Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS
ESTUDIO MOLECULAR DE LOS GENES DE ANTIGENOS
CLASE II REGIÓN DQ, DEL COMPLEJO PRINCIPAL DE
HISTOCOMPATIBILIDAD ASOCIADOS CON LA ARTRITIS
CRÓNICA JUVENIL
Tesis para optar por el grado de
Doctor en Ciencias Médicas
presenta:
M en C. Mario Salazar Páramo
Asesor Básico
Dr. en C. Miguel Huerta
Asesor Clínico
Dr. en C. Fernando Rivas Solís
Colima, Col. Junio de 2006
1
Dedicado a:
Ingrid Patricia, Ingrid de María y Mario.
Agradecimientos:
A mis asesores Dr. Miguel Huerta Viera y Fernando Rivas Solís.
A la M en C. Norma Olivares Gassamans.
A la Facultad de Medicina de la Universidad de Colima y al Hospital de
Especialidades del Centro Médico Nacional de Occidente del Instituto
Mexicano del Seguro Social.
2
INDICE
Indice de Tablas y Figuras ………………………………………………… 1
Resumen ……………………………………………………………………… 2
Abstract ………………………………………………………………………. 4
Introducción
……………………………………………………………….. 6
Antecedentes
……………………………………………………………….. 8
Artritis crónica juvenil. Generalidades ……………………………. 8
Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y Antígenos
leucocitarios humanos (HLA) ……………………………………….14
Planteamiento del problema
Justificación
Objetivos
………………………………………….....27
…………………………………………………………………28
…………………………………………………………………….29
Material y método
Resultados
Discusión
Conclusiones
………………………………………………………….30
…………………………………………………………………36
…………………………………………………………………..45
……………………………………………………………...48
Bibliografía ………………………………………………………………………49
Anexos ……………………………………………………………………………56
3
Índice de Figuras y Cuadros
Figura 1, Inmunorregulación en artritis crónica juvenil ………………..13
Figura 2, Localización de los genes del MHC ……………………………16
Figura 3, Análisis molecular de alelos del MHC mediante PCR………44
Cuadro 1,
Subgrupos clínicos de artritis crónico juvenil ……………..23
Cuadro 2,
Resultados, datos demográficos de los pacientes ………..37
Cuadro 3,
Resultados de frecuencias alélicas globales ……………….39
Cuadro 4,
Resultados, frecuencias genotípicas ……………………….. 40
Cuadro 5,
Resultados frecuencias genotípicas ………………………… 41
Cuadro 6,
Frecuencias alélicas DQA ……………………………………… 42
Cuadro 7,
Frecuencias alélicas DQB ……………………………………… 43
4
RESUMEN
La artritis idiopática juvenil incluye un grupo de artropatías crónicas de la infancia
fenotípicamente heterogéneo. Los subtipos más comunes de la artritis crónica
juvenil (ACJ) definidos por el Colegio Americano de Reumatología son el pauci u
oligoarticular, la poliarticular y la artritis sistémica. Los factores tanto ambientales
como genéticos juegan un papel importante de la susceptibilidad a la ACJ. Los
estudios genéticos se han enfocado en el entendimiento de la contribución de los
polimorfismos del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y la
susceptibilidad al desarrollo de ACJ. La región del CPH se encuentra localizada en
el brazo corto del cromosoma 6 e incluye a más de 200 genes, muchos de los
cuales son esenciales para el sistema inmune. Las asociaciones entre el CPH y la
ACJ siguen siendo reconocidas. La ACJ se ve influenciada en su expresión por la
presencia de alelos clase II del CPH y continúan los esfuerzos para identificar
estos alelos en diferentes grupos poblacionales alrededor del mundo.
En el presente estudio nuestro objetivo fue identificar a los alelos clase II del CPH
(región DQ) mediante la reacción en cadena de la polimerasa con secuencias
específicas de oligonucleótidos y en combinación con polimorfismos obtenidos con
fragmentos de longitud restringidos (RFLP), en niños mexicanos mestizos con
ACJ.
Pacientes y métodos. Usando un diseño transversal analítico, se tipificaron para
genes clase II (DQA y DQB) del CPH, 38 pacientes con ACJ y 54 controles de
mismo origen racial y no relacionados familiarmente. Se registraron datos
5
demográficos, clinicos y de laboratorio. El análisis estadístico mediante el uso de
estadística paramétrica (comparación de promedios) y las variables categóricas
mediante chi cuadrada y exacta.
Resultados. Del total de pacientes 23 ( 61%) correspondieron al género femenino,
la edad promedio fue de 16±5 años al momento de la evaluación y duración de la
enfermedad de 5±5 años. Los alelos del MHC clase II más frecuentes fueron para:
DQ1: *0101 (6.6), *0102 (10.5), *0103 (2.6), *0104 (5.3), *0201 (2.6), *0301
(30.3), *0302 (3.9), *0401 (18.4); DQ2: *0102 (2.6), *0103 (2.6), *0201 (2.6),
*0301 ( 23.6), *0401 (23.6), *0501 (39.4); DQ1: *0101 (13.2), *0201 (26.3), *0301
(31.5), *0302 (36.8), *0402 (2.6), *0501 (2.6); DQ2: *0201 (2.6), *0302 (26.3),
*0402 (26.3), *0501 (18.4), *0601 (5.2), *0602 (5.2), *0603 (10.5).
Conclusión. En el presente trabajo se demostró que existen alelos individuales del
MHC clase II DQ y DQ con frecuencias menores a lo observado entre el grupo
sano.
Palabras clave: Artritis crónica juvenil, complejo mayor de histocompatibilidad,
polimorfismos, reacción en cadena de la polimerasa, oligonucleótidos.
6
ABSTRACT
Juvenile idiopathic artritis includes a phenotypically heterogenous chronic
childhood arthropathies. The most common subtypes of juvenile chronic arthritis
(JCA) defined by the American College of Rheumatology are the pauci or
oligoarticular, polyarticular and systemic arthritis. Genetic and enviromental factors
are believed to play a role in the susceptibility to JCA. Genetic studies have
focused on the understanding the contribution of polymorphisms in the major
histocompatibility complex (MHC) to JCA susceptibility. The MHC region located
on chromosome 6 includes more than 200 genes, many of them are essential to
the immune system. Associations and linkage between MHC and JCA are still
recognizing. JCA is influenced by MHC class II alleles and efforts continue to
identify these alleles in different ethnic populations around the world. In the present
study our objective was to identify the MHC class II alleles (DQ region) using the
polymerase chain reaction (PCR) technique, with sequence specific-primers in
combination with the restriction fragment length polymorphisms (RFLP) in Mexican
mestizo children with JCA.
Patients and methods. Using a cross-sectional design, we typed 38 patients with
JCA and 54 ethnically matched unrelated controls for MHC class II (DQA and
DQB) genes by PCR methods. Demographic, clinical and laboratory data were
registered. Parametric analysis was used for comparison among means. For
categoric variables we used chi square and exact test.
7
Results. There were 23 (61%) women with a mean age of 16±5 years at disease
evaluation and evolution of 5±5 years. More frequent MHC class II allele were as
follows: DQ1: *0101 (6.6), *0102 (10.5), *0103 (2.6), *0104 (5.3), *0201 (2.6),
*0301 (30.3), *0302 (3.9), *0401 (18.4); DQ2: *0102 (2.6), *0103 (2.6), *0201
(2.6), *0301 ( 23.6), *0401 (23.6), *0501 (39.4); DQ1: *0101 (13.2), *0201 (26.3),
*0301 (31.5), *0302 (36.8), *0402 (2.6), *0501 (2.6); DQ2: *0201 (2.6), *0302
(26.3), *0402 (26.3), *0501 (18.4), *0601 (5.2), *0602 (5.2), *0603 (10.5).
Conclusions. In the present work we have demonstrated that individual alleles in
the MHC class II are less frequent among JCA patients when compared with
healthy controls.
Key words: Juvenile chronic arthritis, histocompatibility major complex,
polimorphisms, polymerase chain reaction, specific sequencing primers.
8
Introducción
La artritis crónica juvenil (ACJ) comprende un grupo
heterogéneo de
enfermedades de etiología desconocida que aparece en la infancia. La prevalencia
estimada en EUA es de 0.16-0.43/1000 niños. La incidencia anual de ACJ varía de
0.12 a 139/1000 niños con edades entre 1 a 16 años (Benjamín CM, 1990;
Kaipiainen-Seppanen O et al. 2001). En México la prevalencia aproximada es 2
casos por cada 100000 habitantes, con una incidencia anual de 0.7 a 0.8 casos
por 100,000 habitantes. Varios subtipos de la enfermedad han sido identificados,
siendo el más común el oligo o pauciarticular (45% de los casos), la variedad
poliarticular seronegativa sucede en el 25% de todos los casos, la poliarticular
seropositiva en el 7% y aproximadamente un 23% de casos son considerados de
presentación sistémica (enfermedad de Still).
Se desconoce la etiología de la ACJ, pero es probable que intervengan diversos
factores que predisponen a su expresión, tanto de origen genético como factores
ambientales (Benjamín CM, 1990; Grom AA, et al. 1994; Woo P, et al. 1998).
Algunos estudios han implicado la participación de agentes infecciosos en
particular de origen viral como desencadenantes de la ACJ. Asimismo se han
asociado a otros antígenos bacterianos (Lipnick RN, et al. 1990). Sin embargo, a
nivel mundial no existe consenso sobre el verdadero papel de estos agentes
infecciosos en la génesis de la ACJ. El avance en el conocimiento sobre genética
molecular ha permitido establecer asociaciones genéticas en los grupos de niños
con ACJ. La región más extensamente estudiada del genoma ha sido el complejo
9
principal de histocompatibilidad (MHC-HLA), varios productos de este grupo de
genes se encuentran involucrados en la presentación y procesamiento de
antígenos (Nepom B, 1991). Diversos estudios han revelado frecuencias mayores
en la expresión de genes del MHC a lo normal en subgrupos de pacientes con
ACJ. La escasez de afectación en pares en una hermandad en la ACJ ha
dificultado el abordaje genómico completo, pero una combinación de abordajes
(escrutinio genómico y genes candidatos) ayudaría a aclarar las asociaciones
alélicas con el riesgo de ACJ. Datos también en estudio incluyen la participación
de genes relacionados a citocinas (Nepom B, 1991).
