(PCR) en tiempo real - Fundación Villavicencio

1982
FUNDACION
Dr. J.R. Villavicencio
Avances en el Diagnóstico Molecular: reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real
Dres. Sergio Lejona1 Maria Silvina Benetti2 Fabián Fay3 Oscar Fay4
Laboratorio CIBIC. Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A. Rosario. Argentina
1
Responsable Área Investigación y Desarrollo
2
Responsable Área Biología Molecular
3
Director Ejecutivo
4
Director General
Rosario, Argentina
[email protected]
Resumen
En los últimos años, la reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real (RT-PCR) ha surgido como
una metodología robusta y extensamente utilizada para
la investigación biológica porque puede diferenciar y
cuantificar cantidades muy pequeñas de Acidos
Nucleicos (ADN y ARN). En el área de la investigación
básica, una de sus mayores aplicaciones es la
evaluación rápida y exacta de cambios en la expresión
génica como resultado de procesos fisiológicos o
patológicos. Para el diagnóstico clínico, la reacción en
cadena de la polimerasa en tiempo real puede ser
utilizada para medir las cargas vírales o bacterianas o
evaluar el estado de diferentes tipos de cáncer.
Abstract
In recent years, real-time polymerase chain reaction
(RT-PCR) has emerged as a robust and widely used
methodology for biological investigation because it can
detect and quantify very small amounts of specific
nucleic acid sequences. As a research tool, a major
application of this technology is the rapid and accurate
assessment of changes in gene expression as a result of
physiology or pathophysiology. For clinical molecular
diagnostics, real-time PCR can be used to measure viral
or bacterial loads or evaluate cancer status.
Key words: real-time polymerase chain reaction fluorophore - viral load
Palabras clave: reacción en cadena de la polimerasa
en tiempo real - fluoroforo - carga viral
Introducción
En los últimos años, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en tiempo real “Real Time PCR” ha
surgido como una metodología robusta y extensamente
utilizada para la investigación biológica ya que puede
identificar y cuantificar cantidades muy pequeñas de
Ácidos Nucleicos (ADN y ARN) en forma específica.
Como herramienta de investigación, su importancia se
debe a que su tecnología permite determinar en forma
rápida y exacta cambios en la expresión génica
resultantes de fenómenos fisiológicos o patológicos. De
esta manera es posible correlacionar la fisiopatología con
los eventos moleculares lo que permite un mayor
entendimiento de los procesos biológicos. Esta
metodología se basa en la reacción de PCR desarrollada
por Kary Mullis en la década de los ´80, que permitió a los
investigadores amplificar grandes cantidades de ADN en
forma específica (1- 3). Las diferentes metodologías que
aplican la PCR han propulsado a la biología molecular
hacia delante, permitiendo a los investigadores manipular
el ADN, facilitando procedimientos comunes, como el
clonado, y permitiendo grandes emprendimientos como
el Proyecto Genoma Humano (4, 5). La PCR en tiempo
real representa otro salto tecnológico que ha generado
nuevas expectativas para los investigadores, esto es en
parte porque la enorme sensibilidad de PCR ha sido
emparejada a la precisión proporcionada con la
detección en tiempo real de los productos de la PCR.
Esta tecnología nació en los años ´90 cuando Higuchi y
colegas (6, 7) en Roche y Chiron realizaron la primera
reacción de PCR en tiempo real utilizando el marcador
fluorescente BrEt (bromuro de etidio) el cual aumenta su
fluorescencia al unirse al ADN y siguieron la reacción de
PCR con una videocámara. Subsiguientemente, esta
tecnología maduró rápidamente en un mercado
competitivo; esto es evidenciado por el número de
compañías que ofrecen equipamiento y reactivos para
PCR en tiempo real y la cantidad creciente de
publicaciones científicas que incluyen esta metodología.
