LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) COMO

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) COMO TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO
EN FITOPATOLOGÍA FORESTAL
O. AGUÍN; C. PINTOS; M. SABARÍS; A. ABELLEIRA & J.P. MANSILLA
Estación Fitopatológica "Do Areeiro".Subida a la Robleda s/n. 36153 Pontevedra.
RESUMEN
En los laboratorios de fitopatología, era muy difícil hasta hace pocos años la identificación de algunos
organismos por los métodos clásicos de diagnóstico. El desarrollo de técnicas moleculares como la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) han
simplificado y mejorado los sistemas de trabajo habituales.
En nuestro laboratorio se aplica la técnica PCR para la identificación de hongos patógenos radiculares.
Primero se realiza la extracción del ADN a partir de material fúngico que puede ser de diversa naturaleza,
dependiendo de las características del hongo que se quiere identificar. Posteriormente se lleva a cabo la
amplificación del ADN extraído utilizando cebadores adecuados. El material amplificado puede ser digerido
después con enzimas de restricción para obtener fragmentos de distintos tamaños. En algunos organismos
solo se puede averigüar el género, como en el caso de Fusarium, mientras que en Armillaria y Phytophthora,
al aplicar el método RFLP se consigue la identificación a nivel de especie.
Los resultados demuestran la alta eficacia de esta metodología para el diagnóstico fitopatológico
debido a su rapidez, fiabilidad y repetitividad.
P.C.: PCR, RFLP, Armillaria, Phytophthora, Fusarium, ADN.
SUMMARY
Only few years ago, the identification of some organisms in phytopathology labs by classic diagnosis
methods was very difficult. The development of molecular techniques as the polymerase chain reaction
(PCR) and the analysis of restriction fragment length polymorphism (RFLP) have simplified and improved
the habitual work systems.
In our lab the PCR technique is being applied for the identification of root rot pathogenic fungi. The
fungal DNA is extracted from samples of fungal material, that can be of different nature, according to the
characteristics of the fungus to identify. The amplification of the DNA extracted is carried out by using
appropriate primers to each fungus. Amplified DNA can then be digested by restriction enzymes to obtain
fragments of different size. For some organisms, as Fusarium, the identification reaches genus level, but for
other cases, as Armillaria and Phytophthora, the species identification is achieved after applying the RFLP
analysis.
Results show this phytopathological diagnostic methodology as a highly efficient one, because of its
speed and reliability.
K.W.: PCR, RFLP, Armillaria, Phytophthora, Fusarium, DNA.
INTRODUCCIÓN
La mayoría de las especies forestales son susceptibles de ser atacadas por diversos organismos
patógenos que les causan graves enfermedades. La identificación en el menor tiempo posible y de una forma
fiable de estos microorganismos es fundamental para mininizar los daños que producen llevando a cabo las
medidas de control más adecuadas. Sin embargo, para algunos hongos patógenos, sobre todo los que atacan
al sistema radicular, la determinación tradicional basada en la observación de estructuras morfológicas y en
propiedades fisiológicas no es suficiente para obtener una identificación fiable. El desarrollo de técnicas
moleculares, iniciado con el descubrimiento en 1985 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha
permitido establecer la identidad de cada organismo y sus relaciones filogenéticas, lo que ha revolucionado la
sistemática de hongos (EDEL, 1998).
Las aplicaciones de la técnica PCR son muy amplias y en la actualidad se utiliza en la detección e
identificación de microorganismos patógenos como virus, bacterias, hongos, nematodos, etc. (CENIS, 1993).
La base del éxito de esta técnica consiste en su sencillez teórica y en la rapidez en su ejecución, esencial para
un laboratorio de diagnóstico, ya que permite la identificación de un patógeno en un día. El poder aplicar con
garantías técnicas moleculares supone una enorme ganancia en tiempo que beneficia el control de la
enfermedad. Por este motivo el objetivo de este trabajo fue adaptar un protocolo de PCR, complementado con
el análisis de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), para los géneros fúngicos Armillaria,
Phytophthora y Fusarium.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para el estudio de Armillaria, se han utilizado muestras sintomáticas de diferentes materiales vegetales
(coníferas, ornamentales, frutales, vid, etc.) que mostraban podredumbre blanca de raíz. Para Phytphthora se
utilizaron muestras de vid, frondosas, coníferas y hortícolas que presentaban una sintomatología asociada a
este género. En el caso de Fusarium se utilizaron muestras de hortícolas.