En el presente trabajo nos hemos propuesto identificar mediante metodología
molecular (reacción en cadena de la polimerasa -PCR-, utilizando secuencias de
primers –oligonucleótidos- específicos) la frecuencia de los genes del MHC clase II
(HLA-DQA, -DQB) presentes en un grupo de pacientes con ACJ, y compararlos
con aquellas frecuencias que se observan en individuos sanos. La mejoría en la
precisión del mapeo genético de los loci del HLA permite incrementar el número
de
genes
involucrados
en
las
enfermedades,
además
de
establecer
especificidades de asociaciones clínicas con alelos separados.
10
Antecedentes
Artritis Crónica Juvenil. Generalidades. La ACJ es una enfermedad idiopática,
de carácter inflamatorio con diversos síntomas clínicos tanto al inicio como durante
el curso de la enfermedad que afecta a individuos menores de 16 años. En
Estados Unidos de América (EUA) la ACJ afecta aproximadamente 60000 a
200000 niños, prevalencia de 30 a 150 casos por 100000 habitantes. En este
mismo país la incidencia anual por 1000 niños con edades entre 0-16 años varía
de 0.12 a 0.139 (Falcini F, 2000; Ilowite 2002). Para los países de la comunidad
europea existe un amplio rango de incidencia: de 1.3 a 22.6 por 100000 niños
menores de 16 años (Andersson Gäre B, 1999). De diversos estudios
epidemiológicos europeos (Benjamín 1990, Glass 1999, Kaipiainen-Seppanen O
et al. 2001) se desprende una tendencia a un mayor gradiente de incidencia en
países del norte respecto a países del sur. En Latinoamérica, de un estudio
realizado en Costa Rica, la incidencia es de 6.8 por 100000 habitantes niños
(Arguedas O, et al 1998).
La prevalencia de ACJ también muestra una gran
variabilidad que va de 8 a 400 casos por 100000 niños menores de 16 años. En
nuestro país no se conocen datos precisos acerca de la prevalencia de la
enfermedad. Sin embargo, dos estudios a nivel nacional analizan las
manifestaciones clínicas, la forma en que inicia y su evolución de la esta
enfermedad (Hernández-Ochoa, et al. 1988, Orozco-Alcalá, et al. 1989). Las
edades del inicio de la enfermedad para ambos grupos fue similar siendo de 2 a
15 años, con predominio del género femenino. La forma de inicio más común de
11
esta enfermedad fue la poliarticular (cualquiera de sus subtipos) seguida de la
oligoarticular, siendo la menos frecuente la forma de inicio sistémica.
Clasificación. La ACJ es una enfermedad heterogénea clasificada de acuerdo a su
forma de como inicia según la Liga Internacional Contra el Reumatismo (ILAR). En
función de esta característica existen tres tipos mayores: 1) la variedad oligo o
pauciarticular (donde se afectan 4 o menos articulaciones), 2) el tipo poliarticular
(con 5 o más articulaciones afectadas) y 3) la forma sistémica (conocida también
como variedad de Still). La variedad oligoarticular se subdivide a su vez en los
tipos temprano y tardío, también llamados I y II. La forma poliarticular también
puede presentarse en dos variedades, basados en la presencia o no del factor
reumatoide (FR) (FR-isotipo IgM), de ahí encontramos pacientes con ACJ -FR
positivo (seropositiva) o ACJ -FR negativo (seronegativa). Asimismo, se incluyen
el síndrome entesitis artritis, la artritis psoriásica y un grupo que incluye variedades
de ACJ que no logran ser clasificables (Cassidy JT, 1986; Woo P, 1998; Ilowite
NT, 2002)
Aspectos clínicos de la Artritis Crónica Juvenil.
Artritis Oligoarticular. Este tipo de ACJ es la forma de presentación inicial más
común comprendiendo hasta el 45% de los casos del total de ACJ. Los primeros
signos de la enfermedad oligoarticular pueden ser insidiosos, incluyendo fatiga,
rigidez matinal. La articulación afectada más frecuentemente son las rodillas, la
cual puede estar inflamada sin dolor. Existen pocos datos clínicos sistémicos en
esta variedad, con un mayor riesgo de presentar uveítis de la cámara anterior del
12
ojo. Hasta un 50-75% de los pacientes presentan un resultado de anticuerpos
antinucleares positivo.
Artritis Poliarticular con FR-negativo. Se establece en 30-40% de los casos con
ACJ afectando principalmente a las niñas (4:1)(Thomas E, et al 2000; Woo P
1998), ocurre a cualquier edad con picos entre 1 a 3 años y 8 a 10 años. Puede
acompañarse de manifestaciones sistémicas como fiebre de bajo grado, fatiga,
anorexia y rigidez matinal. El patrón de afección articular es poliarticular, aditivo,
simétrico. La destrucción articular es progresiva si no se trata a tiempo, resultado
en incapacidades físicas y deformidades articulares prominentes.
Artritis Poliarticular con FR-positivo. Contrario a lo que ocurre en la ACJ FRnegativo, el grupo de pacientes con esta variedad es más homogéneo y
comprende del 7-10% del total de casos con ACJ. La mayoría de los pacientes
también son mujeres y la presentación clínica es indistinguible de la forma de
presentación en el adulto de la clásica artritis reumatoide (AR), en la cual existe un
severo proceso erosivo con artritis debilitante, simétrica que afecta a grandes y
pequeñas articulaciones (Falcini F, et al 2000). A diferencia de los adultos en esta
variedad de ACJ pocos eventos extrarticulares son apreciados.
Artritis Sistémica (Enfermedad de Still). Hasta un 23% de casos de ACJ pueden
presentarse bajo la forma sistémica que afecta por igual a niños y niñas. En la
presentación de este tipo se incluyen predominantemente síntomas y signos
generales que obligan al clínico a establecer un protocolo de diagnóstico donde
13
datos como fiebre en picos (hasta 38ºC), la presencia de un eritema rosado,
maculo-papular, migratorio, evanescente, así como la presencia de artritis que
puede llegar a ser severa y habiendo descartado otras entidades patológicas
hacen el diagnóstico (Woo P, 1998).
Tratamiento de la artritis crónica juvenil. El manejo de la ACJ incorpora los
esfuerzos coordinados de un equipo interdisciplinario de profesionales al cuidado
de la salud. Los objetivos terapéuticos incluyen: alivio de los síntomas,
mantenimiento de la función articular y la fuerza muscular, prevención del daño
anatómico, optimizar el estado funcional, incorporar al paciente a la vida
productiva y la dinámica familiar. El tratamiento es dividido en componentes
físicos, sociales y farmacológicos. El manejo con medicamentos está dirigido a
tratar manifestaciones articulares y sistémicas de la enfermedad. El uso de
antinflamatorios no esteroideos es uno de los primeros pasos y en su uso habrá
que tomar en cuenta los efectos colaterales que éstos ocasionan. De los
medicamentos que modifican el curso de la enfermedad, el metotrexate es el más
ampliamente estudiado y utilizado (Falcini F, et al. 2000). Otros agentes
modificadores del curso de la enfermedad incluyen el uso de la sulfasalazina,
leflunomida y más recientemente el manejo con medicamentos biológicos del tipo
del etanercept. Otras complicaciones severas que colocan al pacientes en riesgo
de morir pueden ser manejadas con corticoesteroides, sin embargo la alta
frecuencia de los eventos indeseables y la carencia de evidencias de que estos
medicamentos alteren el curso natural de la enfermedad hacen contrapeso en su
14
uso rutinario en la ACJ (Singsen BH, et al. 1997; van Rossum MAJ, et al. 1998;
Cron RQ, et al. 1999; Ilowite NT, et al. 2002 ).
Etiología, Fisiopatología e Inmunología de la ACJ. El papel de la autoinmunidad en
la etiología de la ACJ es poco claro, pero numerosos estudios han demostrado
claramente las anormalidades inmunológicas en esta enfermedad. La respuesta
inmune patogénica involucra la interacción del receptor de células T o de los
linfocitos promotores de la enfermedad que reconocen antígenos peptídicos
particulares que son presentados en el contexto de las moléculas que participan
en el MHC. El polimorfismo de las moléculas del MHC permite que sean
reconocidos los péptidos antigénicos que serán eficientemente presentados
(Abbas AK, et al 1999, Cortes-Prieto L, 1999). El reconocimiento del antígeno lleva
a la proliferación de linfocitos con especificidad de receptor para el MHC. Uno de
los resultados es la liberación de enzimas proteolíticas y citocinas inflamatorias
que reclutan otras células, incluyendo macrofágos y linfocitos B en el tejido
dañado (Figura 1). El tejido sinovial inflamado es caracterizado por una marcada
infiltración mononuclear, donde predominan los linfocitos T CD4+. En estrecha
relación a esta población de linfocitos se encuentra las células dendríticas que
expresan altos niveles de genes del MHC (antígenos de histocompatibilidad –HLA) (Grom A, et al. 1994). Diferentes hallazgos histopatológicos característicos en
articulaciones enfermas apoyan este concepto, así como la fuerte asociación
existente entre las diferentes formas de ACJ y ciertos genes relacionados al MHC.
15
Figura 1. Diagrama que representa la inmunoregulación que se
desarrolla durante la enfermedad de artritis crónica juvenil
Agentes Infecciosos
Factores Ambientales
Factores Genéticos
Proliferación de células B
Células T
Diferenciación de celulas B
Factor reumatoide
Producción de anticuerpos
Anticuerpos antinucleares,
Autoanticuerpos
Antígenos
Complejos Inmunes
Depósito en Tejidos
Patología
Activación de complemento sérico
Liberación de aminas vasoactivas
Leucotrienos
16
El Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y Antígenos leucocitarios
humanos (HLA). El MHC es una región de genes altamente polimórficos cuyos
productos son expresados en una gran variedad de células. Las proteínas
codificadas en el MHC, son comúnmente llamadas moléculas del MHC o
antígenos MHC. Este locus fue descrito en la década de los años 40 gracias a los
trabajos de Snell y Dausset. Posteriormente, son Benacerraf y McDevitt quienes
describen la importancia fisiológica de las moléculas del MHC en la respuesta
inmune (McDevitt HO, et al. 1968; Terasaki PI, et al. 1978). Zinkernagel y Doherty
a finales de los años 70 demuestran que los linfocitos T no reconocen antígenos
en una forma soluble o libre sino que lo hacen a través de péptidos unidos en
forma no covalente a la moléculas del MHC, en otras palabras las moléculas del
MHC ofrecen un sistema que permite la presentación de antígenos de naturaleza
peptídica a las células T (Zinkernagel RM. 1979). Los científicos Bjorkman y Brown
y colaboradores, en la década de los 80 y 90 respectivamente, describen las
estructuras moleculares del MHC clases I y II (Bjorkman 1987, Brown 1993).