El primer equipamiento para realizar PCR en tiempo real
fue comercializado en 1996 por Applied Biosystems,
posteriormente se fueron incorporando distintas
empresas como BioGene, Bioneer, Bio-Rad, Cepheid,
Corbett Research, Idaho Technology, MJ Research,
Roche Applied Science, y Stratagene.
En la PCR en tiempo real, los procesos de amplificación y
detección se producen de manera simultánea dentro del
mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción
posterior. Además, mediante detección por fluorescencia
se puede medir durante la amplificación la cantidad de
ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de
fluorescencia producida en la reacción es proporcional a
la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y
registrar en todo momento la cinética de la reacción de
amplificación (6,7). Los termocicladores para llevar a
cabo la PCR en tiempo real incorporan un lector de
fluorescencia y están diseñados para poder medir, en
cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno
de los viales donde se realice la amplificación.
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Avances en el Diagnóstico Molecular: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real
Sistemas de detección por fluorescencia empleados
en la PCR en tiempo real
Agentes intercalantes: son fluorocromos que aumentan
notablemente la emisión de fluorescencia cuando se
unen a ADN de doble hélice. El más empleado en PCR en
tiempo real es el SYBR Green I el cual aumenta en más
de 1000 veces su fluorescencia cuando se une al surco
menor del ADN (8). El incremento de ADN en cada ciclo
se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia
emitida (Figura 1). Este sistema de detección tiene la
ventaja de que la optimización de las condiciones de la
reacción es muy sencilla, pero el principal inconveniente
de los agentes intercalantes es su baja especificidad,
debido a que se unen de manera indistinta a productos
generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores,
muy frecuentes en la PCR.
Molecular beacons son sondas parecidas a las
anteriores. Tienen una molécula donadora (reporter) en
el extremo 5', una aceptora (quencher) en el extremo 3'
pero, además presentan una estructura secundaria en
forma de asa, en la que reside la secuencia de unión
Figura 2: Mecanismo de acción de las sondas Taqman
A
B
C
Figura 1: Mecanismo de acción del SYBR Green I
SYBR Green I Libre
Florescencia (-)
SYBR Green I Unido
Florescencia (+)
Sondas de hibridación específicas: estas sondas
están marcadas con dos tipos de fluorocromos, un
donador y un aceptor. El proceso se basa en la
transferencia de energía fluorescente mediante
resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las más
utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas
también sondas TaqMan, las “molecular beacons” y las
sondas FRET.
Sondas de hidrólisis (Taqman) son oligonucleótidos de
unión específica al ADN diana marcados con un
fluorocromo donador (reporter) en el extremo 5' que
emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor
(quencher) en el extremo 3' que absorbe la fluorescencia
liberada por el donador. Para que esto ocurra, las
moléculas donadora y aceptora deben estar
espacialmente próximas. Además, el espectro de
emisión de la primera se ha de solapar con el espectro de
absorción de la segunda. Mientras la sonda está intacta,
la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por
el aceptor (Figura 2A). Sin embargo, durante la
amplificación de ADN blanco, la Taq polimerasa al
desplazarse a lo largo de la cadena en su acción de
síntesis, que tiene actividad 5' exonucleasa, hidroliza el
extremo libre 5' de la sonda, produciéndose la liberación
del fluorocromo donador (Figura 2B). Como donador y
aceptor están ahora espacialmente alejados, la
fluorescencia emitida por el primero es captada por el
lector (Figura 2C).
034
específica con el ADN blanco. Los extremos permanecen
plegados cuando la sonda no está hibridada, lo que
conlleva que donador y aceptor estén muy cerca uno de
otro. En esta conformación la fluorescencia emitida por el
donador es absorbida por el aceptor y no es captada por
el lector del equipo. Sin embargo, al hibridar con el ADN
diana la sonda se abre, alejándose donador y aceptor,
pudiendo ser detectada la fluorescencia emitida por el
primero (Figura 3).
