nº1/11. Marzo 2012
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01/2011 IZASALAB izasa.es REVISTA DEL GRUPO INSTRUMENTACIÓN CIENTÍFICA Nuevas técnicas de Súper Resolución Técnicas N-SIM y N-STORM de Nikon Completada la primera instación de Astrios en España El sorter más sofisticado del mercado Contenidos IZASALAB 1/2011 Microscopía Óptica Ciencias de la Vida Super Resolución 3 Microscopía confocal resonante Multifotón 4 Quimioluminiscencia y Fluorescencia 6 Recuento, distribución y análisis de viabilidad en cultivos celulares 8 Optimización de ensayos con múltiples fluorescencias en Citometría de Flujo 9 Foto portada: Cacoxenite (mineral) (18x) Reflected light Espectrometría Fuente: Small word Nikon Electroforesis Capilar Redacción: Grupo Instrumentación Científica de IZASA Diseño y maquetación: Dpto. Marketing GIC Caracterización de Partículas TOC Centrifugación Cromatografía Medida de Nanomuestras de BCA mediante accesorio Take3 12 Técnicas Avanzadas de Fluorescencia: 13 Construcción Automática de Librerías para Secuenciación Masiva 14 Triple Cuadrupolo SHIMADZU LCMS-8030 16 MALDI Spiral-TOF JSM-S3000 18 Análisis de metales pesados en envases de plástico por ICP-OES 20 Analizador en línea por Matriz de Diodos DA 7300 OL. Perten 21 Nuevos Accesorios de Reflectancia Total Atenuada (ATR) 22 Electroforésis Capilar 23 Mejoras en el análisis de distribución de tamaño de partículas por difracción láser 24 Determinación de TOC en la validación de limpieza 25 Nuevas tendencias en centrifugación 26 El UHPLC LC-30 NEXERA de Shimadzu se reinventa 28 Mayor reproducibilidad y conveniencia en el desarrollo de cromatogramas en capa fina 30 Reflectividad RX Atención al Cliente (DAC) Tfno: 902 20 30 80 Fax: 902 20 30 81 [email protected] Centro de Recepción de Avisos (CRA) Tfno: 902 12 04 89 Fax:934 01 03 30 [email protected] www.izasa.es Técnicas de análisis de películas delgadas: (XRR) Agroalimentación con Perten Instruments AB Desde que en 1962, Harald Perten fundó la empresa al lanzar el método “Falling Number”, Perten Instruments ha seguido innovando. Para Harald Perten, su misión ha sido siempre “ayudar a los clientes a mejorar la calidad de los productos mediante el suministro de métodos analíticos asequibles, fáciles de usar e interpretar” y esta sigue siendo la piedra angular del negocio. El objetivo: “ofrecer soluciones completas hechas específicamente para satisfacer las necesidades de los productores en agroalimentación con resultados rápidos y precisos”. Perten proporciona equipamiento para control de calidad, supervisión de proceso e I + D a las industrias del grano, harineras, alimentación y piensos. Su dilatada experiencia en una amplia gama de aplicaciones les avala. • Producción de bioetanol • Mejora genética • Fábricas de piensos • Molienda de harina 2 IZASALAB 1/2011 • Alimentación general • Lácteos • Comerciantes de grano • Malteado • Semillas oleaginosas • Alimento para mascotas 31 MICROSCOPÍA ÓPTICA Super Resolución: Microscopía Óptica más allá del límite de difracción de la luz Las nuevas técnicas de súper resolución permiten sobrepasar el límite de resolución de los microscopios ópticos tradicionales. La técnica N-SIM permite obtener una resolución lateral dos veces superior a la de los microscopios tradicionales tanto en células vivas como en muestras fijadas; N-STORM, principalmente diseñada para muestras fijadas, alcanza una resolución lateral de 20 nm. y una resolución axial de 50 nm. N-SIM (STRUCTURED ILLUMINATION MICROSCOPY) En la técnica SIM el incremento de resolución se consigue mediante el aprovechamiento de los patrones de interferencia (patrones de Moiré) que se crean cuando se superponen dos rejillas con un cierto ángulo. En SIM una de las rejillas toma la forma de la luz de excitación de la muestra mientras la otra es la distribución desconocida de sondas fluorescentes de la muestra. Dado que la muestra se ilumina mediante un patrón de luz estructurado y por tanto conocido, es posible la obtención de información acerca del patrón de fluorescencia de la muestra. Esta técnica puede ser utilizada para crear imágenes tanto bidimensionales como reconstrucciones de alta resolución en tres dimensiones de la muestra. SIM permite resolver estructuras celulares tales como filamentos de actina o el sistema de membranas interno de las mitocondrias. Permite asimismo la visualización de muestras vivas y en movimiento y la combinación con la técnica TIRF. N-SIM está basado en el microscopio invertido Nikon Ti-E con un objetivo Apo 100x oil TIRF con Apertura Numérica 1.49. N-SIM permite la obtención de imágenes a una velocidad increíblemente rápida: 0.6 segundos / cuadro. N-STORM (STOCHASTIC OPTICAL RECONSTRUCTION MICROSCOPY) La técnica STORM utiliza fluoróforos fotoactivables que son activados y desactivados de forma aleatoria mediante luz de diferentes longitudes de onda para identificar la posición de cada fluoróforo. Por ejemplo el fluoróforo Cy5 Epi-Fluorescencia produce fluorescencia cuando se excita mediante un láser de luz roja pero también puede ser fotoapagado mediante el mismo láser. Si se excita mediante luz verde, también produce fluorescencia pero la velocidad de recuperación de la misma depende de la proximidad de otro fluoróforo, Cy3. El par Cy3-Cy5 (donde Cy5 se denomina “indicador” y Cy3 se denomina “activador”) puede ser activado y apagado cientos de veces cuando el mismo se encuentra unido a ácidos nu- N-STORM cleicos o a proteínas. Cada ciclo ilumina de forma aleatoria solamente algunas moléculas de Cy5, cada una de las cuales puede ser resuelta limpiamente determinando con precisión su posición en la muestra. La imagen final se consigue mediante la superposición de las imágenes obtenidas en cada ciclo. La excepcional resolución óptica obtenida en la imagen final es posible debido a la localización altamente precisa (de hasta 1 nm.) de las diferentes moléculas fluorescentes de la muestra. Mediante esta técnica pueden obtenerse imágenes en dos y tres dimensiones y permite distinguir hasta 9 sondas fluorescentes. STORM ha demostrado su efectividad revelando nano estructuras en tres dimensiones de la red mitocondrial en células vivas de mamífero. Conventional Standard Ep FI Illumination N-SIM 2D IZASALAB 1/2011 3 MICROSCOPÍA ÓPTICA Microscopía confocal resonante Multifotón ¿Un sistema de microscopio confocal multifotón de alta velocidad, alta resolución y alta sensibilidad de excitación?... Nikon lo tiene: A1R MP. El MP A1R permite imágenes más profundas, más grandes, más brillantes y nítidas. Principio de excitación multifotón Cuando dos fotones son absorbidos simultáneamente por una sola molécula fluorescente, la eficiencia de excitación es proporcional al cuadrado de la intensidad de la luz de excitación. Con el fin de lograr la excitación multifotónica, se usa un haz con una alta densidad de flujo de fotones. Debido a que el rayo láser se entrega en pulsos muy corto (femtosegundos) y converge en un punto focal a través de la lente del objetivo, la probabilidad de absorción simultánea de dos fotones es lo suficientemente alta como para ser útil para la proyección de imagen. En la excitación de dos foto- nes, la eficiencia de la excitación disminuye inversamente con la cuarta potencia de la distancia desde el centro de el volumen focal. Como resultado, sólo las moléculas fluorescentes que se encuentran dentro del límite de refracción del volumen focal del objetivo son excitadas y pueden emitir fluorescencia. Este principio permite el uso de detectores de proximidad (NDD – non descanned detetors), donde no es necesario un pinhole para obtener imágenes confocales. Hay menos absorción y dispersión de la luz del en longitudes de onda de infrarrojo cercano que de visible a través de una muestra de forma que el haz de excitación pueden penetrar más fácilmente en profundidad en un tejido grueso. El daño a una muestra se reduce al mínimo, y la detección máxima de fluorescencia crean las condiciones adecuadas para las obtención de imágenes in vivo de un tejido. Mouse kidney glomeruli labeled with GFP, using depth-code pseudocolor volumerendering to reference Z depths (pseudocolored by depth - 1 µm step for 530 µm). Objective: CFI Apo LWD 40xWI λS Z step size: 1 µm IR excitation wavelength: 910 nm 4 IZASALAB 1/2011 Fluorophore excitation in multiphoton microscopy NIKON A1R MP es un sistema confocal multifotón con un escáner galvanómetrico de alta resolución y un escáner de resonante de alta velocidad (30 fps a 512 x 512 píxeles) de hasta 420 imágenes por segundo en modo de escaneo de la banda. Características sistema NIKON MULTIFOTÓN A1R MP Dispone de un sistema de 4 canales con detectores de proximidad (NDD) de muy alta sensibilidad, menor ruido y amplio de rango espectral que permiten la separación espectral a tiempo real de fluorocromos con espectros de emisión superpuestos para la obtención de imágenes espectrales altamente contrastadas. Nikon dispone del A1R MP: sistema de microscopio confocal multifotón de alta velocidad, alta resolución y alta sensibilidad de excitación. El MP A1R permite imágenes más profundas, más grandes, más brillantes y nítidas. Esto es especialmente importante en imágenes multifotón debido a la superposición de los espectros de emisión de sondas y autofluorescencia, que a menudo es inevitable cuando se utiliza un láser de línea única. La combinación de imágenes multifotón y escáner resonante, permite al A1R MP profundizar dentro de una muestra. Esto es, por ejemplo, muy adecuado para obtener imágenes profundas en el tejido cerebral donde no es posible cortar secciones delgadas sin afectar el estudio de los fenómenos neuronales El Nikon A1R MP también cuenta con un nuevo sistema de alineamiento automático del láser infrarrojo femtosegundo Ti:sapphire que permite corregir rápidamente las desviaciones del alineamiento óptico ideal al cambiar la longitud de onda de excitación multifotón. Además, este dispositivo dirige totalmente el haz láser hacia la lente del objetivo, aumentando la seguridad del sistema, y corrigiendo rápidamente las desviaciones de la óptica ideal mientras se cambia la longitud de onda de excitación multifotónica. El láser IR está acoplado al microscopio con una unidad óptica incidente compacta que contiene un modulador acústico-óptico y cuenta con funciones de alineación automática. Nueva serie de objetivos Diseñados para imágenes multifotón, con corrección de aberración cromática avanzada y muy largas distancias de trabajo. El objetivo CFI APO LWD 40X WI λS con una apertura numérica de 1.15 y una distancia de trabajo de 610 µ, incorpora un revestimiento de nanocristales que proporciona un nivel muy alto de transmisiones y la corrección desde el violeta al infrarrojo cercano, una verdadera innovación para la obtención de imágenes multifotón de la más alta calidad. La última versión de software NIS-Elements C versión 3.2 controla el microscopio y la adquisición multi- fotón con las capacidades de adquisición de datos a alta velocidad, el control de varios dispositivos motorizados. Esto incluye posicionamiento de foco Z, rápido enfoque, platina XY, de entrada / salida de datos, y total flexibildad de diseño. Compatible con los microscopios directos e invertidos. A1R MP proporciona imágenes en profundidad rápidas y definidas en los organismos vivos, aumentando los límites de las técnicas tradicionales de investigación en ciencias biológicas IZASALAB 1/2011 5 CIENCIAS DE LA VIDA Nueva gama de equipos de fotodocumentación y softwares para quimioluminiscencia y fluorescencia SYNGENE, líder en equipos de fotodocumentación, pone a disposición de los investigadores a partir del 1 de Enero de 2011, los nuevos equipos de análisis de la imagen para aplicaciones de luz visible, Quimioluminiscencia y Fluorescencia. S yngene, lanza los nuevos equipos de análisis de la imagen para aplicaciones de luz visible, Quimioluminiscencia (ECL, ECL Plus, West Dura, West Pico, CDP Star y cualquier tipo de reacción acoplada a AP, HRP e incluso GRP) y Fluorescencia con patrones de bandas o manchas en geles, filmes o membranas (geles de agarosa o acrilamida) teñidos con bromuro de etidio, Rodamina, Fluoresceína, SYPRO Red, Bromuro de Etidio, SYBR green, ZYMA gel, PHAST gel, SSCP gel, 2D gel, de proteínas teñidos con Coomassie o Plata, TLC, autorradiografías, placas de Elisa, etc, aplicaciones con luz blanca y azul. El sistema incluye una nueva cabina oscura de último diseño tanto en seguridad para el usuario como en versatilidad para posibles upgrades futuros, que permite su instalación en cualquier lugar del laboratorio, sin depender de la disponibilidad de una habitación oscura, además de contar con la ventaja de dos compartimentos independientes para la cámara y la zona de manejo de las muestras, lo que se traduce en unas condiciones de trabajo óptimas para evitar contaminaciones cruzadas, deterioro de la cámara y de componentes electrónicos. 