulación alterada de la glucosa
o diabetes y o resistencia a la insulina (definida como
una captación de glucosa por debajo del cuartel inferior
para la población en estudio, bajo condiciones de
hiperinsulinemia y euglucemia).1 Además, dos o más de
los siguientes componentes:
• Tensión arterial elevada (140/90 mmHg)
• Triglicéridos plasmáticos elevados (1, 7 mmol/L; 150
mg d/L) y/o colesterol
• HDL bajo< 0.9 mmol/L (35 mg d/L) en hombres; < 1.0
mmol/L, (39 mg d/l) en mujeres.
• Obesidad central ( relación cintura cadera > 0.90 para
hombres y > 0.85 para mujeres) y/o índice de masa
corporal (IMC) > 30 kg/m2.
• Microalbuminuria (excreción 20 μm/min o relación
albúmina: creatinina en orina 30 mg/g).
1.3 .Fisiopatología del síndrome metabólico
El avance en las técnicas de biología molecular
e inmunología ha permitido conocer los aspectos
fisiopatológicos
de
múltiples
enfermedades,
principalmente los eventos subcelulares a nivel citosol
y nuclear, así como la funcionalidad de receptores de
membrana involucrados en cascadas de señalización
que rigen la homeostasis celular.10
De esta manera, se considera al SM como una
constelación de factores de riesgo lipídicos y no lipídicos
que pueden aparecer de forma simultánea o secuencial
en un mismo individuo como manifestaciones de un
estado de resistencia a la insulina. No se trata de una
simple enfermedad sino de un grupo de problemas de
salud causados por la combinación de factores genéticos
1.4. Resistencia a la insulina
La resistencia a la insulina se define como una
condición caracterizada por una menor actividad
20
biológica de la hormona (insulina) que se expresa en sus
diferentes acciones metabólicas, siendo la más evidente
en el metabolismo de la glucosa. Esto se manifiesta
en órganos y tejidos como el hígado, tejido adiposo y
muscular y también en el endotelio.11
La resistencia a la insulina (RI) constituye un
rasgo temprano y fundamental dentro del grupo de
desordenes que han sido definidos como Síndrome
metabólico. Dicha resistencia es un rasgo común entre
la obesidad y la Diabetes Mellitus en los tejidos diana
de la insulina como el músculo esquelético. También
se ha observado resistencia a la insulina en personas
con antecedentes familiares de obesidad, hipertensión
arterial, Diabetes Mellitus y dislipidemias.11, 12
La insulina ejerce diversas acciones, principalmente
sobre el metabolismo de carbohidratos, de grasas y
de proteínas, participa en el desarrollo, diferenciación
y supervivencia celular e influye en el equilibrio
hidroelectrolítico y en la función endotelio.12
Este grupo se encuentra constituido por al menos siete
proteínas transmembrana homólogas denominadas
GLUT-1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 que se encuentran codificadas
por distintos genes. Las proteínas Glut tiene distinta
especificidad de sustrato, propiedades cinéticas y
distribución en los tejidos, lo que da origen a diferentes
funciones.11, 13
El Glut 4 es el principal transportador de glucosa
estimulado por insulina y se encuentra localizado
principalmente en las células musculares y adipocito.10
La reducción en el consumo de glucosa estimulado por
insulina en el músculo esquelético de sujetos obesos y
en aquellos con diabetes, se encuentra asociada con un
deterioro en el movimiento de Glut 4 de las vesículas
intracelulares a la membrana plasmática.14, 15, 16
1.4.3. Patogenia de la resistencia a la insulina
Un posible mecanismo de producción de la
resistencia a la insulina es la mutación del receptor de
insulina, fenómeno bastante raro que determina algunos
síndromes genéticos específicos.16
Más frecuentes son los defectos de los
transportadores de glucosa, como la disminución del Glut
4, y las alteraciones de la fosforilación, que pueden ocurrir
tanto en el receptor como en los sustratos intracelulares.
Cabe señalar que en el problema de la resistencia a la
insulina se comprometen las vías metabólicas, no las
vías mitogénicas.14 Actualmente se han descrito nuevos
mecanismos que estarían participando en la resistencia
a la insulina. Uno de ellos es la acción de algunos
factores o moléculas que actuarían sobre la fosforilación
del receptor de insulina, como el factor de necrosis
tumoral (TNF), que actuaría sobre la fosforilación de
los receptores intracelulares, de tal manera que en vez
de fosforilarse el residuo tirosina se fosforila un residuo
serina. Se ha demostrado que el TNF está aumentado
en el suero de personas resistentes a la insulina,
diabéticos tipo II o portadores de obesidad androide,
los que además tienen una mayor expresión del TNF
en su tejido adiposo. Por otra parte, se ha descrito que
algunos polimorfismos del TNF se asocian con una
menor sensibilidad a la acción de la insulina.14, 15 Otro
problema fisiopatológico del paciente insulinorresistente,
que ocurre principalmente en los obesos, es el aumento
del nivel de ácidos grasos libres provenientes de la
lipólisis aumentada del tejido adiposo intraabdominal o
visceral. Este aumento de los ácidos grasos produce
resistencia a la acción de la insulina a nivel muscular,
lo que se traduce en una disminución de la síntesis del
glicógeno y, por otra parte, determina un aumento de la
secreción de insulina en la célula beta como mecanismo
1.4.1. Sitios celulares de resistencia a la
insulina
Los sitios celulares potenciales como causantes
de resistencia a la insulina se pueden agrupar en dos
categorías: los relacionados con alteraciones en el sistema
activador del transporte de glucosa, y alteraciones en el
receptor de insulina y de la cascada de señalización que
se origina a partir de su autofosforilación. Recientemente
se ha implicado al receptor FAT/CD36 en el desarrollo de
resistencia a la insulina tanto en modelos animales como
en humanos. 12
1.4.2 .Mecanismos de resistencia a la insulina
La insulina inhibe la secreción de glucógeno y
disminuye la concentración sérica de los ácidos grasos
libres, que contribuyen a una disminución brusca de la
producción hepática de glucosa. Debido a que los lípidos
conforman la membrana celular son impermeables a los
carbohidratos, se requiere de un sistema de transporte
transmembranal de carbohidratos. Hasta el momento
se han clonado dos familias moleculares distintas de
transportadores celulares: una de glucosa y otra de
hexosas, como fructuosa y lactosa. 11, 13
Los transportadores de glucosa están acoplados
a sodio y se encuentran restringidos al intestino y al
riñón, donde transportan glucosa activamente contra un
gradiente de concentración por medio del cotransporte
del sodio que utilizan como sustrato energético. El otro
grupo de transportadores ejerce su función por difusión
facilitada bajo un gradiente de concentración de glucosa.
21
compensatorio a la resistencia periférica. Si esta
situación se perpetúa en el tiempo, la gran resistencia
que se produce en la periferia provoca la claudicación
de la célula beta y aparece la intolerancia a la glucosa y,
posteriormente, la diabetes tipo II.15 Desde el punto de
vista molecular, hay un aumento del malonil-CoA, que en
condiciones fisiológicas aumenta como un mecanismo
de defensa frente a situaciones de privación prolongada
de nutrientes, con el fin de obtener energía a partir de
la oxidación de los ácidos grasos libres y disminuir la
oxidación de la glucosa, para preservar el aporte de ésta
al sistema nervioso central. Se ha observado que en los
obesos ocurre este mismo mecanismo, aun en presencia
de una ingesta adecuada de nutrientes, y que el aumento
de malonil-CoA no se inhibe con los niveles de glucosa
y de insulina aumentados, lo que finalmente perpetúa el
aumento de los niveles de ácidos grasos libres.16, 17
que se presenta con marcada resistencia a la insulina y
conduce al desarrollo de diabetes mellitus tipo II.19
Numerosos estudios establecen la asociación que
existe entre el sobrepeso, la obesidad y la resistencia
a la insulina; sin embargo, se ha observado que las
alteraciones en el metabolismo de carbohidratos son
reversibles con la perdida de peso, aunque se sabe que
la obesidad está asociada directamente al desarrollo de
diabetes mellitus tipo II.18, 19
1.5. Diabetes mellitus, obesidad e hipertensión
En la composición química de la membrana
plasmática se encuentran lípidos, proteínas y glúcidos
en proporciones aproximadas de 40%, 50% y 10%
respectivamente .22
1.6. Membrana plasmática
La célula está rodeada por una membrana, denominada
membrana plasmática, la cual delimita el territorio de la
célula y controla el contenido químico de esta.20, 21
1.6.1. Composición química
La asociación que existe entre hiperinsulinemia
y presión sanguínea varía dependiendo de distintos
factores, y aunque esta asociación tiene un componente
genético, sus manifestaciones varían dependiendo del
grupo étnico que se trate. Estudios longitudinales con
individuos normotensos, prehipertensos, y en hijos de
pacientes hipertensos, tratan de explicar la inherte pérdida
de la sensibilidad a la insulina y el aumento de la presión
sanguínea. Existen diversos factores cardiovasculares
y metabólicos que relacionan a la hiperinsulinemia con
la hipertensión; desde el punto de vista cardiovascular
interviene el gasto cardiaco y la resistencia cardiovascular,
y desde el punto de vista metabólico se tienen los niveles
séricos de glucosa e insulina. Se han propuesto algunos
mecanismos para explicar cómo algunas alteraciones
fisiológicas influyen sobre el aparato cardiovascular, que
pueden ser los cambios estructurales y/o funcionales
en la vasculatura, la estimulación del sistema nervioso
simpático y el transporte de iones intracelulares.13, 18
En pacientes con hipertensión, la elevación de la
insulina o la disminución en la sensibilidad a esta hormona
indica la presencia de un conjunto de anormalidades
que frecuentemente se acompañan de intolerancia a
la glucosa, elevación de triglicéridos, disminución de
los niveles de colesterol-HDL, aumento de LDL densas
pequeñas séricas, elevación del factor 1 inhibidor del
plasminógeno (PAI-1), microalbuminuria, y niveles altos
de Sodio y Litio; cada una de estas anormalidades son
factores de riesgo para el desarrollo de enfermedad
cardiovascular aterosclerótica.18 Por otro lado, la
obesidad se considera como uno de los desórdenes
orgánicos más importantes del síndrome metabólico,
1.6.2. Lípidos
Podemos encontrar tres tipos de lípidos: fosfolípidos,
glucolípidos y colesterol. Todos tienen un carácter anfipático;
es decir, que tienen un doble comportamiento, parte de la
molécula es hidrófila y parte de la molécula es hidrófoba
por lo que forman una bicapa lipídica. La membrana
plasmática no es una estructura estática, sus componentes
tiene posibilidades de movimiento y fluidez.
Los movimientos que puede realizar son: rotación
(sobre su propio eje), de difusión lateral (longitudinal),
flip flor (de una monocapa a otra) y de flexión (producidos
por colas hidrófobas de fosfolípidos).20
La fluidez es una de las característicos más
importantes de la membrana y depende principalmente
de factores como la naturaleza de los lípidos, la presencia
de lípidos insaturados y de cadena corta (Figura 4);por
el contrario la presencia de colesterol endurece las
membranas, reduce su fluidez y permeabilidad.20, 21
1.6.2.1.Ácidos
esenciales
grasos
poliinsaturados
Los ácidos grasos son compuestos orgánicos que
juegan un papel fundamental en el desarrollo del síndrome
metabólico22. Pueden ser saturados e insaturados, estos
últimos tienen en su estructura dobles enlaces. Los
ácidos grasos insaturados se clasifican a su vez, en
monoinsaturados y poliinsaturados. Los ácidos grasos
22
poliinsaturados (AGPI) se definen como aquellos ácidos
que contienen dos o más dobles ligaduras.22
En los mamíferos, los AGPI se clasifican en dos
grandes categorías, los esenciales y los no esenciales.
Los AGPI esenciales son aquellos que deben ser
ingeridos en la dieta, ya que no pueden ser sintetizados
a partir de otros precursores carbonados en los sistemas
celulares. A esta categoría pertenecen los ácidos grasos
linoléico (18:2 n-6) y alfa-linoléico (18:3 n-3). 21
Los ácidos grasos poliinsaturados esenciales
incluyen a dos familias de ácidos grasos: la familia n-6,
cuyo precursor es el ácido linoléico (18:2 n-6), y la familia
n-3, en donde el precursor es el ácido alfa linoléico
(18:3 n-3). En los AGPI n-3, la primera doble ligadura
se localiza en el tercer carbono a partir del grupo metilo
Terminal de la cadena hidrocarbonada, y en los n-6,
se localiza en el sexto carbono. Estas dos familias son
interconvertibles entre sí, lo que le confiere a cada una
un carácter y funciones especificas. 22
carcinógenas mutantes en la carne durante la cocción.
Por accidente M. Pariza encontró una sustancia en la
grasa de la carne que contrarrestaba el cáncer. Esta
fue identificada como ácido linoléico conjugado (CLA)
y consisten en isómeros posicionales y geométricos de
ácido linoléico.25, 27
El Ácido Linoléico Conjugado (CLA) es un ácido
graso esencial formado por varios tipos de ácidos grasos
todos ellos con estructura química semejante(López
Bote 2004). Se cataloga al CLA como una mezcla de
isómeros del ácido linoléico (cis 9, trans 11 y trans 10,
cis 12) (Fig. 5). El termino conjugado se refiere a que
los dobles enlaces se encuentren separados por un
solo átomo de carbono, al que están unidos por enlaces
simples.25, 26
1.6.3. Proteínas
Las proteínas de la membrana se encuentran
entre las moléculas de los fosfolípidos y de manera
selectiva permiten el transito de sustancias a través de
la membrana plasmática.24
La selectividad de los canales de las proteínas
le permite a la célula controlar la salida y entrada de
sustancias así como los transportes entre compartimientos
celulares. Las proteínas de la membrana además
de ser selectivas utilizan el transporte activo para la
transporte tanto de iones como de otras biomoleculas .
Así mismo pueden presentarse proteínas integrales que
atraviesan la bicapa lipídica o proteínas periféricas que
se encuentran uniendo proteínas localizadas tanto en el
citosol como en el medio extracelular.22
1.7.1. Fuentes de CLA
El CLA es producido por la flora gastrointestinal
de los rumiantes, a partir de ácido linoléico. En el ser
humano y algunos mamíferos también se produce, pero
en muy pequeñas cantidades en el hígado a partir del
ácido linoléico.26, 27
El CLA se encuentra en pocas proporciones en
los aceites vegetales, mientras que su concentración
es particularmente alta en la carne de los animales
rumiantes así como su leche y derivados.28, 29
1.6.4. Glúcidos
1.7.2. Propiedades del CLA
Se sitúan en la superficie externa de las células
eucariotas por lo que contribuyen a la asimetría de la
membrana. Estos glúcidos son oligosacáridos unidos a
lípidos (glucolípidos), o a las proteínas (glucoproteínas).
Constituyen la cubierta celular o glucocálix que protege
las células de posibles lesiones, presenta propiedades
inmunitarias e intervienen en los procesos de adhesión
entre el óvulo y el espermatozoide.20
En 1990 se publicó por primera vez información
relacionada con los posibles efectos benéficos del CLA
obtenido de la leche de vaca. Se le atribuyen efectos
sobre el peso corporal, reduciendo la masa de grasa total;
reduce los niveles de colesterol (LDL y HDL) así como
los triglicéridos; eleva el potencial del sistema inmunitario
y tiene efectos antioxidantes ya que posee una gran
capacidad para captar radicales libres.30, 31, 32 Se han
realizado estudios similares utilizando como unidades
de investigación a ratas, ya que el comportamiento,
anatomía y fisiología es similar al de los humanos.
1.7. Ácido linoléico conjugado (CLA)
A fines de la década de los 70, científicos de la
universidad de Wisconsin investigaban formaciones
23
1.8. Ácidos grasos
omega 3
incluye a todas las clases de lípidos, especialmente a las
VLDL. Existen tambien otros modelos experimentales
de ratas diabéticas, como las ratas SHHF7/Mcc-fa, o la
cepa no obesa BHE/cdb.35
Se encuentra en los pescados grasos como el
salmón, en la soya, las nueces, los caracoles de tierra,
los higos y en las verdolagas, un vegetal similar a las
acelgas. 33 El Ácido graso ω-3 se destaca su intervención
en la formación de las membranas de las células;
conforman la mayor parte de los tejidos cerebrales
siendo que las células nerviosas son ricas en ácidos
grasos Omega-3; y se convierten en prostaglandinas,
sustancias con un papel importante en la regulación de
los sistemas cardiovascular, inmunológico, digestivo,
reproductivo y que tienen efectos antinflamatorios.34
Los ácidos grasos omega 3 tienen un efecto
protector cardiovascular variable, pero está claro que
previenen las arritmias, ya que un corazón con células
ricas en ácidos grasos omega 3 es mucho más estable,
en términos eléctricos, y soporta mejor un infarto agudo
de miocardio.18 Además, mejoran la vasodilatación,
ya que disminuyen la producción de elementos
vasoconstrictores como el tromboxano 2, mejoran la
función endotelial, probablemente por la producción de
óxido nítrico, y disminuyen la secreción de VLDL. Tal
vez no disminuyan el número de partículas, pero sí la
cantidad de triglicéridos que ellas contienen.28
1.10 Ratas Kyoto-Wistar
Las ratas Kyoto-Wistar son albinas normales, es
decir, sin hipertensión, sin componentes del SM se
utilizan como testigo sano de las ratas hipertensas
expontneamente.19
METODOLOGIA
1.9. Ratas hipertensas espontáneamente (HSR)
Las ratas utilizadas para el estudio experimental
de síndrome metabólico son ratas hipertensas
espontáneamente, derivadas de la cepa KyotoWistar, que son un modelo de síndrome metabólico
con hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, obesidad
abdominal e hipertensión sistólica (> 200 mmHg),
además de la intolerancia a la glucosa y resistencia a la
insulina.19
Recientemente se identificó una delección en
el gen que codifica para el receptor/transportador de
ácidos grasos FAT/CD36 de membrana plasmática de
adipocitos en estos roedores hipertensos, y se observó
que se encuentra asociado con el conjunto de signos y
síntomas que caracterizan al síndrome metabólico.35
Existen otros modelos experimentales de ratas
que presentan hipertensión, hipertrigliceridemia e
hiperinsulinemia como las ratas Dahl sensibles a la sal,
la cepa de ratas hipertensas Milan (MHS), que presentan
elevaciones en los niveles plasmaticos de insulina,
triglicéridos y colesterol, y desarrollan hipertensión por un
defecto en la reabsorción de Sodio; la rata obesa Zucker
(OZR) es un modelo de obesidad, resistencia a la insulina
e hiperinsulinemia caracterizadas por hiperlipidemia que
.
Peso corporal
El peso corporal se determinó semanalmente en una
bascula de la marca OHAUS, inmovilizando a los roedores
en un cilindro de acrílico para evitar interferencias en la
lectura del peso.
24
Administración de la dieta experimental
Magnesio y se centrifugó a 16 000 rpm durante 10 min a
4° C., el sobrenadante fue desechado, y el precipitado se
almacenó a -70° C. 35
Los roedores fueron distribuidos en cuatro grupos:
el grupo testigo que recibió una dieta a base de aceite
de girasol (7.5%), y agua para beber; el segundo grupo
denominado hipertensas, que recibió la misma dieta que
el testigo sano con aceite vegetal; el tercer grupo bajo
la dieta a base de Acido Linoléico Conjugado (Girasol
6.0% y CLA 1.5%) y el cuarto grupo bajo dieta de aceite
de pescado (omega-3 7.5%) (figura 8). Las dietas se
prepararon de acuerdo a la composición indicada en la
tabla 2, conteniendo un 7.5% de lípidos, utilizándose
aceite de girasol para dos modelos experimentales
(Kyoto Wistar y SM), ácido linoléico conjugado (SM) y
aceite de pescado (SM).
Extracción de lípidos de membranas celulares
Los lípidos de las membranas celulares se extrajeron
por el método de Folch. Las membranas celulares
precipitadas fueron descongeladas y resuspendidas
con una minima cantidad de amortiguador Tris-cloruro
de magnesio pH 7.5. A 1 ml de la preparación de
membranas se le adicionó 16 ml de la mezcla de Folch
(Cloroformo-metanol 2:1 v/v). Después se agitó 1 min en
vortex. Se añadió 3ml de cloruro de sodio 0.73% y se
volvió a agitar en vortex 1 min, se centrifugó a 16 000
rpm a 4° C durante 20 min. Se recuperó la fase inferior
en la cual se ubican los lípidos. A la fase recuperada se le
adicionaron 7.5 ml de una mezcla de cloroformo-metanolCloruro de sodio 0.73% (3:48:47 v/v/v), con el fin de
eliminar lastrazas de proteínas. Se agitó vigorosamente
con vortex durante un minuto y se dejó separar a 4°C
durante 4 hr. La fase superior fue desechada, y la fase
inferior fue filtrada a través de sulfato de sodio anhidro,
colocado en un embudo de vidrio con un papel filtro
Watman, con la finalidad de eliminar impurezas y restos
de agua. El filtrado fue recuperado en un matraz de bola,
llevado previamente a peso constante, y evaporado al
vacío en un rotavapor a 30°C, y posteriormente con flujo
de nitrógeno. La diferencia en el peso del matraz vacio
y después de la evaporación se usó para calcular la
cantidad de lípidos extraídos.35
El extracto fue resuspendido con cloroformo (BHT
0.02%) en una proporción de 10 mg de lípidos por ml de
cloroformo, y conservados a -20°C para su utilización.
Obtención de membranas celulares de tejido
adiposo
El tejido adiposo que se obtuvo de las ratas fue
pesado, cortado en pedazos pequeños y homogenizado
en un homogenizador de vidrio con pistilo de teflón, sobre
hielo, adicionado con un amortiguador de Bouskella Ringer-Tris pH 7.4 (NaCl 120 mM, CaCl 1.4 mM, KCL
5.2 Mm MgSO4 1.4 mM, Tris 5 Mm) a 4° C.
El homogenizado fue filtrado a través de dos capas
de gasa, y centrifugado a 40 000 rpm durante 40 min.
a 4° C. El sobrenadante y la capa de grasa formada
serán desechadas, y el precipitado se resuspendio, con
la ayuda del pistilo de teflón, en 5 ml de amortiguador
Krebs-Ringer ph 7.4 y 125 ml de Percoll. centrifugar a 16
000 rpm 15 min a 4° C. y se recupero la capa blanca de
la interfase, donde se localizan las membranas celulares.
Esta fue diluida con amortiguador de Tris-Cloruro de
25
Composición de ácidos grasos de los lípidos
totales de membrana plasmática de adipocitos
Análisis estadístico
Se realizó análisis estadístico de varianza (ANOVA),
utilizando la prueba de rango múltiple de Tukey (para
estimar la diferencia significativa entre medias, para
cada grupo y cada parámetro medido) con una p< 0.05
por medio de un software estadístico (MINITAB 4.2). A
cada grupo experimental se le practicó el ANOVA para
compara si existe una diferencia significativa entre
un grupo y otro, y poder así observar si el CLA tuvo
un efecto favorable sobre los parámetros sanguíneos
característicos del síndrome metabólico.
La composición de ácidos grasos de los lípidos
totales fue analizada por medio de cromatografía de
gases, previa metilación de los mismos.
Metilación de ácidos grasos
Para el análisis cromatogáfico los ácidos grasos
se transmetilaron con ácido sulfúrico, a las muestras
resuspendidas en cloroformo (BHT 0.02%) se les adicionó
3 ml de H2SO4 al 2% en metanol y 0.5 ml de benceno,
antes de la incubación a 90°C durante una hora.
La extracción de los ácidos grasos metilados se
realizó con hexano y agitación vigorosa con flujo de
nitrógeno, el producto de la extracción se resuspendió
en 0.5 ml de cloroformo y se almacenó a -20°C.35
RESULTADOS
A continuación se detallan los resultados obtenidos
de la determinación de la composición lipídica de
membrana plasmática de adipocitos de ratas con
síndrome metabólico bajo el efecto del acido linoléico
conjugado (CLA) dietario.
Se determinó la composición de ácidos grasos
saturados (AGS), ácidos grasos monoinsaturados (AGMI)
y ácidos grasos polinsaturados de dos tipos omega 6 y
omega 3 (AGPI n-3 y n-6) y finalmente el contenido de
acido linoléico conjugado total así como del isomero cis9, trans-11 y el trans-10, cis-12.
Todos los resultados obtenidos en el grupo
experimental (CLA) fueron comparados con respecto
al grupo testigo sano (KW), grupo aceite de pescado
(AP) y un grupo testigo enfermo (AV); lo cual permitió
establecer los cambios en la composición lipídica de
manera particular ácidos grasos, como un biomarcador
celular de efectos dietarios.
No se encontraron diferencias estadísticas
significativas en el contenido de ácidos grasos saturados
entre los grupos: experimental recibiendo el aporte de
Cromatografía de gases
Los esteres metílicos fueron separados por medio
de cromatografía de gases, e identificados por la
comparación de sus tiempos de retención con los de los
estándares puros metilados, a partir del cual se obtuvo
el porcentaje de cada ácido graso encontrado. El grupo
testigo determinó los valores de referencia.
Se utilizó un cromatógrafo de gases marca Hewlett
Packard modelo 6890 equipado con una columna capilar
tipo Carbowax con una longitud de columna de 30 m y un
detector de ionización bajo las siguientes condiciones:
Temperatura de inyección de 250°C, temperatura del
detector de 250°C, hidrógeno como gas acarreador,
programación de la temperatura de la columna de 100
°C a 210 °C a una velocidad de 2°C/min, longitud de la
columna: 30 m, tiempo de 90 min.
26
Ácido linoléico conjugado (CLA) con respecto al testigo
sano, grupo enfermo (AV) y aceite de pescado (AP)
manteniéndose una proporción semejante de los ácidos
palmítico y esteárico encontrados en mayor proporción.
Sin considerar que se encontraron fracciones mínimas
pero presentes de acido mirístico, pentadecánoico,
heptadecánoico y araquídico (Tabla 3).
En relación a los ácidos grasos monoinsaturados
(AGMI) se encontró diferencia significativa en el contenido
total de ellos en el grupo recibiendo el aporte de acido
linoléico conjugado el cual mostró una menor proporción
con respecto al testigo sano (KW) y enfermo (AV), es
importante destacar que los cambios en la composición
de ácidos grasos correspondió en este caso al acido
oleico, como principal acido graso monoinsaturado,
encontrándose en proporciones menores el acido
palmitoleico y el acido nervónico (Tabla 4).
En relación a los ácidos grasos poliinsaturados
(AGPI) se analizó la determinación de la composición de
los ácidos grasos omega 6 y de los omega 3. en cuanto
a los ácidos grasos poliinsaturados omega 6 se encontró
una menor incorporación en el grupo CLA en proporción
similar al grupo testigo mientras que el grupo testigo
enfermo mostró una marcada elevación de este tipo de
ácidos grasos. Los ácidos grasos omega 6 encontrados
en mayor proporción en estos grupos correspondió al
acido linoléico y al acido araquidonico (Tabla 5).
Por otro lado se analizó la composición del otro
tipo de ácidos grasos poliinsaturados en este caso
omega 3 (AGPI n-3) encontrando una disminución poco
significativa de omega 3 en el grupo de ratas recibiendo el
aporte de acido linoléico conjugado con respecto al grupo
testigo sano (KW), aceite de pescado (AP) y enfermo
(SM). Las fracciones encontradas en baja proporción
correspondieron al linolénico, acido eicosapentaenoico
(EPA) y docosahexaenoico proveniente del aceite de
pescado aportado (Tabla 6).
Analizando el total de ácidos grasos poliinsaturados
(AGPI) se encontró una disminución significativa en el
total de ellos, considerando omega 6 y omega 3 en el
grupo recibiendo CLA, mientras que el grupo testigo
enfermo mostró un aumento significativo de los mismos
con respecto al grupo testigo (Tabla 7).
Realizando un análisis del contenido de ácidos
grasos tanto saturados (AGS) monoinsaturados
(AGMI) y poliinsaturados (AGPI) totales, se encontró
mayor incorporación de grasa saturada seguida de
la poliinsaturada y finalmente grasa monoinsaturada
(grafico 1).
Finalmente, se analizó la incorporación del acido
linoléico conjugado total derivado de la determinación
de los isomeros cis-9, trans-11 y trans-10, cis-12
obteniéndose una incorporación significativa con respecto
al grupo testigo sano (KW), dieta de pescado (AP) y
enfermo (AV), los cuales no mostraron incorporación
como era de esperarse de este ácido (Tabla 8).
27
KW
AV
CLA
AP
clínicas como la obesidad, la hipertensión y los accidentes
cerebrovasculares, constituyen las primeras causas de
muerte a nivel mundial y en nuestro país. El fenómeno
fisiopatológico que determina las manifestaciones clínicas
del síndrome se conoce como resistencia celular a la insulina,
el cual aparece muchos años antes que el síndrome.1, 8 Este
mecanismo fisiopatológico corresponde a una serie de
eventos moleculares que se llevan a cabo a diferentes niveles
celulares como son la regulación de la expresión génica,
la cascada de señalización celular, manifestaciones de
Así mismo, en el modelo murino que recibió el aporte
de CLA se encontró mayor incorporación del isomero
cis-9, trans-11 tres veces mas que el isomero trans-10,
cis-12 del ácido linoléico conjugado (CLA).
DISCUSION
El síndrome metabólico junto con sus manifestaciones
28
respuesta inflamatoria celular, así como también los cambios
en la estructura molecular de los organelos celulares y de
manera particular la composición lipídica de la membrana
plasmática de diferentes tejidos, principalmente aquellos
implicados en la resistencia a la insulina como lo son el tejido
adiposo, el muscular y el hepático.
En el presente trabajo se evaluó el efecto del acido
linoléico conjugado dietario sobre la composición lipídica de
membrana plasmática de tejido adiposo como un biomarcador
y por lo tanto de un posible mecanismo molecular implicado
en la reversión del fenómeno fisiopatológico de resistencia a
la insulina a nivel celular por efectos dietarios del CLA.
En el presente diseño experimental se encontró que
las ratas hipertensas espontáneas (SM) recibiendo el aporte
de CLA mostraron cambios en su composición lipídica de
membrana, indicando la relación directa en la ingesta del
ácido y la estructura molecular del organelo, teniéndose una
incorporación de 24.68% de CLA (Tabla 6) en comparación
con ácidos grasos saturados (Tabla 1), de 47.55% en
comparación con ácidos grasos monoinsaturados (Tabla 2)
y 35.72% en comparación con ácidos grasos poliinsaturados
(Tablas 3 y 4). Lo anterior muestra claramente la presencia del
acido linoléico conjugado proveniente de la ingesta dietaria
indicando que los cambios estructurales necesariamente
influirán en las propiedades fisicoquímicas de la membrana
como: la fluidez y la microviscosidad, las cuales están
relacionadas con las funciones celulares de receptores como
la insulina y Glut 4 de la célula.
El grupo experimental antes detallado muestra
variabilidad a su vez en el contenido de grasa saturada,
monoinsaturada y poliinsaturada, teniéndose una disminución
de 46.67% de grasa monoinsaturada con respecto a la
saturada y una disminución de 30.91% de la poliinsaturada
con respecto a la saturada (Grafica 1).
Las variaciones anteriores en la composición de los
ácidos grasos de membrana son muy similares al del
grupo control sano exceptuando la nula presencia de
CLA, encontrándose una disminución de 43.18% de grasa
monoinsaturada con respecto a la grasa saturada y una
disminución de 31.81% de grasa poliinsaturada con respecto
a la grasa saturada.
Los resultados anteriores varían en la incorporación
de ácidos grasos poliinsaturados tanto en el grupo testigo
enfermo como en el grupo recibiendo el aporte de aceite de
pescado en el cual incorpora mayor proporción de ácidos
grasos omega 3 con el ácido eicosapentanoico (EPA) y
docosahexaenoico (DHA) que al igual que el grupo testigo
sano mantuvo a las ratas sin síndrome metabólico, debido
a que los ácidos grasos omega 3 tienen un efecto protector
cardiovascular variable, previenen las arritmias, ya que un
corazón con células ricas en ácidos grasos omega 3 es mucho
más estable, mejoran la vasodilatación, ya que disminuyen
la producción de elementos vasoconstrictores como el
tromboxano 2, mejoran la función endotelial, probablemente
por la producción de óxido nítrico, y disminuyen la secreción
de VLDL.1
CONCLUSIONES
La membrana plasmática de adipocitos de ratas con
síndrome metabólico responde a los efectos dietarios de
la administración de CLA:
1.- Incorporándolo como parte de la composición lipídica
de este organelo
2.- Reflejando la relación directa de la ingesta de una
dieta con la estructura molecular de un organelo
3.- Sugiriendo que el cambio en la estructura molecular
de membrana conlleva un cambio en la funcionalidad
de la misma (fluidez y microviscosidad) que pudiera
estar reflejado con el evento fisiopatológico de la
resistencia celular a la insulina.
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hypertension, plasma lipids, and tumor necrosis factor-α
in rats with sucrose-induced metabolic syndrome. J. Nutr.
Biochem. 2004
30
Presencia de Trypanosoma Cruzi en localidades
rurales del Municipio de Tezonapa; Veracruz
Guzmán-Gómez Daniel1, Torres-Morán Arturo1, Pérez-Yepez Eloy Andres1, Morán-Utrera
Yadira1, 2, Torres Montero Jesús1, 2, López-Monteon Aracely1, 2 y Ramos-Ligonio Angel.1, 2
1
Estudiantes de la Licenciatura. Programa educativo de Químico Farmacéutico Biólogo. Facultad de ciencias Químicas, Universidad Veracruzana.
LADISER Inmunología y Biología Molecular. Prolongación de Oriente 6 Mo. 1009 Col. Rafael Alvarado, CP. 94340. Orizaba, Ver.
2
Estudiantes de Posgrado. Instituto de Ciencias de la Salud. Doctorado en Ciencias Biomédicas-UV. Avenida Luis Castelazo s/n Col. Industrial
Ánimas CP. 91190. Xalapa, Ver.
1,2
Profesores de Tiempo Completo Titular “C”. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad VEracruzana. LIDISER Inmunología y Biología
Molecular. Prolongación de Oriente 6 Mo. 1009 Col. Rafael Alvarado, CP. 94340. Orizaba, Ver.
Antecedentes
infectados naturalmente por T. cruzi.8, 9 Estudios recientes
encaminados a la infestación de domicilios en zonas
rurales por vectores de la enfermedad de Chagas 10, 11 o
estudios basados en la determinación de anticuerpos antiT. cruzi en zonas rurales, 12-15 no reflejan la situación actual
de la epidemiología de la enfermedad ni de la presencia y
distribución de los vectores en el país.
Para identificar a los insectos triatominos que son
portadores del parásito, muchos autores opinan que la
técnica de PCR en donde se amplifica minicírculos de
DNA, es mucho más sensible que otras ocupadas para la
identificación del parásito 16. Estos minicírculos, junto con
los maxicírculos son estructuras del cinetoplasto. El cual
constituye una red de DNA extranuclear localizada en un
punto específico de la mitocondria. Esta red representa
una proporción importante del DNA total celular, ya que,
dependiendo de la especie, puede contener del 10-20%
del DNA total en la célula.
Los minicírculos forman la mayor parte de la
estructura. Como su nombre lo indica, son moléculas
circulares de DNA con una longitud de 100- 2,500 pb,
estos se encuentran organizados dentro de 4 regiones
conservadas de 120 pares de bases.
Por muchos años se dudó sobre su función, ya que
no contienen información genética evidente. Ahora se
sabe que codifican para RNAs pequeños que participan
en el procesamiento de RNAs mensajeros mitocondriales.
Los maxicírculos son moléculas mayores de DNA,
que contienen una longitud de 30,000- 50,000 pb. Se
encuentran en mucho menor número que los minicírculos.
Representan el equivalente al DNA mitocondrial de otros
eucariontes, pues codifican RNAs de proteínas, RNAs
ribosomales y de transferencia. 16
El desarrollo de una prueba de amplificación de DNA,
puede llenar los requisitos para tener una prueba confiable
de diagnóstico parasitológico. En términos generales, si
los oligonucleótidos son específicos y son empleados a
la temperatura de reconocimiento adecuada, el producto
de amplificación debería ser específico. T. cruzi presenta
La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis
Americana, es causada por el parásito protozoario
Trypanosoma cruzi, los vectores naturales de este
parásito son chinches del género Triatoma. Este agente
patógeno es transmitido al huésped mamífero cuando la
chinche se alimenta y excreta heces infectadas, lo que
permite que T. cruzi penetre a través de las heridas o
mucosas. La transmisión vectorial es la forma normal
de infección entre los animales y es la más común en
el hombre, pero se puede adquirir también mediante
transfusión sanguínea o transplante de órganos de
personas infectadas, por vía congénita y, más raramente,
por la ingestión de sustancias contaminadas e infección
accidental en el laboratorio 1. Esta enfermedad
representa un problema principal de salud pública en
América Latina, en donde la Organización Mundial de
la Salud estima que aproximadamente 100 millones de
habitantes están en riesgo de infección, y por lo menos
entre 16-18 millones de personas están infectadas, 2 y
de acuerdo a los datos proporcionados por el comité
de expertos de la WHO en el año 2002 se estima que
de 8-9 millones de personas se encuentran infectadas
con el parásito y 25 millones de personas se encuentran
en riesgo de adquirir la infección en países de América
central incluyendo a México y enfatizan la necesidad de
sostener y extender las estrategias de control para esta
enfermedad 3.
En México la enfermedad de Chagas es endémica
en varias regiones, pero se conoce muy poco acerca
de la epidemiología de la enfermedad 4. La información
sobre la prevalencia de la enfermedad es escasa y
la importancia en salud pública de esta enfermedad
permanece en constante controversia 5-7. Se han realizado
pocos estudios entomológicos sobre los vectores de esta
enfermedad, en los que se han reportado que 39 especies
de insectos triatominos están presentes en México,
de las cuales 20 se han observado que pueden ser
31
dos genomas distintos, situados en dos compartimientos
celulares bien definidos como el núcleo y la mitocondria.
El análisis por PCR para la detección de T. cruzi
en vectores y en pacientes, es una técnica alternativa
para la detección por microscopía directa, usando
“oligonucleótidos” complementarios a la región
conservada del DNA mitocondrial. Otros ensayos de
PCR para la detección del T. cruzi han sido desarrollados
usando “primers” que son complementarios al DNA
satelital o a otras regiones del DNA de cinetoplasto
(kDNA). El ensayo de la PCR se basa en la amplificación
de minicírculos que se encuentran en el kDNA, estos
se encuentran presentes en 10,000-20,000 copias
por parásito. Recientemente, se ha mostrado que el
ensayo de la PCR utilizando “primers” para las regiones
conservadas de los minicírculos del kDNA que puede
detectar aproximadamente 100 minicírculos en 100
microlitros de muestra. Por lo tanto, la mayoría de las
pruebas de amplificación para el diagnóstico de T. cruzi,
son basadas en secuencias provenientes del kDNA. 18
La búsqueda de anticuerpos en suero contra
componentes de T. cruzi ha sido de los principales
soportes para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas.
Sin embargo, casi todos los métodos utilizan extractos
completos o fracciones semipurificadas de T. cruzi, lo que
significa una considerable variación en la reproductibilidad
y confiabilidad de los resultados obtenidos con los
diferentes métodos 19. Otro problema vinculado a la
existencia de resultados positivos son los debidos a las
reacciones cruzadas con otras enfermedades parasitarias
tales como leishmaniasis e infecciones con T. rangeli 20. Por
lo anterior, antígenos recombinantes de T. cruzi pueden
proveer una herramienta para mejorar los métodos de
diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas 21, 22.
En relación a estos antígenos recombinantes, la
proteína MBP::Hsp70 se deriva de una proteína nativa
de aproximadamente 80 kDa, la cual se encuentra
presente tanto en tripomastigotes, epimastigotes,
como en amastigotes, pero su ubicación no pudo ser
precisada por ensayos de inmunofluorescencia, lo que
sugiere la necesidad de utilizar metodología de alta
sensibilidad como pueden ser la inmunoprecipitación de
proteínas membranales marcadas con iodo radiactivo o
bien la microscopia electrónica, dirigida a caracterizar
la localización celular en el agente etiológico de la
enfermedad de Chagas. Por otro lado, la proteína nativa
codificada por Hsp70 es de 80 kDa y se encuentra
conservada en diferentes aislados de Trypanosoma
cruzi y en Crithidia luciliae, pero no es compartida por los
miembros de género Leishmania.
Siendo precisamente el mejoramiento de la calidad
del serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas, uno
de los principales objetivos del uso de la tecnología
recombinante en T. cruzi, y basados en los resultados
obtenidos en la evaluación parcial del péptido MBP::
Hsp70 de alta inmunogenicidad, y con la ausencia de una
proteína homóloga en el género Leishmania, la posibilidad
de poder producir el péptido recombinante en cantidad
y calidad adecuada, se esperaban datos alentadores
respecto a su aplicabilidad en el inmunodiagnóstico de
ese padecimiento.
Los
resultados
en
los
ensayos
de
inmunoelectrotransferencia dirigidos a la evaluación del
reconocimiento del péptido MBP::Hsp70 por sueros de
individuos con enfermedad de Chagas, y a confirmar
la ausencia de reactividad con sueros de individuos
con leishmaniasis cutánea localizada, cutánea difusa
y visceral, permitieron concluir que la proteína tipo
Hsp70 es inmunogénica, y al no presentarse reacciones
cruzadas con enfermos de leishmaniasis, su aplicación
diagnóstica es muy factible.
El sistema ELISA-MBP::Hsp70 tiene indicadores
excelentes: valor predictivo positivo de 96.2%, valor
predictivo negativo de 95.8% y un índice Kappa de 0.9023.
El objetivo de este trabajo fue el de determinar la
prevalencia actual y el riesgo potencial de infección por T.
cruzi en habitantes que residen en comunidades rurales
del municipio de Tezonapa, Veracruz.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de vectores
Los vectores fueron recolectados por los habitantes
de las 12 comunidades rurales del municipio de Tezonapa,
los cuales fueron encontrados intra o Peridomiciliar,
y canalizados a sus unidades médicas rurales, para
posteriormente ser analizados.
Obtención de muestras
Todos los vectores que fueron recolectados, se les
realizaron lavados estomacales, con agua desionizada
utilizando una jeringa de insulina, las muestras obtenidas de
los lavados, fueron sometidas a ebullición en un baño con
recirculación a una temperatura de 95°C durante 10 minutos.
