FORMATO 1 - Pontificia Universidad Javeriana

FORMATO 1 (Anexo No.2)
CARTA DE AUTORIZACiÓN DE LOS AUTORES PARA LA CONSULTA, LA
REPRODUCCiÓN PARCIAL O TOTAL, Y PUBLICACiÓN ELECTRÓNICA DEL TEXTO
COMPLETO.
(OPCIONAL)
Bogotá. D.C .. Fecha
Marque con una X
D
Tesis doctoral
Trabajo de Grado
Señores
BIBLIOTECA GENERAL
Cuidad
Estimados Señores:
El suscrito Jesús Arnoldo Daza Figueredo, con C.C. No. 6763394, autor
del trabajo de grado titulado Diseño e implementación de un método de
procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para
microscopia presentado y aprobado en el año 2009 como requisito para optar
al título de Magister en Ciencias Biologicas; autorizo a la Biblioteca General de
la Universidad javeriana para que con fines académicos, muestre al mundo la
producción intelectual de la Universidad javeriana, a través de la vis ibilidad de
su contenido de la siguiente manera:
•
Los usuarios puedan consultar el contenido de este trabajo de grado en
Biblos, en los sitios web que administra la Universidad, en Bases de Datos,
en otros Catálogos y en otros sitios web, Redes y Sistemas de Información
nacionales e internacionales "Open Access" y en las redes de información
del país y del exterior, con las cuales tenga convenio la Universidad
javeriana.
•
Permita la consulta, la reproducción, a los usuarios interesados en el
contenido de este trabajo, para todos los usos que tengan finalidad
académica, ya sea en formato CD-ROM o digital desde Internet, Intranet,
etc., yen general para cualquier formato conocido o por conocer.
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Continúo conservando los correspondientes derechos sin modificación o
restricción alguna; puesto que de acuerdo con la legislación colombiana
aplicable, el presente es un acuerdo jurídico que en ningún caso conlleva la
enajenación del derecho de autor y sus conexos.
De conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el
artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, IILos derechos morales
sobre el trabajo son propiedad de los autores", los cuales son
irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables.
Firma, nombre completo y documento de identificación del estudiante
Jesús Anoldo Daza Figueredo
c. c. &763394
NOTA IMPORTANTE: El autor y o autores certifican que conocen las derivadas
jurídicas que se generan en aplicación de los principios del derecho de autor.
c. C. FACULTAD_ _ _ _ _ _ _ PROGRAMA
CADÉMICO
----------------
FORMATO 2 {Anexo No.3}
FORMULARIO DE LA DESCRIPCiÓN DE LA TESIS DOCTORAL O DEL
TRABAJO DE GRADO
TíTULO COMPLETO DEL TRABAJO DE GRADO: "Diseño e implementación de
un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de
imágenes para microscopia".
letos
Nombres Com letos
esús Arnoldo
DIRECTOR (ES) TESIS DOCTORAL O DEL TRABAJO DE GRADO
Apellidos Completos
Nombres Completos
Carlos Francisco
Corredor Pereira
ASESOR (ES) O CODIRECTOR
Apellidos Completos
lareo
Nombres Completos
Leonardo Rene
TRABAJO PARA OPTAR Al TíTULO DE: Magister
FACULTAD:
PROGRAMA: Carrera _
Doctorado
Licenciatura _
Especialización
Maestría x
NOMBRE DEL PROGRAMA: Maestria En Ciencias Biologicas
NOMBRES y APELLIDOS DEL DIRECTOR DEL PROGRAMA:
Manuel Franco
CIUDAD: BOGOTA AÑO DE PRESENTACiÓN DEL TRABAJO DE GRADO:OS de
noviembre de 2009
NÚMERO DE PÁGINAS 74
TIPO DE ILUSTRACIONES:
DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE
PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN TRIDIMENSIONAL DE
IMÁGENES PARA MICROSCOPÍA
JESUS ARNOLDO DAZA FIGUEREDO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSGRADO
DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN TRIDIMENSIONAL DE IMÁGENES PARA MICROSCOPÍA
JESUS ARNOLDO DAZA FIGUEREDO
1
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los
alumnos en sus trabajos de tesis. sólo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna� antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia.
1 de febrero de 2�1�
DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE
PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN
TRIDIMENSIONAL DE IMÁGENES PARA
MICROSCOPÍA
JESÚS ARNOLDO DAZA Fl7ERED
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carlOS,
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Direc tor
& E, f,JJ
Leonardo Lareo., PhD
Tutor
Jurado 1
.l urado 2
Jurado 3
Decana Académica
Director de Posgrado
Agradezco al creador del cielo y de la tierra quíen permitio que todo fuera
posible.
A mi esposa Betty Yolanda y mis hijos Zunny Tatiana y Omar Augusto
porque son la fuente de mi inspiración.
De modo especial doy mis sinceros agradecimientos a: mi director de Tesis
Carlos Corredor Pereira y tutor Leonardo Lareo por sus orientaciones y
seguimiento en el trabajo.
Al ingeniero Oscar Chavarro por su colaboración en el diseño y programación
del software implementado.
A la Doctora Ángela Umaña por creer y colaborar con su apoyo en el
acondicionamiento del Centro de Microscopía Electrónica durante su gestion
como Decana Académica de la facultad de ciencias.
A mis estudiantes colaboradores en el centro de microscopia quienes hicieron
eco a mis pensamientos en voz alta� Ellos son:
Isabel Moreno� Alexander Basallo� Alejandro Salamanca� José Dimate�
Mauricio Sanabria y Jesús Penagos.
Tambien un reconocimiento especial a mis compañeros y amigos Orlando
Acevedo� Gerardo Moreno y Jemmy Mendieta quienes participaron
activamente en este proceso.
A ellos Muchas Gracias y que Dios los proteja.
Jesús Daza F.
Índice general
Introducción
1
Justificación
5
Objetivos
7
1. Estado del Arte
9
1.1. Trabajos biología celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1.1.1. Descubrimiento de la célula animal y los microorganismos
10
1.1.2. Reconocimiento de la sinapsis neuronal . . . . . . . . . . .
10
1.1.3. Primeras imágenes tridimensionales reales. . . . . . . . . .
12
1.2. Microscopia electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
1.3. Microscopía confocal
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.4. Otras técnicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
1.4.1. Ecografía Doppler transcraneal: . . . . . . . . . . . . . . . .
18
1.4.2. Doppler Carotídeo:
18
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4.2.1. Tomografía axial computarizada:
. . . . . . . . . .
1.4.2.2. Resonancia magnética de imágenes:
19
. . . . . . . .
20
1.4.2.3. Tomografía por emisión de positrones: . . . . . . .
20
1.4.2.4. Angiograma coronario.
20
. . . . . . . . . . . . . . . .
2. Metodología.
23
2.1. Diagnóstico y tipo de investigación. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
2.2. Diseño metodológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
2.3. Lista de chequeo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
I
ÍNDICE GENERAL
3. Resultados
3.1. De los equipos. . . . . . . . . .
3.2. De las muestras. . . . . . . . .
3.3. De la cámara fotográfica. . . .
3.4. Sobre la cámara . . . . . . . .
3.5. Interferencias ópticas . . . . .
3.6. Validación de la membrana . .
3.7. Hojuelas seriadas . . . . . . .
3.8. De la fijación de la membrana.
3.9. Arhivo y captura de imágenes
3.10. Reconstrucción 3D. . . . . .
3.11. Validación R 3D. . . . . . . . .
3.12. Cualidades Vitral . . . . . . .
ÍNDICE GENERAL
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29
31
34
36
39
41
43
44
49
50
53
54
4. Conclusiones.
59
5. Impacto del trabajo investigativo.
61
Bibliografía
63
II
Índice de figuras
1.1. Red Neuronal Dirección del impulso nervioso: . . . . . . . . . .
11
1.2. Neuronas Piramidales: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.3. Oocitos tecnología DIC:
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
1.4. Sinapsis Neuronal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
1.5. Ecografia: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
1.6. Eco Doppler Carotideo: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.7. Tomografía axial computarizada: . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.8. Imagenes de Resonancia Magnetica (IRM): . . . . . . . . . . . .
20
1.9. Tomografía por emisión de positrones: . . . . . . . . . . . . . .
21
1.10.Angiograma coronario:
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
2.1. Diagrama de flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
2.2. Diagrama causa efecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
2.3. Mapa conceptual de correlación . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
3.1. Guia preparación de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
3.2. Obtención cortes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
3.3. Piezas sistema de adaptación óptica . . . . . . . . . . . . . . . .
35
3.4. Ensamble sistema de adaptación óptica. . . . . . . . . . . . . .
37
3.5. Pantalla fosforescente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
3.6. Sistema de adquisición de imágenes digitales para MET. . . .
38
3.7. Imáges de Tardigrados observados en microscopía confocal .
40
3.8. Efecto del aceite de inmersión en la interfase óptica . . . . . .
41
3.9. Escaneo Laser del vidrio cubreobjetos.
. . . . . . . . . . . . . .
42
3.10. Interfase con membrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
3.11. Caracterización espectral de la membrana: . . . . . . . . . . .
43
3.12. Cortes seriados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
III
ÍNDICE DE FIGURAS
3.13.
3.14.
3.15.
3.16.
3.17.
3.18.
3.19.
3.20.
3.21.
ÍNDICE DE FIGURAS
Membrana Polimérica (Formvar). . . . . . . . . . . . . . . .
Aplicación de la membrana con un espécimen biológico.
Citoesqueleto de astrocitos. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diseño y elaboración de rejillas. . . . . . . . . . . . . . . . .
Porta rejillas para microscopía óptica. . . . . . . . . . . .
Reconstrucción en Z de un artrópodo. . . . . . . . . . . . .
Raconstrucción tridimensional de ganglios . . . . . . . . .
Recostrucción 3D con MET . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
R 3D del cultivo celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV
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46
46
47
48
48
50
55
57
58
INTRODUCCIÓN
¿Es posible construir un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para la visualización de una sinapsis neuronal aplicando la microscopía electrónica de transmisión (MET)?
La microscopía electrónica de transmisión permite obtener imágenes bidimensionales con marcadores de metales pesados posibilitando hacer tinciones
para mejorar la definición de membranas y otros organelos celulares. Aunque
el tamaño individual de los átomos metálicos utilizados no es detectable por
MET ni por la microscopía de luz, su asociación con otros átomos sí brinda la
posibilidad de visualizar una estructura completa. Esta propiedad manifiesta
en el microscopio de transmisión nos permite aprovechar la herramienta para
visualizar estructuras diferenciadas a partir de las cuales es posible obtener
una reconstrucción tridimensional.
Este principio óptico es la base para obtener información en primera instancia de la muestra en estudio. Si la misma información es obtenida en diferentes
cortes consecutivos de la muestra, es de esperar que también se pueda hacer
un seguimiento de la morfología estructural de la muestra en un tercer eje
dimensional.
Los trabajos realizados hasta ahora se habían centrado en emplear el microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes bidimensionales.
Sin embargo, esta metodología no permite observar la estructura tridimensional de la muestra. Ante esta limitación, decidimos buscar un método para
aprovechar la MET para lograr construir imagenes tridimensionales a nivel
ultra estructural.
El procedimiento seguido para la captura de la imagen de una muestra
biológica se inicia seleccionando una sección del orden de 1cm2 de superficie y
espesor entre 30 y 60 µm. A esta muestra se le hace una aproximación visual
1
Reconstrucción 3D
Introducción
inicial, conocida como panorámica, la cual nos permite seleccionar y orientar
el área de interés, es decir, aquella zona de mayor probabilidad de presencia
de botones sinápticos.
Una vez ubicada la zona de interés de un área cuadrada de 3 mm de lado
aproximadamente, se procede a realizar una segunda imbibición en resina
poliéster para dotarla de un soporte que facilite su manejo y corte.
Hecho esto, con ayuda de un bisturí o cuchilla, procedemos a delimitar la
sección de trabajo definiendo una pirámide trapezoidal donde la base inferior
tiene lados paralelos de 600 y 1000 µm (≈ 1 mm) de longitud aproximadamente y con área mucho mayor que la base superior. A esta muestra con forma
piramidal de sección trapezoidal se le hace un corte en secciones transversales muy delgadas de modo que se obtengan películas con espesores entre 60 y
80 ηm. Este tipo de corte es el que denominamos corte seriado y es también el
procedimiento que más tarde permitirá hacer la reconstrucción tridimensional
de la muestra.
