universidad autónoma metropolitana unidad iztapalapa ciencias

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
LICENCIATURA EN
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
ANALISIS MOLECULAR DEL RECEPTOR DE LA
LIPOPROTEINA DE BAJA DENSIDAD EN
PACIENTES CON DIABETES TIPO 2
MARTHA ELVIRA MEJIA GARCIA
ASESORAS:
DRA. SOCORRO DURAN VARGAS
M. EN ISP. GLORIA RUIZ GUZMAN
MEXICO,D.F.
DICIEMBRE DE 2003
AGRADECIMIENTOS
v Gracias a Dios por ser bueno conmigo.
v A mis Padres Luis y Josefina por todo el apoyo que día a día me brindaron
para poder concluir la carrera. Los quiero.
v A mis hermanos Gaby y Dany. A mi tía Sofy. Y a quien me motiva a seguir
adelante, la razón de mi vida mi niña Luisita TE AMO.
v A la Doctora Socorro Durán, por la paciencia que me tuvo y por toda la
dedicación que me dio. No pude haber estado en mejor laboratorio Gracias.
v A la Maestra Gloria Ruiz, le agradezco todas su atenciones para conmigo,
gracias por ese apoyo que fue tan esencial en el desarrollo de este proyecto.
v A todos mi compañeros del Laboratorio Giselita, Osvaldo, Angy, Víctor y
Alejandro. Por sacarme de dudas y ayudarme siempre.
v A mejor maestra de Bioquímica que he conocido Martita Ruiz.
v A todas las personas que han sido de gran apoyo en mi vida, especialmente en
los momentos difíciles. A Gaby y Eladio gracias por estar siempre cerca. A mi
amiga Marisol eres lo máximo. A la maestra Rocío Barcena a quien debo el
amor a la biología. Gracias.
INDICE GENERAL
Pagina
INTRODUCCIÓN.
1. Lípidos.
1
2. Transporte de lípidos.
2
3. Metabolismo de Lipoproteínas.
6
4. Dislipidemias.
8
4.1. Hipercolesterolemia Familiar.
9
4.1.1. Vía del receptor LDL.
11
4.1.2. Genética molecular del receptor LDL.
12
4.2. Diabetes tipo 2.
4.2.1. Lipoproteínas en DT 2.
5. Aterogénesis en HF y DT 2.
15
16
18
JUSTIFICACIÓN.
20
OBEJTIVO GENERAL.
21
Objetivos específicos.
21
MATERIAL Y MÉTODO.
22
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
29
Exones 3, 4, y 16.
29
Exón 17.
30
CONCLUSIONES.
35
PERSPECTIVAS.
36
REFERENCIAS.
37
Indice de figuras.
Paginas
Figura A. Estructura de triglicéridos.
1
Figura B. Colesterol.
2
Figura C. Lipoproteína de baja densidad (LDL).
4
Figura D. Grafica de composición en porcentaje de las lipoproteínas.
5
Figura E. Vía endógena y exógena del metabolismo de lípidos.
7
Figura F. Dominio que componen el receptor LDL.
10
Figura G. Gen del receptor LDL.
10
Figura H. Vía del receptor LDL.
11
Figura I. Clasificación de las mutaciones en el gen del receptor LDL.
14
Figura J. Formación de células espumosas.
19
Figura K Programa de termocilcador.
24
Figura L. Gel de agarosa al 1.8% con producto de PCR.
29
Figura M. SSCP del exón 17.
30
Figura N. Histograma de secuencia sentido del exón 17 del paciente 105.
32
Indice de tablas.
Paginas.
Tabla 1. Características de las lipoproteínas en cuanto a densidad,
5
diámetro, composición y apo asociadas.
Tabla 2. Características comunes entre la HF y DT 2.
20
Tabla 3. Oligonucleótidos sentido y antisentido, utilizados para la amplifcación
22
en los exones 3, 4, 16 y 17.
Tabla 4. Temperaturas de alineación.
25
Tabla 5. Reactivos para preparar un gel de poliacrilamida al 6 %.
26
Tabla 6. Mutaciones silenciosas.
31
Tabla 7. Mutaciones con sentido erróneo.
33
INTRODUCCIÓN.
1. Lípidos.
Los lípidos son biomoléculas orgánicas formadas básicamente por carbono hidrogeno
y oxigeno, pero en porcentajes mucho más bajos.
Además, los ácidos grasos se
dividen en saturados, los que tienen enlaces simples entre los átomos de carbono; y
los insaturados que se los que contienen uno o varios dobles enlaces a lo largo de su
cadena.
Los lípidos más sencillos obtenidos a partir de los ácidos grasos son los
triacilgliceroles o triglicéridos y las grasas o grasas neutras. Los triacilgliceroles están
compuestos de tres ácidos grasos en enlace éster con un solo glicerol1 (Fig. A).
Figura. A. Estructura de Triglicéridos.
Los esteroles son lípidos estructurales que se hallan presentes en la mayoría de células
eucarióticas. Su estructura característica es la del núcleo esteroide que consiste en
cuatro anillos fusionados, tres de ellos con seis carbonos y uno con cinco. Los
esteroles son los precursores de diversos productos con actividades biológicas
específicas;
como los ácidos biliares, actúan como detergentes en el intestino,
emulsionando las grasas de la dieta para hacerlas mas accesibles a las lipasas
1
digestivas. El colesterol es el principal esterol en los tejidos animales, es anfipático
(Fig. B). Diversas hormonas esteroides también se producen a partir del colesterol1.
Fig. B. Colesterol.
