- Universidad Autónoma de Nuevo León

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE MEDICINA
"ANAUSIS DEL PERFIL DE EXPRESION DEL
CANCER CERVICAL"
TESIS PRESENTADA POR:
M. C. VIRGILIO BOCANEGRA GARCIA
Como requisito parcial para obtener el grado de
DOCTORADO EN CIENCIAS con especialidad en
Biología Molecular e Ingeniería Genética
Septiembre, 2004
TD
RC280
• I! 8
B6
2004
c.l
1080126305
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE MEDICINA
"ANÁLISIS D E L PERFIL DE E X P R E S I Ó N D E L
CÁNCER CERVICAL"
TESIS PRESENTADA POR:
M. C. V I R G I L I O B O C A N E G R A G A R C Í A
Como requisito parcial para obtener el Grado de
DOCTORADO EN CIENCIAS con especialidad en Biología Molecular e
Ingeniería Genética
Septiembre, 2004
TO
Ö4
FONDO
ffiM DOCTORADO
ANALISIS DEL PERFIL DE EXPRESION DEL CANCER
Aprobación de Tesis:
DR. R I C A R D O M. C E R D A
FLORES
Ctjj-Diredtor de Tesis
DR. IILC.ÍTA
(JARRERA SALDAÑA
Co-Director de Tesis
DRA. H E R M I N I A G. .V^ÁRTIItÉZ R O D R I G U E Z
C o - D i r e c t o r a de Tesis
DR. DIONICIÍTA. GALARZA
DELGADO
Subdirector
de Investigación y Estudios de P o s g r a d o
CERVICAL
E l p r e s e n t e t r a b a j o se d e s a r r o l l ó en el l a b o r a t o r i o d e G e n é t i c a
M o l e c u l a r , d e la U n i d a d d e L a b o r a t o r i o s d e I n g e n i e r í a y E x p r e s i ó n
G e n é t i c a s , d e l D e p a r t a m e n t o d e B i o q u í m i c a d e la F a c u l t a d d e
M e d i c i n a d e la U . A. N. L . , b a j o la d i r e c c i ó n d e la D r a . R o c í o O r t í z
L ó p e z y la c o - d i r c c c i ó n d e los D r s . A u g u s t o R o j a s M a r t í n e z y H u g o A ,
Barrera Saldaña.
RESUMEN
Fecha de graduación: Septiembre 2004
M, C. Virgilio Bocanegra García
Universidad Autónoma de Nuevo León
Facultad de Medicina
Título del Estudio: ANÁLISIS DEL PERFIL DE EXPRESIÓN DEL CÁNCER
CERVICAL
Número de páginas: 135
Candidato para el grado de Doctor eo Ciencias con
especialidad en Biología Molecular e Ingeniería Genética
Área de Estudio: Gcnómica del cáncer
INTRODUCCION. El cáncer cervical constituye el 6% de los tumores malignos, a nivel
mundial y en los países del tercer mundo causa un alto índice de mortalidad. Al desarrollo de
cáncer cervical se ha asociado la infección por el virus del papiloma humano (HPV), del cual se
conocen alrededor de 100 tipos, pero los tipos 16 y 18 son los más frecuentemente encontrados
en cáncer cervical. Debido a que el cáncer cervical es una enfermedad multifactorial asociada a
un agente infeccioso, la identificación de genes virales y genes del hospedero, diferencialmente
expresados que puedan eventualmente utilizarse como marcadores moleculares para el desarrollo
de este cáncer, es de vital importancia En este trabajo, se llevó a cabo un análisis por
microarreglos del transcriptoma de muestras de líneas celulares de cáncer y tejido cervical
normal. Las muestras que se analizaron fueron tejido cervical normal (TCN), células SiHa las
cuales son positivas para HPV16. células C33A que son HPV negativas y células HeLa que son
positivas para IIPV18, llevando a cabo la hibridación competitiva utilizando el tejido cervical
normal como refeiencia. Con esto se abarcan tres posibilidades que se pueden presentar; la
presencia de HPV 16, presencia de HPV 18 y ausencia del virus HPV en cáncer cervical. También
se llevó a cabo el análisis del perfil de expresión de 5 genes del VPH tipo 16 en las tres líneas
utilizadas.
MATERIALES Y METODOS. Extracción de RNA por el método de gradiente de cloruro de
ccsio. Los RNAs se marcaron mediante una reacción de retrotranscripción con la incorporación
de marcadores fluorescentes y se aplicaron a los microarreglos mediante hibridación competitiva
en un panel de 2000 genes relacionados con cáncer. Después del análisis matemático se
descartaron todos los genes que no tuvieran una diferencia de expresión de al menos 2.5 veces
con respecto a la referencia. Cada gen seleccionado se validó por RT-PCR sem ¡cuantitativa. Para
el estudio de la expresión de los genes virales seleccionados (E6, E7, Ll, E4 y E2), se diseñaron
iniciadores y sondas, para su análisis por PCR y RT-PCR en tiempo real.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES. Se analizaron 3 sistemas, TCN/C33A, TCN/SiHA,
TCN/HeLa. De cada sistema se eligieron 3 genes sobre-expresados y 3 genes sub-expresados y
se validó su nivel de expresión diferencial por RT-PCR. De los 18 genes analizados en total, se
obtuvo la validación de 13 genes de expresión diferencial, lo que nos permitió la identificación
de la alteración de 6 rutas de señalización en este tipo de cáncer. En el análisis de la expresión de
los genes virales se encontraron niveles de expresión muy diferentes, pero en general se observó
el patrón de bajo número de copias y alta expresión del virus en las células SiHa, alto número de
copias y baja expresión en las células CasKi. Cabe mencionar que queda por esclarecerse el
papel que juegan estos genes en el CaCU y los mecanismos que regulan la expresión de los
genes virales, ya que la actividad de estos no está relacionada con el número copias del genoma
viral presentes.
Firma del Asesor:
Firma del Coasesor
AGRADECIMIENTOS
A m i s p a d r e s , M a n u e l a García Salinas y Virgilio B o c a n e g r a S á n c h e z , p o r
su apoyo, p o r la vida, p o r todo, gracias.
A la Dra. H e r m i n i a M a r t í n e z R o d r í g u e z , p o r el apoyo, a y u d a y c o n s e j o s
b r i n d a d o s para el desarrollo de la tesis y a lo largo d e m i estancia e n la
ULIKG
A la D r a . R o c í o O r t i z López, p o r ser m i asesora del t r a b a j o y a p o y a r m e
inclusa c u a n d o n o e s t á b a m o s de a c u e r d o en ideas o estrategias.
A l Dr. A u g u s t o R o j a s Martínez, p o r los c o n s e j o s p a r a llevar a c a b o la tesis.
A l Dr. H u g o A. Barrera Saldaña, p o r d a r m e la oportunidad d e cursar el
d o c t o r a d o y p o r e n s e ñ a r m e los c a m i n o s de la investigación.
A la Dra. A g n è s R e v o l de M e n d o z a , p o r los c o m e n t a r i o s a lo largo del
t r a b a j o y a p o y o en el desarrollo experimental de la tesis.
A l Dr. R i c a r d o M . C e r d a Flores, p o r sus c o m e n t a r i o s en el desarrollo d e la
tesis
A l d e p a r t a m e n t o de G i n e c o l o g í a d e l H o s p i t a l Universitario, e s p e c i a l m e n t e
al Dr. O s c a r Vidal Gutiérrez y a los residentes de G i n e c o l o g í a p o r las
f a c i l i d a d e s p r e s t a d a s para el a c c e s o a las muestras y la b u e n a disposición
q u e siempre p r e s e n t a r o n .
A la U n i d a d d e M i c r n a r r e g l o s del Instituto de f i s i o l o g í a Celular de la
U N A M , e s p e c i a l m e n t e al Dr, J o r g e R a m í r e z Salcedo p o r su b u e n a
d i s p o s i c i ó n y a y u d a en la realización de los e x p e r i m e n t o s de m i c r o a r r e g l o s .
A m i s amigos, Luis, Francis, Lucy, Ornar, A l e j a n d r o con q u i e n e s el t i e m p o
s i g u e p a s a n d o , las ideas y e n d o y v i n i e n d o y el espacio entre n o s o t r o s
a u m e n t a n d o y d i s m i n u y e n d o p e r o su a m i s t a d perdura. Por su a p o y o directo
e indirecto, gracias.
A m i s c o m p a ñ e r o s y a m i g o s del laboratorio: Ivan, Olivia, Luis, Irma,
P a b l o , Sergio, p o r las platicas en la c o m i d a que m a s bien eran d i s c u s i o n e s
d e s d e filosofía h a s t a desarrollo de estrategias de las tesis.
A m i s c o m p a ñ e r o s y a m i g o s de la U L I E G : Cristian, A n g e l , N a i k a , Polo,
Itzel, M a u r i c i o , Rafael, Edith y Sergio. D e todos aprendí, a t o d o s les d e s e o
lo m e j o r .
A Iram y A n d r é s , quienes c a d a uno a su m o d u m e a y u d a r o n en a s p e c t o s
m u y i m p o r t a n t e s d e la tesis y sin su a y u d a este t r a b a j o no h u b i e r a sido
posible.
A la U A M R A en R e y n o s a , especialmente a los directivos y a m i g o s J u a n
J o s e G o n z á l e z Cabriales, J o s e A l b e r t o R a m í r e z de L e ó n , R o s a Issel A c o s t a
G o n z á l e z , Gerardo Flores Gutiérrez.
A m i s p r o f e s o r e s y amigos, Enrique G o n z á l e z R o d r í g u e z , J u a n F r a n c i s c o
L e r m a A l v i z o , H u m b e r t o F r a n c i s c o Leal A y a l a , Jesús E n r i q u e C a s t r c j ó n
Duran.
A Fabiola, p o r tu paciencia, p o r tu a y u d a , p o r tu tiempo, p o r tu ánimo, p o r
t u c o n t a g i o s a frescura e n la f o r m a de v e r la vida, por h a b e r estado c o n m i g o ,
gracias.
A l C O Ñ A C Y T p o r el a p o y o e c o n ó m i c o b r i n d a d o p a r a cursar el D o c t o r a d o .
A la ULIEG
GENÉTICA MOLECULAR Y ANEXOS
" U n a sal us victus, nullam aperare s a l u t e m "
A] aumentar la distancia, nuestro conocimiento se va desvaneciendo. Finalmente
alcanzamos la oscura frontera de nuestro telescopio. Allí medimos sombras, y entre los
fantasmales errores de medición buscamos seflales que sean levemente más
sustanciales. La búsqueda continuará. Hasta que los recursos empíricos no se hayan
agotado no necesitaremos pasar al reino visionario de la especulación
El reino de las nebulosas. Edwin Hubble. 1936
Come bitter rain,
and wash from ray heart
that saddest of all words:
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Ulatempa Poetees, "Song of my Exile"
TABLA DE CONTENIDO
CAPÍTULO
PÁGINA
CAPÍTULO I
1
ANTECEDENTES
1
1.1. EL CÁNCER CF.RVICOIJTERINO
1.1.1. Epidemiología y etiología. .
.
.
.
1.1.2. Cuadro clínico y diagnóstico del CaCU.
.
.
1.1.3. Estadios del CaCU
1.1.4. Factores pronóstico del CaCU.
.
.
.
1.1.5. Tratamiento. .
.
.
.
.
.
1
1
2
5
6
6
.
.
.
.
1.2. EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (HPV). .
.
.
1.2.1. Biología Molecular del HPV
1.2.2. Características de los HPVs. .
.
.
1.2.3. Genética del HPV - Integración y ensamblaje.
1.2.4. Funciones e interacciones de la oncoproteina viral E7.
1.2.5. Funciones c interacciones de la oncoproteina viral F.6
y su efecto sobre P5 3.
.
.
.
.
1.2.6. Oncogenicidad y desregulación del ciclo celular por E6 y E7.
1 J . LA IMPORTANCIA DE LOS CAMBIOS EN EL PERFIL
DF, EXPRESIÓN F.N EL DESARROLLO DF. CÁNCER.
1.3.1. Estrategias de análisis de perfil de expresión. .
1.3.2. El desarrollo de la tecnología de micruarreglos para
el análisis de la expresión genética.
.
1.3.3. Estudios del trarscriptoma.
.
.
.
.
.
1.3.4. Estudios del transcriptoma del CaCU. .
.
.
.
,
8
9
10
n
13
15
18
19
19
21
23
24
1.4. J U S T I F I C A C I Ó N
30
CAPÍTULO II
31
OBJETIVOS
2.1. Objetivo general..
2.2. Objetivos específicos.
.
.
.
.
.
.
.
,
.
31
31
2 J . ESTRATEGIA GENERAL DEL TRABAJO.
.
.
.
32
CAPÍTULO III
.
.
.
33
MATERIALES Y METODOS.
3.1. Origen de los reactivos..
.
.
.
.
.
.
3.2. Equipo. .
.
.
.
.
.
.
.
.
3.3. Metodología.
.
.
.
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.
.
.
.
3.3.1. Recolección y almacenamiento de las muestras.
.
.
3.3.2. Extracción del DNA
3.3.3. Extracción del RNA
3.4. Cuaotificación del DNA y RNA obtenidos. .
.
.
.
3.5. Análisis de los genes virales. .
.
.
.
.
.
3.5.1. Análisis de las secuencias y diseño de sondas.
.
3.5.2. Obtención del DNAc de los genes virales.. .
.
.
3.5.3. PCR cuantitativa de los genes virales..
.
.
.
3.5,3,1 Diseño de la curva de calibración. .
.
.
3.5 3.2. Montajede la placa. .
.
.
.
.
3.5.3.3. Cuantificación del número de copias.
3.5.4. Análisis de resultados..
.
.
.
.
.
3.6 Análisis délos genes celulares.
.
.
.
.
.
3.6.1. Mareaje y síntesis de los DNAc.
.
.
.
.
3.6.2. Hibridación cuantitativa a gran escala.
.
.
.
3.6.3. Lectura con el escáner y obtención de la imagen.
.
3.6.4. Procesamiento de los datos: Normalización,
transformación y selección de genes .
.
.
.
3.7 Validación de los genes seleccionados por RT-PCR sern ¡cuantitativa
3.7.1. Selección de secuencias y diseño de iniciadores.
.
3.7.2. Condiciones de reacción de amplificación de los
genes seleccionados.
.
.
.
.
.
.