Para el montaje de la muestra se utilizan membranas poliméricas de formvar con espesor de 60 nm que resultan resistentes al impacto de un haz de
electrones. Esta propiedad fue aprovechada en el trabajo montando los cortes,
tanto para microscopia de luz como para MET, sobre las membranas formvar
con lo cual se logró eliminar totalmente el vidrio del porta objeto que genera
refracción al hacer la lectura de la muestra.
Existen equipos que pueden efectuar cortes seriados, a partir de los cuales
también se puede realizar la reconstrucción tridimensional de la muestra, sólo
que este proceso está limitado a muestras de tamaños grandes, del orden de
milímetros, con lecturas por métodos ecográficos o de resonancia de rayos X.
Otros equipos pueden realizar esta misma tarea con la ayuda del rayo laser
para muestras de tamaño muy superior, del orden de 350 nm, a los obtenidos y
analizados por microscopía electrónica de transmisión.
En el mercado nacional existen sistemas de montaje de rejillas para microscopía electrónica de transmisión caracterizado por su mesh, número de
cuadros por unidad de área, usualmente entre 100 y 400 cuadros por cm2 .
Cuando se emplea este tipo de montaje las barras que constituyen la rejilla
interfieren en la captura de información hacia la obtención de una imagen.
Nuevamente, este problema motivó el diseño y construcción de un sistema de
rejilla de único agujero, mesh 1; este proceso se realizó con técnicas de serigra2
Introducción
Reconstrucción 3D
fía y fotomecánica de modo que la muestra pudiera ser sostenida tan sólo por
los extremos y el montaje no afectara la lectura de la muestra. Este sistema
tiene la virtud adicional de poderse multiplicar continuamente formando un
porta-rejillas de hasta 56 muestras simultáneas, de modo que hace posible la
visualización, continuada e independiente, de una muestra con cualquier tipo
de técnica de microscopía de luz.
La irregularidad en los cortes, tanto en espesor como en uniformidad del
área, hizo que se diseñara y construyera un sistema electrónico de corte el cual
contó con un software de alta confiabilidad y precisión que permitió obtener
un sistema controlado en los cortes requeridos.
Las hojuelas obtenidas por cortes de la cuchilla de vidrio o diamante quedan
suspendidas en la poceta llena de agua con que cuenta en la parte superior la
misma cuchilla. Esto hace posible que se puedan recuperar las hojuelas. Ellas
se mantienen unidas una tras otra en forma de cadena de películas trapezoidales. Al parecer, por razones electrostáticas, los trapecios se van organizando de
modo que cada lado paralelo mayor busca uno menor y tienen un color plateado debido al mínimo espesor que estas alturas poseen; el color de las hojuelas
son una manifestación del espesor que tiene la muestra en cada caso.
Paralelamente se realizó la preparación de la rejilla de único orificio, mesh
1, colocando sobre su superficie una membrana de soporte que es la encargada de recoger la cadena de películas trapezoidales obtenidas. Así, las hojuelas
organizadas que están flotando en agua, por efecto de la tensión superficial,
son recogidas por la rejilla tapizada con membrana, que en este momento se
encuentra sumergida. Con ello, ahora se puede secar la muestra para ser finalmente introducida en el MET para su observación.
Una de las exigencias primarias para la obtención de buenas imágenes es
el estado de la pantalla fosforescente, la cual debe ser muy uniforme y no
presentar problemas de densidad o de intensidad de la película fotosensible.
En el caso de este trabajo, una de las acciones que hubo necesidad de realizar
fue la adecuación de la pantalla, por cuanto su estado inicial no permitía la
obtención de buenas imágenes debido al maltrato mecánico al que había sido
sometida.
Montada la rejilla de orificio único, mesh 1, en el holder, es decir, el portarejillas del MET, procedimos a ubicar el sector de interés, la sinapsis neuronal,
ajustando el equipo para obtener la mejor definición de la imagen y comenza3
Reconstrucción 3D
Introducción
mos a realizar la captura de las imágenes sucesivas del mismo sector en cada
una de las hojuelas. Para la obtención de las microfotografías, cuadrados del
orden de 6 a 20 µm de lado con un aumento de 50000X, se emplea una cámara
CMOS que ofrece igual o mejor resolución que las fotografías obtenidas por revelado, las cuales dependen de la granulosidad y homogenización de la película
fotosensible.
La cámara CMOS (Metal oxido semiconductor complementario) posee un
fotodetector formado por tres capas de oxido de silicio sensible a las longitudes
de onda rojo, verde y azul (Sistema RGB de su abreviatura en ingles) que están
dispuestas una bajo la otra, de tal modo que un haz incidente es capturado por
una unidad fotosensible de la capa correspondiente. El dispositivo sensor de
las camaras CCD (Dispositivo de carga complementaria) está organizado por
triadas de tres tipos de fosforo (RGB), en el mismo plano, Luego un rayo de
luz incidente es capturado por el punto de la triada correspondiente, lo que
implica la perdida de información de los dos puntos restantes.
Para evitar que la luz proveniente del exterior interfiera con el haz de electrones que incide sobre la pantalla fluorescente del microscopio, adaptamos
una camara digital acoplada al microscopio en forma tal que se mantuviera la
oscuridad necesaria exclusivamente al interior del mismo y que facilitara su
monitoreo exterior mediante sistemas computarizados dotados con tarjetas de
video. Esto se realizó adaptando un vidrio protector perforado de modo que el
objetivo óptico diseñado se constituyera en el contacto directo con la pantalla.
En la última etapa del proceso se diseño, elaboró, desarrolló e implementó
un software para realizar la reconstrucción tridimensional de imágenes provenientes de las micrografías electrónicas de las hojuelas seriadas ya tratadas.
A través de todo el proceso investigativo se pretendió aprovechar el equipo disponible y buscar mejorar los procesos comercialmente estandarizados
en busca de una mayor eficiencia y profundidad en la caracterización de las
muestras biológicas. Cada problema se constituyó en estímulo para generar
soluciones económicas y eficientes y contó con la participación de estudiantes
de pregrado y posgrado que pusieron el mayor interés para que todo el proyecto
investigativo se desarrollara como un conjunto armónico y estructurado.
4
Justificación
En la Facultad de Ciencias de la PUJ se contaba con equipos que presentaban grandes deficiencias al momento de pretender realizar una imagen
microscópica de alguna muestra. Esto se veía reflejado tanto en el alcance de
los equipos como en el estado técnico de los mismos.
Por otro lado, el protocolo empleado para realizar el examen de las muestras era muy limitado tanto en las posibilidades de su análisis, como en la
información que se podía extraer a partir de su implementación.
Un tercer elemento motivador para la realización del trabajo de investigación fue el alto costo en que se incurría cuando se trataba de obtener una
sencilla imagen de alguna de las muestras: a los altos costos de los reactivos utilizados había que sumarle el costo de funcionamiento de los equipos,
el costo intrínseco por la exigencia de un ”software” propio y especializado, y
el costo implícito por la necesidad de contratar expertos externos para realizar
cualquiera de las pruebas.
Entonces, se plantea una propuesta de solución y desarrollo de una metodología nueva en la detección de información bidimensional obtenida por MET
y a partir de ésta, diseñar e implementar una técnica de reconstrucción tridimensional de imágenes que aporte al campo de la óptica y al desarrollo de la
investigación física y biológica.
5
Reconstrucción 3D
Justificación
6
Objetivos
General:
Diseñar y evaluar un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopía electrónica de transmisión, con desarrollos propios, a partir de los recursos existentes en el Laboratorio de Microscopía
Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana.
Específicos:
Identificar las caracterísiticas de los equipos existentes en el Laboratorio
de Microscopía Electrónica de la PUJ y analizar su potencial aplicación
en el proceso de reconstrucción tridimensional de imágenes, 3D.
Identificar las características de los procesos estandarizados de preparación de muestras, procesos ópticos, captura de imágenes y manejo de la
información.
Optimizar el proceso técnico de adquisición de imágenes digitales para los
diferentes equipos de microscopía.
Optimizar un sistema de realización de cortes sucesivos y obtención de
hojuelas seriadas ultrafinas.
Diseñar, desarrollar e implementar un software para generar volúmenes
tridimensionales a partir de las imágenes bidimensionales obtenidas de
cada corte de la muestra en estudio.
7
Reconstrucción 3D
Objetivos
8
Capítulo 1
Estado del Arte
1.1.
Primeros aportes de la óptica a la biología celular.
Con el descubrimiento de la microscopia de luz la humanidad se abre paso
para entender el universo y en especial la constitución de la materia. Galileo
Galilei (1564-1662) fué al primero a quien se le acreditó el uso científico de las
lentes al hacer observaciones astronómicas. Entre los años de 1591 y 1608, el
físico holandés Zacharias Jensen construyó el primer microscopio compuesto,
con magnificaciones de apenas 10 a 20 veces, constituido por varias lentes que
permitieron corregir las aberraciones esférica y cromática [7]. Posteriormente
Johannes Kepler (1571-1630) diseñó un microscopio compuesto en el cual el
objetivo y el ocular eran convexos a diferencia de los anteriores; éste es el prototipo de los microscopios actuales. Es Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723)
quien, al observar la textura de telas en un negocio de tejidos, se interesa por
el aspecto que tenían las cosas cuando las veía bajo aumento, comienza a trabajar en el tallado de los vidrios para mejorar las imágenes que observaba,
logrando mejoras en la amplificación de las imágenes hasta en 270 veces. Diversos tipos de materiales pasaron por sus microscopios (musgos, leche, agua,
abejas, entre otros), siendo el primero en observar microorganismos en aguas
estancadas, en 1675.[11].
9
1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
1.1.1.
Descubrimiento de la célula animal y los microorganismos
El médico ingles Robert Hook da a conocer, en 1665 en su obra -MICROGRAFÍA1
, la estructura celular de los seres vivos.
En 1773, el microscopista danés Otto Muller consiguió distinguir suficientemente bacterias, microorganismos que clasificó en dos tipos: bacilos (que
significa “pequeños vástagos”) y espirilos (por su forma espiral).[11]. Las observaciones las realizó con microscopia en dos dimensiones.
Es en 1875, cuando el anatomista italiano Camillo Golgi, logró establecer
el método de tinción para neuronas completas y especificas[15].
Con un método que permitió contar y diferenciar los tipos de células del tejido nervioso, el contemporáneo de Golgi, el médico Santiago Ramón y Cajal
fué quien reveló que se trataba de un aparente sistema nervioso organizado
por células separadas bien definidas. (Ver la figura 1.1 en la página siguiente). Describió cuidadosamente la morfología de las diferentes estructuras del
cerebro y como se interconectan entre ellas.[14].
“En 1887 Ramón y Cajal quedó fascinado por las técnicas de coloración histológicas puestas a punto por Golgi y emprendió una serie de investigaciones
sobre el sistema nervioso que le condujeron a establecer que las neuronas son
células independientes que se comunican entre sí por contacto en contra de la
teoría establecida del reticularismo.” [15]. Figura ( 1.2 en la página siguiente).
1.1.2.
Reconocimiento de la sinapsis neuronal
Los procesos iniciales para entender la conducción del impulso nervioso
y la comunicación entre neuronas, se basan en modelos experimentales con
preparaciones histológicas de fibras simples aisladas del nervio ciático del especimen de rana adulta R. temporaria y R. Esculenta y el axón gigante de calamar Loligo forbesi practicados por Huxley y Stämpfly en 1949. Son modelos de
nervio animal con diametros entre 450 y 550 µm, condición que facilitó su diferenciación y comprobación de la transmisión del impulso saltatorio. [8]. Otros
trabajos realizados por esta epoca, miden el potencial producido en la juntura
1
http://archive.nlm.nih.gov/proj/ttp/flash/hooke/hooke.html. Consulta: junio 24 de
2009, 7:00 a.m.
10
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR
Figura 1.1: Red Neuronal Dirección del impulso nervioso:
Revisión de Ramón y Cajal sobre la dirección del impulso nervioso, señalado con flechas, y modelo axón-dendrítico de
conexiones de células en la corteza cerebral. El detalle morfológico de la neurona es representado, incluyendo ramas
dendríticas y espinas, el cuerpo y el árbol-axonal. Dendritas y cuerpo reciben entradas de muchas células vía terminal
de arborización de axones colaterales. Imagen obtenida del artículo .... la revista “Single neurone models: Oversimple,
complex and reduced Ivan Seveg Dept of Neurobiology institute of life sciences, Hebrew University, Jerusalen.1992.