2. Transporte de lípidos.
El transporte de triacilgliceroles y colesterol esta a cargo de estructuras especializadas
llamadas lipoproteínas, que son agregados moleculares de proteínas transportadoras
específicas denominadas apolipoproteínas (apo) con diversas combinaciones de
fosfolípidos, colesterol, ésteres de colesterol y triacilgliceroles. Las apo se combinan
con agregados esféricos con lípidos hidrofóbicos en el núcleo central y las cadenas
laterales hidrofílicas de aminoácidos de la proteína en la superficie. Combinaciones
variables de lípido y proteína producen partículas de densidades diferentes que van
desde lipoproteínas de muy baja densidad a lipoproteínas de alta densidad, que se
pueden separar por centrifugación y visualizar al microscopio electrónico2.
2
Las lipoproteínas son un grupo heterogéneo de partículas con una composición
diferente de lípidos y proteínas, además de tamaño, existen cuatro diferentes
lipoproteínas, que se describen a continuación (ver tabla 1):
QUILOMICRONES.
Son las lipoproteínas más grandes en tamaño y de menor
densidad, y en su composición tienen una gran cantidad de triacilgliceroles (ver figura
D). Se sintetizan en el retículo endoplasmatico de las células epiteliales que forran al
intestino delgado y se trasladan a través del sistema linfático entrando en el torrente
circulatorio a través de la vena subclavia izquierda. Se encargan del transporte de
ácidos grasos obtenidos en la dieta al tejido en el que han de ser consumidos o
almacenados como combustible3.
LIPOPROTEÍNA DE MUY BAJA DENSIDAD (VLDL).
Los ácidos grasos
ingeridos en la dieta y que se necesitan inmediatamente como combustibles, son
convertidos en triacilgliceroles en el hígado y se incorporan en apolipoproteínas
específicas formando lipoproteínas de muy baja densidad (ver figura D).
Estas
lipoproteínas se transportan por la sangre desde el hígado hasta el músculo y el tejido
adiposo en donde la activación de la lipoproteína lipasa por la apoC-II libera ácidos de
los triglicéridos de la VLDL3.
LIPOPROTEÍNA DE BAJA DENSIDAD (LDL).
La pérdida de triacilgliceroles
convierte a la VLDL en lipoproteína de baja densidad (ver figura D). Estas moléculas
son ricas en colesterol y presentan apoB-100 como única apolipoproteína (ver figura
C).
Las LDL transportan colesterol a los tejidos periféricos
con receptores
específicos de superficie que reconocen a la apoB-1003.
3
Figura C Lipoproteína de baja densidad (LDL).
LIPOPROTEÍNA DE ALTA DENSIDAD (HDL). Estas se forman en hígado e
intestino delgado son partículas ricas en proteína que contiene relativamente poca
cantidad de colesterol y nada de sus ésteres (ver figura D). Las HDL contiene apoC-I
y apoC-II entre otras apo, la enzima lecitina-colesterol acil transferasa (LCAT), que
cataliza la formación de ésteres de colesterol a partir de lecitina y colesterol. La
LCAT en la superficie de las partículas nacientes de HDL convierte esta
fosfatidilcolina y colesterol así como los restos de quilomicrones y VLDL en ésteres
de colesterol, que empiezan a formar un núcleo, transformando la HDL naciente que
tiene forma de disco en una partícula esférica de HDL madura. Esta lipoproteína rica
en colesterol retorna ahora al hígado en donde se descarga el colesterol. Parte de este
colesterol se convierte en sales biliares3.
4
Tabla 1. características de las lipoproteínas en cuanto a densidad, diámetro, composición y apo
asociada2.
Lipoproteína
Rango de
Diámetro
densidad
(nm)
Lípidos
Apolipoproteínas
Triacilgliceroles de
B48, AI, AII, CI,
la dieta diaria
CII,CIII, E.
Triacilgliceroles
B100, CI, CII, CIII,
endógenos (hígado)
E.
Colesterol y
B100.
(g/ml)
Quilomicrones
VLDL
<0.950
0.950-
80-1000
30-80
1.006
LDL
1.019-
20-22
1.063
colesterol
esterificado
HDL
1.0631.090
9-15
Colesterol
AI, AII, CI, CII, CIII
esterificado y
E.
fosfolípidos
Figura D. Grafica de composición en porcentaje de las lipoproteínas.
5
3. Metabolismo de las lipoproteínas.
Las diferentes lipoproteínas, participan en dos vías distintas en donde cada una de las
moléculas juega un papel importante. Estas dos vías son la endógena y exógena.
La vía exógena empieza en el intestino y termina en el hígado, esta vía transporta las
grasas de la dieta (ver figura E). Los triacilgliceroles y el colesterol son absorbidos y
re-esterificados en las células del intestino delgado, en donde son secretadas las
partículas de quilomicrones, de la vía linfática a la circulación; los quilomicrones
adquieren apo C II, que activa a la lipoproteín lipasa, y también facilita el paso a
través de los capilares. En la circulación, los quilomicrones sufren lipólisis; pierden
triacilgliceroles y adquieren esteres de colesterol de otras lipoproteínas. Interaccionan
con otras partículas, y algunas apolipoproteínas más pequeñas que pasan de una
partícula a otra, como la apo E la cual los convierte en remanentes de
quilomicrones2,3,4.
En la vía endógena los triacilgliceroles del hígado se distribuyen a otros tejidos (ver
figura E). En el hígado se secretan las VLDL, las cuales contienen triacilgliceroles,
colesterol esterificado, apo B100, apo E y apo C. Las LDL tienen únicamente apo B100. En el hígado apoB-100 se combina con varios lípidos para dar lugar a la VLDL,
los triacilgliceroles que contiene esta lipoproteína se hidrolizan para dar lugar a la
IDL.
Algunos de los remanentes de VLDL, también conocidos como IDL se
remueven de la circulación mediante el hígado a través de un proceso mediado por
apoE, mientras que otros se hidrolizan dando lugar a la LDL. La LDL tiene la función
de transportar el colesterol a diferentes tejidos periféricos, mientras que el resto de
colesterol, el cual es mayoría, se remueve del torrente sanguíneo de nuevo a través del
hígado. Dicha remoción se lleva a cabo cuando la única molécula de apoB-100 que
contiene la LDL se une al receptor hepático de la LDL2,3,4.