El proceso PCR-RFLP aplicado a los tres géneros consistió en las siguientes etapas:
a.- Extracción de ADN.Para Armillaria se realizó a partir de diferentes estructuras fúngicas: esporas, rizomorfos, micelio en
planta y micelio o rizomorfos aislados en el medio de cultivo selectivo BDS (WORRAL, 1991). Para
Phytophthora se empleó micelio aislado en el medio de cultivo selectivo V8, mientras que para Fusarium se
utilizó micelio aislado en el medio nutritivo selectivo Komada.
Para los tres géneros se siguió el protocolo corto estándar del kit “EZNA fungal DNA
miniprep” (Omega Biotek), sin añadir mercaptoetanol ni ARNasa (MARTÍN & TORRES, 1998).
b.- Amplificación (PCR).Se eligieron los viales “Ready-To-Go PCR beads” (Amersham Pharmacia) a los que se incorporó 0.5
μl de cada cebador (10pm/μl), el ADN extraído (1 μl) y el agua hasta completar un volumen final de 25 μl.
Los dos cebadores empleados en la amplificación fueron específicos para cada género, como se
observa en la tabla 1, teniendo éstos normalmente entre 18-30 nucleótidos.
Los viales “Ready-To-Go PCR beads” se colocaron en un termociclador, siguiendo, en general, las
siguientes fases: desnaturalización de la doble cadena del ADN, anillamiento de los oligonucleótidos a las
cadenas separadas del ADN y elongación o extensión, en la cual los cebadores sintetizan las nuevas cadenas.
La duración de cada una de estas etapas, así como los ciclos de repetición, van a depender del hongo objeto
de estudio.
c.- Electroforesis.Una vez completada la amplificación, se hizo una electroforesis en gel de agarosa, al 2% en el caso de
Armillaria y Phytophthora y al 1% para Fusarium, en tampón TBE 1X a 100 voltios durante 30 minutos.
Pasado ese tiempo, se tiñó el gel con bromuro de etidio para poder visualizar las bandas con un
transiluminador.
d.- Obtención de fragmentos de restricción.Para Armillaria, la digestión del ADN amplificado se llevó a cabo con las enzimas de restricción Alu
I, Nde I y Bsm I. Con Alu I se diferencian 12 patrones de restricción: dos para A. borealis, A. cepistipes, A.
mellea y A. tabescens, uno para A. ostoyae y tres para A. gallica (PÉREZ et al. 99; HARRINGTON
&WINGFIELD, 1995). A. ostoyae, el patrón 2 de A. cepistipes y el patrón 1 de A. borealis presentan las
mismas bandas con Alu I(310 ó 305, 200, 135), con lo cual, para diferenciar estas especies, hay que analizar
los fragmentos de restricción obtenidos al utilizar las enzimas Nde I y Bsm I. Para la digestión con estas
enzimas, el ADN se tiene que purificar previamente con el kit “High Pure PCR Product Purification” (Roche
Diagnostic). La enzima Nde I corta el ADN de las especies A. borealis y A. ostoyae produciendo dos
fragmentos de 550 y 370 pb y no corta el de A. cepistipes. La enzima Bsm I corta el ADN de A. ostoyae
dando dos fragmentos de 620 y 300 pb respectivamente, pero no corta el de las otras dos.
Para identificar las especies de Phytophthora,los fragmentos de ADN amplificados se digirieron con
las enzimas de restricción Rsa I, Hae III y Msp I (Roche diagnostic). Según RISTAINO et al (1998), los
patrones de restricción que se obtienen permiten diferenciar las siguientes especies: P. cactorum, P. capsici,
P. citrophthora, P. nicotianae, P. palmivora, P. citricola, P. infestans, P. mirabilis, P. fragariae, P.
megasperma, P. sojae, P. cinnamomi, P. crytogea, P. erythroseptica.
RESULTADOS
La amplificación del ADN de las muestras fúngicas permitió observar una banda situada
aproximadamente a 900 pb en el caso de Armillaria y Phytophthora, mientras que para Fusarium la banda
apareció a 1200 pb.
En las muestras con Armillaria, se produjo éxito en la amplificación en todos los casos,
identificándose cuatro especies : A. mellea, A. ostoyae, A.cepistipes y A. gallica, en distintos hospedadores
(Tabla 2).