Análisis de la infección de vectores por PCR
El DNA obtenido de los vectores por el proceso de
lavado y ebullición sirvió de templado para la PCR, la
mezcla de reacción se llevó a cabo en un volumen final de
25 µl, conteniendo agua desionizada estéril, amortiguador
de reacción 1x; 2.5 mM de MgCl2; 2.5 mM de dNTP’s;
32
20 pMoles de cada uno de los primers, los cuales son
dirigidos contra el kDNA 24; 5U de Taq polimerasa; 5 µl de
muestra de DNA obtenido previamente. La amplificación
se llevo a cabo en un termociclador Mastercycler
personal, (eppendorf), con las siguientes condiciones
de ciclado: 3 minutos a 94°C; 35 ciclos de: 1 minuto a
94°C; 1 minuto a 55°C; 1 minuto a 72°C; y por último,
un ciclo de 10 minutos a 72°C como extensión final
para los productos amplificados. Las muestras fueron
analizadas en geles de agarosa al 1.8% y los productos
obtenidos fueron visualizados por la tinción con bromuro
de etidio, y con la ayuda de un transiluminador. Como
control positivo se utilizo DNA de una cepa de referencia
donada del Laboratorio de Biología Molecular a cargo
del Dr. José Luis Rosales Encina, y el control negativo
fue una muestra de DNA no relacionado.
de un anticuerpo cabra antihumano (Zymed) acoplado a
peroxidasa a una dilución de 1:5000 en PBS y las placas
se incubaron durante una hora a temperatura ambiente.
Después de ocho lavados y uno adicional únicamente
con PBS se adicionó 100 µl de la solución reveladora
(citrato de sodio 100 mM pH4.2, H2O2 0.03%, 1 mg/ml
de [2, 2,-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonicacid]
(ABTS) (Zymed); después de 10 minutos, las placas
fueron leídas a 415 nm en un lector de ELISA (Multyscan
Lab System). El valor de corte (vc) para este ensayo se
estableció mediante la media obtenida de una muestra
de 25 sueros de sujetos sanos más tres desviaciones
estándar. Para el caso de la proteína MBP::Hsp70, el
valor de corte se fijó en 0.375 densidades ópticas (DO),
mientras que para el extracto total de la cepa Y y de la
cepa H1 fue de 0.415 y 0.420 DO respectivamente. Los
sueros que arrojaron resultaron positivos mediante la
prueba ELISA, fueron procesados para la determinación
de anticuerpos contra T. cruzi empleando otra prueba
serológica diferente.
Preparación del extracto crudo de T. cruzi
Los parásitos (epimastigotes) de la cepa Y y de
la cepa H1 (donada por el Dr. Eric Dumonteil) de T.
cruzi se cultivaron y propagaron en un medio (LIT),
suplementario con 10% de suero fetal bovino (GIBO).
Los parásitos en fase logarítmica fueron colectados por
centrifugación, la pastilla obtenida se resuspendió en
PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM y
KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4) y fueron sometidos a ciclos de
congelación-descongelación para lisar a los parásitos.
La concentración de proteína fue determinada por el
método de Bradford.
Ensayos de Western blot
200 µg del extracto crudo de T. cruzi (cepa Y) fue
separado electroforéticamente en geles de poliacrilamidaSDS al 10% en presencia de un amortiguador de muestra
(Glicerol 2%, SDS 4%, Tris-HCl 50 mM pH 6.8, β-ME 200
mM, azul de Bromofenol 0.2%) 25, y transferidos a papel
de nitrocelulosa (BIO-RAD) para su inmunodetección 26,
27
. Los sueros de cada individuo positivo al ensayo de
ELISA fueron utilizados como anticuerpos primarios a
una dilución de 1:100 en TBS-T (NaCl 150 mM, Tween
20 0.05%, leche descremada 2%, Tris-HCl 10 mM pH
7.4). Los anticuerpos unidos a la membrana fueron
detectados utilizando un segundo anticuerpo IgG cabra
antihumano conjugado a fosfatasa alcalina (Pierce) a
una dilución de 1:5000 y el complejo inmune fue revelado
con NTB (nitroazul de tetrazolium) (sigma) y BCIP (5bromo-4cloro-3-indolfosfato) (sigma). Las muestras
fueron consideradas positivas cuando se observó un
reconocimiento igual o parecido al control positivo y por
lo menos una banda de reconocimiento diferente a la del
control negativo y de segundo anticuerpo (2° Ab). Como
control negativo de este ensayo se utilizó una mezcla
de sueros de pacientes chagásicos y como control
negativo se utilizó una mezcla de sueros de personas
aparentemente sanas.
Identificación de anticuerpos anti-T. cruzi por el
método de ELISA
Se determinó la presencia de anticuerpos anti-T. cruzi
en las 420 muestras de suero empleando como prueba
tamiz la técnica de ELISA y utilizando como antígeno la
proteína recombinante MBP::Hsp70 y extractos totales
de la cepa Y y H1. Se utilizaron placas de fondo plano
(Costar) las cuales se recubrieron con los antígenos
a una concentración de 2 µg/ml en amortiguador de
carbonatos 0.1 M, pH 9.6, se incubaron durante toda la
noche a 4°C. Posteriormente se descartó el antígeno no
unido y se bloquearon las placas con 200 µl de PBS (NaCl
137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM y KH2PO4 1.4
mM, pH 7.4) conteniendo 5% de leche descremada y se
incubaron durante 30 min a 37°C. Las placas se lavaron
2 veces con PBS-Tween 0.05% (PBST), y se incubaron
con 50 µl de cada uno de los sueros a una dilución final
de 1:200 por triplicado.Al término de la incubación las
placas se lavaron cuatro veces con PBST. Después de
los lavados, se agregó a cada uno de los pozos 50 µl
Obtención del índice de Infección natural
El índice de infección natural se obtuvo dividiendo
el número de triatominos infectados entre el total de
33
triatominos analizados, el resultado obtenido finalmente
se multiplicó por 100.
Tezonapa, la presencia de T. cruzi fue monitoreada por
la amplificación del DNA de cinetoplasto mediante PCR
y la aparición de un producto de amplificación de 235 pb
fue considerada como un resultado positivo. (Figura 2)
De los insectos obtenidos, 35 mostraron presencia del
parásito, identificándose la procedencia de los mismos y
un índice de infección natural del 14.83% en el municipio
de Tezonapa, cuando se analizó el índice de infección
por localidad estudiada se encontró que la localidad del
Palmarito posee un índice de infección natural del 1.28%,
San Agustín del Palmar con 1.70%, Rancho Nuevo con
3.40%, Las Josefinas con 0.84%, Paraíso la Reforma
con 0.84%, Monte Alto con 0.84%. (Figura 3).
RESULTADOS
El municipio de Tezonapa (Figura 1), se encuentra
ubicado en la zona centro del estado de Veracruz en la
región de las grandes montañas, en las coordenadas 18°
36’ latitud norte y 96° 41’ longitud oeste a una altura de
220 metros sobre el nivel del mar. Limita al norte con
Omealca, al este y sur con el estado de Puebla, Su
distancia aproximada al sur de la capital del Estado, por
carretera es de 219 Km. Tiene una superficie de 351
km2, Se encuentra regado por los ríos el San Jerónimo
y Santiago que son tributarios del Tonto, que a su vez
es afluente del río Papaloapan, Su clima es templadohúmedo-regular, con una temperatura media anual de
20°C, su precipitación pluvial media anual es de 2,723
mm, y pertenece a la Jurisdicción Sanitaria No. 7 del
Estado de Veracruz.
Figura 2. Análisis de la infección de triatominos
por T. cruzi mediante PCR. A partir de una muestra
obtenida por el por lavado estomacal se amplifico DNA
de cinetoplasto de T. cruzi utilizando oligonucleótidos
específicos. Los productos obtenidos se analizaron en
geles de agarosa al 1.8% tenidos con bromuro de etidio.
(1) Marcadores de tamaño, (2) control positivo utilizando
DNA de T. cruzi, (3) Control negativo utilizando un DNA
no relacionado, (4) Control negativo sin DNA. La flecha
indica la presencia de un producto de amplificación de
235 pb específico de T. cruzi.
Figura 1. Ubicación geográfica del municipio de
Tezonapa, Ver.
Análisis de la infección de triatominos
Para analizar la presencia de la infección por
T. cruzi en triatominos provenientes de localidades
rurales del municipio de Tezonapa, se obtuvieron 236
triatominos en 12 localidades rurales del municipio de
34
dos diferentes técnicas. Para confirmar la positividad
de las muestras obtenidas por ELISA se realizó un
ensayo de Western blot (Figura 5) en donde lo sueros
se reaccionaron contra un extracto total del parásito,
observándose que solamente 59 (14.0 %) muestras
mostraron reconocimiento de proteínas que se
encuentran en un rango desde los 180-20 kDa similar al
observado por el suero utilizado como control positivo.
Figura 3. Índice de infección natural por localidad rural
DISCUSIÓN
Debido a la escases y discrepancia de datos
serológicos con los que se cuenta acerca de la
enfermedad de Chagas en el país, este trabajo
muestra un panorama actual de la presencia de dicha
enfermedad en las comunidades rurales del municipio de
Tezonapa; Veracruz, y en vista de que esta enfermedad
está considerada con un problema de salud pública en
varios países de América Latina, la principal medida de
control sobre esta enfermedad está basada en el control
vectorial, debido a que estos vectores son la principal
causa de infección en estas comunidades rurales. Parte
de nuestro estudio fue el de conocer la distribución del
vector para definir las áreas de riesgo, y así en conjunto
con las autoridades de Salud poder identificar las
localidades con población de triatominos portadores de
la enfermedad de Chagas y prevenir así la infección de
personas con el parasito T. cruzi.
Figura 4. Determinación de anticuerpos anti-T. cruzi
por el método de ELISA. Los sueros de los pacientes
(dilución 1:200) fueron reaccionados con diferentes
antígenos, (♦) Proteína recombinante MBP::TcHsp70 (■)
Extracto total de T. cruzi cepa Y, (▲) Extracto total de
T. cruzi cepa H1. La línea punteada muestra la línea de
corte para los antígenos. Esta figura es representativa
de los ensayos realizados y muestra solamente 20 de las
113 muestras positivas al método de ELISA
Figura 5. Determinación de anticuerpos anti-T.
cruzi por Western blot. El extracto total del T. cruzi fue
separado electroforéticamente y transferido a papel de
nitrocelulosa. A (M) Marcadores de peso molecular, (+)
Control positivo, (-) Control negativo (2° Ab) Control
de segundo anticuerpo. B Suero de pacientes de las
localidades rurales dilución (1:100). Los nombres en la
parte superior del panel B indican la clave por localidad
y número de las muestras. Esta figura es representativa
de los ensayos de Western blot y solo se muestra 20 de
las 113 muestras analizadas.
Identificación de anticuerpos anti- T. cruzi
Para identificar la presencia de anticuerpos
específicos anti-T. cruzi, los 420 sueros recolectados se
tamizaron mediante la técnica de ELISA (Figura 4), los
antígenos usados en este ensayo fue un extracto total
de la cepa Y, un extracto total de la cepa H1 y la proteína
recombinante MBP::Hsp70 de T cruzi, para diferenciar
los sueros positivos de los negativos se utilizó una línea
de corte de 0.375, 0.415 y 0.420 D.O para cada antígeno
respectivamente, encontrandose 113 (26.9 %) muestras
positivas (Dato no mostrado).
Ensayos de Western blot
El diagnóstico de la enfermedad de Chagas se
realiza por la búsqueda de anticuerpos por al menos
35
Los programas de control vectorial son de esta
manera benéficos para el conocimiento derivado de las
investigaciones moleculares, su principal contribución
en el estudio de los triatominos ha sido la identificación y
caracterización de las poblaciones de vectores introducidas
en países de América central y del cono sur 28.
Los datos encontrados en nuestro estudio confirman
que la transmisión natural de la enfermedad ocurre en las
localidades analizadas, ya que la presencia del vector
en la zonas de estudio provee el entorno necesario para
esta forma de transmisión, los resultados obtenidos en
este trabajo muestran un índice de infección natural de
triatominos de 14.83 % arriba del encontrado por otro
trabajo relacionado 29 que fue de 10.6% para todo el
estado de Veracruz. Estos resultados muestran que tan
solo en una pequeña población del estado de Veracruz el
índice de infección es mayor al reportado con anterioridad
29
, sugiriendo que la infección se lleva de forma activa y
que el riesgo de adquirir la infección está latente.
La fase aguda de la enfermedad de Chagas no es
diagnosticada de forma regular, porque con frecuencia
cursa de forma asintomática, sin embargo, la transmisión
natural está bajo control en algunos países de América
Latina, pero es necesario seguir con los monitoreos
epidemiológicos en los países en donde este tipo de
transmisión no ha sido controlada 30. El ensayo serológico
es el método más común y práctico para el diagnóstico
de la enfermedad de Chagas, en algunos países de
América latina el riesgo de transmisión por T. cruzi es
endémico y el diagnóstico se realiza por la búsqueda
de anticuerpos por al menos dos diferentes técnicas
31
. En aquellos países en el que la enfermedad no es
endémica, es aconsejable realizar ensayos serológicos
para la búsqueda de anticuerpos en niños recién nacidos
o en transfusiones sanguíneas de personas provenientes
de lugares en donde la enfermedad es endémica 32. Los
ensayos serológicos convencionales para diagnosticar
la enfermedad de Chagas (Ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzima (ELISA), Inmunofluorescencia indirecta
(IFI), hemaglutinación indirecta (HAI)) usualmente
emplean antígenos semipurificados de epimastigotes
o antígenos crudos del parásito, de esta forma estos
ensayos permiten un gran número de resultados
inconclusos o de falsos positivos, principalmente cuando
es asociada con una infección con el género Leishmania,
33
o bien si los sueros presentan un grado de hemolisis.
El diagnóstico etiológico de la tripanosomiasis
americana, está basado en la presencia de anticuerpos
contra T. cruzi en el suero de individuos infectados.
La inclusión de antígenos recombinantes y péptidos
sintéticos para el diagnóstico serológico de la infección
han mostrado avances en términos de la especificidad34.
Sin embargo en nuestros ensayos se encontraron una
gran cantidad de falsos positivos al método de ELISA,
posiblemente debido a que las muestras que fueron
proporcionadas para el ensayo algunos presentaban
un grado de hemolisis y en algunos casos presentaban
un estado lipémico. Sin embargo, cabe resaltar que los
sueros que fueron positivos a los extractos también
fueron positivos a la proteína recombinante teniendo una
buena concordancia con los antígenos empleados.
La incursión del Western blot como una prueba
complementaria y confirmatoria a los estudios realizados
por la serología convencional ha dado muy buenos
resultados a otros autores 35, ya que es una prueba
rápida y de fácil manejo sin la necesidad de utilizar
equipo sofisticado, en relación a nuestras muestras, solo
59 de las 113 positivas al método de ELISA mostraron
un reconocimiento similar al control positivo mediante
el método de Western. Estos resultados permiten
concluir en nuestro estudio que en doce comunidades
rurales pertenecientes al municipio de Tezonapa existe
una seroprevalencia del 14% la cual concuerda con lo
reportado para el estado de Veracruz que fue de un
15% 29. Los datos sobre seroprevalencia en el país,
controvertidos por años, se han consolidado y se acepta
una seroprevalencia de 1.6%; llama la atención que en el
año 2000 el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica
sólo informó 11 casos nuevos. Esta discrepancia podría
explicarse por que la enfermedad ha sido ignorada por las
autoridades sanitarias en diversos niveles de gobierno y
es desconocida para el médico promedio 4. Por lo cual,
estos estudios son de vital importancia para conocer el
estado actual de la enfermedad así como su distribución,
para poder entonces, elaborar nuevas estrategias que
permitan el control de dicha enfermedad y prevenir así
un mayor número de nuevas infecciones.
CONCLUSIÓN
De los resultados obtenidos en este trabajo se
puede concluir que la presencia del parásito T. cruzi
está latente en zonas rurales del Estado de Veracruz
y este hecho constituye una amenaza permanente
para el estado de salud de sus habitantes, por lo que
es necesario implementar nuevos programas de control
que permitan un aseguramiento en la calidad de vida de
dichos habitantes.
36
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38
Actividad amebicida y anti-inflamatoria del
extracto acuoso de Conyza Filaginoides
Álvarez-Rodríguez, Laura Mónica1, Ramos-Ligonio, Angel1, 2,
De la O-Arciniega, Minarda3, Rosales-Encina, José Luis4 y López-Monteon, Aracely1, 2
1
Estudiante de Posgrado.Instituto de Ciencias de la Salud.Doctorado en Ciencias Biomédicas-UV. Avenida Luis Castelazo s/n Colonia Industrial
Ánimas, CP 91190. Xalapa, Ver.
1,2
Profesores de Tiempo Completo Titular “C”. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Veracruzana LADISER Inmunología y Biología Molecular
Prolongación de Oriente 6, No 1009 Colonia Rafael Alvarado, CP 94340 Orizaba, Ver.
3
Profesor Investigador de Tiempo Completo Titular “B”. Instituto de Ciencias de la Salud, Área Académica de Farmacia-UAEH.Carretera Pachuca-
Tilcuatla s/n Municipio San Agustín Tlaxiaca, Hgo.
4
Profesor Titular 3C. Depto. de Patología Experimental, CINVESTAV-IPN, Avenida Instituto Politécnico Nacional No. 2508 San Pedro Zacatenco CP
07630. México, D.F.
ANTECEDENTES
Conyza filaginoides es una planta originaria de
México, conocida comúnmente como Simonillo, la cual se
encuentra distribuida en los estados de Hidalgo, Oaxaca,
Morelos, Michoacán, Guanajuato y Estado de México,
el té de las ramas se usa para la diarrea, el dolor de
estómago y la bilis. Desde tiempos inmemorables se ha
utilizado para combatir enfermedades gastrointestinales24
. Se ha reportado que algunos componentes de C.
filaginoides poseen actividad antiprotozoaria contra E.
histolytica y G. lamblia5 y es muy utilizada dentro de la
población de escasos recursos cuando se padece de
trastornos intestinales como la diarrea (Figura 1).
La medicina tradicional (MT) tiene muchas
características positivas entre las que se incluyen:
diversidad y flexibilidad; accesibilidad y asequibilidad
en muchas partes del mundo; amplia aceptación entre
muchas poblaciones de países en vías de desarrollo;
aumento de la popularidad en países desarrollados,
un costo comparativo relativamente bajo; bajo nivel
de inversión tecnológica y una creciente importancia
económica. Por este motivo, en los países de bajos
ingresos, como el nuestro, es necesario realizar una
serie de actividades para velar por la seguridad y
eficacia de la medicina tradicional, dentro de las que se
encuentran, establecer un comité nacional de expertos,
formular reglamentaciones nacionales de las medicinas
herbarias, dispensar autorizaciones para ejercer la MT y
facilitar la ayuda a la investigación. Aunque la MT se utiliza
ampliamente en la prevención, diagnóstico, tratamiento
y gestión de enfermedades, muy pocos países han
desarrollado una política nacional sobre MT. De acuerdo
con este último punto, la Organización Mundial de la Salud
(OMS), publicó un documento denominado “Estrategias
de la OMS sobre Medicina Tradicional 2002-2005”, en
donde se menciona que los más importantes temas a
atajar se encuentran el de tener una política nacional
y marcos de trabajo legislativos; seguridad, eficacia
y calidad; acceso y uso racional. Dentro de las áreas
prioritarias de investigación sobre MT, la OMS menciona
el de estudiar los mecanismos de acción de las terapias
individuales, incluyendo los patrones de respuesta al
tratamiento. México no ha sido la excepción, ya que a
partir de esta propuesta se comienza a replantear la
investigación científica de las plantas utilizadas como
medicamento por la población mexicana. Las medicinas
con base de hierbas y la acupuntura son las terapias de
la MT más ampliamente utilizadas.1
Figura 1. Conyza filaginoides
Se tienen evidencias del uso de plantas medicinales
que tienen propiedades amebicidas y no representan
riesgos tóxicos para el usuario6-7. De la misma manera se
han aislado compuestos bioactivos de éstas plantas con
las mismas características de seguridad y eficacia8, 9.
Desde tiempos inmemorables el hombre ha
utilizado las plantas con fines terapéuticos. Tanto
en los países pobres, donde la fitoterapia constituye
39
prácticamente la forma de tratamiento más económica
y arraigada a la cultura popular, como en los países
altamente industrializados, donde las plantas son
fuentes de medicamentos. La importancia de las plantas
medicinales, en el proceso para la obtención de nuevos
medicamentos, es un hecho incontrovertible aceptado
por la ciencia médica hace más de ciento cincuenta
años. Un número importante de los fármacos de uso de
la medicina contemporánea son obtenidos de vegetales
o subproductos de éstos, sometidos a varios niveles de
transformación química. En las últimas décadas del
siglo pasado, en todo el mundo se ha incrementado el
interés por el estudio y el uso de las plantas medicinales.
Este interés está dirigido a descubrir nuevas moléculas
biológicamente activas para la industria farmacéutica
y en la adopción de extractos crudos de plantas para
contar con tratamientos eficaces de bajo costo para
la auto-medicación por el público en general10. Las
plantas medicinales suelen utilizarse para tratar o
prevenir dolencias y enfermedades, muchos de los
consumidores utilizan las plantas medicinales como
autotratamiento debido a la creencia común de que
“natural” significa “inocuo”. Probablemente ignoran
los posibles efectos secundarios y cómo y cuándo se
pueden tomar las medicinas herbarias sin riesgo. En
la mayoría de los países, o bien no existen sistemas
de vigilancia de la seguridad o el sistema de vigilancia
no abarca las medicinas herbarias11, de acuerdo con
esto se han reportado casos de utilización indebida de
preparaciones herbarias debido a la falta de controles
de calidad y a la mala utilización por los consumidores.
América Latina en conjunto con el resto de los países
en vías de desarrollo enfrenta día a día problemas de
Salud Pública, que se tornan cada vez más intensos y
de más difícil control. En México, la diarrea es un serio
problema de Salud Pública y es la segunda causa de
enfermedad entre grupos de todas las edades12. Hasta
el momento se han realizado estudios empleando
diferentes plantas utilizadas en la MT mexicana para los
desórdenes intestinales, sin embargo se han evaluado
propiedades antibacteriales y no propiedades antiparasitarias13.
Hasta el momento, la amibiasis se trata con
diversos fármacos como el albendazol, metronidazol y
sus derivados14. Los resultados han tenido eficacia en
cuanto al control parasitario, sin embargo presentan
un alto índice de toxicidad en el individuo y conllevan
a interacciones medicamentosas con esteroides y
antipiréticos, además del alto costo que generan estos
tratamientos15. Por otro lado sabemos que las diarreas
pueden ser causadas por diversos agentes etiológicos
(bacterias, virus y parásitos), por tal motivo es de vital
importancia investigar si estos extractos acuosos son
capaces de eliminar directamente a los microorganismos
causantes de diarrea o el mecanismo de eliminación es
a través de la activación del sistema inmune. Por tal
motivo el objetivo del presente trabajo fue el de estudiar
el efecto del extracto acuoso de C. filaginoides sobre el
crecimiento de E. histolytica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Selección del material vegetal
Conyza filaginoides (Simonillo) fue colectada en el
mes de Octubre a orillas de la carretera en la comunidad
del Guajolote, Municipio de Epazoyucan, Hidalgo, se
colectó la parte aérea y una muestra de esta planta
fue depositada en él Herbario Nacional MEXU del
Instituto de Biología de la UNAM, para su identificación
taxonómica. El material vegetal seleccionado se dejó
secar a temperatura ambiente (en la sombra) y después
se fragmento utilizando un molino eléctrico de engranes,
con la finalidad de aumentar la superficie de contacto
con los disolventes durante la extracción.
Obtención de extractos acuosos
El extracto acuoso de las plantas de uso terapéutico
Conyza filaginoides, se preparó tal y como se utiliza en la
terapéutica tradicional empleando el método de infusión.
Se dejó hervir 100 ml de agua en una parrilla eléctrica
y cuando el agua alcanzó el punto de ebullición, se
procedió inmediatamente a agregar el material vegetal
seco y molido (5 g), se dejó en ebullición por 10 minutos
y se retiró del fuego, posteriormente se filtró pasando
por papel Whatman para eliminar el material no disuelto
y fue liofilizado para secar el extracto acuoso. El extracto
acuoso se almacenó de 0-4° C hasta su uso.
Preparación
bioensayos
de
extractos
acuosos
para
A partir del extracto acuoso obtenido anteriormente
se preparó una solución de 100 mg/ml en amortiguador
de fosfatos (PBS, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM,
Na2HPO4.7H2O 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4) se
disolvió el extracto acuoso y posteriormente se adicionó
ácido
N-2-hidroxietil
piperazina-N’-etanosulfónico
1M (HEPES), hasta neutralizar la solución. Luego se
centrifugó por 5 minutos a 14,000 rpm. La fracción soluble
fue esterilizada por filtración en membranas Millipore de
0.22 µm y finalmente se conservó en congelación hasta
su uso.
40
Cultivo axénico de E. histolytica
peritoneal. Al término del masaje se recolectó todo el
fluido peritoneal posible y se depositó en tubos cónicos
estériles de 50 ml (Costar) sobre hielo, la solución se
centrifugó durante 10 minutos y se recolectaron las células
peritoneales. La pastilla celular obtenida se lavó una vez
con medio de cultivo y finalmente las células se ajustaron
a la densidad deseada de acuerdo a las condiciones del
experimento en medio DMEM suplementado con suero
fetal bovino al 10%.
La cepa de amibas HM1: IMSS fue donada
amablemente por el Dr. José Luis Rosales Encina del
CINVESTAV-IPN. Las amibas fueron cultivadas en medio
TYI-S-33 suplementado con vitaminas y suero bovino
adulto, a 37º C, y fueron colectadas a las 72 horas de
cultivo16.
Actividad anti-parasitaria sobre E. histolytica
Determinación de óxido nítrico (ON)
Las amibas de la cepa HM1:IMSS se cosecharon
a las 72 horas de cultivo (fase logarítmica), se enfriaron
en hielo aproximadamente de 20 a 30 min. Las amibas
se colectaron por centrifugación a 1200 rpm durante 5
min, se retiro el sobrenadante y se lavaron 3X con PBS.
En el último lavado se tomó una alícuota y las amibas se
contaron en la cámara de Neubauer (Hematocitómetro)
y se colocaron 1 × 104 trofozoíitos por cada tubo de
cultivo, cada tubo contenía una concentración (0, 200,
400, 600, 800 y 1,000 µg/ml) adecuada del extracto
acuoso de Conyza filaginoides, los tubos se incubaron a
37º C durante 7 días, al término de los cuales los tubos
se colocaron en hielo para despegar las amibas, los
tubos se centrifugaron y se determino el porcentaje de
viabilidad por exclusión con azul tripano.
A partir de las amibas interaccionadas con el
extracto acuoso, se realizaron extractos proteicos. Las
proteínas fueron separadas electroforéticamente en
geles de poliacrilamida al 10 % conteniendo SDS al 0.1%
(SDS-PAGE) en presencia de amortiguador de muestra
(Glicerol 2%, SDS 4%, Tris-HCl 50 mM pH 6.8, β-ME 200
mM, azul de bromofenol 0.2%), y fueron visualizadas por
tinción con Azul de Coomassie y tinción con plata17.
Una vez obtenidas las células residentes de
peritoneo de los ratones normales, las células se ajustaron
a una densidad de 3 x 105 células/pozo en medio de cultivo
suplementado con 10% de suero fetal bovino, las células
fueron plaqueadas en cajas de cultivo de 96 pozos, las
células fueron estimuladas con diferentes concentraciones
del extracto acuoso de C. filaginoides (31.25, 62.5, 125,
250, 500, 1000 y 2000 µg/ml) en la presencia de L-NAME
(4.6-300 µM) (Sigma) y fueron incubadas por 24 horas a
37º C en una atmósfera húmeda de 5% de CO2. Al término
de la incubación se recuperaron 50 µl del sobrenadante del
cultivo y se transfirieron a una placa de 96 pozos de fondo
redondo (Costar)). Las muestras se trabajaron por triplicado.
Posteriormente se agregaron 50 µl del reactivo de Griess (25
µl de sulfanilamida 1% más 25 µl de N-naftiletilendiammina
0.01% en H3PO4 al 2.5%) a cada muestra. Las muestras se
incubaron durante 10 min y la densidad óptica se leyó a 550
nm en un Multiskan. Los valores de nitritos se obtuvieron
por la interpolación de las densidades ópticas obtenidas
con los valores de una curva estándar de NaNO2 (Sigma)
(12.5-100 µM). Como control positivo de la inducción de
ON, las células fueron estimuladas con interferón gamma
(IFNγ) a una concentración de 100 U/ml, y como control
negativo las células fueron estimuladas con una proteína
irrelevante como ovoalbúmina (OVA) a una concentración
de 10 µg/ml.
Obtención de macrófagos de peritoneo
Determinación de la expresión de iNOS
Realización de extractos proteicos de E.
histolytica
Lo ratones de la cepa BALB/c de 4-6 semanas
de edad fueron sacrificados según Kruisbeek18 por
desnucamiento, posteriormente se limpió el abdomen
con alcohol al 70% para esterilizar el área, se realizó
una incisión en la línea media sobre la piel del peritoneo,
luego se separó la piel con unas pinzas para exponer
la pared peritoneal intacta y se introdujo una jeringa de
10 ml con medio de cultivo DMEM (Gibco-BRL) frío,
una vez con el medio de cultivo en la cavidad peritoneal
del ratón se procedió a dar masaje durante 10 minutos
aproximadamente sin retirar la aguja de la cavidad
•
Por Western blot
La determinación de la expresión de la enzima
sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) se realizó en
macrófagos de peritoneo de ratones de la cepa BALB/c
tratados con el extracto acuoso. Para la detección los
extractos proteícos de los macrófagos interaccionados
con el extracto acuoso de Conyza filaginoides fueron
separados en geles de SDS-PAGE al 10% en presencia
de un amortiguador de muestra17 y fueron transferidos
electroforéticamente a papel de nitrocelulosa (BIO-RAD)
41
para su inmunodetección19, 20. La iNOS fue detectada
utilizando anticuerpos específicos contra la iNOS de ratón
(Cayman) a una dilución de 1:5000 en TBS-T (NaCl 150
mM, Tween 20 0.05%, leche descremada 2% y Tris-HCl
10 mM pH 7.4). Los anticuerpos unidos a la membrana
fueron detectados utilizando un segundo anticuerpo IgG
cabra anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina (Pierce)
a una dilución de 1:5000 y luego revelado con NBT
(Nitroazul de tetrazolium) y BCIP (5-bromo-4-cloro-3
indolfosfato) (Sigma).
•
Para analizar a qué nivel estaba la inhibición de
la producción de ON, a partir de los macrófagos de
peritoneo que estuvieron en contacto con las diferentes
concentraciones del EACf se obtuvo un extracto proteico
el cual se separó electroforéticamente en geles de
poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes,
posteriormente las proteínas fueron transferidas a papel
de nitrocelulosa, para realizar un Western blot con un
anticuerpo anti-iNOS observándose que a manera que
la concentración del EACf aumentaba, la expresión de la
sintasa de óxido nítrico inducible disminuía (Figura 5A).
Para confirmar que realmente la expresión de
la enzima estaba disminuida se realizó el mismo
procedimiento pero revelando la membrana con un
sustrato más sensible como es el caso del luminol
por medio de una reacción de quimioluminiscencia,
observándose que efectivamente a una concentración
de 500 µg/ml no existe expresión de la iNOS (Figura
5B).
Por otro lado, para investigar el mecanismo por el
cual el EACf estaba inhibiendo la producción de ON, se
realizó el mismo ensayo pero adicionando a cada pozo un
inhibidor competitivo de la enzima iNOS como es el caso
del L-NAME, ya que al ser este un inhibidor competitivo
de la enzima, la enzima debería de estar presente en las
muestras (Figura 5C), los resultados mostraron que el
EACf no posee inhibidores competitivos para la enzima
iNOS, ya que en las Figuras 5A y 5B no se observó la
expresión de la enzima, indicando que el EACf inhibe
directamente la expresión de la enzima
Por quimioluminiscencia
Para la detección por quimioluminiscencia se realizó
lo mismo que para el Western blot. La iNOS fue detectada
utilizando anticuerpos específicos contra la iNOS de ratón
(Cayman) a una dilución de 1:5000 en TBS-T (NaCl 150
mM, Tween 20 0.05%, leche descremada 2% y Tris-HCl
10 mM pH 7.4). Los anticuerpos unidos a la membrana
fueron detectados utilizando un segundo anticuerpo IgG
cabra anti-ratón conjugado a peroxidasa (Pierce) a una
dilución de 1:5000 y luego revelado con luminol como
sustrato (Pierce).
RESULTADOS
Con la finalidad de analizar el efecto que tenía
el extracto acuoso de C. filaginoides (EACf) sobre el
crecimiento de E. histolytica, se interaccionaron trofozoítos
de este parásito con diferentes concentraciones del
EACf, observándose que existe un efecto tóxico a una
concentración de 800 µg/ml, ya que la viabilidad de las
amibas fue del 43% (Figura 2).
Para investigar si existía una proteína que se
expresará por acción del extracto acuoso de C.
filaginoides se recuperaron las amibas que estuvieron
en contacto con el extracto acuoso y se observó que
a una concentración de 400 µg/ml de extracto existe la
expresión de una proteína de aproximadamente 97 kDa
lo cual podría reflejar un mecanismo de defensa del
parásito a la acción del extracto acuoso (Figura 3).
Por otra parte, debido a que el macrófago es una
de las células más importantes en la respuesta inmune
inducida contra E. histolytica, en nuestro laboratorio hemos
investigado si el extracto acuoso de Conyza filaginoides
presenta algunas propiedades inmunomoduladoras,
observándose que es capaz de disminuir la producción
de ON en macrófagos de peritoneo de ratones BALB/c
activados con IFNγ cuando estos son interaccionados in
vitro con el EACf (Figura 4).
Figura 2. Efecto del extracto acuoso de C. filaginoides.
Tubos con medio TYI-S-33 fueron inoculados con 105
trofozoítos de E. histolytica de la cepa HM1:IMSS.
Diferentes concentraciones del extracto acuoso fue
adicionado a cada tubo (200-1000 µg/mL). La viabilidad
de las amibas fue determinada por la exclusión con azul
tripano después de 7 días de cultivo.
42
Figura 3. SDS-PAGE de trofozoítos de E. histolytica
interaccionados con el extracto acuoso de C. filaginoides.
Amibas interaccionadas con diferentes concentraciones
del extracto fueron obtenidas por centrifugación y
lisadas con amortiguador de muestra. (1) Trofozoítos de
E. histolytica no interaccionados, (2-6) Interaccionados
con 200, 400, 600, 800 y 1000 µg/mL. Las proteínas
amibianas fueron separadas en SDS-PAGE al 10% y
teñidas con azul de Coomassie. (M) Marcadores de bajo
peso molecular.
Figura 5. Detección de iNOS en macrófagos de
peritoneo. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c
fueron estimulados durante 48 h de la siguiente manera:
(A y B), IFN-γ (100 U/mL) (1), OVA (10 µg/mL) (2), S/E
(3) y diferentes concentraciones de extracto acuoso de
C. filaginoides: 31.25 (4), 62.5 (5), 125 (6), 250 (7), 500
(8), 1000 (9) y 2000 µg/mL (10). (C) IFN-γ (100 U/mL)
(1), OVA (10 µg/mL) (2), S/E (3) y estimulados con IFN-γ
en presencia de diferentes concentraciones de L-NAME
(4.6-300 µM) (4-10). Las células fueron lisadas y el
extracto se separó electroforéticamente en SDS-PAGE
al 10% y se transfirieron a papel de nitrocelulosa. (A)
Western blot y (B y C) ensayo de quimioluminiscencia
con un anticuerpo a-iNOS 1:2500.
DISCUSIÓN
El siglo XX nos ha enseñado que el papel que
juegan los recursos herbolarios en el contexto de las
llamadas “medicinas tradicionales o indígenas es práctico
o empírico en cuanto al fundamento de su aplicación y
profundamente social por estar vinculado a diversos
aspectos de la cultura. Es indiscutible que las plantas
medicinales y las prácticas médicas tradicionales son
un valioso recurso de la población de escasos recursos
para hacer frente a sus problemas de salud, no obstante
en su mayoría está destinado a resolver la enfermedad
y no a prevenirla.
Las estadísticas demuestran abrumadoramente
que es en los países más pobres del mundo donde
más se necesitan tratamientos baratos y eficaces. Más
del 50% de las muertes infantiles en los países en vías
de desarrollo se deben a enfermedades infecciosas.
Al mismo tiempo, el acceso a los fármacos químicos
modernos esenciales es limitado, debido a que existe
financiamiento inadecuado y un aporte sanitario escaso.
En los países en vías de desarrollo, sin embargo, la MT
puede ser comparativamente barata, en este contexto,
dentro de las estrategias de la OMS sobre MT se
encuentran el realizar estudios de los mecanismos de
acción de las terapias individuales, incluyendo patrones
de respuesta al tratamiento1.
Figura 4. Determinación de ON en macrófagos de
peritoneo activados con IFN-γ. Macrófagos obtenidos
por exudado peritoneal de ratones BALB/c fueron
estimulados con IFNγ y OVA en la ausencia y presencia
de diferentes concentraciones del extracto acuoso de
C. filaginoides. La determinación de NO-2 se llevo a
cabo en los sobrenadantes después de las 48 horas de
cultivo mediante el método de Griess. Los resultados
son representativos de tres experimentos realizados de
manera independiente.
43
El interés en el estudio de las plantas medicinales
como una fuente de compuestos farmacológicamente
activos se ha incrementado en el mundo entero. Se sabe
que en los países en vías de desarrollo, las plantas son
la fuente medicinal principal para tratar las enfermedades
infecciosas. En estos países las condiciones de vida son
sumamente bajas y las condiciones de higiene son muy
pobres, la diarrea y la disentería representa una de las
principales causas de morbilidad y mortalidad13.
Las diarreas causadas por parásitos resultan de
vital importancia, en México, la amibiasis ocupa uno de
los primeros lugares en parasitosis, aproximadamente 40
millones de personas desarrollan la enfermedad intestinal
o la principal complicación extraintestinal (absceso
hepático amibiano), y alrededor de 50,000 a 100,000
de individuos mueren de amibiasis anualmente21. La
amibiasis intestinal se caracteriza por diarrea fulminante y
hemorragia intestinal, y son precisamente estos trastornos
los que permiten la diseminación de la amiba a sitios
sistémicos, comúnmente el hígado, donde ocasiona el
absceso hepático amibiano (AHA) (Figura 6)22.
plantas (preparados acuosos) para curar las afecciones
gastrointestinales y no los constituyentes de la planta.
Actualmente no se han realizado estudios que permitan
comprender el mecanismo de acción por el cual el extracto
acuoso de Conyza filaginoides ejerce sus efectos contra
los desordenes intestinales para los cuales son utilizados
en algunos estados de México, asimismo se desconoce
si este extracto realmente cura o solamente modula el
proceso inflamatorio involucrado en estos desórdenes.
Un paso importante en la eliminación del parásito
E. histolytica es la activación del macrófago, éstos son
activados por citocinas derivadas de la célula T. La
susceptibilidad de las amibas a ser eliminadas por los
macrófagos, indica que la modulación de la producción
de citocinas y las funciones de célula efectora son un
paso primordial para la sobrevivencia de los trofozoítos
en el hígado.
El TNFα juega un papel importante en el control
de la amibiasis, ya que induce la liberación de óxido
nítrico (ON) por parte del macrófago23 y de metabolitos
del oxígeno (H2O2 y O-2), los cuales son importantes
para eliminar parásitos. Aunque los trofozoítos de E.
histolytica son susceptibles a la muerte por H2O2, la
citotoxicidad del macrófago contra las amibas está
mediada principalmente por el ON24. Las células T
son una fuente importante de citocinas que activan
al macrófago y pueden además directamente ser
citotóxicos para las amibas, aunque el mecanismo no se
conoce, también se ha mostrado que la eliminación de
células T inhibe la capacidad de las células esplénicas
para transferir inmunidad a animales receptores25. Por
ello, la activación de células T específicas de antígeno, la
producción de citocinas y la actividad citotóxica de ésta
son componentes importantes de la inmunidad contra E.
histolytica.
En el presente trabajo se encontró que C.
filaginoides tiene propiedades amebicidas, en respuesta
la amiba secreta una proteína que puede fungir como
un mecanismo de defensa del parásito a la acción del
EACf. En E. histolytica se han descrito varios genes
de multiresistencia a drogas (MDR) que codifican para
glicoproteínas presentes en la membrana del parásito
y que son los encargados de bombear la droga del
citoplasma al exterior26.
También se encontró que el EACf presenta
propiedades anti-inflamatorias ya que existe disminución
de ON a nivel de la expresión de la enzima, este mismo
efecto se ha observado con otros extracto acuosos, en
donde se ha visto que ciertos extractos acuosos suprimen
la respuesta inflamatoria inducida por lipopolisacárido
(LPS) a través de la inhibición en la producción de ON y
el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), esta inhibición
Figura 6. Tipos de amibiasis. E. histolytica infecta al
humano causando dos tipos de amibiasis: La amibiasis
intestinal y la amibiasis extraintestinal, comúnmente
llamado Absceso Hepático Amibiano (AHA).
Hasta el momento, la amibiasis se trata con
diversos fármacos como el albendazol, metronidazol y
sus derivados14. Los resultados han tenido eficacia en
cuanto al control parasitario, sin embargo presentan
un alto índice de toxicidad en el individuo y conllevan
a interacciones medicamentosas con esteroides y
antipiréticos, además del alto costo que generan estos
tratamientos15. Por otro lado se sabe que las diarreas
pueden ser causadas por diversos agentes etiológicos
(bacterias, virus y parásitos), por tal motivo es de vital
importancia investigar si estos extractos acuosos son
capaces de eliminar directamente a los microorganismos
causantes de diarrea o el mecanismo de eliminación es
a través de la activación del sistema inmune.
Existen constituyentes de C. filaginoides que
tienen propiedades anti-protozoarias5, sin embargo, la
población de escasos recursos utiliza infusiones de las
44
está directamente relacionada con una disminución
en la transcripción del factor nuclear NF-κB27, el cual
está relacionado con la inducción de mediadores proinflamatorios que contribuyen a una respuesta inmune
inflamatoria de tipo sistémico28, 29.
