Dosage de l`acide acétique dans les vins par méthode

RESOLUCIÓN OIV/OENO 390/2010
DIRECTRICES SOBRE LOS ANALIZADORES POR INFRARROJOS EN ENOLOGÍA
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2 apartado2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la
creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino,
A propuesta de la Subcomisión de Métodos de Análisis,
CONSIDERANDO la resolución Oeno 10/2005 «Guía práctica para la validación, el
control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis
enológico alternativo» que permite a los laboratorios llevar a cabo el trabajo de
conexión del método interno automatizado respecto al método de referencia OIV.
CONSIDERANDO que esta guía también incluye procedimientos de control de la
calidad de los resultados obtenidos por estos métodos automatizados, que permiten
garantizar la utilización segura.
CONSIDERANDO que sólo los métodos publicados en la Recopilación de los métodos
internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación de los
métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen vitivinícola de la
OIV tienen un carácter oficial de referencia y son aplicables para el control y
reglamento de discrepancias.
DECIDE adoptar y publicar independientemente las directrices sobre los analizadores
por infrarrojos en enología adjuntas.
Certificado conforme
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El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
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DIRECTRICES SOBRE LOS ANALIZADORES POR INFRARROJOS
EN ENOLOGÍA
Advertencia: Esta guía no constituye un documento de referencia sino sólo de
información. Los métodos que figuran en las líneas directrices no pueden ser
considerados como métodos de referencia de la misma manera que los que figuran en
la Recopilación de los métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV
o en la recopilación de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas
de origen vitivinícola de la OIV. Sólo los métodos publicados en la Recopilación de los
métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación
de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen
vitivinícola de la OIV tienen carácter oficial y son aplicables para el control y
reglamento de discrepancias.
Estos analizadores emplean las absorciones características de los compuestos
orgánicos de los vinos y de los mostos en el espectro infrarrojo para su cuantificación.
Existen dos grandes familias utilizadas en enología:


Los analizadores de infrarrojo cercano (NIR) ;
Los analizadores de infrarrojos por transformada de Fourrier (IRTF).
1. Los analizadores de infrarrojo cercano
1.1
Principio
Los compuestos cuya determinación desea conocerse se someten a una radiación de infrarrojo
cercano en la que presentan bandas de absorción características. Los datos espectrales de la
muestra analizada se comparan con los obtenidos en el caso de vinos patrón de referencia,
empleados para el calibrado inicial del equipo, y la concentración del compuesto buscado se
calcula a partir de una regresión lineal múltiple. El equipo, informatizado, puede acoplarse a un
extractor de muestras. El nivel de absorción debe ser elevado para que los resultados sean
válidos y el método sólo es aplicable a los macro-compuestos del vino o del mosto, esto es,
básicamente el etanol y los azúcares. Las principales virtudes de este método son su simplicidad
de aplicación, su alta cadencia analítica y el hecho de que no precisa preparación de la muestra
más allá de una descarbonatación de los mostos en fermentación.
1.2
Material
Los equipos utilizados en enología trabajan por reflexión. El fondo de la célula de circulación que
contiene el vino o el mosto que se desea analizar dispone de un reflector que refleja el rayo
infrarrojo incidente, que atraviesa así por segunda vez la muestra antes de ser analizado por el
detector. Los equipos constan de los elementos siguientes.
Un sistema de bombeo de la muestra
En general se trata de una bomba peristáltica que permite llenar la célula de medición. El
sistema de bombeo suele completarse con un baño termostático que permiten ajustar la
temperatura de la muestra al valor deseado para la medición.
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Una fuente luminosa
Se trata de una lámpara de tungsteno que produce una luz policromática con un espectro de
320 a 2.500 nm. La alimentación debe estar perfectamente estabilizada para obtener una
intensidad constante.
Un selector de longitud de onda
Los equipos utilizados en enología utilizan filtros interferenciales de longitudes de onda
conocidas o monocromadores de red para poder seleccionar longitudes de onda características
de los compuestos buscados.
Una célula de medición
La parte que atraviesan los rayos incidentes y reflejados es de cuarzo. El fondo de la célula
puede ser de cerámica recubierta con una capa de oro que permite la reflexión. Esta célula se
mantiene a una temperatura de medición constante, en general mediante un sistema de efecto
Peltier.
Detectores
Dos células fotoeléctricas de sulfuro de plomo recogen la radiación reflejada.
Programa informático
Realiza el tratamiento matemático y estadístico que permite realizar las comparaciones con el
calibrado del equipo y la determinación de la concentración buscada.
1.3
Método de trabajo
La utilización de un analizador de infrarrojo cercano consta de varias etapas.
El calibrado inicial
Esta etapa permite realizar un calibrado permanente del equipo, que servirá de referencia.
