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Tratamientos combinados de la biomasa forestal para la obtención de bioetanol
HERNÁNDEZ, G.1, MARTIN, J.A.2, MATA, Y.1, MARTÍN, R.2. TERRÓN, M.C.1,
CARBAJO, J.M.2, SANTOS, S.2, EUGENIO. M. E. 2, VILLAR, J.C.2, GONZÁLEZ, A.E.1
1. CIB-CSIC, Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid;
2. CIFOR-INIA, Crta. de la Coruña Km. 8, 28040 Madrid
Resumen
La producción de combustibles de primera generación se ha basado en la utilización de
cereales, caña de azúcar y remolacha como materias primas. Los azucares presentes en estos
productos son fácilmente accesibles y procesables mediante la adaptación de los
procedimientos tradicionales de fermentación alcohólica. No obstante, el empleo de materias
primas alimentarias ha sido duramente criticado desde puntos de vista éticos y económicos
impulsando a investigar intensamente sobre materias primas alternativas. La producción de
combustibles de segunda generación usando material lignocelulósico procedente de la
biomasa forestal se ha considerado una buena alternativa, sin embargo, estos procesos
presentan una serie de inconvenientes relacionados con la composición y estructura de dicho
material. Dentro de ellos cabe destacar que la glucosa esta presente en forma de celulosa
cristalina que debe ser despolimerizada para ser accesible a la fermentación. Por otro lado la
lignocelulosa contiene importantes cantidades de hemicelulosa que incorpora azucares
refractarios a la fermentación y la presencia de lignina dificulta el tratamiento ya que es
responsable de la compactación del material. Por tanto la producción de biocombustibles de
segunda generación a partir de biomasa debe minimizar dichos problemas. La biomasa debe
ser pretratada termoquimicamente para despolimerizar parcialmente la lignina y desarticular
la estructura de la celulosa. El material pretratado debe ser sometido a una digestión
enzimática para liberar la glucosa, la cual será fermentada mediante levaduras o bacterias
produciendo bioetanol y materias primas. No obstante el pretratamiento termoquímico es
energéticamente caro, ambientalmente agresivo y produce compuestos que inhiben el
tratamiento enzimático y el proceso de fermentación. En el presente trabajo se investiga el uso
enzimas producidas por hongos basidiomicetos utilizando las capacidades de cepas mono y
dicariontes y explorando la elasticidad de su expresión genica en función del medio en que se
desarrollan para su implimentación en el proceso.
Palabras Clave
Lignocelulosa, biocombustibles, hongos, enzimas ligninolíticas.
1. Introducción
Producción de Biocombustibles.
La producción de Biocombustibles ha estado basada de manera habitual en el uso de
cereales, de maíz, de azúcar de caña y remolacha como materia prima para la obtención de los
llamados combustibles de primera generación (GALBE y ZACCHI. 2007; GRAY, et al.
2006). El azúcar presente en estos productos es fácilmente accesible y adaptable a los
procesos tradicionales de fermentación alcohólica. Sin embargo el uso de alimentos para el
consumo humano y animal que afectan directamente a las cadenas tróficas para la obtención
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de proteína animal como materia prima ha sido fuertemente cuestionado desde puntos de vista
económicos y éticos. Además dichos proceso repercute directamente en zonas con escaso
desarrollo científico y tecnológico. Adicionalmente la variedad en la alimentación de la
población de estas zonas es sustancialmente dependiente de estos alimentos que conforman
su fuente de nutrientes principal.
Los combustibles de segunda generación se producen empleando materiales
lignocelulósicos tales como paja de cereales o residuos de la industria forestal como materia
prima (ZALDIVAR et al. 2001). El empleo de éstas, implican solventar una serie de retos que
dificultan el proceso de obtención del biocombustible: (I) Una fracción importante de la
glucosa se encuentra en forma cristalina que debe ser primero despolimerizada para dar lugar
a sus monómeros fermentables, (II) la lignocelulosa contiene importantes cantidades de
hemicelulosa que incorporan algunos azucares refractarios a los procesos de fermentación
tradicional como las pentosas y (III) la presencia de lignina dificulta los tratamientos porque
actúa como material compactante de la estructura del complejo lignocelulósico.
