Guia sobre figuras de mérito

Análisis Instrumental
Métodos de estimación de Límite de Detección y Límite de Cuantificación
en metodologías instrumentales
1. Algunas definiciones
El proceso de validación de una metodología analítica, obligatorio en determinados rubros
de actividad, incluye la determinación de su Límite de Detección y su Límite de
Cuantificación. Sin embargo, los diferentes organismos internacionales los han definido de
distinta forma y basándose en diferentes conceptos.
Límite de detección
El límite de detección, expresado como una concentración (LD), se calcula a partir de la
medición más pequeña (yL), que puede ser detectada con certidumbre razonable en un
determinado procedimiento analítico. (IUPAC).
El concepto de exactitud se ha modificado en los últimos veinte años. La definición clásica
era “exactitud de una medición es la coincidencia entre el resultado de una medición y el
valor verdadero del mensurando” (ISO, Metrología, 1993). En la actualidad se estima la
incertidumbre de una metodología como la contribución de las incertidumbres sistemáticas
(exactitud) y los incertidumbres aleatorias (precisión).
Repetitividad de una metodología
Es la precisión de los resultados obtenidos a partir de determinaciones independientes del
mismo mensurando, con el mismo método, por el mismo operador utilizando el mismo
equipamiento y en el mismo laboratorio, y en un intervalo corto de tiempo (ISO 3534-1).
El concepto de determinaciones independientes significa que se realiza la totalidad de la
metodología analítica en cada replicado. Si no fuera así se estaría evaluando únicamente la
“repetitividad instrumental”
Reproducibilidad de una metodología
Es la precisión de los resultados que se obtienen de determinaciones independientes del
mismo mensurando, modificando uno de los parámetros que se definen para determinar la
repetitividad. Como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1.- Comparación entre repetitividad y reproducibilidad.
Repetibilidad
Reproducibilidad
Intra-laboratorio
Reproducibilidad
intermedia
Ensayos de colaboración
Muestra
Misma
Misma
Misma
Operador
Mismo
Diferente
Tiempo
Mismo
Diferente
Equipo
Mismo
Reactivos
Mismos
Diferentes
Laboratorio
Mismo
Diferente
Condiciones
Se modifican una o mas
condiciones, pero no todos
Diferente
Error de una medición
Es una medida de la exactitud de un método, y se define como la diferencia que existe entre
el resultado de una medición y el “valor verdadero”. Pero, debido a que no es posible
conocer el “valor verdadero” de la concentración de un analito, tampoco es posible conocer
el error cometido en una determinación.
Sin embargo, podemos asumir como valor verdadero al obtenido a partir de una gran
cantidad de análisis de la muestra en distintos laboratorios. Es asi como organismos como
el NIST comercializan materiales de referencia certificados (CRM) para poder testear la
exactitud de los métodos analíticos.
Incertidumbre de una medición
Es el parámetro asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de
los valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando.
Se trata de un intervalo estimado, que se informa junto al resultado calculado, y en el que
existe una cierta probabilidad (usualmente 95 - 99%) de encontrar al valor verdadero. A
diferencia del error, la incertidumbre nunca puede ser 0, y si bien incluye la repetitividad es
obviamente mayor que ella. Como se observa en la figura 1.
Figura 1.- descripción gráfica de las definiciones de error incertidumbre e intervalo de
confianza
2. Límite de detección basado en la repetitividad del blanco
Consideraciones conceptuales
Nunca se debe olvidar que las matemáticas asociadas a la medición son un auxiliar
más de la misma, pero no constituyen el objeto central. De esta forma, cuando se
encuentran discrepancias entre el resultado de aplicar una determinada estadística y la
evidencia química, deberá tener prioridad esta última y en todo caso encontrar las razones
de la discrepancia. Habitualmente el mal uso de fórmulas o el no cumplimiento de
condiciones de validez imprescindibles para determinado modelo estadístico sugieren
valores de cifras de mérito muy alejadas de la realidad.