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CONCLUSIÓN
Finalmente, se puede concluir que el EACf presenta
una actividad amebicida contra E. histolytica, el cual
es el principal parásito protozoario que causa diarrea y
disentería en la población mexicana.
Los resultados de este estudio validan el uso de
esta planta en la MT mexicana en el tratamiento de
desórdenes gastrointestinales tales como la diarrea y la
disentería y sugieren que parte de su acción es debida a
propiedades inmunomoduladoras que le pueden permitir
actuar como un agente terapéutico para enfermedades
inflamatorias.
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46
Análisis de la interacción entre el receptor tipo toll
y el virus de dengue 2 en monocitos humanos
Hernández Orta K1,2 , Vivanco Cid H1,2 , Alexander Aguilera A2 , Ruíz Pacheco J1 , Parissi Crivelli A.1
1
2
Laboratorio Estatal de Salud Pública, depto-Bioseguridad 3
Universidad Veracruzana, Facultad de Bioanálisis- Universidad Cristobal Colón. [email protected]
INTRODUCCIÓN
IL-8 e IL-12, no hubo diferencias al comparar las células
estimuladas (con o sin bloqueo para TLR4) contra células
control que no lo fueron (células sin estímulo).
Finalmente se analizó la modulación en la expresión
de TLR4 en monocitos humanos que fueron estimulados
con Virus Dengue, encontrando que la estimulación
induce disminución en la expresión de la proteína en
superficie, lo cual fue visualizado por citometría de flujo.
Estos resultados permiten proponer a TLR4 como
un receptor necesario para inducir la síntesis de TNF-α,
abren la posibilidad de que en un futuro, este conocimiento
pueda sentar las bases para la intervención molecular
en la enfermedad, directamente al inhibir la ruta de
señalización que es activada a través de TLR4.
El Dengue es una enfermedad infecciosa producida
por alguno de los cuatro serotipos del virus Dengue
(Familia Flaviviridae) y es transmitida al hombre por
mosquitos vectores, principalmente Aedes aegypti.
Clínicamente, la enfermedad puede manifestarse
con fiebre llamada Fiebre por Dengue (FD), o como
formas más severas denominadas Fiebre Hemorrágica
por Dengue (FHD) y Síndrome de Choque por Dengue
(SCD), las cuales llegan a ser fatales.
En la infección por virus del Dengue, las células
monocíticas son la principal población susceptible de ser
infectada por el virus, y la principal fuente de citocinas de
tipo inflamatorio, tales como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IFN-γ.
La producción no controlada de estas citocinas, propicia
la aparición de las formas severas de FHD y SCD.
Uno de los descubrimientos más importantes que
han llevado a explicar los mecanismos moleculares
que propician la respuesta inflamatoria inducida por
moléculas de origen microbiano, así como a comprender
más el origen de cuadros patológicos que se presentan
como consecuencia de una respuesta exacerbada, lo
fue el descubrimiento de los receptores tipo Toll o TLRs.
Estos receptores localizados en la superficie de células
fagocíticas, participan en la respuesta inmune innata a
través del reconocimiento de moléculas presentes en
patógenos El objetivo del presente trabajo, fue evaluar
la interacción de un miembro de la familia de TLRs: El
receptor TLR4, con el serotipo 2 del virus del Dengue en
un modelo experimental in vitro de monocitos humanos.
La estrategia metodológica que se siguió fue el
bloqueo del receptor sobre esta población celular
empleando un anticuerpo monoclonal antagonista y la
posterior estimulación con el serotipo 2 del virus Dengue.
Finalmente se evaluó como dicho bloqueo, influye en
la activación y producción de mediadores inflamatorios
inducidos por el virus en monocitos humanos.
Los resultados mostraron que bloqueando al
receptor TLR4 en monocitos humanos, se inhibe en
un porcentaje significativo la producción de uno de los
principales mediadores inflamatorios durante la infección
por Dengue: TNF-α. El efecto de bloqueo fue selectivo
para esta citocina, ya que al analizar la producción de
JUSTIFICACIÓN
En la actualidad el Dengue se constituye como una
de las enfermedades re-emergentes más importantes en
todo el mundo y sin duda la número uno como ejemplo
de enfermedad transmisible por vector. La enfermedad
es endémica ahora en más de 100 países del mundo,
localizándose en regiones tropicales y subtropicales de
África, América, Asia mediterránea sur oriental, el este y
el pacifico occidental, siendo el continente americano uno
de los mas afectados. Los esfuerzos internacionales para
prevenir estas epidemias giran en torno a la vigilancia
epidemiológica-virológica y el control del vector.
En México el Dengue se constituye como una
enfermedad endémica en algunas zonas donde no se ha
podido erradicar el vector. En el último año el problema se
ha agudizado aún más debido a que se han presentado
cuadros de DH en las zonas del pacífico y del sureste del
país. En relación al virus de Dengue poco se ha explorado
con respecto a la relación temprana que se establece
entre componentes o moléculas propios del patógeno y
receptores de superficie celular tipo PRRs en el hospedero.
El virus del Dengue como antígeno, se comporta como
un potente inductor de los mecanismos de respuesta
inmune innata, a través de la producción de mediadores
inflamatorios tales como TNF-α MIP-1α, MIP-1β, IL8 etc. La liberación de estos mediadores inflamatorios
juega un papel determinante en la inmunopatología de la
enfermedad, sobre todo en las formas severas tal como
47
DH o SCD en donde son los responsables de fenómenos
tales como el aumento en la permeabilidad vascular,
activación de complemento, liberación de tromboplastina,
insuficiencia circulatoria, etc.
La participación de los receptores similares a Toll
como probables PRRs involucrados en el reconocimiento
y la señalización inducida por alguna de las moléculas
presentes en el virus de Dengue no se había explorado.
Esta interacción que se abordó en el presente trabajo
podría explicar como el virus del Dengue genera una serie
de señales de activación en células de estirpe mielode,
que culmina con el cuadro inflamatorio tan particular
de la enfermedad. Los datos generados contribuirán a
entender mejor la inmunopatogénesis de la enfermedad
y permitirán contar con el conocimiento necesario para
explorar nuevos blancos terapéuticos para la intervención
en esta patología.
estratificación sobre una mezcla de Ficoll-hypaque, el
cual es un polímero de carbohidratos y metrizamida, un
compuesto denso que contiene yodo. Este procedimiento
rinde en la interfase dos halos con células diferentes: las
células polimorfonucleares al fondo del gradiente y las
mononucleares (monocitos y linfocitos) que lo hacen
sobre el gradiente de Ficoll-hypaque (73).
Figura 1. Estratificación sobre una mezcla de Ficollhypaque quedando en la interfase dos halos con células
diferentes: las células polimorfonucleares al fondo del
gradiente y las mononucleares (monocitos y linfocitos)
que lo hacen sobre el gradiente de Ficoll-hypaque.
Fuente: www.bio.us.es/Departamentos/ INMUNOLOGIA/
Nueva%20carpeta/Neubauer.htm
HIPÓTESIS
El serotipo 2 del virus del Dengue utilizará al receptor
TLR4 de monocitos humanos, como uno de los mecanismos
implicados en el establecimiento de la inmunopatología.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar si existe interacción entre el receptor TLR4 de
monocitos humanos con el serotipo 2 del virus del Dengue
como uno de los mecanismos moleculares de la patogenia.
Procedimiento:
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica humana mediante separación en gradiente
de Ficoll-hypaque y se sembraron en cajas para cultivo
celular estériles de 25 cm2 (anexo 2). Las células se incubaron
durante 2 horas a 37OC y 5% de CO2. Al término de este
periodo, se retiró todo el sobrenadante y las células se
lavaron con medio RPMI suplementado con suero fetal
bovino (SFB) al 10 % para remover las poblaciones
celulares no adherentes (Linfocitos T, B y NK). Los
monocitos permanecen en la caja de cultivo gracias a su
propiedad de adherencia al plástico. Después de lavarlos,
los monocitos se despegaron empleando una solución
de PBS-EDTA 5 mM en frío, incubando con esta solución
durante 15 minutos. Las células fueron aspiradas, se
recolectaron en un tubo cónico estéril de 15 mL y se
centrifugaron, para después sembrar en una densidad de
1 x 106 células por pozo, en placas de 6 pozos, agregando
un volumen final de 3 mL de medio RPMI suplementado
con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL, estreptomicina
100 µg/mL y suero fetal bovino al 10%.
OBJETIVOS PARTICULARES
1.Investigar la participación de TLR4 como transductor
de señales para el serotipo 2 del virus del Dengue, y
su papel en la activación y producción de citocinas de
tipo pro-inflamatorio TNF-α, IL-8 e IL-12.
2.Analizar la expresión de TLR4 en monocitos humanos,
purificados de sangre periférica, e infectados in vitro con
el serotipo 2 del virus del Dengue por citometría de flujo.
METODO
Ensayos de activación de monocitos con el
serotipo 2 del virus del Dengue
Fundamento:
El primer paso en los estudios sobre monocitos
consiste en su aislamiento a fin de estudiar su respuesta
in vitro. Los monocitos humanos pueden aislarse de
la sangre periférica con relativa facilidad mediante
centrifugación en distintos gradientes de densidad.
El método más empleado para su purificación es la
Aislamiento y replicación del serotipo 2 del virus del
Dengue en la línea celular C6/36 (Cepa de mosquito
Aedes albopictus).
48
El virus del Dengue serotipo 2 empleado en el
presente estudio, fue un aislado clínico realizado en
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Veracruz. Este
virus fue propagado en la línea celular C6/36 permisiva
de la infección, para incrementar el título viral.
Brevemente:
La línea celular C6/36 fue sembrada en cajas de
cultivo celular estériles marca NUNC de 25cm2, a las
cuales se les agregó 5 ml de medio D-MEM (Dulbecco’s
Modified Eagle Medium) por caja, dejando crecer la
línea celular durante un periodo de 72 horas, se les
cambio el medio agregando 10% albúmina y 1.5% de
bicarbonato de sodio, y a partir de un muestra de suero
de un paciente positivo para el virus Dengue serotipo
2, confirmado por aislamiento viral y RT-PCR previas,
se inoculó una alícuota de 100 μl de este suero en la
línea celular y se dejó incubar durante 5 días, con lo cual
se consiguió elevar el titulo viral en el sobrenandante
celular. Este sobrenadante sirvió como nuestro antígeno
problema para estimular los monocitos humanos. Los
sobrenadantes fueron recolectados y congelados a 20 OC para mantener al virus viable. Se realizó a partir
de una alícuota, la comprobación de la replicación viral
mediante la extracción de RNA y RT-PCR.
Fundamento:
La prueba de ELISA se basa en la reacción
antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser
de reactividad conocida. El color se genera por la
interacción de un sustrato cromogénico y una enzima
que ha sido acoplada al anticuerpo detector. La reacción
inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede
ser de plástico, vidrio o nitrocelulosa. Actualmente los
más usados son los de plástico, dentro de éstos los
de poliestireno gamma irradiados y los de cloruro de
polivinilo porque tienen mayor capacidad para formar
enlaces estables que los de poliestireno no tratados.
La estabilidad de los enlaces electrostáticos, el tiempo
de incubación y la temperatura son factores importantes
a tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y
que pueden afectar la sensibilidad del ensayo (74).
Procedimiento:
Se realizó la determinación de TNF-α, IL-8 e IL-12,
corriendo las curvas estándar de reactivo comercial y los
sobrenadantes problema. Las placas de ELISA fueron
sensibilizadas con un anticuerpo primario de captura,
específico para cada una de las citocinas. Este anticuerpo fue
preparado a una dilución 1:250 (para todos los anticuerpos)
en solución de carbonatos, incubando toda la noche a 4ºC.
Al día siguiente, se descarto el anticuerpo de captura, se
lavo con solución de PBS con 0.05% de tween-20 en tres
ocasiones y se agregó 300 microlitros de solución de bloqueo
(PBS con 10% de SFB) a cada pocillo y se dejó incubando
la placa durante 1 hora a temperatura ambiente, al termino
de esta incubación se aspiró y lavó para un total 3 lavados
nuevamente, retirando el exceso de la solución de lavado de
la placa en un papel absorbente. Se preparó las diluciones
de cada una de las citocinas recombinantes para realizar la
curva estándar como a continuación se muestra:
Evaluación de la activación de monocitos
humanos vía TLR4 por virus del Dengue 2
Los monocitos purificados y ajustados a una
densidad de 1 X 106 células por pozo en placa de 6
pozos, se pre-trataron con un anticuerpo antagonista
específico anti-TLR4 humano. Este anticuerpo comercial
ha sido empleado ampliamente en la literatura para
realizar ensayos de bloqueo del receptor TLR4 y evaluar
su participación en el reconocimiento de diferentes
moléculas (ver información detallada del anticuerpo en
anexo 1). Los monocitos humanos fueron incubados
en ausencia o presencia de 20 µg/ml del anticuerpo
bloqueador durante 1 hora antes de realizar el estímulo
con virus Dengue. Este tratamiento con el anticuerpo
previene que alguna molécula pueda interactuar con el
receptor TLR4 e inducir activación celular. Posterior al
bloqueo, las células fueron infectadas con virus Dengue
(100 µL) durante 24 horas. Al término de estos tiempos
se recolectó el sobrenadante de los cultivos para analizar
la expresión de citocinas proinflamatorias como TNF-α,
IL-8 e IL-12 mediante la técnica de ELISA.
Preparación de la curva estándar:
En una placa para ELISA de 96 pocillos (marca
NUNC) se prepararon diluciones de las citocinas
recombinantes (TNF-α, IL-8 e IL-12 en las siguientes
concentraciones 500 pg/ml, 250 pg/ml,125 pg/ml, 62.5
pg/ml,31.25 pg/ml, 15 pg/ml y 7.5 pg/ml utilizando como
diluyente PBS 1X suplementado con 10% de SFB para
cada citocina. Se anexan esquemas de las diluciones
para la preparación de las curvas estándar:
Para TNF-α:
Tubo inicial: Diluyente (995.5 µl) + 4.5 µl de citocina
concentración final 500 pg/ml.
A partir de este tubo se realizaron diluciones dobles
colocando 500 µl del diluyente a cada tubo + 500 µl de
la preparación de citocina del tubo previo.
Análisis de expresión de citocinas pro
inflamatorias TNF-α, IL-8 e IL-12 en monocitos
estimulados con virus Dengue mediante la
técnica de ELISA
49
un total de 7 lavados, retirando el exceso de la solución
de la placa en un papel absorbente y se le agregó 100 μL
de la solución de substrato TMB a cada pocillo y se dejó
incubando 15 minutos. Por ultimo se agregó la solución de
paro (H2SO4 2N) a cada pocillo y se realizó la lectura de
absorbancia a una longitud de onda a 450 nm.
Figura 2. Diluciones realizadas para determinar la
curva estándar de la citocina TNF-α.
50
500pg/ml
0 µl
50 0 µ l
250pg/ml
50 0 µ l
125pg/ml
50 0 µ l
62.5pg/ml
500 µ l
50 0 µ l
31.25pg/ml
15pg/ml
Extracción de RNA de Virus Dengue a partir
de monocitos humanos infectados con virus
Dengue o sobrenadante de la línea celular C6/36,
empleando el reactivo comercial TRIZOL
7.5pg/ml
Para IL-8:
Tubo inicial: Diluyente (995 µl) + 5 µl de citocina
concentración final 500 pg/ml.
A partir de este tubo se realizaron diluciones dobles
colocando 500 µl del diluyente a cada tubo + 500 µl de
la preparación de citocina del tubo previo.
El material empleado para el proceso de extracción
de RNA: tubos marca Eppendorff de 1.5 mL, puntas para
micropipetas de varios volúmenes, etc. se trataron con un
potente inhibidor de Ribonucleasas (RNAsas) como lo es
el Dietilpirocarbonato (DEPEC, marca sigma). El material
fue sumergido en una solución de agua inyectable con
DEPEC al 0.01%, y mantenido toda la noche en agitación
constante. Posteriormente el material se escurrió y se
colocó en cajas y frascos para su esterilización durante
20 minutos a 120OC.
Sobrenadante de la línea celular C6/36 infectada
con virus dengue o bien monocitos humanos que fueron
estimulados con dicho sobrenadante durante 24 horas,
fueron sujetos a extracción de ARN empleando 1000µL
de TRIZOL, permaneciendo en contacto con este reactivo
por un tiempo de 5 minutos. Después de transcurrido
este tiempo, se agregó 200 µL de cloroformo, tapando
los tubos y agitando durante 30 segundos. Estos
tubos se centrifugaron a máxima velocidad en la micro
centrífuga a 14,000 RPM durante 15 minutos. Al término
de la centrifugación, se recuperó la fase acuosa (capa
superior), colocando en otros tubos estéril. A partir de
este paso se trabajo con esta fase, agregando 800µL
de isopropanol-frío, agitando en el vortex durante 30
segundos y centrifugado durante 15 minutos a máxima
velocidad (14,000 RPM). Al término de la centrifugación,
se eliminó el isopropanol, decantando por inversión. Se
agregaron 1000 µL de etanol absoluto y se agitó en el
vortex durante 30 segundos y se centrifugó a máxima
velocidad. Al término, se eliminó el etanol. Finalmente
se resuspendió el RNA en 30 µL de agua inyectable y se
congeló a –80º C, hasta su empleo.
Figura 3. Diluciones realizadas para determinar la
curva estándar de la citocina IL-8.
50
500pg/ml
0 µl
50 0 µ l
250pg/ml
50 0 µ l
125pg/ml
50 0 µ l
62.5pg/ml
500 µ l
50 0 µ l
31.25pg/ml
15pg/ml
7.5pg/ml
Para IL-12:
Tubo inicial: Diluyente (997.2 µl) + 2.8 µl de citocina
concentración final 500 pg/ml.
A partir de este tubo se realizaron diluciones dobles
colocando 500 µl del diluyente a cada tubo + 500 µl de
la preparación de citocina del tubo previo.
Figura 4. Diluciones realizadas para determinar la
curva estándar de la citocina IL-12.
50
500pg/ml
0 µl
50 0 µ l
250pg/ml
50 0 µ l
125pg/ml
50 0 µ l
62.5pg/ml
500 µ l
50 0 µ l
31.25pg/ml
15pg/ml
7.5pg/ml
Se agregó 100 μL de cada dilución de citocinas
recombinantes para la curva estándar al pocillo respectivo
y se cargaron las muestras problema dejando incubar
durante 2 horas a temperatura ambiente. Al termino
de las 2 horas se aspiró y lavó para un total 5 lavados;
nuevamente se retiró el exceso de la solución de lavado
de la placa en un papel absorbente y se agregó 100 μL
del detector de trabajo (Ac de detección + Av-HRP) a cada
pocillo y se dejó incubando durante 1 hora a temperatura
ambiente. Al término de la incubación se aspiró y lavó para
RT-PCR para la identificación del virus Dengue
en el sobrenadante de células C6/36 y en
monocitos humanos
Fundamento:
La PCR es un método in vitro de síntesis de ácidos
nucleicos, por el cual un segmento particular de ADN es
50
específicamente replicado, dicho fragmento de interés
es delimitado por dos iniciadores o cebadores. Estos
iniciadores son polímeros de nucleótidos de longitud
variable (de hasta 30 nucleótidos de extensión o menos),
que son complementarios a una región de la secuencia
de ADN que nos interesa amplificar.
3), TS4 (específico para Serotipo 4); 0.8 unidades de taq
polimerasa (PROMEGA), MgCl2 50mM y agua c.b.p para
45 µL. Se colocaron los tubos en el termociclador para
correr 18 ciclos (30 segundos a 94º C; 1 minuto a 55º C y 2
minutos a 72º C y finalmente un ciclo más de extensión de 7
minutos. a 72ºC. El producto de amplificación fue revelado
mediante una electrofóresis en gel de agarosa al 2 %.
Procedimiento:
Se realizó el protocolo de RT-PCR descrito por
Lanceotti (71) para analizar si había ocurrido la infección
de los monocitos humanos a través de la demostración
del RNA viral. Se tomo una alícuota de 5 µL de material
obtenido por la técnica de trizol (ARN), colocándose en
un tubo Eppendorf de 500 µL. Los tubos se calentaron
durante 10 minutos a 75º C para posteriormente bajar la
temperatura rápidamente a 4º C, agregando los siguientes
reactivos: 45 µL de la mezcla A que contiene: 5.5 µL de
amortiguador de PCR 10x; 200µM de dNTP´s; 50 mM de
DTT; 20 pmoles de cada uno de los iniciadores: D1 y D2
primers genéricos; 6U de inhibidor de RNAsas; 0.8 U de
Taq polimerasa; 1.6 U de RT; 50 mM de MgCl2 y agua
libre de RNAsas y DNAsas. c.b.p 50 µL. Se colocaron
los tubos en el termociclador corriendo un ciclo a 42ºC
durante una hora. Después de transcurrido ese tiempo
se corrieron 28 ciclos de amplificación (30 segundos a
94º C; 1 min. a 55o C y dos min. a 72º C por cada ciclo).
Técnica de electrofóresis
Concluidos los ciclos programados en el termociclador,
se procedió a evaluar las muestras por medio de la técnica
de electrofóresis, en gel de agarosa al 2%.
Se prepararon los geles, depositando en un
matraz, agarosa (tantos gramos como correspondía al
volumen final a preparar). Se agregó TAE 1X (tantos
mililitros como correspondan al volumen final a preparar)
para ajustar a una concentración al 2%. Se procedió a
calentar hasta disolver y fundir la agarosa. Después de
atemperar, se agregó bromuro de etidio (3.5 µL de un
stock cuya concentración es de 10 mg/ml), por cada gel,
mezclando bien para que el colorante se distribuyera
de manera homogénea en la solución. Se colocó en
la cámara de electroforesis, dejando gelificar. Una vez
gelificado se agregó buffer TAE 1X. Se colocó 8 µL
de muestra (productos de amplificación) más 4 µL de
solución de corrimiento (que contiene azul de bromofenol)
mezclando bien en papel parafilm y se colocó en los
pozos del gel, dejando el primer pozo libre para colocar
el marcador de peso molecular de 100 pares de bases.
Se conectó la cámara a la fuente de poder, aplicando 70
volts, durante 45 minutos.
9.- Una vez terminado el corrimiento de las muestras
en el gel se analizaron las mismas en el fotodocumentador
(analizador de imágenes), registrando e interpretando
los resultados.
Confirmación del serotipo 2 del virus del Dengue
por PCR anidada
Se tomo una alícuota de 5 µL del producto de
amplificación previo y se depositó en un tubo Eppendorf
de 200 µL, agregando: 45 µL de mezcla B que contiene:
5.5 µL de amortiguador de PCR 10X; 200 µM de dNTP´s;
20 pmoles del iniciador D1; 20 pmoles de los iniciadores
TS1 (específico para la detección del Serotipo 1), TS2
(específico para Serotipo 2), TS3 (específico para Serotipo
Tabla 1. Secuencia de iniciadores para serotipos del virus del Dengue
Iniciador
Secuencia
posición
Genómica
Tamaño del
producto
amplificado en
pares de bases
D1
5’-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’
134-161
511
D2
5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’
616-644
511
TS1
5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’
568-586
482
TS2
5’-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’
232-252
119
TS3
5’-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3’
400-421
290
TS4*
5’-TGTTGTCTTAAACAAGAGAGGTC-3’
502-524
389
51
bloqueo (PBS 1X suplementado con 1% de SFB y 4%
de inmunoglobulinas humanas) y se incubaron a 4ºC
durante 1 hora. Después de este tiempo las células fueron
centrifugadas a 2500 rpm durante 3 minutos, se retiró el
sobrenadante y posteriormente las células se incubaron
con 50 µL del anticuerpo monoclonal para TLR4-PE,
diluido 1:10 (de BD Pharmigen) con solución de tinción
(PBS suplementado con 1% de SFB) a 4ºC durante 15
minutos y en oscuridad. Se realizaron 2 lavados con
la misma solución amortiguadora (que consistieron en
centrifugar a 2500 rpm durante 3 minutos y descartar
el sobrenadante, mientras que el botón de células fue
resuspendido y se agregó 100 µL de buffer de fijación
(PBS 1X-4% de paraformaldehido) durante 15 minutos a
4ºC en oscuridad. Posteriormente las células se lavaron
2 veces y se resuspendieron en 400µL de solución de
tinción para análisis por citometría de flujo.
Protocolo de citometría de flujo
Fundamento:
La citometría (Cito=célula, metría=medición) es el
análisis de las características de células ya sea mediante
inspección al microscopio, o midiendo de manera
automatizada propiedades particulares de las células.
La citometría de flujo es una técnica de análisis celular
que implica medir las características de dispersión de luz
y fluorescencia que poseen las células conforme se las
hace pasar a través de un rayo de luz. Para su análisis
por citometría de flujo, las células deben encontrarse
individualmente en suspensión en un fluido. Las células
pueden hacerse pasar a muy altas velocidades, pueden
llegar a alcanzarse velocidades cercanas a las 100,000
células por segundo. Al atravesar el rayo de luz, las
células interaccionan con este causando dispersión de
la luz, basándose en la difracción de la luz en sentido
frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que
pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se
evalúa la granularidad o complejidad de estas. Además
de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis
se coloca a las células en presencia de anticuerpos
monoclonales marcados con moléculas fluorescentes,
se pueden evaluar que células poseen los antígenos
complementarios a los anticuerpos monoclonales
usados. El uso de moléculas fluorescentes distintas
(distintos colores de fluorescencia) permite analizar la
presencia de varios marcadores de manera simultánea.
Los citómetros de flujo pueden analizar partículas en
función de su fluorescencia y tamaño. Los conocidos
como separadores o “sorters” pueden también purificar
poblaciones de características determinadas.
Los aparatos de citometría de flujo pueden hacer
análisis multiparamétrico, es decir, pueden combinar
las medidas de distintos parámetros medidos sobre la
misma célula y relacionarlos (75).
Análisis estadístico
La significancia estadística de los resultados
obtenidos para la producción de citocinas, fue
determinada por el método de ANOVA de una vía y
prueba de comparación múltiple de Bonferroni utilizando
el software GranphPad PRISM 2.01. Los resultados del
análisis individual son mostrados en anexos.
RESULTADOS
En la presente investigación se estudiaron monocitos
humanos y células mononucleares in vitro para comprobar
si existe interacción entre el receptor TLR4 con el serotipo
2 del virus del Dengue mediante la evaluación de la
producción de mediadores inflamatorios tales como TNFα, IL-8 e IL-12 en el sobrenadante de monocitos humanos
estimulados con el serotipo 2 del virus Dengue mediante
el método de ELISA. Así mismo se investigó el efecto de
la infección por Dengue en la expresión del receptor TLR4
en monocitos humanos. La primera parte del proyecto,
consistió en la preparación del antígeno a investigar (virus
del Dengue serotipo 2). Esta se realizó propagando a
dicho virus a partir de una muestra clínica previamente
identificada como positiva para Dengue. Se inoculó la
muestra de suero en la línea celular C6/36 durante 7 días,
visualizando la replicación del virus al observar el efecto
citopático sobre la línea celular a medida que transcurrían
más días de cultivo Al término de los siete días, se empleo
este sobrenadante para inocular de nueva cuenta otro
cultivo de células C6/36 para realizar un segundo pase
del virus y aumentar el título viral en dicho sobrenadante.
La presencia del virus en el sobrenadante fue confirmada
mediante RT-PCR específica para virus Dengue como se
Procedimiento:
Para Investigar si existe modulación en la expresión
del receptor TLR4 humano durante la infección por
virus del Dengue, se siguió la siguiente estrategia
experimental:
Células mononucleares (1 x 106) fueron estimuladas
con virus Dengue durante 24 horas en placas de 24 pozos.
Después de este tiempo, las células fueron recolectadas
y centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos en tubos
de plástico. El sobrenadante fue alicuotado y congelado
hasta la realización de los ensayos de ELISA para conocer
la producción de citocinas inflamatorias, mientras que
las células se resuspendieron en 200 µL de solución de
52
describe en materiales y métodos Estos sobrenadantes
donde se demostró la presencia del virus propagado,
fueron analizados para su capacidad de inducir la
activación de monocitos humanos. Como indicador de
activación, se evaluó la producción de una citocina proinflamatoria humana: TNF-α. Se probaron diferentes
volúmenes del sobrenadante positivo para virus Dengue
2 (provenientes del segundo pase). El objetivo de emplear
diferentes volúmenes de sobrenadante fue conocer
cual era la dosis optima para inducir una activación y
producción significativa de mediadores inflamatorios
en monocitos humanos, sin provocar la aparición de
un fenómeno citotóxico exacerbado en los monocitos.
Al realizar la estimulación de monocitos humanos con
diferentes volúmenes de sobrenadante, encontramos que
con 100µL se inducía una buena cantidad de TNF-α por lo
que se decidió trabajar con este volumen en los ensayos
subsecuentes.
Todas las muestras analizadas para estimar la
concentración de citocinas se trabajaron en presencia de
estándares apropiados. A partir de un estándar (citocina
recombinante) se generaron las curvas respectivas para
hacer los ensayos cuantitativos.
Una vez establecida la dosis optima de antígeno
para inducir activación y producción de mediadores
inflamatorios, se procedió a realizar los ensayos de
estimulación de monocitos humanos con ausencia
o presencia de bloqueo para el receptor TLR 4
humano. Este bloqueo se llevó a cabo empleando
el anticuerpo monoclonal específico mencionado en
materiales y métodos. Este anticuerpo es capaz de
inhibir hasta en un 50 %, la producción de TNF-α en
células mononucleares humanas estimuladas con
LPS (molécula que ha demostrado ser un ligando para
TLR4). Este efecto de bloqueo por el anticuerpo puede
ser visto en la figura 5.
De esta forma monocitos humanos fueron
estimulados en presencia o ausencia de bloqueo para
TLR4, investigando la producción de TNF-α, en diferentes
individuos (figura 9). Los resultados obtenidos demuestran
claramente que al realizar el bloqueo del receptor TLR4, la
producción de TNF-α inducida por el virus del Dengue, se
abate considerablemente (estadísticamente significativo:
p < 0.001) y de manera reproducible. Este fenómeno
demostró ser independiente del origen de los monocitos
humanos, así como del tiempo de estimulación (24 o 48
horas). La respuesta obtenida en cuanto a cantidad de
TNF-α producido, fue variable para cada sujeto ensayado
y en comparación con la cantidad de TNF-α que se
observó con nuestro control positivo de LPS, mientras
que los monocitos humanos que no fueron estimulados,
no producen esta citocina.
Figura 5.- Efecto del bloqueo del receptor TLR4
por el anticuerpo antagonista clona HTA125 previo a la
adición del antígeno LPS. Barra morada: Producción de
TNF-� en células sin estímulo. Barra Azul producción
de TNF-� en células estimuladas con LPS. Barra
Amarilla: Producción de TNF-� en células a las cuales
se les bloquea el receptor TLR4 previo al estímulo con
LPS (72).
Figura 6.- Cuantificación de TNF-α por el método
de ELISA en monocitos humanos purificados a partir
de sangre periférica de diferentes individuos. A y B)
determinación a 24 horas, C) Determinación a 48 horas
post estímulo.
Otra mediador inflamatorio que fue analizado,
fue la quimiocina IL-8, la cual esta implicada en la
defensa del huésped en los primeros momentos
de la infección por el virus del Dengue. Al hacer el
análisis de IL-8, se logra observar que monocitos
humanos que permanecen sin estímulo, producen
IL-8 en niveles detectables. A las 24 y 48 horas hay
un ligero aumento en la producción de esta citocina
al comparar los monocitos humanos estimulados
con LPS y virus Dengue (con y sin bloqueo) contra el
53
control sin estímulo, sin embargo este aumento no fue
estadísticamente significativo (> 0.05). La producción
de IL-8 en células sin estímulo, es interpretada como
una producción basal en los individuos seleccionados
como donadores.
A continuación, se realizó la medición de IL-12, una
importante citocina que permite asociar la respuesta
inmune innata con la respuesta inmune específica. Las
mediciones de esta se realizaron a las 24 horas y 48
horas, observando que solo los monocitos humanos
estimulados con el control positivo (LPS) producen
esta citocina a estos tiempos. Las células estimuladas
con virus Dengue, así como las que fueron pre-tratadas
con el anticuerpo anti-TLR4 no producen esta citocina
como se muestra en la figura 11. Estos resultados son
validados por la producción de IL-12 en el control
positivo de LPS, el cual es un potente inductor de esta
citocina.
Figura 8.- Cuantificación de IL-12 por el método
de ELISA en monocitos humanos purificados a partir
de sangre periférica de diferentes individuos. A y B)
determinación a 24 horas, C) Determinación a 48 horas
post estímulo
Figura 7.- Cuantificación de IL-8 por el método
de ELISA en monocitos humanos purificados a partir
de sangre periférica de diferentes individuos. A y B)
determinación a 24 horas, C) Determinación a 48 horas
post estímulo.
A continuación se analizó la expresión del receptor
TLR4 por citometría de flujo. Los resultados de citometría
obtenidos, muestran que la estimulación de monocitos
humanos con el serotipo 2 del virus del Dengue, induce la
desregulación del receptor TLR4 en la superficie celular
a las 24 horas postestímulo, al favorecer la disminución
en la expresión del receptor (proteína) en esta población
celular. Esta desregulación en la expresión del receptor
TLR4 esta en contraste con lo que se observó al realizar
el análisis de monocitos humanos que permanecen sin
estimular en presencia de medio de cultivo solamente
(Figura 9).
Figura 9.- el color Azul muestra la expresión de
control de isotipo que es el control negativo, el color
Rojo muestra la expresión de TLR4 en las células que no
fueron estimuladas con el serotipo 2 del virus del Dengue
y el color Verde muestra la expresión del receptor TLR4
en las células que fueron estimuladas con el serotipo 2
del virus del Dengue
54
DISCUSIÓN
comparando contra la misma línea celular transfectada
con estos receptores). Los resultados, abren la posibilidad
de que en un futuro, este conocimiento pueda sentar las
bases para la intervención molecular en la enfermedad,
directamente al inhibir la ruta de señalización que es
activada a través de TLR4. La inhibición en la producción
de TNF-α, ha demostrado disminuir la severidad de los
cuadros severos por Dengue.
El efecto de bloqueo fue selectivo para la citocina
TNF-α, ya que al analizar la producción de IL-8 e IL-12,
no hubo diferencias al comparar las células estimuladas
(con o sin bloqueo para TLR4) contra células control
que no lo fueron (células sin estímulo) lo cual nos lleva
a pensar que posiblemente el receptor TLR4 no participa
en la producción de estos mediadores inflamatorios a
diferencia de el LPS.
Por otra parte, en este trabajo se encontró que
el virus del Dengue promueve un cambio fenotípico
de monocitos humanos, que no ha sido reportado
previamente y que puede tener dos importantes
interpretaciones biológicas:
La disminución en la expresión de un receptor de
alerta dentro del sistema inmune innato del hospedero
como lo es TLR4 (al desaparecer el receptor sobre la
superficie de los monocitos humanos), podría conferirle
una ventaja al virus durante la infección, al dejar de
inducir la producción sostenida de TNF-α, el cual ha sido
descrito como un mediador clave para el combate de la
infección).
El disminuir la expresión del receptor TLR4,
podría ser un mecanismo de protección natural de los
monocitos humanos ante la infección, para evitar una
producción sostenida y exacerbada de TNF-α, que en
exceso, puede llevar a complicar la sintomatología del
hospedero, confiriendo protección al hospedero.
Finalmente, otro de los aportes de este trabajo, lo es
el beneficio social que se desprende de la realización del
mismo. Uno de esos beneficios, lo fue la estandarización
de todas las técnicas que se requirieron para poder
realizar este trabajo, ya que permitirán continuar con
trabajos de investigación básica en el área de inmunología
molecular, específicamente en el estudio de la respuesta
inmune a virus Dengue, área en la cual, nuestro grupo
de investigación es pionero en el estado de Veracruz.
La generación de conocimiento, objetivo central de
la investigación básica, es una de las áreas que en el
campo de la salud pública, poco se había explorado en
nuestro estado. Trabajos como el presente, contribuyen
al incorporar precisamente este tipo de investigación en
el quehacer diario, así como también en formar recursos
humanos con las bases suficientes para continuar hacia
estudios de postgrado.
En el presente trabajo, se estudio desde el punto de
vista de la respuesta inmune innata al virus del Dengue,
el cual es uno de los principales agentes patógenos de
nuestra entidad y es considerado en el campo de la salud
pública, como un problema re-emergente a nivel mundial.
Una de las principales motivaciones para realizar
este estudio, lo fue la carencia de información acerca de
los mecanismos moleculares que el virus emplea para
inducir el cuadro inflamatorio sistémico tan característico
de la enfermedad, así como la creciente información con
respecto a la participación de una familia de receptores
de respuesta inmune innata en el humano como lo son
los receptores homólogos a Toll (TLRs).
Para el planteamiento del trabajo, así como para
sustentar la hipótesis del mismo, se tomó en cuenta
algunos antecedentes importantes que nos hablan de
la importancia que tiene TLR4 en asociación con otro
receptor denominado CD14, en el reconocimiento de
moléculas presentes en patógenos, tales como el LPS
de las bacterias Gram negativas (40-50) y de algunos virus
tales como el virus sincicial respiratorio (51). Así mismo
otro antecedente importante para realizar este trabajo,
fue el hecho de que el LPS en monocitos/macrófagos
humanos, ha demostrado inhibir la entrada del virus por
un mecanismo dependiente de CD14 y de un receptor
no caracterizado al momento de realizado el estudio (70).
Estos antecedentes fueron la base para pensar en una
interacción entre el serotipo 2 del virus del Dengue y
TLR4.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo son
muy alentadores, ya que encontramos que bloqueando
al receptor TLR4 en monocitos humanos empleando
un anticuerpo antagonista (comercial) monoclonal y
específico, se inhibió en un porcentaje significativo
la producción de uno de los principales mediadores
inflamatorios durante la infección por Dengue: TNF-α.
La producción de TNF-α es un indicador inequívoco de
activación celular en monocitos humanos y de hecho
es una de las citocinas que como se describió en el
marco teórico, participa en la inmunopatogénesis de
la enfermedad. Las células que fueron pre-incubadas
en presencia del anticuerpo bloqueador para TLR4 y
después estimuladas con virus Dengue, no produjeron
una cantidad abundante de TNF-α, a diferencia de las
que no fueron bloqueadas, pero si fueron estimuladas
con virus Dengue. Estos resultados son muy importantes
y sientan las bases para profundizar más en esta
línea de investigación, empleando otras estrategias
experimentales (por ejemplo empleando líneas celulares
que carezcan de la expresión de TLR4 y CD14 y
55
CONCLUSIÓN
BIBLIOGRAFÍA
Respondiendo la pregunta propuesta en el
planteamiento del problema y de acuerdo a los resultados
obtenidos mediante la estrategia experimental ya
descrita, se concluye que:
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1. El receptor TLR4 participa en el reconocimiento y
la activación inducida por el serotipo 2 del virus del
Dengue en monocitos humanos ya que el bloqueo
con un anticuerpo monoclonal específico para
TLR4 impide selectivamente la secreción de TNF-α,
principal citocina inflamatoria que es producida in vivo
e in vitro.
2. Los resultados obtenidos de la medición de IL8, sugieren que la producción de este mediador
inflamatorio, no se da como una consecuencia del
reconocimiento del virus a través de TLR4, pues al
comparar células estimuladas que fueron además
bloqueadas, contra las que no lo fueron, se obtuvo
diferencias que no son estadísticamente significativas.
3. En el modelo evaluado (monocitos humanos) y bajo
nuestras condiciones, no hubo producción de IL-12,
tanto en células estimuladas sin bloqueo de TLR4,
como en donde se bloqueo el receptor.
4. Los resultados obtenidos por citometria de flujo
nos demuestran que la estimulación de monocitos
humanos con el serotipo 2 del virus del Dengue,
promueve un cambio fenotípico en esta población, al
promover la disminución en la expresión del receptor
TLR4, que no ha sido reportado previamente.
56
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59
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Félix Guillermo Márquez-Celedonio1, Amparo López-García2, Ana Silvia Sabido-Siglher3,
Aída Verónica Blanco-Cornejo4, Elizabeth Soler Huerta5, Manuel Saiz-Calderón Gómez6
1
Coordinador Clínico de Educación e Investigación en Salud. Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Diaz Mirón
s/n, Veracruz, Ver.
2
Residente de Medicina Familiar. Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Veracruz, Ver.
3
Profesor de Residencia de Medicina Familiar, Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Veracruz, Ver.
4
Coordinador delegacional de educación en salud. Instituto Mexicano del Seguro Social, Jalapa, Ver.
5
Coordinador delegacional de investigación en salud. Instituto Mexicano del Seguro Social, Jalapa, Ver.
6
Médico Familiar, Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Veracruz, Ver.
MARCO TEÓRICO
esfuerzos en obtener un aprendizaje homogéneo. Estas
tendencias educativas se fundamentan en un enfoque
epistemológico que considera al conocimiento como
único, uniforme, rígido, acabado y desvinculado de la
práctica y el entorno del estudiante. Sin embargo, cada
vez un mayor número de docentes del área médica
implementan estrategias participativas de aprendizaje
encaminadas a la elaboración del conocimiento que
muestran resultados alentadores6, 7.
El Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) otorga
servicios de atención a la salud a cerca de la mitad de la
población mexicana, de ello 85% se proporcionan en las
unidades de medicina familiar lo cual corresponde a 65
millones de consultas al año8. El médico familiar es el eje
de las actividades de atención médica y es responsable
de la salud de aproximadamente 2400 derechohabientes
adscritos a su consultorio con el objetivo de “proporcionar
atención médica integral y continua con enfoque procesal
que favorezca el trato humanista, la oportunidad, la
calidad y la eficiencia, que propicie la modificación del
estado de enfermedad a través del diagnóstico temprano
con enfoque de riesgo, el tratamiento oportuno, la
limitación del daño y la rehabilitación temprana; para
su curación, mejoría, paliación y pronta reintegración a
su medio familiar, laboral y social”9. Por lo anterior, se
realiza un esfuerzo institucional de gran magnitud para
satisfacer las necesidades de capacitación, actualización
y formación de nuevos profesionales en el área de la
salud que permite alcanzar este objetivo por medio del
acceso de aproximadamente 25% de todo el personal
a cursos de educación continua y 6000 especialistas
en formación cada año4. Desde 1954 se han venido
preparando médicos cuyos estudios son reconocidos
a partir de 1964 por las principales universidades del
país.1
Las unidades docentes de medicina familiar han
jugado un papel destacado en el desarrollo del primer
nivel de atención en nuestro país.1,3,8,10. A partir del año
La aptitud clínica es entendida como una cualidad
caracterizada por el perfeccionamiento de las acciones
de diagnóstico y tratamiento que se enriquece con la
experiencia clínica.1 Es también considerada como la
capacidad del médico para resolver situaciones clínicas
problematizada a partir de casos reales de complejidad
variable donde debe discriminar y poner en juego su juicio
clínico para optar entre alternativas de interpretación,
decisión o acción. Esta estrategia nos permite asimismo
evaluar los resultados del aprendizaje obtenido a través
de cursos formativos2.
El concepto se ha desarrollado a partir de la búsqueda
para establecer estrategias participativas de aprendizaje
y de evaluación que no sólo midan la información
retenida a través de la memorización3. Se considera,
por tanto, un elemento propio de la elaboración del
conocimiento, específicamente dentro de las aptitudes
prácticas relativas a ciertos ámbitos de la experiencia
que implican la interacción e influencia deliberada sobre
otras personas y la aplicación de capacidades complejas
que van desde la obtención confiable de los datos a
través del interrogatorio médico hasta la jeraquización
apropiada de los problemas del paciente. Es evidente
que alcanzar un elevado nivel de dominio de estas
capacidades solo es posible con procesos educativos
que se enfoquen a la elaboración del conocimiento a
través de la vinculación teoría-práctica, discusión crítica
e investigación4, 5. Sin embargo, hasta ahora, en los
diferentes niveles educativos y formativos de médicos
–desde la formación en las escuelas y facultades
de medicina hasta el postgrado- las tendencias de
aprendizaje se orientan en gran parte hacia un enfoque
pasivo donde el profesor es el experto y depositario del
saber y su responsabilidad trasmitir el conocimiento, o
bien el profesor asume el papel de reproductor y asigna
al alumno el rol de consumidor y centra por tanto sus
61
2000 el Instituto Mexicano del Seguro Social inició, con
la participación de diversos actores un programa cuyo
objetivo fue establecer una estrategia que llevará a la
mejora en la calidad de los servicios que se ofrecen en
Medicina Familiar. De esta forma se estructura el proceso
de mejora de Medicina Familiar a partir del concepto de
atención integral a la salud y la articulación de todos
los servicios en la Unidad de Medicina Familiar10,11. La
estrategia de educación médica continua denominada
visita de profesores al mismo tiempo que la elaboración
de 12 guías para el diagnóstico y manejo de los
padecimientos de mayor demanda y trascendencia en la
consulta del médico familiar son dos de sus elementos
orientados a elevar la calidad técnica de los médicos
familiares. La estrategia consistió en asesoría en el
consultorio para resolver problemas de diagnóstico,
lectura de la literatura médica para ampliar la información
del tema revisado, discusión en el aula de casos clínicos
problematizados, revisión con paciente-tutor para
profundizar en la semiología y discusión del expediente
clínico para valorar sus limitaciones y alcances 12.
Teniendo en cuenta lo anterior consideramos que
la estrategia de aprendizaje de la clínica implementada
con la visita de profesores es algo más que aspectos
instrumentales (objetivos, módulos o guías). Cuando
se considera que además de las actividades clínicas
(asesoría, paciente, tutor y discusión del expediente),
se profundiza en la discusión de casos clínicos
problematizados y el alumno progresa en su destreza
para criticar la información poniendo en juego su juicio
clínico en la aplicación de las capacidades complejas ya
podemos hablar del desarrollo de la aptitud clínica13.
Hasta el momento no existen publicaciones que
muestren como ha influido este proceso en el desarrollo
de la aptitud clínica de los médicos familiares. La presente
investigación tiene como objetivo medir el impacto de la
estrategia de visita de profesores en el desarrollo de la
aptitud clínica de los médicos familiares evaluada a través
de un instrumento elaborado y validado para este estudio.
forma global la aptitud clínica en médicos familiares.
Para evaluar la aptitud en el manejo de preeclampsiaeclampsia por médicos familiares Pérez Cervantes et
al15 desarrollaron un instrumento con consistencia de
0.80. Otros instrumentos con confiabilidad aceptable han
sido elaborados para evaluar la aptitud en el manejo
de familia16, hipertensión arterial y diabetes mellitus 17.
Este tipo de instrumento permite que el médico evaluado
ponga en juego su capacidad para identificar situaciones
clínicas variadas, discriminar entre decisiones y acciones
útiles, pertinentes y oportunas y distinguirlas de aquellas
perjudiciales, inoportunas o simplemente inútiles.
Garcia Mangas JA y colaboradores8 en un estudio
con diseño transversal evaluaron la aptitud clínica en
499 médicos de primer nivel de atención (generales,
con especialidad en medicina familiar y médicos con
funciones directivas) adscritos a unidades de medicina
familiar con más de 10 consultorios. Cuatrocientos treinta
médicos (86.2%) quedaron incluidos en la categoría de
aptitud incipiente o menor; la puntuación mas alta fue
entre los médicos familiares con especialidad (mediana
de 178) y con funciones de jefe de departamento clínico
(mediana 170) en comparación con médicos generales
sin especialidad (mediana 153). No se encontraron
diferencias por antigüedad de la práctica clínica, es decir
la experiencia médica expresada en años de antigüedad
no influyó en la aptitud clínica alcanzada en este estudio.
Los autores consideraron que su investigación representa
una aproximación al primer nivel de atención en el IMSS
y que sus resultados no difirieren sustancialmente de los
reportados en otras publicaciones.
La aptitud clínica en preeclampsia-eclampsia fue
explorado por Pérez-Cervantes, BA et al15 el diseño del
estudio fue transversal e incluyó a 193 médicos familiares
de once unidades de medicina familiar en el Distrito
Federal. En la distribución de los médicos según grado
de desarrollo de la aptitud, el mayor número se ubicó en
nivel medio (51.8%) con solo siete (3.6%) en el rango
alto. Adicionalmente, este estudio encontró una mayor
aptitud en médicos con más de 15 años de antigüedad
laboral (mediana 82), con especialidad en medicina
familiar (mediana de 85 versus 76.5 de quienes no tenía
especialidad) y capacitación en preeclampsia-eclampsia
con tiempo menor a 5 años (mediana 85). El turno laboral
y los años de egreso de la licenciatura no mostraron
diferencias estadísticamente significativas. Se concluyó
que la aptitud clínica en preeclampsia-eclampsia en el
grupo de médicos estudiados alcanzó un nivel medio,
mas alto del que se habían planteado en la hipótesis
y de acuerdo con los investigadores, probablemente
debido a la inquietud que provoca el padecimiento dada
su elevada morbilidad y mortalidad.
ANTECEDENTES CIENTIFICOS
La aptitud clínica se ha medido en diferentes
niveles académicos y especialidades; se ha explorado
en médicos internos de pregrado, residentes de
especialidades médicas y especialistas formados, tanto
familiares como de otras ramas de la medicina. Asimismo
a partir de la propuesta del concepto por Viniegra 14,
diversos autores han elaborado, validado y aplicado
instrumentos que miden diferentes aspectos de la aptitud
clínica. García Mangas y Viniegra Velazquez8 elaboraron
un instrumento con confiabilidad de 0.94 que mide en
62
Sabido-Siglher, C y Viniegra-Velázquez, L,17
encontraron en un estudio transversal un nivel de aptitud
en diabetes mellitus bajo en el 57% de los médicos de
primer nivel de atención incluidos; no hubo calificaciones
de nivel alto o muy alto. Las puntuaciones obtenidas
por indicador fueron superiores a 40% con excepción
de reconocimiento de indicios clínicos y paraclínicos,
integración diagnóstica y crítica al colega que obtuvieron
37 a 39. Los autores encontraron evidencias de un
mayor desempeño clínico, estadísticamente significativo,
en la unidad médica con menor carga de trabajo pero
sin diferencias en la aptitud o competencia clínica.
Concluyen que los resultados obtenidos por los médicos
ante situaciones clínicas problematizadas muestran
que su experiencia clínica no propicia el refinamiento y
acuciosidad de sus acciones.
El manejo de familia es una característica particular
del perfil del médico familiar. La aptitud clínica en este
campo fue abordado por Chávez-Aguilar V y AguilarMejía E., quienes elaboraron un instrumento con cinco
casos familiares y 235 reactivos agrupados en once
indicadores propios del estudio de la salud familiar:
tipología familiar, ciclo de vida familiar, exploración del
ámbito social, psicológico y biológico; factores de riesgo
psicosocial, subsistemas familiares, funciones de los
integrantes, comunicación familiar, vínculos familiares y
funcionalidad familiar. El estudio incluyó a 560 residentes
de segundo año del curso de especialidad en Medicina
Familiar del IMSS de 37 sedes de todo el país quienes
obtuvieron promedio de 91 de una puntuación de 235
reactivos que era la máxima esperada (rango de -22 a
154) y la mayor proporción, 368 (65,7%) alcanzó aptitud
en el rango intermedio16. Los autores interpretan la baja
calificación obtenida como reflejo de una escasa reflexión
de la experiencia cotidiana en el manejo de la familia
y consideraron que sus resultados son similares a los
encontrados en otros estudios que han medido aptitud
clínica en residentes de posgrado18.
Existen estudios en otras especialidades; PérezCampos JP19 y colaboradores abordaron la aptitud para
interpretación de imágenes gamagráficas en residentes
de medicina nuclear. Los autores construyeron un
instrumento específicamente para el estudio formado
por siete casos clínicos tomados de la práctica cotidiana
cada uno de los cuáles se acompañó de las imágenes
respectivas. En total se constituyó con 90 enunciados
en siete indicadores específicos del campo clínico,
reconocimiento del control de calidad de la imagen,
identificación de normalidad y anormalidad, asociación
diagnóstica por imágenes, interpretación errónea por
omisión, interpretación errónea por comisión, crítica a
las acciones e integración diagnóstica global. En total 12
residentes (63.2%) obtuvieron un nivel de aptitud bajo
aunque se observa una tendencia hacia aumento de
la aptitud al incrementarse los años de formación. En
el trabajo se concluyó que el instrumento fue apropiado
para detectar el grado de refinamiento de la experiencia
formativa y consideran que indagar el desarrollo de
aptitudes es una aproximación para valorar los alcances
de los procesos formativos y una alternativa que permite
reorientar los esfuerzos educativos para obtener mejores
resultados.
Experiencias similares se han obtenido
en estudios que han evaluado la aptitud de médicos
residentes de anestesiología, pediatría, en internos de
pregrado y en rotación por unidades rurales del sistema
IMSS-Oportunidades18, 19. Se considera que los bajos
niveles obtenidos en la aptitud clínica en diferentes
categorías de médicos y grados de formación están
asociados al predominio de tendencias pasivas de la
educación en las escuelas y facultades de medicina que
privilegian el aprendizaje memorístico desvinculado de la
práctica y el entorno del estudiante sobre un aprendizaje
participativo que fomente la reflexión y la crítica en un
enfoque de elaboración del conocimiento.
MATERIAL Y METODOS
Población
Se consideró como universo elegible la totalidad de
los médicos familiares adscritos a la Unidad de Medicina
Familiar No. 61 del Instituto Mexicano del Seguro
Social en la ciudad de Veracruz, Ver., Los criterios de
inclusión fueron: médicos familiares con adscripción a
consulta externa de medicina familiar, de cualquier edad,
sexo o antigüedad en el trabajo. Fueron eliminados los
médicos familiares que no presentaron alguna de las dos
evaluaciones y aquellos que su porcentaje de asistencia
a la intervención fuera menor al 80%.
Métodos
Se realizó un estudio pre-experimental con diseño
test-retest para determinar el efecto de una estrategia
educativa basada en visita de profesores (variable
independiente) sobre la aptitud clínica de médicos
familiares (variable dependiente). Como objetivo
intermedio se consideró la elaboración y validación de
un instrumento con consistencia aceptable para medir
aptitud clínica en los seis padecimientos incluidos en la
estrategia educativa.
La estrategia educativa consistió en visita de
profesores expertos en cada una de las especialidades
médicas relacionadas con los temas de la segunda
63
etapa del programa de Proceso de Mejora de Medicina
Familiar. En total se realizaron seis cursos que incluyeron
la evaluación, diagnóstico y manejo integral de dispepsia,
urosepsis, osteoartrosis, lumbalgia, traumatismo de
mano y tuberculosis. Cada curso tuvo una duración de
30 horas a la semana distribuidas en seis horas diarias
durante las cuales el profesor tutor permanecía en el
consultorio las cuatro primeras horas para proporcionar
en forma conjunta la atención médica a los pacientes
con la enfermedad y asesorar en forma directa al médico
familiar. Dos horas de la jornada diaria se reservaron para
actividades en aula que incluyeron revisión bibliográfica,
discusión de las guías integrales de diagnóstico y
manejo, análisis de expedientes clínicos y valoración
con paciente tutor. Durante estas actividades se fomentó
un ambiente de participación y reflexión crítica a partir de
la experiencia individual y su contrastación grupal.
Para medir la aptitud clínica se elaboró un instrumento
que incluyó un caso clínico real obtenido de la consulta
externa de medicina familiar de cada uno de los seis
padecimientos considerados en la estrategia educativa.
Para la validez de contenido se identificaron siete
indicadores del proceso de la atención en medicina familiar:
Reconocimiento de factores de riesgo, reconocimiento de
síntomas clínicos, integración diagnóstica, uso de recursos
de diagnóstico, uso de recursos terapéuticos, omisión y
comisión iatropatogénica. Para cada indicador se diseñaron
tallos de preguntas con items en sentido afirmativo y
referidos al caso que tenían que ser respondidas como falso,
verdadero o no se. Las respuestas correctas sumaban un
punto, mientras que las incorrectas restaban uno y las no
sé, no sumaban ni restaban. Para concluir el proceso de
validación de contenido se paso a ronda de tres expertos
en el tema y metodología participativa de aprendizaje
permaneciendo el instrumento con 176 preguntas.
Finalmente se determinaron el número de respuestas
debidas al azar y la confiabilidad del instrumento.
Wilcoxon. También se efectuó análisis comparativo
entre los turnos para lo cual se empleó la Prueba U de
Mann Whitney. El nivel de significancia estadística se
estableció en 0.05.
RESULTADOS
De una población de 42 médicos
familiares
elegibles para el estudio se incluyeron 33 (78.6%) que
reunieron los requisitos de ingreso y permanencia en la
investigación. Con fines de comparación se integraron
dos grupos según el turno al que estuvieran adscritos:
turno matutino (n=17) y vespertino (n=16). La edad del
grupo del turno matutino fue de 51.19 + 2.54 (media y
desviación estándar) y del grupo del turno vespertino de
52.12 + 1.50 (p > 0.05). En el grupo del turno matutino
12 (70.6%) fueron de sexo femenino y en el vespertino
10 (62.5%) fueron mujeres (p > 0.05).
El instrumento para medir la aptitud clínica de los
médicos familiares obtuvo una consistencia de 0.80
con la Prueba de Kuder Richardson y el número de
respuestas debidas al azar fue de 27 con la Prueba de
Pérez Padilla-Viniegra.
La aptitud clínica de los médicos familiares de
ambos turnos antes de iniciar la intervención educativa
se ubicó en azar y muy baja en 25 (75.8%) médicos y
en la medición post-intervención la proporción de estas
categorías fue menor con 15 (45.5%). Asimismo 13
(39.3%) médicos se ubicaron en rangos de regular a muy
alto después de la aplicación de la estrategia educativa
en comparación con 3 (9.1%) en la evaluación inicial (p
< 0.05). La mediana y rango global de calificación pasó
de 44 (26 – 70) en la medición previa a 58 (11 – 142) en
la medición final. (Cuadro I).
Los siete indicadores de aptitud clínica mostraron
incrementos en la puntuación de las mediciones posterior a
la aplicación de la estrategia de visita de profesores y excepto
por reconocimiento de indicios clínicos las diferencias fueron
estadísticamente significativas (p < 0.05). (Cuadro II)
En el análisis comparativo entre los turnos de
atención médica se encontró que antes de la aplicación
de la estrategia de visita de profesores la aptitud clínica
se ubicó en azar y muy bajo en 13 (76.47%) de los
médicos familiares del turno matutino y 12 (75%) del
turno vespertino, diferencia que no fue estadísticamente
significativa (p > 0.05). En contraste después de la
intervención educativa 10 (58.8%) y 8 (50%) médicos del
turno matutino y vespertino respectivamente se ubicaron
en las categorías de aptitud clínica de baja a muy alta. La
mediana de calificación de 44 y 45 antes de la intervención
y 58 y 57 después, para los turnos matutino y vespertino
respectivamente con diferencia estadísticamente
Análisis estadístico
Las mediciones de la aptitud clínica se realizaron con
el instrumento validado antes de iniciar la intervención
educativa y al final. La calificación se obtuvo después
de restar al total de respuestas correctas el número de
las incorrectas y las puntuaciones se categorizaron en la
siguiente escala: azar, muy bajo, bajo, regular, alto y muy
alto. Para determinar el número de respuestas por azar se
empleó la Fórmula de Pérez Padilla-Viniegra y La Fórmula
de Kuder-Richardson para la consistencia del instrumento.
Las puntuaciones obtenidas se expresaron en
mediana y rango y la comparación para determinar
significancia estadística se realizó con la Prueba de
64
significativa (p < 0.05) para los médicos matutinos.
(Cuadro III). El análisis por indicador mostró incremento
en las medianas de los siete indicadores de aptitud clínica
en los médicos de ambos turnos, pero la diferencia fue
estadísticamente significativa (p < 0.05) en el indicador de
omisión iatropatogénica del turno vespertino (Cuadro IV).
investigación son alentadores ante la posibilidad de que su
aplicación y la incorporación de programas académicos
basados en la crítica de la experiencia desde las etapas
formativas de los futuros médicos y especialistas así
como la mejora en los ambientes académicos podrían
revertir la situación actual. Estamos de acuerdo con los
autores citados en cuanto a que el bajo nivel de aptitud
clínica que se ha obtenido en los estudios previos tanto en
médicos familiares como de otras especialidades médicas
y con diferentes grados de formación académica asi como
en la valoración inicial del presente trabajo con médicos
familiares se debe principalmente a la influencia de un
aprendizaje tradicional que ha fragmentado el conocimiento
en dimensiones (afectiva, psicomotora y cognoscitiva) o
bien en objetivos de aprendizaje específicos separando
la teoría y la práctica y dejando de lado la reflexión y la
crítica. Sin embargo, este bajo nivel de aptitud clínica
no necesariamente se correlaciona con un bajo nivel de
desempeño técnico-médico o desarrollo insuficiente de las
habilidades psicomotoras necesarias para la realización
de procedimiento de diagnóstico o terapéuticos y su
asociación con la calidad de los servicios médicos aún
está pendiente de ser evaluada. En cambio, si creemos
que una mejor aptitud clínica facilitará una práctica médica
más comprometida a nivel individual y social, oportuna y
apropiadas al paciente y ello se reflejará necesariamente
en la calidad de la atención médica.
Si bien el diseño del estudio fue adecuado para el
logro de los objetivos de investigación al demostrarse la
eficacia de la estrategia de visita de profesores para mejorar
la aptitud clínica de los médicos familiares, el trabajo
presenta limitaciones metodológicas que pueden ser
consideradas en estudios posteriores. Es conveniente que
nuevos proyectos establezcan una comparación no solo
entre el antes y después de la intervención, sino además
con un grupo control que sea intervenido con el enfoque
tradicional. Los seis padecimientos seleccionados para
la presente intervención son enfermedades frecuentes y
trascendentes en el primer nivel de atención, sin embargo
no son las que tienen mayor demanda de los servicios
médicos. Es necesarios que nuevos estudios consideren
una muestra representativa de los padecimientos del
primer nivel de atención, se incorporen otros aspectos
del perfil del médico familiar tales como la atención
anticipatoria, continuada, integral y que considere los
factores de la dinámica familiar. Con ello se obtendría
un mayor acercamiento a lo que es la aptitud clínica en
medicina familiar.
Se concluye que la estrategia participativa de
aprendizaje en la modalidad de visita de profesores tiene
un efecto favorable en la aptitud clínica de los médicos
familiares, sin importar el turno de adscripción.
DISCUSIÓN
La aptitud clínica es la capacidad del médico para
analizar en forma reflexiva y crítica los eventos y procesos
relacionados con el curso clínico de la enfermedad y las
intervenciones de diagnóstico y tratamiento médicos
sin dejar de considerar la valoración de los factores de
riesgo. De la misma manera que estudios previos 8, 15,
19, la aptitud clínica de los médicos familiares previa a la
intervención educativa fue baja o incipiente. Sin embargo,
en la presente investigación educativa se encontró que la
estrategia de visita de profesores, que incluye modelos
participativos de aprendizaje se relacionó con un incremento
de la aptitud clínica tanto global como en los indicadores de
reconocimiento de factores de riesgo, reconocimiento de
indicios clínicos, integración diagnóstica, uso de recursos
diagnósticos y terapéuticos y comisión iatropatogénica.
Con lo anterior podemos considerar que estrategias
participativas de aprendizaje como las diseñadas en la
investigación favorecen el desarrollo de capacidades
complejas en el proceso de formación médica y facilitan la
toma de decisiones oportunas y adecuadas en el campo
de la atención clínica.
Otrosestudios20hanmostradocomolaimplementación
de microambientes educativos promotores de la discusión
favorecen la interacción grupal e incrementan la discusión
y el debate, elementos de elaboración del conocimiento.
La intervención educativa que establecimos favoreció la
interacción entre médico-docente y médico-alumno en
situaciones reales de la atención médica; en las sesiones
en aulas se reflexionó críticamente sobre el quehacer y
la toma de decisiones en el proceso clínico, se dejaron
atrás las posturas docentes tradicionales del profesor
como único portador del conocimiento y del alumno
pasivo y receptor de la información. Más que buscar un
aprendizaje significativo la estrategia se enfocó a que el
conocimiento elaborado tuviera sentido para el médicoalumno al referirse a su entorno clínico, administrativo,
social y epidemiológico habitual.
Los resultados del estudio concuerdan con los
obtenidos por García Mangas y Leonardo Viniegra8, Soler
Huerta, et al1 y Pérez Cervantes et al15, en el sentido de que
la aptitud clínica tiene un nivel que no es el deseable o se
encuentra poco desarrollada. Sin embargo los resultados
obtenidos con la estrategia educativa que se aplicó en esta
65
Cuadro I. Aptitud clínica de Médicos Familiares antes y después de la Estrategia de visita de Profesores
n = 33
Antes
Después
Azar
2 (6.1%)
6 (18.2%)
Muy bajo
23 (69.7%)
9 (27.3%)
Bajo
5 (15.2%)
5 (15.2%)
Regular
3 (9.1%)
8 (24.2%)
Alto
0 (0%)
3 (9.1%)
Muy alto
0 (0%)
2 (6.1%)
Mediana
44
58*
Rango
26 - 70
11 - 142
* Valor de p < 0.05 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon
** Valor de p = 0.07 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon
Cuadro II. Aptitud clínica por indicadores antes y después de la Estrategia de visita de profesores
INDICADOR
Items
Antes
Después
Mediana
Rango
Mediana
Rango
Valor de
p*
Reconocimiento de
Factores de Riesgo
23
5
(-5 a 15)
8
(-4 a 23)
0.042
Reconocimiento de
Indicios clínicos
49
11
(-1 a 23)
19
(-9 a 47)
0.087
Integración
diagnóstica
23
6
(-5 a 17)
11
(-3 a 21)
0.011
Uso de recursos
diagnósticos
10
0
(-4 a 8)
2
(-2 a 10)
0.01
Uso de recursos
terapeúticos
15
6
(2 a 11)
9
(1 a 15)
0.046
Omisión
yatropatogénica
35
13
(3 a 23)
17
(5 a 33)
0.007
Comisión
yatropatógenica
21
5
(-1 a 15)
7
(-7 a 21)
0.031
*Valor de p < 0.05 obtenido con Prueba de Wilcoxon
66
Cuadro III. Aptitud clínica de Médicos Familiares según turno de adscripción antes y después de la visita de Profesores
Turno Matutino
n
Turno Vespertino
= 17
n
= 16
Antes
Después
Antes
Después
Azar
1 (5.9%)
3 (17.7%)
1 (6.3%)
3 (18.8%)
Muy bajo
12 (70.6%)
4 (23.5%)
11 (68.8%)
5 (31.3%)
Bajo
4 (23.5%)
4 (23.5%)
1 (6.3%)
1 (6.3%)
Regular
0 (0%)
4 (23.5%)
3 (18.8%)
4 (25%)
Alto
0 (0%)
2 (11.8%)
0 (0%)
1 (6.3%)
Muy alto
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
2 (12.5%)
Mediana
44
58*
45
57**
Rango
26 - 70
11 - 142
26 - 64
11 - 158
* Valor de p < 0.05 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon
** Valor de p = 0.07 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon
Cuadro IV. Aptitud Clínica por indicador antes y después de la Visita de Profesores
Comparación según turno de adscripción
Turno
Matutino **
n = 17
Turno Vespertino**
n = 16
INDICADOR
Items
Antes
Después
Antes
Después
Reconocimiento de
Factores de Riesgo
23
3
7
5
9
Reconocimiento de
Indicios clínicos
49
13
17
11
19
Integración diagnóstica
23
7
11
5.5
10
Uso de recursos
diagnósticos
10
2
4
0
2
Uso de recursos
terapeúticos
15
5
9
6
8
Omisión iatropatogénica
35
13
16
15
18*
Comisión iatropatógenica
21
5
6
5.5
10
*Valor de p < 0.05 obtenido con Prueba de Wilcoxon
**Valores expresados en medianas
67
REFERENCIAS
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68
Densidad prostática del ARNm
del receptor a estrógenos β en respuesta
a la conducta sexual de la rata
José Locia Espinoza1, Abraham H. Soto Cid2, María Elena Hernández1,
Milagros Silva1, Gonzalo E. Aranda1 y Jorge Manzo1
1
Instituto de Neuroetología. Dr. Luis Castelazo Ayala s/n, Col. Industrial Ánimas, CP. 91190, Xalapa, Ver.
2
Facultad de Química Farmacéutica Biológica. Calle La Pérgola, Circuito Universitario Gonzalo Aguirre Beltrán, CP. 91000, Xalapa, Ver.
INTRODUCCIÓN
proteasas, esterasas y fosfatasas, además, es la principal
glándula productora de citrato del organismo2.
La conducta sexual de la rata macho influye en
la fisiología de glándulas sexuales accesorias tales
como la próstata. Las hormonas esteroides participan
tanto en la conducta sexual como en el funcionamiento
normal de la próstata. Estas ejercen su efecto a través
de sus receptores, los cuales pertenecen a la familia
de receptores a hormonas esteroides localizados en el
medio intracelular.
Se ha mostrado que los andrógenos regulan los
niveles de ARNm para su receptor en próstata ventral.
El estímulo que ha originado variaciones de testosterona
circulante, de ARNm para receptor a andrógenos y del
receptor mismo ha sido la conducta sexual de la rata al
realizar eyaculaciones consecutivas, observándose los
niveles máximos entre la segunda y la tercera eyaculación.
No obstante, se desconoce si hay variación del
ARNm del receptor a estrógenos β en esta situación. La
literatura sugiere que tal variación también es posible.
Conducta sexual y funcionamiento prostático
de la rata
La conducta sexual de la rata involucra actividades
de cortejo, de apareamiento y de respuestas
posteyaculatorias3. En la rata macho, la actividad
copulatoria implica la ejecución de respuestas
conductuales cuya secuencia es muy específica,
presentándose conductas de monta sin inserción
peneana (montas), conductas de monta con movimientos
característicos de la inserción peneana intravaginal
(intromisiones) y conductas de monta con movimientos
característicos de la inserción peneana vaginal y de
eyaculación (eyaculación)4.
Usualmente, las ratas macho inician la actividad
copulatoria investigando las regiones facial y anogenital
de la hembra mientras emite, al igual que esta;
vocalizaciones ultrasónicas de 50 kHz. Posteriormente,
el macho se aproxima a la parte trasera de la hembra
y despliega la conducta de monta, que consiste en
arremetidas poco profundas con su pelvis. Si detecta
la vagina de la hembra, realiza una arremetida más
profunda, insertando su pene en ella durante 200-300
mseg (intromisión). Entonces da un salto hacia atrás
rápidamente y acicala sus genitales. La conducta de
intromisión se repite 7 a 10 veces, después de lo cual
la rata alcanza la eyaculación. Ésta se caracteriza por
arremetidas mucho más largas y profundas (750-2000
mseg) y por una desmonta también más lenta. En la
eyaculación hay contracciones rítmicas de los músculos
bulboesponjoso e isquicavernoso en la base del pene, y
del esfínter anal y los músculos esqueléticos. Después
de la eyaculación, el macho acicala sus genitales y
permanece casi totalmente inactivo durante un intervalo
de aproximadamente 6-10 minutos antes de reiniciar la
cópula. Este período de inactividad se denomina “Intervalo
Poseyaculatorio” (IPE). Durante el IPE, usualmente
el macho no copula otra vez y emite vocalizaciones
ANTECEDENTES
Estructura funcional de la próstata de rata
La próstata de rata es un complejo formado por
numerosas glándulas alveolares, que están inmersas en
una mezcla de fibras de musculatura lisa y tejido conectivo
denominado estroma. Estas glándulas vierten su contenido
a los conductos excretores, los cuales se comunican con
la uretra. La anatomía prostática de los roedores está
organizada en los lóbulos individuales ventral (PV), lateral
(PL) y dorsal (PD) localizados en posiciones específicas
alrededor de la uretra pero no completamente circunscritas
a ella. Algunos autores consideran a la glándula coagulante
un cuarto lóbulo: el anterior1.
La glándula prostática parece no ser esencial
para la fertilidad del individuo, no obstante produce el
20% del fluido seminal y es responsable de la secreción
de sustancias biológicamente importantes tales como las
prostaglandinas, espermina, fructosa, inmunoglobulinas,
69
ultrasónicas de 22 kHz. Algunos machos pueden iniciar
la cópula si se les presenta una nueva hembra o se les
proporciona un estímulo medianamente doloroso. Por
lo general, después de 7 u 8 eyaculaciones los machos
alcanzan la saciedad y no copulan por 1-3 días.
Por lo común, la habilidad copulatoria es adquirida
por un individuo entre los 45 y los 75 días de edad5.
e inician un descenso después de la tercera eyaculación;
para regresar a valores no significativamente diferentes
del control después de la cuarta eyaculación11.
Influencia de la conducta sexual en la próstata
de rata
Teniendo en cuenta las fluctuaciones hormonales
observadas durante la ejecución de la conducta sexual
y el hecho de que las hormonas mencionadas afectan
la fisiología de la próstata, parece razonable suponer
la existencia de una relación entre esta conducta y el
funcionamiento prostático. A pesar de esto, pocos son los
estudios que existen sobre la influencia que la actividad
sexual diaria ejerce sobre el funcionamiento normal de
la próstata de rata. En 1979, se realizó un trabajo donde
se mostró que la actividad sexual en ratas macho no
se afecta por el hecho de remover completamente las
vesículas seminales y la próstata12. De ello se concluyó
que la ejecución de la conducta sexual no depende de
la presencia de estas glándulas. Por otro lado, se sabe
que la ejecución de la conducta sexual per se sí tiene
efecto sobre el peso de la próstata. En ese sentido se
ha observado que el diámetro de lúmen glandular de los
animales sometidos a conducta sexual es mayor y que la
secreción intraluminar se tiñe menos homogéneamente,
ya que hay un mayor número de gránulos secretorios13.
Adicionalmente, un trabajo reciente realizado
en nuestro laboratorio9, 10 demostró la inducción de
variaciones en el RA en próstata de rata que alcanza
eyaculaciones consecutivas, tanto a nivel del ARNm
como de la proteína. Estas variaciones consisten
en incrementos significativos graduales en el ARNm
después de una eyaculación, que alcanzan niveles
máximos después de la tercera, para regresar a niveles
semejantes a los del control después de la cuarta
eyaculación; a la par de un incremento significativo en las
concentraciones de la proteína después de la primera,
la segunda la tercera eyaculaciones. Los cambios en el
ARNm y la proteína RA se acompañan de incrementos
significativos en los niveles de T sérica descritos con
anterioridad en el presente trabajo.
En conjunto, estos datos muestran claramente
que la función sexual juega un papel importante en el
desarrollo y funcionamiento de la próstata.
Control hormonal de la conducta sexual de la
rata macho
La testosterona (T) es el principal andrógeno
involucrado en regular la ejecución de la conducta sexual
en la rata macho. A este respecto, se ha observado un
decaimiento de esta conducta posterior a la eliminación
de los testículos y una restitución de los parámetros de la
misma por la administración exógena de testosterona6. Sin
embargo, el decaimiento de la conducta sexual, no coincide
con el de T. que es indetectable en las siguientes 24 horas de
la castración, mientras que la habilidad copulatoria decrece
gradualmente días o semanas después. La restitución
obtenida mediante la administración de T requiere de 5 a
10 días de tratamiento5, pero la administración de Estradiol
(E2) incrementa la quimioinvestigación y la monta en los
siguientes 35 minutos de iniciado el tratamiento7, por lo tanto,
efectos rápidos y probablemente basados en mecanismos
que involucran receptores membranales pueden contribuir
a la motivación sexual, pero los efectos genómicos a largo
plazo se requieren para la completa reinstauración de la
cópula por la T.
Además, se sabe que para activar la conducta
sexual, la T no actúa completamente como tal, pues es
aromatizada mediante el complejo enzimático P450AROM
a E2. La actividad de P450AROM es a su vez incrementada
por T8. Así, la “teoría de la aromatización” propone que
es el E2 obtenido por aromatización de la T quien activa
la conducta sexual en machos5.
Por otra parte, se sabe que la conducta sexual en
sí ocasiona variaciones en los niveles plasmáticos de
algunas hormonas. Este es el caso de la T y la prolactina
(PRL). En cuanto a la primera, sus valores séricos
normales de 2.7 ± 0.8 ng/ml muestran variaciones cuando
los animales alcanzan eyaculaciones consecutivas. Se
presenta un aumento en los niveles séricos después
de la primera eyaculación, pero se requirieren dos
eyaculaciones para alcanzar un valor máximo que se
mantiene por lo menos hasta la cuarta eyaculación9, 10.
La PRL también muestra fluctuaciones séricas en las
ratas macho sometidas a eyaculaciones consecutivas.
Los niveles basales de aproximadamente 18 ng/ml
aumentan significativamente después de la primera
eyaculación, alcanzan un máximo después de la segunda
El papel de las hormonas esteroides en la
próstata de rata
La próstata es una glándula dependiente de
testosterona para mantener su tamaño y función
secretoria. La importancia de los andrógenos testiculares
70
se pone en evidencia con la castración; ésta provoca
involución de la próstata mediante una combinación de
atrofia y apoptosis, mecanismos que son revertidos con
una terapia de restitución androgénica14. En la próstata
de rata, la castración causa pérdida de peso seco,
disminución de proteínas, del tamaño celular en los tres
lóbulos, aunque el más afectado es el lóbulo ventral,
que sufre un alto grado de apoptosis, lo que además
puede relacionarse con las bajas cantidades de zinc (un
inhibidor de la apoptosis) presentes en este lóbulo en
comparación con los otros dos15.
Por su parte, los estrógenos (de los que el más
importante es el E2) parecen tener efectos negativos, al
menos en dosis no fisiológicas. A saber, la administración
de estrógenos en ratas neonatas, produce un incremento
en la incidencia de metaplasia, displasia y formación
tumoral en la próstata con la edad, efectos que son
lóbulo específicos e involucran principalmente al lóbulo
ventral16; también se observan efectos negativos sobre
la diferenciación celular epitelial, morfogénesis ductal y
crecimiento de la glándula cuando las ratas alcanzan la
etapa adulta17. En animales adultos, el tratamiento a largo
plazo con estrógenos lleva a neoplasia prostática17. Todos
estos efectos pueden ser causados por una irrupción de
los estrógenos en el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas17,
que ocasionaría una disminución en la producción de
andrógenos18. También se ha propuesto una acción
sinérgica entre los estrógenos y los andrógenos en la
inducción de hiperplasia y displasia glandulares19.
Es posible que los estrógenos tengan efectos
directos sobre la próstata. Sin embargo, la acción directa
de los estrógenos es complicada puesto que pueden actuar
a través de los receptores a andrógenos19 y con dos tipos
de receptores específicos distintos, que aparentemente
median efectos distintos y en algunos contextos celulares,
parecen ejercer acciones antagónicas entre sí20.
El REβ, como los demás miembros de la superfamilia
a la que pertenece posee dominios funcionales distintos:
una parte N-terminal, que participa en la interacción del
receptor con miembros del aparato transcripcional, un
dominio de unión al ADN (DUA), una región de bisagra
que proporciona cierto grado de flexibilidad y un dominio Cterminal involucrado en la unión a ligandos tanto agonistas
como antagonistas, dimerización, localización nuclear de
la proteína y activación de la transcripción. Esta última
parte se denomina dominio de unión a ligando (DUL) 23, 24.
En la rata, el REβ es una proteína de aproximadamente
485 aminoácidos, con un peso aproximado de entre 55
y 60 kD. Es ligeramente más pequeña que el REα (590600 aminoácidos en diferentes especies,) en virtud de
que posee un extremo N-Terminal significativamente más
corto25, 22, 26. En general, los RE presentan alta homología
en sus DUA y DUL, mientras que la homología más baja
se presenta en el dominio N-Terminal, la región de bisagra
y una pequeña región en el dominio C-Terminal22, 26, 27, 23.
Mecanismo de acción del REβ
El mecanismo de acción a nivel genómico del REβ,
al igual que el de los otros miembros de la familia incluye
una serie de eventos que inicia con la unión del agonista
al DUL del receptor (figura 1). Esta unión promueve
su separación de las proteínas de choque térmico
inhibitorias Hsp 90, y ulteriores dimerización, interacción
con el ADN, reclutamiento de coactivadores y en última
instancia la formación del complejo de preiniciación de la
transcripción28. La interacción con el ADN se da a través
del DUA. Esta región, como ya se ha mencionado, está
altamente conservada en los miembros de esta familia
de factores de transcripción. Existe una homología del
90% en el DUA de ambos receptores a estrógenos26, por
lo que pueden unirse a los Elementos de Respuesta a
Estrógenos (ERE) en los promotores de genes blanco con
afinidad y especificidad similares20. Estos EREs consisten,
con unas pocas variaciones entre los distintos genes, en
repeticiones de la secuencia A/GGGTCANNNTGACC,
donde N es un nucleótido cualquiera30, 27. La especificidad
de la transactivación específica de receptor puede ser
el resultado de una influencia del contexto genético de
cada ERE sobre el receptor, lo que causaría un patrón
de reclutamiento de coactivadores distinto20. Además, en
tanto que la FA-1 es espreciable en el REβ, no lo es en el
REα. La actividad de la FA-1 puede también influenciar
el reclutamiento de coactivadores. En la activación
del receptor por la unión de un ligando, es necesaria
la dimerización para la unión con el ERE28. El dímero
puede ser tanto un homo como un heterodímero, es
decir, es posible la existencia de homodímeros REβ-REβ
El receptor a estrógenos beta
Las proteínas receptoras a través de las cuales los
estrógenos ejercen sus efectos directos se denominan
receptores a estrógenos (RE) y se encuentran codificadas
por genes distintos. Los RE son proteínas intranucleares
pertenecientes a la superfamilia de receptores nucleares
para hormonas esteroides, hormonas tiroides, vitamina
D y retinoides21. Inicialmente se pensaba que existía
una única proteína con actividad de RE, sin embargo,
en 1996 se reportó la existencia de la segunda proteína
receptora22 en tejido de próstata y ovario de rata. Esta
proteína fue denominada Receptor a Estrógenos Beta
(REβ), para diferenciarla de la primera proteína que a
partir de entonces fue conocida como REα.
71
y de heterodímeros REβ-REα21. Cuando ambos tipos
de receptores a estrógenos se encuentran expresados
en una célula, la formación de heterodímeros se ve
favorecida sobre la de homodímeros20. El homodímero
REα-REβ tiene una afinidad similar a la del homodímero
REα-REα, pero mayor que la del homodímero REβREβ23.
En general, existe un antagonismo funcional del
REβ sobre las acciones del REα20. Distintos estudios
describen represión dirigida por REβ de varios efectos
mediados por REα, entre los que se incluyen la reducción
de grasa y de la proliferación celular en el útero y la
próstata20, 31, 23, 32.
en la próstata de rata33 y muestra un patrón de expresión
distinto del de REα. El REβ tiene una localización
prominente en las células epiteliales y escasa expresión
en las células del compartimento estromal23. Por su parte,
el REα, es detectable en las células del compartimento
estromal y parece no ser detectable en el epitelio17, 24. La
expresión de REα es en términos generales, mucho más
baja que la del REβ en la próstata33.
El papel del Receptor a Estrógenos Beta en la
próstata de rata
La localización del REβ en la próstata de rata sugiere
un papel en la regulación fisiológica de esta glándula. A este
respecto, distintos estudios muestran que el REβ podría
regular el crecimiento y la diferenciación de la próstata.
Por ejemplo, en cepas de ratones que no expresan esta
proteína (los ratones βERKO) existen focos hiperplásicos
en la próstata ventral17 que aumentan con la edad19, 34, 20
e inician aproximadamente a los seis meses de vida35.
Además, el porcentaje de células proliferativas en el epitelio
de la próstata ventral es de 3.6 veces más alto y hay menos
señales apoptóticas en ratones βERKO que en ratones
normales, lo que sugiere que la apoptosis puede encontrarse
suprimida. Por otro lado, las células epiteliales prostáticas
muestran un patrón de diferenciación incompleto en esta
cepa35, mientras que en ratas se observa relación entre el
nivel de citodiferenciación y lumenización y la expresión de
REβ en la próstata ventral16.
