cuantificacion de la expresion de los dos genes que codifican para

CUANTIFICACION DE LA EXPRESION DE LOS DOS GENES QUE CODIFICAN
PARA LA DESYODASA TIPO 3 EN Fundulus heteroclitus, ESTANDARIZACION
DEL PCR EN TIEMPO REAL. Olvera Vidal A. M.1, Mendoza Cisneros A.2, García
Gutiérrez M. C.2, Villalobos Aguilera P.2, Valverde Rodríguez C. M.2Orozco Rivas A.2,
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Facultad de Ciencias Naturales, Licenciatura en Biología Universidad Autónoma de
Querétaro 2. Laboratorio de Fisiología Evolutiva Instituto de Neurobiología,
Universidad Nacional Autónoma de México.
Resumen
Fundulus heteroclitus es un teleósteo eurihalino que cuenta con dos genes que
codifican para la desyodasa tipo 3 (D3); D3-a y D3-b. Se desconoce aún la importancia
fisiología de poseer dos genes que codifican para una misma proteína, así, como acercamiento
inicial para estudiar la función de estos dos genes, se propone cuantificar la expresión de
ambos genes en diferentes tejidos de F. heteroclitus. Las condiciones de PCR cuantitativo en
tiempo real propuestas en este trabajo nos permitirán realizar la cuantificación de la expresión
de los dos RNA mensajeros que codifican para la D3 en F. heteroclitus.
Antecedentes
Las hormonas tiroideas (TH, del inglés thyroid hormones) promueven el crecimiento y
desarrollo en todos los vertebrados. Además, en los organismos homeotermos, regulan la
producción de calor y energía. Las TH contienen entre el 59 al 65% del yodo del organismo y
por esa razón también se denominan yodotironinas. La biosíntesis de las dos principales TH,
la tetrayodotironina (T4) y la triyodotironina (T3) se sintetizan exclusivamente en la glándula
tiroides. El principal producto secretado por la tiroides es la T4, que puede ser activada o
inactivada en tejidos periféricos. La desyodación del anillo externo de la T4 genera T3 que es
la principal hormona activa. La desyodación del anillo interno produce T3 reversa (rT3), la cual
es metabólicamente inactiva.
Prácticamente todos los tejidos del organismo, expresan una familia de enzimas que
selectivamente desyodan TH y que por esa razón se denominan desyodasas de yodotironinas.
Por sus características operacionales y cinéticas se han identificado por lo menos tres
isoenzimas que catalizan estas vías de monodesyodación (Valverde et al 1998).
En mamíferos la desyodasa tipo I (D1) es más abundante en el hígado, riñón y en la tiroides,
cataliza la desyodación de los anillos externo e interno, y sus sustratos preferenciales son la
rT3 y tironinas sulfatadas (Sanders et al. 1999). La desyodasa tipo II (D2) solo cataliza
desyodación del anillo externo de la T4. La D2 se expresa predominantemente en el cerebro,
hipófisis, y tejido adiposo de los mamíferos, así como en la tiroides y músculo esquelético y
el corazón humano. La desyodación del anillo interno de la T4 produce rT3. La vía de
desyodación del anillo interno o de inactivación esta catalizada por la desyodasa tipo 3 (D3).
Este isotipo enzimático desyoda exclusivamente el anillo interno de las yodotironinas y su
expresión es muy abundante en la placenta, el sistema nervioso y la piel. Como en el caso de
la D1, la actividad de la D3 aumenta en el hipertiroidismo y diminuye en el hipotiroidismo. El
papel fisiológico de la D3 es fundamental durante la ontogenia del organismo. En mamíferos
la D3 se expresa en el cerebro, piel, placenta y tejidos fetales (Koopdonk-Kool et al. 1996). La
actividad de la D3 determina en tiempos precisos (periodos críticos del desarrollo) y en
regiones específicas del cerebro, la exposición a concentraciones apropiadas de T3. (Sanders
et al. 1999).
Estudios realizados en el laboratorio de Fisiología Evolutiva (INB) mostraron la
presencia de dos genes diferentes (D3-a y D3-b), que codifican para la D3 en Fundulus
heteroclitus. Estos dos genes se encontraron con oligonucleotidos degenerados diseñados a
partir de una región muy conservada en las D3 de diferentes especies reportadas en el banco
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de genes; estos oligonucleotidos produjeron dos secuencias diferentes de 387 pb las cuales
corresponden a productos de dos genes diferentes que codifican para la D3 en F. heteroclitus.