La producción industrial de biocombustibles de segunda generación incluye varios
pasos que pueden sintetizarse en los siguientes: (I) la materia prima es pretratada termomecánicamente para alcanzar un nivel de desestructuración parcial de la lignina y el
debilitamiento de la estructura cristalina de la estructura de la celulosa (BALLESTEROS et
al. 2006; GALBE y ZACCHI, 2007), (II) el material pretratado es sometido a una digestión
enzimática con celulasas para liberar la glucosa fermentable principal objetivo de esta etapa y
(III) la glucosa es fermentada por procedimientos clásicos utilizando levaduras o bacterias
para la obtención de etanol o metano. Por ultimo, es necesario destilar el alcohol para obtener
el biocombustible final. La naturaleza de la materia prima y los correspondientes
pretratamientos que se le apliquen son de capital importancia para reducir el coste de esta
etapa final, problemas que hasta el momento tienen algunos tipos de bioalcohol generados,
por ejemplo, a partir de caña de maíz.
Sin embargo, quedan numerosas cuestiones que resolver dentro de esta tecnología entre
las que hay que considerar principalmente:
- El pretratamiento termo-químico es energéticamente costoso, ambientalmente agresivo
porque genera contaminantes que tienen efectos en sus efluentes y productos, generando
adicionalmente compuestos que presentan efectos inhibitorios sobre las enzimas a emplear en
la etapa siguiente y sobre los procesos de fermentación (KLINKE et al. 2003; KLINKE et al.
2004).
- La fermentación de las pentosas contenidas en la hemicelulosa requieren del uso de
microorganismos que aun no están suficientemente bien adaptados a los procesos industriales,
los que reducen drásticamente la producción de los procesos afectando los factores de
convertibilidad de los mismos. (HAHN-HÄGERDAL et al 2007; JEFFRIES, 2006).
Degradación de la lignocelulosa por hongos basidiomicetos de pudrición blanca.
Los hongos basidiomicetes degradadores de lignina, han sido clasificados como hongos
de pudrición blanca y comúnmente su hábitat se encuentra en ecosistemas forestales,
fundamentalmente en la hojarasca y en los troncos de árboles en pie como parásitos o caídos
como saprofitos. Son eficientes depolimerizando, degradando o mineralizando todos los
componentes de la pared celular vegetal, incluyendo la celulosa y hemicelulosa y
fundamentalmente la lignina, biopolímero mas recalcitrante a la degradación. (LEONOWICZ
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et al. 1999). En este sentido, los hongos de pudrición blanca juegan un papel crucial en la
dinámica del ciclo del carbono. Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor,
Pleurotus ostreatus,
Pycnoporus cinnabarinus, son los hongos ligninolíticos mas
extensivamente estudiados hasta el momento. Nuestro grupo de investigación ha incorporado
recientemente Pycnoporus sanguineus (EUGENIO et al. 2007) una especie termófila que ha
sido aislada en las regiones más cálidas de Colombia. Su capacidad para desestructurar el
material lignocelulósico depende de la naturaleza y cantidad de las enzimas extracelulares que
producen. Este hecho ha dado lugar a su clasificación en dos grandes grupos según produzcan
degradación selectiva de la lignina o extensiva de los tres polímeros principales del complejo
(CULLEN y KERSTEN, 2004).
La lignina es degradada principalmente por las lignin peroxidasas (LiP, E.C. 1.11.1.14),
manganeso peroxidases versátiles (MnPV, EC 1.11.1.16), manganeso peroxidasas (MnP, E.C.