Todos estos datos sugieren que el REβ podría tener
un rol prodiferenciativo y negativo sobre el crecimiento
de la próstata ventral de roedores, aunque no se ha
determinado aún con exactitud sobre que genes podría
actuar para ejercer los efectos observados. A este respecto,
se ha postulado una acción sobre el receptor andrógenos
(RA) mediante la cual el REβ reduce o limita el crecimiento
de la próstata e induce una mayor diferenciación. Análisis
en próstata ventral de ratones βERKO muestran una
cantidad mayor de RA que en ratones normales17, lo cual
parece ser el resultado de la ausencia del REβ, del que
se ha constatado que es capaz de disminuir los niveles de
RA, puesto que cuando un ratón normal es expuesto al
estrógeno 5α-androstano-3β, 17β-diol que actúa a través
del REβ, la cantidad del RA en la próstata disminuye24.
Expresión del Receptor a Estrógenos Beta
El REβ ha sido localizado en diferentes tejidos en
la rata tanto a nivel del ARNm como de la proteína. En
general, la expresión más alta del ARNm se encuentra
en el ovario y la próstata ventral22, 26. En ésta última,
hay una expresión prominente en las células epiteliales
de los alveolos, mientras que en el estroma se tienen
cantidades bajas21, 22. Además, se observa un gradiente
de expresión a lo largo del eje ductal de los lóbulos de
la próstata, con la mayor cantidad de expresión en los
extremos distales y significativamente menor en los
proximales16. La proteína muestra distribución similar.
El receptor a estrógenos beta es el RE predominante
Regulación de la expresión del Receptor a Estrógenos Beta
La regulación de la expresión del REβ parece ser
compleja. Distintos estudios muestran la implicación de las
hormonas esteroides y de la prolactina en este proceso.
Regulación por testosterona
72
En la etapa adulta de las ratas, la castración resulta
en un declive marcado en el ARNm del REβ en próstata
de rata, mientras que su expresión máxima se observa
en el día 90 de edad, cuando los niveles de T en el adulto
alcanzan también un máximo16; lo que concuerda con
el hecho de que la castración reduce las cantidades
de ARNm de REβ en este mismo tejido y la repleción
exógena de T los restaura36.
lúteo por la activación de Stat5b y no de Stat5a por la
vía Jak2/Stat5. Estos autores demostraron también que
ambos RE se ven influenciados por esta vía, pero que
REα es responsivo tanto a Stat5a como a Stat5b. La falta
de estimulación por Stat5a en REβ puede atribuirse a un
simple nucleótido en su elemento de respuesta a Stat5.
Por otro lado, aunque REβ puede no ser crucial para la
función luteal, la habilidad de la PRL para estimularlo
puede ser importante en otros tejidos en los que si tiene
una función preponderante.
Por todo lo anterior, el presente trabajo pretende
demostrar la presencia de variaciones en el ARNm del
REβ, específicamente una regulación a la alza; en el
lóbulo ventral de la próstata de rata en respuesta a las
fluctuaciones hormonales que se tienen durante las
eyaculaciones consecutivas en la ejecución de la conducta
sexual, teniendo en cuenta que en trabajos previos se
ha demostrado este tipo de variación en los niveles de
ARNm del receptor a andrógenos9, 10, cuya regulación en
la próstata de rata parece estar ligada al REβ.
Regulación por estrógenos
Los estrógenos, por su parte; podrían estar
regulando hacia abajo los niveles de REβ. Así, las ratas
estrogenizadas neonatalmente muestran un declive en
los niveles de ARNm de este receptor37, 24, mientras que
el tratamiento con estrógenos en ratas castradas adultas
también reduce la expresión del receptor en la próstata19.
Por su parte, en tejido neural de ratones se produce
un descenso de la inmunorreactividad de REβ en el
tratamiento con E220. En la glándula mamaria de ratón,
también se observa un decremento en el ARNm del REβ
dentro de las doce horas siguientes a la administración
de E2, efecto que es revertido con la ovarectomía18. En
este último estudio, se demostró que el mecanismo de
la regulación hacia abajo en la expresión del REβ por el
E2, podría incluir la supresión de la fosforilación de las
proteínas Stat, que tienen un elemento de respuesta en
el promotor de ambos receptores a estrógenos, con el
que interactúan después de una dimerización inducida
por fosforilación.
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN:
¿Las variaciones hormonales producidas durante la
ejecución de la conducta sexual promueven variaciones en
los niveles de ARNm del REβ en próstata ventral de rata?
HIPÓTESIS
La densidad del ácido ribonucleico mensajero
(ARNm) del receptor a estrógenos beta (REβ) en
próstata ventral de rata aumenta con las eyaculaciones
consecutivas al ejecutar la conducta sexual
Regulación por prolactina
Una de las vías de señalización que involucra a las
proteínas Stat5a y Stat5b es la vía Jak2/Stat5, que es
activada por la unión de la prolactina (PRL) (una hormona
peptídica); a su receptor membranal. Esto involucraría
pues, a esta hormona no esteroide en la regulación de la
expresión del REβ.
En efecto, Telleria y colaboradores38 encontraron que
la hipofisectomía provoca un decremento significativo
en la expresión de ARNm del REβ en el cuerpo lúteo
de la rata, efecto que es totalmente revertido por la
administración de PRL y de Lactógenos Placentarios I y
II, lo que proporciona evidencia experimental de que la
acción sinérgica ya descrita entre la PRL y el E2 puede
involucrar a la estimulación prolactínica de los receptores
a estrógenos.
Una ulterior investigación del papel de la PRL en la
regulación de la expresión del REβ fue llevada a cabo por
Frasor y colaboradores en 200139. Este grupo demostró
que la expresión del REβ está regulada al alza en cuerpo
OBJETIVO
Determinar la variación del nivel sérico de estradiol
(E2) y la densidad de ARNm del REβ en el lóbulo ventral
de la próstata de rata en eyaculaciones consecutivas.
METODOLOGÍA
Animales
Se utilizaron ratas macho adultas sexualmente
expertas de la cepa Wistar (de 200 a 250 g de peso)
mantenidas en cajas colectivas de acrílico (50 x 30 x
20 cm) en un bioterio con temperatura controlada y en
ciclo de luz-oscuridad invertido 12:00 h. Luz: 12:00 h.
oscuridad, apagando la luz a las 8:00 a.m.
El agua y el alimento balanceado se les proporcionó
a libre demanda.
73
Entrenamiento conductual de la rata macho
se centrifugó por 10 minutos a 3500 rpm, se decantó
el suero en otro tubo y se volvió a centrifugar con las
mismas especificaciones; se decantó el suero y se
hicieron alícuotas de 400 µl. Estas fueron congeladas a
–20 °C hasta el momento de cuantificar el E2.
Los sujetos de experimentación adquirieron
experiencia sexual sometiéndose a 4 pruebas
conductuales 2 veces por semana, con un intervalo de
3 días entre cada prueba. El entrenamiento conductual
se llevó a cabo durante el último tercio de la fase
oscura del ciclo luz-oscuridad, fase óptima para la
expresión de la conducta sexual en esta especie.
Para las pruebas conductuales se utilizaron hembras
adultas ovariectomizadas a las que se les indujo la
receptividad administrando benzoato de estradiol (10
µg/0.1 ml de aceite vegetal) 48 horas antes de la prueba
y progesterona (500 μg/0.1 ml de aceite vegetal) 4 horas
antes de la prueba. Los animales realizon las pruebas
conductuales en arenas de entrenamiento, que son
cilindros de plexiglass de 60 cm de diámetro x 60 cm de
altura con una base de aserrín. Al inicio de la prueba, se
colocó al macho dentro de la arena de entrenamiento
por un lapso de 5 minutos para su adaptación y después
se introdujo en la arena una hembra receptiva. A partir
de ese momento, se registró el tiempo necesario
para que el macho alcanzara la primera eyaculación.
Una vez concluidas las 4 pruebas de entrenamiento,
se seleccionaron aquellos machos que tuvieron en
promedio una latencia a la primera eyaculación de entre
5 y 10 minutos, considerando los criterios establecidos
por Larsson6.
Los animales seleccionados para el experimento
(según criterios descritos anteriormente) se clasificaron
en 5 grupos; A, B, C, D y E. Se sometieron a una sesión
de registro conductual, en la cual se les permitió copular
en presencia de una hembra receptiva, excepto al A que
fue el grupo control. Los animales de los grupos B, C, D
y E alcanzaron 1, 2, 3 y 4 eyaculaciones consecutivas
respectivamente. Posteriormente, los animales fueron
anestesiados con una dosis de 39 mg/kg de pentobarbital
sódico y se procedió a la extracción de sangre y luego;
mediante cirugía, a la extracción del complejo próstatavejiga urinaria-vesículas seminales
Extracción de próstata
Después de obtener las muestras de sangre se
extrajó el complejo próstata-vejiga-vesículas seminales,
colocándolo inmediatamente en solución salina
fisiológica. Bajo un microscopio de disección (MEIJI,
EMZ-TR) se realizó la disección prostática obteniendo los
lóbulos ventral, dorsal y lateral, que fueron congelados
en nitrógeno líquido y almacenados a –70°C hasta su
uso en la técnica de RT-PCR.
RT-PCR para Receptor a Estrógenos Beta (REβ)
en el lóbulo ventral de la próstata de rata
Obtención de ARN. El ARN total se obtuvo
usando el reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies)
de acuerdo al protocolo del fabricante. En un tubo de
plástico estéril se puso una porción de aproximadamente
100 mg de próstata ventral y se agregó un mililitro de
TRIzol, se homogenizó con politrón y se incubó durante
5 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 200 µl
de cloroformo agitando vigorosamente, se incubó 3min a
temperatura ambiente y se centrifugó a 8000 G bajo una
temperatura de 8 ºC por 15 min. Se tomó la fase acuosa,
que fue colocada en un tubo estéril de 1.5 ml.
Precipitación de ARN. A la fase acuosa obtenida
se adicionó alcohol isopropílico a una proporción 1:1, se
homogenizó e incubó durante 10 minutos a temperatura
ambiente, centrifugándola posteriormente a 12000 G a 8
ºC por 10 minutos, con lo que se obtuvo un precipitado
correspondiente al ARN. El sobrenadante fue removido
del lado contrario a la pastilla; se lavaró la superficie de
ésta una vez con etanol al 75 % y después se centrifugó
a 7500 G a 8 ºC durante 5 minutos; se decantó el etanol y
se secó al aire el precipitado. Se agregaron 50 µl de agua
estéril disolviendo la pastilla de ARN con la punta de una
pipeta. De esta disolución se tomó 1 µl y se mezcló con
999 µl de agua estéril libre de ARNasas obteniendo una
dilución 1:1000 y se midió la densidad óptica de la dilución
en un espectrofotómetro a 260 y 280 nm de longitud de
onda. El cociente de las absorbancias a ambas longitudes
de onda (260/280) que correspondía a un valor de entre
1.6 y 1.8, se usó como indicativo de que el ARN tiene una
pureza adecuada. La concentración de ARN se calculó
tomando en cuenta que una unidad de absorbancia a 260
nm corresponde a 40 µg de ARN por mililitro.
Extracción sanguínea por punción cardiaca
Una vez anestesiados los animales, se procedió a
localizar con el dedo índice el latido cardiaco, con el
objetivo de identificar la posición del corazón mediante
palpación. Después se introdujo una aguja en esa
dirección hasta que apareció una gota de sangre
y se aspiró con el émbolo de la jeringa de plástico
hasta obtención de 5 ml sangre. Ésta fue vertida en
un tubo cónico donde se dejó reposar a temperatura
ambiente para que coagulara. Transcurrido este tiempo
74
Transcripción reversa. En diferentes tubos
Eppendorf de 0.2 ml se pusieron 3 µg de RNA (a partir
de diluciones convenientes de la muestra de ARN
obtenida); 1 µl de oligo dt, 1 µl de DNTP’s y 6 µl de agua
estéril. Los tubos se colocaron en un termociclador a 70
ºC por 3 min. Después se agregaron 9 µl de un coctel de
reactivos para completar 20 µl. El coctel contenía 5 µl de
mix buffer 5X; 2 µl de DTT; 1 µl de inhibidor de ARNasa
y 1 µl de enzima transcriptasa reversa MMLV por cada
tubo. Las muestras fueron incubadas en el termociclador
a 37 ºC durante 60 minutos y a 94 ºC durante 3 min, para
finalizar a una temperatura de 4 ºC, al término de lo cual
fue obtenido el molde de ADN complementario (ADNc) .
Amplificación del ADNc. Se preparó un segundo
cóctel de reactivos con 1 µl de dNTP’S; 5 µl de Buffer
10X (sin MgCl) ; 1.5 µl de Mg++ como MgCl2 ; 0.5 µl
de Taq polimerasa y 30 µl de agua desionizada, por
muestra amplificada. En un tubos eppendorf de 0.2 ml
diferentes se puso 1 µl (50 pmoles) de oligonucleótido
en sentido 5΄-3΄; 1 µl (50 pmoles) de oligonucleótido en
contrasentido 3΄- 5΄; 10 µl de ADNc proveniente de cada
una de las cantidades variables de ARN sometidas a
retrotranscripción , 38 µl de cóctel y 2 gotas de aceite
mineral; se colocaron las muestras en un termociclador y
se sometieron al siguiente protocolo de amplificación:
Etapa 1
1
ciclo
de
amplificación
Paso 1
94 °C por 5
minutos
Etapa 2
30 ciclos de
amplificación
Paso 1
94 °C por 5
minutos
Paso 2
60 °C por 1
minuto
Paso 3
72 °C por 2
minutos
Etapa 3
1
ciclo
de
amplificación
Paso 1
72 °C por 10
minutos
Etapa 4
1
ciclo
de
amplificación
Paso 1
4
°C
infinito
obtener productos de 228 pb. Los datos provenientes de
las amplificaciones de actina se utilizaron para normalizar
aquellos que se obtuvieron de las amplificaciones del
REβ. Como control positivo se incluyó la amplificación
tanto para REβ como para actina a partir de ARN de
vermix de rata.
Preparación del gel de agarosa. Se preparó TBE 3X
(18.15 g de tris base, 9.25 g de ácido bórico y 1.116 g de
Na2EDTA•2H2O en agua desionizada hasta aforar a 1 l), y
se tomaron de él 16.66 ml, mismos que fueron agregados
a 0.5 g de agarosa y disueltos hasta aforar a 50 ml con
agua desionizada, con lo que se obtuvo una solución
al 1% de agarosa en TBE a una concentración de 1 X.
Posteriormente se calentó hasta disolver la mezcla, y se
pasó posteriormente a un tubo eppendorf de 50 ml donde
se le añadieron 4 µl de bromuro de etidio. Esta mezcla
final fue vertida a una cámara de electroforesis para ácidos
nucleicos, colocando los topes y el peine correspondientes
para la obtención adecuada del gel con los pocillos donde
fueron colocadas las muestras amplificadas, y se mantuvo
a 4 ºC por 15 minutos para su solidificación.
Preparación y corrimiento de las muestras. Se
retiraron de la cámara el peine y los topes usados para la
solidificación del gel. Se agregaron 200 ml del buffer de
corrida 1X (66.66 ml de TBE 3X aforados a 200 ml con
agua desionizada). En un pedazo de papel parafilm se
colocaron 5 µl de glicerol-agua en una proporción de 1:1,
y se agregaron 15µl de muestra amplificada, se procedió
a mezclar con la punta de una pipeta y se cargaron 18
µl de ésta mezcla en uno de los pocillos del gel. Este
procedimiento se realizó para cada muestra. En el
primer pocillo se cargaron 5 µl de marcador de 100 pb
(MPB) preteñido. Posteriormente se conectó la cámara
a la fuente de poder a 100 V, deteniendo el corrimiento
cuando el MPB recorrió ¾ partes del gel.
Análisis densitométrico. Se obtuvieron imágenes
de los geles mediante el programa Kodak 1D 3.6 a través
de la estación de imágenes 440 CF de Kodak utilizando
la lámpara UV y el filtro 4, capturadas con un tiempo de
exposición de 8 segundos. Utilizando el mismo programa
se realizó la densitometría respectiva de cada banda.
Cuantificación
de
E 2.
Se
realizó
un
radioinmunoanálisis a cada una de las muestras de
sangre obtenidas con radioisótopo I125.
Análisis estadístico. Los datos obtenidos para cada
prueba fueron comparados con un análisis de varianza
(ANOVA) de una vía para grupos independientes y como
prueba post hoc el método de Dunnett para comparar
los grupos experimentales de animales contra su control
correspondiente.
al
Los oligonucleótidos que se utilizaron para la
amplificación de REβ fueron de 20 pb con las siguientes
secuencias: GGGTGAAGGAGCTACTGCTG (sentido)
y CCAATCATGTGCACCAGTTC (contrasentido) con
lo que se esperaba obtener productos de 192 pb. Se
realizó también, para cada tratamiento, una amplificación
control de una porción del gen de actina β, para lo
que se utilizaron los oligonucleótidos de 20 pb con las
secuencias AGCCATGTACGTAGCCATCC (sentido)
y AAGTGGTGGTGTCGACTCTC (contrasentido) para
75
RESULTADOS
Concentraciones séricas de estradiol
ARNm del REβ
Las concentraciones séricas de estradiol se
muestran en la gráfica 2. Se observa un decremento
estadísticamente significativo (p<0.01) en todos los
grupos de tratamiento (eyaculaciones consecutivas),
con respecto al control de cero eyaculaciones.
Se obtuvieron datos que corresponden al porcentaje
de variación en la expresión del ARNm del REβ en
próstata ventral de rata. Los datos se presentan en la
gráfica 1, que corresponde a grupos de tratamientos
de eyaculaciones consecutivas (1-4) con una n de
3. El porcentaje de variación en cada tratamiento se
expresa con respecto al control de 0 eyaculaciones que
representa el 100% de la expresión.
Hay un aumento en la expresión de ARNm del REβ
en todos los tratamientos. Sin embargo, este aumento
es significativo después de la segunda eyaculación y
regresa a valores cercanos a los del control después de
las eyaculaciones tercera y cuarta.
DISCUSIÓN
Los datos presentados hasta el momento muestran
que la conducta sexual produce un descenso en los niveles
de estradiol sérico, así como también un incremento en el
ARNm del REβ. Este incremento es máximo después de la
segunda eyaculación pero regresa a valores cercanos a los
del control después de 3 y 4 eyaculaciones consecutivas.
Teniendo en cuenta que el estradiol suele provocar una
regulación a la baja de la transcripción del REβ, es probable
que el descenso en el ARNm de éste se deba inicialmente
a los bajos niveles de estradiol provocados por las
eyaculaciones consecutivas en el despliegue de la conducta
sexual. Sin embargo, puesto que el ARNm del REβ no
continúa elevándose, en tanto que el estradiol si continúa
en descenso, es probable que en la segunda eyaculación
se disparen mecanismos de regulación que no involucran
a las concentraciones de estradiol en sangre. Es de notar
el hecho de que en la segunda eyaculación se alcancen
también incrementos máximos en las concentraciones
séricas de PRL11 y de T, que inician un decremento -para
el caso de la PRL- después de la segunda eyaculación9, 10
y que ambas hormonas tengan un papel en la regulación
al alza de la expresión del ARNm específicamente en
próstata para el caso de la T, y en cuerpo lúteo en el de
la PRL, sin descartar su participación en la próstata16, 38, 39.
Así pues, las fluctuaciones en los niveles séricos de estas
dos hormonas, también podrían contribuir a las variaciones
observadas en el ARNm del REβ.
Agradecimientos
El presente trabajo cuenta con el apoyo de becas
para estudios de maestría otorgadas por el CONACyT
a José Locia Espinoza, con número de registro 209152,
y a Milagros Silva Morales, con número de registro
209402.
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78
Análisis de los patrones de expresión de
metaloproteasas de matriz y sus inhibidores en
respuesta al activador farmacológico PMA en
fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo
Clara L. Sampieri1a, Robert K. Nuttall1b, David A. Young2, Ian M. Clark1 y Dylan R. Edwards1
1
School of Biological Sciences, University of East Anglia NR4 7TJ, UK
2
Department of Rheumatology, University of Newcastle- upon-Tyne, NE2 4HH, UK.
a
Instituto de Salud Pública, Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, México.
b
Department of Biochemistry and Molecular Biology Dalhousie University 5850 College Street Tupper Building Halifax, NS, B3H 1X5 Canadá.
RESUMEN
and induction of all except Mmp9 was blocked by all
protein synthesis inhibitors. These data confirm that most
inducible Mmps and Timps behave as “late” activated,
protein synthesis-dependent genes in fibroblasts.
However, the requirement of protein synthesis for PMAinduction of MMPs is not universal, since it is abrogated
for Mmp9, and its induction occurs in terms of hours.
La familia de metaloproteasas de matriz (MMPs)
en el ser humano incluye 24 genes que junto con sus
cuatro inhibidores naturales, de sus siglas en inglés
TIMPs son los responsables de la remodelación de
la matriz extracelular. Mediante análisis de PCR en
tiempo real cuantitativo evaluamos los patrones de
expresión de estas familias en fibroblastos de ratón
C3H10T½ en respuesta al activador farmacológico
PMA, el cual estimula la proteína kinasa C. Investigamos
el requerimiento de síntesis de proteínas utilizando
cuatro inhibidores: anisomicina, ciclohexamida, emetina
y puromicina. De todas las Mmps y Timps únicamente
la transcripción de Mmp9, Timp1 y Timp3 se indujo
después de 4.5 horas, y la inducción por PMA de todos
los genes, excepto Mmp9, fue bloqueada por todos los
inhibidores de síntesis proteínas probados. Estos datos
confirman que la mayoría de las Mmps y todos los Timps
inducibles por PMA tienen un patrón de expresión similar
a la de un gen tardío, es decir, son dependientes de la
síntesis de proteínas para su inducción y la activación
transcripcional ocurre en términos de horas.
MARCO TEÓRICO
Los metaloproteasas de la matriz extracelular, de sus
siglas en inglés MMPs, y sus inhibidores naturales, de sus
siglas en inglés TIMPs, constituyen un sistema proteolítico
cuya coordinación es crítica para el desarrollo, la
homeostasis y la reparación tisular después de una lesión.
La familia humana de MMPs abarca 24 endopeptidases
dependientes de zinc que degradan los componentes de
la matriz extracelular y también ejecutan rompimientos
proteolíticos reguladores de factores de crecimiento,
citocinas y quimiocinas (1, 2, 3, 4). La actividad de las
MMPs y TIMPs es controlada finamente, observándose
desregulación en numerosos estados patológicos como
cáncer, artritis y enfermedades cardiovasculares. La
regulación de la actividad de las MMPs ocurre en diversos
niveles, incluyendo la transcripción, la estabilización
post-transcripcional del ARNm, la eficacia de traducción,
la compartimentalización, la secreción enzimática, la
activación del zimógeno y la inhibición de la enzima
activa por los cuatro TIMPs (2, 5, 6, 7). Para entender el
control proteolítico a nivel celular es importante identificar
los mecanismos compartidos y únicos empleados en la
inducción y represión de la actividad de estas dos familias
genéticas funcionalmente interconectadas.
ABSTRACT
The human matrix metalloproteinase (MMP)
gene family includes 24 genes whose regulated
expression, together with that of four tissue inhibitors
of metalloproteinases (TIMPs), is essential in tissue
remodeling and cell signalling. Quantitative real-timePCR analysis was used to evaluate the shared and
unique patterns of control of these two gene families in
mouse C3H10T½ in response to the protein kinase C
activator PMA. The requirement for ongoing translation
was analyzed using four protein synthesis inhibitors,
anisomycin, cycloheximide, emetine and puromycin. PMA
induced Mmp9,Timp1 and Timp3 RNAs after 4.5 hours,
ANTECEDENTES
La transcripción es el principal nivel de control de
la mayoría de las MMPs y TIMPs (8), con la implicación
79
de la familia de las cinasas MAPKs, el factor-KB nuclear
y las rutas Smad-dependientes (2, 9, 10, 11, 12). Estas
rutas de señalización inducen la fosforilación de factores
trancripcionales y/o co-activadores transcripcionales,
así como la activación de proteínas nucleosomales
que conducen a la transcripción de una clase de genes
llamados los genes “tempranos inmediatos”, de sus siglas
en inglés IE genes (revisados en 13), que incluyen al gen
c-fos y a las familias de c-jun, los cuales forman el complejo
transcripcional AP1. Sitios cis para el factor AP1 están
presentes en las regiones promotoras de muchos genes de
MMPs y TIMPs, los cuales a menudo junto los elementos
PEA3 están implicados en la inducción genética (2, 5, 6, 11,
14). Se ha establecido que los factores AP1 son esenciales
para la activación transcriptional de varios genes de MMPs
y de TIMPs en respuesta a diversos estímulos, incluyendo
MMP1, MMP3 y TIMP1 (15, 16, 17, 18). Los genes IE se
definen por ser activados rápida y transitoriamente en
respuestaa a factores del crecimiento, el activador PMA y
mediadores inflamatorios, sin la necesidad de la síntesis
de proteínas. De hecho, los inhibidores de la síntesis de
proteínas conjuntamente con el activador PMA produce la
superinducción de los transcritos IE (13, revisado en 19).
La transcripción de los genes IE constituye la respuesta
primaria celular. En contraste, los genes MMPs y TIMPs
han sido considerados como genes tardíos, puesto que
sus transcritos se inducen generalmente después de
varias horas y para algunos, por ejemplo, MMP3 y TIMP1,
el requisito de síntesis de proteínas se ha documentado
claramente (15, 20). Sin embargo, al momento no ha
habido una evaluación sistemática de la cinética básica
de la inducción los miembros de la familia de MMPs y
TIMPs en fibroblastos de ratón, conocimiento necesario
para entender las rutas de señalización que intervienen
en su regulación.
mínimo con suero vacuno fetal al 10%, glutamina al 1%,
aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina de 1000 IU/
ml y 100 mg/ml de estreptomicina (todos los reactivos
para cultivo celular fueron adquiridos en Invitrogen,
Paisley, Reino Unido). Las células fueron mantenidas en
CO2 a 37oC. Para determinar si la síntesis de proteínas
era necesaria para la inducción por PMA, las células
confluentes fueron incubadas durante toda la noche en
medio libre de suero, seguido por el estímulo de 10 mg/
ml de inhibidores y/o 10-7M de PMA por 4.5 horas (todos
los inhibidores de síntesis de proteínas se adquirieron en
Sigma Aldrich, Poole, Reino Unido).
Extracción de ARNm. Se procedió a lisar y
homogenizar las células en cultivo usando el sistema de
extracción de ARN total de Promega, de acuerdo a las
instrucciones del proveedor. El posible ADN genómico
que pudo contener las muestras de ARN fue eliminado
mediante tratamiento con la enzima DNasa I incluida en
este sistema de extracción. La pureza y cantidad del ARN
se determinó mediante lectura de la densidad óptica de
cada muestra a 260nm y 280nm usando Nanodrop ND
espectrofotómetro (Labtech International).
Reverso transcripción. Se realizó siguiendo el
protocolo establecido en el laboratorio del Dr. Dylan
R. Edwards (publicado en 21, 22, 23, 24, 25, 26,).
Brevemente, 1µg o 0.5µg de ARN total fue incubado con
hexámeros aleatorios (Roche) a 70oC por 10 minutos.
Posteriormente se agregarón los nucleótidos (Roche), el
inhibidor de RNasas (Promega), DTT (Invitrogene) y la
enzima reverso-transcriptasa (Invitrogene) en un volumen
final de 20µl. La reacción de reverso-transcripción se
llevó a cabo por 1 hora a 42oC. En todas las reacciones
de reverso-transcripción se usaron controles negativos
para verificar la existencia de posible contaminación.
Iniciadores y sondas. Taqman para PCRc. Se
diseñaron, validaron y sintetizaron por la compañía
Applied Biosystems, las secuencias pueden encontrarse
en 21 y 23. Las sondas Taqman para análisis de expresión
mediante PCRc poseen en sus extremos 5´ y 3´ una
molécula excitadora y un fluorógeno respectivamente.
En forma paralela la enzima Amplitaq Gold sintetiza el
ADNc e hidroliza la sonda Taqman mediante actividad
nucleasa 5´-3´. Cuando la molécula excitadora y el
fluorógeno son separados se produce un notable
aumento en la fluorescencia. El extremo 3´ de la sonda
Taqman es bloqueado para prevenir cualquier extensión
(27). Cuando fue posible, se diseñaron sondas Taqman
que permitieran la determinación de tipo múltiple con la
finalidad de evaluar en la menor cantidad de pruebas la
expresión de un mayor número de genes.
Técnica de PCR cuantitativo en tiempo real. Se
prepararon curvas estándar de ADNc correspondientes
HIPÓTESIS
Las Mmps y Timps posen un patrón de expresión
genética similar a la de los genes tradíos en fibroblastos
de ratón C3H10T½ en cultivo.
OBJETIVO GENERAL
Determinar si las Mmps y Timps son genes tardíos
que requieren la síntesis de proteínas para su inducción
en fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo.
METODOLOGÍA
Cultivo celular y tratamientos. Fibroblastos de
ratón C3H10T½ fueron cultivados en medio esencial
80
a 20, 10, 5, 2.5, 1.25 y 0.625ng/10ul. En cada pozo se
colocaron el equivalente a 10ng de ADNc. La cantidad
relativa se determinó usando la curva estándar dividida
entre la cantidad del gen que funcionará como control
endógeno ARNr 18S. Cada reacción de PCRc contuvo
8.33µl de Taqman universal PCR master mix, 200nm de
iniciador 1, 200nm de iniciador 2 y 100nm de sonda Taqman
en un total de 25ul. Se emplearon placas de 96 pozos que
fueron selladas con cubiertas ópticas y se sometieron al
análisis de PCRc usando Abi Prism 7500 Real Time PCR
System. En todas las reacciones de PCRc se usaron
controles negativos para cada gene con la finalidad de
verificar la existencia de posible contaminación. El sistema
Abi Prism 7500 Real Time PCR System monitorea en
tiempo real cada ciclo de la PCR, generándose datos de
manera cuantitativa de forma exponencial, antes que los
componentes de la reacción comiencen a ser limitantes.
Durante cada ciclo de PCR se dirige un rayo láser mediante
una fibra óptica a cada uno de los 96 pozos de la placa. La
luz pasa a través del pozo excitando fluorógenos presentes
en cada celda. Otra fibra óptica colecta la emisión generada
entre 500 y 600nm de cada pozo aproximadamente cada 7
segundos. El incremento en fluorescencia es medido como
una consecuencia directa de la amplificación del ADN
blanco durante la PCR. Los datos son expresados como
ciclo umbral (siglas en inglés CT de cycle threshold). El ciclo
umbral representa el número de ciclo en el cual comienza
a detectarse la fluorescencia, que a su vez es dependiente
de la cantidad de ADN blanco al comienzo de la reacción.
El ciclo umbral es asignado arriba de la fluorescencia de
fondo (27).
Análisis estadísticos. Las curvas estándar fueron
usadas para convertir los datos de ciclo umbral y todos
los análisis de expresión genética de las MMPs se harán
con estos valores normalizados por ARNr 18S. Para
evaluar las diferencias en expresión genética de los
genes en diversas condiciones se usaron pruebas t.
Cuantificación de la síntesis de proteína total
mediante análisis de la incorporación de leucina3
H en C3H10T½. Fibroblastos confluentes de ratón
C3H10T½ fueron incubados durante la noche en medio
libre de suero, después 5 µCi de leucina-3H (Amersham)
fue agregada, posteriormente se agregaron al medio los
inhibidores de la síntesis de proteína 10 µg/ml y/o 107
M de PMA por 4.5 horas. Las células fueron lavadas
tres veces con la solución de sales balanceada fría
(Invitrogen), fijadas en 4oC por 5 minutos con ácido
tricloroacético, tratadas con metanol y lisadas con 0.3
M de NaOH y SDS al 1% por 30 minutos en agitación
a temperatura ambiente. Los lisados fueron mezclados
y transferidos a los frascos del aparato de centelleo y
resuspendidos con Optiphase (LAS Ltd, Reino Unido
PerkinElmer). La síntesis de la proteína fue determinada
mediante la cuantificación de la radiactividad detectada
en el sistema el 1400TM (PerkinElmer) de Wallac.
Análisis para evaluación de viabilidad celular.
Las células fueron cultivadas a una densidad de 10,000 y
20,000 por pozo en placas de 96 celdas en un medio libre
de suero durante toda la noche, al día siguiente se aplicó
el tratamiento de PMA y/o los inhibidores de la síntesis de
proteínas en las concentraciones y los tiempos utilizados
para el análisis de PCRc. Para determinar el número
de células viables después de 4.5 horas de tratamiento
se agregó el reactivo MTT (Sigma) y las células fueron
incubadas por 4 horas adicionales. El medio fue retirado
y el precipitado formado fue disuelto en dimetil sulfóxido.
La intensidad del color se determinó por lectura de las
muestras a 550 nm y 690 nm, usando un espectrofotómetro
de MRX (laboratorios de Dynatech, Chantilly, VA, E.U.).
RESULTADOS
Perfil de expresión de Mmps y Timps en respuesta
a PMA en C3HT10½. Fibroblastos de ratón C3HT10½
en condición basal fueron inducidos con PMA y después
de 4.5 horas de estimulación el ARNm fue colectado,
reversotranscrito y el perfil de expresión de todas las Mmps
y Timps fue analizado mediante la tecnología de PCRc.
Pruebas t fueron aplicadas a los resultados, identificando
así tres grupos: I) Genes inducibles significativamente
por PMA; II) Genes no inducibles por PMA, y III) Genes
no detectados y no inducibles por PMA (Tabla 1). El nivel
de expresión basal varío considerablemente en las dos
familias genéticas, detectándose un total de 11 Mmps y 4
Timps de las cuales 5 Mmps y 3 Timps fueron expresadas
extremada, muy alto o altamente, 6 Mmps y Timp4 se
expresaron de forma moderada, mientras que los niveles
de 14 Mmps no fueron detectados (datos no mostrados).
Tabla 1. Respuesta a PMA de la familia entera de
Mmps y Timps en fibroblastos de ratón C3H10T½ en
cultivo
81
Genes
inducibles por
PMA
Genes no
inducibles por
PMA
Genes no detectados
y no inducibles por
PMA
Mmp9, Timp1,
Timp3
Mmp2, Mmp11,
Mmp14,
Mmp15,
Mmp16,
Mmp17,
Mmp19,
Mmp21,
Mmp28, Timp2,
Timp4
Mcola, Mcolb, Mmp3,
Mmp7, Mmp8,
Mmp10,
Mmp12, Mmp13,
Mmp20, Mmp24,
Mmp25, Mmp27
Requerimiento de síntesis de proteínas de los
genes inducibles por PMA. Una vez identificados los
grupos de genes con base a su respuesta al activador
farmacológico PMA, se analizó el requerimiento de
proteínas para su inducción. Fibroblastos de ratón
C3HT10½ en condición basal fueron estimulados con
los cuatro inhibidores de proteínas y después inducidos
por PMA por 4.5 horas. El ARNm fue colectado,
reversotranscrito y el perfil de expresión de Mmp9,
Timp1 y, Timp3 fue analizado mediante la tecnología de
PCRc, pruebas t fueron aplicadas a los resultados. Se
identificó que Timp1 (datos no mostrados) y Timp3 (figura
1a) tienen patrones de expresión similares, la inducción
por PMA de ambos genes fue afectada por todos los
inhibidores empleados, estos datos sugieren que Timp1
(datos no mostrados) y Timp3 (figura 1a) requieren de
la síntesis de proteínas para la inducción por PMA. Sin
embargo, Mmp9 parecería ser independiente de síntesis
de proteínas para la inducción por PMA (figura 1b), puesto
que los mismos inhibidores de la síntesis de proteínas
no bloquearon la inducción de PMA en fibroblastos
C3HT10½ en cultivo. Interesantemente anisomicina,
emetina y ciclohexamida, pero no puromicina, induce
Mmp9 al mismo grado que PMA.
por PMA; los datos fueron normalizados a ARNr 18S. El
color blanco y obscuro representan los tiempos 0 y 4.5
horas respectivamente. Las barras de error representan
el rango entre las muestras. a) Timp3, y b) Mmp9.
6
Timp3 / 18S (veces)
a)
5
4
3
2
1
0
-
PMA
Anisomicina
Emetina
Ciclohexamida
Puromicina
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
b)
Mmp9 / 18S (veces)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
PMA
Anisomicina
Emetina
Ciclohexamida
Puromicina
Efectividad de los inhibidores anisomicina,
emetina, ciclohexamida y puromicina para bloquear
síntesis de proteínas total en fibroblastos de ratón
C3H10T½. Células C3H10T½ mantenidas en medio libre
de suero por 18 horas fueron estimulandas con 10 µg/ml
de anisomicina, ciclohexamida, emetina y puromicina
en presencia o ausencia 10-7M de PMA por 4.5 horas,
posteriormente se agregó al medio leucina-3H. Estos
cuatro inhibidores de la síntesis de proteínas actúan por
diversos mecanismos (17, 19). La cuantificación de la
incorporación leucina-3H (datos no mostrados) después
de 4.5 horas de tratamiento con inhibidores muestran
que la traducción fue bloqueda al menos en un 95%
comparada con la condición de PMA en fibroblastos de
ratón C3H10T½ en cultivo. La viabilidad celular en estos
estudios no fue comprometida significativamente, pues
los análisis MTT indican que la disminución fue menor al
10% (datos no mostrados).
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
DISCUSIÓN
Bajo condiciones basales 11 Mmps y todos los Timps
fueron expresados en diversos niveles en C3H10T½: 5
Mmps y 3 Timps fueron expresadas extrema, muy alta
o altamente, 6 Mmps y Timp4 se expresaron de forma
moderada, mientras que los niveles de 14 Mmps no
fueron detectados. Estos datos sugieren un patrón
único de expresión para C3H10T½ comparado con los
reportados en la literatura (21, 22, 26).
Previamente se ha demostrado que TIMP1, Timp1
y ciertas MMPs son genes tardíos que requieren la
síntesis de proteínas para su inducción, en comparación
con los genes IE que exhiben la superinducción cuando
los inhibidores de la síntesis de proteínas se utilizan
conjuntamente con un estímulo (17, 18, 29). Por lo tanto,
es importante entender si la familia de Mmps y Timps
comparten la descripción como genes tardíos, lo cual
implicaría son componentes de una respuesta genética
coordinada en procesos de remodelación tisular. En
relación a la necesidad de la síntesis previa de proteínas
para su inducción por PMA, este estudio coincide con lo
reportado previamente para Timp1 (29) e incluye en este
Figura 1 Efecto de los inhibidores de la síntesis de
proteínas en presencia o ausencia de PMA en Timp3 y
Mmp9 en células C3H10T½. Células de C3H10T½ en
medio libre de suero por 18 horas fueron estimulandas
con 10 µg/ml de diversos inhibidores de la síntesis de
proteínas según se indica, en presencia o ausencia 107
M de PMA por 4.5 horas. El ARN total fue aislado y
sujeto a análisis mediante PCRc para cada gen inducible
82
grupo a Timp3, sin embargo, para Mmp9 mostramos
que es independiente de la síntesis de proteínas para
su inducción en respuesta al estímulo por PMA usando
como inhibidores anisomicina, emetina, ciclohexamida y
puromicina después de 4.5 horas de tratamiento.
Aunque se sabe que la inducción de MMPs y de
TIMPs depende del tipo de tejido y del inductor (5, 15,
18, 28, 30, 31) los pocos reportes existentes en los que
se ha documentado el requerimiento de síntesis de
proteínas, indican que la mayoría de estos genes tiene
como prerequisito para su inducción la síntesis previa
de proteínas. Estos reportes incluyen: inducción Timp1
en fibroblasts de ratón por TGF-b (28, 29); PMA (29) y
suero (32); inducción Timp3 en fibroblasts de ratón por
PMA (30); inducción TIMP3 en condrocitos articulares
de bovinos por TGF-b y Oncostatin M (33). De nuestro
estudio es interesante observar que el requerimiento de
síntesis de proteínas para la inducción por PMA puede
variar dependiendo del Mmp o Timp, dado que todos los
inhibidores de proteínas bloquearon la inducción de PMA
para Timp1 y Timp3, pero no para Mmp9.
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Agradecimientos
Deseamos agradecer a C.J. Pennington, M.H.
Handsley, A. Warn, a J. Zhong, A. Cullingford, E. Pineda
Arredondo y S. de la Peña Cruz su apoyo. C.L.S.R
fue becaria para estudios de doctorado por el Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología México (CONACyT),
Secretaría de Educación Pública México (SEP) y
Secretaría de Educación de Veracruz México (SEV).
Este trabajo fue financiado por el consorcio europeo del
“Cancer Degradome” de la Unión Europea (LSHC-CT2003-503297).