Consiste en utilizar el máximo número posible (como mínimo 50) de vinos o mostos de
concentraciones conocidas del analito buscado. Los valores de estas concentraciones deben
distribuirse uniformemente en toda el rango de medición deseada. Las matrices deberán ser lo
más próximas posible a las de los vinos o los mostos que se analizarán a continuación. Para
cada muestra de calibrado, se efectúa una medición para un máximo de longitudes de onda que
cubren el espectro infrarrojo cercano. Se efectúa una regresión multilineal a partir de los
resultados registrados, que permiten establecer la relación siguiente:
Donde:
C = K0 + K1R1 + K2R2 + K3R3 + … + KiRi
C es el valor de concentración buscado
K0 es una constante característica del equipo para un compuesto buscado, independiente de la
longitud de onda.
Ki es una constante para un equipo, un compuesto buscado y una longitud de onda
determinada.
Ri es la expresión de la medición espectral para la longitud de onda Li
Para cada analito buscado se seleccionan de 2 a 10 longitudes de onda características.
La calidad del calibrado se pone a prueba mediante la presentación de una nueva serie de
muestras de vinos o mostos de referencia con concentraciones conocidas.
Calibrados periódicos
Resultan necesarios cuando los controles rutinarios revelan una desviación de los resultados
ligada al equipo (envejecimiento de los componentes electrónicos, reparación, cambio de piezas,
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etc.). Este procedimiento no cuestiona la selección de las longitudes de onda, sino que permite
realizar un nuevo cálculo de las constantes K0 y Ki.
Correcciones rutinarias del sesgo
Antes de cada utilización del material, se analiza(n) una(varias) muestra(s) de control de
concentración conocida de analito buscado. Si aparece un sesgo respecto al valor esperado,
puede efectuarse una corrección.
2. Los analizadores de infrarrojos por Transformada de Fourrier (IRTF)
2.1
Material y principio del método
El material empleado es un interferómetro que utiliza la espectrofotometría de infrarrojos por
Transformada de Fourrier, que permite escanear la totalidad del espectro infrarrojo en una
banda espectral de 2.000 a 10.000 nm, que cubre una parte del infrarrojo cercano y medio.
Tras el calibrado del equipo para diferentes compuestos orgánicos, el análisis de un espectro
permite dosificar simultáneamente estos últimos en el vino o el mosto analizado.
2.2
Interferometría y Transformada de Fourrier
La interferometría es un método alternativo a las técnicas clásicas de adquisición de un espectro
en una escala de longitud de onda determinada. Estas técnicas son farragosas y requieren
mucho tiempo si se desea obtener una resolución fina. La interferometría permite tratar todas
las longitudes de onda emitidas por una única fuente de infrarrojos al mismo tiempo, sin
selección previa, lo que permite obtener un espectro completo en menos de un segundo.
La primera etapa consiste en realizar un interferograma en la muestra que se desea analizar. El
interferómetro se basa en la separación en una lámina de una luz infrarroja policromática
(procedente en este caso de un filamento incandescente). Antes de llegar al detector, las dos
partes de la señal siguen un camino diferente: una primera parte atraviesa directamente la
muestra y una segunda parte se refleja en un espejo móvil antes de regresar hacia la muestra.
Para cada longitud de onda elemental de esta emisión infrarroja, al llegar al detector se
obtendrá una diferencia de fase p. Gracias al espejo móvil, esta diferencia de fase p varía
continuamente durante la medición.
Así, la señal final obtenida es una interferencia de dos señales luminosas de misma longitud de
onda y de diferencia de fase p.
En función de la diferencia de fase, la recombinación será constructiva o destructiva, esto es, en
función de p, la intensidad de la señal de interferencia será variable. La variación de la
intensidad en función del desfase se llama un "interferograma". Su modelo matemático es una
integral.
La Transformada de Fourrier es un procedimiento matemático que permite hallar a partir del
interferograma la intensidad de la señal en función de la longitud de onda y reconstituir el
espectro infrarrojo. Este farragoso cálculo sólo puede realizarse utilizando un sistema
informático potente. Este cálculo importante, no puede ser realizado sino por la utilización de
una informática potente.
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Espejo
Detector IR
Señal 100%
Cubeta
Señal 50%
Señal
interferencia
de
Espejo
Espejo
Fuente IR
Lámina separadora
Interferómetro
Michelson
de
Figura 1: Esquema simplificado de un interferómetro de Michelson
Una vez obtenido de este modo el espectro calculado, encontramos las aplicaciones clásicas de
la espectrofotometría, que permite utilizar las longitudes de onda específicas de absorción de los
diferentes compuestos orgánicos cuya concentración estamos buscando.
2.3
Ejecución de la obtención del espectro infrarrojo
La muestra que se desea analizar no precisa ninguna preparación particular. Sin embargo, en el
caso de los mostos o vinos en rama, se realiza una clarificación por centrifugación o por
filtración para evitar colmataciones. Para contenidos de gas carbónico superiores a 750 mg/l, es
preciso llevar a cabo una eliminación parcial previa para evitar problemas de desgasificación en
el circuito de análisis.