33
34
36
36
37
38
39
40
40
40
42
42
42
43
44
45
46
47
48
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1. Obtención del DNA y RNA.
4.1.1. Extracción de DNA
4.1.2. Preparación del RNA
58
58
58
59
4.2. Análisis del perfil de expresión de los genes virales..
61
49
49
49
52
4.2.1. Gen E6
62
4.2.2.
4.2.3.
4.2.4.
4 2,5,
62
63
63
63
Gen
Gen
Gen
Gen
E7
L1
E4
E2
4.3. Análisis del perfil de expresión de los genes celalares mediante
mic ruar regios.
.
.
.
.
.
.
.
4.3.1. Preparación del DNAc marcado.
.
.
.
.
4.3.2. Hibridación
4.3.3. Normalización y transformación de los datos.
.
4.3.4. Selección de los genes..
.
.
.
.
.
4.3.5. Validación de los resultados de microarreglos.
4.3.6. Estudios de expresión en C33ATCN medíanle
RT-PCR semicuantitativa.
.
.
.
.
.
4.3,6.1. Genes sobre-expresados en el sistema C33A/TCN.
66
67
68
68
74
76
76
75
4.3.6.1.1. Gen six 1 (GCI4M059102)
4.3.6.U. Gen rab3d (GC19M011296)
4.3.6.1.3. Gen dccl. (MGC5528).
4.3.6.2. Genes subexpresados en el sistema C33A/TCN.
4.3.6.2.1. Gen pigs2 (GC01M183879)
4.3.6.2.2. Gen mdm2c (GC12P067488).
.
.
.
4.3.6.2.3. Gen Hla-e(GC06P030563).
.
.
.
4.3.7. Estudios de expresión de HeLa/TCN..
4.3.7.1, Genes sobrexpresados en e! sistema HeLa/TCN.
4.3.7.1.1. Gen bripl (GC17M060234).
.
.
.
4.3.7.1.2. Gen rab27B (GC18P050644).
.
4.3.7.1.3. Gen pah (GC12M1Q1735).
.
.
.
4.3.7.2. Genes subexpresados en el sistema HeLa/TCN.
4.3.7.2.1. Gen mdm2c (GC12P0674B8).
.
.
.
4.3.7.2.2. Gen Hla-e (GC06P030563).
.
.
.
4.3.7.2.3. Gen emk-1 (GC11P063382).
.
.
.
4.3.8, Estudios de expresión en SiHa/TCN. .
.
.
.
4.3.8.1. Genes sebreexpresados en el sistema SiHa/TCN.
4.3.8.1.1. Gen ppp4c (GC16P030126).
.
.
.
4.3.8.1.2. Gen Stat5b (GC17M040726).
.
.
.
4.3.8.1.3. Gen rab23 (GC06M057100).
.
.
.
4.3.8.2. Genes subexpresados en el sistema SiHa/TCN..
4.3.8.2.1. Gen frapl. (GC01M010876).
.
.
.
4.3.8.2.2. Gen mdm2c (GC 12P067488)
4.3.8.2.3. Gen hla-e (GC06P030563).
.
.
.
4.3 9. Resumen de resultados de validación de los genes
seleccionados de los experimentos de microarreglos.
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN
5.1. Perfil de expresión de lus genes virales.
5.2. Perfil de expresión de los genes celulares.
.
76
77
77
78
78
78
79
80
80
80
81
81
81
81
82
83
84
84
84
84
85
85
85
86
87
87
89
.
.
.
.
.
.
.
.
90
93
CAPÍTULO VI
CONCLUSIONES
96
CAPÍTULO VII
PERSPECTIVAS
97
CAPÍTULO V m
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
.
APÉNDICE 1
CARÁCTERÍSTICAS DE LOS GENES SELECCIONADOS..
98
109
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
Página
T a b l a i . Condiciones de reacción para la RT.
.
.
.
.
41
Tabla 2. Condiciones de amplificaciones para la reacción de la RT,
Tabla 3. Condiciones de reacción parala PCR cuantitativa.
Tabla 4. Condiciones de RT para mareaje del DNAc.
.
.
.
41
44
.
.
47
Tabla 5. Genes seleccionados y número de acceso a secuencias del
gen bank,
.
.
.
.
.
.
.
.
50
Tabla 6. Secuencia de los iniciadores utilizados para la amplificación de
los genes seleccionados.
.
.
.
.
51
Tabla 7. Condiciones de reacción de PCR para los genes seleccionados.
.
54
Tabla 8. Condiciones de amplificación para la reacción de PCR de los genes
seleccionados..
.
.
.
.
.
Tabla 9. Condiciones de reacción de retrotranscripción.
.
.
.
.
55
.
56
Tabla 10. Condiciones de incubación para la reacción de retrotranscripción.
56
Tabla 11. Resultados de la extracción de DMA de líneas celulares..
58
Tabla 12. Resultados de la corroboración de la expresión de los
genes seleccionados. .
.
.
.
.
.
.
88
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
Figura 1. Epitelio cervical normal.
.
.
.
.
.
.
3
.
.
4
Figura 2. Esquemas de clasificación de progresión y estadios
del cáncer cervical.
.
.
.
.
.
Figura3. Anatomía del virus del papiloma humano tipo 16.
.
9
Figura 4. Esquema general de la regulación del ciclo celular.
.
15
Figura 5. Esquema general del desarrollo experimental.
.
.
.
32
Figura 6. Distribución de las muestras en la placa para qPCR
del sistema ABI PRISM 7000
43
Figura 7. Procedimiento de validación de los genes seleccionados
mediante RT-PCR s e m ¡ c u a n t i t a t i v a . . . . . .
57
Figura 8. Extracción de DNA genómico a partir de lincas celulares
y tejido cervical.
.
.
.
.
.
.
.
59
Figura 9. Resultado de la ultracentrifiigación del lisado celular
para la obtención de RNA. .
.
.
.
.
.
60
Figura 10. RNA obtenido por el método de ultracentriñigación
de gradiente en cloruro de cesio.
.
.
.
.
.
61
Figura 11. Niveles de expresión y número de copias de los genes
seleccionados de HPV-16 en CaSki..
.
.
.
.
64
Figwa 12. Niveles de expresión y número de copias de los genes
seleccionados de HPV-16 en SiHa. .
.
.
.
.
65
Figura 13. Niveles de expresión y número de copias de los genes
seleccionados de HPV-16 en HeLa. .
.
.
.
.
65
Figura 14. Niveles de actividad de los genes seleccionados de HPV-16
en CasKi, S i H a y H c U
66
Figura 15. Resultado de la síntesis y marcado de DNAc para la hibridación
a gran escala. .
.
.
.
.
.
.
.
67
Figura 16. Imágenes de los resultados de la hibridación a gran escala
en los tres sistemas de análisis de expresión.
.
.
.
69
Figura 17. 'Normalización de los datos obtenidos de la hibridación a
gran escala. .
.
.
.
.
.
.
.
70
Figura 18. Gráfica de los datos normalizados.
.
.
.
.
71
Figura 19. Dalos normalizados y transformados.
.
.
.
.
72
Figura 20. Gráficas de los tres sistemas analizados, con los resultados
normalizados y transformados.
.
.
.
.
.
Figura 21. Genes seleccionados en el sistema C33A/TCN. .
73
,
.
74
Figura 22. Genes seleccionados en el sistema HeLa/TCN. .
.
.
75
Figura 23. Genes seleccionados en el sistema Sil la/TCN. .
.
.
75
Figura 24. Gel de la amplificación del gen six-1 y gráficas
de microdensitometría.
.
.
.
.
.
.
76
Figura 25. Gcl de la amplificación del gen rab3d y gráficas
de microdensitometría.
.
.
.
.
.
.
77
Figura 26. Gel de la amplificación del gen ptgs2 y gráficas
de microdensitometría.
.
.
.
.
.
.
78
Figura 27. Gel de la amplificación del gen mdm2c y gráficas
de microdensitometría del sistema C33A/TCN.
.
.
.
79
Figura 28. Gel de la amplificación del gen hla-e y gráficas
de microdensitometría del sistema C33A/TCN.
.
.
.
79
Figura 29. Gel de la amplificación del gen bripl y gráfica
de microdensitometría.
.
.
.
.
.
.
80
Figura 30. Gcl de la amplificación del gen rab27b y gráfica
de microdensitometría.
Figura 31. Gel de la amplificación del gen mdm2c y gráfica
de microdensitometría del sistema HeLa/TCN.
.
Figura 32. Gcl de la amplificación del gen hla-e y gráfica
de microdensitometría del sistema HeLa/TCN.
Figura 33. Gel de la amplificación del gen emk-1 y gráfica
81
.
.
-
82
.
83
de microdensitometria.
.
.
.
.
Figura 34. Gel de la amplificación del gen ppp4c y gráfica
de microdensitometria.
.
.
.
.
.
.
83
.
.
84
Figura 35. Gel de la amplificación de los genes stat5b y rab23 y
gráficas de microdensitometria.
Figura 36. Gel de la amplificación del gen frapl y gráfica
de microdensitometria.
.
.
.
.
85
.
.
86
Figura 37. Gel de la amplificación del gen mdm2c y gráfica
de microderisitnmetría del sistema SiHa/TCN.
.
.
.
86
Figura 38. Gel de la amplificación del gen hla-e y gráfica
de microdensitometria del sistema SiHa/TCN.
.
.
.
87
Figura 39. Rutas metabólicas donde participa el gen ptgs2
también denominado COX2.
.
112
Figura 40. Rutas donde participa el gen mdm2c en el ciclo celular.
Figura 41. Esquema donde se muestra la función de hla-e. .
114
.
115
Figura 42. Dibujo esquemático de la función del gen BRCA1.
Figura 43. Dibujo esquemático que muestra las múltiples rutas de
señalamiento donde participa la proteína stat5.
.
.
116
.
1[9
NOMENCLATURA
|il
Micro litros
°C
Grados centígrados
Abs
Absorbancia
BPV
Papilomavirus bovino
BSA
Albúmina sérica bovina
DNAc
DNA complementario
C-terminal
Carboxilo terminal
DMEM
Medio mínimo esencial Dulbeco's
DNA
Acido d esoximbotiuc le ico
dNTPs
Desoxirribonocleótidos
D'IT
Ditiotreitol
EDTA
Ácido ctilen-diamino-tctraacético
G3PDH
Glicerul 3-fosfato deshidrogenasa
GAPDH
Gliceraldehido 3-fosfalo dcshidrogenasa
h
Horas
HPV
Papilomavirus humano
Kb
Kilobascs
kDa
Kilodallones
LB
Luria-Bertani
M
Molar
min
Minutos
mi
Mililitros
mM
Milimolar
ng
nanograrao
nm
nanómetro
pb
Pares de bases
PBS
Amortiguador salino de fosfatos
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
pH
Potencial de hidrógeno
PV
Papilomavirus
qPCR
PCR cuantitativa
RNA
Ácido ribonucleico
RNAm
Ácido ribonucleico mensajero
RPM
Revoluciones por minuto
RT
Rerrotranscripción
SBF
Suero bovino fetal
SDS
Dodecil sulfato de sodio
TBE
Buffer tris-boraios-EDTA
TCN
Tejido cervical normal
TE
Buffer tris-FDTA
TSS
Solución de almacenaje y transformación
UV
Ultravioleta
V
Voltios
•tháiius
d f l [wrft/
de expresión
del cáncer
cervical
SI C. V¡t£Í.io fioíonígra Gaicis
CAPÍTULO I
ANTECEDENTES.
1.1. E l . CÁNCER CE RVIC O UTERINO
El cáncer cervicouterino (CaCU) constituye el 6% de los tumores malignos a nivel
mundial y en los países del tercer inundo causa un alto índice de mortalidad. El pronóstico de la enfermedad depende del estadio en el que se encuentra en el momento de ser
diagnosticada. Más del 90% de los tumores pueden ser detectados en estadios iniciales,
mediante el tamizado de la población de alto riesgo con el estudio citológico de la prueba
de Papanicolaou. Sin embargo la exploración no es una práctica rutinaria en más de un
tercio de las pacicntcs de riesgo, porcentaje que es aún mayor en los países subdcsarrollados, donde prevalece como un problema importante de salud'*2,5
1.1.1. Epidemiología y etiología.
Los estadios cancerosos inician entre la quinta y la sexta década de la vida (edad
media de 54 añus), contrastando con la edad media de las lesiones precursoras (neoplasia
intraepitelial cervical o CIN) que inciden en mujeres más jóvenes (alrededor de los 40
años) 4 . F,1 proceso de transformación maligna requiere un largo período de latencia, en
algunos casos de hasta de 20 años 5 .
Anchiis
d f / p e r f i l de P\presión
M
tle! rancer
rprvicn!
C. V i r g i l i o H o c a n c g r a G a r c í a
La etiología del CaCU se asemeja a las patologías venéreas 6 , ya que se asocian a bajo nivel económico, inicio precoz de las relaciones sexuales, coitos frecuentes, múltiples
parejas sexuales y coito con hombres no circuncisos o con escasa higiene genital, asi como con el hábito de filmar7,8,9,10. También se ha relacionado al CaCU con varios haplotipos de complejo mayor de histocompatibilidad ( H L A ) n , 1 2 , n , u . Sin embargo, el factor de
riesgo causal demostrado en los estudios epidemiológicos mediante técnicas moleculares,
es la infección por el papilomavirus humano (KPV) 1 4 . La infección por HPV es frecuente
en la población y se transmite a través de las relaciones sexuales. Hay alrededor de 100
tipos de HPVs, de los cuales solo 23 de ellos infectan al cérvix. Los tipos llamados malignos, de entre los que destacan el 16, 18, 31 y el 45 se asocian con frecuencia a displasias moderadas (CIN II) y displasias severas (CIN III) o carcinomas in situ, además de
que se encuentran en la mayoría de los pacientes con CaCU (95%) 15 . Los llamados HPV
benignos, (como el tipo 5, 11, 12) en cambio solo se encuentran en tumores epiteliales
benignos, comúnmente conocidos como verrugas. La tipificación de HPV puede ser útil
en las pacientes con citologías con anormalidades de bajo grado o citologías dudosas, a
fin de determinar el riesgo evolutivo individual y recomendar el seguimiento más estrecho a las mujeres enn alto riesgo de una posible progresión a carcinoma.