6 IZASALAB 1/2011 Con las nuevas cámaras, todas de 16 bits reales, contamos con hasta 8,3 M. de Píxels de resolución, es la más sensible del mercado debido a que posee un rendimiento cuántico superior al 87% a 425 nm (Longitud de onda de emisión del ECL, reactivo más comúnmente usado en Quimiolum.) y superior al 92% a 580 nm (pico máximo de emisión de la CDP star), donde se sitúa de un 35% a un 40% más de eficiencia con relación al resto de las cámaras, fundamental para exposiciones muy largas en ensayos de Quimioluminiscencia, con tecnología USB 3.0 que permite la transferencia de la imagen directamente al ordenador a alta velocidad, posibilitando la captación de la imagen a tiempo real con un escaneo progresivo de hasta 35 FPS. Todos los modelos incluyen transiluminador UV de 302 nm y epiiluminación blanca de LED, así como convertidor a luz blanModelo ca en transiluminaLente ción para aplicacioM Píxels nes como CoomasA/D sies, autoGradación radiografías, etc. Rango D. Binning Esta opción permite agrupar los pixels en el chip CCD de diferentes maneras y todos los equipos traen esta función incluida con el fin de aumentar la velocidad de captura y la sensibilidad cuando trabajamos con muestras en las que la señal es muy baja Estos nuevos equipos se presentan en 4 modelos diferentes para Quimoluminiscencia y 1 para Fluorescencia. Ver tabla. 1 Total Recall SYNGENE incluye de forma estándar la función Total Recall en todos sus sistemas de Quimioluminiscencia, es decir, en los GBox i Chemi. Con esta característica, es posible recrear automáticamente todos los parámetros fijados para la captura de una determinada imagen con el simple click de un botón. Esto se consigue gracias al sistema de microlentes especiales LFB (Lens Feedback) que conforman el sistema óptico de estos equipos. Estos parámetros incluyen brillo, tiempo de exposición, filtro elegido, resolución y condicioGBox EF2 GBox GBox Chemi XR5 Chemi XT4 nes de sensibilidad (ajustes de binning). Además, la adquisición de la imagen con un solo botón implica que el usuario no tiene que perder el tiempo posicionando la muestra ya que la lente enfocará directamente al centro del transiluminador. Recordemos que esta función cumple estrictamente las especificaciones GLP y GMP además de permitir la protección mediante password de cada una de las diferentes configuraciones creadas por los usuarios. GBox Chemi XX8 GBox Chemi XL1.4 F1.4 F1.2 F0.95 F1.4 F0.85 2,0 5,0 4,2 8,3 1,4 16 bit 16 bit 16 bit 16 bit 16 bit 65536 65536 65536 65536 65536 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 Tabla 1 Las cámaras se han renovado totalmente así como las lentes siguiendo la política de actualización de SYNGENE en lo referente a incorporar la mejor tecnología existente en cuanto a captación de imágenes tanto para aplicaciones de Fluorescencia, como de Quimioluminiscencia y visible Opciones de pantallas convertidoras SYNGENE ha adoptado una nueva tecnología en pantallas de fósforo que permiten la conversión de la luz UV en diferentes rangos de longitudes de onda. Seleccionando la correcta combinación, SYNGENE es capaz de suministrar pantallas de conversión para diferentes tipos de aplicaciones: • UV-Blanca Nuevo Trans NOVA-GLO. Convierte la luz del transiluminador en luz blanca para su uso con autorradiografías, coomassies, geles de proteínas, etc. • UV-Azul Produce un área uniforme y de alta intensidad a 480 nm, ideal para el trabajo con GFP, SYBR Gold y SYBR Green Opciones de Transiluminadores Módulos estándares de luz UV con diferentes longitudes de onda, 254nm, 312nm, 365nm, pasando por los negatoscopios de luz blanca, ahora existe la posibilidad de usar transiluminadores de LED azul para aplicaciones con fluoróforos que se excitan en el rango de los 470nm-490nm, tales como SyBr Safe, GFP, SyBr Green, etc. Modulo de TRANSILUMINACION de fibra óptica para 2D en geles. Este módulo de fibra óptica permite simultanear la captura en tres colores diferentes del mismo gel para aplicaciones 2D. No existe nada igual en el mercado para multiplexar geles de 2D con fluoróforos del tipo FLAMINGO, SYPRO o Cy Opciones de Epiiluminación EPIILUMINACIÓN de LED’s Red Green Blue (válido para CY2, CY3, CY5.) 488nm, 532 nm y 633 nm. 84 Leds de alta intensidad en el mismo módulo permiten aplicaciones multiplex de hasta 3 colores. El módulo es doble con lo que la intensidad e incidencia de luz es óptima para geles marcados con fluoróforos convencionales y por supuesto para Cy en aplicaciones 2D en GELES Y MEMBRANAS. EPIILUMINACIÓN UV a 254nm 365 nm SOFTWARE DE CAPTURA GENE SYS Tras más de 10 años utilizando el software de captura Gene Snap, SYNGENE ha sustituido su tradicional software por el nuevo GENE SYS, mucho más intuitivo y abierto a la hora de capturar las imágenes de las muestras. Es un sistema guiado en el que al usuario se le va preguntando sucesivamente sobre el tipo de muestra que usa, el fluoróforo con el que tiñe la muestra, la resolución que quiere utilizar, etc. Esto se hace con el fin de que cualquier persona pueda uti- lizar este software sin ningún conocimiento previo, tan sólo siguiendo las instrucciones y los diálogos que aparecen en la pantalla del PC. De la misma forma, cuenta con un protocolo inteligente de captura que permite al usuario obtener una imagen óptima independientemente de los ajustes personales, dejando al sensor de la cámara que estime las condiciones de exposición para cada muestra y darnos así una imagen sin saturación. Esto se puede realizar tanto con aplicaciones fluorescentes como quimioluminiscentes. Por otro lado, este nuevo software permite controlar absolutamente todas las funciones tanto de la cámara como de la cabina, incluyendo selección de la iluminación interna, filtro, zoom, iris, enfoque, etc, con el consiguiente ahorro de tiempo entre apliaciones diferentes. Para este último punto, SYNGENE cuenta con el total recall mencionado anteriormente. Estamos pues, iniciando una nueva etapa en el ámbito de la fotodocumentación con equipos renovados tanto en hardware (cámaras, lentes y CCD) como en Software (Nuevo GEN SYS) que permitirá al usuario obtener resultados de forma inmediata, segura y precisa con cualquier tipo de aplicación de Fluorescencia, Quimioluminiscencia y visible asegurándose así de disponer de todas las funciones de análisis posibles en un solo aparato. IZASALAB 1/2011 7 CIENCIAS CIENCIAS DE DE LA LA VIDA VIDA Recuento de células, distribución de tamaño y análisis de viabilidad en cultivos celulares La gama de analizadores de Beckman Coulter ofrece soluciones para el recuento de células, la determinación de la distribución de tamaño o el ensayo de viabilidad en cultivos celulares. L a gama de analizadores de células Beckman Coulter ofrece soluciones basadas en diferentes principios. Por un lado están los equipos que emplean el principio Coulter de zona eléctrica sensible, que permite contar células y calcular su volumen. Por otro, los equipos como el Vi-Cell que emplean la técnica de análisis de imagen para la determinación del porcentaje de viabilidad en cultivos celulares. El nuevo Multisizer 4 extiende aún más las capacidades ya sobresalientes del Multisizer 3, y se configura como el instrumento de referencia en ésta técnica. Entre muchas otras novedades, permite análisis dinámico de tamaño frente al tiempo, para el estudio de cambios de tamaño en células o partículas que ocurran en un breve espacio de tiempo. Instrumentos que emplean el principio Coulter El Multisizer 4 de Beckman Coulter es el instrumento para recuento y determinación de la distribución de tamaño más avanzado nual. El tiempo total de medida es menor de 2.5 minutos. La gama de instrumentos que emplean el principio Coulter incluye la Serie Z de contadores celulares, así como los contadores y analizadores de distribución de tamaño Multisizer 3 y Multisizer 4. Los equipos de la Serie Z son básicamente contadores de células. Sus aplicaciones incluyen recuento y determinación de tamaño de células sanguíneas, algas, tejidos, levaduras, espermatozoides, etc. El Multisizer 3 realiza tanto el recuento como el cálculo de la distribución de tamaño, y permite la caracterización de poblaciones celulares complejas, que excedan la capacidad de la Serie Z. Los contadores de células de la Serie Z permiten realizar un recuento extremadamente fiable y rápido de todo tipo de células 8 IZASALAB 1/2011 Gráfico de distribución de tamaño de células de alga Instrumentos que emplean análisis de imagen El Vi-Cell emplea análisis de imagen y automatiza el ensayo estándar de tinción con azul tripan para la determinación de viabilidad. El método es ampliamente aceptado y consiste en mezclar tinte azul tripan (0.4%) con un volumen igual de suspensión de células. Las células viables, dado que su membrana está intacta, no se verán afectadas por el tinte, mientras que las células no viables se teñirán de azul al penetrar el tinte a través de sus membranas permeables o deterioradas. El Vi-Cell realiza la aspiración de la muestra, adición de reactivos y limpieza posterior de forma totalmente automática. Una vez que la suspensión celular es aspirada y mezclada con el azul tripan, se hace pasar a través de una celda de flujo para la toma de imágenes. El Vi-Cell puede analizar hasta 100 imágenes por muestra, aumentando el volumen entre 15 y 30 veces respecto al empleado en el método ma- El Vi-Cell analiza hasta 100 imágenes y discrimina las células viables y no viables por su tinción El Vi-Cell automatiza el método de azul tripan para determinación de viabilidad CIENCIAS DE LA VIDA Optimización de ensayos con múltiples fluorescencias en Citometría de Flujo Existen muchas razones para que el número de tinciones simultáneas se incremente día a día, en los ensayos de citometría de flujo. Estas razones son de índole práctico, económico y operativo. E n la práctica, hay cada día un número mayor de fluorocromos, y anticuerpos conjugados con estos, los citómetros cada día se fabrican con un mayor número de láseres y detectores y por tanto, los ensayos con múltiples fluorescencias puede decirse