El circuito comienza con una aguja de toma que puede maniobrarse manualmente o bien
controlarse mediante un muestreador. Una bomba peristáltica permite bombear la muestra
hasta una cámara de calentamiento, donde se lleva a una temperatura de 40 °C. Tras pasar por
un filtro, atraviesa la cubeta de medición. Esta última constituye una pieza esencial del equipo.
Está hecha de fluorosilicatos ya que el vidrio o el cuarzo presentan una absorción importante en
el infrarrojo medio. A continuación, la muestra se desecha por el desagüe.
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Bomba
peristáltica
Unidad de
calentamiento
Filtro
Cubeta
Aguja de toma
Desagüe
Figura 2: Esquema simplificado del circuito analítico
El ciclo completo para una muestra dura 30 segundos. La versión automatizada permite una
cadencia efectiva del orden de 120 muestras por hora.
2.4
La quimiometría
En general, el espectro medio infrarrojo de un vino o un mosto contiene datos que presentan un
interés analítico cuya extracción no es inmediata. En la mayoría de casos, ésta requiere un
tratamiento matemático que puede ser muy complejo. El conjunto de los medios que pueden
emplearse para obtener estos datos analíticos forma parte de una ciencia reciente: la
quimiometría. Ésta fue definida en 1996 por GELADI como «la ciencia del uso de los métodos
matemáticos, estadísticos e informáticos que tiene como objetivo extraer la información útil
presente en datos de mediciones químicas». La quimiometría incluye así los métodos
estadísticos adaptados al tratamiento de los datos espectrales.
Los analistas pueden perseguir dos objetivos principales:
La descripción global del producto analizado (método exploratorio). Se trata de clasificar los
espectros por familias previamente definidas. Una aplicación en enología puede ser definir la
matriz de un producto objeto de la medición. Este tipo de herramienta puede permitir
determinar si el producto es un mosto, un mosto en fermentación, un vino seco, un vino
licoroso o un vino dulce natural.
Un enfoque predictivo permite, a partir de datos de referencia previamente obtenidos
(calibrado), hallar valores analíticos de compuestos o índices relativos a la composición de un
vino o un mosto desconocido. Actualmente, los laboratorios utilizan sobre todo este segundo
procedimiento en la medición, donde es posible sustituir las herramientas analíticas clásicas por
la IRTF.
Los métodos quimiométricos aplicables para llegar a los resultados antes descritos son
extremadamente numerosos y su aplicación sólo está al alcance de los especialistas. Pueden
clasificarse en dos grandes grupos según se basen en un modelo lineal o no lineal. Van de las
herramientas estadísticas simples, como el análisis de componentes principales (ACP), a
herramientas de gran complejidad matemática y de utilización, como las redes neuronales.
Mientras que todos los fabricantes ofrecen herramientas de medición óptica con prestaciones
satisfactorias, los medios de normalización de las mediciones, las herramientas de tratamiento
de los datos del espectro y la calidad de las herramientas de quimiometría que se ofrecen a los
usuarios son mucho más variables. Las dificultades halladas por los laboratorios están a menudo
relacionadas con este punto. Asimismo, una parte de las polémicas surgidas en torno al método
tiene su origen en este hecho. La calidad del tratamiento quimiométrico utilizado para la lectura
de los datos espectrales de un vino o un mosto reviste una importancia crucial para la obtención
de resultados analíticos fiables y precisos.
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2.5
Análisis del espectro de infrarrojo medio
Es interesante conocer la enorme complejidad de los datos que contiene el espectro de
infrarrojo medio de un vino o un mosto. Ésta se debe a varios elementos:
1/ La composición orgánica y mineral de estos productos es una de las más ricas del ámbito
agroalimentario.
2/ Las zonas de absorción de cada molécula orgánica en el infrarrojo medio son múltiples
debido, en particular, a importantes fenómenos de resonancia.
3/ Entre los diferentes compuestos orgánicos existen interacciones que generan importantes
efectos matriz imposibles de modelizar.
Así, contrariamente a otros análisis espectrofotométricos, casi siempre es imposible aplicar al
análisis IRTF de los mostos y los vinos conocimientos teóricos sobre la absorción de un
compuesto determinado. Únicamente cabe recurrir a la práctica experimental. Este punto se
convierte en una característica fundamental del método, que se basa así en un enfoque
estrictamente matemático, cuyo rendimiento será determinante para la calidad final del
resultado. El procedimiento de este enfoque experimental de calibrado consiste en multiplicar la
adquisición de espectros por un máximo de variedades de muestras de valores conocidos con
precisión para el compuesto o el índice que se desea analizar, antes de aplicar los métodos
estadísticos matemáticos. Es indispensable comprender que esta etapa es fundamental para
obtener una buena herramienta de análisis. El operario debe disponer no sólo de un número lo
más elevado posible de muestras representativas, sino que debe aplicar los métodos
quimiométricos mejor adaptados y, si es posible, realizar un análisis comparativo crítico de los
resultados obtenidos con varias de ellas. Este procedimiento debe completarse siempre con una
comparación estadística muy amplia de los resultados ofrecidos por el modelo elegido y por los
métodos analíticos de referencia. Pueden precisarse miles de determinaciones para esta última
etapa. El calibrado es, pues, un procedimiento largo y delicado que requiere tiempo y medios
importantes.