Por ejemplo, si contamos con un grupo de muestras de las que algunas contienen
cierto analito y otras no, y mediante un determinado método somos capaces de determinar
cuales son las que lo contienen, es claro que estamos por sobre el límite de detección. Esto
es particularmente cierto cuando se trata de un número de muestras tal que la probabilidad
estadística de haber cometido errores repetidas veces se hace despreciable. Sin embargo, la
aplicacion cruda de la estimación del LD mediante el análisis de una curva de calibración
puede dar valores tan altos que indiquen que es imposible medir en esas condiciones. Esto
suele deberse a la incertidumbre acumulada en la preparacion de patrones, que puede ser
muy alta, mientras que el “valor cero” del analito es muy probable que tenga una
incertidumbre mucho menor, sobre todo en matrices sencillas.
Definición de LD considerando solo error de tipo I
La primera aproximación definió límite de detección como: “La concentración de
analito que origina una señal que puede diferenciarse estadísticamente del blanco”. Si se
asume que la señal del blanco tiene distribución gaussiana, entonces la probabilidad de que
la más pequeña señal analítica discernible, yL, puede ser medida y no corresponde a una
fluctuación aleatoria de la medida del blanco, depende de a cuantas unidades (k) de
desviación estándar del blanco (sB) está yL de yB (promedio de las medidas del blanco). Si
la diferencia entre yB e yL es 3sB la probabilidad que la medida de yL sea una fluctuación
del blanco es menor que el 0,13% (si el número de medidas del blanco es superior a 25). A
esto se lo conoce como la probabilidad de falso positivo o error de tipo I (Ver figura 2).
Figura 2.- Distribución de probabilidad de las medidas del blanco.
Entonces la señal mínima que se diferencia estadísticamente de la blanco (yL) se puede
calcular
y L  y B  3s B
[1]
Luego el valor de concentración teórico que debería tener tal señal surge de
reemplazar la ecuación [1] en la recta de calibración (y = mX + yB) dando el tradicional
cálculo del LD
LD 
3s B
m
[2]
El límite de cuantificación se define como la concentración de analito que origina
una señal que puede cuantificarse con una precisión acotada (usualmente 10%). Por lo
tanto, aproximando que la precisión es constante en el rango inferior de la curva de
calibración se puede determinar el límite de cuantificación (LC) como:
LC 
10s B
m
[3]
Este método utiliza como fuente de variabilidad de las señales, la desviación
estándar del blanco. Para conocerlo con precisión es necesario repetir la medición del
blanco un gran número de veces (n>20), lo que muchas veces resulta muy costoso y
consume tiempo.
Límite de detección basado en la curva de calibración
Como estimadores alternativos al sB se suelen utilizar:
La desviación estándar de los residuos del calibrado (sy/x, ecuación 4), el desvío
estándar de la ordenada al origen (sb, ecuación 5), y la extrapolación de las hipérbolas de
confianza al eje y (s0, ecuación 6). (Note que en el último caso no es necesario dividir por la
pendiente para el cálculo del LD). Esto es útil si no se ha repetido el blanco y s B no puede
calcularse.
n
(y
sy/x =
i 1
i
 yˆ i ) 2
[4]
n2
sb = s y / x
;
1

n
x2
m
 (x
i 1
s0 =
sy/ x
m
1 1
 
p n
x2
m
 (x
i 1
i
 x)
i
 x)
[5]
2
[6]
2
Estas aproximaciones son válidas cuando la precisión instrumental es constante a lo
largo del ámbito de linealidad, y la variabilidad asociada a la preparación de los estándares
de calibración es despreciable frente a la variabilidad instrumental. Si esto no se cumple, el
uso de estos parámetros en el cálculo producirá una sobreestimación del LD. Hay que tener
en cuenta que con los instrumentos actuales es muy probable que la variabilidad de
preparacion de estandares sea similar o mayor a la variabilidad instrumental.
Definición de LD considerando error de tipo I y II
¿Qué ocurre si se mide una solución de analito de concentración igual al límite de
detección?