En los trabajos de diversos investigadores (McDevitt HO, et al. 1968; Terasaki PI,
et al. 1978) notaron que los pacientes que rechazaban tejido renal o presentaban
reacción a trasfusiones sanguíneas frecuentemente desarrollaban anticuerpos
circulantes contra antígenos presentes sobre la superficie de los leucocitos de la
sangre u órgano donado, se desarrolló el término de antígenos leucocitarios
humanos (HLA), que en la actualidad es conocido como el MHC humano. El grupo
total de alelos del MHC presente en cada cromosoma es denominado como
17
haplotipo del MHC; y cada alelo del MHC tiene una designación numérica (Abbas
A, 1999).
Localización y clasificación del MHC. El MHC humano contiene más de 200 genes
en aproximadamente 4 MB de ADN. Codificado en el brazo corto del cromosoma 6
(6p21.3), representa aproximadamente el 1% del genoma. Los genes de
antígenos de histocompatibilidad codificados dentro del MHC forman los tipos
tradicionales del HLA que se subdividen en clases I y II. Los genes clase I del HLA
se encuentran en la región telomérica del MHC y existen por lo menos 6 bien
caracterizados locus de esta clase de antígenos, que se asocian a los principios
antigénicos de trasplantes en humanos y que se expresan en toda clase de
células nucleadas humanas (HLA-A, -C y –B). Por otro lado, para antígenos clase
II del HLA, que se extiende aproximadamente 800kb se han identificado hasta 14
diferentes locus, dentro de tres subregiones mayores denominadas HLA-DR, -DQ,
y –DP. Cada una de estas subregiones contiene por lo menos un locus funcional
beta () y un alfa (), así como genes y pseudogenes adicionales de función no
precisada. La subregión del –DR contiene un solo gene A y múltiples genes B. Se
conocen actualmente nueve locus HLA-DRB, que se denominan DRB1 al DRB9.
La subregión del –DQ contiene los genes DQA1 y DQB1, y los pseudogenes
DQA2, DQB2 y DQB3. La cadena es el determinante o antígeno principal de
una molécula de DQ. En la región del DP se contienen los genes DPA1 y DPB1
así como los pseudogenes DPA2 y DPB2. Por extensión, existe una región
denominada clase III, que comprende un grupo heterogéneo de moléculas y a sus
18
genes localizados en la misma región cromosómica. Estas moléculas tienen
diversas funciones que no se relacionan directamente con la respuesta inmune
(Figura 2).
Figura 2. Representación esquemática de la localización de los
genes del MHC en el brazo corto del cromosoma 6
<centrómero
DP
telómero>
DQ
DR
C4 TNF Hsp70
B
C
A
Estructura de las moléculas del MHC.
HLA clase I. Todas las moléculas clase I contienen dos cadenas polipeptídicas
separadas: una cadena pesada o cadena  de aproximadamente 44 kD y una
cadena (no codificada en el MHC) de 12kD. La cadena es formada por un
centro polipeptídico de 40kD que contiene un oligosacárido en la región amino
terminal. La cadena interactúa en forma no-covalente con la porción extracelular
de la cadena pesada y no directamente con la células. Basados en las secuencias
de aminoácidos primarios y la estructura cristalográfica de las porciones
19
extracelulares de las moléculas de clase I, ésta ha sido dividido en 4 regiones:
una región amino-terminal extracelular (región de ligamiento del péptido); una
región
parecida
a
la
estructura
de
las
inmunoglobulinas;
una
porción
transmembrana y otra citoplásmica .
HLA clase II. Las moléculas de clase II están compuestas de dos cadenas de
polipéptidos asociadas en forma no-covalente. La cadena de 32 a 34kD es
ligeramente más grande que la cadena (29 a 32kD). Ambas cadenas contienen
grupos de oligosacáridos en la región amino terminal; la región aminoterminal es
de localización extracelular y la región carboxiterminal intracelular, dos tercios de
cada cadena se identifican en el espacio extracelular. Las 2 cadenas de las
moléculas clase II se codifican en diferentes genes del MHC. Así como las
moléculas de clase I, las de clase II tienen diferentes regiones: el sitio de unión al
péptido, la región parecida a la inmunoglobulina, y las regiones transmembrana y
citoplásmica. Los antígenos clase II del HLA son extremadamente polimórficos y
esto podría significar que cuando un marcador se asocia a una determinada
enfermedad, la susceptibilidad genética estaría dada por el mismo marcador o un
gene estrechamente relacionado al mismo en virtud de desequilibrio de ligamiento
(Abbas AK, 1999).
Presentación de antígenos por las moléculas del MHC clase II. La presentación de
antígenos que alcanzaron una célula presentadora de antígenos (APC)
extracelularmente es generalmente a través de las moléculas del MHC clase II.
20
Estos antígenos exógenos incluyen proteínas sintetizadas
por bacterias
extracelulares, hongos parásitos, así como proteínas administradas durante las
inmunizaciones (Marks 1998). La fase inicial en la presentación de antígenos
exógenos es la unión de la proteína nativa a una APC. Existen diferentes tipos de
APC con especificidades y eficiencias particulares. Algunas APC unen antígenos
de manera no específica, sin embargo, otras modulan la internalización mediante
receptores específicos, como las porciones Fc de las inmunoglobulinas o los
receptores para el fragmento C3b del complemento. Poco tiempo después de que
los antígenos se unen a las APC, entran a la célula por fagocitosis o por
endocitosis mediada por receptores de superficie en vesículas recubiertas. Los
antígenos proteicos solubles también se adentran a la célula por un proceso de
pinocitosis sin tener que unirse primero a la superficie. Tales antígenos se
localizan posteriormente en membranas intracelulares unidas a vesículas
denominadas “endosomas” (Weenink SM, 1997).
Para
que
ocurra
una
presentación
antigénica
eficiente
varios
eventos
intracelulares ocurren simultáneamente. La proteína monomórfica denominada
“cadena invariante Ii” actúa como molécula “chaperona” ya que se une a los
heterodímeros clase II que se formaron en el retículo endoplásmico y los conduce
hacia los endosomas. Durante el transporte, la cadena Ii previene la asociación del
heterodímero con péptidos inespecíficos. Una vez que el complejo llega al medio
ácido de los endosomas, la cadena Ii se degrada proteolíticamente y se disocia el
complejo, dejando el sitio libre para unirse a un péptido antigénico derivado de
proteínas exógenas (Malcherek G, 1998). El último fragmento de la cadena Ii se le
llama CLIP y es removido físicamente con la ayuda de otra molécula del MHC
21
llamada DM (Kropshofer H, 1996). La interacción de la molécula DM con el
heterodímero clase II ayuda también al ensamblaje rápido de péptidos de alta
afinidad al surco (Kenty G, 1998). El complejo con el péptido sale del
compartimiento endocítico para presentar el péptido a los linfocitos T CD4+ en la
superficie.
Las subunidades y  de las moléculas clase II se unen entre sí de una forma no
covalente poco tiempo después de haberse formado en el retículo endoplásmico.
La cadena Ii también se oligomeriza, formando complejos homotriméricos con
puentes disulfuro intercatenarios cerca de su porción citoplásmica. Cada uno de
los trímeros de Ii se une a 3 cadenas - clase II. Una vez ensamblados los
nonámeros de este complejo, este es transportado al aparato de Golgi para su
glucosilación y sialización terminales (Kropshofer H, et al. 1996).
Para que las moléculas clase II se puedan unir al antígeno, la cadena Ii tiene que
ser liberada mediante un corte proteolítico en los lisosomas. Los primeros
productos formados durante el corte de la cadena Ii incluyen polipéptidos
inducidos por leupeptina (LIP) de 21KD y péptidos pequeños inducidos por
leupterina (SLIP) de 11 kD. Los fragmentos de LIP incluyen las partes
citoplásmicas y transmembranales de la cadena Ii y los fragmentos SLIP son
precursores del CLIP (Sanderson F, et al. 1994). La molécula CLIP se degenera
ya que puede unirse a diferentes moléculas del MHC. Está unión es débil, lo que
asegura su fácil liberación para que posteriormente se una a un péptido (Weenink
SM, 1997).
22
Antes de que los antígenos sean presentados deben ser procesados. Las enzimas
involucradas en este proceso son las de los compartimientos ácidos endocíticos,
proceso en el cual se ven involucradas las hidrolasas lisosomales. Una vez que se
ha internalizado la proteína, esta viaja a través de medios cada vez más ácidos
desde los endosomas tempranos hasta los tardíos y luego a los lisosomas.
La mayoría de las moléculas clase II están localizadas en la célula dentro de los
compartimientos denominados “compartimientos MHC clase II”, ácidos y ricos en
heterodímeros clase II y en moléculas DM, a donde llegan los antígenos por medio
del receptor de membrana. Enseguida, otras vesículas se encargan de transportar
los complejos clase II hacia la superficie de la célula (Cresswell P, 1994; Weenink
SM y Gamautam AM 1997)
Genes del MHC asociados a enfermedades autoinmunes y reumáticas sistémicas.
La motivación para los estudios de asociación entre el HLA y las enfermedades de
origen autoinmune y particularmente reumáticas sistémicas ha sido la mejor
comprensión de nuestro conocimiento general sobre la susceptibilidad conferida
por el HLA al desarrollo de estas enfermedades. Este conocimiento ayudará en la
práctica clínica al diagnóstico, categorización y predicción de las complicaciones
de este tipo de enfermedades.