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84
Capítulo II
Clínica
Índice CPOD en embarazadas y no
embarazadas adscritas a la UMF No. 19
Jesus Ximena Hernandez Vicente1 , Issa Gil Alfaro
1
Pasante cirujano dentista
ANTECEDENTES
bucodentales. El diente y los tejidos de soporte y
sostén, la mucosa oral entre ellos, constituyen blancos
directos que pueden afectarse por este motivo, siendo
las alteraciones más frecuentes a nivel oral: gingivitis,
granuloma del embarazo, periodontitis y caries dental. 3
Un estudio en Madrid arrojo que las embarazadas
presentaron mayor incidencia de caries que las no
embarazadas en el periodo de embarazo y postparto. 4
Las embarazadas han sido consideradas como
población de alto riesgo a la que debe otorgarse una
atención especial, esta orientación se consolida aún
más al incluir en la Norma Oficial Mexicana para la
prevención y control de enfermedades bucodentales
lo siguiente: “En relación a la caries dental, se puede
decir, que la población de alto riesgo está principalmente
representada por los menores de 0 a 15 años y las
embarazadas. 5
Aunque en muchos países desarrollados ha habido
una reducción en la prevalencia de caries en los últimos
20 años, en el ámbito mundial la prevalencia sigue
siendo alta. 6
La caries tienen su inicio en la constante aposición
sobre la superficie del diente de glicoproteínas que
forman la placa bacteriana y por tanto la remoción de la
misma es la premisa principal en la prevención. 7
La caries es la enfermedad bucal de mayor prevalencia
en los países en vías de desarrollo y es considerada como
una enfermedad multifactorial.8 Se define como caries
dental a una enfermedad infecciosa de carácter crónico
que afecta desmineralizando a los tejidos duros de los
dientes en forma progresiva. Su etiopatogenia obedece
a la interacción simultánea de factores como son: una
flora microbiológica específica o placa bacteriana, que
se caracteriza por su alta capacidad en la producción
de ácidos, los que alcanzan rápidamente el pH crítico
necesario para disolver el esmalte. La presencia de un
sustrato (azúcar), que favorezca la colonización de estas
bacterias y que sea metabolizado para la producción de
ácidos orgánicos y, superficies dentarias susceptibles a
esta disolución ácida. Sin embargo para que progresen las
lesiones, debe actuar el factor tiempo sobre las variables
de la tríada. 3,8
Se reconocen en la placa bacteriana cariogénica:
especies de Streptococos mutans y sobrinus, otras
bacterias asociadas a caries dental son Lactobacillus
El embarazo es un estado fisiológico modificado que
como otros (pubertad, menopausia y anticoncepción oral),
no implican una situación patológica, sin embargo bajo
dicha condición, el organismo reacciona temporalmente
de manera distinta ante situaciones como son su propia
biología. El organismo materno sufre una serie de ajustes
hormonales, cardiovasculares, respiratorios, urinarios,
gastroenterológicos y estomatológicos, todas ellas
alteraciones adaptativas temporales, para dar cabida al
feto en desarrollo. 1
El embarazo comienza cuando el espermatozoide
de un hombre fecunda el óvulo de una mujer y éste óvulo
se implanta en la pared del útero. Durante este período,
hasta el parto, suceden una serie de acontecimientos
totalmente nuevos llamados gestación o embarazo los
cuales pueden llevar consigo la perturbación de la salud
bucal de la futura mamá. 2
El embarazo constituye una etapa de importantes
cambios en la mujer, no sólo por las repercusiones
que supone el nacimiento de un hijo sino por todas
las consecuencias que va a experimentar tanto a nivel
general como bucal. Las alteraciones a nivel oral que
puede presentar la mujer durante la gestación son
variadas. Una serie de cambios, extrínsecos e intrínsecos,
relacionados entre sí pueden hacerla vulnerable a
padecer caries dental y enfermedad periodontal.
Los cambios: en la producción salival, hormonales,
dietéticos, microbiológicos y alteraciones en la respuesta
inmunológica, constituyen factores que aumentan el
riesgo a desarrollar las patologías ya señaladas durante
este periodo. 2,10
Existe la creencia errada de que el embarazo le cuesta
un diente o más a la embarazada. Se puede afirmar que
durante el estado de gestación se producen cambios en
los tejidos orales y cambios de conducta que pueden iniciar
enfermedades bucodentales o agravar las ya establecidas,
todo lo cual no valida la creencia antes señalada. 2,3
Durante el período de gestación, las alteraciones
hormonales más significativas son el aumento en los
niveles de estrógenos y progesterona aumentando
gradualmente hasta los ocho meses de gestación. El
incremento de estas hormonas constituye una condición
sistémica particular que modifica las condiciones
87
acidófilo encontradas en caries dentinaria. La transmisión
de S. mutans ocurre principalmente de madre a hijo. Las
pacientes gestantes son un grupo prioritario, un estudio
realizado en Venezuela concluyó, que las embarazadas
presentaron un alto número de dientes cariados. 3,9
La lesión cariosa durante el embarazo es
exactamente igual a la observada en otro tipo de
pacientes. Es evidencia que en época de gestación y
post parto se presenta un aumento en la cantidad de
caries. La etiología del aumento de la incidencia de la
caries se debe a:
• Los cambios del régimen dietético.
• Una tendencia a la disminución de hábitos de higiene
bucal.
• La erosión producida a consecuencia de los ácidos
producidos por los vómitos presentes durante el
embarazo.
• La creencia del supuesto perjuicio que acarrea acudir
a la consulta odontológica durante el embarazo. 9
Un estudio epidemiológico realizado en una
población de 89 gestantes en Venezuela, mostró un
índice CPOD promedio de 11. Las embarazadas con
edades entre los 35-43 años promediaron 14 dientes
con caries, seguidas por el grupo de 24-34 años cuyo
promedio fue de 12 dientes con caries, y el grupo que
presento el promedio mas bajo de 7 dientes con caries
fueron las gestantes de 13-23 años. El índice CPOD es
proporcional a la edad. 9
Por otro lado, en Chile se realizó un estudio en él,
se reveló que la caries dental tuvo una prevalencia del
100% con un índice CPOD de 15.57 presentando las
gestantes en promedio 11.84 piezas dentarias con caries
y 2.24 de las piezas dentarias obturadas y 1.45 fueron
piezas perdidas por caries. 3
En México se realizó un estudio similar examinando
103 pacientes, con una edad promedio de 26.7 años,
en esta población la incidencia de caries dental fue de
99%, el índice CPOD fue de 13.8 correspondiendo 7.1
cariados, 2.4 perdidos y 4.3 obturados.5
Se realizó un estudio para conocer el perfil de las
pacientes embarazadas y dio como resultado la falta de
interés de la embarazada durante el periodo de gestación
y cuando acuden es por odontalgia. 10
La población tiene, desde sus creencias y mitos,
respuestas a los cambios orales que se generen
durante el embarazo existe una asociación errónea
entre gestación e incremento de caries. Por otro lado,
muchas mujeres creen que el calcio es tomado de
sus dientes durante la gestación y esta es la razón de
aparición de caries. El esmalte dentario está compuesto
por cristales de hidroxiapatita que no responden a los
cambios bioquímicos del embarazo, o al cambio en el
metabolismo de calcio. La caries dental es el resultado
de repetidos ataques de ácidos sobre el esmalte dentario
y no de repetidos embarazos. Las cantidades totales de
calcio y fósforo que necesita el feto durante el embarazo
solo representa 1/50 de la cantidad presente en los
huesos maternos. 2,11
Durante el proceso gestacional ocurren una serie
de fenómenos fisiológicos que favorecen el desarrollo
de éstas patologías en la mujer. Por esto, es importante
la prevención de la transmisión de la flora microbiana
desde la madre al hijo. Afortunadamente, los efectos en
la salud bucal durante el embarazo puede ser evitados
con la entrega de información y habilidades acerca de la
salud bucal y con ello, el mantenimiento de una correcta
higiene oral. 3
Concluyendo que no existe relación alguna entre el
embarazo y la incidencia o prevalencia de caries, por lo
que no debe ser considerada como de alto o mediano
riesgo. 5
En relación a la dieta, factores importantes a
considerar son: su poder cariogénico; su composición,
consistencia, frecuencia y momentos de ingesta,
trascendentales en la regulación de la placa bacteriana.
Aquellos alimentos con un alto contenido de carbohidratos
de bajo peso molecular (sacarosa, glucosa y lactosa)
son metabolizados con mayor rapidez por las bacterias
cariogénicas mediante la glucólisis, cuyo producto de
degradación son ácidos, los que descienden el pH en la
En cuanto a la consistencia de alimentos cariogénicos,
se considera más perjudicial cuanto más pegadizo y
adherente sea a la superficie dentaria, debido a que
por su bajo clearence permanece por mayor tiempo en
boca; en cambio, los de alto clearence, como líquidos, lo
hacen en un tiempo menor. 1,3
Si se ingieren azúcares con frecuencia, el pH se
mantiene ácido, por debajo de los valores críticos (5.2 a 5.5).
Cabe señalar que el flujo salival aumenta considerablemente
durante las comidas. Si bien, la saliva presenta una notable
actividad buffer, el pH se normaliza más rápidamente cuanto
mayor es la cantidad de saliva. 3,4,7
El riesgo de caries es mayor si el azúcar es consumido
entre comidas, que si lo es durante las mismas. 7
La Organización Mundial de la Salud (OMS)
recomienda el índice CPOD ANEXO4 (cariados, perdidos,
obturados) para efectuar estudios epidemiológicos sobre
experiencia de caries dental. 5
El estudio realizado en Madrid concluyó que durante
el embarazo, las mujeres presentaron una incidencia de
caries tres veces superior a las mujeres no embarazadas.
Este aumento en la incidencia de caries se asoció a los
vómitos del embarazo.4
88
JUSTIFICACIÓN
de riesgo cariogénico (ANEXO 2). Se les pidió pasar
al consultorio de estomatología para llevar a cabo la
exploración de la cavidad bucal, la cual se realizó en el
sillón dental empleando un explorador, espejo plano del
no. 5, pinza de curación, guantes de látex y cubreboca.
(ANEXO 5)
Los datos de la exploración bucal se registraron en
un odontograma (ANEXO 6) y los resultados recabados
se vaciaron en una base de datos para llevar a cabo su
análisis estadístico.
Aunque se sabe que las mujeres presentan mayores
índices CPOD, son múltiples los factores que condicionan
el problema, observándose que en las embarazadas es
aún mayor la afectación a la salud bucal, esto debido
a los cambios hormonales, ocasionando una mayor
frecuencia de dientes cariados y perdidos, lo que deriva
en repercusión a la salud en general y en mayores costos
económicos. En la UMF 19 hasta el momento no se
han realizado estudios que aborden el problema, por lo
que es conveniente la realización de una investigación al
respecto, para conocer si efectivamente existe un mayor
índice CPOD en embarazadas comparándolas con las
no embarazadas.
RESULTADOS
En nuestro estudio se incluyeron 158 pacientes,
79 embarazadas y 79 no embarazadas, con las mismas
edades. (Gráfica 1.)
OBJETIVO GRAL
Grafica 1. Embarazadas y no embarazadas por
grupos de edad
Comparar el Índice CPOD (ANEXO 4) en
embarazadas y no embarazadas adscritas a la UMF No.
19 en el periodo Enero- Mayo 2007
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Cuál es el Índice CPOD en embarazadas en
comparación con las no embarazadas adscritas a la
UMF No. 19?
HIPOTESIS
FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007.
El Índice CPOD en embarazadas es mayor que en
las no embarazadas adscritas a la UMF No. 19
Con respecto a las características sociodemográficas,
prevalecieron la escolaridad secundaria, como ocupación
las labores del hogar, las casadas, y no se encontró
evidencia de pobreza familiar (Cuadro I)
MATERIAL Y MÉTODOS
DISEÑO: Encuesta prospectiva comparativa
TIEMPO: Octubre de 2006 a Julio 2007
LUGAR: UMF Nº. 19
POBLACIÓN: Mujeres adscritas a la UMF Nº. 19
MUESTRA: Mujeres adscritas a la UMF Nº. 19 que
asistan a consulta en el
periodo Enero
–Junio de 2007
n= 158
Cuadro I. Caracterìsticas sociodemograficas de
embarazadas y no embarazadas
PROGRAMA DE TRABAJO
En el periodo comprendido enero a junio de 2007,
a las pacientes, embarazadas y no embarazadas,
presentes en sala de espera, y las remitidas por los
médicos familiares, se les invitó a formar parte del trabajo
de investigación, con su consentimiento se realizó una
entrevista (ANEXO 1) para determinar las características
sociodemográficas, hábitos higiénico bucales, e índice
Característica
Embarazadas
No embarazadas
Escolaridad:
Secundaria
33 %
37 %
Ocupación: Labores
del hogar
57 %
70 %
Estado. Civil: Casada
56 %
51 %
Índice de pobreza
familiar: Sin evidencia
81 %
73 %
FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007.
89
n= 158
En cuanto a las características clínicas detectadas
se observó en las embarazadas una mayor frecuencia de
cepillado y de molestias al mismo, una baja frecuencia
de uso de hilo dental tanto en embarazadas como en
no embarazadas, baja asistencia a consulta dental, en
promedio acudieron solo una vez al año a consulta,
con un índice de riesgo cariogénico moderado en su
alimentación en los dos grupos . (Cuadro II).
se encontraron diferencias solo en dos rubros entre las
embarazadas y las no embarazadas. (Cuadro III)
Cuadro III.
embarazadas
Índice
cpod
embarazadas
y
no
Cuadro II. Características clinicas de embarazadas
y no embarazadas
FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007.
n= 158
CONCLUSIONES
En nuestro estudio el índice CPOD mostró
diferencias en el número de dientes cariados y en el
número de dientes sanos, dado que las embarazadas
presentaron un mayor promedio de dientes cariados y
un menor número de dientes sanos a pesar de que hubo
una mayor frecuencia de cepillado dental.
No se encontraron diferencias en factores de interés
que repercuten en el índice CPOD tales como índice
cariogénico o asistencia al Servicio de Estomatología.
Como en estudios previos prevalece la escasa
asistencia a consultas odontológicas por lo que será de
interés para estudios subsiguientes promover esfuerzos
con el fin de mejorar en estos rubros.
FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007.
n= 158
BIBLIOGRAFIA
Al evaluar el índice CPOD las embarazadas tuvieron
un índice mayor de dientes cariados y un índice menor
de dientes sanos, con respecto a las no embarazadas.
(Gráfica 2).
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Grafica 2. Índice CPOD embarazadas y no
embarazadas
FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007.
n= 158
Al analizar las diferencias entre los grupos mediante
prueba de T de Student para muestras independientes
90
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14. Manual de prácticas extramuros de la asignatura de
Odontología Familiar.
ANEXO 1
Embarazada
No embarazada
FICHA CLÍNICA ODONTOLÓGICA
FOLIO: ___________
Fecha Examen:
Edad:____________
Nombre: ___________________
_
AFILIACIÓN:________________
FUR: __________________
Escolaridad:
1. Nula
(
)
2. Primaria
(
)
3. Secundaria
(
)
4. Preparatoria (
)
5. Técnica
(
)
6. Profesional
(
)
Otro:______
Ocupación:
1. Ama de Casa (
)
2. Estudiante
(
)
3. Empleada
(
)
4. Profesión
(
)
Estado Civil
1. Soltera
(
)
2. Casada
(
)
3. Divorciada
(
)
4. Unión libre
(
)
5. Otro: _______________
Frecuencia cepillado:
1 (
)
2 (
)
3 (
)
4
(
)
Otro:________
Molestias al cepillado
1. Si (
)
¿Cuáles?_____________
2. No
(
)
Le han enseñado alguna vez a cepillarse los dientes
1. Si (
)
¿Dónde? _____________
2. No
(
)
¿Utilizas hilo dental?
1. Si (
)
Frecuencia ______________
2. No
(
)
¿Está en tratamiento odontológico?
1.
Si
(
)
2. No
(
)
¿Cuántas veces visitaste al dentista en el último
año? ______________________
91
ANEXO 2
RIESGO CARIOGENICO
(a) Consumo
(b) Frecuencia
Valores
Asignados
Valor Asignado
Grado de Cariogenicidad
Bebidas
azucaradas
Jugos de
sobre, jugos
de fruta, té,
leche con
2 o mas
cucharadas de
azúcar.
1
Masas no
azucaradas
Pan blanco
2
Caramelos
Chiclets,
caramelos,
helados,
mermelada,
chocolates
3
Masas
azucaradas
Pasteles
dulces, tortas,
galletas,
donas.
4
Azúcar
Jugo en polvo
sin diluir, miel,
frutas secas,
frutas en
almíbar, turrón,
caramelos
masticables,
cereales
azucarados.
5
(d)
Consumo
por
frecuencia
(c) Ocasión
Valores Asignados
0
1
2
3
1
5
Nunca
2 o más
veces
en la
semana
1
vez
al
día
2o
más
veces
día
Con las
comidas
Entre
comidas
(d)
(f) Valor potencial
cariogénico:____
Consumo
por
ocasión
(e)
(e)
Para obtener puntaje de riesgo:
1. Se multiplica el Valor dado al consumo en la columna vertical izquierda (a) por el Valor dado a la frecuencia (b)
en la columna horizontal.
2. Se multiplica el Valor dado al consumo (a) por Ocasión (b).
3. Se suma los valores parciales de la columna Consumo por frecuencia para obtener el Puntaje total (d).
4. Se suma los valores parciales de la columna Consumo por ocasión para obtener el Puntaje total (e).
5. Se suma (d) + (e) para obtener el Valor del potencial cariogénico.
Escala:
Puntaje Máximo: 144
10-33:
34-79:
80-144:
Puntaje Mínimo: 10
Bajo Riesgo Cariogénico
Moderado Riesgo
Cariogénico
Alto Riesgo Cariogénico
92
ANEXO 3
computado separadamente, por edad y sexo, ya que
estos dos factores son importantes en la interpretación
correcta de los datos. Por lo que respecta al sexo,
sabemos que las niñas, promedio, presentan una
erupción más precoz que los niños, consecuentemente
se espera un CPOD promedio más alto en las niñas,
que en los niños, en el mismo grupo de edad. Así para
el factor edad, también el niño con mayor edad tendrá
un mayor CPOD promedio, ya que tienen un número
mayor de dientes permanentes sujetos al ataque de
caries y también, posee dientes permanentes expuestos
por un tiempo más largo al ataque de la misma. Además
del CPOD promedio, es posible calcular otros datos
estadísticos a través de las encuestas CPOD.
Cuando una encuesta es realizada en una población
de niños que presentan dentición mixta, se utiliza el
índice “ c e o” para descubrir la prevalencia de caries en
los dientes temporales. El símbolo c, significa el número
de dientes temporales presentes con lesiones cariosas
y no restauradas. El símbolo e significa el número de
dientes deciduos con extracción indicada. El símbolo o,
representa el número de dientes temporales obturados.
El deberá ser computado separadamente, para cada
edad y sexo, en grupos de niños menores de 12 años
de edad.
Índice Simplificado de Pobreza familiar
(ISPF)
Indicadores
Categorías
Puntuación
Ingreso
económico
familiar
< 1 salarios mínimos
1-2 salarios mínimos
3-4 salarios mínimos
5 o 6 salarios
mínimos
7 o más salarios
mínimos
4
3
2
1
Número hijos
dependientes
3 ó más hijos
2 hijos
1 hijo
ningún hijo
2.5
2
1
0
Escolaridad
materna
Sin instrucción
Primaria incompleta
Primaria completa
Post-primaria
2.5
2
1
0
Hacinamiento
(número de
personas por
dormitorio)
3 o más personas
1 a 2 personas
1
0
0
0- 3 SIN EVIDENCIA DE POBREZA FAMILIAR
4- 6 POBREZA FAMILIAR BAJA
7- 10 POBREZA FAMILIAR ALTA.
SISTEMA DE CLASIFICACIÓN DEL CPOD
TOTAL DE PUNTOS: ______
El concepto original del índice CPOD fue elaborado
hace 25 años, y la primera publicación sobre el índice
fue un artículo en el “The Public Health”, de diciembre de
1937, titulado “Dental Caries in American Indian Children”,
siendo autor Henry Klein y Caroll E. Palmer. Después
de este trabajo, varios investigadores han utilizado esos
conceptos, y en determinadas ocasiones modificaron los
criterios, métodos o el sistema original de clasificación.
La experimentación y las modificaciones sucesivas han
hecho difícil la comparabilidad de datos obtenidos por
diferentes investigadores.
Las variadas modificaciones usadas hoy en día,
acarrean una serie de problemas en el adiestramiento
de Cirujanos Dentistas en la práctica de encuestas.
Los criterios de exámenes, los sistemas de tabulación
y código presentados en este manual pueden variar, en
uno o en más aspectos de otros usados actualmente. Las
consideraciones siguientes deben merecer la atención
del lector.
ANEXO 4
CPOD
Índice de dientes cariados, perdidos, obturados.
El CPOD describe numéricamente los resultados
del ataque de caries en los dientes permanentes de un
grupo de población. El símbolo C se refiere al número de
dientes permanentes que presentan lesiones de caries
no restauradas. El símbolo P se refiere a los dientes
permanentes perdidos por lesiones cariosas, además se
clasifican como perdidos a los dientes cuya extracción
está indicada por lesiones cariosas. Así los dientes
permanentes perdidos P, estará compuesto por los
dientes extraídos E y dientes con extracción indicada.
El símbolo D, es usado para indicar que la unidad
establecida es el Diente o sea, el número de dientes
permanentes afectados, en vez de superficies afectadas
o número de lesiones de caries existentes en la boca.
El CPOD es generalmente expresado como el
número promedio de dientes CPO por persona, en la
población en estudio. El promedio es generalmente
1. El examen es realizado para determinar la
clasificación de 28 dientes. Los terceros molares son
excluidos del sistema por dos razones:
a) en encuestas en niños menores de 15 años de
93
edad (grupo generalmente estudiado), el registro de
cuatro decisiones adicionales, por el examinador, ofrece
un número de informaciones.
b) En encuestas en adultos jóvenes, de 15 a 35
años, las variaciones en el patrón de erupción y las
frecuentes extracciones debido a dientes incluidos y
otras razones no relacionadas con ataque de caries,
dificultan la clasificación adecuada de la falta de estos
dientes. Aún el interrogatorio cuidadoso al paciente no
ofrece una base segura para que el dentista alcance una
conclusión confiable.
2. Este sistema de clasificación incluye la categoría
de “extracción indicada”, como uno de los componentes
del símbolo perdidos “P”, en dientes permanentes cuya
pulpa dental se haya comprometida. Cierto es que
muchos de estos dientes podrían ser salvados y que
las opiniones profesionales pueden variar en decidir
cuando un diente debe ser extraído, sin embargo, desde
el punto de vista de la Salud Pública, debemos recordar
que la mayoría de los servicios odontológicos públicos
no cuentan con recursos para tratamientos radiculares,
siendo así, que los dientes con problemas pulpares son
sumariamente extraídos. La inclusión de la categoría
“extracción indicada” no altera el valor numérico del CPOD
más la categoría “C” puede estar disminuida cuando es
comparada con datos obtenidos en encuestas que no
incluyeron esa categoría. Ya que la decisión adicional
de clasificar un diente que esta atacado de caries como
“cariado” C o “extracción indicada “ (EI), no aumenta de
forma significativa el tiempo total de examen y permite
además utilizar datos de encuestas epidemiológicas
para evaluar aproximadamente las necesidades de
tratamiento (Planteamiento de Programas de Atención),
la inclusión de la categoría “EI” está justificada.
3. El criterio “extracción indicada” es utilizado
para dientes temporales por las mismas razones arriba
citadas.
4. El código y el sistema de clasificación no incluyen
un método para obtener datos estadísticos sobre otras
afecciones bucales que pueden ser observadas durante
la encuesta CPOD. Si esos datos son necesarios, una
clasificación separada y un sistema de registro diferentes
deben ser utilizados.
5. El código usado en esta clasificación está
basado en valores numéricos seleccionados, porque
ellos son fáciles de aprender o se parecen a palabras
usadas en criterios, siendo fáciles de tabular manual y
mecánicamente. Los números son también diferentes
en sonido, cuando son dictados verbalmente y,
consiguientemente más fáciles de distinguir para el
anotador. Sin embargo pueden utilizarse otros tipos de
código.
CÓDIGOS Y CRITERIOS PARA EXÁMENES Y
REGLAS PARA EL REGISTRO
CÓDIGOS
CRITERIOS
0
Espacio vacío
1
Diente permanente cariado
2
Diente permanente obturado
3
Diente permanente extraído
4
Diente permanente con extracción Indicada
5
Diente permanente sano
6
Diente temporal cariado
7
Diente temporal obturado
8
Diente temporal con extracción indicada
9
Diente temporal sano.
CRITERIO Y REGLAS PARA EL REGISTRO.
0 Espacio vacío: registrar el espacio dental como
“0” (cero) cuando la ausencia del diente es debida a:
• Ausencia del diente deciduo o temporal por
cualquier razón.
• Diente permanente no erupcionado.
• Diente temporal no erupcionado.
• Diente permanente o temporal incluido o ausente
congénitamente.
• Diente temporal extraído
• Diente permanente extraído por otras causas, que no
sea la caries dental.
1. Diente permanente cariado: utilizar el código “1”
cuando existan las siguientes evidencias de lesiones
cariosas:
• Evidencia clínica de esmalte socavado, debe existir
una cavidad
definida con coloración u opacidad a lo largo de los
márgenes, en las
cuales el explorador pueda ser
introducido.
• Las fisuras en las cuales el extremo del explorador se
prende, serán clasificadas como cariadas solamente
si una de las condiciones, citadas abajo fuesen
llenadas:
a)Presencia evidente de tejido blando en la base de la
fisura.
b)Opacidad a lo largo de los márgenes o una mancha
indicada , presencia de lesión cariosa subyacente.
c) En casos de superficie proximales si el explorador
no se disloca cuando se hacen movimientos en la
dirección cervico-oclusal.
2. Diente permanente obturado atribuir el código 2
cuando el diente esta obturado con material permanente
sin llevar en cuenta el tipo de material restaurador.
• Un diente que está al mismo tiempo obturado y cariado
94
es clasificado
como cariado (código 1).
ANEXO 5
PROCEDIMIENTOS EN EL EXAMEN CPOD
3.Diente permanente extraído de acuerdo con la edad
del paciente debería estar presente y fue extraído
debido a lesión cariosa. En caso de duda preguntar
al paciente si la ausencia del diente es debida a
extracción y examínese la forma del reborde alveolar
y la presencia o ausencia del diente homologo. Este
criterio no es utilizado para dientes temporales.
4.Diente permanente con extracción indicada atribuir el
código 4 cuando el diente presente solamente raíces o
corona parcialmente destruida, deberá existir siempre
la evidencia de que la pulpa fue alcanzada.
5.Diente permanente sano dar el código 5 al diente si
no presenta lesión cariosa, restauración, coronas
de oro o porcelana. Otros defectos como hipoplasia,
fluorosis, defectos del esmalte, puede o no estar
presentes. Los dientes permanentes que se presentan
restaurados, por causas diferentes a la caries dental,
por ejemplo: indicaciones protesicas o fracturas, etc.,
serán considerados sanos recibiendo el código 5 y
anotándose en el espacio destinado a observaciones.
En el proceso de examen, el examinador inspecciona
visualmente y con el auxilio del explorador, las caras
oclusal, vestibular, distal, lingual y mesial de todos los
dientes presentes (excepto 3° molares).
El examen es realizado con el auxilio de un espejo
plano y explorador número 5 con extremidad bien
afilada.
La posición del paciente debe ser tal que el
examinador tenga una visibilidad óptima de los cuadrantes
a ser examinados. El examen deberá ser conducido de
la siguiente manera:
1.Iniciar el examen en el espacio correspondiente, al
segundo molar superior derecho y proseguir hasta el
incisivo central superior derecho.
2.Continuar el examen por el incisivo central superior,
siguiendo hasta el espacio correspondiente al segundo
molar superior izquierdo.
3.Reiniciar el examen por el espacio correspondiente al
segundo molar inferior izquierdo, siguiendo hasta el
incisivo central inferior izquierdo.
4.Finalmente examinar el último cuadrante, comenzando
por el incisivo central inferior derecho y seguir hasta
el espacio correspondiente al segundo molar inferior
derecho.
Los códigos siguientes son para dientes deciduos o
temporales, los criterios de clasificación son los mismos
de los dientes permanentes.
Registrarse de la manera siguiente:
CÓDIGO
CRITERIO
6 Diente temporal cariado
7 Diente temporal deciduo
8 Diente temporal con extracción Indicada.
9 Diente temporal sano.
PROCEDIMIENTO PARA EL EXAMINADOR
• Use siempre el explorador, evítelo solo en caries
avanzadas (posible exposición pulpar), a fin de no
causar dolor o incomodidad del paciente.
• Indague con el paciente la razón de la extracción de
sus dientes, más si la respuesta no es concluyente,
siga su propio juicio clínico.
• Dicte el código claramente, para evitar errores de
anotación, mantenga el anotador en posición tal que
le permita hablar directamente con él.
• Solicite al anotador que interrumpa el examen en caso
de aclaración o duda sobre la anotación. La perfecta
anotación de la fecha de examen es responsabilidad
del examinador, por lo tanto mantenga al anotador
bajo frecuente supervisión para tener certeza de que
está desempeñando su papel correctamente.
• Aproveche la oportunidad de realizar educación para
la salud, cuando el paciente se muestre interesado en
hacer preguntas sobre la encuesta.
• Mantenga un ritmo constante.
Reglas especiales:
• Un diente es considerado como erupcionado cuando
cualquier porción de su superficie estuviese expuesta
en la cavidad bucal y pudiese ser tocada con el
explorador.
• Un diente es considerado presente, aún cuando la corona
esta totalmente destruida, quedando solo las raíces.
• Los dientes supernumerarios no son clasificados.
• Si un diente temporal está retenido y su sucesor
permanente está presente, se clasifica solamente el
permanente.
En duda entre:
• Cariado y sano, clasificar como sano.
• Cariado y extracción indicada, clasificar como
cariado.
• 1° y 2° premolar, clasificar como 1° premolar.
95
ANEXO 6
HOJA EPIDEMIOLOGICA BUCAL
(Odontograma)
ÍNDICE CPOD
17
16
47
46
Perm.
55
15
54
14
53
13
52
12
51
11
61
21
62
22
63
23
64
24
64
25
85
45
84
44
83
43
82
42
81
41
71
31
72
32
73
33
74
34
75
35
26
27
36
37
P
T
P
T
96
Capítulo III
Salud Pública
Análisis de Cluster de Leucemia Aguda en
niños de la ciudad de México en el 2006
Sánchez-Acosta Plácido1 , Ortega-Álvarez Manuel Carlos2, Mejía-Aranguré Juan Manuel2
1
Medico Interno de Pregrado del Hospital Regional de Veracruz y egresado de la Universidad Veracruzana, Facultad de Medicina Miguel Alemán
Valdés, Veracruz, Ver..
2
Miembros del Sistema Nacional de Investigadores. Unidad de Investigación Médica en Epidemiología Clínica, Hospital de Pediatría, Centro Médico
Nacional Siglo XXI , IMSS
MARCO TEÓRICO
de alguna forma lo anteriormente mencionado para los
otros métodos(1).
Por otra parte existen técnicas un poco más
generales que pueden aplicarse para la detección de
aglomeraciones inusitadas de enfermos en espacio,
tiempo y en espacio-tiempo: el test de Grimson, (Grimson,
1991) constituye el mejor ejemplo de estos casos y es el
que se utilizará más adelante en el presente trabajo. Este
método parte de dividir la región de estudio en regiones
más pequeñas llamadas celdas(1).
Se dice que una celda está “marcada” si contiene
una cantidad de enfermos superior a un cierto umbral
definido por un especialista, (matemáticamente este
umbral pudiera determinarse por el valor esperado de
una distribución de Poisson; Grimson calcula entonces
la cantidad “A” de celdas marcadas que son adyacentes.
La hipótesis fundamental del test enuncia que bajo el
supuesto de la no existencia de clusters, “A” debe ser
pequeña, pues las celdas marcadas deben distribuirse
con cierta uniformidad por toda la región. Existen fórmulas
específicas para el cálculo del valor esperado de A (E(A))
y de su varianza (V(A)). La hipótesis alternativa, por su
parte, enuncia que “A” tiene un valor demasiado grande
sugiriendo la presencia de al menos un cluster(1).
En ocasiones existen dudas sobre cuando aplicar
una u otra técnica de detección de clusters, muchas
veces la respuesta viene dada por el tipo de datos
disponible y por los objetivos de la investigación(1).
Si se está trabajando con un área geográfica lo
más natural es que se aplique alguna de las técnicas
de detección de aglomeraciones espaciales. Si lo que
se tiene son fechas de ocurrencia de cualquier evento
entonces deben aplicarse métodos de detección de
clusters temporales. Por último si se tienen ambos datos,
debe comenzarse aplicando tests espacio-temporales,
pero en estos casos resulta siempre interesante estudiar
además la ocurrencia de conglomerados en espacio y
en tiempo por separado; en ocasiones ocurre que, a
pesar de contar con ambos tipos de datos, los casos se
distribuyen uniformemente en el tiempo, (o en el espacio)
y si esto ocurre resulta natural trabajar solo con datos
geográficos (temporales)(1).
Antecedentes
En los últimos años ha habido un notable desarrollo
en el surgimiento de métodos estadísticos específicos
para la detección de aglomeraciones que han encontrado
un campo de aplicación exitoso en la Medicina(1).
La importancia de la detección de conglomerados
surge como estrategia para detectar en poco tiempo,
pequeños focos epidémicos y evitar así su propagación,
así como para identificar la etiología de las enfermedades
para su prevención.
Además la detección de
conglomerados constituye una herramienta importante
para la vigilancia del cáncer, sirve para identificar áreas
de alto riesgo y generar hipótesis acerca de la etiología
del mismo(2).
Un “cluster” se define como la aparición de un número
de casos de una enfermedad en cantidad superior a
lo que cabría esperar para un determinado grupo de
población, un área geográfica y un período de tiempo
determinados(3, 4). Se recomienda la denominación
“conglomerado” como traducción más utilizada del
término, en castellano.
Para precisar aun mas la definición es necesario
dividirla en tres: se denomina conglomerado espacial o
geográfico a un exceso de casos en un área geográfica,
que puede ir desde un pequeño poblado hasta todo un
continente; un conglomerado temporal es un exceso de
enfermos diagnosticados muy cercanos en tiempo y un
conglomerado espacio-temporal es un exceso de casos
en ambos escenarios: espacio y tiempo(5). Aunque la
interacción espacio temporal por su parte no es la simple
presencia de conglomerados de enfermos. Para que
exista un cluster en espacio-tiempo tiene que ocurrir que
los casos cercanos geográficamente coincidan con los
casos cercanos en tiempo.
Entre los métodos más conocidos para detectar
interacciones se pueden mencionar el de Knox, (Knox,
1964 ), el de Mantel, (Mantel, 1967) y el del k vecino más
cercano, (Jacquez, 1996) entre otros. Ellos utilizan a la
vez coordenadas espaciales y temporales combinando
99
Por otra parte, ninguno de los métodos de
detección de aglomeraciones es infalible, y para evitar
grandes equivocaciones se recomienda aplicarlos varias
veces modificando el valor de sus parámetros y comparar
siempre los resultados obtenidos(1).
Las técnicas de detección de clusters por sí solas
se limitan a detectar el conglomerado en cuestión, no lo
caracterizan. Es por ello que un profesional de la Salud
Pública necesitaría, además de detectar a tiempo un
posible foco epidémico, conocer cuál o cuáles causas
propiciaron en mayor medida la afección(1).
A pesar de los incalculables avances médicos
de nuestro tiempo, existen numerosas enfermedades
con causas desconocidas, fundamentalmente las no
transmisibles, como se había visto con anterioridad; así
por ejemplo, la lista de alimentos cancerígenos aumenta
cada día más sin que se conozca con certeza cuáles son
las verdaderas causas que provocan el cáncer(1).
Es por ello que resulta trascendental conocer en
una determinada población, cual es la época del año, en
que una enfermedad es mas frecuente o por ejemplo en
que localidad o área geográfica se esta viendo afectada
en gran medida por determinada enfermedad, ya que
seria un buen logro partir de ahí para determinar a
que se atribuye la causa de la enfermedad y si se esta
viendo aumentada la incidencia, a que se debe este
fenómeno.
Vamos a partir del concepto de que las enfermedades
neoplásicas en la población pediátrica son muy raras,
pero paradójicamente, se encuentran entre las primeras
causas de muerte en la población pediátrica en el mundo,
basta considerar que entre la población estadounidense
de 1 a 19 años de edad, es la segunda causa de muerte,
sólo superada por los accidentes(6), y esto no dista
mucho de lo que ocurre en México en cuanto a estas
mismas patologías.
En una nación con pocos recursos para la atención
médica y que no puede garantizar una sobrevida elevada
en enfermedades como el cáncer (como es el caso de
nuestro país), se considera una prioridad instrumentar
medidas preventivas específicas que puedan disminuir
los casos de esta enfermedad(7). Es aquí, donde resulta
notable la aplicación de los métodos de detección de
clusters, ya que se evita invertir demasiados recursos
económicos a la atención de una patología, conociendo
las medidas profilácticas, que surgen a partir de la clara
visualización de la etiología.
Diferentes trabajos en la literatura, que buscan la
identificación de conglomerados, se han enfocado en
leucemia infantil debido a la alta incidencia entre niños
comparado con otras enfermedades cancerigenas y a la
gran preocupación pública que ésta genera(8,9).
Las leucemias agudas son los cánceres más
frecuentes en menores de 15 años(9,10); lo cual llama
la atención de las personas y las mantiene ante la
expectativa de que alguien perteneciente su familia
pueda padecerla, y seria aun mayor el temor si las
personas del país supieran que tan solo en la ciudad
de México representan alrededor de 40 % de todas las
neoplasias, mientras que en otros países constituyen
solo entre 30 y 34 %(9,10).
Actualmente se reconoce que en diferentes partes
del mundo la frecuencia de las leucemias agudas se
ha incrementado(11,12). En lo que respecta a nuestro
país, el cáncer en niños pasó del decimotercer lugar
como causa de muerte en 1971, al segundo lugar entre
la población de 1 a 14 años a partir del año 2000(13).
Considerando a la capital del país, El Distrito Federal, uno
de los estados mas densamente poblados del país, se
ha visto aumentada la tasa de incidencia de la leucemia
desde 1982(10), En forma particular la Leucemia
Linfoblastica Aguda que en 1982 : reportó una tasa de
incidencia de 7.75 por millón de niños menores de 15
años y para 1991 se alcanzó 22.19 por millón(14,15).
Entre 1993 y 1994, en el Instituto Mexicano del
Seguro Social se encontró una frecuencia de 34 por
millón(16); y entre 1996 y 1998, de 60.3(17), siendo
la tasa reportada para el periodo de 1996 al 2000 de
58.4 por 1, 000,000 de niños, una de las tasas más altas
reportadas en el mundo(18).
Debemos definir a las leucemias agudas
como enfermedades monoclonales que se originan
principalmente en la médula ósea, caracterizadas por
crecimiento incontrolado de formas celulares inmaduras
de los componentes sanguíneos llamados blastos(19).
Dependiendo de la estirpe celular afectada, se puede
hacer la distinción de leucemias agudas mieloblásticas,
linfoblásticas o de estirpe indiferenciada(20).
La causa de la mayoría de las leucemias agudas no
se conoce, sólo pocas exposiciones se han establecido
firmemente como factores de riesgo(21).
Las neoplasias que ocurren en la infancia difieren
de las formas principales de aparición en el adulto(22).
En la infancia hay un mayor predominio de neoplasias
no epiteliales (leucemias, linfomas y sarcomas) y en la
etapa adulta hay un mayor predominio de las epiteliales
(carcinomas)(23). Por ello, se infiere que las causas del
cáncer en la infancia son diferentes a las de los adultos;
además, es posible que los factores relacionados con
el cáncer operen en etapas muy tempranas de la vida,
incluso antes de la concepción(10).
En los menores de un año los tumores más frecuentes
son las leucemias, tumores del sistema nervioso central
y los linfomas(24,25); En algunas naciones como
100
Nigeria la incidencia de los linfomas sobrepasan a las
leucemias(26). Pero en la mayoría de los países incluidos
Argentina, Cuba y México las neoplasias más frecuentes
son las leucemias seguidas de los linfomas y los tumores
del sistema nervioso central(9,27,28).
Actualmente se entiende que las leucemias agudas
en los niños son el resultado de la interacción de diferentes
factores ambientales con la susceptibilidad genética a la
enfermedad(29) Cabe mencionar que la susceptibilidad
genética más importante para el desarrollo de leucemia
aguda en niños es el síndrome de Down. Un riesgo relativo
muy alto para desarrollar leucemias ha sido encontrado
en forma repetida, 10 a 20 veces más que en la población
general, si bien el riesgo se incrementa 500 veces en
un tipo especial de leucemia aguda mieloblástica: LAMM7(30) podríamos considerar que donde hay mayor
incidencia de Sx de Down coincide con la incidencia de
Leucemia Aguda y esto puede resultar cierto. Sabemos
que aproximadamente 60 % de las leucemias en niños
con síndrome de Down son agudas linfoblásticas y el
resto 40 %, agudas mieloblásticas(21).
Existen mecanismos a través de los cuales los alelos
HLA se asocian a la leucemia y convergen principalmente
en que uno o más genes del MHC pueden controlar la
carcinogénesis bajo la acción de algún factor químico,
virus o radiación(31,32)
En cuanto a la etiología de la leucemia aguda
(especialmente la linfoblástica aguda), Kinlen y
Greaves(33,34) proponen que una infección puede
tener un papel importante en el desarrollo de la leucemia
linfoblástica aguda. Greaves señala que la infección
actúa como un promotor más que un iniciador de la
mutación leucemiogénica. Se piensa que los niños
que desarrollan leucemia pudieran tener un sistema
inmunológico defectuoso para reconocer una infección
viral(33,35).
Y
volviendo a los factores ambientales, es
importante señalar que algunos factores requieren
mayor investigación, como las exposiciones en el
hogar. Vivir cerca de campos electromagnéticos y vivir
cerca de plantas nucleares han sido las exposiciones
en el hogar más estudiadas y controversiales(36), No
obstante, existen otras que requieren mayor estudio. La
exposición por la proximidad a una industria altamente
tóxica o la cercanía a basureros(37), y la exposición a
zonas de alto tránsito vehicular(38,39) se han asociado
con un riesgo hasta de 4.7 (IC 95 % = 1.6 a 13.5) para
desarrollar leucemia.
En la mayoría de los estudios epidemiológicos
realizados para investigar el cáncer en la población
pediátrica se ha buscado la exposición ambiental
separada de los factores genéticos. Sin embargo, un
estudio de casos y controles realizado en Quebec
identificó la evidencia de interacciones genéticas y
ambientales en el riesgo de cáncer en niños debido a la
exposición a insecticidas y alcohol(40).
Existe una respuesta individual ante los diferentes
agentes patógenos que depende incluso de la misma
herencia genética, así los individuos responde de
diferente manera ante una misma sustancia, infección,
alergeno, etc., por lo tanto la variación del riesgo de
exposiciones específicas asociadas con diferentes
fenotipos sugiere que la predisposición genética puede
jugar un papel sustancial en la respuesta individual
a exposiciones tóxicas y el desarrollo de neoplasias
infantiles(40).
No debemos olvidar que al hablar del hecho de
dilucidar, predisposición genética, implica contar con
recursos materiales y económicos, conocimientos de
ingeniería genética, aparatos especiales, incluso personal
con experiencia en este ámbito, siendo algo que muy
pocos países poseen. Es por ello que el gran problema de
estudiar la susceptibilidad por su expresión genética es el
alto costo de instalación de tecnología y de operación. Por
este motivo, los estudios de interacciones más factibles
son los que utilizan una población con susceptibilidad
conocida, como aquella con síndrome de Down(29).