1.1.2. Cuadro clínico y diagnóstico del CaCL".
El CaCU se origina en la unión de los epitelios escamoso y columnar (ver figura 1), siendo las lesiones precursoras la displasia o el carcinoma in situ, las cuales progresan lentamente a cáncer invasivo. Ixts estudios longitudinales muestran que las pacientes no tratadas con cáncer in situ desarrollarán carcinoma invasivo en un periodo de 10 a 12 años en
Análisis deI nerfíl de expresión del cáncer cervical
M . C. V i r g i l i o B o c a n c g r a G a r c í a
el 30-70% de los casos; aunque en el 10% de los casos las lesiones pueden progresar de
forma acelerada del estadio in situ a carcinoma invasivo en el período de un año.
Escamosa ^
Intermedia *
Parabasal „
Basal J
F i g u r a 1. Epitelio cervical n o r m a l . Se observan las cuatro capas principales de la zona de transición del
epitelio cervical normal, c o m e n z a n d o en la parte inferior con la capa basal, luego la parabasal. intermedia y
e s c a m o s a , con estas tres últimas proliferando a partir de la capa basal 1 4 .
Una vez desarrollado el cáncer, el tumor invade en profundidad hasta romper la
membrana basal, penetrando el estroma cervical directamente o por los canales vasculares. Los diferentes estadios y grados de progresión del CaCU se esquematizan en la figura
2 17 .
Desde el cérvix. el tumor puede extenderse a la vagina o al segmento uterino inferior o a través de los espacios paracervicales y los ligamentos uterosacros. También puede
fijarse a la pared pélvica por extensión directa o por coalescencia del tumor con las adenopatias regionales. Localmente, puede afectar a la vejiga urinaria por vía anterior y posteriormente al recto.
•fwliiis J(i ptrfii
txprtfm cei ÍWK«
M C. Virgilio Bocanegra Garcia
Displasia
i —
Normal
I
Muy
leve
Leve
Gradol
Mod
Grado2
Grave
Carcinoma
•
I—
MicroIn situ
invasivo
Grado3
Neoplasia Intraepiteliai Cervical
Carcinoma
Figura 2. E s q u e m a s de clasificación de progresión y estadios del C a C U . Existen dos esquemas de clasificación del grado de avance del CaCU, el primero (arriba) puede diferenciar entre displasia y carcinoma y
establece niveles de desarrollo que van desde muy leve hasta carcinoma microinvasivo. El segundo (abajo)
solo tiene tres clasificaciones del grado de avance del CaCU.
El cérvix dispone de una rica red de vasos linfáticos, que drena a los ganglios pélvicos y a los paraaórticos. Usualmente el orden de la afectación es progresivo: inicialmente
existe afección pélvica, posteriormente paraaórtica y a continuación a distancia; de ahí la
importancia del tratamiento local en estadios tempranos. La localización de las metástasis
es preferentemente al pulmón, ganglios extrapélvicos, hígado y huesos 17 .
La enfermedad preinvasive se detecta usualmente en la exploración rutinaria y se
confirma con la citología de la exploración Papanicolaou. Esto es de vital importancia, ya
que las pacientes con enfermedad invasiva precoz pueden ser asintomáticas. El primer
síntoma del CaCU invasivo es la metrorragia o el sangrado postcoital, ocasionalmente
con flujo vaginal maloliente, el dolor pélvico se presenta en casos de enfermedad invasiva. La triada de dolor ciático, edema de pierna e hidronefrosis se asocia a la enfermedad
pélv ica avanzada. Otros síntomas como la hematuria, incontinencia urinaria secundaria a
-Innlm."
Jul perñ/
de t>\pre<iñn
de! cancer
cervical
M C. Virgilio Bocíux'gra Garcia
fístula vesico-vaginal o estreñimiento por afectación rectal pueden presentarse pur afectación de órganos vecinos.
La evaluación de la paciente debe incluir; historia clínica con examen clínico completo incluyendo el examen pélvico y rectal, hemograma, bioquímica hepática y renal,
sedimento de orina, tomografia axial computarizada (TAC) abdominal y pélvica, y citoscopía en caso de sospecha de afectación local. El estudio histológico es básico y puede
requerir estudio citológico, colposcopía, biopsias de los cuatro cuadrantes cervicales y
dilatación con legrado uterino. La extensión del estudio se determina por los hallazgos de
cada procedimiento, pero debe suministrar suficiente información para cstadificar adecuadamente a la paciente. 17
Kn cuanto a la anatomía patológica, el carcinoma escamoso comprende el 90% de
las lesiones, mientras que el adenocarcinoma aproximadamente el 10% restante. Los carcinomas adenoescamosos y los carcinomas de células pequeñas son raros. Se han descrito
también sarcomas primarios y linfoinas primarios y secundarios. 17
1.13.
Estadios del CaCU.
La estadificación se basa en la información obtenida mediante el examen pélvico bajo
anestesia, la pielografia endovenosa, citoscopía y rectoscopia. La estadificación es clínica
y no varia con los hallazgos quirúrgicos. La clasificación recomendada es la de la Federation Internationale de Gynecologie et Obstetrique (FIGO).
•ináíiMS Jci
pvü'
Je expresión
del córner
cervical
M. C. Virgilio ü o c a n c g r a Ciarjit
En el estadio I la enfermedad está limitada al cerviz. En el II afecta más allá del cérvix a los dos tercios superiores de vagina o al tejido parametrial, pero no llega a la pared
pélvica. En el estadio 111 el tumor alcanza la pared pélvica, afecta los ganglios pélvicos o
al primer tercio inferior de la vagina. En el estadio IV ha invadido la mucosa de la vejiga
o del recto o hay metástasis a distancia" 4 .
1.1.4. Factores pronóstico del C a C U .
Los factores pronóstico más importantes son el estadio clínico, el volumen tuinoral,
el grado de diferenciación celular, el tipo histológico (escamoso versus adenocarcinoma o
adeno escamo so), la extensión linfática y la invasión vascular. Según diversos estudios,
otros factores de mal pronóstico son: compromiso capilar linfático, profundidad de la
compromiso estromal, edad, mal estado general inicial, e infección por HPVs de alto
19
nesgo .
Sin embargo, el mayor problema para determinar el pronóstico de la enfermedad en
etapas tempranas, cuando no hay todavía síntomas claros y los estudios citológicos no
muestran cambio alguno, radica en la falta de marcadores moleculares que puedan predecir la evolución de la enfermedad. 19
1.1.5. T r a t a m i e n t o
Durante años los esquemas de irradiación y/u cirugía han sido los tratamientos de
elección. I-a quimioterapia se ha utiÜ7ado asistencialmente y con objetivo paliativo en las
Análisis
del perfil
tie expresión
de! cáncer
cervical
M ( ' V i r g i l i o B o c i n a r a Ciarais
rccurr encías o en la enfermedad melastásica, aunque actualmente se utiliza con éxito com o radio sensibilizadora.
En la mayoría de los centros se prefiere la cirugía para tratar los estadios I y lia,
pues preserva la función ovárica y vaginal. La cirugía es siempre de elección en casos de
cáncer y gestación, enfermedades inflamatorias intestinales o anexiales asociadas, irradiación previa de la pelvis y en presencia de un tumor oválico concomitante. La elección de
la cirugía va a depender del volumen tumoral. Las complicaciones de cirugía radical por
lo general son fundamentalmente urológicas. Aunque el porcentaje de fístulas urinarias es
bajo (0-3%), el daño a la sensibilidad vesical y a la capacidad contráctil del músculo dctrusor son muy frecuentes y están en relación directa con la radicalidad de la operación.
Otras complicaciones, todas ellas prevenibles, son la aparición de linfocele, la infección,
hemorragia y el tromboembolismo pulmonar.'' 0
La radioterapia puede aplicarse como tratamiento localizado, de forma exclusiva o
postoperatoria. La
radioterapia externa pélvica se administra mediante rayos X de alta
energía. La dosis recomendada es de 45 a 50 ü r a y (postoperatoria) o 70 (jray para tratamiento con radioterapia extema exclusiva. Las fuentes radiactivas son el cesio 137 y los
hilos de iridio 192. 21
La quimioterapia en la enfermedad localmcnte avanzada puede reducir el tamaño
tumoral (92% de remisiones en esquemas basados en cisplatino), facilitando la labor del
tratamiento local. La quimioterapia puede inhibir la reparación de la lesión producida por
la irradiación, puede promocionar la sincronización de las células en una fase sensible a la
.1 •Kilo, i.s del veril'
de expresión
M.
del cáncer
cervical
V i r g i l i o B o c a n c g r a Cidrcía
irradiación del ciclo celular, iniciar la proliferación de células en fase de reposo y reducir
la fracción de células hipóxicas que son resistentes a la irradiación. La quimioterapia
también puede aumentar de forma independiente el porcentaje de muerte celular 22,23 .
1.2. E L VIRUS DFX PAPILOMA HUMANO (HPV).
Se ha demostrado que el desarrollo del CaCU está fuertemente asociado a infecciones con los HPVs de alto riesgo, específicamente con los tipos 16 y 1824. La interacción
de proteínas virales con proteínas de regulación del ciclo celular del huésped lleva a un
descontrol de éste y condiciona a las células afectadas a la transformación maligna. Las
proteínas transformantes varían de un tipo de virus a otro. En los papilomavirus bovinos
(BPV), la proteína E5 es la responsable de la transformación, mientras que en los humanos (HPV), como en el tipo 16 y 18, las proteínas E6 y F.7 son las involucradas en la
transformación. La proteína E6 se enlaza a la principal proteína celular supresora de tumores P53 y acelera su degradación, mientras que la proteína E7 se une a otra importante
proteína, supresora de tumores, P R B para Lnactivarla. Algunos PVs pueden transformar las
células por si solos y otros parecen requerir de la cooperación de oncogcnes celulares
activados (como los de la familia Ras). Curiosamente, en la mayoría de los casos, todos
los genes del PV se mantienen en las células tumorales, aunque se ha observado en algunos casos, como en el del BPV tipo 4 ( B P V 4 ) , que el DNA viral se pierde luego de la
transformación'"' 26 - 27
Análisis del perfil <te expresión del cáncer cervical
M . C. V i r g i l i o B o c a n e g r a G a r d a
1.2.1. Biología Molecular del H P V .
Los HPVs son virus de DNA pequeños, no envueltos, con un genoma circular de
doble cadena de aproximadamente 7,200 a 8,000 pb. Todos sus marcos de lectura abierta
(ORFs) están restringidos a una sola cadena. Las secuencias codificantes han sido clasificadas como tempranas (E, del inglés early) y tardías (L, del inglés late), para indicar su
secuencia de expresión en el ciclo de vida viral. (Ver figura 3).
B
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1 "•l»"'|'»'|M«T
|
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Poli-A
11 n i i | i n i | i n i | n i i|
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"""7903
1« •»
m
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Región temprana
qC
Región tardía
Región no
codificante
F i g u r a 3. A n a t o m i a d e l v i r u s del p a p i l o m a h u m a n o t i p o 16. A) El g e n o m a viral consta de 7904 pares de
bases distribuidas en 8 genes y una región reguladora ( U R R ) . B) Presenta una cápside compuesta por las
proteínas LI y L2. C ) Muestra los sitios de poliadenilación, ubicados al final del gen ES y de L I , respectivamente.
Los genomas de HPV contienen hasta ocho genes tempranos y la mayoría contienen
los genes E l , E2, E4, E5, E6 y E7 (E3 se encuentra solamente en los BPV1). Estos codifican para la rcplicación viral y transformación celular, y la expresión de estos genes pue-
-tnuiisis
del perfil
de e\pr?siór
ds! rancer
,:erv:Lcl
M ( ' . V i - g i l . c Uncariiígra G a r c í a
de ser detectada en las áreas de las lesiones inducidas por el HPV. Los genes L, como el
L l y L2, codifican para las proteínas estructurales y su expresión está restringida a la parte del epitelio que está en diferenciación activa, donde la replicación Yiral también sucede. Los ORFs de L1 y E6 están separados por 400 a 1,000 pb que no codifican para proteina alguna, y a esta región se le conoce como región no codificante (NCR, del inglés
non coding región), región larga de control (LCR; long control región) o región reguladora río arriba (URR, upstream regulatory región). Contiene secuencias promotoras y potenciadoras críticas para regular la replicación viral y la transcripción de los genes celulares y virales. Hay otra pequeña región no codificante (SNR) entre E5 y L2 con una función biológica todavía desconocida 28 ' 29,30 .
1.2.2. Características de los IIPVs.
Las características de la infección de HPV incluyen un tropismo restringido a células epiteliales humanas y un ciclo de vida viral fuertemente ligado al programa de diferenciación del qucratinocito hospedera. Este ciclo particular ha limitado a los investigadores el estudiar el ciclo de vida vegetativo del HPV por décadas, debido a la carencia de
un modelo de cultivo in vitro. De hecho, la transcripción viral está restringida a las células epiteliales de origen humano, y más específicamente a los querdlinocitos. En contraste, los genomas de HPV pueden mantenerse y replicarse en varias lincas celulares índifcrenciadas a pesar de la infección restringida, mientras que las proteínas de replicación E l
y E2 sean expresadas 31 " 12 .
-l/iáhsis
del perfil
de expresión
d?' cáncer
cervical
M. C. Virgil.o R o c a n e g r a Carcia
1.23. Genética del HPV - Integración y ensamblaje.
La infección por HPV tiene su inicio en las células basales del epitelio escamoso
estratificado (ver figura 1), donde una combinación particular de factores celulares interactúan con el LCR y propician la transcripción de los oncogenes virales F.6 y F,7. Los
productos de estos genes alteran el ciclo celular por su interacción e inactivación de las
proteínas supresoras de tumor P53 y PRB, respectivamente. E l y E2 son las proteínas
que se sintetizan posteriormente. E2 bloquea la transcripción temprana y permite que E l
se una específicamente al origen de replicación viral localizado en el LCR, iniciando la
replicación del genoma viral. Siguiendo el curso de la infección viral, la regulación negativa de E2 sobre E6 y E7 conduce a la liberación de P53 y PRB, y el proceso de diferenciación continúa. Después, un promotor tardío putativo puede activar los genes de la cápside L1 y L2. En esta etapa, los virus maduros son ensamblados y pueden ser detectados
en las capas superiores del epitelio escamoso' 0 .