Para comprender mejor la dificultad del enfoque, se deben precisar los puntos críticos
siguientes:
Comportamiento del analito
Todos los compuestos orgánicos del vino no tienen el mismo comportamiento analítico, por
varios motivos:



En premier lugar, es evidente que los compuestos con una concentración elevada (por
encima de 1 g/L, por ejemplo) tienen muchas probabilidades de ser más fáciles de
determinar, ya que generan fenómenos de absorción más consecuentes.
En segundo lugar, las capacidades de absorción características de un compuesto
dependen de su constitución molecular. Algunas moléculas, como el dióxido de carbono,
por ejemplo, tienen una alta capacidad de absorción en el infrarrojo medio, mientras
que otras moléculas, aunque más complejas, tienen absorciones mucho más modestas.
Por último, la influencia de los demás compuestos del vino (efecto matriz) es un dato
esencial. Resulta sencillo entender que si las longitudes de onda de absorción
características de un compuesto se superponen en el espectro a las del agua o el etanol,
presentes en muy alta proporción, la sensibilidad de medición para este compuesto se
verá muy mermada. Asimismo, existen fenómenos de interacción entre los
constituyentes que pueden desplazar las bandas de absorción.
Cabe admitir que, de nuevo, los conocimientos teóricos no resultan de excesiva utilidad y que
sólo la práctica experimental puede permitir determinar si un compuesto dado puede analizarse
fácilmente por IRTF o no. A modo de ejemplo, la determinación de los azúcares resulta delicada
para valores inferiores a 1 g.l-1, mientras que la del nitrógeno amoniacal (NH3) es accesible a
partir de 10 mg.l-1.
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Estos datos sobre el comportamiento de los analitos permiten comprender que es más fácil
analizar un compuesto con una alta concentración que presenta en el infrarrojo medio
absorciones muy características, fuera de las zonas de absorción del agua y el etanol, y poco
sensibles a los efectos matriz, que un compuesto que presenta las características opuestas. De
este modo, el etanol será mucho más fácil de analizar que el etanal. Asimismo, es evidente que,
cuanto más difícil es acceder a un compuesto, más complejo resulta y más deberá cuidarse el
trabajo de calibrado. En particular, el muestreo inicial deberá ser suficientemente amplio y
perfectamente seleccionado, las herramientas quimiométricas deberán ser más potentes y
pertinentes, y el trabajo de comparación con los métodos de referencia deberá realizarse sobre
un mayor número de muestras.
Extrapolación
Se trata de un punto esencial. En el trabajo de calibrado no es posible contar con una capacidad
de extrapolación del sistema. Así, si el muestreo inicial no cubre la totalidad del ámbito de
análisis deseado de forma equitativa, los resultados obtenidos en las zonas menos ricas en
datos iniciales mostrarán deficiencias. Asimismo, si existe un efecto matriz significativo, como el
que a menudo ofrecen los compuestos fenólicos, se hace indispensable la presencia de vinos de
todas las concentraciones en compuestos fenólicos a todos los niveles de la gama. De lo
contrario, la parte de rango no cubierta por todos los valores posibles de compuestos fenólicos
será más sensible a los efectos matriz y no será fiable.
Los efectos matriz
Hemos visto antes que el efecto matriz se debe a los otros compuestos presentes en el medio
que se desea analizar y absorbentes en el infrarrojo medio. No obstante, el efecto matriz no es
un problema insoslayable. Todo calibrado puede tener en cuenta numerosos efectos matriz.
Para ello, como en los sistemas expertos, conviene ofrecer la información necesaria para que la
herramienta pueda, por aprendizaje, medir el impacto del efecto matriz sobre la determinación
del compuesto buscado. De este modo será posible eliminar el efecto matriz por referencia al
valor de calibrado cuando se detecte en una muestra desconocida. En esta fase, es fácil
comprender que cuantas más matrices diferentes presentemos durante un calibrado, más
robusto será éste y con más facilidad podrá evitar los efectos matriz. Éste es uno de los puntos
más interesantes del método IRTF. Sin embargo, existe un límite en su utilización: cuanta más
capacidad de gestión del efecto matriz se introduce en un calibrado, más sensibilidad y precisión
pierde éste. Por tanto, el operario deberá tomar una decisión al desarrollar un calibrado para
hallar el equilibrio óptimo entre robustez, sensibilidad y precisión. De nuevo, el procedimiento
puede hacerse muy complejo y no puede ponerse en práctica sin el uso de medios importantes.
En la práctica enológica, no es posible trabajar con calibrados que cubran todas las matrices
susceptibles de ser halladas. El estado de los conocimientos permite, sin embargo, para las
determinaciones más corrientes, agrupar los vinos y mostos en cinco matrices fundamentales:





los
los
los
los
los
mostos no fermentados,
mostos en fermentación,
vinos secos o poco azucarados,
vinos licorosos,
vinos dulces naturales.
