Aislamiento, cultivo y esporulación del hongo fitopatógeno

MOMENTOS DE
Universidad de la
AMAZONIA
Momentos de Ciencia 6:(2), 2009
CIENCIA
Aislamiento, cultivo y esporulación del hongo fitopatógeno
Microcyclus ulei en el piedemonte amazónico colombiano
Ramón Alexis Calderón-Álvarez1,*, Olga Lucia Rodríguez A.2 & Lorena Quintero2
1
2
Biólogo con énfasis en Biorrecursos, Universidad de la Amazonia. Florencia (Caquetá). Colombia.
Investigadora, Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas –SINCHI–. Bogotá, D. C. Colombia.
Recibido 26 de mayo de 2009; aceptado 25 de agosto de 2009
Resumen
Microcyclus ulei (P. Henn.) v. Arx, es un hongo patógeno de las especies del género Hevea sp. que causa la enfermedad conocida
como el Mal Suramericano de la Hoja, la cual limita la producción del caucho natural en América. Esta investigación tuvo como
objetivo la estandarización de un protocolo de aislamiento, cultivo y esporulación in vitro de M. ulei que fuera reproducible y que
permitiera obtener suficiente cantidad de inóculo para la caracterización de dicho agente patógeno. La colecta se realizó en jardines
clonales y viveros de caucho ubicados en los departamentos de Caquetá y Guaviare, en donde se identificaron plantas con lesiones
causadas por el agente patógeno. Se colectaron foliolos en estadio B1 y B2 que fueron colocadas en bolsas de papel y llevadas al
laboratorio a una temperatura de 4 °C para su aislamiento y cultivo en condiciones in vitro. Haciendo uso de cámara de flujo laminar
y bajo estereoscopio se observaron las lesiones de las cuales se iban a realizar los aislamientos, estas lesiones debían estar
esporuladas y no presentar contaminaciones por otros microorganismos. Las conidias fueron colectadas con una aguja micológica
y luego transferidas a un medio de cultivo PDA modificado. Posterior a los 10 días de cultivo se observaron colonias dispersas y de
coloración beige, que después de 30 a 40 días de cultivo iniciaron el desarrollo de estromas. Para evaluar todos los estadios de
desarrollo del hongo se indujo esporulación.
© 2009 Universidad de la Amazonia. Todos los derechos reservados.
Palabras clave: aislamientos, cultivo, Microcyclus ulei.
Abstract
Microcyclus ulei (P. Henn.) V. Arx, is a pathogenic fungus of the species of genus Hevea sp. that causes a disease known as South
American Leaf Blight, which limits the production of natural rubber in America. This study aimed to standardize a reproducible
protocol for in vitro isolation, cultivation and sporulation of M. ulei, in order to obtain enough inoculum for the characterization of
this pathogen. The collection was carried out in clonal gardens and nurseries of rubber located in the departments of Caqueta and
Guaviare, where plants were identified with lesions caused by the pathogen. Leaflets in stage B1 and B2 were collected, placed in
paper bags and carried to the laboratory where they were stored at a temperature of 4 °C for isolation and cultivation under in vitro
conditions. Injured leaves of Hevea were observed using a stereoscope inside a flow chamber, in order to obtain samples for the
isolation. Lesions should be sporulated and none contaminated by any other microorganism. Conidias were collected using a
mycological needle and transferred to an amended cultivation media PDA. Ten days later, colonies were observed dispersed and
beige colored, and 20 to 30 days after they began to develop stromas. Sporulation was induced in order to evaluate all stages of
fungus development.
© 2009 Universidad de la Amazonia. All rights reserved.
Key words: isolation, cultivation, Microcyclus ulei.
Introducción
En América Central y del Sur la principal
limitante para el establecimiento de nuevos
cultivos de caucho natural (Hevea sp.) la
constituye el hongo fitopatógeno Microcyclus ulei
que causa el Mal Suramericano de la Hoja (SALB
en inglés). Esta es una enfermedad endémica de la
región amazónica y está identificada como una de
* Autor para correspondencia. E-mail: [email protected]
105
las cinco enfermedades más agresivas en plantas,
que llega a causar pérdidas en la producción hasta
del 70 %, incluso en clones que se han identificado
como resistentes al hongo M. ulei.
Esta enfermedad reviste importancia debido a
que produce defoliaciones prematuras, reduce la
actividad fotosintética de la planta, llegando a
disminuir la producción de látex entre un 20 % y
75 %, siendo esta la causa de las mayores perdidas
Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110
para el productor. De igual forma la presencia de
razas o variantes del hongo M. ulei, hace cada vez
menos efectivo el control químico del patógeno
que causa la enfermedad, lo que ocasiona la
destrucción de las plantaciones ocasionado un
serio problema a nivel mundial, que repercute en
pérdidas anuales de 15 al 20% de la producción
(Gómez & López 2002，Compagnon 1998).