que deberían estar al alcance de casi cualquier investigador. El incremento en el número de marcajes simultáneos tiene innegables ventajas, como reducir el número de tubos por experimento, es decir, el número de células de partida (no olvidemos que en muchos casos el materia celular es el factor limitante) y la cantidad de anticuerpo empleado (un factor económicamente importante) Además, la cantidad de información que podemos obtener de una muestra, crece exponencialmente con el número de marcadores analizados simultáneamente. Así, con un solo anticuerpo, podremos definir tan solo dos poblaciones, con 2 podremos definir 4 y así sucesivamente según la exponencial 2n donde “n” es el número de parámetros que se analizan simultáneamente. En principio, el panorama de poder realizar el mayor número posible de marcajes simultáneos, es atractivo en todos los sentidos, y sin embargo, según se incrementa la complejidad de los ensayos, también lo hace la frustración de los usuarios. Muchos de los intentos de realizar marcajes con más de 4 fluorocromos simultáneos terminan en resultados incomprensibles, cuando no conducen a errores de interpretación. Casi siempre las dificultades en la interpretación de estos ensayos, se acaban achacando a la dificultad de realizar las compensaciones. Por este motivo, ha crecido la demanda de equipos con sofisticadas funciones de “auto-compensación” y sin embargo, en la práctica los problemas persisten, y la calidad de los resultados no mejora. Es cierto que la compensación de múltiples fluorocromos puede resultar difícil (es más tediosa que difícil), y es cierto que las compensaciones suelen acabar siendo el mayor quebradero de cabeza de los usuarios de citometría de flujo. Sin embargo, la mayoría de los problemas que experimentan los usuarios no son sino el resultado de una mala optimización de los experimentos, que se pone de manifiesto en el momento de la compensación. La principal causa de errores en el planteamiento de un experimento, procede de la selección de los reactivos. La elección de anticuerpos y sus correspondientes marcajes fluorescentes, sigue habitualmente las siguientes pautas: los que hay en el laboratorio, los que usa un compañero, los más baratos, los que vende mi fabricante favorito, los que tienen un marcaje diferente de los que ya tengo… Y así podríamos seguir con una lista de razones tan reales como ilógicas para diseñar un experimento. Existen sin embargo, algunas pautas que pueden hacer que nuestros experimentos con múltiples marcajes resulten más satisfactorios. Sin pretender hacer una revisión exhaustiva, a continuación os ofrecemos algunas ideas para la reflexión 1.-No todos los anticuerpos son adecuados para todos los experimentos Entenderemos de aquí en adelante, que cuando se habla de anticuerpo, se entiende que esta siempre conjugado con un marcador fluorescente, y en este caso, podemos poner un ejemplo sencillo. Un anticuerpo marcado con una Phycobiliproteina (PE,APC) nos dará siempre una mayor emisión de fluorescencia, que el mismo anticuerpo marcado con pequeñas moléculas sintéticas fluorescentes, como los Alexa o el FITC, y sin embargo, la conjugación con estas grandes proteínas, como PE o APC, no es necesariamente mejor, cuando pretendemos emplear nuestro anticuerpo en tinciones intracelulares (mayor interacción inespecífica, dificultades para penetrar en la célula…) o cuando estamos marcando dos epítopos muy próximos, dado que se podrían dar impedimentos estéricos que dificultasen el marcaje. Debemos por tanto seleccionar los anticuerpos en función de criterios como los tipos celulares, los tipos de tinción y la combinación de anticuerpos a emplear. 2.-No hay recetas universales A pesar de los esfuerzos que realizan los fabricantes de anticuerpos para estandarizar los reactivos, no es fácil encontrar una receta universal. Hay factores como la APC or Solapamiento de espectros. La compensación entre fluorocromos es inevitable, pero no debe presentar ningún problema se si emplean los controles adecuados cantidad de células a teñir o el volumen final de la reacción, que condicionan el resultado final de la tinción. Un ejemplo sencillo que he encontrado en alguna ocasión: “Para un millón de células, 10 µl de anticuerpo, entonces para medio millón 5 µl de anticuerpo” el problema suele suceder cuando en el primer caso, tenemos el millón en 300 µl, y cuando reducimos la cantidad de células, el volumen sigue siendo los mismos 300 µl. Es un factor crítico titular los anticuerpos para calcular la concentración del mismo que nos da la mejor relación Señal/Ruido (S/R) . Una buena aproximación de este valor S/R es el cociente de las medianas de la población positiva (s) y negativa (r). Este mismo criterio, nos servirá para comparar reactivos procedentes de diferentes fabricantes, clones dirigidos contra el mismo antígeno, o diferentes conjugados fluorescentes del mismo clon. 3.-No por poner más anticuerpo “veré” mejor mi población Esta es una situación común, cuando trabajamos con antígenos que tienen una baja expresión, acaban surgiendo las dudas de donde empieza la población positiva. Entonces surge la tentación de poner más cantidad de anticuerpo, lógico, si tengo más marcaje, mi población será más “brillante” y la distinguiré mejor. Desgraciadamente, lo que suele suceder es que la adsorción inespecífica sobre la población negativa será mayor, y tendré aun más dificultades. ¿Qué hacer entonces, IZASALAB 1/2011 9 CIENCIAS DE LA VIDA excitan también en el láser 640 (donde lo hace APC) con un mismo espectro de emisión que APC. Podemos encontrarnos con que nuestra población “débil” se convierte en imposible de compensar. Hay ocasiones en las que la vida se hace más fácil solo con buscar un canal libre de interferencias. 5.-La importancia de los marcadores de linaje las configuraciones de filtros (de forma fácil para el usuario) En el ejemplo anterior, una escusa puede ser que mi citómetro tiene filtro para Cy5 pero no para Cy5.5 Es igual, un filtro es barato (cuesta más un vial de Ab) y fácil de cambiar, y sin embargo, a la gente le da miedo hacer cambios. Lo único importante, es revertir los cambios al terminar. Sin embargo, no todos es tan fácil, especialmente cuando un usuario nuevo pasa de la microscopía de fluorescencia a la citometría de flujo e intenta extrapolar los fluorocromos de una técnica a la otra. La configuración de cada máquina es uno de los factores más limitantes, y a veces nos obliga a elegir combinaciones de fluorocromos que no necesariamente serían las optimas. A veces, nos empeñamos en compensar algunas cosas, que no tienen sentido. Un ejemplo pactico; es comúnmente aceptado que en ciertos citómetros no es compatible en empleo de tandems de PC-Cy5 y APC Titulación de anticuerpos. Obsérvese la grafica simultáneamente, por los problemas 7.-¿Tandems? inferior, se comprueba que, en este anticuerpo, a que acabamos de comentar. Pensepartir de una cierta concentración, la relación S/R empeora, a pesar de que se incremente el nivel de mos por ejemplo que tenemos dos Son imprescindibles si queremos poder brillo de la población positiva anticuerpos aCD14PC5 y aCD4APC. hacer más de 6 colores. De hecho, otro En principio uno esperaría problemas factor limitante es la disponibilidad de anponer menos? Pues tal vez, desde luepara compensar la población de CD4, por ticuerpos marcados con suficientes fluogo lo que hay que hacer es buscar aqueculpa de la Cyanina 5 de otro anticuerpo, y rocromos diferentes, por lo que en mullas condiciones en las que el parámetro sin embargo, no hay ningún inconveniente chas ocasiones para hacer combinaciones S/R sea máximo. Podemos intentar lavar para utilizar esta combinación, puesto que de 3 ó 4 de ellos, nos vemos obligados al el ensayo en condiciones más exigentes, ambos marcadores se expresan en linajes empleo de tandems del tipo PE-Cy5, PEutilizar bloqueantes de unión inespecífica, celulares independientes, y nunca apare- Cy5.5 PE-Cy7, APC-A700, APC-A750, como un anticuerpo irrelevante del mismo cerán sobre la misma célula. Nos basta- APC-Cy7. El problema que se achaca al isotípo sin marcar, cambiar de clon, de faría con incluir un marcador de linaje como empleo de estos reactivos, es que normalbricante, o buscar un fluorocromo más briCD3, para poder trabajar sin compensa- mente requieren grandes compensaciollante. En cualquier caso, casi seguro que ción en el canal de APC. Ahora bien, como nes en el canal de la molécula aceptora, existe una combinación optima de todos la Cyanina 5 funciona bien (sobre el papel por ejemplo, habrá que compensar en el estos factores, y nos volvemos a remitir tiene mejor rendimiento que la 5.5) tengo canal de PE la emisión de la misma en un al punto dos. Cuanto más difícil es definir todos mis anticuerpos con esta combina- conjugado de PE-Cy5. El problema radica nuestra población, más importante resulta ción. El problema surge si intento utilizar en la gran variedad de métodos de fabricaoptimizar la receta. un CD56PC5 en el mismo caso que el an- ción y purificación (los que purifican) entre terior, ya que un pequeño número de las los diferentes fabricantes. De este modo, 4.-¿El fluorocromo más brillante células CD3+ también son CD56+. En es- el mismo clon, con el mismo marcaje en dos fabricantes diferentes puede requerir tos casos, lo mejor es no tener para el marcador más débil? miedo a los cambios, y pasarS/N=22 S/N=19 A pesar de lo aplastantemente lógico que se a otro marcaje (criterios de parece esta afirmación, no tiene porque selección de los anticuerpos). ser cierta necesariamente. En los marca- Si somos capaces de diseñar jes difíciles, creo que es más importante nuestra “caja de anticuerpos” de elegir el más limpio, que el más brillante. modo que aquellos que puedan El concepto limpio viene definido no solo presentar mayores interferenCD45-ECD CD7-PE CD19-PE por la relación S/R, también influyen el res- cias, puedan ser diferenciados to de los marcajes presentes en el ensayo. por linaje, nos facilitaremos muS/N=27 S/N=38 Entre los fluorocromos con mayor eficien- cho la vida a la hora de las comcia cuántica, se encuentran las phycobili- pensaciones. proteinas PE y APC, la primera tentación es por tanto utilizar un anticuerpo marcado con alguna de las dos para nuestra tinción 6.-¿Cuál es la CD45-PC7 CD7-PE CD19-PE “débil”, pero no podemos olvidar que am- configuración instalada bas proteínas se emplean como acepto- en mi citómetro? Solapamiento de espectros. Cuando un marcador muy “brillante” interfiere en un canal donde estamos viendo ras en la mayoría de los tandems actuales un marcaje “débil” el efecto es especialmente notable (PE-Cy5, PE-Cy5.5 PE-Cy7, APC-A700, La mayoría de los citómetros en las formas y definiciones de las poblaciones. Elegir modernos de una cierta calidad, APC-A750, APC-Cy7 …) y que algunos correctamente el fluorocromo (panel inferior) puede componentes los tandems, como Cy5 se tienen la posibilidad de cambiar proporcionarnos distribuciones poblacionales muy diferentes 10 IZASALAB 1/2011 400 PECy7 Conjugates Multiple Vendors, Multiple Conjugates 350 300 250 200 150 100 50 0 550 650 750 850 Tandems. No todos los fabricantes son iguales. Dependiendo de los procesos de conjugación, la cantidad de fluorescencia de la molécula aceptora (PE en este caso) libre, puede ser muy variable hasta el doble de compensación. Es más, la estabilidad en el tiempo varia mucho entre fabricantes, y esto puede hacer que un anticuerpo fabricado con un mal proceso, nos obligue a emplear compensaciones mucho mayores al cabo de una pocas semanas de abierto el vial. Lo único importante, es tener en cuenta que cuando se emplean reactivos de distinto fabricante, deben interpretarse como diferentes reactivos, desde el punto de vista de compensación. Por lo demás, tan solo recomendar que se empleen los mejores, hay muchas diferencias, y no solo en el precio, y al final, lo que más se resiente es el resultado. 