Por el contrario, cabe señalar que, en general, los calibrados correctamente realizados eliminan
los efectos matriz generados por variedades de cepa diferentes, el color del vino o el origen
geográfico.
La complejidad de los efectos matriz implica otra consecuencia importante: es imposible utilizar
para el calibrado, al igual que para el control, muestras sintéticas o muestras recargadas. Sólo
los vinos naturales son pertinentes.
Valores de referencia
La calidad de un trabajo de calibrado depende también de la calidad de los valores de referencia
de las muestras que se emplean. El ejemplo del ácido glucónico resulta revelador. El método
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enzimático de determinación del ácido glucónico clásicamente utilizado , no es fiable. Presenta
una falta de robustez no señalada en la bibliografía correspondiente y que probablemente se
debe a efectos matriz no identificados. Las primeras calibraciones IRTF se realizaron con
resultados obtenidos mediante este método y, aunque el ácido glucónico presenta
características de absorción muy marcadas, los resultados obtenidos por IRTF resultaron
deficientes. Más adelante se realizaron nuevas calibraciones utilizando, para los valores de
referencia, técnicas más fiables como la electroforesis capilar, y los resultados obtenidos por
IRTF son actualmente de gran calidad.
2.6
Principales etapas del análisis espectral
La figura 3 ilustra un espectro infrarrojo del vino.
Figura 3: Ejemplo del espectro infrarrojo medio de un vino
A partir del banco de datos obtenido con las muestras de referencia de valor conocido para el
analito buscado, las herramientas de quimiometría utilizadas permiten seleccionar las zonas
espectrales más pertinentes para éste (en general, una decena) y, seguidamente, calcular un
modelo de regresión, que se utilizará para realizar la predicción para cualquier muestra
desconocida.
2.7
La importancia del control de la calidad de los resultados
Una vez asumidos los puntos anteriores, hay que ser consciente de que la utilización de la IRTF
implica, para el laboratorio, la obligación de crear una herramienta de control de la calidad de
los resultados, que debe basarse en una estrategia específica, original y adaptada. Una
automatización muy potente del sistema unida a una utilización simple del equipo constituye
una peligrosa trampa en términos de riesgo de desviación de los resultados o de existencia de
resultados aberrantes no identificados. Sólo un sistema muy completo y estricto de
identificación de las matrices, de eliminación de los resultados relativos a muestras no
conformes a definiciones precisas, de introducción en las series de muestras de controles
suficientemente numerosos y la perfecta gestión de los datos recabados puede garantizar la
calidad de los resultados. Los laboratorios deben saber que el tiempo dedicado al control de la
calidad de los resultados supone, con la IRTF, una parte mucho más importante del tiempo total
dedicado al análisis en comparación con el que precisan los otros métodos habitualmente
utilizados en los laboratorios de enología.
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Una estrategia de control de la calidad de los resultados puede incluir los siguientes
elementos:
2.7.1.1
Rangos de trabajo
Los rangos de trabajo validados deben establecerse para cada parámetro analítico.
Todos los resultados fuera del rango de trabajo, deben ser confirmados por los
métodos validados que sirven de apoyo al resultado IRTF.
2.7.1.2 Divergencia máxima admitida para las dos repeticiones
Este procedimiento debe introducirse en la aplicación de una nueva herramienta IRTF.
El laboratorio puede a continuación suspender la aplicación si los resultados obtenidos
son satisfactorios. Para cada muestra se efectúan dos lecturas. Las lecturas se aceptan
si su divergencia es inferior a la divergencia modelo máxima establecida para cada
parámetro analítico. La determinación para cada parámetro se repite, si la divergencia
de las lecturas supera la divergencia modelo máxima establecida.
2.7.1.3 Materiales de referencia (MR)
Los materiales de referencia deben presentar matrices conformes a las de los vinos
analizados. Sirven para comprobar la estabilidad del sistema analítico a lo largo del
tiempo. Los valores de referencia del MR se establecen a partir del certificado de
análisis (materiales resultantes de ejercicios interlaboratorios) o a partir de los
resultados obtenidos con los métodos utilizados para la calibración del IRTF. Se
asocian algunas tolerancias a los valores de referencia para establecer “límites de
alerta” y “límites de acción”. La serie de trabajo debe integrar varios MR
representativos de las matrices analizadas y dentro del rango de trabajo. La secuencia
de trabajo se valida si se incluyen todos los resultados del conjunto del MR dentro de
los límites de alerta. Si los resultados del MR se encuentran entre el límite de alerta y
el límite de acción, la secuencia analítica es válida, no obstante, sería necesario
comprobar:
1) si el MR se alteró (por ejemplo por mala conservación)
2) la posible existencia de divergencias sistemáticas que requiere entonces un
ajuste de la calibración. En ese caso, conviene utilizar los resultados más
recientes (si es posible del día) obtenidos por cruce de métodos (2.2.7.4). La
situación debe valorarse en función de toda la información disponible.