Se ha observado que una alteración de la transcripción del gen E2 está usuaJmente
asociada con la neoplasia genital maligna. En la ausencia de E2, las proteínas E6 y E7
continúan siendo expresadas de modo constitutivo, provocando la inmortalidad de las
células infectadas y bloqueando el programa de diferenciación epitelial que se mostró en
la figura 1. Los estudios de hibridación in situ han mostrado que los patrones de la expresión de los genes varían de acuerdo al grado de la lesión clínica. Las proteínas de la región temprana del HPV pueden ser detectadas a través de todo el espectro de lesiones de
IIPY. En las lesiones benignas, las proteínas E4 y E5 son las más expresadas, mientras
^nglms
tlel perfil
de expresión
del cáncer
cervical
M. C Virgilio Boc4ii;¿"a García
que la expresión de E6. E7 y E2 es baja. En contraste, E6 y E7 son altamente expresadas
en las lesiones de alto grado.
En las lesiones genitales, el DNA de HPV es detectado más comúnmente como moléculas episomales en las lesiones precursoras, mientras que usualmente se encuentra integrado en la célula hospedera en los tumores malignos. Además, el HPV siempre está
integrado en lincas celulares derivadas de CaCU o en células inmortalizadas por transacción con DNA de HPV 1 6 o 18. La integración del DNA del HPV es considerada como
un paso importante en la progresión del tumor. Las consecuencias de la integración en la
estructura y expresión del genoma viral han sido estudiadas extensamente, pero poco se
sabe de sus efectos sobre los genes celulares involucrados en la proliferación celular. La
integración del genoma viral en el DNA celular puede tener un impacto en los estados
iniciales de la transformación celular, en el mantenimiento del fenotipo transformado y/o
en la progresión del tumor. Además, el genoma viral integrado puede llevar a la expresión
de proteínas con actividad transformante. Toda vez que la integración viral puede provocar que el genoma hospedero gane genes con un nuevo mecanismo regulador que involucra tanto la pérdida de mecanismos reguladores virales o la adición de nuevos mecanismos de ongen celular 3 *.
La integración del HPV en el genoma celular involucra ruptura de la región del gen
E2, por lo tanto se inactiva la expresión de E2. Ya que el ORE de E2 del IIPV codifica
para proteínas de modulación transcripcional, se ha sugerido que la integración del virus
en el genoma del hospedero y la interrupción de la expresión de E2 podría desencadenar
una expresión descontrolada de los genes transformantes E6 y F.7. Otro evento geneial-
-ir.nlISIS del perfil
de expresión
de! cáncer
cervical
M C. Virgilio R o j i n e g r a Gdícía
mente resultante de la integración de HPV-16 o 18 es la expresión de E6/E7 vía transcritos fusionados virales-celulares. También se considera que la localización cromosómica
de la integración del IIP Y pudiera jugar un papel importante en este proceso.
1.2.4. Funciones e interacciones de la oncnproteína viral E7
a) Formación
del complejo PRB-E2F
y la progresión
del ciclo celular: En el epi-
telio escamoso normal, las células basales son las únicas capaces de proliferar y una vez
que dejan la capa basal, comienzan a diferenciarse. Las células normales tienen puntos de
control que se encargan de revisar la progresión del ciclo celular del paso G1 al S y del
G2 al M, de modo que las células con DNA dañado o con replicación incompleta puedan
tener tiempo de reparar el daño. Cuando el HPV expresa la proteina E7, ésta se une a
PRB, provocando una disociación del complejo entre la proteina PRE y la proteína E2F,
lo cual lleva a un incremento en la cantidad de E2F libre. E2F es una proteína que induce
la síntesis de DNA para que la célula entre en división.
En células normales no infectadas, la acción de F.2F cambia durante el curso del ciclo celular. En G l , E2F está asociada con PRB desfosforilada o con las proteínas p l 0 7 o
p l 3 0 . El complejo PRB-E2F funciona como un represor activo del ciclo celular, debido a
que la sobrexpresión de PRB regula negativamente la transcripción de promotores dependientes de E2F por debajo de los niveles basales. La activación de E2F sucede cuando la
célula pasa el límite Gl/S. Los complejos PRB-E2F se disocian y la E2F es libre de actuar como un activador transcripcional siempre y cuando PRB sea fosforilada. La fosfori-
Análisis
del mrñl
de v\¡jres¡iin
dei ctinixr
ctrvicai
M. C. Virgilio Bncancgra G a ñ í a
lación de PRB depende de ciclinas dependientes de cinasas (CDK). Las CDKs consisten
de una subunidad catalítica estable (CDk) y una ciclina, que es una subunidad reguladora
degradable que es resintetizada durante la progresión del ciclo celular.
b) El complejo PRB-E7y
sus efectos. La oncoproteína E7 de HPV-16 evita que las
células suprabasales pasen a la fase GO del ciclo celular, incrementando con esto la cantidad de células replicantes que están disponibles. En las células infectadas por HPV, E7
compite directamente con E2F por la unión a PRB, provocando con éstu un incremento
de E2F libre. E7 pueden interactuar también con proteínas relacionadas a PRB, como la
p l 0 7 y la p 130, las cuales están asociadas con E2F4 y E2F5 en el ciclo celular. Esta interacción lleva a la expresión de ciclina E y ciclina A, las cuales están involucradas en la
inhibición de la familia de proteínas PRB normales. Se ha mostrado que la expresión de
la oncoproteína E7 lleva a la inactivación de varias señales reguladoras del crecimiento,
incluyendo al arresto del ciclo celular mediado por P53 en G l , inhibición del crecimiento
mediada por TGF-beta y quiescencia de queratinocitos suprabasales. En contraste con los
queratinocitos normales, los queratinocitos HPV-16 positivos que expresan E7 muestran
una diferenciación celular retrasada y una actividad de cdk2 cínasa elevada, además de
altos niveles de P21 y asociación de P21 con cdk2. E7 puede interactuar con P21 y eliminar la actividad de inhibición de P21 sobre las actividades asociadas a las ciclinas A y F..
Esta capacidad de interacción de E7 durante la diferenciación de queratinocitos parece
contribuir a la habilidad de E7 de permitir la síntesis celular de D N A en los queratinocitos
en diferenciación 15 . Para más detalles ver la figura 4 donde se tratan de ejemplificar todas
estas interacciones.
•t'uilisis Jd ivdil ¡le ev'/wiún M ÌV'HW an'iwl
M . C. Virgilio B o c a n c g r a (Jarcia
F i g u r a 4. E s q u e m a general d e la regulación del ciclo celular. Cuando hay daño en el DNA, éste se detecta y la célula responde activando factores de reparación e inhibidores de la progresión del ciclo celular.
Dos de las proteínas que responden al daño del DNA son la supresora de tumor P53 y la ciclina c h k l . A su
vez, P53 interactúa con P2I para bloquear la actividad de cdk2 (ciclina dependiete de cinasa 2) evitando el
paso de G l a la fase S y una replicación alterada del DNA. Uno de los blancos de cdk2 es la proteina PRB.
otra proteína supresora de tumor. Cuando está desfosforilada. PRB interactúa con los factores transcripcionales E2F y previene la transcripción de los genes necesarios para la progresión del ciclo celular. Cuando
PRB es fosforilada (PRBp) por ciclinas dependientes de cinasas como cdk2 y cdk4. P R B ya no interactúa
con E2F y el ciclo celular pasa del GI a S. Las oncoproteinas E6 y E7 al interactuar con P53 y PRB previenen las funciones normales de éstas, desregulando el ciclo celular.
1.2.5. Funciones e interacciones de la oncoproteína viral E6 y su efecto sobre P53.
a) P53: proteina supresora
de tumor y su papel en la apoptosis: La proteína P53
fue descubierta originalmente porque forma complejos con el antígeno T de SV40. Ahora
se sabe que interactúa con otras oncoproteinas de virus de DNA como las de los adenovirus y los papilomavirus. El gen que codifica para P53 se encuentra mutado o alterado en
la mayoría de los tumores, implicando que la pérdida del producto normal del gen está
AnyuSLi
perfil
de exortuúr.
de! ranLt'
cervical
M. C Virgilio Hocanegra García
asociada con la emergencia de células transformadas. La proteína P53 es activada por
varias señales, incluyendo el daño al DNA, llevando al subsecuente arresto del ciclo celular y de la apoptosis. Esta proteina actúa como un guardián genómico que previene la
acumulación de errores genéticos, los cuales podrían llevar a la transformación de células
y formación de tumores. La proteína P53 es un factor transcripcional específico de secuencia y los genes que regula incluyen a; p21, gadd 45, bax, mdm2, ciclina G e IGFBP3.
La activación de estos genes relaciona a P53 con las rutas que gobiernan el arresto del
ciclo celular en G l , llevan a la apoptosis o inducen la reparación del DNA. El blanco mejor conocido de P53 es P21, un inhibidor de CDKs (incluyendo a F./Cdk2 y A/Cdk2), el
cual es inducido por P53 a través de un motivo de unión de P53 localizado 2.5 Kb rio
arriba del promotor del gen p21. La inducción de p21 media el arresto del ciclo celular en
G l mediante la prevención de la fosforilación de los miembros de la familia de proteinas
de RB. La función del producto de E6 durante una infección del ÍIPV, es intervenir negativamente en las rutas de regulación del ciclo celular y modificar el ambiente celular para
facilitar la replicación viral en una célula diferenciada terminalmente. Para lograr ésto, la
proteína F,6 se une a P53 y provoca su degradación rápida mediante la vía celular de la
ubiquitina; como consecuencia, cuando la oncoproteína E6 previene todas las funciones
normales de P53, favorece la acumulación de errores en el DNA y con ésto la posibilidad
de que la célula se transforme 36-37 ' 38 .
b) Participación
de PS3 en la apoptosis. La palabra apoptosis procede del griego y
significa "caída con fragmentación", hace referencia a un evento celular descrito clásicamente, que cursa con una condensación del citoplasma, reducción del volumen, condensación de la cromatina con fragmentación del DNA y formación de cuerpos apoptóticos
-jm/i.ti.t
del perfil
d? expresión
del enneer
cervical
M C. V i r g i l i o BrtCim.'gra G a r d a
provenientes de la rotura celular. Este proceso está programado genéticamente y constituye la forma en que se contrarresta cualquier exceso que se produzca en la proliferación de
un tejido. I'or otra parte, supone un medio de seguridad que permite eliminar las células
con genotipo/fenotipo alterado, Este proceso puede activarse igualmente ante diversos
estímulos como la irradiación, quimioterapia, infecciones virales, factores de crecimiento,
hormonas o procesos de desarrollo embrionario.
Estudias recientes han mostrado que muchos virus pueden inducir apoptosis en células infectadas, pero que los virus transformantes pueden inhibir los eventos apoptóticos,
provocando la transformación de la célula. Los virus más estudiados a este respecto han
sido el virus de la vaccinia, citomegalovirus murino, PV, adenovirus y herpesvirus. La
inhibición de la apoptosis se puede llevar a cabo cuando el virus tiene genes homólogos a
bcl-2, debido a que puede generar inhibición de la cascada de las caspas as o inhibición de
Fas/TNF. El mecanismo especifico por el cual los HPVs inhiben la apoptosis aún no esta
claro 39 .
Entre los factores celulares que controlan este proceso se destacan los miembros de
la familia bcl-2. Esta familia contiene dos grupos de genes, los apotóticos (bax, bcl-Xs.
bak, bad) y los antiapoptóticos (bcl-2, bcl-XL, bag-1, mcl-1). Las proteínas interaccionan
unas con otras, por ejemplo, cuando un exceso de bax desplaza a bcl-2, de forma que predominan los dimeros bax-bax en lugar de los bax-bcl-2, la consecuencia es la activación
de la apoptosis. Por el contrario, si existe una sobreexpresión de bcl-2, entonces predomina el dímero bax-bcl-2, lo que inhibe la apoptosis independientemente de los estímulos
externos 40 . Existen otras proteínas fuera de esta familia, que participan tanto como induc-
Análisis
del perfú
da e\pr?s
i ó* del cáncer
cervical
M. C Virgilio B o c a r c g r a García
toras de la proliferación celular como inductoras de la apoptosis, entre éstas están las ya
mencionadas P53 y PRB, además de mvc y ras. Finalmente, es importante destacar el
sistema de proteínas caspasas, que son tanto iniciadoras como efectoras del proceso de
apoptosis. Estas son proenzimas con actividad proteolítica, muy bien reguladas, que
cuando son activadas, matan a la célula inhibiendo las proteínas anti-apoptóticas 41 .
1.2.6. Oncogcnicidad y desregulación del ciclo celular por E6 y E7.
Una vez que la expresión de las oncoproteínas E6 y E7 de los IIPVs de alto riesgo
queda fuera de control, éstas despliegan una habilidad clara para perturbar la regulación
normal del crecimiento celular. Para el HPV, la oncogenicidad evidentemente no es una
parte normal de su ciclo de vida, ya que eventualmente mata al hospedero. Los HPVs son
capaces de inducir síntesis de I)NA celular, lo cual evidencia su dependencia de la maquinaria celular del hospedero. La función de esas oncoproteínas virales durante una infección productiva es asegurar la replicación del virus en las células que han llegado a
una diferenciación terminal. Para ello, tienen medios para evitar los puntos de revisión del
DNA dañado. Por todo ésto, la activación o inactivación de los genes celulares adicionales requeridos para la invasión y metástasis puede no ser una consecuencia directa de las
oncoproteínas F.6 y F.7, sino fenómenos separados en la cadena de transformación celular42/\
Ardil ui ¿el perfil
de pxprrsiñn
del cáncer
•servu ai
M . C". V i r g i l i o H o c a / i í g r a G a / c i a
1 J . L A IMPORTANCIA DE LOS CAMBIOS EN EL PERFIL DE EXPRESIÓN
EN EL DESARROLLO DE CÁNCER.