En el caso de Phytophthora, mediante la aplicación de las técnicas PCR-RFLP se han detectado hasta
el momento tres especies: P. cinnamomi, P. cactorum y P. capsici.
En las muestras de Fusarium solo se ha llegado a determinar el género mediante PCR; estudios
posteriores con las enzimas de restricción adecuadas permitirán la diferenciación de especies.
CONCLUSIONES
El género Armillaria presentaba grandes dificultades en la identificación de especies y los métodos
propuestos resultaban complicados, de mucha duración (entre cuatro o quinco semanas) y con resultados la
mayor parte de las veces confusos. La aplicación de la técnica PCR junto con el análisis RFLP ha posibilitado
la identificación de las especies en menos de un día de una forma fiable. Para Phytophthora y Fusarium, estas
técnicas constituyen, por el momento, un buen complemento al diagnóstico por la metodología tradicional,
pero estudios posteriores permitirán sin duda un mejor desarrollo de las mismas.
BIBLIOGRAFÍA
CENÍS, J.L. (1993). Aplicaciones de la técnica PCR a la protección de cultivos. Phytoma 45: 8-11.
EDEL, V.; STEINBERG, C.; GAUTHERON, N. & ALABOUVETTE, C. (1996). Evaluation of restriction
analysis of polymerase chain reaction (PCR)- amplified ribosomal DNA for the identification of
Fusarium species. Mycological Research 101: 179-187.
EDEL, V. (1998). Use of PCR and RFLP in fungal Systematics. In: Chemical Funfal Taxonomy. Ed. Frisvad,
J.C.;Bridge, P.D.; Arora, D.K. 51-78.
HARRINGTON, T.C. & WINGFIELD, B.D. (1995). A PCR- based identification method for species of
Armillaria. Mycologia, 87 : 280-288.
MARTÍN, M.P. & TORRES, E. (1998). Evaluación de los métodos de extracción y amplificación del DNA
para la detección de fitoplasmas en viña. IX Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología.
Salamanca.
PÉREZ, A.; WHITEHEAD, S.D. & WHITEHEAD, P.M. (1999). Investigation of a PCR- based method for
routine identification of British Armillaria. Mycologial Research 103 :1631-1636.
RISTAINO, J.B; MADRITCH, M.; TROUT, C.S. & PARRA, G. (1998). PCR amplification of Ribosomal
DNA for species identification in the plant pathogen genus Phytophthora. Applied and Enviromental
Microbiology, 948-954.
WORRAL, J.J.; (1991). Media for selective isolation of Hymenomycetes. Mycología 83: 298-302.
Tabla 1.- Secuencias de cebadores y condiciones de amplificación para los géneros Armillaria,
Phytophthora y Fusarium.
Hongos
Cebadores
Condiciones de amplificación *
Armillaria
0-1: 5'-AGTCCTATGGCCGTGGTAT-3'
-LR12R:
5' CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3'
Phytophthora
ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'
Fusarium
ITS1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
P3: 5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'
- 95 segundos a 951C.
- 35 ciclos: 60 segundos a 601C
120 segundos a 721C
60 segundos a 951C
- 10 minutos a 721C
- 120 segundos a 961C
- 35 ciclos: 60 segundos a 961C
60 segundos a 551C
120 segundos a 721C
- 10 minutos a 721C
- 182 segundos a 951C
- 35 ciclos: 60 segundos a 95 1C
60 segundos a 551C
60 segundos a 721C
- 3 minutos a 721C
* Condiciones propuestas para Armillaria (PÉREZ et al, 1999), Phytophthora (RISTAINO et al, 1998) y Fusarium (EDEL et al, 1996).
Tabla 2.- Especies de Armillaria identificadas y material vegetal de las que se han aislado.
Especies
Hospedadores
A. mellea
Actinidia deliciosa, Quercus robur, Quercus suber, Camellia sp., Castanea sativa, Magnolia
grandiflora, Prunus domestica, Olea europaea, Salix babylonica, Vitis spp., Crataegus azarolus,
Acacia sp., Hydrangea sp., Malus domestica, Euonymus japonicum, Syringa vulgaris, Pinus sp.
A. gallica
Corylus avellana, Robinia pseudoacacia, Aesculus hippocastanum, Acer pseudoplatanus, Thuja sp.,
Vitis sp.; Prunus domestica, Citrus sinensis, Acacia melanoxylum.
A. ostoyae
Pinus pinaster, Pinus sp.
A. cepistipes
Vitis sp.