1.11.1.13), y fenol oxidasas (Pox) también conocidas como lacasas (E.C. 1.10.3.2)
(HATAKKA, 1994; KERSTEN y CULLEN, 2007). Este grupo de de exoenzimas oxidantes
se complementa con otro grupo tales como la aril alcohol oxidasas (AAO, E.C. 1.1.3.7)
(ANDER y MARZULLO, 1997), superóxido dismutasa (SOD, E.C. 1.15.1.1), glioxal oxidasa
(GLO E.C. 1.2.3.5), celobiosa dehidrogenasa (CDH, E.C. 1.1.99.18) (IGARASHI et al. 1998;
ZALDIVAR et al. 2001), y otras que proveen algunos de los substratos usados en las
correspondientes reacciones (LEONOWICZ et al. 1999). Por otro lado la Celulosa, es
degradada por endoglucanasas que atacan las zonas amorfas y las celobiohidrolasas que son
exocelulasas que producen disacáridos como la celobiosa desde el final reducido (tipo I) o no
reducido (tipo II) de la celulosa. La degradación final de la celobiosa es levada a cabo por las
β- glicosidasas. Los procesos de biodegradación de la lignocelulosa han sido revisados
extensamente (LEONOWICZ et al. 1999; MARTINEZ et al. 2004; CULLEN y KERSTEN,
2004; KERSTEN y CULLEN, 2007).
Las lignin peroxidasas (LiP) son glicoproteínas que rompen los enlaces Cα-Cβ en los
compuestos modelo tipo ligninoles dependiendo del H2O2, haciendo posible la
depolimerización de la lignina metilada in vitro (TIEN y KIRK, 1983). Se han aislado varias
isoenzimas catalíticamente diferentes (CULLEN y KERSTEN, 2004) y se han encontrado
hasta diez genes lip siendo descrita su compleja regulación en P. chrysosporium (MARTINEZ
et al. 2004). Genes lip no han sido encontrados en otras especies como P. ostreatus. La
Manganeso peroxidasa (MnP) oxida Mn+2 to Mn+3 usando H2O2 como oxidante (GLENN y
GOLD, 1985). Su actividad es incrementada por la presencia de ácidos orgánicos
dicarboxílicos estabilizando el Mn+3 (GLENN y GOLD, 1985). Seis genes mnp han sido
identificados en el genoma de P. chrysosporium (MARTINEZ et al. 2004) uno de ellos es
similar a la MnPV descrita en P. eryngii. En P. ostreatus, se han caracterizado tres genes
mnp; dos de ellos corresponden a MnPV (KAMITSUJI et al. 2005). Finalmente, las
fenoloxidasas (lacasas) catalizan la transferencia de un electrón de los fenoles, aminas
aromáticas y otro de un sustrato rico en electrones con la reducción de O2 a H2O
(BALDRIAN, 2006). No se han encontrado genes que codifiquen para lacasa en el genoma de
P. chrysosporium mientras que hasta ocho genes pox han sido encontrados en un BAC
clonado de una cepa de P. ostreatus secuenciada en nuestro laboratorio. La reciente
liberación del genoma de P. ostreatus (febrero 2009) por el Joint Genome (USA) nos
demuestra la presencia de 12 genes de lacasa y 8 entre mnp y mnpv(34), lo que abre el
potencial de las capacidades genéticas de esta especie y demuestra la coherencia que nuestros
resultados preliminares (SANTOYO et al. 2008).
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Pretratamientos de lignocelulosa como materia prima para la producción de bioetanol con
hongos.
Los problemas causados por los pretratamientos termo-químicos de la lignocelulosa
como materia prima han impulsado la investigacion por alternativas basadas en tratamientos
biológicos o tratamientos combinados. Los hongos de pudrición blanca son una respuesta
clara a este problema, por su actividad lignocelulolítica específica (KERSTEN y CULLEN,
2007). Hay muy pocos artículos que describan el uso de hongos de pudrición blanca en el
pretratamiento de maderas blandas (LEE et al. 2007) y alguno que describe el empleo de P.
ostreatus para el pretratamiento de paja de trigo (TANIGUCHI et al. 2005).