6
Figura. E Vía endógena y exógena del metabolismo de lípidos.
7
4. Dislipidemias
Las dislipidemias son alteraciones en los valores normales de lípidos (o grasas de la
sangre), que son fundamentalmente colesterol y triglicéridos. Los defectos genéticos
del metabolismo de las lipoproteínas ocasionan las siguientes enfermedades llamadas
comúnmente
hiperlipoproteínemias:
hipocolesterolemia,
hipoalfalipoproteínemia
hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia y otras a las cuales se les llama mixtas. Las
hiperlipoproteinemias se pueden clasificar en 2 grupos, las primarias y las
secundarias.
Dentro
de
las
primarias
tenemos:
(extremadamente raras), hipercolesterolemia familiar,
hiperquilomicrolemias
hiperlipidemia familiar
combinada, disbetalipoproteinemia, hipertrigliceridemia familiar, hipercolesterolemia
esporádica e hipertrigliceridemia esporádica.
Mientras que las dislipidemias
secundarias son aquellas alteraciones en el metabolismo de los lípidos o de las
lipoproteínas que se producen como consecuencia de otra entidad patológica como las
neuropatías, la diabetes mellitus, la obesidad entre otros4.
En este trabajo nos enfocaremos en dos dislipidemias una primaria, la
hipercolesterolemia Familiar y una secundaria que se desarrolla a consecuencia de DT
2 por tener características similares en el perfil de lípidos.
8
4.1 Hipercolesterolemia Familiar.
La hipercolesterolemia Familiar es una enfermedad autosomica dominante,
caracterizada por mutaciones en el receptor LDL. En pacientes heterocigotos hay
disminución a la mitad de los receptores para apoB-100, mientras que para
homocigotos se demuestra la ausencia total de los receptores para apoB-100. La
enfermedad prevalece en homocigotos 1/1 000 000 y en heterocigotos 1/5004. La
anormalidad principal de esta patología es la elevación de colesterol LDL como
consecuencia de las mutaciones en el receptor LDL o en apoB-100, que lleva a un
defecto de su catabolismo, ya que la interacción entre el receptor LDL y la apoB-100
hace posible que un alto porcentaje de las LDL sean eliminadas del plasma5,6.
El receptor de la LDL es una glicoproteína de superficie de membrana, que es sitio de
unión específico, para el paso y degradación de lipoproteínas plasmáticas que
contengan apoB-100. La proteína esta constituida de 839 aminoácidos, en su paso por
el aparato de golgi reduce su peso molecular de 160 a 120 KDa. El receptor LDL
maduro contiene numerosos puentes disulfuro que confieren estabilidad de el ligando
al sitio de unión. El receptor LDL esta constituido de 5 dominios: dominio de unión
al ligando, dominio homologo al precursor de EGF (factor de crecimiento epidermal),
dominio de glicosilación, dominio transmembranal y el dominio citoplasmático5,6 (ver
Fig. .F).
9
Figura F. Dominios que componen al receptor LDL.
El gen ldlr, se localiza en posición distal del brazo corto del cromosoma 19 (p13.1p13.3) se compone aproximadamente de 45 Kb (kilobases), consta de 18 exones y 17
intrones5,6(ver figura G).
45 kb
5
´
Exón
3
1
2
3
4 5 6
11 12 13 14
15
Homólogo al precursor
del Factor de
Crecimiento Epidermal
(EGF)
Secuencia
Señal
Promoto
r
7 8 9 10
Unión
al
Ligando
RNAm = 5.3 kb
16 17 18
Transmembrana
l
Unión a Cadenas
de
Carbohidratos
Citoplasmátic
o
Figura G. Gen del receptor LDL
10
El exón 1 codifica para una secuencia señal de 22 aminoácidos, del exón 2 al 6
codifican para el dominio de unión al ligando, los exones 7 al 14 para el precursor
homologo EGF, el 15 para el dominio de unión de azucares, el exón 16 y el extremo
5’ del 17 codifican para el dominio transmembranal, y por último, el extremo 3’ del
exón 17 y el extremo 5’ del exón 18 codifican para el dominio citoplasmático5,6. El
resto del exón 18 se refiere a la región 3’ del ARNm de 2.6 Kb la cual no se traduce.
4.1.1. Vía del receptor LDL.
La proteína precursora del receptor LDL (120 kDa) se produce en el retículo
endoplásmico, para madurar pasa al complejo de Golgi después se transporta a la
superficie celular para unirse a su ligando. Las partículas LDL circundante en el
torrente sanguíneo contienen apoB-100 que es reconocida por las proteínas receptoras
de superficie (receptor LDL), de las células que necesitan captar colesterol. La
fijación de LDL a un receptor de LDL inicia la endocitosis que lleva la LDL y su
receptor asociado al interior de la célula dentro de un endosoma. Este endosoma se
fusiona finalmente con un lisosoma que contiene enzimas que hidrolizan los ésteres de
colesterol liberando colesterol y ácidos grasos al citosol. La apoB-100 de la LDL
también se degrada dando aminoácidos que se liberan al citosol, pero el receptor LDL
escapa de la degradación y vuelve a la superficie celular en donde puede funcionar
una vez más en la captación de LDL3 (ver figura H).
11
Figura H. Vía del receptor LDL.
4.1.2 Genética molecular del receptor LDL.
Las mutaciones en el gen que codifica para el receptor LDL, da como fenotipo la
Hipercolesterolemia Familiar. Actualmente se han reportado más 800 mutaciones que
afectan al gen ldlr, entre ellas hay inserciones y deleciones. Se han clasificado las
mutaciones del receptor LDL en 5 categorías de acuerdo a las consecuencias
funcionales de a mutación (Fig. I).
Clase 1. Alelos Nulos.