Vol 15, pg 414.
Figura 1.2: Neuronas piramidales sometidas a tres ticiones diferentes:
a)Neurona
serve
la
teñida
compleja
con
H-E.
400X,
ramificación
b)La
dendrítica.
misma
C)La
neurona
misma
con
neurona
la
Técnica
con
la
de
Cajal.
técnica
de
100x.
Golgi.
(http://histología.bigthicketdirectory.net/unidad6a/nissl.htm :consulta, junio 06 de 2009. 10:00 a.m.) )
11
Ob100X
1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
de dos celulas diferentes, en las fibras múscular y neural y muestran resultados de conducción eléctrica causadas por liberaciones de acetil colina en el
sitio de union. Se comprobó entonces la transmisión neuromuscular,[16], y fué
la primera aproximación de la sinapsis neural a partir de mediciones electrofisiológicas con participación de sustancias químicas. Por consiguiente en el
sitio de union se presentan dos tipos de comunicaciones del impulso nervioso,
una electrica y otra química, siendo esta última la de nuestro interes.
Hacia 1950, se mostró la óptica con imágenes bidimensionales provenientes
de microscopios compuestos que alcanzaron los 2000 aumentos.2 A causa de
los limites de longitud de onda puestos por la luz , no fue posible realizar
profundizaciones en alta resolución.
1.1.3.
Primeras imágenes tridimensionales reales.
El desarrollo de la microscopía de luz o de campo claro, que se habia estancado desde 1875, recuperó su dinamismo hacia 1930 con los trabajos de
diferentes investigadores quienes utilizaron las propiedades de los objetos traslucidos. Estos materiales, al ser estimulados, generan respuestas detectables
en el microscopio.
La actividad paralela de disciplinas físicas y biológicas contribuyó a la creación de herramientas para el trabajo de los investigadores, en su tarea de
reconocimiento, tanto de las estructuras translucidas como de las opacas. Esto se puso de manifiesto en la observación de la sinapsis de la placa motora
y en la detección otros niveles de organización biológica, desde asociaciones
moleculares hasta relaciones de tejidos, sistemas y órganos [2].
Fue Fritz Zernike, profesor de física de la Universidad de Groningen, quien
sentó las posibilidades de aplicación de la investigación básica en óptica teórica con respuestas prácticas a la observación de espécimenes traslucidos al
microscopio de luz sin utilizar métodos de tinción. La información de la imágen
que es captada por el ojo humano es la información proveniente de la amplitud de la onda luminosa; en la misma onda existe informacion del especimen
que no puede ser vista directamente: es la información presente en la fase de
2
Ernest Abbe controyó con el equipo de Carl Zeiss el ultra-microscopio, que consistió en
utilizar una fuente de iluminación diferente a la luz día. Revista Bohemia. 42(20): 24-28,
112-114 La Habana, 1950. http://bvs.sld.cu/revistas/his/cua_89/his118901.htm. Consulta:
julio 3 de 2009: 5:00 p.m.
12
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
1.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
Figura 1.3: Oocitos tecnología DIC:
Oocitos primarios de almeja de olas, Spissuela Solidissima, en óptica Contrast diferencia de interferencia (DIC). Los
gradientes de sombra en la imagen indican las regiones de rápido cambio del camino óptico en la célula. Foto tomada
de (Murphy 2002).
las ondas luminosas. Para capturar la información presente en la fase de las
ondas de luz cuando éstas atraviesan una muestra, se introdujo el concepto
de objetos de amplitud, los que permiten el paso directo de luz, y objetos de
fase los que retienen parte del haz incidente al variar la frecuencia. Al detectar
ambas informaciones, no solo se contaba con la información de la amplitud de
la onda sino también de la fase de la onda.
Para obtener la información de fase, trabajos ópticos desarrollados por el
grupo de colaboradores del laboratorio de Karl Zeiss en Jena 1942, en los que
aplicaron esta teoría, obtuvieron un microscopio de contraste de fase (FCM),
primera aproximación a una imagen tridimensional bajo la apariencia de relieve. Los trabajos realizados con esta tecnología transformaron la investigación
de la biología y medicina. Aún con esta técnica, los avances sobre resolución
no son los mas deseados. Entre los principales exponentes de la técnica tenemos a: Benett et al (1951), Francon (1961), Slayter (1976), Slayter y Slayter
(1992) y Pluta(1989). [12].
1.2.
Aparición de la microscopía electrónica.
Con el auge de la microscopia electrónica en la década de los 60, se intentó
medir el radio de un átomo y así poder validar los modelos atómicos hasta
el momento propuestos; los resultados no fueron los mas alentadores. Sin
13
1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
embargo, este esfuerzo con el que se pretendía explicar el microcosmos desde
la intimidad del átomo, sirvió para alcanzar tres logros importantes:
El primero fué el perfeccionamiento de equipos de microscopía electrónica
de transmisión (MET), con robustas fuentes de poder (alta tensión); con ellos
se gana en amplificación de las imágenes, puesto que la longitud de onda del
haz de electrones depende de la diferencia de potencial aplicada al equipo y,
adicionalmente, se dotan los equipos con mejores componentes electrónicos de
control y se obtienen las lecturas deseadas con mayor resolución (Agar, A. W.,
1991).
Un segundo aporte fué el desarrollo de técnicas y protocolos químicos que
contribuirían a la preparación de muestras, específicamente en procesos de
fijación, tinción y contrastación.
Y el tercer aporte fue la identificación de ultra estructuras y seguimiento
de cadenas de señalización de rutas metabólicas, por métodos de marcaciones inmunocitoquímicas, los cuales sólo se presentan en forma estandarizada
hasta el año de 1977 [9]. Sin embargo, aún con la eficiencia de los marcadores
metalicos y los logros obtenidos en resolución inferiores a 1 nm, unicamente
fué posible obtener imagenes bidimensionales.
1.3.
Usos de la microscopia láser confocal.
Más adelante, hacia 1980, con el mejoramiento de la óptica de confocalidad
se consiguieron aumentos del orden de 4000 o 5000 veces. A este punto de
magnificación, las condiciones internas del instrumento ponen el limite a su
avance, esto debido a las características físicas de funcionamiento generadas
por la longitud de onda del espectro visible, 350 a 750 nm.
La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica que está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia
( medicina, biología, materiales, geología, etc). Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica tradicional (imágenes de
mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal, entre otros)
y, sobre todo, a la posibilidad de obtener “secciones ópticas” de la muestra con
adquisiciones de datos de imagen punto a punto, lo que permite su estudio y
reconstrucción tridimensional. “ Si bien se han llevado a cabo algunos trabajos
14
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL
Figura 1.4: Microfotografía electrónica de la sinapsis neuronal:
Imágenes de la sinapsis neuronal obtenidas en un microscopio electrónico de transmisión a 60.000X. Se observan
las vesículas en la terminal nerviosa del axón presinaptico. a) sinapsis neuromuscular en rana adulta. b) sinapsis
de núcleo interpeduncular adulto c),d),e) junciones neuromusculares de músculo intercostal en rata día embrionario
14, (d)17, e(19). Barra 0.5µm. Microfotografias obtenidas: Synaptic structure and development the neuromuscular
juntion. Zach. Hall and Joshua R. Sanes. Departament of Physiology university of California, San Fransisco. Vol 73
pg 100,102.
15
1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
en los que se ha aplicado la microscopia confocal al estudio de las neuronas
impregnadas por la técnica de Golgi para su reconstrucción tridimensional,
esta tecnología ha sido poco explotada aún para este propósito”.[15]
Aunque el principio de la microscopía confocal surgió hace varias décadas
(Minsk, 1957) los primeros microscopios basados en esta técnica mostraron su
validez en 1968, con trabajos descritos por (Petran., et al). Y su aceptación con
avanzados desarrollos ha tenido lugar solo hasta hace unos pocos años con la
inclusión de los láseres y de los mini computadores.
La mayor parte de las muestras observadas con microscopía óptica convencional son traslúcidas. Si una muestra es opaca o si la superficie de reflexión
no se encuentra perfectamente pulida, para ambos casos, la luz interacciona con la muestra a varias profundidades por lo que la imagen que llega al
observador presenta áreas borrosas. Debido a que la luz reflejada procedente
de zonas fuera del plano de enfoque, produce un efecto de degradación con
perdida de contraste y resolución de la imagen.
El principio de la microscopía confocal consiste en eliminar la luz reflejada
o fluorescente que proviene de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina
una pequeña zona de la muestra y únicamente se deja pasar el haz luminoso
que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos
inferiores y superiores mediante una apertura conocida como pinhole (Boyde,
1988).
En la microscopía electrónica de transmisión, el análisis también se realiza
sobre un plano focalizado, que a diferencia del plano explorado con el microscopio confocal, se obtiene por medio de un corte físico con cuchilla y no por el
metodo de escaneo láser como lo hace el microscopio confocal.
La técnica de microscopía electrónica posibilitó mejorar la magnificación
y la resolución de las imágenes. Sin embargo es de considerar que, obtener
ganacias en magnificación implica una perdida de resolución y a la inversa.
En la década de los años 40, se iniciaron los trabajos con aplicaciones de microscopía electrónica de transmisión, MET, y de escaneo electrónico, SEM. El
principio de funcionamiento de estos equipos no depende de la longitud de
onda de los fotones.Por el contrario, es dependiente de la longitud de onda
de los electrones, caracteristica física que varia con el potencial aplicado a los
electrones para ser acelerados, es decir, que su cota superior para la resolución, depende solamente de la diferencia de potencial que le podamos aplicar
16
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL
al sistema. Especificamente para el microscopio de barrido SEM, se llegó obtener aumentos hasta 30000X y resoluciones de 100 a 200 nm. Para la misma
época el desarrollo del MET permitió resoluciones inferiores a 1 nm y aumentos
superiores a 106 . Esta ventaja del microscopio de transmisión brindó una oportunidad para ser aprovechada en este trabajo de reconstrucción tridimensional
de una sinapsis neural.
Últimamente, el desarrollo tecnológico ha permitido tener resoluciones del
orden de 1 Å para equipos de microscopía de fuerza atómica y microscopios de
efecto túnel. Equipos que condicionan su actividad unicamente en adquirir la
información superficial de la muestra. [4][6]
La aplicación de estos avances en la tecnologia de instrumentos y equipos
ópticos, se ha conjugado con un desarrollo paralelo en tecnicas para la investigacion de la biología celular, hasta llegar a reconocer ultraestructuras.
Contribuciones adicionales provenientes de los desarrollos de la biología
celular y que tambien son de interes para nuestro estudio, son las reconstrucciones volumétricas de un espécimen. En 1968, se logró reconstruir tridimensionalmente una imagen a partir de algorítmos matemáticos, [3]. Trabajo que
dió aportes significativos para que posteriormente fueran utilizados en procesos de adquisición y analisis de imágenes mediante fotografías, inicialmente
analógicas y posteriormente digitales, con captura directa de imágenes producto de un mejor ensamble de los equipos de microscopía.
Paralelamente con el desarrollo de los equipos, también se ha mejorado en
el proceso mismo de tratamiento de muestras, objeto de estudio, que impulsa
el desarrollo de múltiples técnicas de adquisición y análisis de imágenes.
Para obtener imagenes, sobre las que posteriormente se realiza el analisis,
se han desarrollado tecnicas basadas en efectos logrados por campos magnéticos, electricos y de sonido. Entre ellos podemos citar: ecografia Doppler
transcraneal, Doppler Carotideo, tomografía axial computarizada, resonancia
magnética, tomografía por emisión de positrones y angiograma Coronario.
17
1.4. OTRAS TÉCNICAS.
A)
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
B)
Figura 1.5: Ecografia:
A) ventana sónica transcraneal, Según la ventana utilizada se van a poder registrar diferentes arterias cerebrales.
B) Corresponde a la distancia entre la superficie del transductor o sonda y la arteria localizada, midiéndose esta en
milímetros y se determina al chocar el ultrasonido mandado por la sonda desde la superficie con los hematíes del
flujo sanguíneo del vaso, siendo este el punto o area donde se origina la señal doppler denominado “Volumen de
muestra”. En la mayoria de los aparatos la insonación es registrada desde el punto medio del volumen de muestra.
http://www.eccpn.aibarra.org/temario/seccion7/capitulo127/capitulo127.htm, Consulta: Junio 05 de 2009, 5:00
p.m.