2. Objetivos
El principal objetivo de este trabajo es el estudio del uso de hongos en el tratamiento de
materiales lignocelulósicos para la producción de biocombustibles. La actividad de los hongos
de podredumbre blanca consiste principalmente en la degradación de la lignina y en la
estructura cristalina de la celulosa con el fin de poder acceder a los nutrientes que necesitan
para su desarrollo. En esta línea se llevará a cabo un estudio preliminar diferenciado en dos
aspectos, por un lado se estudiará la producción de las enzimas ligninolíticas por
determinadas cepas de hongos de pudrición blanca, y por otro el crecimiento de un hongo
celulolítico sobre distintos sustratos para determinar sus posibilidades de uso sobre distintos
tipos de materias primas. Los resultados obtenidos de este estudio nos van a ofrecer
información valiosa para construir nuevas variedades generadas para que hagan eficiente y
selectivamente viable el bio-pretratamiento de la materia prima sometida a estudio.
Como modelo de producción de enzimas ligninolíticas se estudiarán los sistemas
basados en Pleurotus ostreatus. Para el estudio del desarrollo de un hongo celulolítico sobre
distintos materiales se seleccionaron cepas de hongos Thichoderma.
3. Metodología
Materias primas lignocelulósicas
Se prepararon distintos tipos de materia prima lignocelulósica con el fin de analizar la
posibilidad de crecimiento de los hongos sometidos a estudio sobre las mismas. Los
materiales preparados fueron:
- Astillas de Pinus radiata de tamaño fósforo.
- Astillas de Eucaliptos globulus de tamaño fósforo.
- Serrín de Pinus radiata.
- Serrín de Eucaliptus globulus.
- Gasa de uso farmacéutico.
- Algodón.
- Celulosa de Pinus radiata (Papel obtenido por el proceso Kraft).
Tanto la madera procedente de Pinus radiata como de Eucaliptus globulus se
descortezó manualmente, tras lo cual fué astillada en una astilladora semi-industrial de
volante con dos cuchillas. Las astillas se tamizaron a continuación eliminando las retenidas
por un tamiz de agujeros de 30 mm de diámetro y las que atravesaban uno de 8 mm. Para
reducir el tamaño de las mismas se empleó un refinador de laboratorio “Sprout-Waldron” con
una guarnición de discos de púas C2975, ajustados a la separación mínima. Parte del material
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tanto de pino como de eucalipto se molió empleando un molino de martillos y posteriormente
se tamizó. Para los experimentos con celulosa se utilizo gasa para uso farmacéutico, algodón,
celulosa de pino obtenida por proceso Kraft,
Cepas de hongos
Se han utilizado 20 cepas de monocariontes de Pleurotus ostreatus todas ligninolíticas.
Para determinar las capacidades de crecimiento en distintas materias primas se utilizaron 7
cepas del hongo Trichoderma.
Cultivo de los monocariontes
La replicación de las cepas de los monocariontes se hizo con la finalidad de seguir
preservándolas y para tener material de trabajo en los posteriores experimentos. Para la
preparación del medio de cultivo se pesó Agar extracto de Malta al 2% y agar bacteriológico
en la misma proporción. El medio se esterilizaró en autoclave a 110º C durante 15 minutos.
Se prepararon las placas en una campana de flujo laminar previamente esterilizada con luz
U.V y etanol. Transcurrido el tiempo suficiente como para que se gelificaran se procedió a
etiquetarlas y sembrarlas. Las placas se dejaron a la temperatura ambiente del lugar,
aproximadamente 24 °C. Como medio líquido para trabajar los monocariontes y la
producción de las enzimas se eligió el medio 7, el cual se esteriliza a 110 ºC durante 15
minutos en autoclave. Para los preinóculos se prepararon 264 ml de medio, mismos que
fueron divididos en 6 matraces de 250 ml y sobre los cuales fue vertida la placa de agar con el
hongo crecido.