Si uno o más resultados de los distintos parámetros analíticos del MR están sobre el
límite de acción, no se valida la secuencia analítica. Conviene:
1) confirmar el resultado (s) anormal (es) por los métodos que sirven de apoyo
al resultado IRTF
2) efectuar una normalización de las condiciones espectrales del aparato IRTF.
3) analizar otro MR disponible para comprobar si las lecturas respetan los
criterios establecidos.
4) confirmar si los antecedentes cruce de métodos (2.2.7.4) demuestran que
un ajuste de la calibración debe practicarse (divergencias sistemáticas) para el
parámetro anormal.
La situación debe valorarse en función de toda la información disponible. En particular,
nunca debe hacerse una corrección del sesgo a partir de la única información
establecida por el MR.
2.7.1.4 Cruce de métodos
Es muy importante hacer sistemáticamente el cruce de los resultados obtenidos por
IRTF y por los métodos de referencia que sirven de apoyo al resultado. Se recomienda
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efectuar el cruce de métodos diariamente para los parámetros más sensibles. Las
diferencias deben ser inferiores o iguales a los límites de acción (2.2.7.3). Si la
diferencia entre los resultados obtenidos para un parámetro analítico, supera el límite,
es necesario considerar los puntos siguientes:
1) encontrar una explicación probable (por ejemplo matriz no - cubierta por la
calibración);
2) efectuar un cruce de métodos con otras muestras de la serie de trabajo;
3) confirmar si los antecedentes del cruce de métodos demuestran que un
ajuste de la calibración debe practicarse (divergencias sistemáticas) para el parámetro
anormal.
Criterios de aceptabilidad de una nueva calibración
Es también muy importante tener criterios definidos para sustituir una calibración
validada y aplicada por una nueva calibración. Una de las estrategias posibles es
considerar los puntos siguientes:
1) la nueva calibración debe incluir un número de observaciones superior al de
la calibración utilizada;
2) el “cross validación error” (CVR) de la nueva calibración debe, idealmente,
ser inferior o igual al de la calibración anterior; un CVR superior puede sin
embargo aceptarse si hay un refuerzo de las zonas de calibración menos
potentes;
3) para un conjunto de al menos 15 vinos representativos dentro del rango de
trabajo, conviene comparar los resultados obtenidos con la nueva calibración y
los obtenidos con la calibración anterior y con los métodos que sirven de apoyo
al resultado IRTF.
4) Se recomienda efectuar la comparación de los resultados obtenidos con la
calibración anterior y los obtenidos con la nueva calibración introduciendo
materiales de referencia externa. Conviene sin embargo garantizar que estos
últimos son vinos o mostos naturales no dopados y no estabilizados con
compuestos que pueden modificar la matriz.
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ANEXO 1
EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN HABITUALES EN ENOLOGÍA MEDIANTE
ANALIZADORES DE INFRARROJO CERCANO (IRC)
Los métodos aquí descritos sólo lo son a título de ejemplo.
1. Determinación del grado alcohólico de vinos y mostos en
fermentación mediante infrarrojo cercano
1.1 Principio
Un rango de longitudes de onda de 1.150 nm a 1.200 nm presenta una absorción específica que
permite determinar el grado alcohólico de las bebidas alcohólicas. En este intervalo, ningún otro
compuesto interfiere en la determinación. Dos puntos en los extremos del rango permiten
determinar la línea de calibrado. El cálculo de la concentración de alcohol se realiza utilizando
un algoritmo simple. La medición puede efectuarse para una escala la cual tiene de 0 a 20
%vol.
1.2 Reactivos y materiales de referencia
1/ Agua destilada y descarbonatada.
2/ Soluciones hidroalcohólicas cuyo grado alcohólico se determina después de la
destilación por la medida de la masa volumétrica.
1.3 Material
Se utiliza un espectrómetro de infrarrojo cercano con una calibración específica para la medición
del grado alcohólico en los vinos y los mostos en fermentación.
1.4 Muestreo
Las muestras deben estabilizarse previamente a una temperatura próxima a los 20°C. El análisis
debe realizarse rápidamente tras la apertura de las muestras.
Conviene eliminar el gas carbónico excedente por filtración sobre papel de filtro de gran
porosidad o por cualquier otro medio.
1.5 Procedimiento
Antes de realizar las mediciones, el espectrómetro debe ajustarse utilizando agua destilada y
una solución hidroalcohólica de grado conocido.
1.6 Cálculos
Los equipos disponen de un programa de cálculo que ofrece directamente el resultado en %vol.
con 2 decimales.
1.7 Validación del método
1.7.1 Comparación interlaboratorio entre la determinación del grado alcohólico por
infrarrojo cercano y determinación por el método de referencia después de la
destilación en los vinos
El objetivo principal de este estudio era comparar los resultados obtenidos por el método de
infrarrojo cercano y el método de referencia OIV por destilación. 14 laboratorios participaron en
esta comparación. 10 vinos diferentes procedentes de 5 países europeos han sido sometidos al
examen de los laboratorios. Su grado alcohólico cubría una escala de 9 a 14 %vol. Cada
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análisis, por el método de referencia o por infrarrojo cercano, se realizó 3 veces en cada uno de
los laboratorios. El cuadro n.° 1 detalla los diferentes vinos, que incluían vinos blancos secos o
dulces y vinos tintos secos.