1.4.
Otras técnicas para obtener imágenes tridimensionales
1.4.1.
Ecografía Doppler transcraneal:
Es un exámen de diagnóstico seguro que proporciona una visión interior
del cerebro, no visible directamente. Produce imágenes de dos o tres dimensiones usando ondas electromagneticas y ultrasónicas, emitidas en ecos hacia la
fuente que los produjo.
Apareció en 1982 y muestra la hemodinámica y la velocidad de del flujo
sanguíneo intracerebral.3
1.4.2.
Doppler Carotídeo:
El eco Doppler de las arterias carotídeas en el cuello, investiga mediante
el ultrasonido el interior de las arterias, la calidad de las paredes y si existen
placas con anormal deposito de calcio y colesterol. Como se puede observar en
la imagen ( 1.6 en la página siguiente), estas placas pueden restringir el flujo
sanguíneo al cerebro o romperse y embolizar bloqueando el flujo sanguíneo en
3
http://www.eccpn.org/temario secccion7/capitulo127/capitulo127.htm
18
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
1.4. OTRAS TÉCNICAS.
Figura 1.6: Eco Doppler Carotideo:
Un estudio indoloro con Eco Doppler Preventivo puede identificar esta amenaza y permitir actuar a su médico.
http.//www.cardiomedic.com.pe/01_arteriografiacarotidea.html., consulta, junio 05 de 2009, 5:00 p.m.
B)
A)
Figura 1.7: Tomografía axial computarizada:
A) Infarto de la arteria cerebral media como forma de presentación de la tuberculosis miliar (Middle cerebral artery
ischemic stroke presentation of miliar tuberculosis B. Zalba Etayo, B. Obón Azuara, I. Gutiérrez Cía, B. Villanueva
Anadón, R. Ridruejo Sáez Servicio de Medicina Intensiva. Hospital Clínico Universitario. Zaragoza B)Exámen normal de TAC de cabeza con medio de contraste intravenoso. Las imágenes no son comparables, No es posible sacar
conclusiones por comparación de las imágenes. Solamente los radiólogos calificados deben interpretar las imágenes.
http://www.radiologyinfo.org/sp/info.cfm?pg=headct, consulta: junio 26 de 2009, 10:00 a.m.
una arteria cerebral causando un accidente cerebro vascular de diverso grado.
Esta complicación es actualmente la tercera causa de muerte en países como
Estados Unidos de América.4
1.4.2.1.
Tomografía axial computarizada:
Son diagnisticos que combinan un equipo de rayos x especial con computadoras sofisticadas para producir múltiples imágenes o visualizaciones del
interior del cuerpo.5
4
5
http://www.cardiomedic.com.pe/01_arteriografiacarotidea.html
htpp://radiologyinfo.org/sp/info.cfm?pg=headct
19
1.4. OTRAS TÉCNICAS.
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
Figura 1.8: Imagenes de Resonancia Magnetica (IRM):
IRM significa imágenes por resonancia magnética. La IRM es un procedimiento indoloro que usa imanes potentes
y ondas radiales para construir imágenes del cuerpo. Se crea un campo magnético alrededor, enviando ondas que
forman una imagen de la región específica. http://www.neurochirurgie-zwolle.nl/grap/MRI_fMRI.jpg
1.4.2.2.
Resonancia magnética de imágenes:
La resonancia magnética (IRM) es un procedimiento que combina imanes
grandes con radiofrecuencias y usa una computadora para producir imágenes
detalladas de los órganos y las estructuras internas del cuerpo. La IRM se
utiliza a menudo: para examinar tejidos blandos como el corazón, el cerebro,
el hígado, entre otros.6
1.4.2.3.
Tomografía por emisión de positrones:
La tomografía por emisión de positrones (PET) es un tipo de procedimiento
de medicina nuclear que mide la actividad metabólica de las células de los tejidos del cuerpo. Es utilizada frecuentemente por los oncólogos, los neurólogos,
los neurocirujanos, y los cardiólogos. 7
1.4.2.4.
Angiograma coronario.
Es una técnica radiográfica que inspecciona cavidades internas del corazón
y arterias usando un colorante para medir el flujo y presión en las arterias
6
7
http://www.neurochirurgie-zwolle.nl/grap/MRI_fMRI.jpg
http://www.healthsystem.virginia.edu/uvahealth/adult_radiology_sp/pet.cfm
20
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
1.4. OTRAS TÉCNICAS.
Figura 1.9: Tomografía por emisión de positrones:
Con 2-(18F)-fluro-2-deoxi-D-glucosa (FDG-PET) que detecta una imagen tumoral en el páncreas en un paciente
con pancreatitis cronica (PC). (http://www.intramed.net/contenidover.asp?contenidoID=40537) ¡Revisión! Pancreatitis crónica: diagnóstico y tratamiento, 28 MAY 08 Dres. DiMagno MJ, DiMagno EP. Angiografia: Es una técnica
radiográfica que inspecciona cavidades internas del corazón y arterias usando un colorante para medir el flujo y presión en las arterias coronarias. http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm, Consulta:
junio 08 de 2009, 8:00 a.m.
Figura 1.10: Angiograma coronario:
La
flecha
indica
una
obstrucción
en
la
arteria
coronaria
derecha.
http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm, Consulta: junio 06 de 2009, 8:00
a.m.
coronarias.8
De la discusión anterior se desprende que, los procesos desarrollados hasta
ahora han posibilitado la reconstrucción tridimensional de macro estructuras,y de manera muy tímida, y menor a la posibilidad de reconstrucción de
imágenes en el orden de la resolución permitida por el MET, [3],como lo hemos
aplicado para la reconstrucción tridimensional de la sinapsis neuronal.
8
http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm
21
1.4. OTRAS TÉCNICAS.
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
22
Capítulo 2
Metodología.
2.1.
Diagnóstico y tipo de investigación.
La reconstrucción tridimensional de una muestra, objetivo central del trabajo, exigió para su desarrollo llevar a cabo algunos procesos anteriores. Inicialmente fue necesario evaluar los equipos disponibles, su funcionamiento,
alcances y limitaciones; luego, se llevó a cabo una revisión bibliográfica acerca de los métodos de preparación de muestras, su ubicación en los diferentes
tipos de microscopios, el proceso óptico de captura de las imágenes, la magnificación y resolución obtenidas a partir de cada uno de ellos y cada característica que presentaba el método específico analizado. Simultáneamente, se
realizó una revisión bibliográfica sobre el proceso óptico de captura de imágenes, con el objeto de determinar el tipo de cámara más adecuado a las necesidades del proceso. Los altos costos inherentes a la consecución de un Laboratorio de Microscopía llevaron a ingeniarnos un método de corte de muestras
con características muy similares a las generadas por los equipos comerciales automáticos. Esto también exigió el diseño de una metodología de trabajo
que permitiera obtener hojuelas suficientemente delgadas y uniformes con lo
cual pudieramos estar seguros que una reconstrucción tridimensional, 3D,
sí correspondía a la estructura de la muestra. Esta etapa exigió también la
revisión bibliográfica acerca de controladores de velocidad para motores y la
realización de un proyecto de investigación para la elaboración de un software
de control de velocidad de corte de la muestra, proyecto éste que también permitió la elaboración de tarjetas electrónicas de control para independizar los
23
2.2. DISEÑO METODOLÓGICO
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
procesos de corte y presión.
Finalmente, se realizó también una revisión bibliográfica encaminada a la
obtención de información sobre los programas de computador empleados para
la reconstrucción de volúmenes a partir de la captura de imágenes bidimensionales obtenidas en cada hojuela. Este proceso llevó a la construcción de un
programa propio obtenido a partir de la utilización de diferentes programas de
software libre con el cual se logró la reconstrucción final.
Todo este proceso exigió también su convalidación; ésta se llevó a cabo
desarrollando inicialmente un entrenamiento sobre el proceso de captura de
imágenes de especímenes conocidos para luego ser comparadas con las obtenidas a partir del proyecto de investigación. También al final, para comprobar
la validez del software de reconstrucción tridimensional elaborado a través
del proyecto, se editaron las imágenes obtenidas de las hojuelas para formar
un archivo en columna (stack) de imágenes para posteriormente aplicarle el
programa VITRAL, producto del grupo de trabajo, y así obtener una imagen
tridimensional animada, proceso conocido como renderización. Para posibilitar la comparación de reconstrucciones tridimensionales se optó por recuperar
imágenes individuales a partir de una animación creada desde un microscopio
confocal. Estas imágenes individuales, que no requieren edición porque ya salen formando un archivo en columna de imágenes, fueron sometidas al mismo
programa VITRAL obteniéndose la reconstrucción tridimensional idéntica a la
reportada por el fabricante. Este proceso fue aplicado a diferentes muestras
corroborando las bondades y efectividad del software creado.
2.2.
Diseño metodológico
Las actividades planteadas en el numeral anterior condujeron a la elaboración de un diagrama de flujo que nos permitiera visualizar el proyecto en
conjunto y separar cada una de las actividades y proyectos a desarrollar en
cada etapa del proceso. Esta forma de trabajo tuvo como resultado la elaboración de una lista de chequeo para verificación.
El diseño metodológico se fundamentó en el método de Pareto (figura 2.2 en
la página 26) para identificar el origen de los problemas, haciendo posible individualizarlos para poderlos resolver separadamente. Según este planteamiento
24
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
2.2. DISEÑO METODOLÓGICO
Figura 2.1: Diagrama de flujo
El diagrama señala los pasos a seguir en el reconocimiento del estado de los equipos y el recorrido que debe tener
una muestra, para que apartir de la misma sea posible extraer hojuelas seriadas con sus respectivas imagenes para
la posterior recontrucción tridimensional.
el 100 % de problemas existentes dependen de un 20 % de las causas posibles
que los originan; a partir de aquí lo que se busca es identificar aquellas causas efectivas que impiden la solución de los problemas, con lo cual podemos
dar solución a una situación. Esto nos lleva a la generación de una lista de
chequeo que verifique la superación de los problemas identificados.
Como resultado de este diseño metodológico se encontró que las dificultades para el desarrollo del proyecto se manifestaban en las condiciones humanas presentes en el momento, en las adaptaciones locativas, en el estado de
los equipos y en los procedimientos de preparación de muestras y carencia
de software para captura y análisis de imágenes, además de los problemas
económicos.
Luego de secuenciar jerárquicamente las situaciones problema sobre equipos, muestras, camaras y software ellos se transformaron en el eje conductor
y metodologico para desarrollar esta investigación. El diagnóstico así realizado
facilitó la elaboración de un diagrama de flujo con el cual se visualizara todo el
proceso y sirviera de guía de análisis de las etapas del proceso.
Complementario con el método de Pareto se empleó el método de Causaefecto, también conocido como espina de pescado figura 2.2 en la página siguiente, mediante el cual se busca identificar todas las causas que producen
un efecto en la solución del problema. Así, se posibilita el análisis de la inci25
2.3. LISTA DE CHEQUEO
Figura 2.2:
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
Diagrama causa efecto:
El diagrama causa efecto es el resultado del diagnostico para conseguir la reconstrucción tridimensional de imagenes a
diferentes niveles con los instrumentos existentes en el Centro de Microscopía Electrónica de la Pontificia Universidad
Javeriana.
dencia que la solución de cada problema pueda tener sobre la solución total
de la situación. Al aplicar este método al proyecto de investigación se obtuvieron resultados muy similares y complementarios a los obtenidos mediante el
método de Pareto.
Cabe anotar que este trabajo de investigación tiene como fundamento un tipo de investigación experimental centrada en conceptos básicos de la óptica, el
desarrollo tecnológico y aportes pedagógicos visualizados en las diferentes etapas de investigación. Esto permite definirlo como un trabajo de investigación
básico experimental (Zorrilla, 1993).
2.3.
Lista de chequeo
Los resultados de la etapa de diagnóstico se resumen con la siguiente lista
de chequeo1 :
1. Identificar el tipo de equipo existente en el laboratorio y evaluar su posible
aplicación en la reconstrucción tridimensional, 3D.
2. Determinar el tamaño de las posibles muestras y el método de preparación más adecuado que, de acuerdo con las limitantes del equipo, se
1
http://www.geocities.com/WallStreet/Exchange/9158/indicete.htm
26
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
2.3. LISTA DE CHEQUEO
pueden tratar a lo largo del trabajo de investigación.