Con el fin de depositar el agar y el hongo a la placa se tuvo que cortar el agar en trozos de
aproximadamente 1 cm2 con la ayuda de un escalpelo.
Producción de las enzimas.
Se obtuvieron los crudos enzimáticos de los días con mayor actividad de lacasa,
manganeso peroxidasa y alcohol aril oxidasa, desarrollados en medio 7 (alto en nitrógeno).
Se determinaron las actividades de acuerdo con el procedimiento seguido por Santoyo y col.
(SANTOYO et al. 2008)
Análisis de la actividad enzimática
Las actividades enzimáticas se midieron a temperatura ambiente. La unidad de actividad (UA)
se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir un 1 µmol de producto en un
minuto. La actividad lacasa fue medida mediante el método de 2-6 dimetoxifenol: el método
utilizado se basa en la oxidación del 2-6 dimetoxifenol (ε0=49600 M-1 cm-1) en ausencia de
peroxido. Este sustrato se diluye en tampón acetato 0,1 M (pH 5.0) hasta concentración final
de 1mM en la mezcla de reacción. El incremento de absorbancia se mide en una longitud de
onda de 468 nm durante 1 minuto en el espectrofotómetro. La manganeso peroxidasa se midió
en la misma cubeta que se hizo la determinación de la actividad de la lacasa, siguiendo el
experimento, es decir solo se añadía MnSO4 y después H2O2 esto en intervalos de 1 minuto
midiendo a la misma longitud de onda. La Aril-alcohol oxidasa (AAO) se midió a temperatura
ambiente en tampón fosfato 100 mM, pH 6.0 y con alcohol veratrílico 10 mM como sustrato
en condiciones estándar. Esta enzima chata liza la reacción oxidando el alcohol veratrílico en
presencia de oxigeno a veratraldehído y produce agua oxigenada. Este ensayo enzimático es
continuo y por lo tanto se realiza directamente en la cubeta del espectrofotómetro midiendo el
incremento del valor de absorbancia a 310 nm durante un tiempo determinado. El valor de ε0
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para calcular la concentración de veratraldehído fue de 9300 M-1cm-1. Para cuantificar la
actividad se usa la unidad internacional (μmol/min).
Crecimiento de Trichoderma sobre diferentes sustratos en medio sólido y líquido
Se pretende determinar los sustratos y condiciones en los cuales Trichoderma es capaz
de mostrar un mejor crecimiento además de la cantidad de azúcares reductores que pueda
liberar el medio, teniendo en cuenta que parte de esos azúcares se consumen por el hongo para
su metabolismo. A continuación se muestra la Tabla 1 con las condiciones de siembra para el
Trichoderma con el cual se ha realizado el trabajo.
Análisis de azúcares reductores
Los azúcares reductores en las disoluciones obtenidas a partir de las distintas materias
primas tratadas con Trichoderma se determinaron por el método del ácido bicincónico (COPA
PATIÑO et al. 1993).
Tabla 1. Condiciones de siembra de Trichoderma
Medio
sustrato
Agar bacteriológico al 2%
Algodón
Agar bacteriológico al 2%
Gasa
Agar bacteriológico al 2%
Papel de Pinus radiata
Agar bacteriológico al 2%
Papel de Eucalyptus globulus
Agar bacteriológico al 2%
Carboximetilcelulosa
Agar
Agar
Agar extracto de malta
Agar extracto de malta
Agua
Astillas de Pinus radiata
Agua
Astillas de Eucalyptus globulus
Agua
Fosforitos de Pinus radiata
Agua
Fosforitos de Eucalyptus globulus
Agua
Serrín de Pinus radiata
Agua
Serrin de Eucaliptus globulus
Agua
Papel de Pinus radiata
Agua
Papel de Eucalyptus globulus
Agua
Gasa
Agua
Algodón
Medio Kirk modificado
Astillas de Pinus radiata
Medio Kirk modificado
Astillas de Eucalyptus globulus
Medio Kirk modificado
Fosforitos de Pinus Radiata
Medio Kirk modificado
Fosforitos de Eucalyptus globulus
Medio Kirk modificado
Serrín de Pinus radiata
Medio Kirk modificado
Serrin de Eucaliptus globulus
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Medio Kirk modificado
Papel de Pinus radiata
Medio Kirk modificado
Papel de Eucalyptus globulus
Medio Kirk modificado
Gasa
Medio Kirk modificado
Algodón
Identificación de la especie del Trichoderma
Haciendo uso de un microscopio óptico y con una cámara especial que lograba una
mejor definición de la morfología del hongo Tri-7 se identificó morfológicamente la especie
de este hongo.