Estudios iniciales entre las poblaciones de pacientes con ACJ, determinaron que
el perfil de los antígenos del MHC era diferente al que se presentaba entre adultos
con AR y controles sanos (Fink CW, et al 1995). A partir de ese momento se han
realizado diferentes esfuerzos por tratar de identificar genes y polimorfismos
específicos del HLA que predisponen al desarrollo de la ACJ. Diferentes estudios
23
apoyan la asociación entre ciertas formas de ACJ y genes del MHC (veáse Cuadro
1). La ACJ tiene un fondo genéticamente diferente a lo que se observa en el
adulto, en la mayoría de los casos de ACJ los marcadores de susceptibilidad del
MHC no residen en el mismo haplotipo.
En la ACJ de inicio pauciarticular que en su evolución cursa bien sea como
enfermedad poliarticular o pauciarticular la asociación mayor es con DPB1*0201 y
DPB1*0301, en el caso de la evolución poliarticular con presencia de factor
reumatoide positivo. Otros estudios han establecido asociación con DR8 y DR5. El
alelo DR8 es usualmente ligado al alelo DQB. El locus DQ puede modular la
enfermedad, estableciéndose la asociación de DQA1*0101 con la presencia de
artritis erosiva y uveítis crónica otros alelos involucrados son: DQA1*0401, 0501,
0601, 0103 y en DQB1*0301, 0402 y 0603. La baja frecuencia de los alelos DR4,
DR2 y DR7 en la variedad pauciarticular parece jugar un papel protector al
desarrollo de la enfermedad.
En la ACJ de inicio poliarticular con factor reumatoide negativo, existe una baja
frecuencia de DR4 y en contraste frecuencia incrementada de DR5, DR6, DR8.
Dentro de este grupo de inicio oligoarticular con factor reumatoide negativo con
características clínicas similares a la AR del adulto con FR positivo, adquieren
particular importancia los alelos DR1 y DR4 sin embargo DR8 (DRB*0801) es más
frecuente. En el grupo de ACJ poliarticular con FR positivo, que clínicamente es
muy similar a la enfermedad del adulto el DR4 es común (hasta el 60% de los
casos) con frecuencia incrementada del DRB1*04. Finalmente en la variedad
sistémica las asociaciones con los genes del MHC-HLA son variables, destacando
24
la presencia del DR4, en la población con enfermedad severa (Murray KJ 1999,
Oen K 1998).
Sin embargo, a pesar de las posibles asociaciones del HLA y la susceptibilidad al
desarrollo de los diferentes subtipos de ACJ es importante tomar en cuenta:
primero, que la definición de los criterios de inclusión varía ampliamente entre los
diferentes estudios; segundo, las variabilidades étnicas y geográficas de los
pacientes y sus controles; tercero, la tipificación de los genes del HLA ha
evolucionado y sufrido cambios importantes en la última década. Esto último va
desde la capacidad inicial de tipificar sólo antígenos de clase I por serología,
progresando a la tipificación serológica de los antígenos de clase II, más adelante
a la tipificación celular utilizando cultivos mixtos de linfocitos, para llegar a las más
recientes técnicas basadas en abordaje molecular a partir del ADN (Terasaki PI,
et al 1978; Erlich HA, et al, 1991; Bidwell J, 1994).
25
Cuadro 1. Artritis crónica juvenil. Subgrupos clínicos y
asociaciones con el MHC-HLA*.
Subtipo de ACJ
Asociación con HLA
Asociación con HLA
(variedad clínica)
(susceptibilidad)
(protección)
Oligoarticular
DQA1*0401, 0601
DRB1*07
DQB1*0301, 0402
DQA1*0201
DRB1*08, 11
Poliarticular, FR negativo,
DRB1*11,
Aan positivos
DQA1*0101,0102
Poliarticular, FR negativo,
DRB1*14
Aan negativos
DQB1*0301, 0302
Poliarticular, FR positivo
DRB1*04
DQB1*0301,0302,0402
Sistémica ( de inicio)
DRB1*0401
DRB1*13
DQA1*0103,0201,0501
DQB1*0603
Sistémica (evolución)
DQB1*0301, 0303
DRB1*13
* Prieur AM et al. 12° Taller Internacional de Histocompatibilidad (1996).
Abreviaciones: FR (factor reumatoide), Aan (anticuerpos antinucleares).
26
Importancia del estudio molecular del MHC clase II. Métodos de tipificación del
HLA. Las moléculas de clase II del MHC son participantes claves de los eventos
de activación inmune en la autoinmunidad, así como en la respuesta inmune
normal. Los polimorfismos entre los alelos de las moléculas clase II resultan
cruciales en al menos dos eventos de la activación inmune: primero, el
polimorfismo de los aminoácidos de las moléculas clase II determina la
especificidad o no de los péptidos antigénicos que serán presentados sobre la
superficie de la célula presentadora de antígenos al receptor de la célula T.
Segundo, este polimorfismo regula el desarrollo de la selección de la especificidad
al receptor de la célula T durante el proceso de diferenciación y maduración de la
célula T en el timo. Es a partir de estos dos eventos básicos que las moléculas
clase II del MHC controlan los aspectos de competencia inmune y activación
periférica (Abbas AK, 1999).
En las moléculas clase II del MHC localizadas en el brazo corto del cromosoma 6,
la metodología utilizada en su identificación sólo determina regiones del exón 2,
que son los determinantes del polimorfismo (Olerup O et al, 1992, 1993).
Novedosas metodologías moleculares en la tipificación del polimorfismo de
proteínas clase II del MHC, representan un avance en
términos del costo-
beneficio. Por otro lado, el polimorfismo de los genes clase II depende
principalmente de las regiones –DRB, -DQA, -DQB. Regiones que se han visto
asociadas a un incremento en el riesgo relativo de un gran número de
enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico,
esclerosis sistémica progresiva) que tienen alta prevalencia en la población
27
(Nepom GT, 1991). La identificación de moléculas –DQA y –DQB particularmente,
es útil como referencia para estudios poblacionales, y el trasplante de tejidos.
Métodos de tipificación del HLA. En las últimas dos décadas, la tipificación del
HLA se ha hecho más sofisticada, esto es particularmente importante desde el
advenimiento e introducción de técnicas de biología molecular para la
discriminación entre los genes del HLA clase II estrechamente relacionados. Los
avances en la metodología de la tipificación han permitido identificar haplotipos
específicos y en algunos casos genes individuales que asocian al HLA con las
enfermedades autoinmunes (Nepom y Erlich, 1991).
En el curso de la historia de la tipificación de los genes del HLA se han utilizado
métodos serológicos, bioquímicos, de reconocimiento de los linfocitos T, siendo en
la actualidad reemplazados por la tipificación del ADN.
El espectacular avance en el desarrollo de métodos moleculares de tipificación del
HLA basados en la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha
llevado a clarificar la diversidad de los alelos y haplotipos relacionados. Entre los
métodos moleculares de detección del HLA destacan, los polimorfismos de
longitud con enzimas de restricción (RFLP’s), adoptada ampliamente en 1988, sin
embargo desplazados actualmente por métodos de PCR (Bidwell 1994). Los
métodos que emplean la técnica de la PCR, son: 1) La tipificación a partir de
secuencias específicas de oligonucleótidos (PCR-SSO). Este procedimiento
implica la hibridización de un panel de secuencias específicas de primers (SSP)
dirigidas a secuencias blanco de productos de ADN amplificados por PCR. Las
secuencias blanco son normalmente amplificadas a partir de exones polimórficos
28
de los genes del HLA (el exón 2 para los genes HLA clase II). Esta metodología
del PCR-SSO para HLA ha sido implementada y estandarizada desde 1990. 2)
Técnicas basadas en electrofóresis incluyen: a) el análisis de productos de PCR
por RFLP’s, que utiliza un panel de endonucleasas de restricción que digieren los
productos amplificados por la PCR previo al análisis por RFLP en gel de agarosa o
acrilamida. b) PCR de un paso con primers de secuencias específicos (PCR-SSP),
método que deriva de los sistemas de amplificación de productos de mutación
refractarios y que ha sido particularmente apropiado para su aplicación en la
tipificación de transplante de órganos de donadores cadavéricos, dado que es una
prueba rápida (dos horas) (Ota M et al, 1991; Olerup O et al, 1992, 1993). Una
derivación de esta prueba de PCR-SSP es la denominada PCR-SSP “anidada”. 3)
Análisis conformacionales, al final de cada ciclo de PCR un proporción del ADN
generado puede existir en forma no-homoduplex, bien sea de cadena sencilla o de
doble cadena, estos artefactos producidos en el realineamiento del proceso de la
PCR posee formas conformacionales que son específicas para alelos individuales
o haplotipos del HLA .
Muchos de estos métodos utilizados en la tipificación de los genes clase II del HLA
permanecerán probablemente como herramientas de referencia o investigación,
algunos de estos incrementaran su filtración hacia los escenarios clínicos en la
forma de reactivos o equipos.
La contribución del avance en los nuevos métodos en la tipificación molecular del
HLA tanto a la histocompatibilidad como a la inmunogénetica, tanto en el nivel
básico como en el clínico, continúa siendo notable y muy importante.
29
Planteamiento del Problema
El advenimiento y desarrollo de la metodología molecular en la identificación y
tipificación de los alelos de los genes del MHC, particularmente aquellos
relacionados a la clase II, representa un avance importante en la búsqueda de una
asociación con susceptibilidad a la expresión clínica de diversas enfermedades.
De las enfermedades relacionadas al HLA destacan las de origen autoinmune y en
particular las enfermedades reumáticas sistémicas. La ACJ constituye una de
estas últimas enfermedades, donde dada la diversidad de síndromes clínicos en
que se manifiesta y la controversia en relación con diferentes alelos de los genes
clase II del HLA resulta de interés describir las frecuencias alélicas de dichos
genes en particular en nuestra población de pacientes con ACJ. Por otro lado,
hasta donde se tiene conocimiento no existen estudios que describan la frecuencia
de alelos de genes clase II del MHC en población mexicana con ACJ, cuando
estos genes son tipificados utilizando métodos moleculares.