3. Identificar el tipo de cámara fotográfica de mayor resolución y que mejor
se adecuara al presupuesto para la captura de imágenes.
4. Evaluar la posibilidad de adecuar la cámara obtenida en los microscopios
de MET y de Campo Claro o de luz.
5. Buscar generar alternativas que permitan la eliminación de interferencias
ópticas debidas a elementos diferentes al espécimen.
6. Realizar pruebas de captura de imágenes con microscopio confocal buscando mejorar la resolución y fidelidad de la imágen para validar el método propuesto en el numeral anterior.
7. Desarrollar un método para mejorar el proceso de corte de muestras para
obtener hojuelas más delgadas con el mismo espesor y ángulo de corte.
Evaluar la posibilidad de realizar estos cortes con ayuda de controladores
electrónicos para mejorar la calidad de los cortes.
8. Determinar el método más apropiado para fijar la membrana en el soporte, de modo que ella pueda sostener la hojuela en estudio.
9. Identificar el proceso más adecuado para la captura de imágenes y la
formación del archivo en columna o stack de fotografías. Determinar la
necesidad de emplear un marcador para fijar un sistema de referencia.
10. Desarrollar el software para acoplar el stack de fotografías como una reconstrucción tridimensional.
11. Validar el proceso de reconstrucción tridimensional desarrollado comparando sus resultados obtenidos con procesos ya reconocidos.procesa
12. Identificación de cualidades complementarias del programa VITRAL cuando se emplea en la reconstrucción tridimensioal de otras muestras biológicas.
27
2.3. LISTA DE CHEQUEO
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
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J
rende ri zación
J
+
( animaciones)
Figura 2.3: Mapa conceptual de correlación
Señala las asociaciones de nivel, equipo y técnica de preparación mas significativas que se deben tener en cuenta,
sobre que elementos estructurales es posible la aplicación de una recontrucción 3D.
28
Capítulo 3
ANALISIS Y RESULTADOS
Como ya se anotó anteriormente, la reconstrucción tridimensional de imágenes a partir de MET, objetivo central del presente trabajo de investigación,
exigió la elaboración de un Mapa Conceptual y, con él, la construcción de un
Diagrama de Flujo de las actividades a realizar; posteriormente, fue elaborada
una lista de chequeo pormenorizada de estas actividades permitiendo así la
organización de las tareas a desarrollar ya comentadas en la metodología.
Como resultado del plan de trabajo establecido también cada una de éstas
etapas del proyecto fueron generando unos resultados parciales que, aunque
no eran el núcleo central del trabajo, sí se constituyeron en parte integral del
mismo.
3.1.
De los equipos.
Como ya se mencionó, la primera labor consistió en la evaluación de los
equipos disponibles, su funcionamiento, alcances y limitaciones. Como resultado de este proceso se obtuvo:
Se realizó todo el proceso de limpieza, ajuste y alineación del microscopio
de luz LEICA ORTOPLAN el cual está dotado con los kits para miscroscopía de campo oscuro, para contraste de fase y fluorescencia; este equipo
tiene como propiedad la posibilidad de trabajar con todo el espectro de luz
visible y hace refringente o visible las partes translúcidas, como por ejemplo las membranas celulares sin necesidad de realizar tinción; también
tiene la propiedad de poder trabajar con muestras transluminiscentes y
29
3.1. DE LOS EQUIPOS.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
epiluminiscentes; sin embargo, este equipo carece de cámara fotográfica.
Este microscopio sirvió como instrumento esencial en el diagnóstico del
camino óptico, identificando con él las partes más vulnerables a las interferencias ópticas; además se identificaron las principales características
de cada procedimiento de captura de imágenes a partir de un campo oscuro o de un contraste de fase, los proceso de calibración Köelher y el
análisis de las posibles adaptaciones. Posteriormente, este mismo equipo sirvió de soporte de inspección de muestras, es decir que, sobre él se
construyeron los soportes que contenían la membrana con el propósito
de tener las primeras imágenes que nos permitieran hacer seguimiento
de las panorámicas de los tejidos que se utilizarían posteriormente. Como
puede verse, este equipo fue esencial dentro del desarrollo del trabajo de
investigación. Una vez se puso en marcha, se realizaron pruebas para depurar la magnificación y el contraste. Con la adaptación de una cámara
a un microcopio de luz.
También se contaba con un microscopio electrónico de transmisión, MET,
marca JEOL 100B, en pésimo estado, dado que este equipo durante varios años permaneció fuera de servicio ; por ello fue necesario efectuar
trabajos de róeparación del sistema hidráulico, de la detección de vacío y
del sistema de regulación de alto voltaje; además, se implementó un sistema de recirculación de agua para mejorar la refrigeración necesario para
conseguir baja presión y con ella un alto vacío. Este trabajo fue necesario
hacerlo en virtud del alto poder de resolución del equipo indispensable
para nuestra investigación, por cuanto ella, la resolución, depende solo
de la alta diferencia de potencial en la columna del microscopio, es decir,
de la energía de los electrones. Este microscopio sirvió como instrumento
para capturar imágenes de ultraestructuras a magnificaciones de 50000X
y resoluciones del orden de 5nm. Recordemos que estas imágenes de cada hojuela de la muestra se constituyeron en una parte fundamental del
stack hacia la reconstrucción tridimensional de la muestra.
Otro dispositivo que hacía parte de los equipos iniciales del laboratorio
fue una ampliadora de fotografías con brazo ecualizable y de graduación
vertical, marca LEICA. Este equipo fue modificado para convertirlo en un
esteroscopio con el objeto de obtener las panorámicas de una sección
30
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.2. DE LAS MUESTRAS.
completa del organismo, un escorpión, una libélula y diversos insectos.
Dentro de las modificaciones realizadas se le eliminó todo el sistema de
captura de imágenes y se reemplazó por el sistema de lentes oculares;
se le adaptó un soporte para fijar la cámara CMOS con la cual poder
tomar una serie de fotografías en secuencia fija y con orientación estable. Este equipo se empleó para obtener el primer nivel de acercamiento
de una muestra, con la cual se obtenían imágenes que, posteriormente,
iban a ser empleadas como elemento de verificación de la reconstrucción tridimensional obtenida. El esteroscopio también sirvió, más tarde,
como soporte de la cámara que fue adaptada al microscopio de luz LEICA
ORTOPLAN; este último montaje requirió el diseño de un sistema óptico
adecuado para la captura de imágenes a través del microscopio de luz.
3.2.
De las muestras.
Para insertarnos en el manejo de muestras se hizo necesario el estudio
pormenorizado de los diferentes protocolos de manejo[5] y se reprodujeron algunos de ellos en la adecuación y procesamiento de las muestras para microscopía electrónica de transmisión. Esto nos llevo a los siguientes resultados:
El estudio inicial de las diferentes metodologías de trabajo de las muestras
nos llevó a determinar los procesos mas ádecuados en el alistamiento de
una determinada muestra, figura( 3.1 en la página siguiente). Aquí se
tuvo en cuenta el tamaño, el origen, la textura, la dureza, la adherencia
y la densidad de las muestras para seleccionar el tipo de preparación
más adecuada a las necesidades. Tambien se propuso la metodología de
proporcionar reactivos por gotas y no por mililitros como se ha venido
haciendo en los diferentes laboratorios y se propone como estandar en la
literatura.[3].
A continuación se realizó un estudio de los diferentes procesos de corte
de las muestras con el objeto de generar un protocolo propio de cortes
para diferentes tipos de muestras. Este proceso nos permite realizar cortes con cuchillas aceradas, de vidrio, de diamante, sierras díiamantadas
de diferentes espesores y crio-fractura. Además de estos cortes se aplicó
31
Figura 3.1:
T"
PREPEARACIÓN DESUSTANCIAS
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\
IPREPARACiÓNDEL AMORTIGUADOR1
\
I
I
I
se vierteen
se vierteen
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balóna!crado
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Se pesa VOgr¡
~ /
se vierteen
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\
[] S,IO%PI!
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I
SoluaónamOrtigUadOr, a
detrabalodeglutaraldehldo
AtBtCtO,
MILLONIG--} amoolguadora"sto~"se
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doruro decalao,
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I
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Porcada 55mlde soluaón
' --
Solució namortiguadora
Etanol'100%
I
'--_-,---_-.J Muestrapara
I
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I
Soluciónamortiguadora
I
- Se utilIZa 20ml- - - - - -- - - I
OXido de 'proPll elll
e
4
~
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
~II IZ/ar 17ml
Cloruro de calao,
Sepesa lgr¡
I
l,Ogr de tetróXldo de osmio
O.lmlde glutaraldehldo
2S %Grado ME
balóna!orado
balóna!orado
de 100ml
de SOmlron
con
aguadestilada
aguadestilada,
1
[] 2,S2%PI!
Glutaraldehld02,S%
\
\
Sacarosa,
'-----3
~-'-----~
A~/ \~o
Fos!atode sodiomonobáSlco, HidrÓXido dl SOdiO,
Se pesa 2,26gry
Se pesa 252gry
3.2. DE LAS MUESTRAS.
Guia para la preparación de muestras de microscopía electrónica:
La organización conceptual, muestra en la figura la integración de procesos sobre la preparación de muestras para
microscopía electrónica de transmisión[5], relaciona globalmente las actividades y permite visualizar o hacer ajustes
32
para un proceso específico durante la marcha. Propuesta metodológica elaborada en el Centro de Microscopia de la
PUJ.
PROCESAMIENTODETEJIOOS
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.2. DE LAS MUESTRAS.
íí
í
Figura 3.2:
Procesos de cortes para obtener imágenes:
Las imagenes indican las diferentes técnicas de obtención de cortes: A, B y C. Preparación de muestras para obtener
superficies por el método de raspado; en C, se incluyen las guias para orientación de las superficies. D. Corte de
diente realizado con disco diamatado de espesor 0,3 mm. a 2500 r.p.m y refrigeración por agua. E. corte de diente
utilizando criostato posterior a la descalcificación con acido nitrico al 5 % y coloración con hematoxilina de Mayers.
F. Sección de corte con microtomo de espesor de 25 µm, observado en el microscopio confocal FV1000 de Olympus a
40X. G y H. Metodo de crifractura para observar tubos dentinarios, micrografia a 4000X obtenida en el SEM Quanta
200 de la Universidad Nacional de Colombia y posterior análisis de imagenes con el software libre Image J. I, J y K.
Cortes seriados de sinapsis interneural realizados con el ultramicrotomo sorval MT-1, de espesor de 60 nm vistos al
microscopio electrónico de transmisión a 50000X. Procesos desarrollados en el Centro de Microscopía Electrónica,
Pontificia Universidad Javeriana.
otro método, utilizando el sistema de raspado con el objeto de conseguir
superficies más delgadas. Estos cortes son posibles sobre muestras continuas o discretas (colonias de bacterias), sobre muestras sólidas, como
minerales (vidrio), oseas (dientes), queratinizadas (caparasones) y en vegetales; y también, sobre muestras de cultivos celulares.
Dado que la captura de una imágen de la hojuela proveniente de una
muestra no puede ser orientada previamente para facilitar su posterior reconstrucción, se hizo necesario introducir un sistema de referencia propio
33
3.3. DE LA CÁMARA FOTOGRÁFICA.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
que nos facilitara este proceso. Esto se logró incluyendo guías de orientación como puntos, círculos, líneas, barras u otras señales externas y
distintas al espécimen, figura( 3.2 en la página anterior).í
La importancia de desarrollar estos procesos radica en la necesidad de preservar la morfología e histología de la muestra de modo que no se altere su
biometría y composición. Adicionalmente, la estandarización de estos procesos
permite caracterizar muchos materiales de la naturaleza. Además, la introducción de guías de referencia ahorra posterior trabajo de ajuste de las imágenes
mediante el sotware de alistamiento.
3.3.
De la cámara fotográfica.
La captura de imágenes procedentes de los microscopios hizo necesario el
análisis, evaluación, ajuste al presupuesto, implementación de un proyecto
y, finalmente, compra de este equipo. Con ello se obtuvieron los siguientes
resultados:
Después de un proceso como el ya narrado se logró la adquisición de
la cámara digital Sony SR-1 de 10.3 megapixeles con tecnología CMOS.
Este tipo de cámara resultó favorecida en el proceso de selección porque
su tecnología permite la captura completa de cada pixel de color[1].