4. Resultados
Producción de enzimas.
Se obtuvieron distintos crudos enzimáticos producidos por las 20 cepas de Pleurotus
ostreatus,. Se analizó la actividad lacasa, manganeso peroxidasa y aril alcohol oxidasa a
diferentes tiempos. La Aril-alcohol oxidasa es una enzima que aporta producción de H2O2
para la actividad de las peroxidasas. Los caldos una vez concentrados alcanzaron los niveles
de actividad ligninolítica que se presentan a continuación.
Tabla 2. Producción máxima de enzimas ligninolíticas en 20 cepas de Pleurotas ostreatus.
Cepa
Máxima
actividad
Lacasa (U.A.)
Dia
Máxima actividad
Manganeso
Peroxidasa (U.A.)
Dia
Máxima actividad
Aril Alcohol
Oxidasa (U.A.)
Dia
1
0,0342
10
0,001
4
0,10245
14
2
0,0069
8
0,00165
10
0,02005
8
3
0,01
12
0,00085
14
0,39795
28
4
0,00735
4
0,0047
30
0,0186
30
5
0,01855
4
0,01095
10
0,0267
14
6
0,02485
4
0
0
0,00605
16
7
0,0662
12
0,0024
6
0,0554
24
8
0,0003
12, 14, 16
0,00015
4, 20
0,00085
12
9
0,00035
6
0,00185
6
0,00405
6
10
0,0022
6
0,00045
12
0,0009
16
11
0,0219
4
0,0001
2
0,0041
12, 16
12
0,0073
30
0,01365
22
0,00565
22
13
0,00025
10
0,0002
6
0,00015
10
14
0,01985
22
0,00005
2
0,01985
22
15
0,0058
14
0,00035
6
0,5442
14
16
0,01705
8
0,0002
4
0,09355
14
9/15
17
0,0416
22
0,0027
6
0,0416
22
18
0,029
24
0,0003
4
0,029
24
19
0,003
10
0,0002
4
0,00135
14
20
0,0172
4
0,00405
28
0,01105
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Como se ha puede observar en la Tabla 2 se producen cantidades variables de las
enzimas ligninolíticas, tanto lacasa como manganeso peroxidasa en todas las cepas sometidas
a estudio en las condiciones de cultivo empleada. Esto permite confirmar la potencialidad de
estos microorganismos para participar de forma evidente en la desestructuración de la matriz
lignocelulósica para los procesos posteriores que puedan dar lugar a la producción de
bioetanol. Ya que la cantidad de manganeso peroxidasa obtenida en la mayoria de los
experimentos es inferior a la actividad producida por la lacasa en cada una de las cepas, se
llevó a cabo un experimento empleando un colorante como Poly R46 el cual es decolorado
especificamente en medio sólido por esta enzima (GOLD et al. 1988).
En la Figura 1 se muestra el comportamiento de 80 monocariontes de Pleurotas
ostreatus frente a este colorante, siendo los resultados coincidentes con los obtenidos en el
análisis de la actividad enzimática de las cepas mostrado en la Tabla 1.