Todos los procesos llevados a cabo dentro de la célula son controlados en última
instancia por instrucciones del material genético, el que a su vez responde a estímulos
ambientales. Todas las condiciones celulares pueden ser reflejadas en el perfil de expresión de una cclula en un momento dado. El perfil de expresión varía de acuerdo a las necesidades celulares para adaptarse a una determinada situación. Las diferencias básicas
entre una célula normal y una célula cancerosa son conocidas desde hace mucho tiempo,
siendo éstas la capacidad de crecer en cultivo, el número de divisiones que la célula puede llevar a cabo, el requerimiento de factores de crecimiento y la interacción de las células con su ambiente. Sin embargo, los cambios a nivel de perfil de expresión que hacen
posibles estas diferencias no están descritos de manera integral y detallada144. Como todo
proceso, estos cambios deben comenzar de manera sutil, con solo unos cuantos genes
primordiales alterados en su perfil de expresión, de modo que un conocimiento en las
diferencias de éste entre las células normales y cancerosas podría generar conocimiento
suficiente para identificar marcadores tempranos que permitan precisar estos cambios en
sus inicios, para así poder tomar decisiones acertadas sobre el diagnóstico y tratamiento
de determinada condición. 45
1.3.1. Estrategias de análisis de perfil de expresión.
Los primeros análisis para evaluar la expresión de un gen fueron llevados a cabo
mediante técnicas de hibridación con sondas de ácidos nucleicos marcadas con fluorescencia o radiactividad, para identificar genes expresados y diferencias en los niveles de
•jrxiiisif
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de expresión
de! cáncer
¿er/ic.il
M C\ Y i r t i ' i o B o c d - i í g r a Ciu/cia
expresión de éstos. Tiempo después se implemenlaron las tecnologías basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (TCR), las cuales además de permitir analizar un gen,
podían utilizarse para la síntesis in vitro de éste. Sin embargo, ambas técnicas solo permiten el estudio de uno o un grupo de genes relacionados y difícilmente se puede analizar
un perfil de expresión completo, donde se involucran cientos o miles de genes expresados
difcrencialmentc.
Una variante de la PCR, es la tecnología de despliegue diferencial del RKA que
permite comparar dos condiciones celulares en un solo experimento. Otras metodologías
para estudiar los perfiles de expresión son sccucnciación de bancos de D N A complementario (DNAc), hibridación sustractiva, y análisis serial de la expresión genética (SAGE).
Actualmente se cuenta con metodologías más eficientes para detectar y cuantifiear la expresión de varios miles de genes en un solo experimento.
La técnica más reciente para la cuantificación de un gen o un grupo de genes, es la
amplificación por PCR en tiempo real (qPCR). Esta es en principio, igual que la amplificación por PCR común, solo que además de emplear los iniciadores tradicionales, adicionalmente utiliza una sonda que se une específicamente a la región blanco a amplificar, y
es diseñada de tal manera que cada vez que la DNA polimerasa lleva a cabo el proceso
de extensión, destruye a esta sonda. La sonda está marcada con un colorante
fluorescente
(F) y con un "apagador" de la fluorescencia (Q de "quencher"), cada uno colocado en un
extremo de ella; el apagador absorbe la señal del colorante fluorescente cuando la sonda
está intacta, pero cuando la sonda es destruida por la polimerasa, el fluoróforo y el apagador se separan, generándose una señal cada vez que una nueva copia de la secuencia
-ínáliju
delperfil
de exprrsiúr,
del cáncer
cervical
M C Virgilio Hoc aneara García
blanco es fabricada. La señal emitida es detectada por el instrumento y registrada en la
computadora. De este modo, se lleva una cuenta en tiempo real del número de copias que
se van generando, Esta estrategia se ha convertido en una herramienta muy útil en la
cuantificación de la expresión de genes, con el inconveniente mismo de las otras metodologías descritas, la de analizar a un gen a la vez en cada ensayo.
1.3.2. El desarrollo de la tecnología de microarreglos para el análisis de la expresión
genética.
F.l antecedente directo para el análisis de un gran número de genes (perfil de expresión) mediante arreglos de estos, viene de la década de los 80s con Leonard Augenlicht,
quien se enfocó en demostrar que había un cambio sutil pero significativo en los niveles
de expresión de los genes de células cancerosas. Su experimento consistió en tomar 400
colonias de bacterias de una biblioteca de I)NAc, a partir de las cuales extrajo DNA y lo
acomodó en arreglos definidos en una membrana. Con este arreglo de genes, midió el
nivel de expresión en diferentes muestras celulares, marcando los DNAcs de estas muestras con radioactividad' 16 . Con esto logró comparar los niveles de expresión de cientos de
genes en un solo experimento y verificar las diferencias que éstos presentaban en células
normales y en células de cáncer. En estudios posteriores de cáncer de colon, éste investigador demostró que un 3% de lus genes estudiados disminuyeron su expresión a una tercera parte o menos y 5% de los genes ensayados mostraron un aumento tres veces superior en las células de cáncer, con respecto a las células normales de colon. En este estudio
se detectaron cambios en los patrones de expresión en cada etapa del desarrollo del cáncer de colon y además que las células intestinales provenientes de pacientes con una forma heredada particular de cáncer de colon tuvieron patrones de expresión genética dife-
-Inalisis
del p^rfii
da e xfjrvsitin
Un! cana?'
¡.tr-icaí
M . (.' V irgilio B o c a n t f g r a ("jarcia
rentes. Sin embargo, todos estos hallazgos no causaron mucha impresión, porque los revisores argumentaron que las membranas contenían genes no identificados, y de los pocos
que se conocía la secuencia, no se conocía su función. Además eran parte de cientos o
miles de genes cuya expresión cambiaba y las manchas obtenidas por la señal de radiactividad no eran claras para definir con certeza el grado del cambio de expresión. El artículo
fue rechazado en revistas de alto impacto y finalmente fue publicado en Cáncer Research.
Aún publicado, el informe recibió escasa atención y el Instituto Nacional de Salud (NIH)
rechazó una aplicación en busca de fondos para desarrollar el sistema 41 .
Aunque no en forma exacta, básicamente los microaneglos se han considerado como una extensión de las metodologías de hibridación tipo Northern (que rutinariamente
se han empleado para el análisis diferencial de expresión de genes). Solo que los microarreglos permiten el análisis de la expresión de varios miles de genes en un solo experimento apoyándose en la competencia entre dos tipos de sondas, En los análisis de Northern, la sonda está en la solución de hibridación, mientras que en las técnicas de microarreglos la> sondas son las que están fijadas a un soporte sólido, y el material genético a
hibridar es la mezcla de los DNAcs de los dos sistemas a comparar. El desarrollo comercial de los microarreglos solo pudo lograrse de modo práctico, por los avances en el campo de la robótica y en las técnicas de fotolitografía para dirigir la síntesis de bibliotecas
combinatorias aplicadas a la biología molecular. Los microarrcglos de ácidos nucleicos
funcionan mediante hibridación de R N A o DNAc (en solución y marcado), a sondas de
DNA unidas a una superficie, en una localización específica. La relación de la señal obtenida a partir de la hibridación a gran escala competitiva, proporciona una medida del nivel de expresión de un gen dado en una condición determinada, por lo que esta tecnología
•incluir
del perfil
de expresión
del cáncer
cervical
M. C. Virgí.io Bacancgra García
es especialmente útil para el estudio de enfermedades complejas como el cáncer, como ya
lo había demostrado Augenlicht. El primer reporte de un estudio utilizando microarreglos
fiie hecho en diciembre de 1996 por Lockhart D. J y cois 47 . Actualmente la tecnología de
microarreglos es ofrecida por varias casas comerciales y se basa en distintas estrategias,
como tener DNAe completos en los soportes sólidos o también representaciones de los
genes con sondas de 20 hasta 40 nucleótídos. Ixis métodos de mareaje son mediante la
incorporación de nuclcótidos marcados con compuestos fluorescentes y también se dispone de una variada selección de aparatos para detectar y cuantificar las señales fluorescentes.
13.3. Estudios del transeríptoma.
Ahora con el acceso a la secuencia de miles de genes o secuencias expresadas marcadas (ESTs), una de las mas importantes aplicaciones para los microarreglos es el monitoreo de la expresión genética (abundancia del RNAm) 4 *. La colección de genes que son
expresados o transcritos a partir de DNA genómico, referido como el perfil de expresión
o transenptama. es un determinante del fenotipo celular y la función. La transcripción del
DNA genómico para producir RNAm, es el primer paso en el proceso de la síntesis de
proteínas y las diferencias en la expresión de genes son las responsables tanto de los cambios morfológicos y fenotípicos, asi como de ser indicadores de las respuestas celulares a
estimulaciones y perturbaciones ambientales 49 ,
En términos de entendimiento de la función de los genes, el saber cuándo, dónde y
cual gen es expresado y en qué cantidad, es central para entender la actividad y el papel
4rielan de! perfil de eiires/iin deI cáncer 'ei~vic.il
M . C. Vir^i.i j B o c a n c y / a G a r c í a
biológico de la proteína codificada, así como las relaciones entre los productos génicos de
dos organismos que interactúan, como en el caso de las células cervicales y el HPV, en el
desarrollo de CaCU.
1 3 . 4 . Estudios del transcriptuma del CaCU.
Los estudios sobre perfiles de expresión utilizando microarreglos en CaCU se han
enfocado principalmente a dos aspectos: i) identificar genes diferenciaJmente expresados
entre el CaCU y el tejido cervical normal; asi como en ii) establecer parámetros de clasificación de los estadios de progresión del cáncer. Otro enfoque que se les ha dado a los
estudios del transcriptoma del CaCU ha sido para determinar la susceptibilidad o resistencia a la radioterapia con base al nivel de expresión de algunos genes celulares. Los
antecedentes reportados son los siguientes.
En cuanto a los estudios para identificar genes diferencialmente expresados está el
estudio de Nees y cois., en 2001 donde utilizaron microarreglos de DNAc para examinar
las alteraciones globales en la expresión en queratinocitos en diferenciación, después de
ser infectados con retruvirus a los que se les habían insertado los genes que codifican para,
las proteínas E6 y E7 de HPVlfi. I,a expresión de 80 genes celulares (4% aproximadamente) fue reproduciblemente alterada por E6 y/o E7. El análisis por agrupamiento clasificó esos genes en tres grupos funcionales: 1) genes de respuesta a interferón, 2) genes
estimulados por NF-kappaB y 3) genes regulados en la progresión del ciclo celular y síntesis de DNA. Se encontró que E6 reduce la expresión de IFN-alfa y beta, subregula la
proteína STAT-1 y reduce la unión de STAT-l al elemento de respuesta estimulado por
-ímíisis del
pe'fil
de expresión
deI roncer
cervical
M C. Virgilio Bocaiicgrd Garcia
IFN. Por otro lado E7 por si solo fue menos efectivo, sin embargo, la coexpresión de E6 y
E 7 subreguló los genes de respuesta a IFN m á s eficientemente que Eó solo. E6 potenció
la expresión de componentes celulares de la ruta de señalamiento NF-kappaB, incluyendo
a p5Q, NIK y la proteína de interacción a TRAF. E6 también incrementó la secreción de
IL-8, RANTEs, la proteína 1 alfa macrófago inflamatoria y la proteína 10 kappaDa inducible por IFN gamma en los queratinocitos en diferenciación." 0
Cheng y cois., en 2002 utilizaron RT-PCR, despliegue diferencial y microarreglos
de D N A c para identificar genes celulares involucrados en la carcinogenesis de carcinoma
cervical de células escamosas. Se estudiaron 38 pacientes en varias etapas de la enfermedad y 5 pacientes sin CaCU. De particular interés fueron las clonas G32C4B y G3CC que
se identificaron como el gen de la N A D H deshidrogenasa 4 y el gen de la proteína ribosomal S12 que se encontraron sobre expresadas en el cáncer. Los autores indican que
estos genes pudieran ser potencialmente útiles como marcadores de diagnóstico prctransformación de CaCU humano. 5 1
Por otro lado Ruutu y cois., en 2002 estudiaron la carcinogénesis cervical inducida
utilizando una línea celular HPV33 positiva ( U T - D E C - l ) establecida a partir de una displasia vaginal de bajo grado. Para determinar la importancia de la integración del HPV,
compararon el nivel de expresión en queratinocitos de vagina normal, en pasaje temprano
y en pasaje tardío de las células UT-DEC-l utilizando microarreglos de DNAc, El R N A
f u e extraído mediante gradiente de centrifugación con CsCl, sometido a R T con M M L V
R T y marcado con
(32)
P-oATP. Los 16 genes sobre-regulados, identificados al comparar
ambos tipos celulares con los queratinocitos normales, al parecer están involucrados con
Anr.l'.sLc de!perfil
de. ?<prpR¡,in deI cáncer
rcrvicil
M . C. V i r g i l i o H o t x i L ' ¿ ' a G a r c í a
la progresión del ciclo celular o en la mitosis. Estos incluyen al factor de replicación de
DNA mcm4, cdcp34 y el factor de ensamble de la cromatina 1 subunidad p48. Los genes
subrcgulados (44 en total) interfieren con la apoptosis y la adhesión celular, incluyendo
los genes inductores de apoptosis frap, bik y el precursor de caspasa-9. Las diferencias
más significativas entre los pasajes tempranos y tardíos fueran la sobrexpresión de los
factores E2F5 con su compañero de dimenzación D l ' l . NF-kappa B y las serin/treonin
cinasas y la subexpresión de las enzimas de la ruta de MAPK. Con estos datos, la adquisición de una ventaja de crecimiento selectivo después de la integración viral podía ser
explicada por un cambio considerable en la ruta de MAPK en la desregulación del ciclo
celular. 52
También Berger y cois., en 2002 utilizaron microarreglos de DNAc y qPCR para
comparar la expresión de genes celulares en epitelio cervical a diferentes tiempos de exposición a transducción retroviral con los genes E6/E7 de virus de bajo riesgo y alto riesgo. En los pasajes tempranos, las células transducidas con los genes E6/E7 del alto riesgo
demostraron una expresión incrementada de los genes reguladores del ciclo celular C.DC2
y el acarreador de ubiquitina E2-C. En los pasajes tardios, las mismas células exhibieron
incrementos dramáticos en el IGFBP-3, asi como en la proteína intracelular y en la secretada, con incrementos de aproximadamente 85 veces. Estos resultados indican que la sobreexpresión de IGFBP-3 es un evento tardío después de la expresión E6/R7. fenómeno
que también se ha observado in vrvo.53
En otro estudio, el de Alazawi y cois, en 2002 se utilizaron microarreglos para investigar el efecto de la integración del HPV16 en la expresión genética de queratinocitos
4nril,\is
ád perfil
¡ir expresión
del cáncer
M . L'. V i r g i l i o
ftocanrpa
remen!