La utilización de la cámara exigió adecuación de la distancia óptica; y
hacer coincidir la distancia focal de la cámara con el área de captúra
de la imagen. Esto se logró diseñando las lentes delgadas adecuadas,
mandandolas a pulir en una fábrica y realizando el montaje respectivo.
Eaplicó cadal sistema óptico se complementó con otra lente compuesta
para extender la distancia focal hasta el infinito. Adicionalmente le fueron
adecuadas lentes intermedias para la corrección de la aberración cromatica, generadas por la esfericidad de la lente pulida. Es de anotar que la
corrección se logró con baño de oxidos metalicos sobre la superficie de
las lentesproceso que no es puede realizar en el país por carencia de la
tecnología adecuada y, por ello, fue necesario enviarlas al exterior para
realizarlo.
34
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.3:
3.3. DE LA CÁMARA FOTOGRÁFICA.
Piezas sistema de adaptación óptica:
Sistema óptico diseñado para la adquisición de imágenes en el microscopio de transmisión JEOL 100B. Cuenta con un
vidrio de agujero central para acoplar el objetivo de la cámara formado por 4 lentes , dos de enfoque y dos de corrección
cromática. Diseñado y contruido en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
A pesar de ser una actividad distinta a la óptica asociada a la cámara fotográfica, sí está relacionada con ella, por la necesidad de diseñar, construir
e implementar todo un sistema de ensamblaje del conjunto de lentes de la
cámara. Inicialmente se realizó un diseño que luego fue moldeado con resinas sintéticas de tipo poliester; más tarde, fueron pulidas las roscas de
giro requeridas y las guías de ajuste y separación de lentes y, finalmente,
las lentes fueron ajustadas a presión, garantizando la invariabilidad de
los centros ópticos y su posible desarme para ser implementado en otros
microscopios, si así fuera requerido.
Este equipo fue importante en el desarrollo del proyecto porque permitió
el proceso de adquisición de imágenes de alta calidad. Los dos últimos pasos
descritos anteriormente contribuyeron en la captura de una imagen completa
y enfocada de la superficie de una muestra y posibilitaron eliminar las aberraciones cromáticas generadas por las barras laterales de las rejillas de soporte.
35
3.4. SOBRE LA CÁMARA
3.4.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
De la adecuación de la cámara a los microscopíos.
Una vez capturadas las imágenes procedentes de los microscopios se hizo
necesario el procesamiento de la información digital proveniente de la cámara
fotográfica. El alto costo asociado con el proceso de revelado y al tiempo requerido para ello, exigieron el manejo de un software comercial para recolección,
orientación y almacenamiento en formato de datos de las diferentes fotografías. Una muestra procesada puede contener más de 200 fotografías y podría
llegar a un número cercano a las 1000. Con este proceso se obtuvieron los
siguientes resultados:
Para evitar la oscuridad externa requerida en el MET, generadas por reflexiones que alteraban la información proveniente de la pantalla, se ensambló el sistema óptico incrustándolo en una placa maciza y opaca del
tamaño de la ventana del microscopio sellando toda posibilidad de ingreso de rayos de luz al interior de la zona de trabajo, (figura 3.4 en la página
siguiente).
Para evitar efectos de dispersión, difracción y reflexión al interior del microscopio, generados por la luz emitida por la fluorescencia de la pantalla
se cambió el vidrio principal y original por otro de idénticas características
pero con un agujero en la zona de ubicación del sistema óptico (figura 3.3
en la página anterior). Sin embargo, las bajas presiones a la que quedaba expuesta la lente delgada debido a las condiciones de vacío obligaron
a adaptarle una lente adicional concavo-convexa, de identica curvatura
asegurando la conservación de la distancia focal. Esto premitió soportar,
con seguridad, las bajas presiones del interior del microscopio.
Las huellas que aparecían en las fotografías debidas al deterioro de la
pantalla, exigieron la reconstrucción de la pantalla fosforescente con lo
cual se lograron imágenes más definidas por las características renovadas
de la misma. (Figura 3.5 en la página siguiente).
36
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.4:
3.4. SOBRE LA CÁMARA
Ensamble sistema de adaptación óptica:
La figura muestra los pasos para el montaje de los lentes que arman el objetivo de la cámara y la asegura en el vidrio
de la ventana del microscopio mediante el adaptador cilindrico que aparece en la imagen F. Centro de Microscopía
Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana
Figura 3.5:
Testigos de ancho de banda fosforescente para haz de electrónes.
Las placas en la parte superior actuan como testigos, comprobación de la respuesta de fosforescencia para la radiación
UV larga y corta. Al observar el testigo: A. Iluminación con luz día, no presenta fosforescencia. B. Excitación con UV
de longitud de onda larga, no hay respuesta. C. Excitación con UV de longitud de onda corta, el testigo fluoresce. La
pantalla es fosforescente en todo el espectro de UV después de su reconstrucción, imágenes de la pantalla en B y C.
Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
37
3.4. SOBRE LA CÁMARA
Figura 3.6:
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Sistema de adquisición de imágenes digitales para MET:
Cámara digital adaptada al microscopio electrónico de transmisión JEOL 100B. Monitorea la
imagen sobre la pantalla fosforescente en el microscopio y evita cualquier incidencia de luz de
exterior hacia el interior. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Los procesos de adaptación de la cámara nos eliminaron la posibilidad
de observar la muestra por el aislamiento de todo el montaje. Esto hizo
necesario implementar un sistema de seguimiento y selección de la zona
de interés. Para ello se adquirió una tarjeta capturadora de video que,
introducida en un computador, permitiera, a través de la misma cámara,
monitorear la ubicación del haz de electrones sobre el espécimen y así
delimitar la ultraestructura de interes. (Figura 3.6).
Esta adaptación de la cámara digital al MET aportó al proyecto los siguientes
beneficios: se posibilitó obtener imágenes de alta calidad en formato digital, se
logró disminuir el tiempo de procesamiento al evitar el revelado de las imágenes y su consiguiente escaneo, se pudo aumentar el número de exposiciones
fotográficas y, a partir de ellas, determinar aquella o aquellas que nos entregaran la imágen más definida, lo cual significó un ahorro efectivo en tiempo y
material.
La disposición de la cámara sobre el microscopio facilitó la manualidad y
visualuzación directa de los archivos fotográficos posibilitando una posterior
readecuación del trabajo que anteriormente no se podia realizar hasta poseer
todas las fotografias reveladas. También se evitaron las exigentes condiciones
38
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.5. INTERFERENCIAS ÓPTICAS
de oscuridad total en el lugar de trabajo del MET y se hicieron más eficientes
las condiciones de oscuridad al interior del microscopio.
Un aporte adicional de la adecuación de la cámara y su ensamblaje al microscopio fue la posibilidad de emplear todo el sistema óptico diseñado[10],
tanto en el MET como en el microscopio de luz y en el esteroscopio.
3.5.
De la eliminación de interferencias ópticas
indeseadas.
Una dificultad adicional que se presentó en el proceso de observación de
muestras inmersas en el microscopio de luz, debido a la necesidad de acercar
el lente objetivo a la muestra y que se puede convertir en una seria dificultad
en la reconstrucción tridimensional de una muestra, consiste en la presencia
de elementos de interferencia óptica ajenos a los provenientes de la muestra.
Estos elementos hacen referencia a una posible suciedad en alguna zona del
espacio de trabajo, a la presencia de imperfecciones sobre la superficie de los
materiales utilizados o de contaminaciones provenientes del medio. También
a fenómenos ópticos, reflexión, refracción, difracción, presentes en los vidrios
porta y cubre-objetos. Para solucionar estos impases se desarrolló un proceso
de detección que condujo a los siguientes resultados:
Se elaboró un protocolo de detección y seguimiento de posibles fuentes de
suciedad y su tratamiento posterior. Las fuentes así estudiadas provenían
de falta de homogeneidad del rayo luminoso, de falta de homogeneidad en
el aceite de inmersión, de impurezas en la composición del vidrio porta
y cubre-objetos o de contaminación de las lentes condensadoras o de los
lentes objetivo.
Se adaptó una membrana polimérica, empleada en MET para tapizar rejillas, como elemento sustitutivo del vidrio porta-objetos con el fin de eliminar los efectos de difracción producidos por el vidrio sobre el rayo luminoso al atravesarlo. Además, al sustituir el vidrio, se eliminan las interfases
vidrio-aire o vidrio-aceite, las cuales generan un cambio del índice de refracción afectando la calidad de la imagen. (Figura 3.8 en la página 41).
39
3.5. INTERFERENCIAS ÓPTICAS
Figura 3.7:
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Imáges de Tardigrados observados en microscopía confocal :
Observación a 20X de una muestra viva del tardigrado (osito de agua) en montajes diferentes con el microscopio
confocal FV1000 de Olympus. La imagen A es el resultado del montaje sobre vidrio cubre-objetos. El montaje B.
muestra la uniformidad y finos detalles de éste espécimen animal al ser observado en un montaje sobre la membrana
polimérica. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
El beneficio de este protocolo para el proyecto de investigación radicó en aseguramiento de limpieza de la fuente de iluminación y del camino óptico con sus
elementos asociados. Además se garantiza la distribución homogenea del área
iluminada; este proceso se conoce como “Proceso de alineación Köheller”. [13].
Otro beneficio obtenido para el trabajo fue el conocimiento acerca del adecuado uso del aceite de inmersión en el momento de su aplicación: su agitación
remueve las partículas sedimentadas en el fondo generando difracción del rayo
de luz incidente.
La adaptación de una membrana polimérica en sustitución del vidrio portaobjetos incidió en el trabajo de investigación posibilitando el mejoramiento en
la calidad de las imágenes obtenidas de una muestra en estudio al evitar las interferencias ópticas mencionadas. Adicionalmente, el empleo de la membrana
permite el traslado de una muestra en estudio desde el MET hasta el microscopio de luz y su retorno.
40
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.8:
3.6. VALIDACIÓN DE LA MEMBRANA
Efecto del aceite de inmersión en la interfase óptica:
Los aceites de inmersión en el laboratorio presentan indices de refraccion aproximados a 1.6, que se ve afectado
cuando este se agita y las partículas sedimentadas se interponen en la trayectoria del rayo laser, la imágen muestra
puntos brillantes donde se aprecia la difracción del haz.
3.6.
De la validación del protocolo anterior.
El hecho de haber limpiado de impurezas el camino óptico y sus elementos
y el haber sustituido el vidrio porta-objetos por una membrana nos debería
dar como resultado imágenes de mejor calidad. Sin embargo, fue necesario
corroborar los resultados esperados del proceso anterior. Para esto se procedió
a realizar un escaneo laser para un análisis espectral del aceite de inmersión
y del vidrio porta-objetos en el microscopio confocal. (Figuras 3.8, 3.9 en la
página siguiente) y para la membrana (figura 3.10 en la página siguiente).
Como resultado del espectro obtenido se observa una distribución no regular
del recorrido del haz laser dentro del aceite y aparecen visos de puntos de
mayor intensidad, causados por partículas de diferente transparencia, ya sea
en el vidrio o en el aceite. Al realizar el cambio del vidrio por la membrana
y someterla al mismo proceso anterior, escaneo laser espectral, se apreció la
distribución normal del rayo laser y la eliminación de las interferencia por
partículas extrañas. Como resultado de este proceso se puede señalar:
Se consiguió validar el proceso de limpieza y eliminación de interferencia
óptica.
Se determinó mediante el análisis de escaneo laser espectral, la autoflorescencia de la membrana polimérica, formvar, con un pico gaussiano en
41
3.6. VALIDACIÓN DE LA MEMBRANA
Figura 3.9:
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Escaneo Laser del vidrio cubreobjetos:
La linea amarilla representa la respuesta en fluorescencia del material de vidrio, los visos perpendiculares sobre el
vidrio son efectos de difracción por irregularidades en su superficie, componentes que hace que se comporte como
heterogeneo. Las bandas vistas en tonalidades son causadas por la reflexión del rayo laser sobre la superficie del
vidrio. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Figura 3.10:
Interfase con membrana:
No se aprecia separación de los medios aceite-membrana. Al igual que se elimino el problema de interferencia del
vidrio y del aceite. A causa del humedecimiento de la membrana no puede ser detectada en la imagen. Centro de
Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
42
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.11:
3.7. HOJUELAS SERIADAS
Caracterización espectral de la membrana polimerica de formvar:
En el equipo de escaneo laser confocal FV1000 de Olympus, la figura muestra el pico de emisión en 543 nm. y un
ancho de banda aproximado 30 nm. Trabajo realizado en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad
Javeriana.