Figura 3: Mecanismo de acción de las Molecular beacons
Sonda
ADN diana
Mol beacons
Sondas FRET el sistema se compone de dos sondas que
se unen a secuencias adyacentes del ADN diana. Una de
las sondas lleva un donador (reporter) en el extremo 3' y
la otra un aceptor (quencher) en el extremo 5'. Cuando las
sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están
próximos. Al ser excitado el donador transfiere su energía
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al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que
detecta el lector del equipo (Figura 4).
Biosystems y Roche Diagnostics (Tabla 1). Las
diferencias más importantes entre estos equipos hacen
referencia a la rapidez y al número de muestras que se
pueden procesar al mismo tiempo. El número de canales
de lectura que presentan los equipos también es
importante. Disponer de varios canales de lectura
permite detectar la emisión de distintos fluorocromos a la
vez. De esa manera, se pueden usar varias sondas
marcadas con distintos fluorocromos, para identificar
diferentes tipos de ADN blanco en la misma reacción
(PCR múltiple) o incorporar controles internos a la
reacción, para detectar la presencia de inhibidores.
Figura 4: Mecanismo de acción de las sondas FRET
A
Formatos de PCR a tiempo real.
Amplificación y detección de ADN o ARN blanco
en la muestra.
PCR múltiple.
Cuantificación del ADN o ARN blanco en la
muestra.
Se puede cuantificar la concentración inicial de
ADN (o ARN) blanco en la muestra de manera
muy sencilla, añadiendo simplemente controles
externos con concentraciones conocidas y
crecientes de ADN blanco (curva patrón) en la
tanda de amplificación. En la PCR en tiempo real
el programa informático va registrando el
incremento de fluorescencia (proporcional al
aumento de ADN) en cada ciclo y esta
información se refleja gráficamente en curvas de
cinética de la reacción para cada una de las
muestras y controles. Por tanto, se puede
controlar la amplificación en las fases iniciales,
cuando la concentración de los reactivos todavía
no es limitante y el efecto de la variabilidad en la
eficiencia de amplificación es menos importante.
Para cada muestra el programa informático
calcula el número de ciclo en el que el lector
empieza a detectar un incremento de
fluorescencia significativo, con respecto a la señal
de base. El ciclo en el que se empieza a detectar
el aumento de fluorescencia se denomina punto
de corte (Cp o crossing point) o ciclo umbral (Ct, o
B
Lector
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada
ciclo se corresponde con un aumento de hibridación de
las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma
proporción de fluorescencia emitida. El empleo de
sondas garantiza la especificidad de la detección y
permite identificar polimorfismos o mutaciones
puntuales.
Equipos para PCR en tiempo real
Están compuestos por un termociclador y por un lector de
fluorescencia y diseñados para poder efectuar la lectura
de la fluorescencia emitida en cada uno de los viales
usados y en cualquier momento de la reacción. Los más
utilizados son los equipos fabricados por Applied
Tabla 1
Instrumento
Fabricante
Sistema Técnico
Tiempo
de Reaccion
Capacidad
Serie GeneAmp
Applied
Biosystems
Convencional
2 hs.
96
Serie AbiPrism
Applied
Biosystems
Convencional
2 hs.
96
ICycler iQ
Bio Rad
Convencional
3 hs.
96-384
Light Cycler
Roche
Aire
20-60 min
32
Smart Cycler
Cepheid
Ceramica
40-60 min
16-96
MX4000
Stratagene
Convencional
90 min
96
Rotor Gene
Corbett
Aire
50 min
32
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threshold cycle) y es inversamente proporcional a
la concentración inicial de ADN blanco presente
en la muestra. Con las concentraciones
previamente conocidas de los controles externos
y sus Cp correspondientes se dibuja una curva
patrón. Interpolando en ella los valores de los Cp
de cada muestra problema se puede inferir su
concentración de ADN inicial (Figura 5).