Como la distribución de probabilidad será una gaussiana centrada en la mínima
señal detectable (yL), la mitad de las veces tendrá un valor mayor a yL y la otra mitad será
menor. Con lo cual la mitad de las veces no se detectará, y la tasa de falso negativo será del
50%. Esto quiere decir que la mitad de las veces que se mide una concentración de analito
igual a su límite de detección no será detectable. (ver figura 3).
Figura 3.- Distribución de probabilidad de las medidas del blanco (curva azul), y
distribución de probabilidad de las medidas de una solución de analito de concentración
igual al LD (curva roja). Las áreas sombreadas representa la probabilidad de cometer error
de tipo I (area azul, ) y error de tipo II (área roja,).
Definición moderna del Límite de detección de IUPAC
Para solucionar este inconveniente IUPAC reformulo la definición de límite de
detección con una sutil diferencia: “Es la menor concentración de analito que puede ser
detectada con un cierto nivel de confianza”. Esta definición no solo limita el error tipo I que
se puede cometer sino que también acota el error de tipo II. Entonces, bajo la nueva
definición, el límite de detección ya no es el valor a partir del cual se toma la decisión de
detectado, y pueden detectarse concentraciones de analito aun menores que el LD.
Además se agregó la definición de un nuevo parámetro denominado como nivel
crítico (Nc), que representa el Nivel de concentración límite a partir del cual se toma la
decisión de “detección” del analito.
En la definición moderna, el límite de detección (LD) se calcula en función del
desvío estándar de la concentración predicha para una muestra blanco (s0). Para estimar s0,
en lugar de repetir la medición del blanco un gran número de veces, IUPAC recomienda
recurrir a la ecuación [6].
Como se muestra en la Figura 3, el LD se calcula mediante una prueba de hipótesis
estadística. En primer lugar se fija la concentración llamada nivel crítico (NC en la Figura
4), a partir de la cual se toman decisiones respecto de la detección del analito. Para
concentraciones superiores a NC, existe una probabilidad  de cometer el llamado error de
tipo I o falso positivo. Este último consiste en aceptar erróneamente la hipótesis alternativa,
admitiendo que el analito está presente cuando en realidad está ausente. Como se aprecia en
la Figura 1, la probabilidad de cometer este error de tipo I está dada por la zona sombreada
de azul (área ), siendo la "distancia" de LC al cero de la escala igual al producto de s0 por
el coeficiente t. Si se toma igual a 0,05, entonces una concentración superior a LC
tendrá sólo un 5% de probabilidad de constituir un falso positivo.
Figura 4.- Representación gráfica de la definicion moderna IUPAC para estimar el
límite de detección. NC es el nivel crítico, LD el límite de detección,  y  las
probabilidades correspondientes a errores de tipo I y II respectivamente, s0 el desvío
estándar del blanco (en unidades de concentración) y t y t los coeficientes de student
para  grados de libertad.
Del mismo modo, existe una probabilidad  de cometer un error de tipo II o falso
negativo, en el que se acepta erróneamente la hipótesis nula, admitiendo que el analito está
ausente cuando en realidad está presente (zona sombreada de rojo en la Figura 1, con
probabilidad igual a ). Si se toma también como 0,05, la probabilidad de obtener un
falso negativo será del 5%. En este caso la distancia de LC a la concentración
correspondiente a dicho valor de es el producto del coeficiente t por s0, considerando
que este último parámetro es muy cercano al desvío estándar en la concentración de una
muestra blanco.
Puede notarse entonces que el valor de LOD depende de  y , y de los desvíos
estándar de las dos curvas gaussianas de la Figura 1. En general, ambas probabilidades se
toman como iguales 0,05, mientras que los desvíos estándar se suponen ambos iguales a s0.
De este modo, el LOD está dado por:
LOD = 2  t0,05,m–2  s0
[7]
Definición que ha sido adoptada también por IUPAC e ISO. En la práctica, dado que m es
un número relativamente grande, el valor de (2t0,05,m–2) tiende a 3,28, por lo que una
ecuación aproximada para el límite de detección es LD = 3,28 s0.