543±1 nm. Con esto se posibilita encontrar aplicaciones adicionales para la membrana como el marcaje con fluorocromos en rangos espectrales
distintos al pico gaussiano. (Figura 3.11).
La incidencia de estos resultados en el trabajo de investigación consistió en
conseguir la garantía que la información proveniente de la muestra pertenecía
a ella misma y estaba libre de impurezas ajenas a la estructura.
3.7.
De la obtención de hojuelas por cortes seriados.
Los cortes realizados a las muestras usando ultramicrótomos se realizaban
de manera manual y los buenos resultados en los cortes semifinos y ultrafinos
sólo dependían de la habilidad del instrumentador y se obtenían secuencias
de un número pequeño de cortes. Para mejorar este proceso se buscó implementar un sistema motorizado de corte con control electrónico de modo que
mantuviera constante la velocidad de corte y la presión sobre la muestra; esto
exigió el manejo de motores paso a paso y el diseño de circuitos electrónicos de
control. Adicionalmente, para regular los cortes se elaboró un software para
el control de motores a través de los puertos seriados RS-232 y paralelo del
computador. Como resultado de estos procesos se logró:
Diseñar un protocolo de corte seriado con control electrónico o con un
control a través de los puertos del computador.
43
3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA. CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.12:
Cortes seriados para microscopía de luz y electrónica:
En la obtención de cortes seriados, el control del espesor es relacionado con el color del corte como una respuesta de
interferometría. Los cortes gruesos y semifinos son multicolores en (C). Los cortes delgados ultrafinos son plateados
en (D). Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Este diseño tuvo su incidencia en el trabajo de investigación garantizando la
uniformidad de los cortes, con un espesor constante, del orden de 60 nm. (Figura 3.12).
Es importante resaltar que la tecnologia ópticas de MET y de microscopia
de luz son sistemas que hasta este trabajo de investigación exigian preparaciones y montajes de muestras independientes y diferentes. A partir de esta
innovación los dos sistemas ópticos se complementan, es decir, que la misma muestra que se prepara para el MET también se puede inspeccionar en el
microscopio de luz. Esta situación ahora nos permite realizar observaciones
complementarias, independientes o de validación al emplear alternativamente
los equipos.
3.8.
De la fijación de la membrana.
A esta altura del trabajo se tenía claridad sobre la necesidad de sustituir
el vidrio portamuestras del microscopio óptico por una membrana que permitiera eliminar las interferencias del camino óptico propias del rayo luminoso,
reflexión, refracción y difracción. El otro problema a superar era que, si se
cambiaba el vidrio por una membrana, aparecía la dificultad de sostenerla y
tensionarla.
44
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA.
La primera dificultad se corregió probando diferentes posibilidades de solución, colodión, alcohol polivinílico, polietileno y formvar, hasta conseguir el
tipo de membrana apropiada como portamuestra. Es de notar que, se buscaba
un material que pudiera sostener muestras de diferentes tamaños, pesos, consistencias, estados y la membrana desarrollada cumplió con estas exigencias.
La membrana elegida fue la de formvar, (figura 3.13 en la página siguiente),
una de las membranas empleadas en los procesos regulares de microscopía.
Adicionalmente, se probó la consistencia y degradación de la membrana manteniéndola inmersa en agua durante un período de tres meses. La membrana
así probada mantuvo sus características inalteradas, confirmando su calidad.
El problema de sostener y tensionar la membrana se podría haber solucionado con la adquisición de una rejilla única que soportara a la membrana en
sus extremos pero, dado los costos y demora en ingresar al país, la hizo poco
viable como solución. En vista de esto, se optó por diseñar rejillas de cobre
con características similares a las comerciales y que fueran intercambiables
en los dos tipos de microscopios. El resultado fue la elaboración de un variado número de clases de rejillas y su posterior montaje en grupos de 60 rejillas
independientes en el mismo soporte portamuestras, ver (figura 3.17 en la página 48), con lo que se podía realizar varias observaciones en forma consecutiva
en el microscopio.
Se pueden sintetizar los resultados finales de este proceso así:
Se cuenta con una membrana portamuestras que posee una perfecta
adeherencia a plásticos y metales condición ésta que permite su tensión
sin deformarse; la posibilidad de elaborarla con mayor o menor espesor
lo cual implica mayores posibilidades de trabajo con diferentes tipos de
muestra; la alta cohesión molecular de esta membrana permite espesores
muy pequeños (±60 nm) sin deformaciones o perforaciones, incluso cuando es atacada por un haz de electrones.
Se cuenta con una membrana que, por sus propiedades de consistencia y
preservancia, permite ser utilizada como fondo de un recipiente húmedo
para análisis de muestras vivas, en la (figura 3.14 en la página siguiente), medios de cultivo o para materiales seccionados, sin que interfiera
biológicamente con ellas y sin perder sus propiedades.
45
3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA. CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.13:
Membrana Polimérica (Formvar):
El aspecto rugoso de la membrana es eliminado con vapores de xilol de ser necesario. También por la tensión ejercida
por el soporte o por entrar en contacto con la cara frontal del objetivo. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia
Universidad Javeriana.
Figura 3.14:
Aplicación de la membrana con un espécimen biológico.
De fondo se observa la textura de la membrana polimerica que no interfiere con las partes del especimen. Centro de
Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
46
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA.
Figura 3.15:
Citoesqueleto de astrocitos
Crecimiento de astrocitos sobre la membrana enriquesida con nutrientes y dopada con L-polilisina y D-polilisina.
Resumen de la secuencia de neuro fibrillas marcadas con FITC, observadas con escaneo laser. Centro de Microscopía
Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana
Se cuenta con una membrana que, por su característica apolar, permite
eliminar influencias electrostáticas sobre la muestra, facilitando la manipulación de la muestra.
Se cuenta con una membrana que permite variar su propiedad de apolaridad, permitendo ser dopada, para que sobre ella se adhieran, tanto los
nutrientes (sustratos) para el cultivo de células, como las mismas células
en crecimiento. (Figura 3.15).
Se cuenta con un sistema múltiple de rejillas individuales e independientes que permiten la realización de observaciones consecutivas e independientes a muestras seriadas o, incluso, a muestras distintas. (Figura 3.16
en la página siguiente)
Con la implementación de la membrana se aseguró eliminar las interferencias ópticas sobre la muestra, con lo cual se consiguieron imágenes independientes de muestras intercambiables entre los equipos de diferente naturaleza
47
3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA. CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.16:
Diseño y elaboración de rejillas:
Modelos de rejillas en cobre con suficiente espacio libre interior, para visualizar varios cortes seriados sin interrupción
óptica y facilitar la reconstrucción en Z. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Figura 3.17:
Porta rejillas para microscopía óptica:
Sistema de soporte para rejillas tapizadas con membranas poliméricas que pueden ser inspeccionadas en microscopía
óptica convencional. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana
48
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.9. ARHIVO Y CAPTURA DE IMÁGENES
óptica, y de mejor calidad. Además se pudo contar con un método de observación para muestras de variadas características vivas o inertes.
Estos resultados también permitieron obtener seguimiento secuencial a
una gran cantidad de muestras proveniente de los cortes seriados.
3.9.
De la captura de imágenes y su archivo.
Las imágenes inicialmente obtenidas a través de la cámara, en formato
RAW, que provienen de una muestra con un área del orden de milimetros,
tienen que ser procesadas mediante un editor de imágenes; sin embargo, este proceso puede significar pérdida de información dependiendo del programa
empleado, en formato gif, tif o jpg; puede también significar pérdida de orientación de las imágenes o puede implicar alta necesidad de memoria de procesamiento en un computador. Estas condiciones llevaron a evaluar la posibilidad
de seleccionar sólo aquellas partes de una imágen que fueran fundamentales
en la reconstrucción tridimensional de un espécimen. Así, se tomaron todas
las imágenes en formato RAW, se estableció la zona de interés en cada una de
ellas y se eliminó el resto de imagen, con lo cual, el peso computacional de la
imagen se redujo considerablemente y el área de trabajo de la muestra pasó al
orden de los µm. Cada imagen así reducida se volvió a procesar en el programa
editor de imágenes: allí se resaltó con un color diferente sólo la parte de interés
de la muestra que se deseaba reconstruir tridimensionalmente. Con el mismo
editor se procede a reorientar la zona de interés de cada foto, para que encajen
cada una con la siguiente, conformando el denominado stack de fotografías.
El bloque organizado de fotografías es archivado en formato jpg, con lo cual
el archivo es mucho más libiano en datos y una vez seleccionada la zona de
interes, no hay pérdida de información.
Con este proceso se logró obtener los siguientes resultados:
Se tiene un stack ver (figura 3.18 en la página siguiente) de fotografías
orientadas y encajadas en formato jpg que permite su procesamiento
computacional.
Cada elemento del satck tiene demarcada la característica estructural
de la muestra sin pérdida de información debido al tipo de adquisición
realizada a partir del formato original RAW.
49
3.10.
RECONSTRUCCIÓN 3D.
Figura 3.18:
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Reconstrucción en Z de un artrópodo:
Montaje realizado por medio de transparencias sin quitar información de color hasta obtener el stack para ser reconstruidoen 3D, Encajando las transparencióa se hace la reconstrucci´on bidimencional con proyección en Z. Imágenes
obtenidas en el Centro de Microscopía Electrónica Pontificia Universidad Javeriana.
El proceso diseñado de construcción del stack permite la reconstrucción
tridimensional de imágenes para muestras con ordenes de magnitud desde cm hasta nm.
Es evidente la importancia que tuvo la construcción del stack de imágenes
por cuanto se constituyó una base computacional hacia la reconstrucción tridimensional de imágenes. Por otra parte, se pudo asegurar la reconstrucción
tridimensional de calidad para una muestra, debido a la captura total de información adquirida desde el formato RAW. Finalmente, se cuenta con todo
un protocolo de trabajo para la reconstrucción tridimensional de muestras de
variada magnitud.
3.10.
De la reconstrucción tridimensional.
Hasta este momento el trabajo contaba con una serie de imágenes planas
con demarcaciones de zonas por colores. Sin embargo, surgió la necesidad de
asociar cada imagen con la inmediatamente superior o inferior. Esto significa
50
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.10.
RECONSTRUCCIÓN 3D.
que, cada imagen se debe vectorizar, es decir, tomar una decisión en torno al
número de puntos a digitalizar y, a partir de allí, obtener las coordenadas de
cada punto y su intensidad de color para así armar con ellos una base de datos
para cada una de las fotografías. A continuación, el problema se centró en buscar la manera de conectar un punto de una fotografía con alguno de los puntos
de la siguiente fotografía. Esto implicó establecer criterios de seguimiento de
estos puntos en los diferentes niveles; para ello se hizo necesario evaluar diversos programas de cómputo de lectura de coordenadas de cada uno de los
puntos buscando la generación de paredes de las imágenes reconstruidas.
Sin embargo, no existe el programa que haga la reconstrucción completa.
Por ello fue necesario emplear un primer programa denominado VTK, encargado de generar los cubos de menor volumen, es decir, el formado por los puntos
contigüos de una fotografía con los que le encajan de la siguiente. A estos
cubos se les denomina “cubos marchantes”.
El siguiente programa utilizado se denomina JOGL y su labor consistió en
seleccionar conjuntos de tres puntos contiguos del cubo en estudio, donde
se consideran tanto los vértices del cubo como los puntos centrales de cada
arista del mismo cubo. Sin embargo, el proceso inicial de lectura de las coordenadas de cada punto en cada nivel tenía una exigencia computacional muy
alta, es decir, exigía muchas horas y vasta memoria computacional. Para mejorar el problema se buscó aprovechar la simetría de los diferentes tríangulos
inmersos en cada cubo. Este proceso llevó a generar sólo 14 posibilidades de
asociación de triángulos a partir de cada cubo de mínimo volumen. Así, en
cada triángulo formado se pasó a evaluar la intensidad de los diferente puntos
y, si es la misma para los tres, significaba que correspondían a una superficie
sólida o pared; de lo contrario, ellos correspondían a superficies distintas y se
abandonaban para pasar al siguiente triángulo.