Nuestra Hipótesis del presente trabajo es que
si existe, un conglomerado temporal en la serie de
casos, por fecha de diagnóstico y en sentido espacial
en ciertas delegaciones del DF, la cual responde a la
pregunta de investigación ¿Están ocurriendo todos los
casos consecutivos de leucemia infantil, registrados en
México DF, en un intervalo crítico de tiempo y cercanos
espacialmente?
Por lo anterior, planteamos como objetivo analizar
la distribución temporal y espacial de la incidencia de
leucemia entre niños de 0-14 años de edad en México
Distrito Federal, de enero a diciembre del año 2006,
utilizando métodos estadísticos que evalúen la existencia
de conglomerados.
METODOLOGÍA
Tipo de estudio: Observacional, descriptivo, transversal
prolectivo.
Diseño: Registro de base poblacional.
Universo de estudio: Población pediátrica del DF.
Numeradores: casos incidentes de leucemia aguda
(LA), diagnosticados de enero a diciembre del 2006 por
delegación política, cuyo rango de edad 0-14 años.
Denominadores: población de 0 a 14 años por
delegación reportada por el INEGI en el II Conteo de
Población y Vivienda 2005.
101
Participaron todos los hospitales del DF que atienden
niños con LA: pertenecientes al IMSS: Hospital de
pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI, Hospital
General de México, Centro Médico Nacional La Raza
y Hospital Regional Gabriel Mancera; pertenecientes a
la SSa: Hospital Infantil de México “Federico Gómez”,
Instituto Nacional de Pediatría y el Hospital Juárez de
México; y del ISSSTE el Centro Médico Nacional “20 de
noviembre”.
Diagnóstico: Todos los pacientes con LA fueron
diagnosticados por aspirado de médula ósea
(Internacional Classification of Disease for Oncology,
ICD-O2; 1990); Como dice el Dr Ignacio Mariscal el
diagnóstico de la Leucemia se sospecha por la clínica.
Se orienta con la citología hemática y se confirma con la
biopsia de Médula Ósea(41).
Las tasas fueron estandarizadas por edad, la cual
es la estandarización más utilizada en epidemiología, es
decir considerar la diferente distribución de la población
por grupos de edad de las áreas cuyas razones se
quieran comparar. Consiste en dividir el número total de
casos observados en un área determinada, por el total
de la población a riesgo en dicha área.
Se utilizó el paquete estadístico Epidat, que contiene
distintos métodos de detección de clusters, se realizó el
análisis temporal grupal con los métodos Scan, Cusum y
Poisson; y el método de análisis espacial fue Grimson. A
continuación intentaremos explicarlos.
SCAN es una prueba estadística para detectar
agrupaciones temporales en una serie temporal de
casos de un cierto evento o enfermedad. Es un método
útil para captar picos de incidencia de una enfermedad.
La hipótesis nula establece que los casos ocurren al
azar en el tiempo, frente a la alternativa de que los casos
se agrupan en ciertos periodos. Representa el número
máximo de casos observados en una ventana móvil
de longitud fija (duración esperada de una epidemia),
que se mueve en forma continua a lo largo del tiempo.
Si los casos se agrupan en el tiempo, entonces el
número máximo de casos en la ventana temporal será
grande(42).
El método CUSUM detecta incrementos en la
incidencia de una enfermedad. En la suma acumulada de
valores desde el periodo inicial, si aun no se ha declarado
ninguna alerta; la reporta, o en caso contrario, desde el
periodo siguiente al de la última alerta reportada(42).
Usando POISSON, basada en la distribución de
Poisson nos permite detectar agregaciones de casos en
el tiempo. La pregunta es: ¿hay evidencia de agregación
de casos en algún mes?. Epidat con la información de
casos esperados calcula, para cada mes, la probabilidad
de observar esos casos. Si esa probabilidad resulta ser
muy pequeña, se concluye que hay evidencia de una
agregación temporal que no es producto del azar(42).
GRIMSON detecta agregaciones espaciales dentro
de una región subdividida en áreas más pequeñas
cuando las áreas de mayor riesgo tienden a agruparse.
Se necesita identificar cada una de las áreas( con letras
del alfabeto), conocer los índices que identifican áreas
adyacentes a ella, esto es que comparten fronteras(Figura
1 y Figura 2); saber las tasas de incidencia de cada área
y plantear un punto de cohorte en las tasas de incidencia
que define áreas de alto riesgo(42).
Fig. 1 Delegaciones del DF
Fig.2 Ubicación geográfica
102
RESULTADOS
Fig. 4 Distribución de casos por mes y por trimestre
Se diagnosticaron 113 casos en niños menores de
14 años residentes del DF, la relación hombre: mujer fue
56:57. La tasa estandarizada por edad de 56.4 casos de
leucemia aguda por cada millón de niños.
Al participar todos los hospitales del DF que atienden
niños con LA cada uno atribuyo un número considerable
de casos: pertenecientes al IMSS: Hospital de pediatría
del Centro Médico Nacional Siglo XXI, sede del proyecto
de investigación 22 casos, Hospital General de México, 1
caso, Centro Médico Nacional La Raza, 21 casos; y Hospital
Regional Gabriel Mancera, 4 casos; pertenecientes a la
SSa: Hospital Infantil de México “Federico Gómez” con 23
casos; el hospital en el cual fueron diagnosticados mayor
numero de casos fue el Instituto Nacional de Pediatría con
32 casos y el Hospital Juárez de México 1 solo caso; y
del ISSSTE el Centro Médico Nacional “20 de noviembre”
con 9 casos (Figura 3).
Las tasas de incidencia por delegaciones políticas
reportaron tasas que van de 9.8 a 123.1 casos por
millón de niños para las delegaciones Tláhuac y
Venustiano Carranza respectivamente (Figura 6). Al
buscar un conglomerado espacial mediante el método
de Grimson analizando las tasas de incidencia de las 16
delegaciones así como su relación geográfica entre ellas,
se encontraron 7 delegaciones próximas (Figura 7), con
tasas elevadas; de las 5.9 que se esperarían, pero sin
significancia estadística global de conglomerados para
el DF.
Fig. 3 Hospitales del DF que atienden niños con
LEUCEMIA.
HOSPITALES DEL DISTRITO FEDERAL
INP
32
Fig. 5 Análisis Temporal de los casos por fecha de
diagnóstico
HIM
SXXI
23
22
CMLR
21
20 DE NOV
GABRIEL MANCERA
HGM
9
HJM
4
1
1
El método de Scan con una ventana temporal de
3 meses muestra una mayor incidencia en los meses
de enero, febrero y marzo con un total de 40 casos
(Figura 4), que corresponde al 35.4% de los registrados,
específicamente marzo contiene el mayor numero de
casos, hasta 3 por día. Dicho resultado es demostrable
también con el método de Cusum que detecta zona
de alarma en marzo por superar el número de casos
esperados mensuales. Aplicando el método de Poisson
que compara los 9.4 casos esperados con los 19 casos
reportados en marzo arroja un valor de p de 0.0024
proporcionando significancia estadística para este cluster
(Figura 5).
103
Establecer la presencia de conglomerados, no es un
fin en si mismo, es más bien un primer paso para generar
hipótesis de investigación para identificar posibles
factores ambientales, que posteriormente puedan ser
evaluados (44).
Con respecto a los clusters en el tiempo, el presente
estudio identificó un conglomerado en el mes de marzo, si
bien este tipo de estudios se realizan principalmente para
enfermedades infecciosas, su búsqueda en padecimientos
malignos, aporta elementos para dar sustento la hipótesis
de la etiología infecciosa de la leucemia (45).
El presente trabajo no identificó significancia a la
presencia de clusters espaciales, ya que el método de
Grimson no considera la superficie territorial de las unidades
de análisis y en este caso las delegaciones políticas son
muy heterogéneas al respecto, por lo que es recomendable
continuar con el análisis de esta información usando métodos
como el de Knox, para el estudio de las distribuciones en
espacio y tiempo que precisamente fue probado con casos
de leucemia y encontró que en los mismos existía una
tendencia al agrupamiento demostrándose un exceso de
pares de casos a menos de 1 km., de distancia y de 60
días en la presentación uno del otro (46).
Fig. 6. Tasa de incidencia por delegación del DF
Fig 7. Distribución de Tasa de incidencia por
Delegación en DF
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DISCUSIÓN
Este es el primer trabajo que busca la identificación
de clusters de leucemia aguda en México. Se confirmó
que la incidencia de leucemia aguda infantil en la ciudad
de México continúa siendo muy elevada (18), y es este
tipo de situaciones donde se recomienda la utilización de
los métodos para la búsqueda de clusters (43).
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106
Prevalencia de obesidad abdominal en adultos
participantes al curso “Escuela sana”
Malpica C. M. L1, Marquínez T. D.2, Gómez, D. G.3,
Dorantes, C. Alicia, Carrillo, T. Graciela, Martínez, S. Cristina
1
Directora de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, Universidad Veracruzana.
2
M.N.D., Académica de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, Universidad Veracruzana
3
Académica de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, Universidad Veracruzana.
RESUMEN
Faculty of Nutrition proposed a cross and descriptive
study which was approved by the Mexican Society of
Nutrition and Endocrinology Chapter Veracruz during the
International Congress of Nutrition and Endocrinology.
This study of 118 adults included anthropometric
evaluation of weight, height and waist circumference. The
information was processed thru the program of statistics
and epidemiology Epi-info. RESULTS: The prevailing
abdominal obesity among women was 64.7% and among
men was 73.3%. Obesity grade II was found in 44.9%
of the participants against the 11% of them found within
the normal parameters CONCLUSSIONS: The obesity
is associated with the abdominal obesity determines an
increased probability to develop diabetes mellitus type
2, high blood pressure. The importance of the study of
the prevalence of abdominal obesity within the adult
population is vital to value the size of the problem and to
take actions to prevent, early detect and correctly treat the
metabolic alterations to reduce the risk of complications.
INTRODUCCIÓN: La obesidad resulta de un
desequilibrio entre ingestión y gasto energético, puede
entenderse como un desequilibrio entre el aporte de
grasas y la oxidación lipídica. OBJETIVO: Determinar
la prevalencia de obesidad abdominal en los asistentes
al programa “Escuela Sana” en Veracruz, Veracruz.
MÉTODOS: Se realizó un estudio transversal y descriptivo
propuesto por la Facultad de Nutrición y aprobado por
La Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología
Capítulo Veracruz, durante el Congreso Internacional
de Nutrición y Endocrinología. El estudio incluyó 118
adultos, realizando evaluación antropométrica: peso,
talla y circunferencia de cintura. La información se
procesó en el programa de estadística y epidemiología
Epi-info. RESULTADOS: La prevalencia de obesidad
abdominal en mujeres fue de 64.7 % y en hombres fue de
73.3%. El 44.9% de los participantes se encontraron
con obesidad grado II en contraste con el 11% dentro
los parámetros de normalidad. CONCLUSIONES:
La obesidad se asocia directamente con la obesidad
abdominal y condiciona un aumento en la probabilidad de
desarrollar diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial.
El estudio de la prevalencia de obesidad abdominal en
la población adulta es de vital importancia para valorar
la magnitud del problema y de esta forma intervenir
con acciones de prevención, detección temprana y
tratamiento oportuno de las alteraciones metabólicas
para reducir el riesgo de complicaciones.
KEY
WORDS:
abdominal
obesity,
waist
circumference, diabetes mellitus 2, high blood pressure.
INTRODUCCION
En los últimos años se han generado datos que
sustentan un incremento en la prevalencia e incidencia
de la obesidad en todos los grupos de edad, razas,
grupos étnicos, tanto en hombres como en mujeres, y
está considerada por la Organización Mundial de la
Salud como la enfermedad nutricional más común del
mundo, estimando alrededor de 300 millones de adultos
obesos. 1
La obesidad implica una gran preocupación para los
clínicos, debido, sobre todo a las graves consecuencias
que afecta el estado de salud de las personas, lo que
ha llevado a muchos a considerarla una epidemia de
consecuencias devastadoras. 2
En los países en transición como el nuestro, la
obesidad está alcanzando proporciones significativas
en la población adulta y se asocia con un aumento en la
morbilidad de enfermedades crónicas no transmisibles. 1
Palabras clave: obesidad abdominal, circunferencia
de cintura, diabetes mellitus 2, hipertensión arterial.
ABSTRACT (SUMMARY or RÉSUMÉ)
INTRODUCTION: Obesity results from an unbalance
between intake and energetic expense; it is understood
as a lack of equilibrium between fat contribution and lipid
oxidation. OBJECTIVE: To determine the prevalence
of abdominal obesity in the assistants to the program
“Healthy School” in Veracruz, Veracruz. METHODS: The
107
Las implicaciones de la obesidad en relación con
la salud de los individuos se puede considerar a partir de
varias perspectivas: la magnitud general de la obesidad
(cuánto sobrepeso u obesidad tiene el individuo), la
disminución de la reserva corporal de grasa, el patrón
de distribución regional de grasa subcutánea (si es
obesidad abdominal o fémoro-glútea) y el grado relativo
de acumulación de grasa intraabdominal. 3
La obesidad es el resultado de un desequilibrio
entre la ingestión y el gasto energético. Este desequilibrio
es frecuentemente consecuencia de la ingestión de
dietas con alta densidad energética y bajas en fibra, y
de bebidas azucaradas, en combinación con una escasa
actividad física, la cual se ha asociado a la urbanización,
al crecimiento económico y a los cambios en la tecnología
para la producción de bienes y servicios, así como a los
estilos de vida y recreación. 4
La obesidad también puede entenderse desde
la perspectiva del desequilibrio entre el aporte de grasas
y la oxidación lipídica, es decir, como el resultante de
un disbalance graso. Tiene en gran medida una base
genética; sin embargo, sobre este factor predisponente
resaltan factores de tipo ambiental y/o cultural, siendo
esto, condición necesaria para la instauración de la
obesidad. 5, 6, 7
La predisposición genética para la obesidad
está asociada tanto con la ingesta como con el gasto.
Los genes pueden determinar señales aferentes y
eferentes así como mecanismos centrales implicados
en la regulación del peso corporal. El número de genes
o marcadores relacionados con la obesidad pueden
ser más de 200. Algunos genes están implicados
específicamente en el control de la ingesta (neuropéptido,
leptina, POMC, CCK, MCH, etc.) o la regulación de
la termogénesis (receptores adrenérgicos β2 y β3,
proteínas desacoplantes, leptina, etc.) mientras que la
expresión de algunos otros genes influencían diferentes
vías de señalización como por ejemplo en adipogénesis
que podrían afectar a la ecuación energética. 8
En México, la prevalencia de obesidad en
los adultos se ha incrementado en la última década,
según los resultados de las diferentes encuestas de
salud realizadas: Encuesta Nacional de Enfermedades
Crónicas 1993 (ENEC) la cual mostró que la prevalencia
de obesidad en adultos fue de 21.5%; Encuesta de Salud
2000 (ENSA) reveló que el 24% de los adultos padecía
obesidad y para el 2006 la Encuesta Nacional de Salud
y Nutrición (ENSANUT)
registró obesidad cerca de
30% de la población mayor de 20 años (mujeres 34.5 %,
hombres, 24.2%). 4
El sobrepeso y la obesidad son problemas que
afectan aproximadamente a 70% de la población
(mujeres, 71.9 %, hombres, 66.7%) entre los 30 y 60
años, en ambos sexos. No obstante, entre las mujeres
existe un mayor porcentaje de obesidad –índice de masa
corporal igual o mayor a 30– que entre los hombres. 8
Existen mediciones antropométricas que estiman de
manera indirecta el contenido de grasa abdominal, tales
como la circunferencia de cintura y la relación cintura –
cadera (ICC). Estudios probados han demostrado una alta
correlación entre estas técnicas, sin embargo, la medición
de circunferencia de cintura es el procedimiento más
recomendado por su fácil aplicación, mayor sensibilidad
y especificidad. De esta manera se han establecido los
puntos de corte para determinar el riesgo a desarrollar
Diabetes Mellitus (DM) e Hipertensión Arterial (HTA). 1
La obesidad centroabdominal se determina
midiendo la circunferencia de la cintura y su diagnóstico
depende del sexo y del grupo étnico a los que pertenece
la persona (no al país de residencia). Los valores de
referencia actualmente aceptados para México, son los
criterios propuestos por la SSA (menor de 80 en mujeres
y menor de 90 en hombres). 9
La ENSANUT 2006 registró la prevalencia de
circunferencia de cintura excesiva según los criterios
propuestos por la SSA del 83.6% en mujeres, representando
riesgo para DM e HTA, mientras que los hombres el
porcentaje con cintura de riesgo fue de 63.8 %. 2
La presencia de obesidad exacerba las
anormalidades metabólicas de la Diabetes Mellitus tipo
2, incluyendo la hiperglicemia, la hiperinsulinemia y la
dislipidemia. Aumenta la resistencia a la insulina y la
intolerancia a la glucosa. La obesidad puede contribuir a una
elevada morbilidad y mortalidad en los diabéticos. 10, 11, 12
La grasa acumulada en la región abdominal es
metabólicamente activa, ya que es la responsable de
la liberación de múltiples hormonas relacionadas con
las complicaciones de la obesidad abdominal, entre
las cuales encontramos: Leptina (encarga de enviar
señales al cerebro respecto a la formación adiposa del
cuerpo, regulación del apetito y la síntesis energética),
TNF Factor de Necrosis Tumoral (Interfiere con las
señales de los receptores de la insulina y es una posible
causa de la resistencia a la insulina en los obesos), IL6 Interleucina – 6 (Implicado en el metabolismo de la
glucosa y los lípidos), Angiotensinógeno (Precursor de la
angiotensina II. Regulador de la presión sanguínea y la
homeostasis electrolítica), AdipoQ/apM1/ Adiponectina/
Acrp (es probable que juegue un papel en la patogénesis
de la familia de las hiperlipidemias combinadas y están
asociadas a la resistencia a la insulina), entre otras; en
este sentido, se considera que la secreción hormonal del
tejido adiposo abdominal es el responsable de la mayoría
de las complicaciones de la obesidad. 13
108
En este contexto epidemiológico nacional, la nutrición
juega un papel fundamental para incidir en las políticas
gubernamentales de prevención y control de la obesidad
y sus factores de riesgo, a través de la participación de
organismos, instituciones y asociaciones enfocadas al
abordaje de este problema de salud pública.
La Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología
Capítulo Veracruz, durante el Congreso Internacional de
Nutrición y Endocrinología realizado en Octubre de 2006,
incluyó en su programa científico-académico el Curso
Escuela Sana con el tema “La Obesidad y la Diabetes
Mellitus” en el que Universidad Veracruzana a través
de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, participó
con el apoyo de docentes y estudiantes en el estudio de
obesidad abdominal para determinar la prevalencia en
maestros de escuelas primarias convocados por el H.
Ayuntamiento de Veracruz.
establecidos en un informe de la OMS (Anexo 1) que
se basan en el riesgo de mortalidad y morbilidad y
estos puntos de corte actualmente se aceptan para
usarse en adultos tanto en el campo clínico como en
el poblacional. Además de la clasificación por IMC se
presenta la información sobre el riesgo que representa
para la población estudiada tener valores de perímetro
de cintura mayores a los actualmente aceptados. 3
Estudio antropométrico
El peso se midió sobre una báscula de campo,
portátil, digital con graduación de 0.1 kg. El peso
se registró a los 100g más cercanos, solicitando al
participante despojarse de prendas innecesarias. La
estatura se evaluó con estadímetros de barra vertical
graduada y una barra horizontal (cabecera), deslizable
en la parte superior, que haría contacto con el máximo
punto superior sobre la cabeza, solicitando al participante
estar descalzo, supervisando la posición correcta en el
plano de Frankfurt. Con ambas medidas se determinó
el Índice de Masa Corporal (IMC) Peso (kg) / Talla (m)2,
(peso entre la talla al cuadrado) y se comparó con el
patrón de referencia recomendado por la OMS. 14
Para determinar la circunferencia de cintura, se
solicitó a los participantes separar la ropa ajustada, de
tal forma que la cinta pudiera colocarse en un nivel y
posición correcta, el sujeto se colocó con los pies juntos
en posición erguida y con el abdomen relajado. Se tomó
la medición con una cinta métrica de fibra de vidrio
flexible colocándola en el punto medio entre la última
costilla y el borde superior de la cresta iliaca. Se utilizó
como referencia los criterios propuestos por la SSA . 1
MATERIAL Y MÉTODOS
Se realizó un estudio descriptivo transversal con un
muestreo de no probabilística a un grupo de 118 adultos
y se utilizó el método de sujetos participantes del curso
“Escuela Sana” que fue el criterio único de inclusión,
realizando un muestreo por conveniencia.
El estudio fue propuesto por la Facultad de Nutrición
y aprobado por La Sociedad Mexicana de Nutrición y
Endocrinología Capítulo Veracruz, durante el Congreso
Internacional de Nutrición y Endocrinología.
Se les informó del carácter voluntario de su
participación y se les explicaron los procedimientos a
realizar. Todas las variables se midieron sólo una vez.
Consistió en la evaluación antropométrica de peso, talla
y circunferencia de cintura.
Para estudios de población, el sobrepeso y
la obesidad son cuantificados mediante el uso de
indicadores antropométricos, basados principalmente
en la combinación del peso, la talla (considerando
edad y género) y la circunferencia de cintura, datos que
fueron utilizados para obtener los índices que aportaron
diagnósticos del estado nutricio del grupo evaluado.
De acuerdo a los lineamientos clínicos para la
identificación, evaluación y tratamiento del sobrepeso y
la obesidad de la Organización Mundial de la Salud el
sobrepeso se define como un IMC de 25.0 a 29.9 kg/m2
y la obesidad como un IMC igual o mayor de 30.0 Kg/m2.
El razonamiento que dio origen a estas cifras se basó en
datos epidemiológicos que muestran un aumento en la
mortalidad de las personas que tienen un IMC por arriba
de 25 kg/m2. 1
Una manera práctica de clasificar el sobrepeso
y la obesidad es utilizar el IMC en los puntos de corte
Procesamiento y análisis de la información
La información obtenida se procesó en el programa
de estadística y epidemiología Epi Info. Se realizó un
análisis univariado a través de medidas de tendencia
central y de dispersión, así como proporciones. 15
RESULTADOS
La población en estudio incluyó 118 personas, de
las cuales el 74.6% mujeres y 25.4% hombres.
Se encontró un 89 % de mujeres con sobrepeso
y obesidad, el 21.6% con sobrepeso, 19.3 obesidad
grado I, destacando el 42% con obesidad grado II y con
obesidad grado III sólo un 5.7%. Tomando en cuenta la
circunferencia de cintura en mujeres encontramos 24.1%
con cintura recomendada y 75.9% con cintura excesiva.
109
A nivel nacional la prevalencia de sobrepeso según
la ENSANUT 2006 fue más alta en hombres (42.5%),
que en mujeres (37.4%, 5pp mayor); en cambio, la
prevalencia de obesidad fue mayor en mujeres (34.5%)
que en hombres (24.2%, 10pp mayor). Al sumar las
prevalencias de sobrepeso y obesidad, 71.9% de
las mujeres mayores de 20 años de edad y 66.7% de
los hombres mantienen diagnósticos combinados de
sobrepeso u obesidad. Estas cifras, especialmente la de
obesidad, tienden a incrementarse con la edad. 4
Los resultados de la evaluación nutricia en los
maestros que asistieron al curso “Escuela Sana”
mostraron diferencias con la situación mundial y nacional,
ya que se encontró mayor prevalencia de obesidad en
hombres y de sobrepeso en mujeres, no obstante, la
prevalencia de obesidad se presentó por arriba de los
registros nacionales en las mujeres 67% (32.5pp mayor)
y en los hombres 76.6%, (52.4pp mayor).
Con respecto a la prevalencia de circunferencia de
cintura de adultos hombres y mujeres a nivel nacional, los
estudios reportan que el 83.6% de las mujeres presentaron
una CC de riesgo (>80), mientras que en los hombres
el porcentaje con cintura de riesgo (>90) fue de 63.8%,
en comparación con los datos obtenidos en el estudio
el 75.9% de las mujeres presentaron circunferencia de
cintura en riesgo, resultado por debajo del promedio
nacional a diferencia de los hombres con el 86.7% con
cintura excesiva, superior al promedio nacional. (1)
De manera concordante los datos obtenidos
mostraron la prevalencia de obesidad grado II en ambos
sexos y se asocian con obesidad abdominal obtenida de
los índices IMC y CC arriba de los parámetros oficiales.
Estos resultados determinan las consecuencias a la
salud que condiciona este estado que es un factor de
riesgo para el desarrollo de enfermedades crónicas no
transmisibles.
Esta intervención académica en el marco de eventos
científicos resultan de gran interés para la comunidad
medica así como para el gremio de la Nutriología ya que
es claro que los problemas de salud pública que se están
viviendo actualmente se han convertido en una epidemia
de trascendencia mundial y nacional y es necesario
abordarlos desde una perspectiva multidisciplinaria y
multisectorial
Los estudios de prevalencia de obesidad abdominal
en población adulta e inclusive joven, son necesarios para
vigilar y valorar la magnitud del problema con el propósito
de intervenir en acciones de prevención, detección
temprana y tratamiento oportuno de las alteraciones
metabólicas para reducir el riesgo de complicaciones y
disminuir el gasto en atención médica que generan estos
padecimientos.
Tabla 1. Prevalencia de obesidad abdominal en
mujeres
En el caso de los hombres se encontró el 90%
con sobrepeso y obesidad, 13.3 % sobrepeso, 23.3%
obesidad grado I, 53.3% obesidad grado II. Tomando
en cuenta la circunferencia de cintura los resultados
muestran el 86.7% con cintura excesiva a diferencia del
13.3% de los parámetros recomendados.
Tabla 2. Prevalencia de obesidad abdominal en
hombres
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La obesidad abdominal, diagnosticada por medio de
IMC y circunferencia de cintura, condiciona un aumento
en la probabilidad de desarrollar DM tipo 2 e HTA.7
A la vez que el tejido adiposo es útil para el
almacenamiento y liberación de energía, produce
sustancias activas conocidas como hormonas. Una
gran cantidad de la grasa abdominal de “alto riesgo”, es
responsable de niveles anormales de estas sustancias,
que interfieren con la función metabólica normal y
conducen a un incremento de la glucosa sanguínea y
a niveles de colesterol perjudiciales, los cuales pueden
aumentar el riesgo de enfermedad cardiaca y diabetes. 16
En el ámbito mundial las mujeres presentan
mayores tasas de obesidad (IMC>30) que los hombres,
aunque estos últimos tienen mayores tasas de sobrepeso
(IMC>25 y <30). 1
110
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ANEXOS
ANEXO 1: CLASIFICACIÒN DE LA OBESIDAD
Y SOBREPESO MEDIANTE EL ÌNDICE DE MASA
CORPORAL
Preventing and managing the global epidemia
of obesity. Report of the World Health Organization
Consultation of Obesity. Ginebra: WHO; 1997. En:
National Institute of Health
111
“Incidencias de Hiperlipidemia y/o Hipertensión
y su probable correlación con el IMC y Diabetes
Mellitus 2 en personas que acuden al puesto de
sangrado del hospital general Córdoba, Veracruz”
José A. González-Garrido1, Mario R. Guapillo-Vargas2, Emma V. Herrera-Huerta3,
Ángel Ramos-Ligonio4, Aracely López-Monteon5, Guillermo M. Ceballos-Reyes6 y Enrique Méndez-Bolaina7
1
Estudiante DCB-UV. Instituto de Ciencias de la Salud, Doctorado en Ciencias Biomédicas-UV (DCB-UV). Avenida Dr. Luis Castelazo Ayala s/n,
Colonia Industrial Ánimas, Xalapa, Ver., CP. 91000.
2
Profesor Titular “C”;
3
Profesor Titular “C”;
4
Profesor Titular “C”; Dra.
5
Profesor Titular “C”; **Dr.
6
Profesor-Investigador .Sección de Posgrado e Investigación-Escuela Superior de Medicina-Instituto Politécnico Nacional. Prolongación de Díaz
Mirón y Plan de San Luis s/n, Colonia Casco de Santo Tomás, México, D. F., CP. 11340.
7
Profesor Titular “C” ([email protected]). Facultad De Ciencias Químicas-UV. Prolongación de Ote. 6 # 1009, Colonia Rafael Alvarado, Orizaba, Ver.,
CP. 94340, ZP. 215.
ANTECEDENTES
Dislipidemias. Se entiende por Diabetes Mellitus tipo 2
(DM2), al tipo de Diabetes en la que hay capacidad residual
de secreción de insulina, pero sus niveles no superan
la resistencia a la insulina concomitante, insuficiencia
relativa de secreción de insulina o cuando coexisten
ambas posibilidades y aparece la hiperglucemia.5
La hiperglucemia o Diabetes es la causa más
importante de amputación de miembros inferiores, de
origen no traumático, retinopatía e insuficiencia renal,
además, es uno de los factores de riesgo más importantes
para desarrollar enfermedades cardiovasculares. Los
costos económicos asociados al tratamiento y sus
complicaciones representan una grave carga para los
servicios de salud y para los pacientes.3
La Obesidad es un problema de salud nacional, que
ha incrementado su prevalencia alrededor de 167% en los
últimos 11 años, siendo el principal factor de riesgo para
el desarrollo de Enfermedades Crónico-Degenerativas,
ciertos tipos de Cáncer y otros padecimientos.4
Además, alrededor del 8.2% de la población entre
20 y 69 años padece Diabetes y, cerca del 30% de los
individuos afectados, desconoce que la tiene.
Esto significa que en nuestro país existen más de
cuatro millones de personas enfermas, de las cuales
poco más de un millón no han sido diagnosticadas.
Por otra parte, la mortalidad por esta causa muestra un
incremento sostenido durante las últimas décadas, hasta
llegar a ocupar el tercer lugar dentro de la mortalidad
nacional general.5,6
Por otra parte, durante las últimas décadas, la
mortalidad por enfermedades del corazón ha mostrado
La Obesidad es uno de los principales determinantes
de la salud en los adultos y un fenómeno mundial que
incluye tanto a los países industrializados como a los
países en desarrollo.
La prevalencia de Sobrepeso y Obesidad en
población pediátrica ha aumentado en años recientes
hasta alcanzar proporciones epidémicas alrededor del
mundo. Según la Encuesta Nacional de Nutrición de
1999 (ENN 99), uno de cada cinco niños mexicanos en
edad escolar padece Sobrepeso u Obesidad prediciendo
los riesgos futuros en nuestra población adulta.
Como es bien sabido la Obesidad es una
enfermedad que incluye al Sobrepeso como un estado
premórbido, es una enfermedad crónica caracterizada
por el almacenamiento en exceso de tejido adiposo en el
organismo,1 de etiología multifactorial de curso crónico en
la cual se involucran aspectos genéticos, ambientales y
de estilo de vida que conduce a un trastorno metabólico.
Se determina la existencia de Obesidad en adultos
cuando existe un Índice de Masa Corporal (IMC) elevado
(≥27 Kg/m2).7
Es por ello que la identificación de factores
y poblaciones de riesgo debe iniciar en edades
tempranas, con el fin de facilitar el diseño y focalización
de intervenciones destinadas a la prevención de este
problema de salud.17
La Obesidad en sí misma es un factor de riesgo
para desarrollar enfermedades crónicas, principalmente,
Diabetes,
Enfermedades
Cardiovasculares
y
113
un incremento constante, hasta llegar a constituirse en la
primera causa de muerte en México. Entre las principales
causas para el desarrollo de estas enfermedades se
encuentra la aterosclerosis. Esta última es una alteración
estrechamente asociada a las Dislipidemias, cuyas
presentaciones clínicas pueden ser: hipercolesterolemia,
hipertrigliceridemia,
hipoalfalipoproteinemia
e
hiperlipidemia mixta.
Las Dislipidemias pueden obedecer a causas genéticas
o primarias, o a causas secundarias. En el caso particular
de la hipercolesterolemia secundaria, se consideran como
causas: la Diabetes, la Obesidad, el Hipotiroidismo y el
Síndrome Nefrótico. La hipertrigliceridemia secundaria,
puede tener como causa a: la Diabetes, el Alcoholismo,
la Obesidad, el Síndrome de Resistencia a la Insulina,
la Insuficiencia Renal, la ingesta elevada de azúcares
refinadas, así como al uso de β-bloqueadores, diuréticos
y corticosteroides anabólicos. También los procedimientos
de diálisis y hemodiálisis, pueden actuar como causa
desencadenante de esta Dislipidemia.7
En los Hospitales de nuestro país uno de los
principales problemas es la donación de sangre por la
falta de personas donadoras, así como la educación para
la donación altruista, aunado a esto, de las personas
que acuden a donar, muchas veces no cuentan con las
condiciones de salud para efectuar la donación, entre
otras situaciones por detectárseles alguna Enfermedad
Crónico-Degenerativa o No Transmisible.
Siendo el propósito de este estudio el conocer el
impacto de estas enfermedades, prevalencia y probable
correlación en personas que acuden a donar sangre,
conociendo que las enfermedades transmisibles han
disminuido debido a los nuevos procesos de obtención de
la sangre observando nuevos padecimientos en nuestros
donadores,8 siendo de gran utilidad la recolección de
sangre para brindar atención oportuna a las urgencias
médicas e intervenciones quirúrgicas que se presentan
día con día.
trabajaron normalmente, tal y como se hace en la
donación, separándolos en donadores a las personas
que efectuaron el proceso y no aptos aquellas que no
realizaron el proceso de donación. Los sueros fueron
separados por centrifugación a 1 200 x g por 10 minutos
y conservados de 2 a 8º C hasta su uso.
Determinación de DM tipo 2
La determinación de la glicemia se realizó en el
Laboratorio de Farmacología Cardiovascular en la
Universidad Veracruzana en muestras de predonadores
con un ayuno de 12 horas en suero por método
colorimétrico (glucosa oxidasa) y fueron leídos en un
espectrofotómetro de la marca Jenway a una longitud
de onda de 520 nm, el cual previamente fue calibrado
y comprobado con tres niveles comerciales alto, bajo y
normal, posteriormente fueron procesadas las muestras
considerando como personas diabéticas aquellas que
presentaron mediciones de glucosa ≥126 mg/dL.5
Determinación de Hiperlipidemia
La determinación de la Hiperlipidemia se realizó a
través de la observación macroscópica de los sueros
determinado la presencia o ausencia y descartando
los sueros con Hiperlipidemia automáticamente por
interferir con las pruebas serológicas que garanticen la
recolección de sangre segura de acuerdo al Manual de
Toma de Muestra y Flebotomía.
Determinación del IMC
La medición del Índice de Masa Corporal (IMC) se
realizó pesando, midiendo a la persona y correlacionándolo
con la medición de la Circunferencia de la Cintura (CC),
de acuerdo con los siguientes criterios: IMC elevado ≥27
Kg/m2, y el valor de la CC de los participantes, la cual no
debe ser mayor a 80 cm en mujeres y en hombres no
mayor a 94 cm, denotando así la presencia de Sobrepeso
y Obesidad a través de estos indicadores.7
MATERIALES Y MÉTODOS
Población de estudio
Determinación de la Presión Arterial
Se realizó un estudio experimental descriptivo a 300
predonadores de sangre del Puesto de Sangrado del
Hospital General Córdoba, los cuales fueron invitados
a participar por medio de un consentimiento informado.
Dentro de los criterios de selección se incluyeron
personas entre 18 y 65 años de edad, las cuales eran
asintomáticas y con evolución clínica normal.9
Los predonadores que aceptaron participar
mediante la firma del consentimiento informado se
La medición de la Presión Arterial (PA) se realizó
por medio de un baumanómetro tomando en cuenta
los valores de referencia clasificando presión alta
como PA >140 mm de Hg (sistólica), y/o >90 mm de Hg
(diastólica).10
114
RESULTADOS
Cuadro II. Principales incidencias de enfermedades
en pacientes donadores
De 300 personas que aceptaron participar en este
estudio, 25 (8.3%) eran mujeres y 275 (91.7%) hombres,
con una edad promedio de 35.5 años, de los cuales,
donadores aptos fueron 89 (29.7%) y no aptos 211
(70.3%). (Figura 1)
Figura 1. Relación de donadores y predonadores no
aptos
En los 211 (70.3%) predonadores no aptos se
presentaron las siguientes incidencias:
Hiperlipidemia en 92 de ellos (30.7%), 19 (9%) con
DM2.
IMC elevado en 109 de ellos (51.6%) y HTA 7 (3.3%).
(Cuadro III)
Cuadro III. Principales incidencias de enfermedades
en pacientes predonadores no aptos
Las incidencias presentadas en los 300 participantes
fueron: Hiperlipidemia en 110 (36.6%), HTA en 7 (2.3%),
IMC elevado en 167 (55.6%) y DM2 en 41 (13.7%).
(Cuadro I)
Cuadro I. Incidencias de enfermedades presentadas
en los 300 participantes
Dentro de las correlaciones analizadas se
encontró:
De los predonadores que presentaron Hiperlipidemia
se correlacionaron con:
IMC elevado 167 personas (55.6%) y 31 personas
(10.3%) DM2. (Figura 2)
Dentro de los 89 donadores destacaron las
siguientes incidencias: IMC elevado en 58 donadores
(65%), 22 (24.7%) con DM2 y solo 9 (10.3%) sin ninguna
incidencia. (Cuadro II)
115
Figura 2. Porcentaje de predonadores con
Hiperlipidemia y su correlación con un IMC elevado y la
DM2
Figura 4. Porcentaje de predonadores no aptos que
presentaron Síndrome Metabólico
De los predonadores que presentaron HTA se
correlacionaron con:
IMC elevado 3 personas (42.8%) y 4 personas (57%)
con DM2. (Figura 3)
DISCUSIÓN
Los cambios sociales y en el estilo de vida
han favorecido el aumento de la Obesidad y de las
enfermedades crónicas relacionadas. En el mundo, se
estiman al menos 300 millones de adultos con Obesidad.
En México, 24% de los adultos a partir de los 20 años de
edad tienen Obesidad.20,21,22
La Obesidad es una de las epidemias de mayor
aumento en nuestro país aumentado su prevalencia en
167% en los últimos 11 años, la cual afecta a la mayoría
de los mexicanos.
Se ha reportado una asociación directa entre la
Obesidad y varias enfermedades, incluyendo Diabetes
Mellitus, HTA, Dislipidemia, Enfermedad Cardiaca
Isquémica, entre otras.18,19
Es considerada un problema de Salud Pública, que
conlleva a un estado mórbido que se correlaciona con
una mala alimentación conduciendo a problemas de
salud, tales como HTA y DM2, las cuales continúan en
aumento. Se han descrito los riesgos cardiovasculares
que presentan las personas que padecen Resistencia a la
Insulina, produciendo DM2, desarrollando el incremento
de enfermedades cardiovasculares, además se ha
observado la relación de la Obesidad interaccionando
con la DM2 y procesos inflamatorios.11-12
En la donación de sangre existen campañas para
la captación de donadores voluntarios, debido a la alta
demanda de los componentes sanguíneos,13 dado que
Córdoba, Veracruz no es un punto crítico de interés
económico del país, resalta el avance de Enfermedades
Cardiovasculares en forma silenciosa al observar el
Figura 3. Porcentaje de predonadores con HTA y su
correlación con un IMC elevado y la DM2
Dentro de los predonadores no aptos para la donación
se encontró la combinación de tres padecimientos,
denotando la presencia del Síndrome Metabólico (SM)
en 21 personas (9.9%). (Figura 4)
116
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
desconocimiento por parte de los participantes en este
estudio de padecerlas.
Los resultados obtenidos en este trabajo indican que
la Obesidad está presente y sugiere riegos de padecer
enfermedades tales como, Hiperlipidemia, HTA y DM2,
además de considerar la presencia del SM por la presencia
de tres de estos padecimiento, aumentando al doble la
probabilidad de presentar un infarto agudo de miocardio
por la presencia de este último,14,15 evitándonos así el
llevar a cabo la donación de sangre y observando los
riesgos que presentan las donaciones actuales por parte
de donadores diabéticos asintomáticos, aumentando
con esto el riesgo de presentar una descompensación
por la realización del proceso de donación aunado al
desconocimiento de la enfermedad al llevar a cabo la
donación, además de las complicaciones conocidas por
padecer esta enfermedad, siendo primordial redoblar
esfuerzos para que más donadores voluntarios acudan
a los puestos de donación cerciorándose del estado
de su salud y ayudando a personas que requieran sus
componentes sanguíneos, siendo importante que la
determinación de glucosa se realicé de rutina a todos
los predonadores, aunado a esto, falta más énfasis
en el diagnóstico temprano de la Diabetes pues en
este trabajo fue evidente que el total de personas
predonadoras y donadoras voluntarias ignoraban que
la padecían, lo cual podría beneficiar la salud de los
predonadores, conociendo su situación con respecto
a padecer Diabetes y tomando según corresponda el
caso medidas preventivas para evitar el deterioro de su
salud, más allá del poder o no donar, es necesaria dicha
detección para un mejor control, tratamiento y una mejor
calidad de vida.
Investigaciones recientes predisponen a la DM2
como el principal factor de riesgo para desarrollar SM,
aunque, dos de los factores fuertemente ligados a este
síndrome son la Obesidad Abdominal y la mencionada
Resistencia a la Insulina,16 siendo significativo el resultado
de este trabajo, por la presencia de los padecimientos
y factores de riesgo evaluados, agregando que en este
trabajo no se aplicó una encuesta que hiciera evidente la
presencia de sedentarismo en las personas participantes
en este estudio, sin embargo, la presencia de donadores
diabéticos, permite calificar que una parte de la donación
se hace de un enfermo a otro enfermo y otra parte de
donadores sanos que no presentan ningún factor de
riesgo al momento de la donación, pero que conllevan
riesgos que les impedirán realizar la donación en un
futuro, además de los problemas de salud que conllevan
este tipo de padecimientos y factores de riesgo.
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118
“Determinación de un patrón somatométrico
propio de los recién nacidos sanos
de término del Hospital Regional
de Poza Rica SES VER en el periodo 2004 - 2006”
Arlen Abril Parrales Rios1, Dra. Esperanza Hernández Cuellar 2
1
M.P.S.S. Facultad de medicina. Universidad Veracruzana. [email protected]
2
Jefe del servicio de pediatria HRPR [email protected]
“Un Recién Nacido es una promesa, un devenir,
Un ser en construcción hacia el porvenir”
tablas somatométricas elaboradas bajo las mismas
características: geográficas (Espin Mayorga,2000(2), y
Jiménez Balderas,1991(6)), socioeconómicas (Ramos
Galván,1977(8)) y socioculturales (Dueñas,1992(1)) a las
que pertenece el individuo en estudio.