Es una falla completa para producir receptor inmunoprecipitable. Son las mutaciones
que reducen en mayor medida el número de receptores LDL funcionales5.
12
Clase 2. Alelos con defecto en el transporte.
Es el tipo de mutación más común. El defecto esta en el transporte de la proteína del
receptor entre el RE y el sitio en donde se efectúa la glucosilación (AG). Existen dos
tipos 2A se produce una proteína que no puede ser transportad fuera del RE. En el
tipo 2B una parte del receptor maduro es expresado en la superficie celular5.
Clase 3. Alelo con defecto en la unión al ligando.
Es un defecto de unión a la apoB de la LDL al receptor. La proteína del receptor es
transportada normalmente a la superficie celular pero solo une lipoproteínas ricas en
apo-E como lo es VLDL y en una cantidad disminuida y variable de LDL, esto es
dependiendo de la mutación. Estos defectos se presentan en los exones 7 al 14 5.
Clase 4. Alelos con defecto de internalización.
Existen alteraciones de 50 aminoácidos del dominio citoplasmático.
Existen 2
subtipos, el 4-A en el que la mutación se encuentra en el dominio citoplasmático de
receptor y afecta las secuencias indispensables para la migración de complejo
receptor-lipoproteína hacia vesículas recubiertas.
En las 4-B la alteración se
encuentra en los dominios del receptor que facilitan la unión a la membrana celular,
como consecuenciales receptores muestran pobre adherencia a la superficie celular.
Los receptores se encuentran de manera difusa en la superficie celular y no son
concentrados en vesículas y por lo tanto no pueden internalizar LDL. Todas las
deleciones se encuentran desde el intrón 15 a la región no codificada del exón 185.
Clase5. Alelo con deficiencia en el reciclaje.
Defecto en la disociación ácido-dependiente del receptor y el ligando en el endosoma,
evento que es esencial en el reciclaje del receptor. El defecto se encuentra en las
repeticiones idénticas al EGF5.
13
Figura I. Clasificación de las mutaciones en el gen del receptor LDL.
14
4.2 Diabetes tipo 2.
Es una enfermedad crónica generalizada, con predisposición genética y
participación de diversos factores ambientales que en conjunto interfieren con el
metabolismo de carbohidratos y lípidos7.
La enfermedad se caracteriza por
hiperglucemia persistente ya sea por la deficiencia en la producción o acción de la
insulina, que afecta el metabolismo de carbohidratos, proteínas y grasas. La Diabetes
mellitus se ha clasificado en dos grandes grupos, donde la tipo 2 es la más frecuente
con una prevalencia mayor al 90% de todos los casos reportados8. La diabetes de tipo
2 (DT 2) es una afección caracterizada por una marcada ineficiencia del cuerpo
utilizando insulina. Los mecanismos por los cuales esta resistencia a la insulina se
origina son muy variados. En su mayoría se deben a una combinación de factores
genéticos asociados con factores de estilo de vida como obesidad y hábitos dietéticos
inapropiados4. La DT 2 es un problema de salud mundial se estima en más de 150
millones el número de afectados y de estos, 19 millones viven en América Latina8. Se
estima que 11.7 millones de mexicanos aproximadamente tendrán diabetes para el
año 20259. Según la Encuesta Nacional de Enfermedades Crónicas (ENEC), el 10%
de la población mexicana entre los 20 y 69 años padece diabetes. La prevalencia
tiende a aumentar en adultos. La Diabetes es la causa más común de muerte en
México, al año se registran más de 300,000 nuevos casos y la tasa de incidencia se ha
estimado en 300/ 100,000 habitantes, con una mortalidad asociada a diabetes que es
considerada entre las cinco más elevadas del mundo8.
Se ha demostrado que adultos mexicanos que padecen DT 2 han tenido alta
prevalencia de factores de riesgo que contribuyen a complicaciones macro y
microvasculares9.
Otros factores de riesgo son: obesidad, niveles elevados de
triglicéridos, niveles bajos de colesterol HDL, colesterol LDL elevado, resistencia a la
acción de la insulina y presión arterial elevada8.
15
4.2.1 Lipoproteínas en DT 2.
Durante la DT2 se incrementan los niveles de triacilgliceroles, dando como resultado
el aumento en plasma de lipoproteínas ricas en triacilgliceroles (TRL’s), que se
asocian con el desarrollo de potencial aterogenico además de ser un factor de riesgo
de enfermedades de las coronarias.
Lo anterior se debe a una alteración en el
metabolismo de lípidos durante la DT 2, principalmente en las VLDL LDL y HDL.
Existen dos componentes cruciales en la dislipidemia diabética, que son el incremento
en plasma de triglicéridos y las bajas concentraciones de colesterol HDL10.
Las TRL’s se caracterizan por la diferencia en la densidad y la composición de apo,
derivada de los quilomicrones del intestino y de las VLDL del hígado. En este
padecimiento, las partículas VLDL endógenas se dividen en dos clases: las VLDL1
que son partículas más grandes de lo normal (Sf 60-400) y las VLDL2 (Sf 20-60)que
son pequeñas y densas. El metabolismo y la síntesis de las TRL’s es regulado por dos
enzimas: la lipoproteín lipasa (LPL) y la lipasa hepática (HL). La hidrólisis de los
triglicéridos de las lipoproteínas esta a cargo de la LPL; en varios estudios se ha
reportado que la actividad de la LPL frecuentemente se encuentra baja en pacientes
con DT 2. Por otro lado, la HL es responsable de la conversión de IDL a LDL; hay
evidencias que indican que la actividad de la HL comúnmente se incrementa en la DT
2, amplificando la conversión de IDL a LDL. Las VLDL1 y VLDL2 tienen diversas
vías para producir las IDL y las LDL. Las VLDL1 por acción de la CETP son
precursoras de las LDL pequeñas y densas10.