El tercer programa empleado fue el ZBUFFER que se encargó de vectorizar
las superficies seleccionadas en la etapa anterior, es decir, la red de triángulos,
leyéndolos uno a uno. El programa toma la intensidad de cada triángulo y la
compara con la de los triángulos aledaños, asignándole a cada grupo de ellos
una tonalidad de color con lo cual se van formando volúmenes con color que
van degradándose dependiendo de su ubicación en el cubo, es decir, aplicando
el efecto de perspectiva a la imagen a partir del uso del color y las sombras
asociadas, técnicamente denominado “Shading”.
51
3.10.
RECONSTRUCCIÓN 3D.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
El cuarto programa, denominado VITRAL, fue creación del grupo de investigación formado a partir del trabajo. Para el desarrollo de software fue necesario
contar con la colaboración de dos profesores de ingeniería, uno interno y otro
externo a la Universidad, encargados de su optimización, tanto a nivel de mejoramiento del software como de traducción de información desde un lenguaje
computacional a otro, tarea requerida en diferentes etapas del proceso.
El propósito de este programa fue el encadenar los tres anteriores a partir de un Diagrama de Flujo que establecía el alcance de cada uno de ellos y
su integración con el siguiente para evitar los traslapes, conflictos o desbordamiento entre ellos. Está dotado de un acelerador de video y permite ahora
sí, la reconstrucción de la imagen completa desarrollada a partir del programa
anterior. Adicionalmente, el programa VITRAL mantiene el caracter vectorial de
las imágenes con lo cual se hace posible la rotación de la imagen, su aumento,
su disminución o, incluso, la navegación al interior de ella.
Sintetizando, las etapas específicas, desde la perspectiva técnica, de este
proceso de reconstrucción tridimensional se puede esbozar como:
Para organizar y vectorizar las imágenes, proceso denominado digitalización, se utilizaron las librerias Java Media Framework (JMF) y Java
Advanced Imaging (JAI).
Para organizar los “cubos marchantes” y simplificar el trabajo computacional, aprovechando los principios de simetría, para realizar la organización volumétrica estructural de los objetos, se implemento la libreria
VTK.
Para convertir la información procedente del lenguaje C hacia Java, se
implementó el software libre JOGL y las librerias integradas OPENGL y
MESA 3d que permiten implementar el programa de visualización ZBUFFER pero en lenguaje Java.
Es de valorar el oportuno aporte que el grupo SIDRE de la Facultad de Ingeniería de la Pontificia Universidad Javeriana dió al proyecto. Este grupo desarrollo
inicialmente el programa VITRAL, con el cual implementaban la representación
tridimensional de figuras sólidas como apoyo didáctico hacia la obtención de
las diferentes “vistas” del objeto, pero sin posibilidad de interacciones con ellas.
La necesidad compartida llevó a que los dos grupos de trabajo adelantaran en
52
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.11. VALIDACIÓN R 3D.
el desarrollo de un programa de aplicación múltiple, tanto en ingeniería como
en ciencias.
Este proceso se manifestó en los siguientes resultados:
Se tiene un software que permite la reconstrucción tridimensional de imágenes con la posibilidad de animación y visualización de ellas.
Adicionalmente, el software desarrollado permite el proceso de “renderización”, consistente en realizar acercamientos hacia la muestra, penetrando
sus paredes para visualizar su interior y llegar a atravesarla totalmente.
Estos resultados tuvieron una incidencia básica en el desarrollo del trabajo
investigativo por cuanto significaron la generación de un programa de visualización propio y con un nivel de profundización mucho más alto que los conocidos hasta ahora. Adicionalmente, el programa permite el acercamiento a una
muestra, su visualización interna hasta ser atravesada totalmente, posibilitando un análisis interno de las características de la muestra en estudio.
3.11.
De la validación de la reconstrucción tridimensional.
Una vez obtenidos los primeros resultados de la aplicación del programa
VITRAL para la reconstrucción de muestras hubo necesidad de validar el software desarrollado. Para esto, se efectuaron trabajos comparativos entre el
software VITRAL y el suministrado por la empresa OLYMPUS, con el equipo
FV1000 y por la empresa CARL ZEIZZ, con el equipo META 510. El software
asociado a cada uno de estos equipos tiene la capacidad de realizar reconstrucciones tridimensionales a partir de cortes obtenidos desde un escaneo laser, desarrollado en muestras con áreas del orden de los µm y con espesores
del orden de los nm.
Con cada uno de los equipos fueron capturadas las imágenes y generado el
stack de reconstrucción; a continuación, esta información fue utilizada para
realizar la reconstrucción tridimensional de la muestra de manera independiente. Una vez realizado esto se tomó cada uno de los stack organizados y se
introdujo su información al programa VITRAL, el cual realizó la reconstrucción
53
3.12.
CUALIDADES VITRAL
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
tridimensional obteniendo resultados similares a los arrojados por los programas comerciales antes mencionados.
Es necesario anotar que los equipos comerciales referenciados tienen la limitante de exigencia en realizar la reconstrucción tridimensional sólo a partir
de los datos provenientes del mismo equipo, es decir, no permiten operar con
información proveniente de otros equipos. Por el contrario, el programa VITRAL
ha permitido no solo trabajar con información proveniente de los stacks generados desde el mismo equipo sino que, además, tiene la posibilidad de operar
la infomación proveniente de stacks obtenidos a partir de otros equipos.
En las figuras adjuntas se muestran los resultados de la reconstrucción
tridimensional del sistema ganglionar de una sanguijuela, obtenida a partir del
microscópio confocal Olympus FV1000 y su análogo obtenido con el programa
VITRAL; esto se visualiza en la (figura 3.19 en la página siguiente).
Este proceso se puede sintetizar en el siguiente resultado:
Se cuenta con el programa de reconstrucción tridimensional estandarizado con patronización internacional, con fines de aplicación en las diferentes técnicas de microscopía.
La validación del programa VITRAL dentro del contexto del trabajo de investigación implicó la garantía sobre la calidad de los procesos de reconstrucción
que fueron realizados con posterioridad. Estos resultados permitieron concentrarse en la búsqueda de profundización en la visualización de muestras.
3.12.
De la identificación de cualidades complementarias del programa VITRAL.
Los resultados obtenidos con el desarrollo e implementación del programa
VITRAL condujeron a la necesidad de identificar otras cualidades que puediera
brindar el mismo programa cuando fuese aplicado en otras condiciones y a otro
tipo de muestras.
Un trabajo inicial consistió en corroborar la reconstrucción sinaptica con
MET: el comportamiento de la membrana desarrollada como soporte, tanto
de muestras biológicas, como de crecimiento celular. La homogeneidad de la
54
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.12.
A
Figura 3.19:
CUALIDADES VITRAL
B
Reconstrucción tridimensional de glanglios de sanguijuela. A la izquierda
se presenta la imagen 3D de los ganglios de una sanguijuela, cuadros escaneados con microscópio confocal FV1000
realizados por el equipo de trabajo de la empresa Olympus. A la derecha se utilizó el mismo stack de imágenes y se
proceso la reconstrucción 3D y renderización con el programa VITRAL. Este trabajo comparativo fue realizado en el
Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana
55
3.12.
CUALIDADES VITRAL
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
membrana mostró que la textura de ella no interfiere ni apantalla la información suministrada por la muestra en estudio. La membrana con nutrientes
como sacarosa, glucosa y otros similares, sumados a su dopaje para adquirir
polaridad, como en el caso de la L−polilisina y de la D−polilisina, permitieron el
crecimiento celular sobre la misma membrana eliminando los soportes de acrílicos y de vidrio, normalmente utilizados para estos fines. Adicionalmente, el
proceso desarrollado permite la utilización de la membrana y cultivo como elementos integrados para ser observados en cualquier tipo de equipo, incluyendo
el microscopio electrónico de transmisión, MET. (Figura 3.20 en la página siguiente). Estas propiedades de la membrana, que permiten obtener cultivos
celulares incluidos en resinas poliméricas para ser seccionadas en hojuelas
ultradelgadas y con ello ser observadas en el microscopio electrónico, permitieron obtener una visualización a mayor profundidad y especificidad, donde
el programa VITRAL se encargó de reconstruir muestras a un nivel antes no
alcanzado. Esta propiedad es resultado del efecto integrado de la membrana y
el programa VITRAL.
Otra cualidad de la aplicación del programa VITRAL es la didáctica. Se puede obtener la reconstrucción de una muestra estática y contar con animación
a partir de la captura de información directa de la muestra; esto hace posible reconstruir un órgano humano o una sinápsis entre células nerviosas,
visualizarlas, rotarlas en diferentes direcciones, hacerles acercamientos e introducirse en ellas permitiendo la visulización desde su interior con fines de
enseñanza.
56
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.12.
Figura 3.20: Reconstrucción sinaptica con MET:
CUALIDADES VITRAL
En A se encuentra la micrografía segmentada de
una sinapsis de hipocampo de rata wistar adulta encajada con el stack de fotos seriadas adquiridas con el microscopio
electrónico de transmisión JEOL 100B a 50000X y una resolución de 5 nm. En B. se presenta la Reconstrucción
Tridimensional, generada a partir del stack mostrado en A, con el programa VITRAL. Las imágenes de C y D señalan
la existencia de vesílculas presinápticas al interior de la sinapsis, un proceso de renderización, también efectuado por
el programa vitral. Estudio realizado en el Centro de Microscopía electrónica Pontificia Universidad Javeriana.
57
3.12.
CUALIDADES VITRAL
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.21: Reconstrucción 3D del cultivo Celular:
Cultivo celular de astrocitos, reconstruidos
tridimensionalmente con el programa VITRAL. trabajo realizado en el ceentro demicroscopia electrónica Pontifica
Universidad Javeriana.
58
Capítulo 4
Conclusiones.
A partir de las condiciones iniciales dadas, se logró consolidar el programa VITRAL de reconstrucción tridimensional de imágenes de diversos
espécimenes provenientes de diferentes tipos de microscopios.
El proceso desarrollado permite una mayor calidad en definición y profundidad de las imágenes reconstruidas tridimensionalmente con respecto a
las obtenidas a partir de los equipos comerciales con el mismo principio
de funcionamiento.
El proceso implementado permite analizar una misma muestra de manera complementaria con dos tecnologías ópticas de distinta naturaleza:
la de microscopía basada en fotones o de luz y la microscopía basada en
electrones o del microscopio electrónico de transmisión, MET.
El trabajo desarrollado se constituye en una evidencia de los mayores
alcances que se pueden obtener cuando el nivel de exploración de los
equipos y de los procesos se profundiza en habilidad y conocimiento.
Las actividades intermedias exigidas por el proyecto llevaron a la necesidad de replantear el objetivo general inicial hasta convertirlo en Diseñar, desarrollar, validar e implementar un método de procesamiento y
reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopía con desarrollos propios a partir de los recursos existentes en el Laboratorio de
Microscopía de la Pontificia Universidad Javeriana.
59
CAPÍTULO 4. CONCLUSIONES.
El trabajo desarrollado es muestra que, con equipos con cierto deterioro,
es posible conseguir resultados similares o iguales a los obtenidos con
equipos de reciente producción.
El trabajo realizado fué una demostración de la interdisciplinaridad en el
ejercicio investigativo.
También se alcanzaron otras conclusiones específicas intermedias, pero no menos importantes: Se optimizó todo el sistema óptico de captura
de imágenes procedentes de los microscopios eliminando el revelado de
películas, lo que implicó mejoras en tiempo y costo. El empleo de la membrana optimizada generó la eliminación del índice de refracción del vidrio
en el espacio de trabajo.
60
Capítulo 5
Impacto del trabajo investigativo.
El desarrollo de este trabajo posiciona al Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana a la altura de los mejores a
nivel nacional y lo hace competitivo a nivel internacional.
La posibilidad de reconocimiento e inspección profunda de estructuras y
ultraestructuras abre posibilidades inmediatas de trabajo en el campo del
reconocimiento de ultraestructuras específicas por métodos de inmunomarcaje.
El trabajo realizado permitió la consolidación de la línea de investigación
en óptica denominada: “ Microscopía de ultraestructura”.
El trabajo desarrollado fue una oportunidad de aprendizaje y crecimiento conceptual por parte de los estudiantes implicados en las diferentes
etapas del mismo.
El trabajo realizado posibilita la creación y organización de cursos, prácticas de laboratorios, adiestramiento en procesamiento de muestras y manejo de equipos y, se constituye en base de conocimiento para las personas que se acercan al estudio de la óptica.
61
CAPÍTULO 5. IMPACTO DEL TRABAJO INVESTIGATIVO.
62
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