El hongo M. ulei se ha estudiado desde
comienzos del siglo pasado y aunque se ha
avanzado en el conocimiento de su morfología,
diversidad patogénica y comportamiento en
campo, debido a que es un hongo biotrófico, una
de las mayores limitantes en la investigación ha
sido la dificultad de su manejo in vitro, razón por
la cual se desconoce mucho de su fisiología y de
los factores asociados a la virulencia del patógeno
(Bos &Parlevliet 1995). De igual forma la pérdida
de patogenicidad, reducción de la esporulación y
viabilidad del inocuo, son fenómenos que se
presentan en los hongos fitopatógenos como M.
ulei debido a la serie de repiques sucesivos, siendo
estos fenómenos comunes en este tipo de hongos
(Junqueira et al. 1986). Esta investigación se realizo
con el objetivo de obtener aislamientos in vitro de
M. ulei provenientes de la región amazónica
colombiana.
estado anamórfico de M. ulei que se caracterizan
por presentar una intensidad de esporulación en
un rango comprendido entre 4 y 5 según la escala
de Mattos et al. (2003) (Figura 2) esto con el fin de
colectar muestras con suficientes conidios para el
proceso de aislamiento en laboratorio. Las
muestras fueron transportadas en bolsas de papel
Kraf y a una temperatura de 4 °C.
Metodología
Figura 1. Localización geográfica del Jardin Clonal y parcela
clonal de observ ac ión del Inst i tuto Amazónic o d e
Investigacion e s Cie n tífi ca s – SINCHI – . M od if ic ado d e
GoogleEarth. Versión 2009. Europa Technologies Images
Terrametrics.
Área de estudio
Las colectas del material vegetal de caucho
natural (Hevea spp.) afectadas por M. ulei
realizaron en el vivero de ASOHECA (Gremio
cauchero) ubicado en la localidad de Itarka
(Figura 1), Municipio de La Montañita (Caquetá,
Colombia) y en los viveros de caucho ubicados en
el municipio El Retorno (Guaviare). En esta región
las condiciones climáticas propias de la Amazonia
colombiana favorecen el desarrollo del patógeno,
por lo que es considerada una zona de no escape al
Mal Suramericano de la Hoja.
Colecta del material foliar infectado con M. ulei
A través de la observación macroscópica de los
síntomas causados por M. ulei en el material foliar
se muestrearon de forma aleatoria las plántulas de
caucho colectando foliolos en estadio B o C según
Halle et al. (1978) con lesiones abaxiales de tipo
conidial (apariencia afelpada y acuosa de un color
verde cenizo) ocasionadas por Fusicladium heveae,
Figura 2: Foliolos en estado C de clones de caucho colectados
en vivero provenientes la Vereda Itarka (La MontañitaCaquetá, Colombia), con lesiones conidiadas del el hongo
fitopatógeno M. ulei.
106
Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110
50 ml; posteriormente, con un agitador de vidrio
(flameado) se realizó el macerado y se adicionó
una solución de cloranfenicol a 50 ppm, en una
proporción de 10 ml por cada gramo de estroma.
Luego se adiciona 0,5 ml de esta suspensión de
macerado a erlenmeyers de 125 ml con medio de
cultivo para esporulación (alrededor de 25 ml),
después se tomo un rastrillo (estéril) y se procedió
a esparcir la solución por toda la superficie del
medio de cultivo. La incubación se realizó
empleand o un f o toperíodo de 12 h luz
(empleando una lámpara de 40 W de luz blanca
fluorescente) y 12 h oscuridad, a 23 ºC durante 1215 días (Sambugaro 2003).
Después de 30-45 días de crecimiento, se
tomaron nuevamente los cultivos estromáticos y
con una aguja de punta curva (estéril) se transfirió
una porción del estroma a un frasco de vidrio
(estéril) de aproximadamente 10 ml. Luego se
fragmentó el estroma empleando un agitador de
vidrio y se transfirieron de nuevo con el asa a un
erlenmeyer de 125 ml con medio de cultivo para
esporulación. La incubación se realizó siguiendo
el mismo procedimiento del método anterior, con
lo que se obtuvieron los aislamientos de M. ulei.