Las LDL pequeñas y densas se definen como partículas con diámetro menor a
25.5nm, estas lipoproteínas contienen más colesterol esterifcado de lo normal, lo cual
las hace mas densas. Las LDL pequeñas y densas, por su composición química
16
tienden a tener mayor afinidad por los proteoglicanos. Estudios indican que las LDL
pequeñas y densas, están presentes en pacientes con DT 2 en un porcentaje de 40 a
50%. Estas partículas se correlacionan con la resistencia a la insulina y el control de
triacilgliceroles. Estos cambios en la conformación de lípidos de estas lipoproteínas
esta mediado por la vía de la CETP. Por otro lado el incremento en HL y apo B-100
en pacientes con DT 2 favorece la formación de las partículas LDL pequeñas y
densas. Estas no son reconocidas por su receptor LDL, es decir pierden afinidad, de
manera que aumenta su concentración en el plasma10.
17
5. Aterogénesis en HF y DT 2.
La hipercolesterolemia familiar se caracteriza por la elevación del colesterol LDL en
el torrente sanguíneo, este es el mecanismo más frecuente sobre el proceso aterógeno.
Para que las LDL puedan expresar su potencial aterógeno, primero deben ser
modificadas en su estructura química, principalmente mediante la oxidación de sus
lípidos y de la apoproteína B-100 estos cambios químicos permiten que estas
lipoproteínas ingresen a los macrófagos, transformándolos en células espumosas. La
participación de un receptor diferente al de las LDL nativas fue sugerida por
Goldstein y Brown, quienes describieron en detalle el funcionamiento del receptor de
estas lipoproteínas y el hecho, aparentemente
paradójico, de los pacientes con
hipercolesterolemia familiar homocigótica que están desprovistos del mismo por
completo y presentan depósitos masivos de lípidos en el reticuloendotelio, en
particular en los macrófagos de las placas de ateroma y de los tejidos blandos
(Xantomas). El receptor LDL nativas exhibe un fenómeno de “retroalimentación a la
baja” que impide el cúmulo de colesterol en las células provistas del mismo, como en
hepatocitos y células de la estirpe monolito/macrófago que poseen este tipo de
receptor pueden acumular colesterol en grandes cantidades4,11.
Es poco probable que la oxidación de las LDL ocurra en la circulación, por la
presencia en la sangre de numerosas sustancias antioxidantes. Sin embargo, cuando
las LDL penetran a través del endotelio a la pared arterial, sobre todo de las arterias
afectadas por factores capaces de lesionarlas, se exponen a radicales tóxicos de
oxígeno como el radical superóxido y otras formas reactivas de oxígeno. En este caso
se ponen en marcha la oxidación de los componentes de la LDL, que parecen iniciarse
con la autooxidación de los ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos
contenidos en las LDL. La lecitina se transforma en lisolecitina y los ácidos grasos en
aldehídos reactivos (alquenantes). Las LDL oxidadas (LDLox) tienen una acción
quimiotáctica hacia los monolitos circulantes, quimiostática para los macrófagos del
18
espacio subendotelial y citotóxica para las células endoteliales. Los cambios químicos
en la apo B-100 de las LDL permiten el reconocimiento de la misma por los
receptores de los macrófagos y dan origen a epitopos que al ser desconocidos por el
sistema inmunológico evocan a la formación de anticuerpos (anti-LDLox)4.
Small and dense
Small and dense
Figura J. Formación de células espumosas.
En la DT 2 las LDL son transformadas a LDL pequeñas y densas, de las cuales
recientemente se ha comprobado que tienen potencial aterogénico. Se considera que
el tamaño pequeño de estas partículas favorece a la entrada a la capa interna de la
arteria, en donde se exponen a estrés oxidativo.
Las LDL pequeñas y densas son
oxidadas, fagocitadas por macrófagos formando células espumosas, las cuales
intervienen en la formación de la placa ateromatosa10.
19
JUSTIFICACIÓN.
Se sabe que los pacientes con Hipercolesterolemia Familiar, presentan la característica
de tener una concentración elevada de colesterol LDL y una disminución de colesterol
HDL y también en pacientes con DT 2 se ha observado un patrón similar en cuanto a
colesterol LDL y HDL.
Lo anterior nos motivo a realizar un estudio entre ambas dislipidemias. Como se
menciono anteriormente la HF se debe a mutaciones en el gen del LDLR, por lo que
propusimos que los altos niveles de C-LDL en DT 2 podrían presentarse mutaciones
en el gen ldlr.
Tabla 2. Características comunes entre la HF y la DT 2.
hipercolesterolemia familiar
Diabetes tipo 2
C- LDL
C-LDL
C-HDL
C-HDL
Desarrollo prematuro de aterosclerosis
Desarrollo prematuro de aterosclerosis
20
OBJETIVO GENERAL
Ø Determinar si las mutaciones en el gen del receptor LDL, están relacionadas
con la hiperlipidemia presente en pacientes con Diabetes mellitus tipo 2.
Objetivos específicos.
Ø Amplificación de los exones 3, 4, 16 y 17 de gen del receptor LDL a partir de
DNA genómico mediante la técnica de PCR.
Ø Determinar si existen cambios conformacionales en las muestras para los
exones a analizar.
Ø Elección de posibles candidatos con cambios en la secuencia.
Ø Análisis de la secuencia nucleotídica de los candidatos a mutación en la base
de datos Gene Bank.
Ø Determinar posible correlación entre los niveles de C-LDL y las mutaciones
presentes en el receptor LDL.
21
MATERIAL Y MÉTODO.
Obtención de las muestras.
Se trabajo con el DNA de 126 pacientes diagnosticados con DT 2 que presentaran
niveles de colesterol LDL por arriba de 130mg/dL y de colesterol HDL por debajo de
65 mg/dL. Las muestras de DNA fueron obtenidas de la colaboración que hay con el
Dr. Miguel Cruz del la Unidad de Investigación Bioquímica del IMSS.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR: Polymerase Chain Reaction).