8.-Es necesario utilizar los controles adecuados para compensar de forma que nos permitan además elegir unas condiciones de amplificación suficientes para nuestros ensayos. Un buen ejemplo, cuando se trabaja con leucocitos, es el empleo de marcadores como CD4 en todos los fluorocromos, tiene una distribución casi 50/50, un nivel de fluorescencia medio, y un marcaje claro y nítido. Además, es muy importante disponer de controles positivos (con una expresión clara, no de esos que hay que imaginárselo porque lo dice la literatura) del marcador que queremos ensayar. Uno de los problemas con los que nos encontramos más frecuentemente, es que no tenemos una línea celular que exprese claramente nuestro marcador, y si además el resultado es una expresión negativa, acabamos sin saber si es que ese es el resultado, si el ensayo no ha funcionado, o si lo que no funciona es el anticuerpo. En definitiva, un consejo, antes de empezar a hacer un ensayo complejo, con múltiples fluorocromos, optimice por separado cada uno de los factores comentados, elija con criterio los reactivos a emplear, busque los mejores reactivos del mercado, cambie lo que no funciona, por mucho que ya tenga ese reactivo, o se haya hecho siempre así en su laboratorio y no se lance a hacer el experimento de su vida hasta que todo esté controlado. Una vez que tenga optimizado el experimento, no improvise de un día a otro, y a lo largo del tiempo, compruebe frecuentemente que nada ha cambiado en las condiciones de trabajo. De nada sirve fiarlo todo a las bondades de los softwares de auto-compensación. Estos programas solo trabaOtro BCI jan bien cuando se eligen los controles adecuados. Es una 10,2% buena idea utilizar el mismo marcador con todas las combinaciones de fluorocromos a emplear, y por supuesto, si se piensa utilizar una compensación automática (que suele hacerse por el método de las medianas) el marcador a emplear debe estar presente en un % de las cé20,5% lulas suficientemente grande (idealmente 50%) para marcar claramente una población positiva y una población negativa. Dado que la compensación es dependiente del voltaje de los fotomulTandems. Es este ejemplo, la diferencia en los procesos de tiplicadores, es conveniente conjugación entre dos fabricantes, supone una mayor cantidad que los marcadores a emde APD libre en uno de ellos, lo que obliga a pasar de una plear como controles tengan compensación de 10% a una del 20%. Si aplicamos esta ultima una intensidad de fluorescen- al primer fabricante, nos encontramos con una población sobrecompensada. El mismo reactivo, procedente de diferentes cia media (ni demasiado brillantes ni demasiado débiles) fabricantes, debe tratarse con criterios de equivalentes al caso Completada la primera instalación de ASTRIOS en España D urante la segunda semana de enero, se ha completado la instalación del Sorter más sofisticado del mercado, en la fundación IDIBELL de Barcelona. Se trata del equipo Astrios de Beckman Coulter. Este es el primer equipo de su gama que se instala en España, al que seguirá en las próximas semanas el que se instalara en Madrid, en el Biobanco del Hospital Gregorio Marañón, dentro del laboratorio de seguridad biológica, en la que pretende ser la primea y más importante instalación de separación celular para muestras patogénicas de Clase II en Madrid. El MoFlo Astrios de Beckman Coulter, es un Sorter capaz de albergar hasta 7 laseres, cubriendo el espectro desde los 350 a los 640nm. Capaz de montar hasta 42 detectores de fluorescencia y separar simultáneamente 6 poblaciones, con una velocidad superior a los 70.000 eventos por segundo, y una facilidad de manejo propia de un analizador. de diferentes reactivos IZASALAB 1/2011 11 CIENCIAS DE LA VIDA NOTA APLICATIVA Medida de Nanomuestras de BCA mediante accesorio Take3 Esta nota aplicativa describe los materiales, métodos y el protocolo del Gen5 usados para la medida de ácido bicinconínico (BCA) usando la placa multivolúmenes Take3. Materiales usados Configuración Gen5/Take3 • • • • Kit medida de proteína ácido bicinconínico (Sigma, PN-BCA1 y B9643) Agua purificada (Elga, MilliQ,…) Pipetas monocanal o multicanal de 8 puntas con un rango de 1-10μL El diseño de la placa o Plate Layout viene descrito en el esquema 1 Con el diseño de placa definido se crea un protocolo estándar siguiendo las indicaciones siguientes. • 1. Elegir la placa Take3 que corresponde con su número de serie del tipo de placas disponibles del protocolo. 2. Programar pasos de lectura de absorbancia 562nm, Velocidad Normal y los pocillos A2-H3. 3. El diseño de placa se muestra en la impresión de pantalla 2 4. Pasos de Data Reduction requeridos: - Crear una transformación para calcular la absorbancia corregida a su paso óptico, para ello hay que utilizar el paso óptico o Pathlengths incluidos con la documentación del Take3. Procedimiento • • • • El Kit de medida de BCA es preparado justamente antes de su uso siguiendo las indicaciones del fabricante. A partir de una dilución estándar de 1mg/mL (Sigma, PN-3294) en agua purificada se crean 6 diluciones a 1:3 siguiendo el siguiente esquema. Los blancos se crean a partir de un ratio 1:1 de reactivo de BCA y agua purificada. La reacción se incuba a temperatura ambiente (~22ºC) por 25minutos y luego es leído por un lector de absorbancia de BioTek. 1 12 IZASALAB 1/2011 2 A Black B 0,012 mg/L C 0,037 mg/L D 0,11 mg/L E 0,33 mg/L F 1,0 mg/L G muestra 1 H muestra 2 Esquema 1 - Crear un paso de transformación para hacer el blanco del paso óptico correguido al estándar de concentración STD 0. - Crear una curva de calibración usando la absorbancia 562nm restando el blanco en el eje de ordenadas (eje y) Pantalla 2 CIENCIAS DE LA VIDA Técnicas avanzadas de Fluorescencia: Introducción a la Fluorescencia Polarizada La técnica de Fluorescencia Polarizada fue descrita inicialmente en 1926 por Perrin y se basa en la observación del comportamiento que tiene un fluoróforo en disolución al ser excitado con una luz polarizada. Los ensayos de fluorescencia polarizada se realizan sin un soporte físico estando en disolución, lo que permite que se consiga el equilibrio en la interacción llegando a medidas bajísimas de concentración D icho fluoróforo si se encuentra estático durante su excitación emitirá la emisión polarizada presumiblemente en un plano distinto al sufrir las moléculas rotaciones y cambios de orientación, si permaneciera estática completamente emitiría la emisión en el mismo plano al de excitación. El tamaño de la molécula es el principal factor que determinará el plano en el que se emita la emisión. Moléculas grandes suelen tener poco movimiento por lo que la emisión es en el mismo plano mientras que las moléculas más pequeñas rotan muy fácilmente por lo que la emisión será en un plano distinto. Aplicaciones Conclusiones Las principales áreas de aplicación incluyen interacciones: La Fluorescencia Polarizada ofrece numerosas ventajas frente a métodos tradicionales, permite trabajar con muestras crudas, turbias o coloreadas y no requieren el uso de enzimas o de isótopos radioactivos. Los ensayos son sencillos de seguir ya que requieren pocos pasos y no dependen de longitudes de onda o cambios de intensidad. A diferencia de otras técnicas en fluorescencia no existe transferencia de energía. 1.Interacciones Receptor/Ligando. 2.Proteína/Proteína. 3.DNA/Proteína. 4.Ensayos Tirosina Quinasa. 5.Inmunoensayos. Beneficios - La fluorescencia polarizada va enfocada principalmente al estudio de interacciones moleculares permitiendo tener rápidamente un ratio complejo/libre. - Los ensayos de fluorescencia polarizada se realizan sin un soporte físico estando en disolución, lo que permite que se consiga el equilibrio en la interacción llegando a medidas bajísimas de concentración. Adicionalmente no se adulteran las muestras, los efectos en la unión producidos por cambios como el pH, temperatura, concentración de sales, etc permite la reutilización de las muestras. Instrumentación BioTek dispone de tres equipos capaces de llevar a cabo éste tipo de técnica. Dos con tecnología híbrida como son Synergy H4 y Synergy H1 y uno con filtros Synergy2. IZASALAB 1/2011 13 CIENCIAS DE LA VIDA SPRIworks – Construcción Automática de Librerías para Secuenciación Masiva La aparición de las nuevas tecnologías de Secuenciación Masiva ha permitido a los investigadores poder obtener una gran cantidad de datos de sus experimentos de secuenciación. Sin embargo, este aumento en productividad requiere flujos de trabajo relativamente complicados y laboriosos, así como bastante manipulación por parte de personal cualificado para preparar las muestras que alimentan estos equipos. Basado en la tecnología de partículas paramagnéticas SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) y el Automatismo de Beckman Coulter, el SPRIworks facilita la construcción reproducible de librerías de alta calidad. Los Sistemas SPRIworks permiten a los investigadores poder preparar hasta 20-30 librerías al día, sin apenas intervención por parte del usuario, y con la facilidad de tan solo pulsar un botón. Esto supone, en algunos casos, un incremento de hasta cinco veces la productividad que se consigue de manera manual. La tecnología de Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) es una tecnología de purificación de Ácidos Nucleicos basada en partículas paramagnéticas desarrollada en el Whitehead Institute del MIT (Hawkings, et. al., Nucleic Acids Res. 1995 (23): 4742-4743). Supone una metodología sencilla y altamente eficaz de purificar ácidos nucleicos eliminando la necesidad de limpiezas basadas en gel. Cambiando el tampón de unión utilizado en cada protocolo, se logran inmovilizar tamaños y tipos de ácidos nucleicos diferentes, dotando así al sistema de una amplia flexibilidad. Los contaminantes se eliminan fácilmente sin la necesidad de pasos de centrifugación ni filtración, consiguiendo así un formato fácilmente robotizable. Algunos ejemplos de aplicaciones de este tipo de tecnología son los kits CleanSEQ para limpieza de terminadores marcados (Secuenciación Sanger) y los kits AMPure XP para purificación de productos de PCR. Componentes del Sistema Los Sistemas SPRIworks incluyen: • • • Extractor Automático de Ácidos Nucleicos, SPRI-TE. Tarjeta de método específica. Cartuchos de reactivos pre-empaquetados para la construcción de librerías. Características Principales del SPRIworks • • • • • • • Productividad del SPRIworks Fragment Library System II vs construcción manual de librerías para el Roche 454 GS FLX 14 IZASALAB 1/2011 • Manipulador de líquidos automático, sencillo y compacto. Reactivos preparados en cartuchos desechables. Purificación automática de ADN fragmentado. Selección de tamaños optimizada – no más geles ni columnas. Productividad de hasta 10 librerías en paralelo. Construcción de Librerías reproducible y consistente. Disminución del costo de secuenciación por muestra. Mejora en el aprovechamiento de los recursos del laboratorio. Componentes del Sistema SPRIworks Fragment Library System I para el Genome