Modificación de la técnica de PCR

Modificación de la técnica de PCR-REA de Guillot y col.
para diferenciación y tipificación de especies de Malassezia
Giusiano, Gustavo - Bustillo, Soledad - Mangiaterra, Magdalena - Deluca, Gerardo
Departamento de Micología - Instituto de Medicina Regional - UNNE.
Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia - Chaco - Argentina.
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ANTECEDENTES
Las especies del género Malassezia son organismos levaduriformes que desde la década pasada han adquirido una
importancia considerable por su asociación a procesos patológicos como agentes de micosis superficiales o de
infecciones sistémicas, siendo hoy consideradas entre los patógenos oportunistas emergentes. Dos especies han
dominado la literatura por largo tiempo, M. pachidermatis (Weidman) C.W. Dodge y M. furfur (Robin) Baillon. Desde
1996 las levaduras incluidas en este género fueron clasificadas en 7 especies, M. pachydermatis, la única especie que no
depende de suplementos lipídicos y que puede aislarse sobre la piel de otros mamíferos y seis especies lipofílicas, M.
furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. obtusa, M. globosa, M. restricta.
Este género es miembro de la flora cutánea normal humana y puede ser aislado desde diversas áreas del cuerpo,
principalmente de las seborreicas. Bajo diversos factores predisponentes endógenos y exógenos puede ser patogénico y
asociarse a diversas enfermedades como pitiriasis versicolor, foliculitis, dermatitis seborreica y atópicas, papilomatosis
y también sistémicas. La ecología y el rol patogénico de estas nuevas especies todavía no está definido y es escasa la
información sobre la epidemiología de las mismas. La taxonomía debe ser aplicada en estudios epidemiológicos para
comprobar si las siete especies de Malassezia tienen relevancia clínica (3).
Estos organismos difieren entre sí por el aspecto de las colonias, las características morfológicas y fisiológicas, el mol%
G+C, por la secuencia RNA/DNA del 25S ribosomal, los requerimientos de ácidos grasos de cadena larga, la actividad
catalasa y la termotolerancia (3).
Debido a las características fisiológicas similares de M. furfur, M. sympodialis y M. sloffiae, presentan cierta
ambigüedad la identificación de las mismas a través de la asimilación de tweens en medios simples. Algunos autores
consideran que el agregado de cremophor EL y el estudio de la actividad B-glucoronidasa podrían resolver esta
ambigüedad (15). Esta es una de las principales razones por las que diversas técnicas moleculares se han evaluado para
la identificación de las especies de este género.
El objetivo de este trabajo fue encontrar una metodología rápida, específica y eficaz que permita realizar no solo
investigaciones taxonómicas y epidemiológicas, sino como punto de partida para evaluar el rol patogénico de las
distintas especies de este género ubicadas hoy entre los patógenos oportunistas emergentes. Con ese fin se aplicaron
modificaciones a la técnica de PCR-REA de Guillot y col. (14).
MATERIALES Y METODOS
Se estudiaron cepas de Malassezia aisladas de 2 tipos de muestras:
1) Muestras de lesiones cutáneas de pacientes adultos y pediátricos con pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica,
foliculitis, dermatitis atópica, papilomatosis confluente y reticulada.
2) Puntas de catéteres de niños y adultos hospitalizados y neonatos en unidades de cuidados intensivos neonatales.
Las muestras se recolectaron en el Departamento de Micología del Instituto de Medicina Regional (UNNE), en el
Servicio de Microbiología del Hospital “Dr. Julio C. Perrando”, en el Servicio de Laboratorio del Hospital Pediátrico
“Dr. Avelino Castelán” de la ciudad de Resistencia y en el Servicio de Laboratorio del Hospital Pediátrico “Juan Pablo
II” de la ciudad de Corrientes.
Los materiales se inocularon en medio de Agar Dixon modificado y en medio de Sabouraud con antibióticos:
cloranfenicol y gentamicina. Se incubaron a 32ºC hasta 7 días.
Se estudiaron paralelamente cepas de referencia de las 7 especies de Malassezia obtenidas del INEI - ANLIS “Dr.
Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires.
Extracción de ADN
Las seis especies lípido-dependientes se reaislaron en Agar Dixon modificado y Malassezia pachidermatis en agar
Sabouraud. La lisis celular se realizó en buffer de lisis (200 mM Tris.HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5%
SDS), llevando a 100 ºC por 15 minutos. Posteriormente se realizó la purificación del ADN con cloroformo-alcohol
isoamílico.
PCR y Análisis de restricción con endonucleasas (REA)
a) Se empleó la técnica de Guillot y col. utilizando un par de primers (Malup 5´-AGC GGA GGA AAA GAA ACT-3´ y
Maldown 5´-GCG CGA AGG TGT CCG AAG-3´) seleccionados usando el software OLIGO 4.0 de las secuencias de
LSU del gen de rRNA de las especies de Malassezia (Gen Bank números de acceso: M furfur AJ249955, M. globosa
AJ249951, M. obtusa AJ249954, M. pachydermatis AJ249952, M. restricta AJ249950, M. slooffiae AJ249956 y M.
sympodialis AJ249953) (14).