A partir del DNA de los pacientes se amplificaron los exones 3, 4, 16 y 17 del gen
LDLR, mediante la técnica de PCR12,13, para esto se utilizaron los siguientes
oligonucleótidos específicos, para cada exón.
OLIGONUCLEÓTIDOS5.
EXÓN
OLIGO SENTIDO
OLIGO ANTISENTIDO
PRODUCTO
3
5’-TGA CAG TTC AAT CCT GTC TCT TCT G -3’
5’-ATA GCA AAG GCA GGG CCA CAC TTA C -3’
176 pb
4
5’-GTT GGG AGA CTT CAC ACG GTG ATG G -3’
5’-ACT TAG GCA GTG GAA CTC GAA GGC C -3’
356 pb
16
5’-CCT TCC TTT AGA CCT GGG CC -3’
5’-CAT AGC GGG AGG CTG TGA CC -3’
173 pb
17
5’-CAC GGA GCT GGG TCT CTG GTC -3’
5’- TCG GCC TGG TCC CTT GAG G -3’
302 pb
Tabla 3. Oligonucleótidos sentido y antisentido, utilizados para la amplificación de
los exones 3, 4, 16 y 17.
22
En cada tubo de PCR se depositaron 2 l de ADN de cada paciente y cada reacción
fue de 15 l, la mezcla se preparo con los siguientes reactivos:
Para los exones 3, 4 y l6 se usaron las siguientes condiciones.
MEZCLA
Reactivo
1 Reacción
Concentración fina/reacción.
Buffer
1.5 l
1X
DMSO
1.5µl
10%
dNTP’s
2.4µl
0.2µM
MgCl2
0.45µl
1.5mM
Taq Pol
0.13µl
0.5 unidades
Oligo Sentido
100ng/µl
100ng
Oligo Antisentido
100ng/µl
100ng
Marca [α32P] dCTP 0.086µl
DNA
2µl
200 ng
H2O
5.3µl
Aforar hasta 15 l
Para el exón y 17, se usaron las siguientes condiciones.
MEZCLA
Reactivo
1 Reacción
Concentración fina/reacción
Buffer
1.5 l
1X
DMSO
1.5µl
10%
dNTP’s
2.4µl
0.2µM
MgCl2
0.45µl
1.5mM
23
Taq Pol
0.075µl
0.375 unidades
Oligo Sentido
100ng/µl
100ng (150 para exón 14)
Oligo Antisentido
100ng/µl
100ng (150 para exón 14)
Marca [α32P] dCTP 0.075µl
DNA
2µl
200 ng
H2O
5.3µl
Aforar hasta 15 l
Nota: la marca radioactiva solo se utilizo en PCR para análisis SSCP
Programa de Termociclador
El programa utilizado en el termociclador, consta de 3 fases, la primera de inicio en la
que las muestras se mantienen a 95ºC durante 4 minutos con 30 segundos, esto es para
desnaturalizar la hebra de DNA. La segunda fase es la de los ciclos, las reacciones se
harán a 30 ciclos, los cuales van a consistir en 95ºC durante 30 segundos, la
temperatura de alineación (Tm) de los oligos (ver tabla 4) durante 30 segundos y por
último a 72ºC durante 30 segundos. La tercera fase se compone de 7 minutos a 72ºC
y posteriormente a 4ºC ∞ (ver figura K).
95ºC
95ºC
72ºC 72ºC
TmºC
4ºC ∞
30
ciclos
1ª Fase
2ª Fase
3ª Fase
Figura K. Programa de termociclador.
24
Cada oligonucleótido tiene una temperatura de alineación (Tm) especifica.
EXÓN
TmºC
3
58º
4
54º
16
54º
17
56º
Tabla 4 . Temperaturas de alineación.
Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla. (SSCP: Single-Strand
Conformation Polymorphism)11.
CARGADO Y CORRIMIENTO DE LOS GELES.
Se realizó electroforesis de los productos de PCR marcados radiactivamente, diluidos
y desnaturalizados en geles de poliacrilamida de 30 x 40 cm. y 0.4 mm de grosor.
Diluciones y desnaturalización.
Muestras de pacientes y controles.
a)
l de la reacción de PCR más 120µl de solución desnaturalizante (EDTA
10mM y SDS 0.1%).
b)
l de la dilución a más 5 l de colorante formamida (Formamida 95%, Xylen
Cyanol 0.25% y Azul de bromofenol 0.25%).
Se calentaron las muestras de la dilución b a 95º durante 5 minutos, inmediatamente
se pasaron a hielo y posteriormente se depositaron en el gel.
25
Muestras sin desnaturalizar.
Se escogieron dos muestras al azar y se realizó la siguiente dilución.
a)
l de la reacción de PCR más 120 l de buffer TE (Tris-HCl 10mM y EDTA
0.1%).
b)
l de la dilución a mas 5 l de colorante-glicerol (glicerol 30% en agua,
Xylen cyanol 0.25% y azul de bromofenol 0.25%).
Cargar de 2.5 a 2.8 µl de las diluciones b de las muestras de pacientes, controles y
controles sin desnaturalizar, en el gel de poliacrilamida al 6% en condiciones
nativas (ver tabla 4).
Gel de Poliacrilamida al 6%
120ml
Agua
84
Acrilamida/Bisacrilamida 29:1%
24
TBE 10X
12
Persulfato de amonio al 10%
400 l
Temed.
90 l
Tabla 5. Reactivos para preparar un gel de poliacrilamida al 6%.
Los geles se corrieron a voltaje constante de 4 watts. Con una solución amortiguadora
TBE 0.5X, durante un periodo de 14 horas.
Se transfirió el gel a papel de cromatografía Wattman y se puso a secar a 60ºC
durante 45 minutos.
Exposición de la placa y el revelado.
En este caso solo para el exón 17, se tuvieron que utilizar casetes de exposición de 5
días debido a que el analizador de imágenes departamental, permanece ocupado por
periodos prolongados.