A.A.P.R.
MARCO TEORICO
Justificación:
Antecedentes:
A pesar de que se han realizado múltiples estudios
acerca de la Somatometría en recién nacidos, tenemos
conocimiento, de que se han realizado en poblaciones
diferentes a la de nuestro universo en estudio (región
norte de Estado de Veracruz). Dichos estudios, no
comparten las mismas condiciones socioeconómicas,
culturales, dietéticas, geográficas y genéticas. Por lo
tanto al aplicarlas a poblaciones que no corresponden al
grupo de estudio, marcan diferencias significativas
En nuestro medio la población que se encuentra
bajo el régimen del Hospital Regional de Poza Rica de
los Servicios de Salud de Veracruz (HRPR SES VER),
es una población que cuenta con una gran diversidad
socioeconómica y cultural. Además de ser un sector con
una estructura demográfica significativa y un abordaje
geográfico amplio de la región norte de Estado de
Veracruz.
Sin embargo, en la actualidad, no contamos con
tablas somatométricas propias para los recién nacidos de
término sanos de nuestra población. Es por ello que surge
el interés de plantear esta investigación bajo el escenario
retador de establecer un patrón somatométrico propio de
la población abierta que atiende el Hospital Regional de
Poza Rica Ver de los Servicios de Salud de Veracruz
HRPR SES VER., obteniendo Tablas Somatométricas
Regionales de una población representativa de la
zona norte del estado de Veracruz, que nos permitan
implementar:
1.Un recurso diagnostico no invasivo, con características
regionalizadas, para la clasificación del crecimiento
de nuestros recién nacidos veracruzanos.
2.Un sistema evaluador mas fidedigno del estado
La Somatometría o antropometría neonatal, es el
estudio y técnica de medidas del cuerpo humano, con la
finalidad de clasificación y comparación (12). Las medidas
corporales más utilizadas para este fin son: peso, talla
y circunferencias. La precisión es muy importante por
lo que se debe contar con instrumentos adecuados y
examinadores capacitados. (3,13)
Es un procedimiento rutinario en las unidades
de cuidados neonatales que constituye una parte
importante de la evaluación clínica no invasiva del
crecimiento corporal y del estado de salud, permitiendo
la identificación de neonatos con: afección nutricia,
riesgo de complicaciones metabólicas en el periodo
neonatal y las posibilidades de supervivencia. Por lo
tanto la Somatometría, es considerada como uno de los
factores de riesgo perinatal más importante, que debe
tomarse en cuenta en la valoración integral de los recién
nacidos.
En el ámbito poblacional, constituye un elemento
valioso para la toma de decisiones en cuestiones de salud
pública, a pesar de lo cual es aún poco apreciada. (13)
Actualmente las tablas somatométricas oficiales
para recién nacidos que rigen a cualquier institución
de salud en México, son las marcadas por la Norma
Oficial Mexicana NOM-007–SSA2-1993 Para la atención
de la mujer durante el embarazo, parto y puerperio, y
del recién nacido. Dichas tablas fueron obtenidas del
estudio mexicano realizado por Jurado García 1970.(12,14)
,quien tuvo como antecedente las graficas de Battaglia/
Lubchenco; sin embargo en estudios posteriores se
ha establecido, que son de mayor utilidad aquellas
119
de salud de los recién nacidos, que arroje datos de
afección nutricia y posibilidades de supervivencia de
cada recién nacido veracruzano. Este será un elemento
valioso para la toma de decisiones en cuestiones de
salud pública regional y estatal.
3.Una mejora de calidad en los servicios de salud que
se le brinde a cada recién nacido veracruzano.
y Jornada Acumulada, obtenidos por parto o cesárea en
el del HRPR SES VER, durante el periodo 2004 – 2006,
de ambos sexos y de estado socioeconómico indistinto.
3. Tamaño de la Muestra:
Por censo se incluyeron el 100% de los recién
nacidos sanos de término.
Pregunta de Investigación:
¿Cuál es el patrón somatométrico promedio, de los
recién nacidos sanos de término 38 – 42 semanas de
gestación del HRPR SES VER, en el periodo 2004 2006?
Tabla 1: Caracteristicas del universo que censa el
hrpr sesver
Estructura Geografica
(Zona Norte Veracruz)
Objetivo General:
Determinar un patrón somatométrico regionalizado,
basado en peso, talla y perímetro cefálico en los recién
nacidos sanos de término 38 – 42 semanas de gestación
de la población abierta que atiende el HRPR SES VER,
en el periodo 2004 - 2006.
METODOLOGIA
Tipo de Estudio:
Observacional,
Transversal
Descriptivo,
Retrospectivo,
Extension Territorial
6631.89 Km2
Densidad De Poblacion
118 Habitantes / Km2
Altitud
44 -54 Mts
Sobre Nivel Del Mar
Latitud
20° 29’55’’
Del Meridiano Greenwich
Numero De Municipios
48
Total De Localidades Que Censa El Hrpr
Sesver *
86 1ernivel-4 Hosp. Subzona
Localidades De Mas De 100 Habitantes
78
Localidades De Menos De 100 Habitantes
12
Estructura Demografica
Universo de Estudio:
1. Institución Participante:
Hospital Regional de Poza Rica de los Servicios de
Salud de Veracruz
HRPR SES VER .Servicio de
salud público. Características especificadas en la Tabla 1.
Poblacion Total
746,037
Población Asegurada
175, 990
Población No Asegurada
570,047
Población Ses Ver
341,163
Poblacion Imss Oportunidades
228,884
Estructura Socioeconomica
Poblacion Con Ingreso Inferior Al Salario
Minimo
65%
Poblacion Con Ingreso Superior Al Salario
Minimo
35%
Nivel De Marginacion (Conapo 2000)
4to. Lugar Nacional
Estructura Sociocultural
Dirección: calle de las Flores sin número Colonia Las vegas Poza Rica
Regiones
La Huasteca Veracruzana
La Región Del Totonacapan
Etnias/razas Establecidas
Totonacas,
Nahuas,tepehuas,otomies
Veracruz
2. Universo Poblacional:
Fuente: Departamento de Archivo y Estadística del HRPR SES VER
Todos los recién nacidos sanos de término (38 – 42
semanas de gestación), atendidos durante las 4 jornadas
hospitalarias establecidas: Matutino, Vespertino, Nocturno
–2006.
120
Variables:
parte distal de la planta del pie.
Unidades: Centímetros (cm.)
VARIABLE
CONCEPTO
INDICADORES
ESCALA DE
MEDICION
Edad
Gestacional
Tiempo
transcurrido
desde la
concepción
hasta el
nacimiento
Semanas de
gestación
(SDG)
Independiente
Numérica
Sexo
Diferencia
constitutiva y
física entre el
hombre y la
mujer
Femenino
Masculino
Independiente
Nominal
Peso
Masa
corporal de
un cuerpo
Gramos (Gr.)
Dependiente
Numérica
Talla
Longitud total
de un cuerpo
Centímetros
(cm.)
Dependiente
Numérica
Perímetro
cefálico
Medida de la
circunferencia
craneana
Centímetros
(cm.)
Dependiente
Numérica
Perímetro cefálico:
Concepto: Medida de la circunferencia craneana.
Obtención: Utilizando una cinta métrica, se mide
la circunferencia cefálica, tomando como referencia la
protuberancia frontal y la protuberancia occipital.
Unidades: Centímetros (cm.)
Operacionalizacion:
Se realizó una base de datos obtenida de los archivos
clínicos de registros somatométricos de recién nacidos
de las salas de Recuperación Posparto y Alojamiento
conjunto del HRPR SES VER, periodo 2004 - 2006.
Se determinaron Medidas de tendencia central
(media X) y Medidas de dispersión (desviación estándar
SD) para determinar el patrón somatométrico propio del
universo sometido al estudio.
Los resultados se sometieron a un análisis estadístico
a través del software STATISTICA 7.0, y se presentaron
de manera gráfica.
RESULTADOS
Edad Gestacional
Concepto: Tiempo transcurrido desde la concepción
hasta el nacimiento.
Obtención: Será calculada por la fecha de última de
menstruación hasta el nacimiento del recién nacido. En
casos de fechas de última menstruación no confiables se
obtendrán por USG.
Unidades: Semanas de gestación (SDG).
En el periodo 2004 – 2006 en el cual se realizo el
estudio, se obtuvo un total de Universo de 3560 recién
nacidos sanos, de los cuales 1730 (48.6%) fueron
femeninos y 1830 (51.4%) fueron masculinos.
Los recién nacidos de término (RNT) sanos del
sexo femenino se distribuyeron de la siguiente manera:
301 RNT fueron de 38 SDG, 609 RNT de 39 SDG, 562
RNT de 40 SDG, 217 RNT de 41 SDG y 41 RNT de 42
SDG. En el sexo masculino: 237 RNT fueron de 38 SDG,
616 RNT de 39 SDG, 602 RNT de 40 SDG, 289 RNT de
41 SDG y 86 RNT de 42 SDG (Gráfica 1).
Obtuvimos una población de recién nacidos
mayoritariamente masculinos. Y con una frecuencia
mayor de nacimientos en la 39 y 40 semanas de
gestación.
Sexo:
Concepto: Diferencia constitutiva y física entre el
hombre y la mujer.
Obtención: Por inspección directa.
Unidades: Femenino y masculino.
Peso:
Concepto: Masa corporal de un cuerpo.
Obtención: A través de una báscula mecánica
Pesabebés (BAME 440 ®) previamente calibrada, se
coloca el recién nacido desnudo en decúbito dorsal.
Unidades: Gramos (Gr.)
Talla:
Concepto: Longitud total de un cuerpo.
Obtención: Utilizando una cinta métrica, se mide
desde la parte más prominente del polo cefálico hasta la
121
Gráfica 1: Distribución de los Recién Nacidos Sanos
de Término De acuerdo al Sexo y Edad Gestación del
HRPR SES VER Periodo 2004 – 2006
Gráfica 2: Peso / Edad Gestacional Femenino
En el sexo masculino la media en relación al peso
para los recién nacidos de:
38 SDG fue de 2709.3 gr. +- 476.4 SD
39 SDG fue de 3229.9 gr. +- 234.2 SD
40 SDG fue de 3421.0 gr. +- 307.8 SD
41 SDG fue de 3906.5 gr. +- 156.6 SD
42 SDG fue de 4366.6 gr. +- 518.6 SD
Tomando en consideración todas las variables
expuestas previamente, se presenta en la Tabla 2 : La
media Global que se logro obtener en nuestro estudio,
exponiendo los valores de referencia obtenidos como
patrón Somatométrico Regionalizado..
Gráfica 3: Peso / Edad Gestacional Masculino
Tabla 2: Patrón Somatométrico Regionalizado
En el sexo femenino la media en relación a la talla
para los recién nacidos de:
38 SDG fue de 46.5 cm. +- 1.6 SD
39 SDG fue de 48.5 cm. +- 1.5 SD
40 SDG fue de 50.0 cm. +- 1.8 SD
41 SDG fue de 51.8 cm. +- 2.0 SD
42 SDG fue de 53.4 cm. +- 2.7 SD
Gráfica 4: Talla / Edad Gestacional Femenino
A continuación se muestra de manera grafica,
los resultados obtenidos, y analizados por el software
STATISTICA 7.0.
En el sexo femenino la media en relación al peso
para los recién nacidos de:
38 SDG fue de 2783.5 gr. +-424.6 SD (Desviación
Estándar)
39 SDG fue de 2993.0 gr. +-233.2 SD
40 SDG fue de 3352.5 gr. +- 322.9 SD
41 SDG fue de 3885.5 gr. +- 186.9 SD
42 SDG fue de 4209.0 gr. +- 619.7 SD
122
En el sexo masculino la media en relación a la talla
para los recién nacidos de:
38 SDG fue de 45.9 cm. +- 1.3 SD
39 SDG fue de 48.2 cm. +- 1.8 SD
40 SDG fue de 50.0 cm. +- 2.0 SD
41 SDG fue de 52.1 cm. +- 2.0 SD
42 SDG fue de 53.9 cm. +- 2.1 SD
Gráfica 7: Perímetro Cefálico / Edad Gestacional
Masculino
Gráfica 5: Talla / Edad Gestacional Masculino
DISCUSION
Tres razones fundamentales son las que dieron
origen a la presente investigación: en primer lugar, la
necesidad de establecer una identidad somotométrica en
la zona norte de estado de Veracruz. En segundo lugar
los beneficios para salud pública que trae consigo y por
último dejar claro que este trabajo tiene una perspectiva
amplia a futuro.
Se estableció un Patrón Somatométrico propio de
los recién nacidos de término sanos del HRPR SES VER.
Obteniendo de esta manera una entidad somatometrica
de los recién nacidos de término veracruzanos
pertenecientes a las 2 regiones del Norte de Veracruz
(Huasteca y Totonaca), los cuales comparten y se
identifican por sus características Genética, Geográficas,
Demográficas y Socioculturales.
El presente trabajo representa el análisis estadístico
de 3560 nacimientos del trienio 2004 – 2006, por lo cual,
los resultados aquí planteados se consideran como una
muestra representativa y significativa del universo en
estudio, ya que se aproxima con la tasa de nacimiento
anual. Para la variable de edad gestacional encontramos
que de acuerdo a lo reportado por nuestro estudio, la
ponderación mas significativa de nacimientos fue para
las semanas 39 y 40 de gestación, que nos indica que
el 67.7% de los RNT sanos femeninos y el 66.5% de
los RNT sanos masculinos analizados, están naciendo
en las semanas idóneas de gestación, según lo refieren
tratados bibliográficos referidos. 9, 11,12
La comparación con los rangos mediales que se
encuentran en el órgano oficial que rige a los servicios
de salud mexicanos (NOM -007-SSA2-1993,) 14 nos
permite obtener un confiabilidad del 95% para cada una
de las variables con respecto a nuestros resultados
Ante la circunstancia de no contar con un parámetro
de referencia como antecedente, no es posible definir si
En el sexo femenino la media en relación al perímetro
cefálico para los recién nacidos de:
38 SDG fue de 35.0 cm. +- 1.9 SD
39 SDG fue de 36.0 cm. +- 1.4 SD
40 SDG fue de 37.0 cm. +- 1.8 SD
41 SDG fue de 38.0 cm. +- 2.5 SD
42 SDG fue de 39.3 cm. +- 2.8 SD
Gráfica 6: Perímetro Cefálico / Edad Gestacional
Femenino
En el sexo masculino la media en relación al
perímetro cefálico para los recién nacidos de:
38 SDG fue de 36.0 cm. +- 1.5 SD
39 SDG fue de 36.7 cm. +- 2.0 SD
40 SDG fue de 37.7 cm. +- 2.3 SD
41 SDG fue de 38.8 cm. +- 2.2 SD
42 SDG fue de 39.8 cm. +- 2.3 SD
123
el patrón somatométrico establecido en nuestro estudio
pudo haber sido modificado de forma evolutiva a través
del tiempo, pero a partir de las bases aquí establecidas,
aplicaran como un antecedente de referencia para
valoraciones y comparaciones posteriores.
11. Palacios Treviño J.L., Games Eternord J. Introducción
a la Pediatría. Sexta Edición. México: Editorial Méndez
Editores 2004;1-8,49-53
12. Martínez y Martínez R. Pediatría La salud del niño
y del adolescente. Cuarta Edición. México: Editorial
Manual moderno 2001;65-75
13. Scheaffer R, Mendenhall W, Ott L. Elementos de en
muestreo México. Cuarta Edición. México: Editorial
Iberoamericana 1986;20-25
BIBLIOGRAFIA
FUENTES PRIMARIAS:
A. Revistas
A. Manuales
1. Dueñas Toledo, et Al. Determinación de Somatometría
en recién nacidos vivos en Mexicali B.C. Rev. Médica
IMSS 1992; 31: 3751- 78.
2. Espin Mayorga V. H., El recién nacido en la altura. Bol
Med Hosp Infant Mex 2000; 57(11): 663-67.
3. Fajardo Gutiérrez A, Yamoto-Kimura L, Garduño
Espinosa J, Hernández-Hernández DM. Consistencia
y validez de una medición en la investigación clínica
pediátrica. Bol Med Hosp Infant Mex 1991; 48: 36781.
4. González Richmond A. Estudio comparativo de
diferentes índices antropométricos del estado
nutricional. Bol Med Hosp Infant Mex 1994; 41: 594604.
5. Gutiérrez Sandoval et al, Caracterización del peso
normal del recién nacido de termino en baja California
Sur México. Bol Med Hosp Infant Mex 1991; 48:36781.
6. Jiménez Balderas et Al. Somatometría del recién
nacido de termino en Villahermosa Tabasco, estudio
de una población de clase media. Bol Med Hosp
Infant Mex 1985; 48:3 189-92
7. Kleffer Escobar L.F. Uso de las curvas de crecimiento
de los centros para el control y la prevención de
enfermedades en niños mexicanos, Anales médicos
2002; 47, (4) 189-200
8. Ramos GR; Somatometría Pediátrica. Estudio
semilongitudinal en niños de la ciudad de México.
Artículos de investigación médica IMSS 1999;6
(suplemento1):83-396A.
14. Norma Oficial Mexicana-007-SSA2-1993 Para La
Atención de la mujer durante el embarazo, parto y
puerperio, y del recién nacido.
FUENTES SECUNDARIAS:
Índices Médicos:
1. Excerpta Médica
Sitios de Internet relacionados con el tema:
1. www.ssa.gob.mx
2. www.imss.gob.mx
3. www.himfg.gob.mx
B. Libros y Tratados
9. Gordon, B. Avery et al. Neonatología fisiopatología del
recién nacido. Quinta Edición: Editorial Panamericana
2001; 411-45
10. Levin J. Fundamentos de estadística en la
investigación social. Segunda Edición. México:
Editorial Harla 1979;211-20
124
Colposcopía asistida por computadora:
un enfoque temporal
Acosta Mesa Héctor Gabriel1, Llaguno Roque José Luis2, Cruz Ramírez
Nicandro3, Hernández Jiménez Rodolfo4, Cocotle Ronzón Bertha5
1Coordinador de la Maestría en Inteligencia Artificial, Departmento de Inteligencia Artificial, Universidad Veracruzana, Sebastián Camacho # 5, C.P.
91000, Xalapa, Ver. México. Tel. (228) 8-17-29-57, Fax (228) 8-17-28-55 http://www.uv.mx/dia, [email protected] {http://www.uv.mx/heacosta}
2 Departmento de Inteligencia Artificial, Universidad Veracruzana, Sebastián Camacho # 5, C.P. 91000, Xalapa, Ver. México, [email protected]
3 Investigador, Departmento de Inteligencia Artificial, Universidad Veracruzana, Sebastián Camacho # 5, C.P. 91000, Xalapa, Ver, [email protected]
{http://www.uv.mx/ncruz}
4 Gineco-Obstetra, Diego Leño # 22, C.P. 91000, Xalapa, Ver. México
5 Unidad de Patología Anatómica, Betancourt # 62 Bis, C.P. 91000, Xalapa, Ver. México. [email protected]
1 MARCO TEÓRICO
absolutos para correlacionar las características observadas
en las imágenes con el grado de lesión. La posibilidad
de aportar métodos objetivos para el diagnóstico del
cáncer cérvico uterino ha motivado a diversos grupos a
la investigación para tratar de automatizar la identificación
de lesiones cérvico uterinas a partir del procesamiento de
imágenes colposcópicas digitales (6-8).
En México, el cáncer cérvico uterino representa la
segunda causa de muerte en mujeres. En México, se
estima que cada dos horas una mujer fallece por este
padecimiento (1). Si es detectado a tiempo, el cáncer
cérvico uterino tiene una alta probabilidad de cura (2).
La detección temprana de las lesiones precursoras
del cáncer cérvico uterino contribuye a la reducción
de la incidencia de este tipo de cáncer(3). Las técnicas
utilizadas para la detección de las lesiones precursoras
y del cáncer cérvico uterino son: el Papanicolaou o
Citología (con sensibilidad 62% y especificidad 68%) y la
Colposcopía (con sensibilidad 96% y especificidad 48%)
(4)
, siendo esta última la que tiene mayor sensibilidad
aunque resulta económicamente mas costosa (2).
La prueba colposcópica es uno de los métodos más
comunes para la detección de lesiones malignas y premalignas en el epitelio del cérvix, la cual, realizada por un
colposcopista experimentado logra una sensibilidad de
96% y una especificidad de 48% (4). La prueba colposcópica
consiste en la observación de la superficie del cérvix después
de aplicar una solución de ácido acético diluido al 5% como
agente de contraste. El patrón más importante a evaluar
es el cambio de tonalidad del tejido ante la reacción con
el ácido acético, fenómeno que es conocido como cambio
aceto-blanco, ya que el epitelio con transformaciones
celulares sugestivas de transformaciones anormales se
torna de pálido a blanco intenso (figura 1).
Este fenómeno ha sido utilizado desde hace más de
50 años como método de detección para dirigir la toma de
biopsias, sin embargo, los fundamentos físico- químicos
que producen este fenómeno aun no son entendidos en
su totalidad (5)
El principal problema de la colposcopía es la
naturaleza subjetiva del análisis visual que realiza el
experto colposcopista, lo que produce una alta variabilidad
de diagnóstico entre expertos ya que no existen criterios
Figura 1 Epitelio aceto-blanco. Imágenes adquiridas
antes a) y después de la aplicación del ácido acético b).
a)
b)
2 ANTECEDENTES
La posibilidad de almacenar digitalmente las
imágenes ha permitido la evaluación de cambio de
tonalidad en el tiempo que se presenta en cada parte
del epitelio. El estudio de estos patrones temporales
ha dado pauta a varios proyectos de investigación que
125
2.2 Hipótesis
buscan correlacionar estos patrones temporales con
el tipo de tejido observado(5, 7, 9). Particularmente estos
trabajos han buscado encontrar las características
relevantes que permitan hacer una discriminación del
epitelio con la finalidad de poder categorizarlo de forma
automática.
En términos generales se puede apreciar que los
esfuerzos por crear modelos computacionales que
realicen un diagnóstico automático que facilite una mejor
toma de la biopsia han sido estudios piloto que carecen
de conclusiones definitivas. En su mayoría, estos trabajos
reportan resultados con un reducido número de casos,
carentes de una metodología bien definida que permita
replicar los experimentos y menos aún que permitan
disponer de los datos para poder analizar los resultados
que se reportan.
La hipótesis de este trabajo es que es posible
caracterizar tanto el tejido normal como las lesiones
cérvico uterinas a partir de la dinámica aceto-blanca
utilizando criterios cuantitativos, tales como la magnitud
de la reacción, velocidad de cambio y velocidad de
retorno a su estado basal.
2.3 Objetivo general
El objetivo del proyecto es caracterizar los
patrones temporales que permitan detectar las lesiones
precursoras de cáncer cérvico uterino para segmentar
las imágenes colposcópicas.
3 METODOLOGÍA
2.1 Pregunta de Investigación
Para llevar a cabo este proyecto se ha propuesto
una metodología la cual está conformada por módulos.
En la figura 2 se muestra el esquema con el flujo de
datos y el vínculo entre los módulos:
¿Es posible identificar el epitelio normal y anormal
del cérvix a partir de su patrón temporal característico
ante la reacción con el ácido acético?
Figura 2 Metodología propuesta en el proyecto.
Adquisición de datos
Adquisición del conocimiento
Aprendizaje autómático
Clasificador K-Nearest Neighbor
(K-vecinos mas cercanos)
Secuencias
colposcópicas
Segmentación de Imágenes
t
Registro de imágenes
Extracción de
series de tiempo
Escala de grises
con % de cambio
126
3.1 Adquisición de datos
3.1.1 Colposcopio
Todas las imágenes se obtuvieron con una
frecuencia de muestreo de 1 cuadro/segundo con una
resolución de 352x240. Antes de la aplicación del ácido
acético se adquirieron 10 imágenes, las cuales fueron
tomadas como imágenes de base. Después de la
aplicación del ácido acético se adquirieron 300 cuadros,
dando en total 310 imágenes. Las imágenes abarcan
un área aproximada del cérvix de 18mm.x13mm. Las
imágenes de control obtenidas al inicio de cada prueba
cumplen dos propósitos: el primero es el de tener una
base de referencia para calcular el porcentaje de cambio
de la señal, y el segundo es para estimar la cantidad de
ruido en la señal. Cada cuadro es almacenado como una
imagen independiente en un archivo de formato BMP.
En este trabajo al conjunto de imágenes adquiridas le
llamaremos secuencia colposcópica. El equipo que
utilizado para la adquisición de las imágenes coloscópicas
está compuesto por:
Un colposcopio es un microscopio de campo
estereoscópico, binocular, de baja resolución, con una
fuente de iluminación potente de intensidad variable
que ilumina el área bajo examen, en este caso el cuello
uterino de la paciente (3). En nuestro caso se ha utilizado
un colposcopio Vasconcelos modelo CP-M7 con una
magnificación de 16 veces, la paciente a revisar se
encuentra a una distancia aproximada de 20 cm. del
objetivo del colposcopio. Al colposcopio se le ha añadido
una cámara de video, la salida producida por la cámara
de video se ha enviado hacia la tarjeta digitalizadora
instalada en una computadora, en la figura 4 se muestra
el colposcopio y la cámara de video utilizados.
•
•
•
•
Figura 4 Colposcopio con cámara de video
Colposcopio
Cámara
Digitalizador
Iluminación blanca
En la figura 3 se muestra como interactúan los
dispositivos utilizados para adquirir las imágenes.
Figura 3 Equipo utilizado para la adquisición de
imágenes colposcópicas.
3.1.2 Cámara
La cámara de video utilizada en el presente trabajo
es marca Sony modelo SSC-DC50A a color (Figura 5).
Figura 5 Cámara de video Sony SSC-DC50A
Para obtener las imágenes de la prueba
colposcópica se utilizó un colposcopio con una cámara
de video montada en el cabezal del mismo. La salida
producida por la cámara de video es enviada hacia la
tarjeta digitalizadora la cual fue instalada en el equipo de
cómputo. Con la finalidad de iluminar el colposcopio, se
utilizó una fibra óptica que fue conectada al sistema de
iluminación.
3.1.3 Digitalizador
Para digitalizar las imágenes adquiridas durante la
prueba colposcópica se ha utilizado la tarjeta digitalizadora
Meteor II de la Marca Matrox (figura 6), la cual ha sido
instalada en una computadora marca Hewlett Packard
127
3.2 Registro de imágenes
modelo Workstation XW6000. La Meteor II es una tarjeta
digitalizadora de cuadros análogos monocromáticos o a
color, puede adquirir diferentes tipos de formatos de video
utilizando su decodificador de video, acepta un disparador
de entrada externo, puede transferir las imágenes
adquiridas ya sea a la memoria de la computadora
para su procesamiento o a un dispositivo de despliegue
(Monitor). La tarjeta digitalizadora Meteor II tiene 4 Mbytes
de memoria de transferencia de video para almacenar
temporalmente los cuadros adquiridos. (10)
Durante la prueba colposcópica la paciente
se encuentra acostada en la mesa de exploración
con las piernas sujetas en unos soportes llamados
“pierneras” con los que se evitan los movimientos de
rotación o escalamiento. Sin embargo, factores como
la respiración, nerviosismo, movimientos musculares, o
incluso el ritmo cardíaco de la propia paciente podrían
producir movimiento de traslación, siendo necesario la
estabilización de las secuencia de imágenes, lo cual
se ha resuelto por medio de algoritmos de registro de
imágenes(11).
Debido a que las imágenes colposcópicas no
contienen muchos detalles distintivos, un método basado
en el área fue elegido. El representante clásico de los
métodos basado en el área es la correlación-cruzada
normalizada (CC) (11). Este método busca la coincidencia
directa de las intensidades de la imagen, esta medida de
similitud es calculada en cada par de ventanas desde las
imágenes de entrada y de las imágenes de referencia en
donde se busca su máximo (12). En este trabajo, la finalidad
del registro de imágenes es el de corregir el movimiento
que pudiera existir en la secuencia colposcópica. Esto
se logra a partir de la selección de un área de interés
(ROI – “Region of interest”). La ROI contiene patrones
definidos durante toda la secuencia de imágenes, esta
se añade en las imágenes (en forma de recuadro) como
referencia para el registro de las imágenes (figura 8).
Figura 6 Tarjeta Digitalizadora Matrox Meteor II
3.1.4 Iluminación
El colposcopio cuenta con un sistema de iluminación
denominado “luz fría” debido a que no permite el paso
de radiación de calor. Este sistema de iluminación está
compuesto básicamente por el generador (figura 7), el
cual tiene un tablero de mandos que está comprendido
por una lámpara piloto, un conector para el cable de fibra
óptica y un interruptor con potenciómetro que permite
regular la intensidad de la luz en el colposcopio, así como
una tapa que da acceso a la lámpara de iluminación que
por fábrica es de halógeno de 15V/150W
Figura 8. Area de interés (ROI – “Region of Interest”)
añadida en la imagen (en forma de recuadro) como
referencia para el registro de las imágenes.
Figura 7 Sistema de Iluminación
Después del registro de las imágenes, estas se
pasan a escala de grises. Al cambiar las secuencias
colposcópicas a escalas de grises estas reducen su
tamaño en un 50%. Logrando con esto disminuir el
costo computacional en el manejo de las imágenes.
128
Este reescalamiento puede también ser visto como un
filtro espacial pasa bajas que hará a las imágenes más
homogéneas y con menos ruido. Con las imágenes
alineadas, en escalas de grises y con menor resolución
es posible obtener a partir del valor de intensidad de
cada píxel series temporales las cuales caracterizan la
respuesta aceto-blanca (13).
El siguiente paso que se realiza al obtener las series
de tiempo de las secuencias colposcópicas es elegir la
forma de normalizarlas.
3.3.1 Porcentaje de cambio
El porcentaje de cambio se ha utilizado para
normalizar las series de tiempo (FDRA) extraídas de las
secuencias colposcópicas. La normalización se llevó a
cabo utilizando la siguiente ecuación:
3.3 Extracción de series de tiempo
Partiendo de la hipótesis que el tejido normal o
anormal de la superficie del cérvix puede ser caracterizado
por la dinámica aceto-blanca (6), se han obtenido a partir
de las imagenes colposcópicas series de tiempo, las
cuales llamamos funciones dinámicas de respuesta
aceto-blanca(FDRA). Para construir una serie de tiempo,
contamos con datos que consisten de una secuencia de
imágenes 2D que han sido adquiridas del reflejo de la
superficie del cérvix. La secuencia fue obtenida durante
un periodo de tiempo (antes y después de la aplicación del
ácido acético). Las imágenes pueden ser representadas
como una secuencia de t imágenes 2D It(x,y) con tiempo
de adquisición t con t<t+1. La variación de tonalidad sobre
el tiempo de cada píxel en la imagen proporciona una
serie de tiempo. La secuencia de imágenes resultantes
puede ser vista como un bloque de imágenes 3D I(x,y)
definida en un dominio espacio-temporal (14). En la figura
9 se muestra que para obtener una Función Dinámica
de Respuesta Aceto-blanca (FDRA) se busca en toda la
secuencia de imágenes el cambio de intensidad de un
píxel en las coordenadas (x,y), la búsqueda se inicia en
la imágen0 y termina en la imágenn en donde Z es la
cantidad total de las imágenes(tiempo).
FDRA(t ) =
FDRA(t )
− 1 , ∀t ∈ T
FRDA(0 )
(2.1)
Donde FRDA(t) es la serie de tiempo observada,
FDRA(0) es la intensidad promedio de la serie de tiempo
en su estado de control. En la figura 10 se muestra una
Función Dinámica de Respuesta Aceto-blanca (FDRA)
obtenida para un píxel en particular, en donde el eje
de las ordenadas corresponde al porcentaje de cambio
(variación en la intensidad de un píxel en el tiempo) y el
eje de las abscisas representa la secuencia de imágenes
(tiempo) (13).
Figura 10 Función Dinámica de Respuesta Acetoblanca (FDRA). En la barra horizontal el color verde
muestra el tiempo que se utilizó para adquirir imágenes
que sirven como estado de control (10 segundos). En
amarillo se muestra el momento en que se aplicó el ácido
acético. En la zona de color rojo se encuentra la reacción
del tejido al ácido acético.
Figura 9 Gráfica que muestra las series de tiempo
(FDRA) de 2 pixeles. Las coordenadas (x,y) representan
un píxel en la imagen, Z representa el volumen de
imágenes (tiempo), las series de tiempo (azul y rojo) son
obtenidas a partir del cambio de intensidad de cada píxel
en el tiempo.
129
3.4 Adquisición de conocimiento
La adquisición del conocimiento es una etapa en
el desarrollo de un sistema experto que se enfoca en
extraer, transformar y transferir la experiencia de una
fuente de conocimiento a un programa de computadora
(15)
. Tradicionalmente se utiliza la entrevista como técnica
para extraer conocimiento, sin embargo, en este trabajo
se ha implementado una herramienta computacional que
le ha permitido al experto (ginecólogo con especialidad
en colposcopía) recopilar su propio conocimiento (16). El
objetivo de la herramienta de adquisición de conocimiento
implementada (figura 11) es el de visualizar una serie
de tiempo de la secuencia colposcópica (mediante la
selección de un píxel en una imágen) y asignarle una
clase de tejido mediante una etiqueta. Para cada pixel
de una imagen colposcópica tiene asociada una serie
de tiempo. Partiendo del hecho que una serie de tiempo
caracteriza un tipo de tejido (sano o enfermo) (7), en la
herramienta implementada se le permite al experto
seleccionar un pixel a la vez para visualizar su serie de
tiempo y posteriormente etiquetarla. La utilización de la
herramienta de adquisición del conocimiento se lleva
a cabo después de realizar el registro de imágenes.
El conjunto de series de tiempo etiquetadas que sean
obtenidas mediante esta herramienta será utilizado en
el proceso de clasificación del aprendizaje automático.
La herramienta ha sido desarrollada como una interfaz
gráfica implementada en el lenguaje Matlab versión 7.
Figura 11. Herramienta de adquisición del conocimiento (Katool- “Knowledge Acquisition Tool).
1) Visualizador de secuencias colposcópicas, 2) Barra seleccionadora de la imagen e indicador del
número de imagen desplegada, 3) directorio en donde se encuentran las imágenes de la paciente, 4)
Visualizador de respuesta aceto-blanca, 5) Visualizador de series de tiempo de puntos similares, 6)
Series de tiempo, 7) Aprendizaje semi-supervisado, 8) Tipos de etiquetas, 9) Biopsias, 10) Utilerías.
130
3.5 Aprendizaje automático
un espacio patrón de n-dimensiones. Cuando llega un
ejemplo desconocido, el clasificador “K-vecinos más
cercanos” busca en el espacio patrón los k ejemplos
de entrenamiento que sean más cercanos al ejemplo
desconocido. La cercanía está definida en términos de
la distancia Euclidiana (19), aunque se puede utilizar otra
métrica. En nuestro caso las series de tiempo son los
ejemplos que entrarán en el modelo de clasificación. El
enfoque que se ha utilizado para evaluar el desempeño
del clasificador es “dejar uno afuera” (“leave one out”).
El cual es un caso especial del método de “validación
cruzada” (“cross validation”), con el que se asegura que
las observaciones de un paciente (conjunto de prueba)
no se encuentra en las observaciones del conjunto de
entrenamiento.
Las técnicas de aprendizaje automático permiten a
un algoritmo “aprender” una tarea a partir de un conjunto
de ejemplos. Un caso particular de este aprendizaje es
la clasificación, la meta es inducir un modelo para poder
predecir una clase dados los valores de los atributos
(17)
. Los métodos de aprendizaje basado en instancias
(ejemplos) como el “K-vecinos más cercanos” (“KNearest Neighbor”) son algoritmos sencillos en donde
el aprendizaje consiste en almacenar los ejemplos de
entrenamiento. Cuando se quiere clasificar una nueva
instancia, se extraen de memoria un conjunto de
instancias similares que serán utilizadas para clasificar
la nueva observación. Este tipo de aprendizaje también
se conoce como “lazy learning” (“aprendizaje perezoso”)
o “memory based learning” (“aprendizaje basado
en memoria”) donde los datos de entrenamiento se
procesan solo hasta que se requiere, (cuando se quiere
clasificar un nuevo ejemplo) y la relevancia de los datos
se mide en función de una medida de distancia (18). En
el algoritmo “K-vecinos mas cercanos” el conjunto de
ejemplos de entrenamiento está descrito por un espacio
de atributos de n-dimensiones. De esta manera, todos
los ejemplos de entrenamiento son almacenados en
3.6 Segmentación de Imágenes
Uno de los resultados que se obtuvieron en este
proyecto fue implementación de una herramienta que es
capaz de emitir un diagnóstico segmentando imágenes
colposcópicas mediante colores que representan los
diferentes tipos de lesiones (figura 12). Esto se lleva
a cabo a partir del resultado obtenido de aplicar el
algoritmo de aprendizaje al conocimiento adquirido de
parte del experto.
Figura 12. Herramienta de segmentación de imágenes llamada Sistema experto en colposcopía asistido por
computadora, por sus siglas en ingles, Caces (Computer Aided Colposcopy Expert System)
131
4 RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA.
Se adquirieron 34 casos (secuencias colposcópicas)
de pacientes con edades entre 25 a 45 años. De las
observaciones se obtuvieron las siguientes muestras:
25 Normales (11 tejido normal, 7 metaplasia inmadura,
5 metaplasia madura, 2 Ectopia ), 21 Anormales (19
lesión bajo grado, 2 lesión alto grado). El número de
observaciones supera al de pacientes debido a que
en algunos casos se tomó más de una observación de
un mismo paciente. De las secuencias adquiridas se
extrajeron series de tiempo representadas en escala de
grises con estandarizadas con porcentaje de cambio.
Los resultados mostraron porcentajes de especificidad
superiores a los reportados en la bibliografía para la
colposcopía realizada por un experto humano (59.78%),
en cuanto a la sensibilidad se logró un índice promedio
de 75.01% [7].
1. Antonio Tapia FG, Octavio Gómez. Salud:México
2001-2005. Información estratégica por entidad
federativa. Secretaría de Salud 2006;Primera Edición
2006.
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care Colposcopy. New Year; 2004.
3. Aroch Calderon Arturo, Díaz Sánchez Joel Gerardo
, Zertuche Ouani José Gerardo, B. OG. Nueva
Técnica Colposcópica para la prevención del cáncer
cervicouterino. Revista de la Facultad de Medicina.
Facultad de Medicina, UNAM 2005;48(2):47-51.
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cervivcal cancer screening. Contemporary Ob/Gyn
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epithelial dysplasias and malignancies based on
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2001;48(1):96-104.
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Biomedical Optics. 2001;6(4):397-403.
9. Pogue Brian W., Mycek Mary-Ann, Harper D. Image
Analysis for Discrimination of Cervical Neoplasia.
Journal of Biomedical Optics. 2000:72-82.
10. Matrox-Electronic-System-Ltd. Matrox Meteor II/
Standard Installation and Hardware Reference.
2003;Manual no. 10577-101-0500.
11. Acosta-Mesa H., Zitová B., Ríos-Figueroa H., CruzRamírez N., Marín-Hernández A., Hernández-Jiménez
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Sixth International Conference on Computer Science
(IEEE Computer Society Press) 2005:158-64.
12. Zitova Barbara FJ. Image Registration Methods: a
Survey. Image and vision computing 2004.
5 DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en el presente trabajo de
investigación fueron comparados con aquellos que se
han reportado en investigaciones enfocadas en torno a
la caracterización de lesiones malignas y pre-malignas
a partir del análisis de imágenes colposcópicas (58, 20). En el trabajo realizado por Schmid se reporta
como mayor valor alcanzado para la especificidad 88%.
Mientras que en nuestro trabajo hemos obtenido como
máximo 59.78% en el mismo rubro.
Es importante aclarar que el trabajo de Schmid,
fue reportado solamente como un borrador de reporte
técnico, que no se publicó en alguna revista o congreso, y
que a juicio propio del autor, representa un estudio piloto.
En sus experimentos se consideraron 50 pacientes. De
las observaciones se obtuvo el siguiente número de
casos: 26 anormales (CIN II-III), 32 normales (16 CIN I,
11 sanas y 5 metaplasias). Esto hace una gran diferencia
con nuestro enfoque ya que en su trabajo la categoría CIN
I se considera normal, lo que simplifica la discriminación
pero dificulta la interpretación de la especificidad.
En el presente trabajo se adquirieron 34 secuencias
colposcópicas de pacientes de un total de 50 que se han
considerado en el proyecto. Los resultados obtenidos
hasta ahora son prometedores, pero se espera que sean
concluyentes al incluir un mayor número de casos en
proceso.
132
13. Hernández-Galicia E. Propuesta Metodológica para la
detección de lesiones precursoras de cáncer cérvico
uterino utilizando funciones dinámicas de respuesta
acetoblanca (Tesis de Maestría). 2006.
14. Acosta-Mesa H.G., Cruz-Ramírez. N., Llaguno Roque
J.L., Hernández- Jiménez R., B.E. C-R. Assessing
Cervical Cancer Lesion Predictability Using AcetoWhite Temporal Patterns with Bayesian Network
Learning. Avances en la ciencia de la Computación
VII Encuentro Internacional de Computación ENC’06
2006.
15. McGraw Karen L., Karan HB. Knowldges Adquisition:
Principles Guidelines. Prentice-Hall 1989.
16. Mockler Robert J. , G. DD. Knowledge Based
Systems. An introduction to expert systems. McMillan
Publishing Co. 1992.
17. Morales-Manzanares E. Machine Learning. Instituto
Nacional de Astrofísica, Optica y Electrónica(INAOE)
2005.
18. Mitchell TM. Machine Learning. In: K-Means; 1997. p.
191-6.
19. Jiawei Han, Kamber M. Data Minig: Concepts and
Techniques. Morgan Kaufmann Publishers 2001.
20. Balas Costas, Themelis George, Papadakis A.,
Vasgiouraki E., Argyros A., Koumantakis E., et al. A
Novel Hyper-Spectral Imanging System: Application on
in-vivo Detection and Grading of Cervical Precancers
and of Pigmented Skin Lesions. “Computer Vision
Beyond the Visible Spectrum” CVBVS’01 Workshop,
Hawaii, USA 2001.
133
Instituto de
Salud Pública