Analyzer II de Illumina Selección de Tamaños Reproducible y Optimizada Como parte del flujo de trabajo automático que realiza el SPRIworks, se incluye la selección de tamaños necesaria para las muestras a cargar en los equipos de Secuenciación Masiva. Esta característica elimina la necesidad de trabajar con geles de agarosa o columnas, aumentando así la productividad y disminuyendo la manipulación requerida por parte del usuario. Dependiendo del método de Construcción de Librerías usado, se obtendrán hasta 10 librerías en los siguientes tiempos: • Óptima reproducibilidad en la selección de tamaños en el SPRIworks Fragment Library System III (para Sistema SOLiD de Life Technologies), basada en la tecnología de partículas magnéticas SPRI • • Construcción de Librerías en Cuatro Pasos Paso 1: Carga de cartuchos de reactivos. Paso 3: Cargar Adaptadores y resto de consumibles. Para cargar el cartucho de reactivos en el equipo, deslizarlo por la hendidura de la gradilla de cartuchos. Cargar tantos cartuchos como librerías se vayan a procesar (hasta un máximo de 10, por ciclo). Terminar de llenar la gradilla de reactivos con los tips (y fundas), adaptadores y tubos de recogida final necesarios para el número de librerías a procesar. SPRIworks Fragment Library System I – Illumina Genome Analyzer II. Producción de 10 librerías en 5 horas. SPRIworks Fragment Library System II– Roche GS FLX. Producción de 10 librerías en menos de 4 horas. SPRIworks Fragment Library System III– Life Technologies SOLiD. Producción de 10 librerías en 3.5 horas. Tanto los cartuchos de reactivos como la tarjeta de método van codificados con diferentes colores para cada uno de los tres sistemas SPRIworks. Así pues, sobre el mismo instrumento es posible realizar el proceso de construcción de librerías para cualquiera de las tres plataformas principales de secuenciación masiva, combinando el SPRI-TE con los cartuchos y tarjeta adecuados. Resumen Paso 2: Carga de Muestras de partida: ADN fragmentado, ADNc o Amplicones. Una vez que los cartuchos se encuentran instalados, cargar la gradilla de reactivos en el instrumento. Colocar las muestras a procesar en las posiciones vacías. Paso 4: Insertar la tarjeta de método y darle al “start”. Una vez cargados en el equipo las gradillas con los cartuchos, reactivo y tips, cerrar la puerta del instrumento. Darle a la techa de “start” y elegir la opción de selección de tamaños a usar en el procesado de las muestras en cuestión. El Sistema SPRIworks para Construcción Automática de Librerías para Secuenciación Masiva permite a los investigadores aumentar el número de muestras preparadas, de manera completamente automática y con una intervención mínima por parte del usuario, obteniendo unos resultados altamente reproducibles y de calidad. Al incluir también en su protocolo la selección de tamaños automatizada, elimina uno de los mayores y más tediosos cuellos de botella de la construcción de librerías, así como su “manualidad” al no necesitar trabajar ni con geles ni con columnas. Asímismo, es una solución amplia y flexible al poder trabajar con cualquiera de los protocolos de las tres principales plataformas masivas presentes en el mercado. IZASALAB 1/2011 15 ESPECTROMETRÍA / LC/MS/MS/TRIPLE CUADRUPOLO Triple Cuadrupolo SHIMADZU LCMS-8030 Como respuesta al creciente aumento de la demanda de metódicas de UHPLC se hacía necesaria la aparición de un sistema de LC-MS/MS capaz de satisfacer las expectativas de velocidad de análisis. S himadzu ha desarrollado un nuevo espectrómetro de masas de triple cuadupolo, el LCMS-8030. Con los equipos existentes en el mercado los resultados en UHPLC se parecen a los presentados en la figura 1. máximas de130MPa y rangos de flujos de 0.1µl hasta 10ml/min. El control del gradiente se realiza cada 100 milisegundos, lo cual asegura una reproducibilidad extrema y gran rapidez en la formación de los gradientes, junto con el mezclador de alta eficiencia de 20µl. 1.- Gradiente de alta velocidad Figura 1 Requerimientos para un sistema de trabajo en Ultra alta velocidad UHPLC-MS/MS 1.- Gradiente de alta velocidad. El gradiente se realiza con las bombas Nexera LC-30AD con rango presiones 16 IZASALAB 1/2011 2.- Inyección de alta velocidad. El tiempo empleado en la inyección no es significativo en analíticas de HPLC convencional, pero cuando se habla de UHPLC, el tiempo empleado en la inyección puede ser cercano al tiempo de análisis, lo cual supone multiplicar por dos el tiempo total del ciclo. Por ello Shimadzu dispone del inyector Nexera SIL-30A, el cual es el más rápido del mercado, con un tiempo de inyección de muestra de tan solo 10 segundos para 10µl. Por otro lado, cuando la analítica requiere derivatización, existe un problema de tiempo adicional que en el caso de Shimadzu se minimiza gracias a la función de superposición de inyecciones. 3.- Columnas de UHPLC. Existen gran variedad de columnas de UH- PLC en el mercado. 4.- Cambio de polaridad alta velocidad en el espectrómetro de masas. Es necesario que el instrumento realice cambio de polaridad a muy alta velocidad con el fin de poder tener suficiente información sobre los compuestos que están eluyendo de la columna de UHPLC. En el caso del LCMS-8030 este valor es de 15 milisegundos, lo cual implica que es el más rápido del mercado. 5.- Celda de colisión de alta velocidad y sin “efecto memoria”. Shimadzu ha patentado la tecnología UFsweeper, que acelera los iones dentro de la propia celda para reducir el tiempo de residencia de los mismos, y así aumentar la velocidad de muestreo del sistema. El UFsweeper reduce la pérdida de iones, mejorando así la sensibilidad, y reduce el efecto memoria (Cross Talk), muy significativo en otros equipos cuando se trabaja en UHPLC. Punto 2.- Inyección de alta velocidad. 4.- Cambio de polaridad alta velocidad en el espectrómetro de masas 5.- Celda de colisión de alta velocidad y sin “efecto memoria”. 6.- Tiempo de reposo mínimo. El LCMS-8030 permite trabajar con un tiempo de reposo de 1milisegundo. Gracias a esto permite disponer de más tiempo de medida, y por tanto mayor reproducibilidad a la hora de tener resultados en UHPLC. 7.- Alta velocidad de barrido. La alta velocidad de barrido es necesaria para poder realizar análisis en UHPLC. Así mismo es necesario que la sensibilidad del instrumento no desaparezca al trabajar a altas velocidades. En el caso de LCMS8030 de Shimadzu, la velocidad de barrido es de 15.000 uma/s, lo cual lo sitúa al frente en este punto, y lo más importante es que la tecnología patentada de Shimadzu evita la perdida de sensibilidad del sistema al aumentar la velocidad de barrido. 6.- Tiempo de reposo mínimo 7.- Alta velocidad de barrido IZASALAB 1/2011 17 ESPECTROMETRÍA DE MASAS / MALDI-TOF MALDI Spiral-TOF JSM-S3000 El nuevo JMS-S3000 de JEOL es un nuevo sistema MALDI-TOFMS con un diseño revolucionario. El JMS-S3000 define un nuevo estándar en MALDI-TOF. P ara mejorar el poder de resolución y la exactitud de masa en un espectrómetro de masas, se requiere la prolongación de la distancia de vuelo mientras se mantienen los paquetes de iones del mismo m/z (paquete de iones) de forma compacta, sin dispersión. Prolongar la distancia de vuelo de los sistemas convencionales de TOF, lineales o de reflectrón, hace aumentar de tamaño los equipos disminuyendo la sensibilidad por la pérdida de iones en la dispersión, y puede perderse exactitud de masa por la misma razón. El sistema de óptica de iones SpiralTOF desarrollado por JEOL basándose en los principios de “Perfect focussing” y “Multi-turn” y aplicado en el JMS-S3000, supera las especificaciones de los sistemas convencionales lineales y de reflectrón. Los paquetes de iones son reagrupados en el espacio cada giro durante el vuelo. Por esta razón, incluso después de numerosos giros los iones no se dispersan y permite obtener gran resolución, exactitud de m/z muy alta y gran transmisión de iones. La tecnología patentada por JEOL permite conseguir trayectorias de iones de hasta 17 metros en un diseño muy compacto. El JMS-S3000 tiene más de un orden de magnitud de longitud más que los sistemas convencionales TOF de Reflectrón, de modo que el poder de resolución de masas es muy superior y con una exactitud de masas y un rango de masas incluso mejoradas. El sistema de óptica de iones SpiralTOF desarrollado por JEOL basándose en los principios de “Perfect focussing” y “Multiturn” y aplicado en el JMS-S3000, supera las especificaciones de los sistemas convencionales lineales y de reflectrón ion-gate es de más de 15 metros, más de un orden de magnitud mayor que los equipos convencionales de Maldi TOFTOF, lo cual permite la selección monoisotópica de iones precursores. MALDI TOF-TOF La herramienta perfecta para el análisis estructural: CID de alta energía de precursores seleccionados monoisotópicamente. El JMS-S3000 de Jeol con la configuración de TOF-TOF puede obtener iones producidos en la en la celda CID por colisión de alta energía de iones seleccionados monoisotópicamente. La distancia a la 18 IZASALAB 1/2011 Los iones seleccionados son introducidos en la celda de colisión sin deceleración. Estos iones colisionan con el gas de reacción con una energía de 20 keV. Existen dos deflectores colocados antes y después de la celda de colisionan, lo que asegura una alta transmisión de iones. La combinación de los modos Spiral y linear en un solo equipo permite el análisis de una gran variedad de compuestos El segundo tramo de TOF incorpora un sistema de reaceleración de iones y un nuevo reflectrón patentado por JEOL. Este nuevo reflectrón permite detectar iones en un rango que va desde las pocas unidades hasta la masa del ion precursor. Los sectores eléctricos utilizados en el JMS-S3000 son capaces de eliminar los iones generados en el PSD (Post Source Decay) características de la técnica Maldi. Así, las fragmentaciones, derivadas de una rotura en la celda de colisión de alta energía, son las únicas que se observan en el espectro de masas, sin interferencias. MALDI LINEAR-TOF La configuración del JSMS3000 de JEOL para el análisis TOF con vuelo lineal permite la obtención de resultados de alta sensibilidad para moléculas de alto peso molecular (moléculas con pesos de varios cientos de miles), y moléculas con tendencia a sufrir fragmentaciones (PSD) SpiralTOF SpiralTOF + TOF-TOF SpiralTOF + Linear TOF SpiralTOF + TOF-TOF +Linear TOF IZASALAB 1/2011 19 ESPECTROMETRÍA / ICP Análisis de metales pesados en envases de plástico por ICP-OES La legislación en la Unión Europea obliga a la reducción del impacto ambiental provocado por los residuos procedentes de material de envase y embalaje. torcha del plasma. Los átomos e iones liberados, se excitan y emiten sus líneas de emisión. El sistema óptico procesa la luz emitida, que se detecta en un sensor CCD, adquiriendo el espectro completo de emisión correspondiente a todos los elementos presentes en la muestra de forma simultánea. A demás de la reducción del impacto ambiental, se pretende conseguir que la proporción de material no contaminante empleado tanto en envases de un solo uso como en envases reusables sea incrementado hasta un nivel de al menos el 80%. La concentración acumulada de los metales pesados plomo, cadmio, mercurio y cromo hexavalente en materiales de envase y embalaje no puede exceder el valor de 100 mg/kg. Por lo tanto, los productores de materiales para envase y embalaje deben asegurarse que las materias primas empleadas en su fabricación no contienen estos elementos. La