García
cervicales, utilizando la línea celular W12. Esta línea fiie generada a partir de una lesión
cervical intraepitelial escamosa de bajo grado, infectada de manera natural con HPV16 y
que contiene aproximadamente 100 episomas de HPV16 por célula Con el arreglo de
Affymetrix U95A que contiene sondas para 12600 transcritos humanos, se identificaron
85 genes a partir de un rango de rutas celulares que muestran cambios en la expresión
después de la integración del HPV16. Interesantemente, la integración está asociada con
la sobreexpresión de numerosos genes que responden a IFN. Estos genes incluyen a p48,
un componente del regulador primario de la respuesta a IFN, y al gen del factor estimulador de IFN3. 54
Finalmente, está el reporte de Lee y cois., en 2004 que realizaron un estudio para
identificar los genes y proteínas modulados por el oncogen HPV E7. Se utilizó la línea
C33A para generar una línea estable que exprese F.7. Utilizaron espectrometría de masas
MALDI-TOF y micro arreglos. Detectaron 47 puntos diferenciales mediante electroforcsis
bidimensional. Las proteínas di sulfuro isomerasa A3, proteína de interacción a integrasa
1, protcíiia inhibidora de crecimiento, la glutation S-transferasa P y el protooncogen vav
se encontraron subrcguladas. También la proteina de shock térmico 60 kDa l, la proteína
de unión Ku70, la alfa enolasa y la subunidad 26S del proteasoma estaban sobrereguladas. A nivel de transcripción, con el estuche de microarreglos se encontró que IL12R beta, el citocromo C y el receptor II del factor de necrosis tumoral íueron inducidos
por el oncogen E7. Estos resultados sugieren que E7 puede evadir la vigilancia inmunitaria suprimiendo o induciendo esos factores de señalamiento, reguladores del ciclo celular
y chaperonas. 55
-1 xalitis
del perfil
de expresión
del cáncer
cervical
VI C . V i r g i l i o U n c a n e p / a O a r d a
En cuanto a los estudios para clasificar tumores con base a su estadio en la progresión o a su sensibilidad a radiación, tenemos el estudio de Achary y cois, del 2000 quienes buscaron genes que pudieran identificar a los tumores que son radiosensibles. En un
arreglo de 5776 genes y F.STs conocidos, la expresión de 53 genes se encontró elevada
(con un máximo de 4.1 veces) en las células radioresistentes en comparación con las células radiosensibles. Diez de estas secuencias son genes conocidos, mientras que los otros
42 son ESTs. La expresión de 18 genes fue elevada en células sensibles en comparación
con células radioresistentes, siete de los cuales son genes conocidos y los otros 11 son
ES T. Los genes que mostraron mayor sobre-expresión en las células radioresistentes fueron el factor de transcripción 1 metal regulador, el citocromo p450 CYP1B1, adenomatosis polyposis coli, el factor de enlogación de traducción 1, el eitrocromo-c oxidasa. Mientras que en la linea de células radiosensibles, se encuentra la transcripción del factor NFkappa-B, el precursor de inhibidor de metaloproteinasa 1, la superóxido dismutasa-2, la
proteina de unión parecida a la insulina 3, la proteina de unión a guanina y la pro teína
inducida por el factor transformante de crecimiento bcta. í 6
Por otro lado, Wong YF y cois., en 2003 examinaron los perfiles de expresión del
CaCU comparado con tejido cervical normal en microarreglos de DNA que contenían
aproximadamente 11000 puntos, y que correspondían a genes humanos con función conocida o a ETS. El objetivo era hacer una clasificación de los tejidos en base a su nivel de
expresión. Los resultados mostraron que los tejidos cervicales normales fueron completamente segregados de las muestras de cáncer utilizando aproximadamente 40 genes con
expresión significativamente diferente. Los tumores en estado IB y IIB también pudieron
ser clasificados basados en sus perfiles de expresión. Más aún, algunas de las muestras de
Análisis
del perfil
de evpreuon
de! cáncer
cervical
M . C Virgilui Fincdnegra G a r c í a
tumor fueron estratificadas adicionalmente en dos grupos principales basándose en su
respuesta a radioterapia.'' 7
Finalmente, Chen Y y cois., en 2003 utilizaron un arreglo de 30,000 clonas para
examinar los perfiles de expresión de 34 tejidos cervicales a diferentes estadios clínicos
definidos. Los perfiles globales separaron los tejidos cervicales normales de las lesiones
intraepitelialcs escamosas de bajo grado y a la mayoría de las lesiones intracpitclialcs
escamosas de alto grado y a los cánceres. Entre los 62 genes/EST que estaban sobreexpresados en el tumor y las lesiones de alto grado. 35 fueron confirmados utilizando hibridación in situ con microarreglos de tejido cervical. Y en general, se observó que la sobreexpresión de esos genes incrementó a medida que las lesiones progresaban de bajo grado
a alto grado y finalmente a cáncer.
•inahiis
de! perfil
de expresión
de! cáncer
ce ni
raí
M. ('. Virgilio RocaiKgra García
1.4. JUSTIFICACIÓN
El CaClJ es un grave problema de salud pública y es una enfermedad multifactorial
fuertemente asociada a la presencia de un agente infeccioso, el HPV; específicamente los
HPV de alto riesgo. El cáncer se ha distinguido por ser en una sola patología, un conjunto
de enfermedades complejas, tanto por el efecto que tiene el medio ambiente sobre su desarrollo, como por los mecanismos celulares que están involucrados en su generación y
progresión. Específicamente en el caso del CaCU, la participación del HPV complica aun
más la comprensión de la enfermedad. A pesar de que se han abordado diferentes aspectos en el análisis del perfil de expresión en el CaCU, es necesario conocer qué rutas están
alteradas, asi como el considerar el comportamiento de la expresión global de los genes
celulares y virales (en un mismo sistema), pero en diferentes ambientes. En este trabajo
se realizó la comparación de tres sistemas de CaCl." donde se ohservó el cambio en los
perfiles de expresión de líneas celulares infectadas con HPV-16, con HPV-18 y sin infección, y se analizó la expresión de genes celulares y de genes virales con la finalidad de
definir rutas metabólicas alteradas, afectadas principalmente por el efecto de las oncoprotein's virales.
Análisis
delperfil
tie expres,
un del cáncer
cervical
M ( . V i r g i l i o R o c t u i c g r a Ciareis
C APÍTULO O
OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Analizar el perfil de expresión viral y celular en lincas celulares de CaCU y compararlo con el perfil de expresión de células de cérvix normal, para determinar y seleccionar
aquellos genes con la variación de la expresión global (mayor o menor) mas marcada.
2.2. Objetivos específicos.
1.
Obtener el RNA y el DNA de tejido cervical normal y de las líneas celulares de CaCU,
2.
Analizar el perfil de expresión de los genes del HPV-16 mediante RT-PCR
en tiempo real.
3.
Aplicar la técnica de microarreglos para el análisis del perfil de expresión
celular.
4.
Seleccionar genes con expresión diferencial (sub o sobre expresados) y validar los resultados mediante análisis por RT-PCR,
5.
Realizar el análisis global de los resultados y elaborar las conclusiones
.•Imitisis dei ferii! Je expresión del cáncer cer\-ìcal
M. C. Virgilio Bouincgra Garda
2.3. E S T R A T E G I A G E N E R A L D E L T R A B A J O
F i g u r a 5. E s q u e m a general del desarrollo e x p e r i m e n t a l . La estrategia consistió en la obtención de R N A
de los tejidos a estudiar y lineas celulares y llevar a cabo estudios de expresión de los genes virales seleccionados y el estudio de expresión de los genes celulares mediante microaneglos, para luego, a partir de
esos resultados, seleccionar un grupo de genes y corroborar su nivel de expresión por RT-PCR semicuantitativa.
•irtühsis
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del cdncsr
cervical
M. C. Vi'gil.o Hnuiiiogra (jarcia
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. Origen de los reactivos.
Los materiales utilizados para el cultivo de células (frascos, cajas, tubos, filtros, pipetas, unidades de filtración, etc.) fueron adquiridos de las compañias: Falcon™ (Lincoln
Park, N. L, F.. II. A), Corning (New York, N. Y , E. U. A.), Costar (Cambridge, M . A., F..
U. A.) y Promega (Madison, Wisconsin, E. U. A.). Los tubos de ultracentrifuga de 5.2 mi
se obtuvieron de la compañía Beckman (Mexico, D. F.).
Para el aislamiento del DNA se utilizó EDTA, SDS, NaCl, trizma base, tntón X-100
y fenol, adquiridos de Sigma Chemical Company (Saint Louis, M. O., E. U. A.), así como
ácido clorhídrico, cloroformo, alcohol isoamílico, etanol y cloruro de cesio, de la compañía Merck (México, D. F.). En las reacciones de amplificación y de retrotranscripicion se
utilizaron las enzimas Taq DNA polimerasa y MMLV polimerasa, la solución amortiguadora de reacción, el cloruro de magnesio, los dNTP's, el RNAsin, D'IT y BSA de la compañía Promega y el aceite mineral de Sigma Chemical Company. Para las electroforesis
en gcles de agarosa se utilizó agarosa, trizma base, EDTA, ácido bórico, azul de bromofenol, xilencianol y bromuro de etidio, de Sigma Chemical Company. La solución de lisis
JnálLMS tiel peni!
de e\pre*:án
de/ cáncer
cervical
M . C. V i r g i l i o B o c ü i i i g i a G a r c í a
para extracción de RNA y la solución de preservación de tejido para extracción de RNA
se obtuvieron de la compañía Qiagen, (Valencia, CA, E. U. A).
Los reactivos para preparación de medios de cultivo, así como suero bovino fetal
(SBF), y la tripsina, se adquirieron en Sigma Chemical Co., HyClone, Inc. (Logan, UT, E.
U. A.), DIFCO-LARORA1 ORIES (Detroit, MI, F.. U. A.) y (¡ibco-BRL de BRL Life
Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, E. U .A.) respectivamente. Los reactivos para elaborar las soluciones amortiguadoras, medio de cultivo, geles de agarosa se obtuvieron de:
Sigma Chemical, Co., Merck, y Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, E. U. A.).
Los reactivos para el mareaje de los RNAs y la hibridación de los microarreglos, así como los arreglos de genes PanHuman Cancer Array se obtuvieron de la compañía MWG
Biotech (Ebersgerg, Alemania).
3.2. Equipo.
Se utilizó un homo de microondas Goldstar modelo MA-857M, Microcentrífugas
Eppendorf modelos 5402 y 5415 (Camibh Göttingen, Alemania), ultracentrífuga Beckman modelo TLX120, un termociclador de la compañía MJ Research Inc (San Francisco,
CA, E. U. A.) modelo Pi'100, una fiicntc de poder Gibco BRL, modelo 250, una campana
de flujo laminar marca Labconco Corporation (Kansas, City, MO, E. U. A.), una campana
para PCR CBS Scientific Inc modelo P-036-02 (Los Angeles, CA, E. U. A.), una balanza
digital Sartorios modelo 120ñ MP (Camibh, Göttingen, Alemania), una balanza analítica
O HAUS modelo API 105 (Florham Park, Suiza), micropipetas de Pipetman Gilson de
Raining Instruments CO, Inc. (Emeryville, CA, E, U. A.), un agitador G10 marca New
Análisis
deI pprfii
dt pxpresión
de' cáncer
cen'ical
M . C. Virgilio B o c a ^ c g r a García
Büssings Scientific CO., Inc. (Edison, MI, EUA), jeringas y agujas Becton Dickinson
(ini/ de la Fiora, MG, Brasil), un potenciómetro Beckinan 0320, y un microscopio invertido Karl Zeiss (Mexico, D. F.).
Para los experimentos en tiempo real se utilizó el termociclador ABI Prism 7000 de
la compañía Applied Biosystems (México, D. F.). Para los experimentos de microarreglos
se utilizó el escáner Axon 4000 de la compañía Axon Instruments Ine (Los Angeles CA,
EUA) y para la cuantifícación de los ácidos nucleicos se utilizó el bio-Photometer de Eppendorf.
El procesamiento de los datos se realizó en computadoras marca Power PC marca
Compaq, Presario, MV500 y una Laptop Compaq Presario 1200. Se empleó el procesador
de textos Microsoft Word versión XP, procesadores de gráficos Microsoft Power Point
versión XP, y procesador de hojas de datos Microsoft Excel versión XP, Adobe Photoshop Limited Edition 2.5.1 (1989-1993 Adobe Systems Inc.) y el programa de fotodocumentación Molecular Analyst versión 1.5 de BioRad Laboratories (San Diego CA, E. II.
A.).
Para los análisis relacionados a la Biología Molecular se usò el programa DNA
Strider TM 1.1 (Ch. Marek y CEA, 1989, Service de Biochimie-Départament de Biologie-Institut de Recherche Fondamentale-CEA-Francia), Amplify versión 1.2b (Hill Engels 1992, University of Wisconsin Genetics M, (Madison, WI, E. U. A), Oligo version 4.0 (Plymouth, MN, E. U. A.). Para la búsqueda
al
internet en las bases de datos de
de información se recurrió
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y sitios del NCBl
Annli\¡s
del perfil
de
pt/)»t uón
det cáncer
ce™ wat
M . C. Virgilio B o c o r v g r a García
como
el
programa
Blast
y
la
base
de
datos
OMIM,
GENATLAS
(Mtp:/'/wvvw.gcneallas.oi^/geriB/niain jsp), ATI .AS (htlp://www.irifcihioeen.fr/serv i ees.' c hrnm cajiccr/')T el
Protcin
Data
Bank
(PDB)
(http://www.rcsb.org/ixai/').
y
GENECARDS
(http: i fb\o in forro ati c s. w e izmann .acil/cards/).
3.3. Metodología.
3 3 . 1 . Recolección y almacenamiento de las muestras.
Mediante el apoyo del Dr. Oscar Vidal Gutiérrez., del Servicio de Ginecología del
Hospital Universitario. Se colectaron 26 biopsias de tejido cervical normal (TCN), de
pacientes sometidas a cirugía cervical por causas diferentes a CaCU. Las biopsias tenían
pesos que variaban entre 10 y 40 mg, las cuales al ser obtenidas del paciente se sumergieron en 10 volúmenes de conservador de RNA (aproximadamente 1 mi Qiagen RNA Later®) para su transporte hasta el laboratorio. Inmediatamente se llevaron a 4°C y para
conservación a largo plazo se mantuvieron a -70°C.