Una vez en el laboratorio, se procedió a tomar las
muestras de campo que fueron colectadas y se
almacenaron en cajas de petri las cuales contenían
un disco de papel filtro húmedo (con agua estilada
estéril), luego fueron guardadas en el laboratorio a
temperatura de 24 °C y bajo luz cercana a los 2 000
lux durante 12 h constantes (Junqueira et al. 1984)
lo cual favoreció la producción de conidios.
Después de este periodo de incubación, se
realizó una observación bajo estereoscopio, la cual
permitió comprobar la presencia de conidios en la
superficie de las lesiones.
Aislamiento, cultivo y esporulación de M. ulei.
Para el aislamiento y crecimiento de M. ulei se
prepararon medios de cultivo adaptando las
metodologías descritas por Junqueira et al. (1984)
y Cardoso & Mattos (2007) y para el medio de
c u ltivo de es p oru l ación se ajust a ron las
metodologías propuestas por Gasparotto et al.
(1997), Mattos et al. (1999) y Cardoso & Mattos
(2007).
El aislamiento del hongo M. ulei se realizó en el
laboratorio (in vitro), donde los folíolos de caucho
que exhibieron las mejores lesiones fueron
examinados bajo estereoscopio y después de
verificar que estaban aparentemente libres de
hongos contaminantes, se procedió a usar agujas
micológicas para colectar las conidias mediante
toques leves en la superficie de la masa de esporas
sobre la lesión para que algunos conidios y
conidióforos se adhieran a la punta de la aguja
(Gasparotto et al. 1997); luego se transfirieron a
cajas de petri que contenían medio de cultivo para
aislamiento (alrededor de 10 ml por caja)
realizando cinco piques por caja y por duplicado.
Posteriormente, las cajas fueron debidamente
flameadas y selladas con papel cristaflex y se
incubaron a 23 °C a oscuridad total (Ziebell 2000,
Sambugaro 2003).
Después de tener el hongo aislado y en
crecimiento por 20 - 30 días, se procedió a
transferir el micelio formado a un erlenmeyer de
125 ml que contenía 20 ml de medio de cultivo para
crecimiento y fueron incubadas a 23 °C y en
oscuridad total. Para la esporulación de M. ulei se
p r oc e dió a to m ar cu l tivos en m edio de
crecimiento con 30-40 días de edad, y en
condiciones estériles se procedió a tomar con
ayuda de una aguja de punta curva una fracción
de estroma y se deposito en un tubo de ensayo de
Resultados y discusión
Los folíolos colectados de Hevea spp. infectados
con M. ulei se caracterizaron por presentar
lesiones abaxiales con forma irregular y de
apariencia felposa color verde-cenizo con un
rango de intensidad de ataque que oscilo entre e 3
a 4 con base en la escala de Chee (1976) y un rango
de intensidad de 3 - 6 (Figura 2), con base en la
escala de intensidad de esporulación de Mattos et
al. (2003).
El aislamiento directo a partir de las lesiones
foliares conidiadas en medio de cultivo para
aislamiento se logro debido a que los foliolos
colectados presentaron lesiones con la fase
asexual de M. ulei, la cual fue suficiente para
realizar un aislamiento exitoso, coincidiendo con
lo expresado por Chee & Holliday (1986) quienes
afirman que la cantidad de inoculo presente en las
hojas de caucho en estado B o C, en donde las
lesiones están en fase conidial, es generalmente
suficiente para efectuar un aislamiento efectivo.
También se evidencio la aparición de colonias de
diversos agentes contaminantes que alteraron el
desarrollo y crecimiento del hongo M. ulei. Con la
relación a la dificultad para obtener aislamientos
conidiales de M. ulei con buena capacidad
107
Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110
d i v e rso s a g entes m ic ro b i a no s sapro fi tos
oportunistas. Con base en estas afirmaciones se
logra explicar la dificultad que se presento en esta
investigación para obtener aislamientos de M.
ulei. En esta investigación se obtuvo un total de 12
aislamientos de M. ulei provenientes de la región
amazónica.
Después de ajustar el proceso de aislamiento, al
cabo de 12 días se observó la aparición de
pequeñas colonias dispersas y de coloración beige
(Figura 3A) las cuales, 10 días después se tornaron
grisáceas y estromáticas (Figura 3B), coincidiendo
con los resultados de Gasparotto et al. (1997),
quienes afirman que luego de 12 días de
incubación se puede observar claramente la
germinación de la fase asexual de M. ulei.