determinación simultánea de metales pesados se lleva a cabo normalmente empleando espectrómetros de plasma óptico (ICP-OES), como el Shimadzu ICPE-9000 (Figura 1), que destaca por su elevada sensibilidad, amplio rango dinámico y alta velocidad de análisis. El ICPE-9000, con detector de estado sólido CCD, incorpora una óptica a vacío, estableciendo nuevos patrones en rendimiento y velocidad. Espectro de emisión de todos los elementos presentes En el ICPE-9000, las muestras de plástico, previamente digeridas empleando un método adecuado, son vaporizadas en la an20 IZASALAB 1/2011 La determinación cuantitativa de elementos se lleva a cabo empleando rectas de calibración obtenidas a partir de patrones multielementales. La Figura 2 muestra las rectas de calibración de Cd y Cr en el rango 0,1—2 mg/L. La concentración acumulada de los metales pesados plomo, cadmio, mercurio y cromo hexavalente en materiales de envase y embalaje no puede Figura 2. Rectas de calibración de Cd y Cr en el rango 0,1—2 mg/L exceder el valor de 100 mg/kg Descomposición de la muestra Existen diferentes métodos para la descomposición de la muestra. El método más empleado es la digestión por microondas, empleando una mezcla de ácido nítrico concentrado y peróxido de hidrógeno concentrado en condiciones de alta presión y temperatura. Figura 1. Espectrómetro de emisión por plasma de acoplamiento inductivo ICPE-9000 de Shimadzu ESPECTROMETRÍA / NIR ON-LINE Analizador en línea por Matriz de Diodos DA 7300 OL de Perten NEW El DA 7300 es un analizador NIR on-line avanzado y moderno, con una cámara de color digital incorporada, para uso en grano, harina, procesado de alimentos y piensos. R ealiza el análisis continuo de múltiples parámetros al mismo tiempo, tales como humedad, proteína, grasa/aceite, cenizas y muchos otros. Dado que el DA 7300 se puede integrar en sistemas de control de procesos, su medición continua permite el control automático de proceso, lo que lleva a una producción optimizada. El seguimiento a tiempo real también reduce el deshecho y vuelta de nuevo al trabajo a la vez que mejora la consistencia del producto y calidad. Una amplia gama de opciones de montaje disponibles proporcionan flexibilidad para su uso en diferentes tipos de instalaciones. El DA 7300 se instala y se utiliza en un gran número de harineras, fábricas de piensos y la agricultura y otros centros de producción agroalimentarios. Características y Beneficios • • • • • • Medida de la Calidad en Continuo: Sigue, ajusta y optimiza el proceso de producción en tiempo real ahorrando costes, aumentando el rendimiento y la consistencia del producto. Basado en la Tecnología NIR: El DA 7300 se basa en la exitoso DA 7200, instrumento para el laboratorio con bancada óptica de sobremesa. En línea o al lado de la línea: Transferencia de calibraciones de forma directa entre el DA 7200 y el DA 7300 con pleno acuerdo entre proceso y laboratorio. Cámara digital de color Integrada: da imágenes congeladas o en continuo de la producción. Aplicación para color y análisis imagen en recuento de specks. Interfaz abierta: estándar industrial, protocolo de comunicaciones abierto con completa integración de la información en los sistemas de planta ya existentes. Conectividad Ethernet y acceso remoto: Acceso al sistema, por TCP/IP, para gestión de calibraciones, ajustes y back-up del sistema. Diagnóstico remoto usando herramientas estándar del Windows. Una amplia gama de opciones de montaje disponibles proporcionan flexibilidad para su uso en diferentes tipos de instalaciones. El DA 7300 se instala y se utiliza en un gran número de harineras, fábricas de piensos y la agricultura y otros centros de producción agroalimentarios Aplicaciones Se puede instalar en distintos puntos del proceso. Su interfaz óptica -cristal de zafiro- sobresale a través de la pared penetrando en el flujo de producto asegurando un funcionamiento sin problemas con el DA 7300 + Celda de Muestreo mínimo de perturbaciones externas. • Harineras: Maximizar la extracción de harina midiendo la ceniza en tiempo real. Mezclar trigo y harina para llegar a la especificación de destino. Optimizar la adición de gluten. • Grano y procesamiento de oleaginosas: Medida de humedad, proteína y aceite en grano para fijar precios y almacenaje. Seguimiento y optimización de la extracción y el secado. • Fábricas de Pienso: Optimizar la humedad, proteína y grasa en la mezcladora y en todo el proceso. Control del secado para reducir al mínimo la pérdida de humedad. Optimizar el recubrimiento de grasa. • Alimentación: Una amplia variedad de productos lácteos y alimentos que se pueden medir en continuo facilitando el seguimiento y control del proceso. DA 7300 en planta harinera IZASALAB 1/2011 21 ESPECTROMETRÍA / FTIR Nuevos Accesorios de Reflectancia Total Atenuada (ATR) de un rebote y multi-rebote incorporados en el Compartimento de Muestras de IRAffinity-1 de Shimadzu Shimadzu ha lanzado tres tipos de accesorios de reflectancia total atenuada ATR (dos de ellos de un solo rebote, Miracle 10 y GladiATR 10 y un tercero, tipo ATR horizontal el HATR 10) que se integran en el compartimiento de muestras de la bancada óptica de infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR) modelo IRAffinity-1. E stos tres accesorios ATR son productos OEM de PIKE Technologies en los EE.UU. y todos los modelos tienen la característica de accesorio con auto-reconocimiento. El Miracle 10 y el GladiATR 10 se pueden proporcionar con o sin un sensor de presión. Dado que los tres accesorios ATR tienen el sistema óptico debajo de la cubierta, se pueden encajar en el compartimiento de muestras con sólo quitar la tapa de dicho compartimiento del IRAffinity-1. Los usuarios pueden colocar o extraer el accesorio ATR por sí mismos. Características de cada ATR según rebote y tipo de cristal Accesorio ATR de un rebote MIRacle 10: • • Ventajas Dado que estos accesorios ATR van incorporados dentro del compartimento de muestras tiene las siguientes ventajas: • El proceso del purgado es de mayor rendimiento. • El MIRacle 10 puede medir muestras de grandes dimensiones (áreas amplias) sin necesidad de cortarlas. • El polvo y la suciedad no entran en el compartimiento de la muestra del IRAffinity-1. Vista externa del accesorio ATR de un rebote MIRacle 10. 22 IZASALAB 1/2011 • • El ATR lleva un prisma diamante sobre óptica de SeZn. Asimismo, hay disponibiidad de prismas de Seleniuro de Zinc (ZnSe) y Germanio (Ge) Los intervalos de lectura son: • Diamante: de 4.600 cm-1 a 600 cm-1 • Seleniuro de Zinc (ZnSe): de 4.600 cm-1 a 600 cm-1 • Germanio (Ge): de 4.600 cm-1 a 700 cm-1 También hay disponibilidad de platos sencillos con prismas de diamante, ZnSe y Ge de forma opcional. Los usuarios pueden adquirirlos de forma individual e intercambiarlos en el MIRacle 10 solos, sin ayuda externa. Accesorio ATR de un rebote GladiATR 10: • Su plato está hecho con un prisma de solo diamante que hace que su inter- Vista externa del accesorio ATR de un rebote GladiATR 10. Vista externa del accesorio ATR accesorio ATR multi-rebote HATR 10. valo de lectura sea de 4.000 a 400 cm-1. Hay disponible otra opción de plato con prisma de Germanio (Ge) (intervalo de lectura: 4600 a 700 cm-1) para medir cauchos negros, etc. Los usuarios pueden adquirirlo de forma individual e intercambiarlo en el GladiATR 10 solos, sin ayuda. Accesorio ATR multi-rebote HATR 10: • El número de rebotes en el cristal de ATR es de diez. • El cristal ATR estándar es de ZnSe (intervalo de lectura de 4.600 cm-1 a 600 cm-1 ) tanto para platos de análisis de muestras sólidas como líquidas (con acanaladura). • También hay disponibilidad de platos con cristal de Germanio (Ge) con intervalo de lectura de 4600 a 700 cm-1 para líquidos y sólidos. Al igual que en los casos anteriores, los usuarios pueden adquirirlo de forma individual e intercambiarlo solos, sin ayuda. Vista externa del Espectrómetro FTIR IRAffinity-1 con el MIRacle 10 montado. ELECTROFORÉSIS CAPILAR Electroforésis Capilar: una técnica separativa muy potente que permite análisis eficientes y robustos La Electroforésis Capilar (CE) consiste en una familia de técnicas separativas que emplean capilares de sílice fundida para llevar a cabo separaciones de las moléculas presentes en una disolución en función de la relación masa/carga de las mismas. La electroforesis capilar encuentra aplicación en campos muy diversos, siendo los más importantes: • Péptidos y proteínas. • Peso molecular. • Análisis de aniones y cationes. • Productos farmacéuticos. • Ácidos nucleicos. • Análisis de enantiómeros. • Carbohidratos. Sistema automático de análisis por electroforesis capilar PA 800 plus de Beckman Coulter E n la técnica de electroforesis capilar, las separaciones se llevan a cabo mediante la aplicación de un alto voltaje, que genera flujos electroosmóticos y electroforéticos de la solución tampón y de las especies iónicas, respectivamente, dentro del capilar. Las propiedades de la separación y del electroferograma tienen características que asemejan un cruce entre la electroforesis tradicional en gel de poliacrilamida (PAGE) y la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). menudo se asemeja a un cromatograma. • Tiene eficiencias en el orden de las conseguidas con cromatografía de gases, o incluso mayores. • Requiere cantidades mínimas de muestra. • El consumo de reactivos es muy bajo. La electroforesis capilar posee características que la diferencian claramente de las técnicas mencionadas anteriormente: • Emplea tubos capilares dentro de los cuales tiene lugar la separación. • Emplea campos eléctricos muy altos, en el rango de 500 V/cm. • Emplea tecnología de detección moderna, de forma que el electroferograma a Ejemplo de separación de 20 compuestos que muestra el extraordinario poder separativo de la técnica Esquema básico de la electroforesis capilar • Es aplicable a un número mayor de analitos, en comparación con otras técnicas separativas. La configuración instrumental básica para electroforesis capilar es relativamente simple. Se requiere un capilar de sílice fundida con una ventana óptica, una fuente de alimentación de alta tensión regulable, dos electrodos, dos recipientes para solución tampón y un detector UV. Los extremos del capilar se colocan en los recipientes de tampón y la ventana se alinea con el detector. Después de llenar el capilar con tampón, la muestra se introduce en el capilar empleando diferentes técnicas, como presión, vacío, voltaje o gravedad. IZASALAB 1/2011 23 CIENCIAS CARACTERIZACIÓN DE LA VIDA DE PARTÍCULAS Mejoras en el análisis de distribución de tamaño de partículas por difracción láser Beckman Coulter expande el rango de medida de los analizadores de distribución de tamaño de partículas por dispersión láser LS 13 320 hasta los 17 nm y añade capacidades analíticas como la notación Phi o la estadística Rosin-Rammler. B eckman Coulter ha extendido el rango de medida de sus analizadores de distribución de tamaño de partículas por dispersión de luz de la Serie LS 13 320, de forma que es posible realizar medidas reproducibles y de alta resolución en el rango de tamaños desde 17 nm hasta 2000 µm. Analizador de distribución de tamaño de partículas por dispersión de luz Beckman Coulter LS 13 320, equipado con módulo acuoso ALM y modulo AutoPrep (preparador de muestras y automuestreador) Rango de medida extendido hasta 0,017 µm en el LS 13 320. Además, se mejora su capacidad analítica al añadir cálculos empleando la notación Folk & Ward Phi, así