De ahí nuestra pregunta: ¿cuál es la frecuencia de los alelos de los genes clase II
del MHC en pacientes mexicanos con ACJ?
30
Justificación
La utilización de métodos moleculares en la determinación de alelos de los genes
del MHC, representa avances en la sensibilidad para identificar variaciones de
secuencias y disminuir significativamente las reacciones cruzadas entre los alelos.
Es por ello que actualmente se han adoptado cada vez con mayor aceptación
técnicas de ADN para el análisis de estos genes.
Estudios moleculares de la frecuencia de genes clase II del MHC, particularmente
los sitios HLA-DQA, -DQB en pacientes con ACJ son necesarios para tratar de
establecer posibles diferencias entre los diversos síndromes clínicos en los que se
expresa esta enfermedad.
Finalmente, se desconoce la epidemiología molecular de los genes clase II del
MHC entre pacientes con ACJ y cuál es el peso que los factores de tipo
inmunogenético juegan en la expresión de esta artropatía en nuestro medio.
Conociendo más acerca de la participación de genes del HLA en la expresión de
enfermedades como la ACJ, tendremos oportunidad de acercarnos a comprender
cómo un huésped susceptible en asociación con factores ambientales y otros
desconocidos desarrolla esta enfermedad, que tiene un impacto directo en
diversas áreas del desarrollo de un individuo.
31
Objetivos
 El objetivo general esta tesis es el de Identificar mediante reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores de secuencias
específicos (SSP) y polimorfismos de longitud mediante enzimas de
restricción (RFLP) los alelos correspondientes a los genes de las moléculas
clase II del sistema HLA (locus –DQA y –DQB) en pacientes con artritis
crónica juvenil. Teniendo como objetivos particulares:
 Determinar la frecuencia alélica de los genes clase II del MHC (HLA -DQA, DQB) en pacientes con artritis crónica juvenil.
 Comparar las frecuencias alélicas obtenidas de la población de pacientes
con artritis crónica juvenil con aquellas referidas a la población general.
 Estimar los riesgos relativos para el desarrollo de la ACJ de los alelos de
los genes clase II del MHC.
 Desarrollar la metodología molecular en la tipificación de los genes clase II
del MHC.
32
Material y Métodos
Tipo de estudio: Transversal, descriptivo, analítico. Universo de estudio: Pacientes
con diagnóstico de ACJ. Sujetos sanos como controles de comparación. Criterios
de Inclusión: Pacientes con diagnóstico de ACJ, evaluada en base a los criterios
del Colegio Americano de Reumatología 1987 (Cassidy JT, et al 1986) y que
voluntariamente acepten participar en el estudio. Criterios de no inclusión:
Pacientes con manifestaciones articulares que no reúnan criterios de diagnóstico
de ACJ. Criterios de exclusión: Casos en los que no se obtengan los datos clínicos
completos o no se pueda obtener una tipificación completa. Tamaño de la
muestra: Un tamaño de muestra considerado como mínimo para estimar
correctamente alelos con frecuencia mayor al 5% es de 60 cromosomas, lo que
equivale a estudiar a 30 individuos (Chakraborty R, 1992a).
Pacientes. En todos los casos, se solicitó el consentimiento informado para
participar en el estudio en forma voluntaria de parte de los pacientes y en caso de
ser menores de edad se sometió a consideración del padre o tutor (veáse Anexo
2). La población de estudio incluyó 40 pacientes de los servicios de consulta
externa de Reumatología, del Hospital General de Occidente de la Secretaría de
Salud, del OPD Hospital Civil de Guadalajara “Fray Antonio Alcalde” y “Juan I.
Menchaca” así como del Departamento de Pediatría del Centro Médico Nacional
de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social, que reunían los criterios
33
del Colegio Americano de Reumatología para ser considerados como portadores
de ACJ (Cassidy JT et al, 1986). El cuadro clínico de presentación inicial se
clasificó de acuerdo a: oligo/pauciarticular (<4 articulaciones afectadas),
poliarticular (4 ó más articulaciones afectadas) y sistémica (Anexo 3).
Se registraron datos demográficos, incluyendo (edad, sexo, escolaridad, estado
socio-económico), edad de inicio, tiempo de diagnóstico y seguimiento, datos
clínicos extrarticulares, índice de actividad articular (adaptado de los índices
utilizados para pacientes adultos con AR, aprobados por el ACR), evaluación
serológica (velocidad de sedimentación globular –VSG-, proteína C reactiva, FRIgM por método de látex y nefelometría, anticuerpos antinucleares) y evaluación
radiográfica de procesos erosivos.
Se incluyeron individuos sanos como controles sin historia familiar de artritis u
otras enfermedades de origen autoinmune.
34
Descripción general de la metodología utilizada.
Diagrama de flujo.
Extracción de ADN
Cuantificación y Dilución del ADN
Tipificación molecular
(PCR-SSP o RFLP)
Electroforesis
Tinción (bromuro de etidio), fotografía
Análisis e interpretación de resultados
35
Técnicas de laboratorio.
Obtención de ADN total a partir de leucocitos de sangre periférica. La muestra de
sangre periférica fue recolectada en tubos con EDTA como anticoagulante, a partir
de lo cual se extraen leucocitos. Para la extracción del ADN, se utilizó uno de los
dos métodos, a) método de DTAB-CTAB (Gustincich S y cols. 1991) también
conocido como micrométodo y que brevemente consiste en: una vez obtenida la
sangre periférica (500 µl –microlitros-), se procede a incubar con amortiguador de
lisis DTAB a 65ºC por 5 min, para añadir 500 mcl de cloroformo al 100% y
proceder a agitación; centrifugación posterior a 13,000 rpm durante 10 min. Se
obtiene la fase superior y se añaden 900 mcl de dH20 y 100 mcl de CTAB al 5%,
se mezcla y se centrífuga 5 min a 10,000rpm. Se procede a resuspender en 300
mcl de NaCL 1.2 M y se añaden 600 mcl de etanol al 100%, centrífugando 5 min.
a 10,000 rpm. Finalmente se elimina el sobrenadante y se lava con etanol al 70%,
resuspendiendo el amortiguador de conservación y almacenando durante 6-12
meses a -20ºC. b) método de fenol-cloroformo o macrométodo, una vez separados
los leucocitos (que pueden ser preservados a -20ºC, por máximo un mes), se
incuba 10 min, a 37ªC con NaCl O4 3.5M. Se añade fenol/Tris y una solución de
alcohol isoamílico-cloroformo 24:1. se mezcla y se centrífuga, recuperando el
sobrenadante. Se agrega nuevamente solución de alcohol-cloroformo 24:1 se
mezcla y se centrífuga. se recupera el sobrenadante y se agrega etanol frío al
100%. se procede a recuperar el ADN y lavar con etanol al 70%. Finalmente se
resuspende en amortiguador de conservación y se pude almacenar durante 12-24
meses (veáse Anexo 4).
36
El
ADN
obtenido
se
cuantifica
en
cuanto
a
su
concentración
por
espectrofotometría y su calidad se valora mediante geles de agarosa (veáse
Anexo 4 y Figura 3).
Genotipificación de alelos HLA clase II, DQ mediante Reacción en Cadena de la
Polimerasa –PCR-. La determinación del polimorfismo alélico de los genes HLA
clase II, -DQA1 y -DQB1 se realizó por el método de amplificación de la PCR
utilizando oligonucleótidos para secuencias específicas (PCR-SSP) y técnicas de
RFLP (polimorfismos de longitud mediante enzimas de restricción). En estas
técnicas, la asignación de alelos se basa, respectivamente, en la presencia o
ausencia de productos amplificados y en la combinación de sitios positivos a
enzimas de restricción y la observación de los fragmentos de diferente longitud. La
identificación se hace en electroforesis en geles de agarosa. Los SSPs y RFLPs
utilizados fueron obtenidos del informe de Olerup O, et al 1993.
Técnica de Primer Secuencia Específico (PCR-SSP). En este método se utilizan
oligonucleótidos (iniciadores) altamente específicos que amplifican el exón 2 de
los genes DQA1, DQB1 del sistema HLA e identifican un alelo o grupo de alelos.
La asignación de alelos esta basada en la presencia o ausencia del producto
amplificado. Para descartar problemas en la amplificación de productos, este
método incluye el uso de un par de iniciadores que amplifican una región del intrón
3, que debe estar presente en todos los individuos y este es el control positivo de
37
la amplificación. Las condiciones completas del procedimiento de amplificación y
su detección se detallan en el Anexo 4.
Técnica de PCR-RFLP. Para distinguir los alelos HLA-DQB1*0302 del *0303 se
amplifica un segmento de 237 pb del exón 2. El segmento amplificado se sometió
a digestión con enzimas de restricción HpaII y Hsp921.
Consideraciones éticas. El proyecto fue previamente evaluado y aprobado por el
Comité de Investigación y Etica del Hospital General de Occidente de la Secretaría
de Salud en Guadalajara, Jal. Todos los participantes del mismo fueron
detenidamente informados del proyecto y su realización aceptando colaborar en
forma voluntaria. El consentimiento por escrito fue obtenido antes de la toma de
muestra sanguínea (Anexo 2).
Manejo estadístico de los datos. Las variantes cuantitativas se esperan con una
distribución normal, por lo que se utilizarán métodos paramétricos en su análisis
(comparaciones de medias, ANOVA). Las variables categóricas se estudiarán
mediante las pruebas de Chi cuadrada y exacta. En la medida en que el número
de casos lo permita, se estratificará la población de enfermos para el análisis
respectivo.
La base de datos y su procesamiento se llevó a cabo utilizando el software SPSS
para Windows versión 8.0 (Chicago, IL. EUA.)