Después de cuatro semanas de crecimiento se
encontró densas masas estromática oscuras y
compactas, con crecimiento muy lento sobre el
medio de cultivo (Figura 3C). Los aislamientos
con edad de 30 - 45 días en medio de crecimiento
esporulante, Junqueira et al. (1984) afirman que la
tasa de éxito de un aislamiento realizado el mismo
día de la colecta de las hojas, es de 70 % a 80 %,
mientras que después de 15 días conservando la
mu estr a en co n d i ci o nes a m b ie nta l es, l a
efectividad desciende entre un 10 % y 15 %; por tal
razón, la siembra del patógeno en este estudio fue
realizada entre 12 y 24 h después de la colecta,
buscando con esto maximizar el éxito en el
proceso de aislamiento, obteniendo que los
con i d i os r e cié n r et i rad os de l as le s ion e s
esporuladas presentaron mayor variabilidad y
menos contaminantes. Igualmente, Junqueira et
al. (1984) manifiestan que la obtención en
laboratorio del inóculo primario de la fase
anamórfica de M. ulei (F. heveae) ha sido uno de los
factores que han limitado las investigaciones del
mal suramericano de la hoja de caucho, dado que
los aislamientos obtenidos sufren una rápida
pérdida de viabilidad de los conidios y poseen
una alta susceptibilidad a la contaminación por
Figura 3. Características macroscópicas de M. ulei observado en estereoscopio. A. Colonias filamentosas de 12 días de edad. B.
Crecimiento estromático a los 22 días de edad. C. Masa estromática de 35 días de edad. D. Colonia altamente conidiada al cabo de 15
días de edad en medio para esporulación.
108
Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110
Con esta investigación se determinó que los
medios de cultivo para el aislamiento, crecimiento
y espo r ul a ció n son más favorable s par a
crecimiento del hongo fitopatógeno M. ulei, dado
que en ellos encuentra los requerimientos
nutricionales para su desarrollo.
fueron transferidos a medio de cultivo para
esporulación desarrollando en 15 a 20 días una
apariencia ligeramente aterciopelada, con una
coloración marrón brillante (Figura 3D), la cual es
caracterí s tica de l a s col o nia s a lta m e n te
conidiadas. Holliday (1970) relató un aumento en
la producción de conidios de M. ulei después de
irradiación de luz a los cultivos con más de 14 días
de edad por 30 o 40 min diarios, con una longitud
de onda próxima a la luz al ultravioleta, es decir
300 - 365 nm. Por otro lado, Chee (1978) sugirió una
hora de luz al día para aumentar la producción de
conidios, mientras que Schrader (1980) sostiene
que los cultivos de M. ulei con 14 a 16 días de edad
aumentan significativamente la producción de
conidios, cuando son iluminadas por uno o dos
días con ciclos de 0,5 h de luz de una lámpara
fluorescente de 40W a intervalos de 1,5 horas de
oscuridad. Lieberei et al. (1983) afirman que los
aislamientos de M. ulei expuestos a 90 min de luz
diariamente por uno a dos días aumenta entre 13 y
24 veces la producción de conidios. En este trabajo
l o s cultivos fueron iluminados 90 min
diariamente, con lo que se obtuvo buenos
aislamientos “esporulantes”, corroborando lo
afirmado por Lieberei et al. (1983). Algunos
aislamientos realizados en cultivo in vitro no
presentaron germinación, posiblemente por
factores físicos y químicos, entre ellos pH,
temperatura y luminosidad que, según Mattos et
al. (2003), son factores primordiales a la hora de
hacer un estudio en medio artificial de este hongo.
De igual forma juega un papel importante el tipo
de medio de cultivo empleado para el asilamiento,
crecimiento y esporulación del hongo, en los
cu ales s e e ncuentr a n los requerimientos
nutricionales para el desarrollo del patógeno. En
experimentos con varios medios de cultivo para el
aislamiento, crecimiento y esporulación in vitro de
M. ulei realizados por Junqueira et al. (1984)
indican que el medio más favorable para el
crecimiento y esporulación de hongo fue el medio
para crecimiento donde la producción de conidios
fue máxima después de 12 días de incubación
efectuando l a ad i ción d e a g ua de coco
recomendado por Mattos (1999). Coincidiendo
con lo obtenido con en esta investigación ya que
estos medi o s de cul t ivo favor e cie r on el
crecimiento y la esporulación del hongo. Sin
embargo otros autores como Lieberei et al. (1983),
muestran que la esporulación es mejor en medios
poco enriquecidos como el agar papa dextrosa al
0,5 % con una iluminación diaria de 90 min.