Figura 1. Crecimiento de 80 monocariontes de P. ostreatus frente al colorante Poly R 476
Crecimiento de los Trichoderma en placa en medio sólido y en medio líquido
Con el fin de determinar la capacidad del crecimiento de hongos productores de
enzimas celulólíticas tales como Trichoderma se sembraron varias cepas en placas de agar y
como fuente de carbono se emplearon los siguientes sustratos tal y como se han detallado en
la Tabla 1: algodón, gasa, Pinus radiata, Eucalyptus globulus, carboximetilcelulosa, agar
(control negativo) y Agar Extracto de malta (control positivo). Tres días después de la
siembra se identificaron los sustratos en los cuales hongos se desarrollaba de forma más
significativa, siendo algodón, gasa, serrín de Eucalyptus globulus así como agar extracto de
malta, los que ofrecieron mejores resultados. En la Figura 2 se muestran diferentes ejemplos
del crecimiento sobre alguno de los sustratos estudiados. Es importante mencionar que los
hongos también crecieron en sólo agar, es decir, sin ninguna fuente de carbono extra,
indicando que con una aportación mínima de nutrientes es capaz de desarrollarse. Respecto al
medio líquido Kirk modificado y agua, se desarrollaron de mejor forma en medio Kirk
modificado en condiciones estáticas, ya que la agitación podría de interferir el crecimiento de
los hongos. En el agua como medio de cultivo con las diferentes fuentes de carbono también
crecieron los Trichoderma, pero el desarrolló fue menor que en el medio Kirk modificado.
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Trichoderma harzianum es una cepa que presenta una alta actividad celulolítica y crece
vigorosamente sobre gasa y pasta de Eucalipto. Presentando alta actividad celulasa, también
se ha confirmado que es capaz de desarrollarse sobre determinados sustratos pretratados
donde hay mayor presencia de lignina y hemicelulosa y los resultados son concluyentes el
hongo es capaz de crecer aun teniendo este tipo de barreras para acceder a la celulosa.
a
b
Figura 2. Crecimiento de Trichoderma sobre dos sustratos: (a) gasa y (b) serrín de Pinus radiata
Los experimentos llevados a cabo para determinar el contenido en azúcares reductores
en determinados sustratos tratados previamente con el hongo, indican la existencia de
azúcares reductores y que en los casos de celulosa, algodón y la gasa, la liberación de
azúcares reductores se produce exclusivamente por la acción de las enzimas secretadas por el
Trichoderma. A continuación se muestran la Tabla 3 y la Figura 3 en las que se detallan las
muestras estudiadas y el contenido en azúcares reductores liberados al medio de las mismas.
Tabla 3. Azúcares reductores en algunos medios donde se desarrollo el hongo Trichoderma..
Número de
muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Muestra
Absorbancia
Fosforito de Pinus radiata en agua
Astillas de Eucalyptus globulus en agua
Papel de Eucalyptus globulus en agua
serrín de pino en agua
Fosforitos Eucalyptus globulus en agua
serrín de Eucalyptus globulus en agua
Papel de pino en M. Kirk estático
Gasa en M.Kirk en agitación
Gasa en M.Kirk en estático
Papel Eucalyptus globulus M. Kirk estático
Papel de pino en agua y estático
serrín de pino en M.Kirk estático
Gasa en agua y en agitación
serrín Eucalyptus globulus M. Kirk agitado
Algodón en M. Kirk estático
Algodón en M. Kirk agitado
0.81
1.585
0.08
0.553
1.979
1.796
0.119
0.037
0.203
0.045
0.196
0.31
0.002
0.984
0.208
0.3
Azúcares en
µmol/ml
31.71900826
63.74380165
1.553719008
21.09917355
80.02479339
72.46280992
3.165289256
0.0
6.636363636
0.107438017
6.347107438
11.05785124
0.0
38.90909091
6.842975207
10.6446281
11/15
Azúcares reductores, μmol/mL
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Figura 3. Comportamiento de algunos sustratos en la liberación de azúcares reductores.