38
Resultados
Características demográficas y clínicas de los pacientes. La edad promedio de los
40 pacientes con ACJ estudiados fue de 16 años (rango 5-25 años) de los cuales
23 fueron mujeres (61%) y el resto hombres (39%). En la mayoría de los pacientes
a media de duración de la enfermedad fue de 5 años ó más, siendo la edad de
inicio de la enfermedad en promedio a los 10 años (rango 2-15 años). Las
variedades clínicas en las que fueron clasificadas se aprecian en el cuadro 2. El
número promedio de articulaciones inflamadas al momento de la evaluación
clínica fue de 6±7. Otros datos clínicos y de laboratorio incluyen: historia de fiebre
en 11/38 (29%), historia del eritema en 6/38 (16%), presencia de nódulos
reumatoides en 8/38 (21%), evidencia de iridociclitis en 2/38 ( 5%). La presencia
de factor reumatoide en 10/38 (26%), positividad para la prueba de la proteína C
reactiva en 33/38 (87%) y anticuerpos antinucleares presentes en 14/38 (37%),
siendo el patrón de fluorescencia más frecuente el moteado fino (11/38). Como
parte del tratamiento una mayoría de pacientes se encontraba recibiendo alguno
de los medicamentos inductores de remisión de la enfermedad (28/38) y el uso de
esteroides en diferentes dosis fue documentado en 11/38 (29%) pacientes.
Grupo Control. Como grupo control se incluyeron 54 individuos que procedían de
familias mestizas, aparentemente sanos participantes de un protocolo de
tipificación de polimorfismos del MHC en población general (Cortés-Prieto L, 1999,
Cortes LM, et al 2004). Todos estos individuos fueron no relacionados entre sí o
no existía historia de consanguinidad.
39
Cuadro 2. Datos demográficos, de laboratorio y clínicos de la población de
pacientes con artritis crónica juvenil
Género femenino
61%
Edad al momento del estudio*
16±5
Edad de inicio*
10±4
Duración de la enfermedad*
5±5
Número articulaciones
Inflamadas*
6±7
Variedades clínicas:
Oligoarticular tipo I n (%)
7 (18%)
Oligoarticular tipo II
10(26%)
Poliarticular seropositiva
10(26%)
Poliarticular seronegativa
7(18%)
Sistémica (Still)
4(11%)
Serología
Factor reumatoide+ (positivo)
10/38 (26%)
Proteína C reactiva¶ (positiva)
33/38 (87%)
Anticuerpos antinucleares§
14/38 (37%)
Especificaciones: * promedios ± desviación estandard; +nefelometría, título
>20U/ml; ¶nefelometría, título >0.8mg/L; §inmunofluorescencia indirecta células
HEp-2, título >1:40; ± desviación estándar.
40
Frecuencia de los alelos HLA-DQA1, -DQA2, -DQB1 y -DQB2 en los pacientes con
ACJ. En el cuadro 3 se muestra la frecuencia global alélica (génicas) de los
diferentes sitios de la región DQ obtenidos en los pacientes con ACJ. Se puede
apreciar que los alelos de mayor frecuencia porcentual para la población con ACJ
fueron: HLA-DQA2*0502 (39.4%), -DQB1*0302 (36.8%), - DQB1*0301 (31.5%), DQA1*0301 (30.3%), y -DQB2*0302, *0402 (26.3 y 26.3% respectivamente).
Frecuencias genotípicas. Los genotipos mayores observados en la población de
estudio, tanto para HLA-DQA como para HLA-DQB se aprecian en los cuadros 4,5
respectivamente. Para HLA-DQA fueron identificados 19 diferentes genotipos,
siendo los de mayor frecuencia HLA-DQA* 0301/0401 (6 veces) y HLA-DQA*
0301/0501 (6 veces). Para HLA-DQB se identificaron 15 genotipos principales.
En los cuadros 6 y 7 respectivamente, se muestran los resultados comparativos de
la distribución genotípica de los sitios HLA-DQA1 y –DQB1 tanto para el grupo
control como para los pacientes con ACJ. En –DQB1 *0400 se incluyen los alelos
*0401 y *0402 para ambos grupos; en los *0500 se agruparon los alelos *0501,
*0502 y *0503 para el grupo control y *0501 y *0503 del grupo con ACJ; en los
*0600 se incluyen al *0601, *0602 y *0603 para el grupo control y *0602, 603, 604
y 608 en el caso de los pacientes con ACJ.
41
Cuadro 3.
Frecuencias alélicas globales (%) de los sitios HLA-DQ estudiados en
pacientes con ACJ
DQA1
Frecuencia
DQA2
Frecuencia
DQB1
Frecuencia
DQB2
Frecuencia
*0101
6.6
*0102
2.6
*0101
13.2
*0201
2.6
*0102
10.5
*0103
2.6
*0201
26.3
*0302
26.3
*0103
2.6
*0201
2.6
*0301
31.5
*0402
26.3
*0104
5.3
*0301
23.6
*0302
36.8
*0501
18.4
*0201
2.6
*0401
23.6
*0402
2.6
*0601
5.2
*0301
30.3
*0501
39.4
*0501
2.6
*0602
5.2
*0302
3.9
*0603
10.5
*0401
18.4
*0501
19.7
* Nomenclatura adoptada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para
identificar los alelos principales del MHC.
42
Cuadro 4
Frecuencias genotípicas mayores para HLA –DQA en pacientes con ACJ
Genotipo (-DQA)
Frecuencia (n)
*101/*201
1
*101/*301
1
*101/*501
3
*102/103
1
*102/201
1
*102/*301
2
*102/401
1
*102/501
2
*103/501
1
*104/*301
4
*201/*301
1
*301/301
1
*301/*401
6
*301/*501
6
*302/301
1
*302/401
1
*302/501
1
*401/*401
2
*401/501
2
* Nomenclatura aceptada por la OMS 1990.
43
Cuadro 5
Frecuencias genotípicas mayores para HLA–DQB en pacientes con
Artritis Crónica Juvenil
Genotipo (-DQB)
Frecuencia (n)
*201/301
1
*201/302
4
*201/400
2
*201/500
1
*201/600
2
*301/302
6
*301/400
2
*301/500
2
*301/600
2
*302/302
1
*302/400
7
*302/500
4
*302/600
2
*402/600
1
*501/600
1
*Nomenclatura aceptada por la OMS 1990.
44
Cuadro 6. Frecuencia alélica HLA-DQA1 entre pacientes y
controles.
Alelo
ACJ n(%)
Controles n(%)
*0101
5 (6.6)
9 (8.3)
*0102
8 (10.5)
3 (2.8)
*0103
2 (2.6)
4 (3.7)
*0104
4 (5.3)
11 (10.2)
*0201
2 (2.6)
11 (10.2)
*0301
23 (30.3)
32 (29.6)
*0302
3 (3.9)
0 (0)
*0401
14 (18.4)
14 (13)
*0501
15 (19.7)
24 (22.2)
*Nomenclatura aceptada por la OMS 1990.
45
Cuadro 7. Frecuencias alélicas HLA-DQB1 en pacientes con ACJ
y controles.
Alelo
ACJ n(%)
Controles n(%)
*0201
10 (13.2)
18 (16.7)
*0301
13 (17.1)
17 (15.7)
*0302
25 (32.9)
30 (27.8)
*0303
0 (0)
7 (6.5)
*0400
12 (15.8)
8 (7.4)
*0500
8 (10.5)
21 (19.4)
*0600
8 (10.5)
7 (6.5)
*Nomenclatura aceptada por la OMS 1990.
46
Figura 3. Análisis molecular de alelos mediante PCR-SSP.
47
Discusión.
La susceptibilidad a la presentación de la ACJ se asocia desde el punto de vista
genético al involucro de múltiples regiones cromósomicas. La región más
ampliamente estudiada, al respecto ha sido la región del MHC (HLA). A nivel
mundial se han establecido numerosas asociaciones entre los diferentes
polimorfismos del HLA y los diferentes subtipos de la ACJ. Sin embargo, existen
diferencias raciales, que pueden reflejar diferencias poblacionales en la frecuencia
de los antígenos del HLA asociados a ACJ y sus subtipos clínicos (Prahald Set al.
2000; Oen K, 1998).
Numerosas asociaciones se han establecido entre artritis reumatoide y las
moléculas del MHC clase II (Prahald S, et al 2000), siendo las primeras
determinaciones mediante metodología de citotoxicidad. Desde esa fecha hasta
en la actualidad se han dado cambios tecnológicos substanciales en la tipificación
del HLA, este proceso ha variado de metodologías serológicas a los abordajes
basados en técnicas basadas en ADN, utilizando para ello pruebas mediante PCR
y RFLP.
Dadas las diferencias raciales en el complejo MHC-HLA, las asociaciones con
enfermedades reumáticas sistémicas como ACJ y el avance en la tecnología
utilizada en su determinación fueron las bases para iniciar este estudio del cual no
se tiene información haberse realizado en poblaciones con ACJ provenientes del
noroccidente de nuestro país, en el que se han determinaron genes específicos
48
del MHC clase II (DQA y DQB), mediante metodología molecular, usando
secuencias específicas de oligonucleótidos.
Incluimos un total de 38 individuos con diagnóstico de ACJ, provenientes de tres
centros hospitalarios, estos pacientes fueron comparados con 54 sujetos controles
sanos sin evidencia de ACJ en ellos o sus familiares. En el pareamiento de
pacientes y controles no hubo diferencias significativas en edad y sexo. Las
variedades clínicas de ACJ de mayor frecuencia en nuestra población, fueron la
oligoartritis tipo II y la poliarticular seropositiva.
En esta población de estudio las frecuencias genotípicas se encuentran en
equilibrio de Hardy-Weinberg. Asimismo, la población control cumple con este
equilibrio.
Los alelos del HLA-DQA1 observados con mayor frecuencia porcentual en la
población con ACJ (0301, 0401 y 0501) tuvieron una frecuencia similar a lo
observado en la población control. Sin embargo, se presentaron alelos con
menores frecuencias porcentuales entre la población con ACJ. Para la tipificación
de HLA-DQB1, el alelo de mayor frecuencia fue similar para las poblaciones
estudiadas, siendo este el 0302. De igual manera existen alelos con frecuencias
menores entre los pacientes. Sin embargo, las diferencias observadas no son
significativas desde el punto de vista estadístico.
Por otro lado, para HLA-DQA los genotipos de mayor frecuencia incluyen el alelo
0301 combinándose bien con 0401 y 0501. Para HLA-DQB de los 15 genotipos
principales, el de mayor frecuencia, es aquél en el que esta presente el alelo 0302.
