PCR - Estación Fitopatolóxica do Areeiro

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) COMO
TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO EN FITOPATOLOGÍA FORESTAL
O. Aguín
(1);
M. Sabarís
(1);
A. Abelleira
(1);
C. Pintos (1) y J.P. Mansilla
(1, 2)
(1) Diputación Provincial de Pontevedra. Servicio Agrario. Estación Fitopatológica Do Areeiro. Subida a la Robleda, s/n. 36153 Pontevedra. Www.efa-dip.org
(2) Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo
INTRODUCCIÓN
La identificación en el menor tiempo posible y de una forma fiable de organismos patógenos es fundamental para mininizar los daños que producen. Sin embargo, para algunos hongos,
sobre todo los que atacan al sistema radicular, la determinación tradicional basada en la observación de estructuras morfológicas y en propiedades fisiológicas no es suficiente para obtener
una identificación fiable. El desarrollo de técnicas moleculares, sobretodo con el descubrimiento en 1985 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha permitido establecer la
identidad de cada organismo y sus relaciones filogenéticas, lo que ha revolucionado la sistemática de hongos (EDEL, 1998).
Las aplicaciones de la técnica PCR son muy amplias y en la actualidad se utiliza en la detección e identificación de virus, bacterias, hongos, nematodos, etc. (CENIS, 1993). El éxito de esta
técnica consiste en su sencillez teórica y en la rapidez en su ejecución, ya que permite la identificación de un patógeno en un día. El poder aplicar con garantías técnicas moleculares supone
una enorme ganancia en tiempo que beneficia el control de la enfermedad. Por este motivo el objetivo de este trabajo fue adaptar un protocolo de PCR, complementado con el análisis de la
longitud de fragmentos de restricción (RFLP), para los géneros fúngicos Armillaria, Phytophthora y Fusarium.
MATERIAL Y MÉTODOS
Extracción del ADN
Se utilizó el EZNA fungal DNA miniprep Kit
AMPLIFICACIÓN
Se utilizaron las Ready-To-Go-PCR beads
ARMILLARIA:
Micelio sobre planta
Micelio en medio de cultivo
Secuencias de cebadores y condiciones de amplificación para los géneros Armillaria, Phytophthora y Fusarium.
HONGOS
CEBADORES
CONDICIONES DE AMPLIACIÓN (*)
- 95 segundos a 951C.
Armillaria
0-1: 5'-AGTCCTATGGCCGTGGTAT-3'
Material fúngico utilizado:
- 35 ciclos: 60 segundos a 601C
PHYTOPHTHORA:
Micelio en medio de cultivo
120 segundos a 721C
60 segundos a 951C
-LR12R: 5' CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3'
- 10 minutos a 721C
- 120 segundos a 961C
Phytophthora
ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
FUSARIUM:
Micelio en medio de cultivo
- 35 ciclos: 60 segundos a 961C
60 segundos a 551C
120 segundos a 721C
ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'
- 10 minutos a 721C
- 182 segundos a 951C
Fusarium
ITS1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
ARMILLARIA:
Alu I, Bsm I, Nde I
- 35 ciclos: 60 segundos a 95 1C
60 segundos a 551C
RFLP
60 segundos a 721C
P3: 5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'
- 3 minutos a 721C
PHYTOPHTHORA:
Rsa I, Hae III, Msp I
* Condiciones propuestas para Armillaria (PÉREZ et al, 1999), Phytophthora (RISTAINO et al, 1998) y Fusarium (EDEL et al, 1996).
RESULTADOS
La amplificación del ADN de las muestras fúngicas permitió observar una banda situada aproximadamente a 900 pb en el caso de Armillaria y Phytophthora, mientras que para Fusarium los
cebadores amplificaron una región de 1200 pares de bases.
En las muestras con Armillaria, se produjo éxito en la amplificación en todos los casos, identificándose cuatro especies : A. mellea, A. ostoyae, A.cepistipes y A. gallica, en distintos hospedadores.
En el caso de Phytophthora, mediante la aplicación de las técnicas PCR-RFLP se han detectado hasta el momento tres especies: P. cinnamomi, P. cactorum y P. capsici.
En las muestras de Fusarium solo se ha llegado a determinar el género mediante PCR; estudios posteriores con las enzimas de restricción adecuadas permitirán la diferenciación de especies.
1500
Rsa I Hae III
1000
500
500
100
100
Gel de agarosa al 1%, mostrando el
DNA amplificado de muestras
de Fusarium
Gel de agarosa al 2%, mostrando los
fragmentos de restricción obtenidos al
digerir el DNA amplificado de muestras
de Phytophthora con Rsa I y Hae III
Gel de agarosa al 3%, mostrando los
fragmentos de restricción obtenidos
al digerir el DNA amplificado de
muestras de Armillaria con Alu I
CONCLUSIONES
El género Armillaria presentaba grandes dificultades en la identificación de especies y los métodos propuestos resultaban complicados, de mucha duración
(entre cuatro o quinco semanas) y con resultados la mayor parte de las veces confusos. La aplicación de la técnica PCR junto con el análisis RFLP ha
posibilitado la identificación de las especies en menos de un día de una forma fiable. Para Phytophthora y Fusarium, estas técnicas constituyen, por el momento,
un buen complemento al diagnóstico por la metodología tradicional, pero estudios posteriores permitirán sin duda un mejor desarrollo de las mismas.
III Congreso Forestal Español, Sierra Nevada (Granada) 25-28 septiembre 2001