Tabla 1: Lista de las muestras
País
Color del
vino
Grado alcohólico
indicado en la
etiqueta
Seco/dulce
Número de
muestreo
Portugal
blanco
9%vol
seco
1
Francia
blanco
11,5%vol
seco
2
Italia
blanco
12,5%vol
seco
3
Austria
blanco
13,0%vol
seco
4
Austria
blanco
10,0%vol
dulce
5
Hungría
blanco
13,0%vol
dulce
6
Italia
tinto
11,5%vol
seco
7
Austria
tinto
12,0%vol
seco
8
Francia
tinto
13,0%vol
seco
9
Austria
tinto
14,0%vol
seco
10
1.7.2 Resultados de la validación y conclusiones
La búsqueda de los valores erráticos mediante el test de GRUBBS es negativa para los erráticos
de tipo 1.
Los resultados de la medición del grado alcohólico volumétrico a partir de un amplio muestreo
de vinos revelan que los valores obtenidos por el espectrómetro de infrarrojo cercano son
idénticos a los obtenidos por el método de referencia por destilación. Las repetibilidades y
reproducibilidades de los dos métodos son comparables. Los valores obtenidos se muestran en
la tabla n° 2.
Tabla 2: Resumen de los parámetros de fidelidad
Todos los valores
Tras eliminación de los aberrantes
Parámetro
NIR:
Destilación:
NIR
Destilación:
r
0,0396
0,0638
0,0328
0,0639
sr
0,0142
0,0228
0,0117
0,0228
R
0,1705
0,1865
0,1136
0,1500
sR
0,0609
0,0666
0,0406
0,0536
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1.8 Bibliografía
Amtsblatt der Europäischen Union; Bestimmung des Alkoholgehaltes von Wein mittels
hydrostatischer Waage; VO (EG) Nr. 128/2004;
OIV; ANNEX A – Methods of Analyses of wines and musts; Alcoholic strength by volume; Seite 1
– 52; Section 3.1.2; compendium of international methods of wine and must analysis; Volume
1; Edition 2010
Murer; G.; Benes,R.; Germann, K.; Imre, M.; Kotnik, P.; Sauseng,G.; Trinkel, M; Alcolyzer – Ein
Alkoholmessgerät für Wein; Schweizerische Zeitschrift für Obst-und Weinbau, Wädenswill;
Switzerland, 2000, 136(23)597-598
American Society of Brewing Chemists; Anton Paar Alcolyzer for Measurement of Alcohol and
Original Extract Content in Flavored Alcohol Beverages; Journal – American Society of Brewing
Chemists; USA, 2006, VOL 64; Part 4, pages 242-243
W. Horwitz; Protocol fort he design, conduct and interpretation of collaborative studies; Pure &
Appl. Chem.; Vol. 60; No 6; pp. 855-864; 1988;
W. Horwitz; Protocol fort he design, Conduct and interpretation of method-performance studies;
Pure & Appl. Chem.; Vol. 67; No 2; pp. 331-343; 1995;
OIV; Praktischer Leitfaden für die Validierung, Qualitätskontrolle und Bestimmung der
Unsicherheit einer üblichen önologischen Analysenmethode; Resolution Oeno 10/2005;
CABANIS M.T., CABANIS J.C., RAFFY J., PEYRONNENCHE M., VIOTTE O., LEBOEUF J.P. 1983
L’Infralyseur 400 : une détermination automatique du titre alcoométrique des vins. Rev. Fr.
Oenol., 89, 75-79.
BOUVIER J.C., 1986 Influence du glycérol sur la mesure du degré alcoolique par infra-rouge.
Rev. Fr. Oenol., 102, 21-22.
OIV, Recueil des méthodes d’analyse des boissons spiritueuses d’origine vitivinicole Edition
2010.
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ANEXO 2
EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN COMUNES EN ENOLOGÍA POR ANALIZADORES
INFRARROJOS MEDIOS (IRTF)
Los métodos descritos a continuación sólo lo son a modo de ejemplo. Su número no deja de
crecer debido a la realización constante de nuevas calibraciones. Los más importantes
actualmente desarrollados pueden clasificarse en varias categorías distintas.
1. Los métodos “directos”
Se trata de la determinación de los compuestos orgánicos para los cuales la correlación entre la
absorción molecular y la concentración puede considerarse directa. El cuadro siguiente resume
los métodos habitualmente hallados.