Análogamente, el límite de cuantificación (LC) es la mínima concentración
cuantificable en forma confiable. Este parámetro se toma como la concentración
correspondiente a 10 veces el desvío estándar (en unidades de concentración) del blanco,
con lo cual:
LOQ = 10 s0
[8]
De este modo, el desvío estándar relativo (DSR) para una concentración igual al LC es
del orden del 10%, nivel que se toma convencionalmente como el máximo desvio estándar
relativo aceptable para cuantificar el analito en una muestra.
En la figura 5 se resumen las decisión tomadas a diferentes concentraciones.
Figura 5.- Representación gráfica de las decisiones tomadas en función de la
concentración
3. Métodos empíricos para la estimación del Límite de Cuantificación.
Límite de cuantificación basado en la desviación standard relativa (RSD) de la señal.
Este método considera la evidencia empírica de que la RSD de la señal aumenta cuando la
concentración disminuye.
El límite de cuantificación es la cantidad analítica para el cual la RSD de la señal neta del
análisis alcanza un nivel preestablecido (0.1 ó 0.05).
Se deben realizar análisis sucesivos a distintas concentraciones próximas al Límite de
Cuantificación. Se grafica la RSD de la señal neta como una función de la concentración
(gráfico logarítmico), entre el valor de LC esperado y 20-50 veces este valor. Se calcula la
regresión lineal en este gráfico y el LC será la concentración para el RSD preestablecido
(0,1 o 0,05)
A modo de ejemplo
Figura 6.- Desvio estándar relativo porcentual (%RSD) de la señal de Zn a 231nm obtenida
por ICP-AES en función de su concentración usando una escala log-log.
Resultan
Y
LC = 30 µ/l
LC = 60 µ/l
si RSD = 10%
si RSD = 5%
Límite de cuantificación del método o nivel mínimo
El LC se deduce del límite de detección del método (MDL), definido como la
concentración mínima de un analito que, en una matriz dada y con un método determinado,
tiene una probabilidad del 99% de ser identificado, determinado cualitativamente, e
informado como mayor que cero.
Se deben realizar al menos 7 replicados de una adición de analito al blanco, con
concentración entre 1 y 5 veces la esperada como límite de detección del método. Los
replicados deben procesarse a través de todas las etapas analíticas del método.
Considerando n replicados, se calcula la desvación standard s de las mediciones, y para n-1
grados de libertad y un nivel de confianza 1-α, resulta
A partir del MDL, se calcula el nivel mínimo, que resulta ser el límite de concentración:
Es de destacar que se trata de un límite muy realista, ya que considera la medición real de
concentraciones próximas al LC.
A diferencia del método anterior (de las desviaciones standard relativas), se está asumiendo
que la desviación standard es constante frente a la concentración.
Bibliografia
1.
Alejandro C. Olivieri, Héctor C. Goicochea, La calibración en la Química Analitica,
Ediciones UNL.
2.
K. Danzer y L. A. Currie, Guidelines for calibration in analytical chemistry. Part 1.
Fundamentals and single component calibration, Pure & Appl. Chem. 1998, 70, 9931014.
3.
W. P. Gardiner, Statistical analysis methods for chemists. A software-based approach,
The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1997.
4.
J. N. Miller y J. C. Miller, Estadística y quimiometría para química analítica, 4ta.
Edición, Prentice Hall, Madrid, 2002.
5.
C. A. Clayton, J. W. Hines y P. D. Elkins, Detection limits with specified assurance
probabilities, Anal. Chem. 1987, 59, 2506-2514.
6.
L. A. Currie, Detection and quantification limits: origins and historical perspective,
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L. A. Currie, Recommendations in Evaluation of Analytical Methods including
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8.
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9.
M. Valcárcel, Principios de química analítica, Springer-Verlag Ibérica, Barcelona,
1999, p. 81.
10. Mermet, J.M. Spectrochimica Acta part B 63 (2008), 166- 182.