Hasta ahora se desconoce el papel fisiológico de los dos genes que codifican para esta misma
proteína en esta especie de estudio.
Objetivo
Estandarizar y optimizar las condiciones de temperatura, tiempos de alineación y
síntesis para el PCR en tiempo real que permitan cuantificar la expresión de cada gen (D3-a y
D3-b) que codifica para la D3 en diferentes tejidos de F. heteroclitus.
Materiales y Métodos
Para la realización de este proyecto se utilizaron métodos estándar de biología
molecular (current protocols)
Estandarización de condiciones en el Light Cycler. Para cuantificar (PCR cuantitativo en
tiempo real) los dos RNAm (D3-a y D3-b) que codifican para la desyodasa tipo 3 en F.
heteroclitus se estandarizaron las condiciones de temperatura, tiempos de alineación y
síntesis. Los fragmentos conocidos de cada gen D3-a y D3-b obtenidos con anterioridad
fueron ligados a un vector (pGMET) y transformados en células competentes de E. coli. Se
purificaron los plasmidos y se determino la concentración en el espectrofotómetro UV-visible
a 260nm, a partir de esta concentración (μg/μl) se calculó la concentración de los plasmidos
en moléculas/μL con la siguiente fórmula: moléculas/μl=(concentración en g/l) / PM (no.
Avogadro) / 1e6. Para determinar la temperatura ideal de alineación de cada gen se realizo un
PCR de gradiente de temperatura, el termociclador genera un gradiente el cual elegimos fuese
de 54°C a 64°C, usando oligonucleotidos diseñados específicamente para cada gen: cD3-1 5`GCCAGGACAGGCCCGGAC y cD3-2 5`CTCGATGTACACAACCAAGAA para D3-a y
gD3-3 5`-CAGGGAGGCGATGCCATT y gD3-4 5`-CGATGTACACCACCGCCGT para
D3-b. El resultado de este PCR se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se
realizó la misma reacción de PCR pero en tiempo real en el Light Cycler para observar cual
era la temperatura adecuada para cada gen. Con base a las concentraciones calculadas, se
prepararon los distintos puntos de la curva haciendo diluciones del plasmido purificado y
estos fueron utilizados como templados en reacciones de PCR en tiempo real para generar la
curva estándar para cada uno de los genes.
Animales. Se utilizaron peces F. heteroclitus machos y hembras de 2 a 4 gr. de peso.
Los peces fueron mantenidos en el bioterio del INB en estanques con agua de mar, a
condiciones de temperatura ambiente entre 22 y 24°C, bajo ciclos de luz oscuridad 14:10 hrs.
Antes del sacrificio (decapitación) los peces fueron tratados con 100nm de T3 aplicada por
inmersión durante 24 hrs. Los animales se sacrificaron y se les extirpó el estomago, el hígado,
el cerebro, las branquias, la piel, y los ojos.
Extracción de RNA. El RNA total se extrajo utilizando el reactivo Trizol. La pureza
del RNA se comprobó por electroforesis en gel de agarosa al 1% y la concentración se midió
en el espectrofotómetro UV-Visible.
Obtención de DNA complementario. Se realizó una trascripción reversa (RT-PCR)
para obtener el DNA complementario (cDNA) de los dos RNAm de los genes D3-a y D3-b,
usando 10μg de RNA total y un oligonucleotido d(T). Los RT´s se congelaron a -60 °C hasta
realizar la cuantificación del mRNA.Se realizó el PCR cuantitativo usando como templado el
cDNA de hígado y piel obtenidos del RT-PCR. Como control positivo se utilizó un estándar
de concentración 1e7 para cada gen y oligonucleotidos específicos CD3-1 y CD3-2 para D3-a
y GD3-3 y GD3-4 para D3-b. Se varió la temperatura de síntesis hasta encontrar las mejores
condiciones para lograr la cuantificación de los dos mensajeros de D3.
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Resultados
PCR de gradiente de temperatura: Los dos fragmentos de la secuencia conocida para
cada gen amplificaron en las diferentes temperaturas de alineación para la reacción de PCR en
el termociclador siendo 7 diferentes temperaturas: 54.2, 55.7, 58.1, 60.7, 62.9, 63.9 y 56.8°C.
La electroforesis de esta reacción de PCR mostró la amplificación de los 2 fragmentos de la
secuencia conocida para cada gen que pesan 387pb. En la reacción de PCR en tiempo real se
encontró una temperatura específica a la cual cada gen mostró una mayor amplificación,
siendo de 58°C para D3-a y de 60°C para D3-b.