Analito
Escala de medición
Reproducibilidad
intralaboratorio
Glucosa y fructosa
0 a 400 g.L-1
1,3 g.L-1
Ácido málico
0,3 a 6 g.L-1
0,15 g.L-1
0,6 g.L-1
Ácido láctico
0,3 a 6 g.L-1
0,15 g.L-1
0,6 g.L-1
60 a 1300 mg.L-1
95 mg.L-1
230 mg.L-1
0,2 a 10 g.L-1
10 %
Dióxido de carbono
Glicerol
Ácido tartárico
Ácido glucónico
1 a 15 g.L
-1
0,1 a 15 g.L
-1
Reproducibilidad
interlaboratorio
10 %
10 %
2. Los métodos “indirectos”
En enología encontramos dos casos diferentes.
1/ La molécula buscada no tiene una absorción significativa en el infrarrojo cercano, ya sea por
su naturaleza o debido a concentraciones demasiado débiles.
2/ La búsqueda no tiene que ver con una molécula específica sino con un índice que traduce un
equilibrio resultante de un conjunto complejo de compuestos orgánicos.
Para el primer caso, pondremos el ejemplo de la determinación del potasio. El ión potasio no
absorbe en el infrarrojo. Las absorciones que se detectan mediante los procedimientos
quimiométricos y que se correlacionan con su concentración en el vino o el mosto analizados
son, de hecho, las de compuestos orgánicos que están en equilibrio con ese ión.
Para el segundo caso, podemos citar como ejemplo las mediciones del pH o de la acidez total,
muy bajos, y que son posibles por la lectura, en el espectro infrarrojo, de los equilibrios
complejos de los compuestos orgánicos responsables de estos valores indicados
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El cuadro siguiente describe los métodos habitualmente aplicados.
Método
Escala de medición
Reproducibilidad
intralaboratorio
Reproducibilidad
interlaboratorio
0,0012 a 1,4000 g.cm-
0,00015 g.cm-3
0,0010 g.cm-3
8 a 16 %.vol.
0,10 %.vol.
0,21 %.vol.
Acidez total
3 a 33 g.l-1 en ácido
tartárico
0,11 g.l-1 en ácido
tartárico
0,15 g.l-1 en ácido
tartárico
Acidez volátil
0,30 a 0,96 g.l-1 en
ácido acético
0,036 g.l-1 en ácido
acético
0,12 g.l-1 en ácido
acético
2,6 a 4,7
0,06
0,12
600 a 8000 mg.L-1
10 %
15 a 100
14
Nitrógeno amoniacal
5 a 250 mg.L-1
16 %
Nitrógeno -aminado
5 a 250 mg.L-1
10 %
Densidad
Grado
alcohólico
volumétrico
pH
Potasio
Índice de compuestos
fenólicos totales
3
3. Bibliografía
DUBERNET Marc, DUBERNET Matthieu y GRASSET Françoise, 1999, Utilisation de l’analyse
infrarouge multiparamétrique à transformée de Fourier en œnologie, Feuillet vert OIV N°1089.
DUBERNET Marc et DUBERNET Matthieu, 2000,
Utilisation de l’analyse infrarouge à
transformée de Fourier pour l’analyse œnologique de routine, Revue Française d’œnologie,
N°181, 10-13.
Marc DUBERNET , Matthieu DUBERNET, Vincent DUBERNET, Sylvain COULOMB, Matthieu LERCH
e Isabelle TRAINEAU, 2000, Analyse objective de la qualité des vendanges par spectrométrie
infra-rouge à transformée de Fourrier (IRTF), Congrès OIV 2000, Paris.
DUBERNET Matthieu, DUBERNET Marc, GRASSET Françoise, GARCIA Augustin, 2001 Analyse de
l’azote assimilable dans les moûts par Interférométrie Infrarouge à Transformée de Fourier,
Revue Française d’Oenologie, N°187, 9-13.
DUBERNET Matthieu, DUBERNET Marc, SAGE Lucile, 2006, Modification de la composition des
moûts et des vins issus de raisins parasités par Aspergillus carbonarius. Evaluation rapide de la
contamination du raisin et de la teneur en Ochratoxine A dans les moûts et les vins par
infrarouge à transformée de Fourier, Revue Française d’œnologie, N°216.
BERTRAND D., DUFOUR E. et al. 2000, La spectroscopie infrarouge et ses applications
analytiques. Technique et documentation Ed.
PATZ C-D, DAVID A., THENTE K., KURBEL P., DIETRICH H ; 1999. Wine
analysis with FTIR spectrometry. Wein Wissenschaft, 54, 80-87.
J.C. Boulet, P.Williams, T.Doco. A Fourier transform infrared spectroscopy study of wine
polysaccharides, Carbohydrate Polymers, 69 (2007), 79-85.
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J.C. Boulet, T.Doco, J.M. Roger, Improvement of calibration models using two successive
orthogonal projection methods. Application to quantification of wine polysaccharides,
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 87 (2007), 295-302.
FERREIRA M.L., COSTA A. M., RIBEIRO N., SIMÕES T., BARROS P., 2009. Quality control in FTIR
wine análisis. Acceptance of analytical results. Ciência Tec. Vitiv., 24(1), 47-53.”
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