26
•
Se coloco el papel Wattman viendo hacia arriba dentro del cassette para que
queden igual, guiarse por los controles (manchas mas grandes).
•
En el cuarto oscuro se puso una placa de revelado encima del papel filtro y
cerrar el casete. Dejo el casete a -72ºC durante 5 días a temperatura ambiente.
•
Se revelo la placa y se analizo el patrón de bandas obtenido.
BIO-RAD FX IMAGING.
Una vez obtenidos los geles de los exones 3, 4 y l6 fueron analizados utilizando
equipo departamental; el analizador de imágenes FX de Bio-Rad. El cual consiste en
exponer los geles a una pantalla Kodak sensible a radioisotopos como lo es el
durante 24 horas aproximadamente.
32
P,
Posteriormente se lee en el analizador de
imágenes el cual detectara las bandas radioactivas, dándonos el patrón de bandas
esperado.
La imagen se graba en un disco de 31/2 y se checa la migración de las
muestras.
Purificación del producto de PCR.
Los posibles candidatos a mutación seleccionados, se enviaron a secuenciar, siendo
purificados previamente mediante el Kit “Rapid PCR Purification System” de Gibco.
•
Se hizo una PCR de 100µl.
•
A 100µl de reacción de PCR se adiciono 400µl de solución de unión H1
(guanidina hidrodotada concentrada, EDTA, Tris-HCl e isopropanol), mezclar
bien con vortex y pasarlo a la columna, la cual debe de estar dentro del tubo de
lavado de 2 ml.
•
Centrifugar a 12000 rpm a temperatura ambiente en microfuga durante 1
minuto, desechar la solución recuperada.
27
•
Se añadio 700µl de buffer de lavado (NaCl, EDTA, Tris-HCl, etanol absoluto)
a la columna, la cual de nuevo debe de estar en el mismo tubo de lavado.
•
Centrifugar a 12000 rpm a temperatura ambiente en microfuga durante 1
minuto, desechar la solución recuperada y centrifugar una vez más en las
mismas condiciones.
•
Transferir la columna a un tubo eppendorf y adicionar 80µl de agua
bidestilada estéril precalentada a 70ªC.
Incubar a temperatura ambiente
durante 5 minutos y centrifugar a 12000 rpm a temperatura ambiente en
microfuga durante 2 minutos.
•
En hormo de vacío a 50ºC concentrar la muestra a un volumen final 20µl.
•
Correr 4µl de la muestra para verificar los productos en un gel de agarosa al
1.8%.
El producto de PCR se llevo a secuenciar, y se analizaron las secuencias candidatas a
mutación.
28
RESULTADOS Y DISCUSION.
En el análisis de los exones 3, 4, 16 y 17 en los 126 pacientes y lo 10 controles sanos
se obtuvieron los siguientes resultados.
Los exones amplificados corresponden al tamaño esperado. El tamaño del exón 3 es
de 176pb, el del exón 4 es de 356pb, el exón 16 de 173pb y el exón 17 consta de
302pb (ver figura L).
Marcador
Exón 3
Exón 4
Exón16
Exón 17
Marcador
400pb
200pb
Figura L. Gel de agarosa al 1.8% con producto de PCR y marcador de peso molecular Low
DNA Mass Ladder.
Exones 3 y 4.
Los exones 3 y 4, pertenecen al dominio de unión al ligando, el cual consta de 7
repeticiones de 40 aminoácidos, cada repetición contiene 6 residuos de cisteínas que
forman 3 puentes disulfuro entre ellas. Es de gran importancia para la unión al
ligando.
El análisis por SSCP para los exones 3 y 4 no mostró diferencia en la migración de
bandas entre los 126 pacientes, tampoco en comparación con los 10 controles sanos.
29
Exón 16.
El exón 16 pertenece al dominio transmembranal, que esta constituido por 22
residuos de aminoácidos hidrofóbicos interacción con la membrana celular.
El
análisis por SSCP del exón 16 no mostró diferencias en la migración de bandas entre
los 126 pacientes y los 10 controles sanos.
Exón 17
El extremo 5’ del exón 17 codifica para una parte del dominio transmembranal,
mientras que el extremo 3’ de este mismo exón codifica para el dominio
citoplasmático. Este último dominio juega un papel importante en la internalización
del complejo lipoproteína-receptor.
El análisis por SSCP del exón 17 de los 126 pacientes y los 10 controles sanos, mostró
solamente una diferencia en la migración de la banda perteneciente al paciente 105
(ver figura M), la banda migro por debajo de las bandas correspondientes a los 125
pacientes restantes y aún de los 10 controles sanos.
Fig M. SSCP de exón 17, fecha roja muestra candidato a mutación.
100
105
110 111
120
121
126 C-1
C-10
Al encontrar esta diferencia en el paciente 105, se amplifico nuevamente, pero sin
marca, se purifico y se envió a secuenciar en dos ocasiones; lo anterior fue debido a
que la primera secuencia obtenida al ser comparada con la secuencia original del
exón, mostró una homología del 90%. Por esta razón se decidió corroborar estos
30
resultados, enviando nuevamente a secuenciar el producto de PCR de este paciente
(105). Se obtuvo el histograma de secuencia de la figura N.
Se comparo la secuencia normal del exón 17 con la obtenida del paciente 105 para el
exón 17, mediante el programa DNA MAN y se obtuvo una homología del 90%. Al
analizar se encontraron varios cambios en la secuencia del paciente 105.
Las
mutaciones encontradas en el paciente 105 en el exón 17, fueron 9 silenciosas y 6
mutaciones con sentido erróneo, las cuales no habían sido reportadas con anterioridad
y se muestran en las siguientes tablas junto con la nomenclatura13,14.