Construcción de la curva estándar: En base a las concentraciones de los plasmidos que
contenían los fragmentos de las secuencias conocidas de cada gen (D3-a y D3-b) y la
temperatura de alineación específica, las diluciones realizadas fueron de 5 puntos: 1e4, 1 e5, 1
e6
, 1 e7 y 1 e8 moléculas/μL. Con estos puntos se realizó una reacción de PCR en tiempo real y
la curvas resultante se muestra en la fig 1.
FG. 1. Se observan la curva de los estandares para D3-a y D3-b, realizada en un PCR en tiempo real..
Extracción del RNA total: La concentración de RNA total de todos los tejidos
extraídos se muestra en la tabla 1. La concentración de RNA para cada tejido fue variable
siendo más abundante en estomago e hígado.
Tabla 1. Concentración de RNA total en μg/μl de diferentes tejidos en F. heteroclitus.
Tejidos
Concentración
Estómago
Cerebro
Branquia
Hígado
Piel
Ojo
0en μg/μl
4.658
1.618
0.306
2.833
0.534
1.555
Tabla 2. Condiciones optimas de amplificación en hígado y piel.
D3-b
temp/tiempo
D3-b
temp/tiempo
desnaturalización 94°C-3 seg. desnaturalización 94°C-3 seg.
alineación
58°C- 5 seg.
alineación
60°C- 5 seg.
síntesis
72°C-15 seg.
síntesis
72°C-15 seg.
Cuantificación de la concentración de RNA de los genes que codifican para la D3.
Con las condiciones establecidas anteriormente, las cuales se muestran en la tabla 2, se
amplificaron los mRNAs que codifican para D3-a y D3-b en hígado y en piel (fig.2; tabla 3),
D3-a muestra una mayor expresión en hígado y piel comparada con D3-b.
Tabla 3. Concentración del los RNAm de la D3 en hígado y piel de F. heteroclitus.
Muestra
Hígado D3-a
Duplicado Híg. D3-a
Piel D3-a
Duplicado Piel D3-a Std. 1E7 D3-a
Duplicado Std 1E7D3a
Concentración
7.90E12
5.97E12
5.42E7
Muestra
Hígado D3-b
Duplicado Híg. D3-b
Piel D3-b
5.40E7
Duplicado Piel D3b
Std. 1E7 D3-b
9.45E6
Duplicado Std 1E7D3b
Concentración
1.04E17
1.14E17
8.85E6
7.40E6
9.46E6
1.06E7
1.06E7
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Fig. 2 Curvas de amplificación por duplicado para D3-a (1) y D3-b (2) respectivamente. La D3-a en el estándar
1e7, 1b D3-a en hígado, 1c D3-a en piel, 1d negativo. 2a. D3-b en el estándar 1 e7, 2b. D3-b en hígado, 2c D3-b
en piel, 2d negativo.
Discusión
Aunque cercanas, las temperaturas de alineación para cada gen (D3-a Y D3-b) son
específicas. Con esta temperatura se logró realizar la curva la cual se usa como estándar
externo al interpolar los resultados que nos arroje la amplificación del mRNA en el Light
Cycler. Por otra parte cuando se realice la cuantificación de los dos mensajeros en los
diferentes tejidos de F. heteroclitus esta se corregirá con la de la actina, un gen constitutivo.
Claro esta que al momento de llevar acabo la cuantificación de estos dos mRNA en esta
especie, el método se puede complicar debido a que las concentraciones de los mRNA de la
D3 son variables y en ciertos tejidos la expresión es muy baja, lo cual dificulta la
amplificación, esto se podría resolver haciendo un PCR convencional antes de realizar la
amplificación en el Light Cycler. Las condiciones de PCR en tiempo real se obtuvieron
haciendo repeticiones de este experimento así como también variaciones del tiempo requerido
en desnaturalización, alineación y síntesis. El hígado y la piel mostraron una diferencia en
cuanto a la expresión de los genes y estos a su vez mostraron una expresión diferente siendo
la D3-a el gen más expresado.
Conclusión
Establecer las condiciones de PCR cuantitativo en tiempo real nos permitirán realizar
la cuantificación de la expresión de los dos RNA mensajeros que codifican para la D3 en F.
heteroclitus. El desarrollo de esta metodología es necesario para tratar de describir el papel
fisiológico de dos genes que codifican para una misma proteína, la D3.
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