Identificación de la especie de Trichoderma
Se llevó a cabo una identificación de las cepas utilizadas mediante un microscopio de
alta resolución. Para ello se analizaron las esporas y se observó la forma de sus conidios. En
función de su morfología y de acuerdo a la bibliografía se dedujo que se trataba de
Trichoderma harzianum (Figura 4). Cabe mencionar que este tipo de hongos se desarrollan
rápidamente, en comparación de los Basidiomicetos que necesitan semanas para obtener un
crecimiento aceptable y por ello los Trichoderma son los competidores naturales de algunos
hongos Basidiomicetos en cultivo como P.ostreatus..
a
b
Figura 4. Conidióforos de Trichoderma harzianum (a) y esporas del mismo (b)
5. Discusión
Los resultados preliminares mostrados demuestran que es posible desarrollar
concentrados de enzimas ligninolíticas producidos por cepas de hongos basidiomicetos,
utilizando sus capacidades de crecimiento en diferentes medios de cultivo. Una purificación y
aislamiento posterior de dichas enzimas atendiendo a los criterios de una máxima actividad
ligninolítica sobre distintos sustratos, permitiría desarticular la estructura de la materia prima
para las etapas posteriores en el proceso de obtención de bioetanol, primero en condiciones
controladas de laboratorio y posteriormente en el escalado de las mismas para lo que se
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requiere el apoyo de la ingeniería de procesos. Este hecho resolveria el primer gran reto del
proceso global.
Por otro lado también se ha puesto de manifiesto la potencialidad de hongos
Deutorimicetos productores de enzimas celulolíticas tales como Trichoderma que poseen un
potente sistema exo e intracelular para desarticular la celulosa. Según hemos demostrado,
estos hongos poseen capacidad para desarrollarse en un amplio espectro de sustratos. Se han
obtenido los primeros resultados de presencia de glucosa libre en los caldos de cultivo,
teniendo presente que cuando aplicamos el hongo al sustrato la degradación que se realiza es
para satisfacer el metabolismo del hongo, dando lugar a azúcares reductores en la mayoria de
los casos. Por tanto, estos resultados avalan la posibilidad real del empleo de estos hongos
como poderosas herramientas para acometer la segunda gran dificultad del proceso, la
obtención de azúcares capaces de ser fermentados hasta etanol.
El desafío ahora se encuentra en producir enzimas celulolíticas en calidad y cantidad
que permitan desarticular la celulosa hasta glucosa y separar las pentosas o reducirlas para
que no interfieran o al menos levemente en los posteriores procesos de fermentación. Los
resultados obtenidos en nuestros laboratorios hasta el momento abren una línea de
investigación que al igual que otros grupos europeos y latinoamericanos que trabajan en el
tema nos permite prever que los procesos combinados de tratamiento de la biomasa vegetal
son una vía de solución para los combustibles de segunda generación. Hay una bibliografía
emergente en esta dirección que comienza señalar la importancia de desarrollar tecnologías en
este ámbito (HENDRIKS, A.T.W.M. Y ZEEMAN, G. 2009).
6. Conclusiones
Los resultados preliminares que aquí se presentan demuestran que se pueden
implementar procesos enzimáticos, junto a los termoquímico-mecánicos como alternativa real
para transformar la lignocelulosa. Las enzimas ligninolíticas producidas por Pleurotus
ostreatus así como los complejos celulolíticos producidos por hongos en este caso
Trichoderma harzianum permiten abordar el proceso de desarticulación del material
lignocelulósico y una posterior degradación de la celulosa a unidades de glucosa. Dentro de
este ámbito el papel desempeñado por diferentes variedades de hongos con propiedades
ligninolíticas y celulolíticas es esencial. En este sentido se abren nuevas vías de investigación
para adaptar la biología molecular de estos organismos a los procesos de producción de
bioetanol a partir de distintos materiales lignocelulósicos.
7. Agradecimientos
Agradecemos a las autoridades del Gobierno de Morelia, México por la beca concedida
a Giovanni Hernández para realizar la estancia en nuestros laboratorios. Y al proyecto AGL
2005-08005-CO2-02 del MICINN, España.
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