como la estadística Rosin-Rammler. La notación Folk & Ward Phi es de gran utilidad para el trabajo con muestras de suelos y sedimentos. Los datos de distribución de tamaño se proporcionan en intervalos de phi (Φ), en lugar de en micras o en milímetros. El cálculo de phi se realiza tomando el logaritmo negativo del diámetro en milímetros. log (d ) φ = − 10 log10 2 El resto de parámetros estadísticos se cal24 IZASALAB 1/2011 culan a partir de los valores de phi. De esta manera, es muy fácil clasificar los diferentes tipos de suelos y sedimentos en función de sus valores de phi. La distribución Rosin-Rammler es un modelo útil para la caracterización del tamaño de partícula de muestras de varios tipos Valor Phi Grava Adoquín -8 hasta -6 Guijarro -5 hasta -3 Gránulo -2 Muy gruesa Arena y tamaños diferentes. El cálculo se realiza con la siguiente expresión. R = 100 e Micras >2000 -1 hasta -0,5 Gruesa 0 hasta 5 Media 1 hasta 1.5 Fina 2 hasta 2.5 Muy fina 3 hasta 3.5 63 hasta 2000 Limo 4 hasta 7.5 2 hasta 63 Arcilla >8 <2 Clasificación de diferentes tipos de suelos y sedimentos en función de los valores de Phi d − d n n El método facilita la descripción y el estudio de procesos que producen cambios en la distribución de tamaño de partícula, tales como la molienda o la aglomeración. Algunas aplicaciones típicas en las que la distribución RosinRammler resulta de interés son fertilizantes, cenizas volantes, cementos, etc. NOTA APLICATIVA CARBONO ORGÁNICO TOTAL Determinación de TOC en la validación de limpieza En la industria farmacéutica el término “Limpieza” es especialmente significativo pues en la producción de cualquier clase de medicamento, la pureza del mismo es esencial. E TOC-V con ASI-V l requisito básico es la eliminación eficaz de productos residuales generados durante la producción. Una planta limpia reduce la contaminación de los medicamentos. Cuando se trabaja en lotes, la limpieza es particularmente importante, pues en la misma instalación se producen distintos productos, debiéndose garantizar que no se produzcan contaminaciones provenientes de los procesos de producción anteriores. La validación de la limpieza asegura la eficacia del proceso de la limpieza. Proceso de limpieza El factor determinante de una limpieza eficaz es la selección del proceso que se utilizará para la realización de dicha limpieza. Normalmente se utilizan dos tipos de procesos: CIP (Clean In Place) La limpieza se hace automáticamente y sin necesidad de desmontar los sistemas de producción de la planta. En este caso la planta debe estar diseñada para realizar aclarados del sistema y disponer la posibilidad de realizar reciclados y no tener volúmenes muertos a lo largo de la línea; normalmente esto requiere una inversión alta pero por otro lado permite optimizar los tiempos, la temperatura, los agentes de limpieza y los disolventes, dando como resultado una limpieza muy eficaz. El aclarado automá- tico permite establecer un procedimiento estandarizado y validado. COP (Cleaning Out of Place) En este proceso, los sistemas de producción deben ser desmontados y cada uno de los componentes deben ser limpiados de modo individual. Este procedimiento requiere más tiempo y una alta dedicación del personal de la planta, siendo la estandardización y la validación de este procedimiento más difícil. La ventaja es que se necesita una baja inversión y da la oportunidad de examinar todos los componentes visualmente. Muestreo y analíticas Dependiendo del proceso de la limpieza, y con el fin de comprobar la eficacia de la misma se pueden realizar muestreos en distintas partes de la línea, siendo la manera más fácil y rápida muestrear y analizar la solución después del aclarado. Dependiendo del solvente usado, el análisis se puede realizar utilizando la técnica HPLC o bien realizando el análisis del TOC (Carbono Orgánico Total). El análisis del TOC para la validación de la limpieza presenta numerosas ventajas: • Los sistemas para análisis de TOC son fáciles de usar: • La medida de TOC es independiente del producto y muy flexible. • El método TOC es un método fácil que no requiere prepa- ración de la muestra. • La determinación de TOC es fácil de validar. • La determinación de TOC se puede combinar con el análisis de otros parámetros como TNb y Carbón Inorgánico (IC) que permite disponer de mayor información – TNb en BioFarma. • Análisis rápido • Las muestras de agua pueden ser analizadas muy rápidamente (4 minutos) • Coste bajo • Pocos consumibles. • Ningún solvente. El sistema modular de Shimadzu TOC-V simplifica el análisis de TOC, sin importar cual sea el método de muestreo (líquido o swab). El TOC-VCPH se basa en la tecnología de combustión catalítica de la muestra (680°C) y detección del CO2 generado en la misma por NDIR. De esta manera, es posible detectar tanto ácidos de bajo peso molecular como partículas. Gracias al rango de medida de hasta 25.000 mg/l (con un limite de detección de 4 μg/L), el equipo permite analizar no solo en el más bajo rango sino también realizar el análisis de muestras altamente contaminadas, por ejemplo durante el proceso de validación de la limpieza. La posibilidad de analizar simultáneamente el TNb (Nitrógeno total) con la ayuda del módulo TNM1 hace que se pueda diferenciar el producto del agente del enjuague, siendo esto especialmente interesante en los productos biofarmaceúticos. y compatibles con GLP/GMP. Un módulo integrado con trazabilidad, gestión de datos y administración de usuarios permite el cumplimiento de los requisitos de la norma FDA 21 CFR parte 11. Gestión de Datos Class Agent Además de los análisis, el archivar los datos de los resultados analíticos tiene cada vez mayor importancia. Uno de los ejemplos más conocidos de requerimientos de archivo de datos es la norma 21 CFR parte 11, regulada por la FDA americana y que describe la administración de datos electrónicos y el uso de firmas electrónicas. Los expedientes electrónicos y las firmas electrónicas se consideran equivalentes a un informe impreso del análisis con una firma manuscrita solo cuando el software aplicado cumple criterios muy específicos. Shimadzu ofrece una solución completa con el paquete de programas informático Class Agent. Permite al usuario estructurar, almacenar y asegurar expedientes electrónicos en una potente base de datos. Los datos se pueden recuperar de la misma en formato legible en cualquier momento. La firma electrónica que consiste en el nombre y la contraseña de usuario se requiere, por ejemplo, para tener acceso a resultados analíticos. El nombre, el grupo fecha/hora y el tipo completo de acción realizada están documentados con total trazabilidad. TOCControl V El software TOCControl V transforma la serie de analizadores TOC-V en sistemas de control de calidad completamente automáticos AGENT MENU IZASALAB 1/2011 25 CENTRIFUGACIÓN Desde los inicios hasta hoy: nuevas tendencias en centrifugación Una centrífuga es una máquina que crea aceleración, aceleración centrífuga, mediante una rotación rápida. Existen múltiples opciones de uso de ese campo de aceleración para separar mezclas de líquidos, sólidos o gases en gran variedad de campos de trabajo. Se usan centrífugas desde hace mucho tiempo en todas las áreas de la vida, desde secadores centrífugos hasta centrífugas para leche en las que se separa la nata de la solución principal. Primera ultracentrífuga (analítica) disponible comercialmente: el Modelo “E” (1947) L as centrífugas que se usan hoy en el campo de la investigación biomédica están muy unidas al nombre de Theodor Svedberg, que recibió el Premio Nobel de 1926 por sus trabajos en sistemas coloidales. Su objetivo inicial era observar coloides durante la sedimentación. La centrífuga se desarrolló para acelerar ese proceso de sedimentación, en colaboración con James Burton Nichols en 1923 y se alcanzaron fuerzas de 150 x g. En el año siguiente Svedberg y Herman Rinde resolvieron problemas como la convección, el control de temperatura y la eliminación de las vibraciones y consiguieron una campo centrífugo de 7000 x g. ¡¡¡Empezaron a usar el término ultracentrífuga por primera vez!!! La primera centrífuga que se usó para investigar en moléculas biológicas a 100.000 x g que la desarrollaron Svedberg y Lysholm en los años 1925-1926. Los resultados que se consiguieron fueron un acicate para el desarrollo de sistemas más veloces y más eficaces en las siguientes décadas. Se han usado para multitud de aplicaciones tales como la separación de compar- 26 IZASALAB 1/2011 timentos celulares, de componentes de la sangre, separación de virus, proteínas o aislamiento de ácidos nucleicos o la deBeckman Coulter representa terminación precisa de la masa y el tamaen centrifugación la propuesta ño de complejos macromoleculares entre otras. de los estándares más La opción de conseguir una separación simplemente mediante la aceleración proavanzados y las soluciones ducida en un campo centrífugo en una somás eficientes en un proceso lución acuosa es manifiestamente ventajosa. Hasta ahora, la centrifugación es continuo de liderazgo que ya conocida como uno de los métodos más respetuosos con las estructuras en la sesupera los 60 años de servicio paración de moléculas biológicas. Desde 1947 la División Spinco de Becka la comunidad científica man Coulter ha marcado la innovación en centrífugas de todas clases. Al Modelo “E” (1947), primera ultracentrífuga analítica, le siguió el Modelo “L” que fue la primera ultracentrífuga preparativa hasta las series actuales de ultracentrífugas, Optima, de centrífugas de Alta Eficacia, Avanti-J y de sobremesa Allegra y Microfuge, Beckman ha roto límites en un proceso de innovación continua y de ampliación de la aplicabilidad de la centrifugación. Hoy un objetivo creciente es la seguridad biológica y la batalla contra el bioterrorismo, satisfacer las demandas en investigación y producción de vacunas que se han cubierto con el programa BioSafe en todas las series con soluciones de protección a diferentes niveles, siempre sin restringir funcionalidad ni facilidad de manejo. Centrífuga Avanti J-30I (4 L, 30000 rpm, 110.000 x g) ciado a estas características que redunda en sensibles reducciones del tiempo de trabajo a las que además contribuye la gran capacidad de aceleración deceleración de la última generación de motores Switch Reluctant Drive. En ultracentrifugación se han incorporado prestaciones que mejoran asimismo su eficacia: • Eliminación de tiempos de espera mediante el uso de la más avanzada tecnología de sistemas de vacío. • La optimización de la geometría de los rotores para hacerlos aún más eficientes. • El uso de herramientas informáticas “in situ” para ayudar a la planificación experimental y a la ejecución de los métodos de trabajo. • El aumento de la capacidad de los modelos de sobremesa hasta el Centífuga Avanti J-30I y los rotores JS 24.38 y JA 30.50 límite inferior de las ultracentrífugas (más de 100.000 xg) y el rotor para microplacas JS-5.9 preparativas, lo que proporciona una gran versatilidad. (más de 6000 x g)) • El aumento de la fuerza cenEn centrífugas de Alta Eficacia se han detrífuga disponible hasta superar sarrollado nuevas aplicaciones en la lí1.000.000 x g. nea de aumentar los volúmenes de trabajo y la fuerza disponible: con 82000 x g se acortan sensiblemente los tiempos de separación. Aunque no se puede todavía alcanzar una separación de partículas 100 s puede tener sentido abordar su separación, en algunos casos se puede conseguir alargando el tiempo. Con