Figura 6: Curvas de disociación
Figura 5: Curvas de cinética de reacción
Análisis de curvas de disociación:
Se basa en la aplicación de un gradiente de
temperaturas creciente después de la PCR para
monitorizar la cinética de disociación de los
fragmentos amplificados. Mediante esta
aplicación se puede determinar la Tm de los
amplicones para comprobar su especificidad.
También permite el análisis de mutaciones
puntuales, que se puede abordar de diferentes
maneras. Un enfoque sencillo consiste en usar
una sonda complementaria con el ADN blanco de
tipo salvaje, que abarque la posición del
polimorfismo. El híbrido formado entre sonda y
ADN de tipo salvaje tendrá una estabilidad mayor
que el formado entre la sonda y el ADN mutado,
puesto que en este caso la complementariedad
no es absoluta. La mayor estabilidad de la unión
entre la sonda y el ADN salvaje se reflejará en un
Tm superior. Las diferencias en la temperatura de
disociación de los híbridos nos permitirá
discriminar perfectamente entre el ADN de tipo
salvaje y el de tipo mutado, pudiéndose
establecer además, de forma relativa la cantidad
de ambos (Figura 6).
Ventajas de la PCR en tiempo real
La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su
rapidez, puesto que no se necesita ningún proceso
adicional de detección. Si el equipo empleado es el Light
Cycler o equivalente, esta ventaja todavía es más
acusada, pudiéndose completar el proceso de
amplificación y detección en 30-40 min. Además, gracias
a su rapidez, estos equipos se pueden rentabilizar al
máximo, permitiendo un flujo mucho mayor de muestras
y de ensayos. Otra ventaja muy importante de la PCR a
tiempo real es que, al utilizar sistemas cerrados, el riesgo
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de contaminación disminuye de forma muy importante.
Los sistemas a tiempo real permiten cuantificar la
concentración inicial de ácido nucleico presente en las
muestras de manera mucho más sencilla, más precisa y
sobre todo en un rango mucho mayor (5-6) que en los
procedimientos convencionales (2-4). Asimismo, la
determinación de mutaciones puntuales que pueden
estar relacionadas con resistencias a medicamentos
antimicrobianos o con factores de virulencia, es mucho
más fácil. Los equipos para PCR a tiempo real tienen una
capacidad muy elevada ya que en el mismo instrumento
se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos,
cuantitativos, determinación de mutaciones, PCR
múltiple, etc., mientras que para los procedimientos
convencionales se requieren múltiples equipos.
Aplicaciones de la PCR en tiempo real en el
Diagnóstico Biomédico
> Microbiología (9,10)
a) Diagnóstico e identificación de patógenos
b) Medición de Cargas virales y bacterianas
c) Identificación de resistencia a los tratamientos
(aparición de cepas mutantes)
d) Genotipificación
> Oncología/Oncohematologia (11- 15)
a) Medición de la expresión de genes
relacionados con diferentes tipos de tumores con
valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de
respuesta al tratamiento
b) Determinación y cuantificación de diferentes
translocaciones causantes de desórdenes
oncohematológicos.
> Genética Humana (16 - 19)
a)Determinación de mutaciones y polimorfismos
causantes de enfermedades genéticas y de
predisposición génica
b) Determinación y cuantificación de variantes
alelicas (polimorfismos) relacionadas con
diferente respuesta a drogas (fármacogenetica)
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Bibliografía
1 Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci
Am 262: 5661, 1990.
2 Mullis KB and Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335350,
1987.
3 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, and
Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences
and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science
230: 13501354, 1985
4 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith
JA, and Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology. Hoboken, NJ:
Wiley, 2005
5 Olson M, Hood L, Cantor C, and Botstein D. A common language for
physical mapping of the human genome. Science 245: 14341435, 1989
6 Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, and Griffith R. Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology
10: 413417, 1992.