Las líneas celulares IleLa, Caski, C33A y Silla se usaron como modelo de CaCU,
ya que IleLa contiene integrado el virus HPV-18, SiHa y Casky presentan el virus HPV16 y C33A es H P V negativa. Las líneas celulares se obtuvieron y cultivaron en el laboratorio de Biología Celular de la ULIF.G, en medio DMEM con 10% de suero bovino fetal
(SBF) en una atmósfera al 5% de CO2. Las células se mantenían hasta llegar al 80% de
confluencia, en este punto se lizaron para obtener el RNA total. Con este material bioló-
Anal'as
de! perfil
de expresión
dej cáncer
M C. Vir^iuu Bocdncgra
cervical
Cía/cía
gico se generaron los sistemas de comparación de expresión para los genes virales (Hela,
SiHa y Caski) y para los genes celulares (SiHaTCN, HeLa/TC-N y C33A/TCN) para observar el comportamiento de la expresión de un tejido canceroso en presencia del IIPV16, del HPV-18 y en ausencia de virus.
3.3.2. Extracción del DNA.
Para la extracción del DNA de las líneas celulares, éstas se recuperaron con tripsina
y se resuspendieron en 50 [il de PBS. Las células luego se trataron con proteínasa K. (10
mg/ml)
agregando 20 |il de esta solución a la muestra (20 mg) y posteriormente se incu-
baron por 30 min a 55°C. 1.a lisis se llevó a cabo mediante la adición TSNT (Tritón 2%,
SDS 1%, NaCl 100 m M y Tris-HCl 10 mM). La extracción del D N A se hizo mediante
separación de fases con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico, siguiendo el procedimiento
estándar de extracción de acuerdo a Sambrock 1988 59 .
La cuantificación de los ácidos nucleicos se llevó a cabo en un Bio-Photometer®, e
acuerdo con las instrucciones del instrumento. El aparato tiene ya funciones preprogramadas para cuantificar directamente ácidos nucleicos y proteínas. Para hacer las cuantíficaciones se realizó una dilución 1:20 (50|al de la muestra y 950 jal agua) y se colocó en
una celda. La celda se colocó en el porta celda del aparato y se llevó a cabo la medición
directa. El resultado se reporta en mg / mi.
Anah\is
dt-i perfil
de expresión
M (
de! raneer
-crviml
Virgilio Bocunegra García
3 J U . Extracción del RNA.
Para la extracción del RNA se probaron varias metodologías con la finalidad de determinar cual de éstas permitía la obtención de RNA de mejor calidad, en mayor concentración y libre de DNA.
Inicialmente se utilizó el reactivo comercial Trisol. En este protocolo, a lml de Usado celular se le agregaron 0.9 mi de Trizol y 0.1 mi de Scvag. Se mezcló en vortex y se
incubó durante 15 min. en hielo, Posteriormente se centrifugó a 2,500 r.p.m y el sobrenadante se recuperó en un tubo limpio para realizar la extracción con fenol cloroformo y
precipitación con etanol.
El otro método que^se utilizó fue el de Qiagen, que es un método de separación del
RNA mediante columnas de sílica. El estuche contiene todos los reactivos necesarios para
la lisis celular. Una vez obtenido el lisado, este se transfiere a la columna y se centrifuga
para retener en ella el RNA y eliminar el resto de líquido y componentes celulares. El
RNA se recupera de la columna con una siguiente solución de "elución". El RNA obtenido esta listo para su uso.
Se probó también el método de ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio, de acuerdo con las instrucciones del Sambrock 1988 56 . En este método, el tejido se
maceró y se hnmogenizó en solución D (isoticianato de guanidina 4 M, 25 mM de citrato
4 nal ais da'. pyrfìl ile expresión dt! cauce' et te a!
M ( ' Virgilio UfKansgra G a r d a
de sodio pH 7, 0.1 M de 2-ME y 0.5% (p/v) de N-laurilsarcosin) o en la solución de lisi«;
del kit RNAcasy® de Qiagen, y el lisado total se colocó cn un tubo de ultracentrifuga con
agua destilada y cloruro de cesio (1 gr/ral) y 20 (il de bromuro de etidio (2 mg/ml). El
tubo se sella y se lleva a ultracentnfugación a 96,000 RPM durante 12 h. Después de la
ultracentrifugación la banda de DNA queda suspendida a la mitad del tubo y el RNA total
queda como un paquete precipitado en el fondo del tubo. Este precipitado se extrae mediante una jeringa con una aguja calibre 20. El paquete es lavado tres veces con etanol al
70% frío en agua DEPC (dieltilpirocarbonato) para eliminar el exceso de cloruro de cesio
y de bromuro de etidio, luego se deja secar 30 min a temperatura ambiente. El RNA seco
se disolvió en agua DEPC mediante calentamiento durante 5 min a 55"C. El RNA se
guarda a -20 3 C o a -7[]°C para conservación a largo plazo.
3.4. CuantificaciÓD del DNA y RNA obtenidos.
La cuantiñcación de los ácidos nucleicos se llevó a cabo en un Bio-Photometer® de
acuerdo con las instrucciones del instrumento. El aparato tiene ya funciones preprogramadas para cuantificar directamente ácidos nucleicos y proteínas. Para hacer las cuantificaciones se tomó una alícuota de 50 fil de la muestra, se colocó en una celda y se llevó a
cabo la medición. El resultado se reportó en mg / mi.
/Injfi.sn
de i perfil
de exQwon
de! cáncer
cervical
M . C. V i r g i l i o B o c a n e g r a ( i a r u i a
3.5, Análisis de los genes virales.
3.5.1. Análisis de las secuencias y diseño de sondas.
Los genes seleccionados para el análisis del número de copias, expresión y actividad fueron E6, E7, E4, L1 y E2. Los iniciadores y las sondas se mandaron a sintetizar por
el servicio "'Assay by dcsign" proveído por Applied Biosystcms de México. Para ello, se
seleccionaron del Gene Bank las secuencias de interés y los sitios específicos donde se
deseaba ubicar la sonda para llevar a cabo la detección (denominadas: coordenadas). En
el diseño de éstas se procuró seleccionar aquellas regiones altamente específicas para cada uno de los genes. Las coordenadas indicadas para cada secuencia fueron: E6
(NC_001526.1) coordenada 531, E7 [NC 001526.1) coordenada 150, E4 (NC_001526.1)
coordenada 150, L1 (NC_001526.1) coordenada 770 y E2 (XC_001526.1) coordenada
652. Las sondas y los iniciadores fueron diseñados por el fabricante con base en esas coordenadas.
3.5.2. Obtención del D N A c de los genes virales.
Las muestras para medir la expresión de los genes virales por qPCR fueron el producto directo de una reacción de RT de los RNAs de cada linea celular (SiHa, CasKi y
HeLa). N o se utilizó el tejido cervical normal ni la línea celular C33A ya que son negativas para ILPV.
en la tabla 1.
Los reactivos para las reacciones de RT se mezclaron de cómo se indica
Ahelea
del perfil
de expx'Sló'!
del cáncer
cervical
M . (" V i r g i ' . i j U o c a n c g r a G a r c í a
TABLA 1
CONDICIONES D E REACCIÓN PARA LA RT DE L O S G E N E S V I R A L E S
Reactivos
Volumen
Buffer 5X (Invitrogen)
2. 0 ^ 1
DNTP's 10 m M (Promega)
1.0 ni
D'IT (Invitrogen)
1.0 ni
RNAsin (Promega)
0.5 \x\
BSA (Promega, dil 1:2)
0.4 ni
Agua MiliQ
1,1
Jll
OligoDT (Promega)
ljü
RNA total (1 ug)
3 Mi
Volumen total
10 ni
El programa en el termociclador PTC-100 MJ Research del laboratorio de Genética
Molecular fue el que se muestra en la tabla 2.
TABLA 2
COP.DICIONES DE INCUBACIÓN PARA LA R E A C C I Ó N D E L A RT.
Paso
Condiciones
25=C
15 min
2
42 a C
60 min
3
72°C
15 min
4
•m
-Inri/, a; del perfil dfl expresión del canrtr
cervirat
M. C. V i r g i l i o Boca.iL.-gra ( l a r d a
El producto de esta reacción (10
totales) se agregó a la mezcla para amplificación
en tiempo real, simultáneamente con la curva de calibración para cada gen. Cada muestra
se analizó por triplicado. Cada punto de la curva de calibración se amplificó por duplicado. Las muestras analizadas fueron DNAcs obtenidos a partir de los RNAs de las lineas
celulares C33A, SiHa y HeLa.
3.5.3. PCR cuantitativa de los genes virales.
3.5.3.1 Diseño de la curva de calibración.
La curva de calibración se construyó mediante diluciones (10, 100, 1000, 10000,
100000, 1000000 copias) del plásmido pHPV16 que contenía todos los genes del virus
HPV-16 (El, E2, E4, E 5 , E6, E7, L1 y L2). Este plásmido fue proveído por el Dr. Grcgory L. Shipley, director del Quantitative Genomics Core Laboratory, Department of lntegratíve Biology and Pharmacology de la University of Texas Medical School at Houston.
3.5.3.2. Montaje de la placa.
Las muestras ( D N A ó DNAc) y la curva de calibración se colocaron en la placa de
amplificación y se cargó y corrió el programa estándar para experimentos de "Assay by
design" que ya viene precargado en el Tcrmociclador de Tiempo Real de Applied biosystems ABI PRISM 7000. La distribución de las muestras en la placa se muestra en la figura 6.
¡ndlhis del perfil <k expresión del cáncer cervical
M. C. Virgilio B n c a n e g r a G a r c í a
pHPVI6
pHPVI6
pHPVI6
pHPVI6
pHPVI6
pHPV16
10
100
1000
10000
100000
1000000
copias
copias
copias
copias
copias
copias
pHPV16
pHPVI6
pHPVIé
pHPV16
pHPVIÓ
pHPVIé
10
100
1000
10000
100000
1000000
copias
copias
copias
copias
copias
copias
DNAc
DNAc
DNA
DNA
SiHa
Caski
SiHa
Caski
DNAc
DNAc
DNA
DNA
NTC
SiHa
Caski
SiHa
Caski
DNAc
DNAc
DNA
DNA
SiHa
Caski
SiHa
Caski
NTC
NTC
NEG
NEG
NEG
i
F i g u r a 6. D i s t r i b u c i ó n d e las m u e s t r a s en la p l a c a p a r a q P C R del s i s t e m a ABI P R I S M 7000. C a d a
placa consta de 96 lugares, y solo p u e d e utilizarse una vez, por lo que es necesario colocar todas las muestras que se desean cuantificar. La distribución de las muestras depende del analista, pero en general se coloca p r i m e r o la curva de calibración y luego las muestras. Siempre se agregan controles que no tienen D N A ,
d e n o m i n a d o s N T C (non template control).
3.5.3.3. Cuantificación del número de copias.
Para la cuantificación de número de copias de DNA de cada gen, se llevó a cabo
una extracción de DNA de cada línea celular y de tejido cervical normal y se utilizaron
100 ng de cada muestra de DNA. Todas las muestras, las correspondientes a la curva de
calibración, al DNAc y al DNA se colocaron en una misma placa de cuantificación, la
cual tiene 96 lugares. De este modo, en una sola corrida se realizaron la curva de calibración, la cuantificación del DNAc y la cuantificación de cada uno de los genes del HPV-16
estudiados.
ArjgíijLS iA7 i?fr/t,'.-/? expresión -Je! r ó n t t r
W . C'. V i r g i l i o
cervcat
HucuncgraGarcía
En este experimento, se determinó la cantidad de copias de DNA y de DNAc de cada gen, utilizando una curva de calibración generada por el plásmido pHPV-16, el cuaJ
contiene el genoma completo del HPV-16.
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo de la siguiente manera: se preparó una mezcla de reacción para cada una de las sondas de acuerdo con las instrucciones
del fabricante como se muestra en la tabla 3.
TABLA 3
CONDICIONES DE REACCIÓN PARA LA PCR CUANTITATIVA.
Reactivos
Sonda e iniciadores
Volúmenes
Agua MiliQ + Muestra
22.5 jil
Master Mix (ABI)
Volumen final
25 \ú
50 pl
2 5 ni
La muestra era DNA o DNAc según el caso, en concentraciones adecuadas para cada experimento como se describe más adelante.
3.5.4. Análisis de resultados.
I .os resultados se obtienen en número de copias detectadas de cada muestra con base en la curva de calibración. Se obtiene el número de copias de DNA de cada gen, del
número de copias del DNAc de cada gen y con estos dos datos se puede determinar la
-irxiliíis del per/"il de expresión del cáncer cervical
M. C" V u g í l 10 n i i L a n s ¿ : a O a i d a
actividad de cada gen individual e n cada línea celular, dividiendo la cantidad de copias de
DNAc detectadas entre la c a n t i d a d de copias de DNA detectadas. Todos los resultados se
grafican por gen, poniendo el n ú m e r o de copias en el eje "y", y las muestras de líneas
celulares en el eje "x".
3.6 Análisis de los genes celulares
Los niveles de expresión de los genes celulares se determinaron mediante la técnica de micro arreglos. Para ésto, se generaron tres sistemas comparativos entre el tejido
normal y la línea celular de cáncer.
En resumen la m e t o d o l o g í a consiste en lo siguiente: se realizó el mareaje de los
RNAs mediante una reacción de R T , para finalmente obtener DNAcs marcados. En cada
sistema se marcó el tejido n o r m a l con el colorante ("y.1 y la línea celular con el colorante
Cy5.
Después del mareaje, los D N A c s se cuantificaron y se mezclaron en cantidades
iguales. La mezcla de D N A c s m a r c a d o s se calentó a 65° C y posteriormente se colocó en
hielo. A la mezcla se le agregó la solución de hibridación y toda la mezcla se colocó sobre la laminilla que contenía las sondas. Se cubrió el arreglo y se sometió a hibridación al
menos 12 h. La laminilla se s a c ó de la hibridación y se realizaron lavados para eliminar el
exceso de la sonda. Posteriormente la laminilla se procesó en el scanner y se obtuvieron
los resultados.
•Inahsis dit per'a! de expresión del rr.nCfr emir ni
M C. V irgilio H o c a n í g r a G a r c í a
3.6.1. Mareaje y síntesis de los DNAc.
Para la síntesis de DTs'Ac marcado de cada muestra se utilizaron 30 jig de RNA total, llevando a cabo el mareaje mediante una reacción estándar de retrotranscripción agregando nucleótidos marcados con los colorantes fluorescentes Cy3 y Cy5 para la muestra
problema y la muestra de referencia, respectivamente, como ae muestra en la tabla 4. El
producto resultante de la reacción se purificó mediante precipitación con 2.5 volúmenes
de etanol al 100% y 1/10 del volumen de acetato de sodio 3 M pH 5 centrifugando a
12000 RPM durante 10 min, al precipitado se le eliminó el sobrenadante y se lavó con 1
mi de etanol al 70% y se centrifugó de nuevo a 12000 RPM durante 10 min. Al precipitado se le eliminó el sobrenadante y se resuspendió en 10
de agua MiliQ y se cuantificó.