rotores de más de 100000 x g se pueden abordar separaciones de precipitación (8 x 50 mL) y separaciones en gradiente (15 y 38 mL) en instrumentos de Alta Eficacia, hasta ahora exclusivos de ultracentrífugas. Es en ese sentido que en Beckman Coulter se habla de Alta Eficacia en lugar de Rotor basculante JS 5.3 “All Spin” para Alta Velocidad para describir la serie Avanmicroplacas y todo tipo de tubos y botellas ti-J por el incremento de productividad aso(6000 x g) Rotor JLA 8.1000 (6 x 1000 mL, 16000 x g)) Harvest Line System para JLA 8.1000 Incluso en centrifugación de sobremesa Beckman Coulter marca nuevos estándares. El desarrollo de la tecnología ARIES, (Automatic Rotor Imbalancing Equilibrating System) permite trabajar con muestras de pesos diferentes compensando activamente esa diferencia. Entre otras posibilidades permite centrifugar cultivos celulares directamente en el frasco de cultivo sin ningún trasvase. Beckman Coulter representa en centrifugación la propuesta de los estándares más avanzados y las soluciones más eficientes en un proceso continuo de liderazgo que ya supera los 60 años de servicio a la comunidad científica. IZASALAB 1/2011 27 CROMATOGRAFÍA / UHPLC El UHPLC LC-30 NEXERA de Shimadzu se reinventa El Sistema de Cromatografía líquida UHPL de Shimadzu ha incorporado nuevos accesorios y funciones que hacen de él el sistema más versátil y flexible del mundo. E l rango de flujos actualmente se sitúa entre 0.1 microlitros/min y 10 ml/ min. Este rango es más amplio del mercado y permite utilizar el NEXERA para aplicaciones muy diversas, desde aplicaciones semipreparativas hasta semimicro, pasando por supuesto por las aplicaciones de alta velocidad y alta resolución, gracias a las presiones máximas admitidas por el equipo (hasta 130MPa). Nuevo formador de Gradientes de baja presión NEXERA El UHPLC Nexera ha sido centro de atención desde su lanzamiento en la Pittcon 2010, por sus especificaciones y robustez. Ahora Shimadzu lanza el módulo de formación de gra- dientes para la bomba NEXERA LC-30AD. La nueva unidad de gradientes permite tanto su utilización como válvula formadora de gradientes, típicamente usada en el HPLC convencional, y como válvula selectora de hasta 4 disolventes, útil en el desarrollo de nuevas metodologías. La incorporación de la válvula de gradientes, junto con el au- Pressure (MPa) 28 IZASALAB 1/2011 La incorporación de la unidad de gradientes en la bomba NEXERA LC-30AD, permite generar gradientes de concentración con una sola bomba y bombearla con presiones de hasta 130MPa, y flujos de hasta 10ml/min. La excelente eficiencia de bombeo y de formación de gradientes permite obtener unos magníficos resultados en reproducibilidad de tiempos de retención tanto en gradientes a alta presión (mezcla de eluyen- Only NEXERA is available in this range Maximun pressure:130Mpa Nexera Vendor 1 Vendor 2 Flow ratte (mL /min) mento del rango de flujos hasta 10ml/min, coloca al NEXERA de Shimadzu como único sistema del mercado capaz de trabajar en un solo instrumento, desde analíticas de rutina, investigación y desarrollo de métodos, tanto en HPLC como en UHPLC. Pressure (MPa) La posibilidad de realizar inyecciones superpuestas permite realizar secuencias con el máximo aprovechamiento del tiempo, lo cual se hace mucho más evidente cuando existen metódicas con pretratamiento de las muestra en el inyector automático SIL-30 NEXERA. Nexera Flow ratte (mL /min) tes después de las bombas), como en gradientes de baja presión (mezcla de eluyentes antes de las bombas). En la tabla se presentan los datos en ambos modos de trabajo con una columna con tamaño de partícula de 1.6 micras La gran versatilidad del NEXERA se presenta en la siguiente configuración, en la que en un solo sistema disponemos de: 1.-Gradientes binarios en alta presión con dos bombas y selección de hasta 4 eluyentes por bomba para trabajar en UHPLC (columna UHPLC) 2.-Gradientes binarios en alta presión con dos bombas y selección de hasta 4 eluyentes por bomba para trabajar en HPLC (columna HPLC) 2.-Gradiente cuaternario en baja presión para trabajar en UHPLC (columna UHPLC) 3.-Gradiente cuaternario en baja presión para trabajar en HPLC (columna HPLC) IZASALAB 1/2011 29 CROMATOGRAFÍA / CAPA FINA Mayor reproducibilidad y conveniencia en el desarrollo de cromatogramas en capa fina La cámara automática de desarrollo ADC2 de Camag aumenta espectacularmente la reproducibilidad, seguridad y conveniencia en el desarrollo de placas de cromatografía en capa fina. La cámara automática de desarrollo ADC2 es de aplicación universal y proporciona resultados con una reproducibilidad sin precedentes. Esta diseñada para automatizar todas las operaciones que normalmente se realizan de forma manual durante el desarrollo de la placa. Uno de los puntos fuertes de la ADC2 consiste en que emplea una cubeta estándar de Camag de 20x10 cm con doble fondo, que permite trasferir directamente métodos analíticos basados en esas cubetas sin ningún cambio. El proceso de desarrollo completo se realiza de forma automática: 1) Antes del desarrollo, es posible ajustar la actividad de la placa hasta el nivel requerido mediante la opción de control de humedad relativa. 2) Es posible también Cámara automática de desarrollo de cromatogramas TLC / HPTLC ADC2 de Camag establecer la saturación de la cubeta, con una a cromatografía en capa fina es un programación de tiempo. sistema abierto y por lo tanto fácil3) La placa entonces desciende al intemente influenciable por factores exrior de la cubeta pero sin contacto con ternos, tanto medioambientales como del el disolvente de desarrollo, de modo que propio operador. Esto es especialmense realiza un pre-acondicionamiento de te cierto cuando factores como la activila placa con la fase de vapor del disoldad de la placa, la saturación de la cubevente en un tiempo controlado. ta o el pre-acondicionamiento de la capa 4) Después comienza la cromatografía sean factores importantes en la separación bajando la placa hasta que se sumera realizar. ge ligeramente en el disolvente de desarrollo. Solamente es posible obtener resulta5) Durante el desarrollo, se monitoriza dos reproducibles si todos estos factores de forma constante la posición del frente que pueden tener influencia se mantienen del disolvente. constantes. En análisis de rutina, estos pa6) Tan pronto como el frente del disolrámetros deberían estar normalizados. vente alcanza la distancia de desarrollo Uno de los puntos fuertes de la ADC2 consiste en que emplea una cubeta estándar de Camag de 20x10 cm con doble fondo, que permite trasferir directamente métodos analíticos basados en esas cubetas sin ningún cambio definida en el método, la placa sube y se seca con un flujo de aire optimizado. 7) Cuando la cámara ADC2 se opera a través del software winCATS, todos los parámetros cromatográficos quedan guardados como parte del análisis, de acuerdo a GMP/GLP, y pueden ser recuperados e impresos en cualquier momento. 15% 30% 47% 60% L 30 IZASALAB 1/2011 Efecto de la humedad relativa en la separación de polifenoles en té verde La cámara automática de desarrollo ADC2 ofrece facilidad, seguridad y reproducibilidad para el desarrollo isocrático de placas TLC / HPTLC de tamaño 20 x 10 cm. REFLECTIVIDAD DE RAYOS X Técnicas de análisis de películas delgadas: Reflectividad de rayos X (XRR) Hoy en día es muy habitual encontrar materiales formados por multicapas de distintos compuestos, o también materiales recubiertos por una capa delgada de otro que le confiere una serie de propiedades muy útiles. P or necesidades de reducción de costes y optimización de recursos suele ser necesario buscar el espesor mínimo del recubrimiento que confiera al material la propiedad buscada, y para ello hay que recurrir a diferentes técnicas (en lo posible no destructivas) con las que obtener este tipo de información. Una de estas técnicas es la reflectometría de rayos X, también conocida como XRR por sus siglas en inglés. Pese a que es una técnica englobada dentro de la difracción de rayos X de polvo, no se fundamenta en el fenómeno de difracción sino en la reflexión de la radiación. En un experimento de XRR utiliza la intensidad de reflexión de los rayos X que inciden sobre la muestra a un bajo ángulo (inferior al ángulo crítico para ese material) para estudiar parámetros de las películas delgadas como por ejemplo, el espesor de capa, la densidad del material o la rugosidad, tanto superficial como intercapa. (Figura 1) Algunas de las características de esta técnica son: Estudio de materiales amorfos, mono- Información obtenida por reflectometría A partir de una curva de reflectometría se pueden deducir de forma cualitativa y a simple vista distintas propiedades de un material en función del parámetro observado. Espesor de capa El periodo de oscilación en la curva de reflectividad en función del ángulo (2q) nos da idea del grosor de la capa estudiada. En función del sistema óptico utilizado, se pueden identificar capas de grosores comprendidos entre 0.5 y 1000nm, siendo más difícil la determinación cuanto mayor sea el grosor, pues las oscilaciones se hacen más débiles. Las oscilaciones se producen Critical angle θc : Density ρ B) Ángulo incidente = ángulo crítico de reflexión total. Los rayos X incidentes se propagan a lo largo de la superficie de muestra. C) Ángulo incidente > ángulo crítico de reflexión total. Los rayos X incidentes penetran en el maFigura 2 por la interferencia de los rayos X reflejados por la superficie de la película y los reflejados por la interfase y reciben el nombre de interferencias de Kiessing. Rugosidad superficial e intercapa Otros parámetros Oscillation decay rate at higher angles: Surace or interface roughness σ Amplitude of oscillation: Density contrast 2 θ (deg.) A) Ángulo incidente < ángulo crítico de reflexión total. Todos los rayos X incidentes se reflejan. La información sobre rugasodad procede de la amplitud de la oscilación, o mejor , del decaimiento de la amplitud de oscilación en función del ángulo 2q. Así, a mayor rugosidad de la película, más rápido será el decaimiento de la oscilación. Period, Δθ : of oscillation: Film thickness, d Reflectivity • cristalinos y policristalinos. • Evaluación la rugosidad superficial e intercapa de forma no destructiva. • Determinación de la estructura de las capas de materiales formados por monocapas o multicapas. • Medida deespesores entre varios nanómetros y 1 milímetro. Intensity decay rate at higher angles: :Surface roughness σ En la figura 2 se muestra un resumen de toda la información que se puede obtener a partir de un experimento de reflectividad. La gama de equipos para difracción de Rayos X de polvo de Rigaku (Ultima IV y SmartLab), incorporan los componentes ópticos necesarios para la realización de experimentos de reflectometría de rayos X. Fuente: The Rigaku Journal,26(2), 1010 Figura 1 IZASALAB 1/2011 31 Super Resolución: Microscopía Óptica más allá del límite N-SIM alzanca una resolución lateral dos veces superior a la de los microscopios tradicionales a una velocidad increíblemente rápida: 0.6 segundos / cuadro. Adicionalmente permite la obtención de imágenes en 3D e imágenes en TIRF mediante el nuevo iluminador iluminador TIRF-SIM Antes Después N-STORM, con una resolución lateral de 20 nm. y una resolución axial de 50 nm., permite la obtención de imágenes en dos y tres dimensiones e imágenes multiespectrales Antes Después IZASA, S.A. Tel.: 902 20 30 80 - Fax :902 20 30 81 - [email protected] - www.izasa.es