49
La ACJ es considerada como una enfermedad genéticamente compleja con
involucro de múltiples regiones cromosómicas en su susceptibilidad (Prahald y
cols. 2000). La región más ampliamente estudiada ha sido la relacionada al MHC
y se han establecido diversas asociaciones entre los polimorfismos del MHC-HLA
y la ACJ.
Existen en el mundo al menos unas 50 series que informan de esta asociación.
Las asociaciones varían entre los subtipos clínicos de la ACJ. Dentro de los genes
del CMH clase II, los que han sido más extensamente estudiados con HLA-DR1 y
HLA-DR.
Uno de los genes que con mayor frecuencia se han asociado a la AR es el alelo
DRB1, sin embargo su papel exacto en la patogénesis de la enfermedad se
desconoce. Los alelos específicos del MHC clase II asociados a la artropatía
varían de acuerdo a la población estudiada (Tezenas, S 2005). Los alelos que se
han informado asociados con AR tienen en común que están estrechamente
relacionados con amino ácidos de la tercera región hipervariable de la molécula
del DR, más específicamente comparten la secuencia RAA en posición 72-74 de
la propia secuencia de amino ácidos. Diversos autores sugieren que este sitio
puede ser la unidad funcional llamada el “epítope compartido” (Gregersen PK,
1987; Meyer JM 1996, Pierrot 2005).
50
Conclusiones.
Este estudio representa el primer informe que utilizando metodología molecular
identifica las frecuencias genotípicas y alélicas de los genes clase II (-DQA1 y DQB1) del MHC en un grupo de pacientes mestizos mexicanos con ACJ.
De los resultados se pudo observar que no existen diferencias en las frecuencias
genotípicas y alélicas de estos genes entre pacientes con ACJ y controles
aparentemente sanos, conservando el equilibrio de Hardy-Weinberg.
El conocimiento de la asociación entre alelos del MHC y la ACJ permitirá
establecer elementos pronósticos de protección o severidad de la enfermedad, así
como acercarnos más a determinar las implicaciones de la interacción molecular
entre posibles antígenos y la respuesta inmunológica en la patogénesis de la ACJ.
51
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57
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shared
epitope
hypothesis
of
rheumatoid
susceptibility.
Arthritis
Rheumatism, 52, 1063-1068.
58
Anexo 1.
59
Anexo 2.
60
Anexo 3.
61
Anexo 4.
Técnicas de laboratorio.
EXTRACCIÓN DE ADN (Método de Miller 1988).
Este método es útil para aislar ADN a partir de sangre periférica cuando se tiene
una cantidad de sangre periférica de al menos 7 ml.
Procedimiento:
1. Pasar el contenido del tubo de sangre (colectados en tubo Vacutainer®), a
un tubo cónico de 50 ml. Adicionar dos volúmenes de buffer de lisis de
eritrocitos 10:1.
2. Agitar por inversión varias veces para favorecer la lisis de eritrocitos.
3. Refrigerar de 20 a 30 minutos.
4. Centrifugar a 4500 rpm durante 20 minutos a 4 °C.
5. Decantar y lavar el botón con solución amortiguadora de lisis de eritrocitos.
6. Repetir los pasos 4 y 5, hasta que se observe limpio el botón de leucocitos,
aproximadamente 3 veces.
7. Al botón limpio de leucocitos se le agregan 3 ml de solución amortiguadora
de lisis de leucocitos y agitar ligeramente.
8. Agregar 200 l SDS al 10% y 500 l de proteinaza K.
9. Agitar en el vórtex hasta que el botón se disuelva.
10. Incubar a 37° durante 24 hr.
11. Adicionar 1 ml de solución saturada de cloruro de sodio (6M).
62
12. Agitar vigorosamente por 15 segundos.
13. Centrífugar inmediatamente a 5000 rpm/15 min.
14. Transferir el sobrenadante (contiene el ADN) a un tubo de 15 ml limpio y
estéril.
15. Adicionar 2 volúmenes de etanol absoluto frío e invertir varias veces hasta
que se observen las hebras de ADN.
16. Transferir el ADN a un microtubo Eppendorf® estéril, con ayuda de una
micropipeta.
17. Lavar tres veces con etanol al 70%.
18. Secar el ADN dejando el tubo abierto por 24 hr.
19. Diluir el ADN con 200 l de solución amortiguadora TE.
20. Agitar el tubo que contiene el ADN para homogeneizar.
21. Colocar el microtubo a 37°C, hasta la disolución total del ADN (24-36 h).
Soluciones
Para la extracción de ADN se preparan las siguientes soluciones:
Solución de cloruro de sodio al 6M
Cloruro de sodio
17.532 g
Aforar a 50 ml con agua deionizada.
Solución amortiguadora TE
Tris 10 mM
0.06055 g
EDTA 2 mM
0.00372 g
Ajustar el pH a 2.5 con HCl.
Aforar a 50 ml con agua deionizada.
63
Solución amortiguadora para lisis de leucocitos
Tris 10 mM
0.1211 g
Cloruro de sodio 400 mM
2.3376 g
EDTA 0.002M
0.0744 g
Ajustar el pH final con ácido clorhídrico (pH 8.2)
Aforar a 100 ml con agua desionizada
Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%
SDS
10 g
Aforar a 100 ml con agua desionizada.
Solución de proteinasa K
Proteinasa K
25 mg
SDS
0.25 g
EDTA 2 mM
0.0186 g
Aforar a 25 ml con agua deionizada estéril.
64
Micrométodo (Gustincich 1991).
Este método es útil cuando disponemos de poca cantidad de sangre para la
extracción de ADN.
Procedimiento
1. Incubar 300 l de sangre en un microtubo de 1.5 ml con 600 l de buffer de
lisis a 68°C durante 5 minutos. Mezclar por inversión.
2. Añadir 900 l de cloroformo, agitar 5 minutos fuertemente con la mano y
centrifugar a 14000 rpm 710 min.
3. Extraer la fase superior y pasarla a otro tubo, adicionar 900 l de agua
inyectable y 100 l de solución de CTAB, mezclar suavemente por inversión
durante 2 minutos y centrifugar a 10000 rpm/10 min. En esta etapa el ADN
se precipita y se recupera en forma de un a pastilla. Decantar el
sobrenadante cuidadosamente con la ayuda de una micropipeta.
4. Resuspender la pastilla en 100 l de na Cl 1.2 M y agregar 750 l de etanol
al 100% agitar suavemente y centrífugar a 14000 rpm/10 min. Decantar el
sobrenadante evitando perder la pastilla.
5. Lavar la pastilla con 1 ml de etanol al 70% y centrifugar a 10000 rpm/5 min.
6. Decantar el sobrenadante y lavar tres veces con etanol al 70%.
7. Secar la pastilla a temperatura ambiente ó 5 min. A 40°C y resuspender en
50 l de TE.
8. Incubar a 37°C, hasta la disolución total del ADN.
9. Con ésta técnica se obtiene aproximadamente 100 g de ADN.
65
CONCENTRACIÓN
Y
PUREZA
DEL
ADN.
Espectrofotometría
y
electroforesis.
1) La espectrofotometría es un método que sirve para determinar
cuantitativamente la cantidad de genoma y de proteínas (concentración y
pureza).
Procedimiento:
1. Ajustar el espectrofotómetro a la longitud de onda deseada (260 y 280 nm).
2. Ajustar a cero con el blanco (agua).
3. Colocar 1.0 ml de agua desmineralizada y depositarla en una celdilla de
cuarzo, adicionar 5 l de muestra de ADN y mezclar.
4. Colocar la celdilla con la mezcla en el espectrofotómetro y obtener la
densidad óptica (DO) a 260 nm para determinar la concentración de ADN y
a 280 nm para determinar la concentración de proteínas.
5. Calcular la concentración y pureza del ADN a partir de los datos obtenidos.
La concentración de ADN se calcula tomando en cuenta el coeficiente de
extinción molar de 50 ng/ml de ADN, que tiene la máxima absorbancia de
1.0 unidad de DO a 260 nm y cuyo valor es 50 y la dilución usada. Para ello
se utiliza la siguiente fórmula:
Conc. ADN nG/ l=D.O. 260 nm* factor de dilución (1005 l/ l) * 50 (valor
constante).
6. Determinar la pureza del ADN con la siguiente formula:
Pureza del ADN = DO 260 nm/DO 280 nm
66
El valor mínimo de pureza no deberá ser menor a 1.4 para reacciones
Estándar de PCR.
2) La electroforesis es útil para estimar de manera cualitativa la pureza,
concentración y calidad del ADN.
Procedimiento:
1. Preparar un gel de agarosa al 1% en solución amortiguadora TEB 0.5X.
2. Depositar 5 l de la solución de ADN con 3 l de jugo azul.
3. Correr el gel a 120 V por 2 h.
4. Teñir el gel con bromuro de etidio y visualizar el ADN en un transiluminador
de luz UV.
Una banda nítida en el gel indica una pureza e integridad adecuadas para la
amplificación por PCR. La presencia de un barrido es sugestiva de una
contaminación por sales, mientras que la aparición de múltiples bandas es señal
de una degradación del ADN y si no se observa ninguna banda probablemente no
se extrajo suficiente cantidad de ADN.
Geles y soluciones.
Solución amortiguadora TEB 10X
Tris
EDTA
107.76 g
9.30 g
67
Acido bórico
55.02 g
Aforar a 1000 ml con agua deionizada.
Solución amortiguadora TBE 1X
Solución amortiguadora 10x
100 ml
Aforar a 1000 ml con agua deionizada
Gel de agarosa al 3%
Para preparar 30 ml de gel, pesar 0.9 g de agarosa, mezclar con 30 ml de solución
amortiguadora TEB 0.5x y fundir la agarosa con calor, agitando ocasionalmente de
forma
manual, calentar la agarosa hasta que no se observen grumos. Si
disminuye el volumen, compensar con solución amortiguadora 0.5x. esperar a que
la temperatura del gel baje aproximadamente a 50°C y vaciar en la cámara de
electroforesis evitando la formación de burbujas, enseguida colocar el peine en el
gel. Esperar al menos 30 minutos para que la agarosa gelifique a temperatura
ambiente antes de usar.