Tabla 6. Mutaciones silenciosas, es decir, cambio de nucleótido en la tercera base del
triplete.
núm.
no. de
nO. de
codón
codon
aminoácido
cambio
NOMENC
nucleotido
codón
original
presente
codificado
1
2391
776
GTG
GTA
VAL
G>A
2391 G>T
2
2397
778
CTC
CTT
LEU
C>T
2397 C>T
3
2400
779
GTC
GTT
VAL
C>T
2400 C>T
4
2406
781
CTT
CTC
LEU
T>C
2406 T>C
5
2424
787
CTT
CTC
LEU
T>C
2424 T>C
6
2427
788
CTA
CTC
LEU
A>C
2427 A>C
7
2484
807
TAT
TAC
TRY
T>C
2484 T>C
8
2487
808
CAG
CAA
GLN
G>A
2487 G>A
9
2496
811
ACA
ACG
THR
A>G
2496 A>G
LATURA
.Las mutaciones silenciosas que se muestran en la tabla 6 hay cambios de base en la
tercera posición de los codones, por lo que no cambia el aminoácido, sino los
nucleótidos
31
Figura N
32
Histograma de secuencia sentido del exón 17 del paciente 105.
Al exón 17 los componen 53 codones, de los cuales los primeros 14 forman parte del
dominio transmembranal, en esta región se encontraron 6 mutaciones silenciosas, que
son las siguientes: 2391 G>T, 2397 C>T, 2400 C>T, 2406 T>C, 2424 T>C y 2427
A>C.
Los 39 codones restantes del exón 17, codifican para el dominio citoplasmático,
dentro de esta región se encontraron 3 mutaciones silenciosas (ver tabla 6) las cuales
son: 2484 T>C, 2487 G>A y 2496 A>G, que no cambia el aminoácido.
Tabla7. Mutaciones con sentido erróneo. Cambio de aminoácido.
num.
no. de
no. de
codon
codon
cambio de
cambio de
NOMEN
nucleotido
codon
original
presente
aminoácido
nucleotido
CLATUR
A
1
2410-2412
783
CTG
GTC
LEU > VAL
C>G y
L 783 V
G>C
2
2417
785
GTC
GCC
VAL > ALA
T>C
V 785 A
3
2431
790
AAG
AGG
LYS > ARG
A>G
K 790 R
4
2450
796
AAC
AGC
ASN > SER
A>G
N 796 S
5
2452
797
ATC
GTC
ILE > VAL
A>G
I 797 V
6
2519
819
CAC
CGC
HIS > ARG
A>G
H 819 R
Cuando hay un cambio de nucleótido en la primera o segunda base del triplete,
cambia el aminoácido, a este tipo de mutaciones se les conoce como mutaciones con
sentido erróneo. Los cambios de aminoácidos encontrados en el este exón para este
paciente, son por otro del mismo grupo, es decir con las mismas características
fisicoquímicas.
La región transmembranal presento 2 cambios de aminoácidos que son L78 V y
V785A, estos aminoácidos leucina, valina y alanina están dentro del Grupo R apolares
alifáticos los cuales son importantes para las interacciones hidrofóbicas entre la
proteína y la membrana citoplasmática1.
33
En la región del dominio citoplasmático se encontraron 4 mutaciones con sentido
erróneo (ver tabla 7), la cuales son: K790R, N796S, I797V y H819R. En el caso de
la mutación K 790 R y la H 819 R, los aminoácidos involucrados son lisina-arginina e
histidina-arginina, que pertenecen al grupo R cargados positivamente, por lo que el
cambio no es tan relevante.
En la mutación N796S, en el que hay un cambio de
asparagina por serina, estos aminoácidos pertenecen al grupo R polares sin carga.
En la bibliografía se han reportado que existe un secuencia altamente conservada de
gran importancia en el dominio citoplasmático para la internalización , la cual va
desde el codón 804 al 807, los cuales codifican para los aminoácidos asparagina,
prolina, valina y tirosina ( NPXY), en esta secuencia la valina puede ser sustituida por
alguno otro aminoácido. Esta secuencia es de gran importancia, porque cuando hay
un cambio en alguno de estos residuos, se ve afectado la formación del poro
recubierto (coated pit), para la internalización del complejo lipoproteína receptor. Se
realizaron experimentos de mutagénesis dirigida en la cual cambiaban ciertos residuos
de aminoácidos a lo largo de todo el exón, sin embargo esta región es la que resulto
ser más sensible a cambios de aminoácidos, es decir que si influye sobre la actividad
normal del receptor en la internalización15.
Los codones 804 al 807 pertenecientes al exón 17
en este paciente encuentran
normales, es decir no se mostré ningún cambio en esta región, que es de gran
importancia.
34
CONCLUSION.
Después de analizar los resultados obtenidos al practicar SSCP de las 126 muestras de
pacientes con DT2, para los exones 3, 4, 16 y 17, no se encontraron mutaciones como
probable factor responsable de los niveles elevados de colesterol LDL en la DT2.
Sin embargo al analizar el exón 17, se encontró un paciente con cambios conformacionales
en este exón. En este sujeto se encontraron 15 cambios de nucleótidos que no se han
reportado hasta la fecha. Estos cambios consisten en 9 mutaciones silenciosas y 6 de
mutaciones con sentido erróneo.
A pesar de lo anterior, cabe la posibilidad de los niveles elevados de LDL en este
padecimiento se deba algún defecto en el gen de la apoB-100, ya que en HF cambios en la
estructura de esta apo impiden la unión de esta última al receptor.
Por lo anterior, concluimos que los niveles elevados de colesterol LDL en pacientes con
diabetes tipo 2, no están relacionado con las mutaciones en el gen de este receptor.
35
PERSPECTIVAS.
v Búsqueda del factor responsable de la hiperlipidemia LDL en la DT 2.
v Escaneo del gen de la apo B-100, la cual es el ligando al receptor LDL, y cambios
en ella impiden esta unión.
v Análisis molecular de los familiares del paciente 105 que presento cambios
conformacionales en el exón 17.
36
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