Agradecimientos
Los autores agradecen sinceramente al proyecto
Caracterización Morfológica y Molecular del
Hon g o Microcyclus u l ei C aus a nte del Mal
Suramericano de la Hoja en el Cultivo del Caucho
(Hevea brasiliensis), Convenio 035/04 IICA-MADR
y contrato 018/04 IICA-Unión Temporal: Instituto
Am a zó n ico d e Investigaci o ne s Ci e ntíficas
SINCHI - Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional de Colombia.
Literatura citada
Bos, L. &. J. E. Parlevliet. 1995. Concepts and terminology on
plant/pest relationships: Toward Consensus in Plant
Pathology and Crop Protection. Annu. Rev. Phytopathol.
33:269-102.
Cardoso, S. & C. R. R. Mattos. 2007. Modo operatório para
preparação do meio de cultura para Microcyclus ulei.
Programa de melhoramento genético de clones de
seringueira com resistencia ao fungo Microcyclus ulei. Projeto
CMB (Cirad-Michelin-Brasil). Documento Técnico D3.
Chee, K. H. & Holliday. 1986. P. Enfermedad suramericana de
la hoja del hule (caucho) Hevea. Instituto para la
Investigación y Desarrollo del Hule de Malasia, MRRDB.
Monografía 13. Presentado en la serie técnica n° 37 Avances de
la investigación en caucho natural. CONIF. 1997. Bogotá.
Chee, K. H. 1976. South American Ieaf blight of Hevea
brasiliensis: spore dispersal of Microcyclus ulei. Annals of
Applied Biology, 84(2):147-152.
Chee, K. H. 1978. South American Leaf Blight of Hevea
brasiliensis: Culture of Microcyclus ulei. Trans. Br. Mycol. Soc.
70(3): 341.
Compagnon, P. 1998. El Caucho Natural. Biología - Cultivo Producción. CIRAD - C.P. México.
Gasparotto L. F., A. F. Dos, J. C. R. Pereira & F. A. Ferreira. 1997.
Doenças da seringueira no Brasil. Embrapa-SPI. Brasília.
Gómez, D. & B. López. 2002. Respuesta del caucho (Hevea
brasiliensis) a la aplicación del bioinsumo orgánico Biofun
estrella en el control del mal sur americano de la hoja
(Microcyclus ulei). Universidad de la Amazonia, Facultad de
Ing e nierías, Prog ra ma de Ing e niería Agroecológica.
Florencia, Caquetá. 16-39 p.
Hallé, F., R. A. A. Oldeman & P. B. Tomlinson. 1978. Tropical
trees and forest. Berlin, Springer-verlag.
Holliday, P. 1970. South american leaf blight (Microcyclus ulei)
of Hevea brasiliensis. Phytopathological papers, 12: 1-31.
Junqueira, N. T. V., G. M. Chaves, L. Zambolim, R. da S.
Romeiro & L. Gasparotto. 1984. Isolamento, cultivo e
esporulação de Microcyclus ulei, agente etiológico do maldas-folhas da seringueira. Revista Ceres, v.31, p.322-331.
Junqueira, N. T. V., L. Zambolin, G. M. Chaves & L. Gasparoto.
1986. Esporulação “in vitro”, viabilidad dos conídios e
109
Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110
de s e r i n g ue i ra ( Hevea s pp . ) v i s an do r e sis t enc i a ao
Microcyclus ulei. Tese (Mestre). Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho”. Botucatu (SP, Brasil).
Schrader, A. 1980. Cyanideinfluss anf sporenkeimung und
mycelentwicklung bei Microcyclus ulei, dem. Erreger der
sudamerikanischne Blatt-Kranlheit auf Hevea.
Braunschweig, Botan. Inst. Tu.
Ziebell, P. 2000. Los factores que afectan el desarrollo y la
producción del caucho Hevea en el Caquetá y Putumayo
(Zonas Húmedas). Informe final del área de fitopatología.
Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas SINCHI.
Santafé de Bogotá. Colombia.
patogenicidade de Microcyclus ulei. Fitopatología Brasileira,
11 (2): 667.
Lieberei, R., A. Schrader, B. Biehl & K. H. Chee. 1983. Effect of
cyanide on Microcyclus ulei cultures. Journal of the Rubber
Research, Institute of Malaysia. 31(3): 227-235.
Mattos, C. R. R. 1999. Meios de cultura com água de coco verde
para esporulação de Microcyclus ulei. Fitopatologia Brasileira
24:470. (Resumo).
Mattos, C. R. R., D. García, F. Pinard & V. Le Guen. 2003.
Variabilidade de isolados de Microcyclus ulei no Sudeste de
Bahia. Fitopatologia Brasileira. 28 (5): 502-507.
Sambugaro, R. 2003. Caracterização anatómica foliar de clones
110