Los primers fueron derivados de regiones altamente conservadas en todas las levaduras de Malassezia y que se predijo
eran gen-especificas. La PCR convencional fue realizada en un volumen de reacción de 50 µl, conteniendo 1µl de una
mezcla de 10 mM de dNTPs, 0,5 µl de Taq DNA polimerasa, 5 µl de buffer PCR 10X, 0,6 µl de cada primer y 10 µl de
DNA templado. El programa de amplificación incluyó desnaturalización inicial por 3 minutos seguido por 30 ciclos a
94ºC (30 s), 55ºC (1 min) y 72ºC (1 min).
Los productos de la PCR fueron sujetos a REA usando BanI, HaeII y MspI, separadamente de acuerdo a las
instrucciones del fabricante (Promega). Los fragmentos digeridos fueron analizados por electroforesis en agarosa 1000
(GIBCO BRL) al 3% en buffer TAE, a 90 v por 1 hora y 10 min. en frío (10-15ºC) y teñido con bromuro de etidio (0.5
µg. ml-1).
b) Se empleó la misma técnica anterior modificando la corrida electroforética utilizando gel de agarosa al 3%, en lugar
del agarosa 1000, a temperatura ambiente.
DISCUSION DE RESULTADOS
Existen diversas técnicas de moleculares similares a la aplicada en éste estudio pero que trabajan realizando la
amplificación sucesiva de tres regiones genómicas (LSU rRNA, ITS y β-tubulina) y utilizan primers designados para la
región LSU (26S-S y 26S-A), que producen un amplicón muy grande (640 pb versus 541 a 570 en nuestro estudio) que
probablemente incluya regiones muy variables (4). Esta técnica, en cambio, utiliza la PCR y análisis de restricción con
endonucleasas (REA) analizando solamente una región genómica LSU del gen de rRNA, lo cual es suficiente para
resolver la ambigüedad entre M. furfur, M. sympodialis y M. sloffiae.
Para la extracción de ADN hemos obtenido buenos resultados realizándola a 100ºC con buffer de lisis, a diferencia de la
metodología de Guillot y col. (14) que propone la utilización de un kit comercial de alto costo económico.
Las tres enzimas utilizadas producen patrones que incluyen fragmentos de restricción de 547 a 27 pb. Para poder definir
este patrón de restricción tan amplio la técnica de PCR-REA de Guillot requiere de una agarosa de alta resolución
(Nusieve) para la corrida electroforética. En el presente estudio se ensayaron dos modificaciones. No se utilizó Nusieve
reemplazándola por agarosa 1000 observándose una buena definición en los resultados. Por otro lado se propone una
técnica alternativa utilizando agarosa ultrapura al 3% en la corrida electroforética y analizando sólo las bandas mayores
a 100 pb, esto resultó suficiente para lograr una clara diferenciación entre las siete especies. De ésta manera no sólo se
disminuyen los costos, sino que se simplifica el método, ya que la corrida con agarosa 1000 debe realizarse en frío.
CONCLUSIONES
El esquema de identificación de las especies de Malassezia basado en el estudio de sus características morfológicas,
fisiológicas y bioquímicas no resuelve los problemas de ambigüedades que se presentan entre algunas de estas especies
obteniéndose resultados poco específicos. Dadas estas dificultades, varios grupos de investigación han diseñando
metodologías de identificación basadas en técnicas moleculares.
La aplicación de PCR-REA analizando solamente una región genómica LSU del gen de rRNA para la diferenciación del
género Malassezia representa una técnica precisa y rápida como procedimiento de identificación, ya que requiere poco
tiempo de trabajo a partir del desarrollo de las levaduras en el medio de cultivo. Es una técnica precisa ya que no admite
ambigüedades y permite además detectar e identificar la presencia de mezclas de dos o más especies en una misma
muestra. Esto resultaría muy difícil de discernir con las técnicas convencionales por pruebas fisiológicas y bioquímicas.
La metodología de extracción de ADN y las modificaciones propuestas en la PCR-REA en este trabajo confieren una
mayor practicidad a la técnica y disminuye los costos de la misma.
La obtención de resultados fácilmente definidos a partir de ésta técnica permitiría a través de investigaciones
taxonómicas y epidemiológicas concluir con datos confiables y certeros sobre la verdadera etiología de la infecciones
producidas por este género, contribuir al discernimiento de la ecología y la patogenia de cada una de las siete especies y
orientar en la conductas diagnósticas, la profilaxis y terapéuticas, como así también, en el discernimiento entre el valor
patogénico o secudarismo de estas especies según los diferentes casos.
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