7 Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, and Watson R. Kinetic PCR
analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions.
Biotechnology 11: 10261030, 1993.
8 Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, and Rasmussen RP.
Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.
Biotechniques 22: 130138, 1997.
9 Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin
Microbiol Infect 10: 190212, 2004.
10 Mackay IM, Arden KE, and Nitsche A. Real-time PCR in virology.
Nucleic Acids Res 30: 12921305, 2002.
11 Ferrari AC, Stone NN, Kurek R, Mulligan E, McGregor R, Stock R,
Unger P, Tunn U, Kaisary A, Droller M, Hall S, Renneberg H, Livak KJ,
Gallagher RE, Mandeli J. Molecular load of pathologically occult
metastases in pelvic lymph nodes is an independent prognostic marker
of biochemical failure after localized prostate cancer treatment. J Clin
Oncol. 2006 Jul 1;24(19):3081-8.
12 Eisenberg DP, Adusumilli PS, Hendershott KJ, Chung S, Yu Z, Chan
MK, Hezel M, Wong RJ, Fong Y. Real-time intraoperative detection of
breast cancer axillary lymph node metastases using a green fluorescent
protein-expressing herpes virus. Ann Surg. 2006 Jun;243(6):824-30.
13 Cerna M, Holubec L Jr, Pesta M, Kormunda S, Topolcan O, Cerny R.
Quantitative estimation of CEA and CK20 expression in tumour tissue of
colorectal cancer and its liver metastases with reverse transcription and
real-time PCR. Anticancer Res. 2006 Jan-Feb;26(1B):803-8.
14 Stock W, Yu D, Karrison T, Sher D, Stone RM, Larson RA,
Bloomfield CD. Quantitative real-time RT-PCR monitoring of BCR-ABL
in chronic myelogenous leukemia shows lack of agreement in blood and
bone marrow samples. Int J Oncol. 2006 May;28(5):1099-103
15 Lamy PJ, Nanni I, Fina F, Bibeau F, Romain S, Dussert C, Penault
Llorca F, Grenier J, Ouafik LH, Martin PM. Reliability and discriminant
validity of HER2 gene quantification and chromosome 17 aneusomy
analysis by real-time PCR in primary breast cancer. Int J Biol Markers.
2006 Jan-Mar;21(1):20-9.
16 Tran A, Jullien V, Alexandre J, Rey E, Rabillon F, Girre V, Dieras V,
Pons G, Goldwasser F, Treluyer JM. Pharmacokinetics and toxicity of
docetaxel: role of CYP3A, MDR1, and GST polymorphisms. Clin
Pharmacol Ther. 2006 Jun;79(6):570-80.
17 Lualdi S, Di Rocco M, Corsolini F, Spada M, Bembi B, Cotugno G,
Battini R, Stroppiano M, Gabriela Pittis M, Filocamo M. Identification of
nine new IDS alleles in mucopolysaccharidosis II. Quantitative
evaluation by real-time RT-PCR of mRNAs sensitive to nonsensemediated and nonstop decay mechanisms. Biochim Biophys Acta. 2006
Apr;1762(4):478-84.
18 Bodlaj G, Stocher M, Hufnagl P, Hubmann R, Biesenbach G, Stekel
H, Berg J. Genotyping of the lactase-phlorizin hydrolase -13910
polymorphism by LightCycler PCR and implications for the diagnosis of
lactose intolerance. Clin Chem. 2006 Jan;52(1):148-51
19 Tizzano EF, Barcelo MJ, Baena M, Cornet M, Vencesla A, Mateo J,
Fontcuberta J, Baiget M. Rapid identification of female haemophilia A
carriers with deletions in the factor VIII gene by quantitative real-time
PCR analysis. Thromb Haemost. 2005 Sep;94(3):661-4.
ANUARIO FUNDACIÓN Dr. J. R. VILLAVICENCIO | 2006 | Nº XIV | 033 - 037
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