Gel de agarosa al 1%
Para 30 ml, pesar 0.3g de agarosa en 30 ml de buffer TEB al 0.5x, disolver la
agarosa por medio de calor, colocar los peines en la cámara y verter agarosa en la
cámara de electroforesis, dejar gelificar por 30 minutos.
Solución de bromuro de etidio
68
Para la tinción de los geles, se prepara una solución stock, a una concentración de
0.5 mg/ml disuelto en agua deionizada y se coloca en un frasco protegido de la
luz. La solución de trabajo contiene 1 ml de la solución stock por cada 100 ml de
TBE 1x.
El bromuro de etidio es un compuesto carcinogénico, por lo que se debe tener
gran cuidado de utilizarlo, se recomienda el uso de guantes y cubre bocas, así
como precauciones para el desechar adecuadamente el material que haya tenido
contacto con él.
Amortiguador de carga o jugo azul
Para 50 ml:
Xilencianol
12.5
Azul de bromofenol
12.5
Glicerol
30% (15 ml)
Agua
50 ml
Preparación de los marcadores de peso molecular pbr322, y de 25 y 50 pb
Concentración final del marcador
75 g/ l
Marcador de peso molecular
7.5 l
Jugo azul
10 l
Agua inyectable
82.5 l
Volumen final
100 l
69
Gel de poliacrilamida
Para visualizar los fragmentos de la digestión enzimática se corre una
electroforesis vertical en geles de poliacrilamida al 6% para la cuál se aplicaron 7 l
del producto digerido con 3
l del colorante jugo azul. Como referencia para
distinguir el peso molecular de los fragmentos digeridos y no digeridos se utilizó
una escalera de 25 ó 50 pb como marcador. El corrimiento se realizó a 150 V
durante 2 h y los geles se tiñeron con nitrato de plata.
Procedimiento (35 ml de gel):
1. Mezclar 7 ml de acrilamida al 30% (29:1) con 3.5 ml de solución
amortiguadora TBE 5x, más 24 ml de agua bidestilada con agitación leve.
2. Agregar 500
l de APS al 10% y 50
l de TEMED, con agitación leve,
procurando no formar burbujas dado que el TEMED funciona como
catalizador y el oxígeno inhibe la reacción, vaciar la mezcla en un tiempo
breve (segundos) para evitar la polimerización antes del vaciado completo.
Acomodar el peine en la parte superior del gel.
3. Dejar polimerizar 1 hora, remover el peine, colocarlo en la cámara de
electroforesis con solución amortiguadora TBE 0.5x y retirar los restos de
acrilamida lavando los carriles con la ayuda de una micropipeta. Antes de
colocar las muestras se precorre a 150 V710 min.
70
Soluciones
Solución de poliacrilamida (29:1) al 30%
Acrilamida
Bisacrilamida
29 g
1g
Añadir 50 ml de agua bidestilada y agitar para disolver. Aforar el volumen a 100
ml con agua bidestilada.
Persulfato de amonio (APS) al 10%
APS
0.5 g
Ajustar el volumen a 5 ml con agua bidestilada (preparar cada semana).
Tinción con nitrato de plata (Sanguinetti 1994).
1. Colocar el gel de poliacrilamida 3 minutos en solución fijadora.
2. Retirar esta solución y ponerlo en una solución acuosa de nitrato de plata al
0.2%, durante 5 minutos.
3. Lavar el gel con agua destilada durante 2 minutos, haciendo cambios de
agua varias veces.
4. Verter la solución reveladora al gel durante 15 minutos o hasta la aparición
de las bandas.
5. Detener la reacción lavando nuevamente con agua destilada.
6. Colocar el gel sobre un papel filtro y cubrir con papel plástico.
7. Deshidratar el gel en el secador durante 1 hr 30 minutos a 80°C.
71
Solución fijadora
Etanol 10%,Acido acético 0.5%
Etanol absoluto
Acido acético
100 ml
5 ml
Aforar a 1000 ml con agua desionizada.
Solución de nitrato de plata al 0.2%
Nitrato de plata
0.2 g
Aforar a 100 ml con solución fijadora
Solución reveladora
Hidróxido de sodio (3%)
30 g
Formaldehído (0.5%)
5 ml
Aforar a 1000 ml con agua desionizada
72
TIPIFICACION MOLECULAR MEDIANTE PCR-SSP Y PCR-RFLP
Reacción estándar de PCR para la tipificación del HLA con la técnica PCR-SSP:
Reactivos
Concentración
Condiciones de amplificación de
Final
PCR
Buffer PCR
1x
Etapa
Temp
Tiempo
MgCl2
1.5mM
Desnaturalización
94°C
3 min
dNTP´s
200 M
Inicial
Iniciador 5´
15 pmol
Desnaturalización
94°C
20 seg
Iniciador 3´
15 pmol
Alineación
65°C
50 seg
Control C3
3.75 pmol
Extensión
72°C
20 seg
Control C5
3.75 pmol
Ciclos 30
Taq polimerasa
0.25 U
Enfriamiento
4°C
5 min
ADN genómico
100 ng/ l
73
Reacción estándar de PCR para la tipificación del HLA con la técnica PCR-RFLP:
Reactivos
Conc. Final
Buffer PCR
1x
MgCl2
2.0mM
DNTP´s
200 M
Iniciador 5´GH28N
15 pmol
Iniciador 3´QB204
15 pmol
Taq polimerasa
0.25 U
ADN genómico
100 ng/ l
Condiciones de amplificación de PCR-RFLP:
Etapa
Temp.
Tiempo
Desnaturalización
96°C
5 min
Desnaturalización
96°C
1 min
Alineación
55°C
1 min
Extensión
72°C
2 min
72°C
10 min
4°C
5 min
Inicial
Ciclos 35
Extensión final
Enfriamiento
74
Condiciones de digestión para Hpall
Reactivo
Volumen
Solución Amortiguadora,10X
1.5 l
Agua bidestilada
9.4 l
Hpall (10U/ l)
0.10 l
ADN amplificado
4.0 l
Volumen total
15 l
Incubar a 37°C/24h
Condiciones de digestión para Hsp921
Reactivo
Volumen
Solución Amortiguadora (10X)
1.5 l
BSA (100X)
0.15 l
Agua bidestilada
9.25 l
Hsp921 (10 U/ l)
0.10 l
ADN amplificado
4.0 l
Volumen total
15 l
Incubar a 37°/24h
75
INICIADORES USADOS EN LA REACCION DE PCR-SSP
MEZCLA
DE REACCION
DQA1
*0101/4
INICIADOR
5´
3´
TAMAÑO
PRODUCTO
ALELOS
A-5´01
A-3´01
149 pb
* 0101,*0104
*0101/2/4
A-5´02
A-3´01
172 pb
* 0101,*012,*01014
*0102/3
A-5´03
A-3´01
149 pb
*0102, *103
*0103
A-5´04
A-3´01
172 pb
*0103
*0201
A-5´04
A-3´02
170 pb
*0201
*0301
A-5´05
A-3´03
183 pb
*0301
*0302
A-5´06
A-3´03
183 pb
*0302
*0401
A-5´07
A-3´04
190 pb
*0401
*0501
A-5´02
A-3´05
186 pb
*0501
*0601
A-5´04
A-3´06
117 pb
*0601
“A”
A-5´08
A-3´07
196 pb
*0104
A-5´09
A-3´07
195 pb
Todos menos *0104
*0104
76
MEZCLA
DE REACCION
DQB1
*0501
*0502
*0503
*0601
*0602
*0603/8
*0604
*0201
*0201/0302
*0301/4
*0302/3
*0303
*0401
*0402
*0504
*0605
*0606
*0602/3/7
*0604/5/6/7
INICIADOR
5´
3´
TAMAÑO
PRODUCTO
B-5´01
B-5´02
B-5´02
B-5´03
B-5´04
B-5´05
B-5´06
B-5´07
B-5´08
B-5´09
B-5´09
B-5´08
B-5´10
B-5´11
B-5´12
B-5´13
B-5´05
B-5´08
B-5´05
B-3´01
B-3´02
B-3´03
B-3´04
B-3´05
B-3´05
B-3´06
B-3´07
B-3´08
B-3´09
B-3´09
B-3´10
B-3´11
B-3´11
B-3´02
B-3´06
B-3´12
B-3´13
B-3´01
128 pb
117 pb
87 pb
198 pb
121 pb
127 pb
254 pb
205 pb
129 pb
122 pb
122 pb
129 pb
200 pb
200 pb
118 pb
254 pb
176 pb
165 pb
127 pb
*0604/5/6/8
B-5´09
B-3´10
163 pb
*0601/0301
*0304
B-5´09
B-5´09
B-3´10
B-3´08
129 pb
129 pb
ALELOS
*0501
*0502
*0503
*0601
*0602
*0603, *0608
*0604
*0201
*0201,* 0302
*0301,* 0304
*0302, *0303
*0303
*0401
*0402
*0504
*0605
*0606
*0602, *0603, *0607
*0604, *0605, *0606,
*0607
*0604, *0605, *0606,
*0608
*0601, *0301
*0304
77
TIPIFICACION MOLECULAR MEDIANTE PCR-SSP Y PCR-RFLP
Las mezclas de oligonucleótidos, conteniendo todos los componentes de la
reacción de PCR y las condiciones de la amplificación propiamente dichas, se hizo
como sigue: se prepara la mezcla (10 l) conteniendo, ADN genómico (75 ng)
amortiguador de PCR (50 mM Kcl/1.5mM MgCl2/10mM Tris-Cl, pH 8.3/0.001%
(p/v) gelatina), 200 M de dATP, dCTP, DGTP y dTTP, 0.25 M del alelo y grupo
específico para oligonucleótidos de -DQA1 y -DQB1, 0.05 M de los primers control
y Taq polimerasa 0.25U. Los condiciones de los ciclos de PCR y la temperatura
de amplificación se basaron también en la referencia de Olerup O y cols. 1992,
1993.
La visualización de los productos de amplificación en electrofóresis en
geles de agarosa se tiñieron con bromuro de etidio y revisaron con luz UV para ser
documentados mediante fotografía (Figura 3).
78