-irifili its del rvrfil cie "xpresmn del cancer
ctrviml
M C. Virgilio H o c d n s g r i j G a r c i a
TABLA 4
CONDICIONES D E RT PARA M A R C A J E DEL DNAc
Reactivas
Volumen
Volumen
TCN
Línea celular
17.5 pjJ
17.5 jj.1
Oligo d(T15,20)-Primer (1 pg/^1)
lpl
iMl
5x RT reaction buffer (superscript II kit, invitrogen
8 p.1
8 jil
dNTP master mix
4 p.1
4 pi
1 m M Cy3-dCTP
0 pi
4 nl
Agua MiliQ
1 m M Cy5-dCTP
0^1
0.1 M DTT (superscript II Kit, invitrogen)
Superscript II (200 U, Invitrogen)
RNA
Volumen total
4 jil
4 p.1
1.5 yl
1.5 pi
30 MB (X h-]>
30 ^g (X K l)
50 pi
50 |il
3.6.2. Hibridación cuantitativa a g r a n escala.
Las hibridaciones se realizaron en parejas de una línea celular y tejido cervical normal como referencia, generando los siguientes sistemas de comparación de expresión:
C33A/TCN, Silla/TCN, IIcLa/TCN.
Las placas de microarreglos fiieron obtenidas de M W G Biotech, el aneglo de Pan
Human Cáncer Array que contiene 1921 genes relacionados con cáncer y 79 genes constitutivos como control interno. L o s protocolos y reactivos necesarios para llevar a cabo
estos experimentos fueron proporcionados por el proveedor.
•inai:MS del perfil de p\pre:.>on dei cáncer
cervical
M . C . Vi [ f i ! io J l o o a n c g r a C!a.'cia
Cantidades iguales (15 a 20 |j.g) de éste DNAc marcado fueron colocadas en contacto con la solución de hibridación (MWG Biotech) que se colocó sobre el arreglo de genes
Pan Human Cáncer array de MWG Bintech. 1.a laminilla se colocó en una cámara húmeda de hibridación por 24 h a 42°C. Concluida la hibridación se realizaron tres lavados,
uno en buffer 2x SSC, 0.1% SDS por 5 min a temperatura ambiente, luego en buffer SSC
lx por 5 min a temperatura ambiente y finalmente en buffer SSC 0.5 x por 3 a 5 min a
temperatura ambiente, para eliminar la señal no válida y el ruido de fondo. El portaobjetos se secó en un tubo cónico de 50 mi por centrifugación a temperatura ambiente por 2
min a 500 RPM.
3.6.3. Lectura con el escáner y ohtención de la imagen.
La lectura e interpretación de los resultados se llevó a cabo en un escáner Axon Gene Pix 4000, mediante el software Jaguar Array análisis. El programa permite convertir
la intensidad y tipo de color detectado en el arreglo a valores numéricos, asi como la determinación del ruido de fondo.
Analitis Jti perf'l de expresión dei rarver
cerjiccl
M. C. Virgilio ÜociiDcgra ( i i r c í a
3.6.4. Procesamiento de los datos: Normalización, transformación y selección de genes
F.l análisis de los perfiles de expresión se llevó a cabo con el programa Microsoft
Kxccl XP. Este análisis incluyó sustracción del fondo, un proceso de normalización, el
cual se llevó a cabo mediante un factor de normalización obtenido por la ecuación: (n señal de fondo / En) y transformación a l o g 2 de cada dato obtenido. Solo los genes con
una diferencia de 2.5 o más en su nivel de e x p r e s i ó n fueron tomados en cuenta Con base
a este criterio se seleccionaron los genes con u n a diferencia en la expresión más marcada
en los tres sistemas antes mencionados. D e s p u é s del análisis informático, de cada sistema
se seleccionaron los 6 genes con una mayor diferencia en los niveles de sobreexpresión o
subexpresión.
3,7 Validación de los genes seleccionados por RT-PCR semicuantitativa
3.7.1. Selección de secuencias y diseño de iniciadores.
Para cada gen, se obtuvo su secuencia del GenBank y se diseñaron lus iniciadores
correspondientes. En la tabla 5 y 6 se muestran los resultados.
•I ría has de.'
rft! de expresión del cáncer
lxrvical
VI. (.'. V i r e i l i o B D c a n j g r a Ourcia
TABLAS
GENES SELECCIONADOS Y NÚMERO DE ACCESO A SECUENCIAS
DEL GEN BANK
Gen
No. de acceso Gen Bank
Six-1
NM.005982
Rab3d
NM_004283
Dccl
NM_005215
Mdm2c
NM_006880
Hla-e
NMJ305516
Pt f i S 2
NM_000963
Bripl
NM_032043
Pah
NM_000277
Rab27b
NM_004163
Emkl
NM_017490
Ppp4c
NM_002720
Stat5b
NM 012448
Rab23
NM_016277
Frapl
NM_Ü0495B
-inahstJ Jcl perfil de e-.pres i ón de! cáncer ce me al
M . C. V i r g i l i o BocA-K'gra G a r c í a
TABLA 6
SECUENCIA DE L O S INICIADORES UTILIZADOS PARA LA
AMPLIFICACIÓN D E LOS GENES SELECCIONADOS
SRXL
Rlb3d
Sixl-1 5'
CTGGAGAGCCACCAOTTCTC
Rab3d-I 5
CiTCCTCAGTACTCTGGGC A
.SL*1-2 3'
C ACTTAGGACCCCAAOTCCA
Rab3J-2 3
0TTGACAG<1 AGGGAAGGGAT
Hnpl
Dccl
dcc-1 5'
GAGATGGAAACACr(K5AGCC
B n p l - 1 5'
GCA1 ACAGGGCCTTAAACCA
úcc-2 3
GT G T r T G C J T l T G A G O C C T t í T
tírpl-2
CACKj I o n GCCT1 CUGTAI"I
óccABC-1 5'
AGATGTGGTCCCTÜTCrTGG
BnpABC-1 5'
cccABC-2 3'
GÜTTCi'ITTCCiCTCCAG I'CjTT
BnpABC-2
3
Mdm2c-2 3'
CA GCTTCGG A A C A A O A G A C C
GGGCAAACTAGATTCCACACI'C
HÍae-1
G A T I T r CCGAG TGA \ C C T GC
Hla£-2 3'
CCTCCA TATCACAGCAGCAA
Pah
Pt»2
Ptgs.M 5
Ptgs2-2 3'
CACITTCriTGGAC ICTGCC
G'ICTTATGGCACATTCAGCiC
GG TTTGCTC GGG AT G A ACT A
CAMCKJTACCAACCCAAACC
Hls-c
Mdm2e
Mdm2í-1
3'
?ah-l
Pah-2
5
3
Ksb2?B
ATCRGCRGCAC <\C;TGTTC A A G
C'AATCCTTTGGGTGT ATGOG
ETJCI
Rab27b-1 5'
(K 3 TGGGGAAG A C A A C AT T r C
F.mkl 1 5'
CAAUCTGCiACACXrrTCTG I'G
Rah27b-2 3'
C C AT1 G T G C G T O G I T T A C T C
E m k l - 2 3'
CTC AGGCCGCTT A I T T T C T ü
Ppp4c
?rapl
Ppp4c-I 5'
CAAGGAG A UC G A A G 7 C A A G G
Frapl-1 5'
CC AGC AGG ATATC.AAGG AGC
Ppp4c-2 3 '
TG AGC ACCGTCTC A T T G A AG
P r a j 1-2 3
A TCCC ACTTGTGCTC CAACTC
SW5b
Rab23
Sia5b-1 5'
G TT CKi 7GG A A A T( i A t ¡<"TGG T
Rah23-1 y
f r G A A G A l ATGCiAAGTCCrCCA
Stal5h-2 3'
TGÍ-TIGATCTGTGÍ3CTTCAC
Raí>23-2 3'
ATG AC A G C T ü G A T ü G G T T I C
GAPDH
OLI 15 5
A G t i l CJ ( K j A GTC A A( .'U G ATF7C iGT
01.116 3'
C APGT GGGCC A T G A G C T C C A C C A C
A natías del perfil dt e xpn'Siur del cáncer
cemcn!
M . C". V i r g i l . o B o c í J i e g r a
García
3. 7. 2. Condiciones de reacción de amplificación de los genes seleccionados
Para corroborar y validar los resultados obtenidos por micro arreglos, se llevó a cabo
una RT-PCR semicuantitativa de cada uno de los genes seleccionados en tejido cervical
normal y la línea celular correspondiente. El procedimiento fue el siguiente:
a)
Seleccionar los 3 genes más sobreexpresados y los tres más subex-
presados de cada sistema.
b)
De cada gen se diseñaron un juego de oligonuclcótidos basándonos
en las secuencias del Gen Bank para cada gen.
c)
Se estandarizaron las condiciones para cada una de las R T - P C R se-
leccionadas y se aplicó el procedimiento a las muestras. Las condiciones de R T se
muestran en las tablas 9 y 10. Para el análisis se tomó 1 p,g de RNA total de TCN
y 1 ^.g de RNA de la linea celular correspondiente para llevar a cabo una
de RT. De la reacción de RT se tomaron alícuotas de 1 pl, 3 pl y 5
reacción
para llevar a
cabo la reacción de PCR. Se utilizó el gen ü A P D H como control de amplificación
en reacciones independientes. Del producto obtenido se colocaron 5 jil en un gel
de agarosa al 1.5% y se observó la intensidad de las bandas, la cual fue posteriormente medida por microdensitometría de gel. El procedimiento general se muestra
en la figura 7.
•Inciitíif del iM-rf¡í •te rxareyiüi
del cáncer
cervical
M . C. Virgilio B o c t i i t í g r a G a r c í a
d)
Se diseñaron los iniciadores indicados en material y métodos para
cada uno de los genes seleccionados y se procedió a la estandarización de las condiciones de amplificación para cada caso. D e b i d o a que muchos de estos genes seleccionados aun no estaban reportados en la base de datos, los iniciadores se diseñaron a partir de las secuencias de DNAc reportadas. Por lo anterior, la estandarización se realizó utilizando DNAcs generados de las líneas celulares y de la mezcla de tejidos normales. Las reacciones d e R T se procesaban utilizando oligo-dT
para captar solamente RNAs mensajeros. El producto de reacción se utilizaba como muestra común para llevar a cabo la estandarización de todos los genes seleccionados. Las condiciones óptimas de estandarización se muestran en las tablas 7
y 8.
(ie_ e\or?*<ún de! canter can ical
M . C. Virgilio B o c a n c g r a (Jarcia
TABLA 7
CONDICIONES DE REACCION DE P C R P A R A LOS GENES
SELECCIONADOS. Todas las cantidades e s t á n e n microlitros
Condiciones de amplificación
Gen
Duffcr
MgCl¡ 25
DNTP's 10
Primer 1
Pitmer 2
Agua
Taq
Muestra
six 1
2.5
2.5
1
2
2
13-S
o.s
1
rab3d
2.5
2.5
1
2
2
13 S
05
mdm2c
25
2
]
2
2
14
0.5
hla-e
2.5
1.5
1
2
2
14.5
0.5
25
ptRs2
2.5
2
!
7
2
14
0 5
25
bripl
25
2
]
2
2
14 3
0.2
25
rab27
2.5
2.5
1
2
2
13.8
02
25
emkl
2.5
2
1
2
2
14.3
0.2
25
ppp4c
? 5
1
2
2
143
0.2
25
statS
2.5
1.5
1
2
2
14.75
0.25
2.5
rab23
2.5
15
1
2
2
14.75
0.25
25
írapl
25
1.5
1
2
2
14.75
0.25
25
GAPDH
2.5
2
05
2
2
14.75
025
25
Vohimea
filMj
25
25
1
NOTA Las w n d \ c w n n paiapali y dcci nu se incluyen porque eso? g e n e s n o s e pudie-rm amplificar
25
•1na!is;s 4?¡ perfil de tipreiaón de! cáncer
cervical
M. C. Virgilio B o c a n e g r a G a r c í a
TABLA 8
CONDICIONES DE A M P L I F I C A C I Ó N PARA LA REACCIÓN DE PCR DE
LOS G E N E S S E L E C C I O N A D O S
Condiciones de t e r m o c i c l a d o r PTC-100 MJ Research
six 1
rab3d
mdm2c
hla-e
ptgs2
bripl
GAPDH
9 5 T 5 min
95*C5min
W C 5 min
9S°r « mn
95°C 5 min
95=C * mm
W C Smm
2
W T 1 mió
« ' C í mir
9S C C i m m
95'C I min
95 °C' I mm
? S ' C 1 mm
95-C I muí
3
52 3 C 1 min
5 2 ' C 1 mir.
52°C 1 m i n
52°C 1 min
5C°C l mm
52'C 1 min
52°C 1 nvji
4
7 2 ' C 1 min
UT. 1 mm
72°C 1 m m
7 2 T 1 min
72 °C 1
72 3 C 1 min
72°C 1 mmi
5
3Ü veces
i2
30 veces a 2
'i J veces a 2
30 veces a 2
30 víces a 2
30 veces a 2
30 veces a 2
6
72 C 5 T.in
72 °C 5 mm
72° C 5 ruin
72 D C 5 muí
72°C 5 m m
72 3 C J min
72 CC 5 mm
7
Fin
Fin
Fin
Fin
Fin
Fin
Fin
Pasos
3
ram
Condiciones de t e r m o c i c l a d o r PTC-100 MJ Research
Pasus
rab27
emkl
ppp4C
stat5
rab23
frapl
1
95 °C 5 itlia
95 "C 5 min
9í°C 5 mir
95"C 5 min
9 5 ° C 5 mm
95 °C 5 min
2
95 "'C 1 ir.m
95°C 1 min
95"C I m i n
95"C 1 min
95 °C 1 rmn
9 5 ' C 1 min
3
50"C 1 min
S2"C
l min
S2"C 1 mil)
50°C 1 min
50°C i mm
4 9 a C 1 mm
4
72°C 1 min
7 2 ' C 1 mm
72 ° C 1 m i n
72°C 1 min
72 "C 1 rom
7 2 ' C 1 min
5
30 veto d 2
30 « c u s a 2
30 v c x c s a 2
30 yetes a 2
30 veces a 2
30 veces a 2
C
6
72°C 5 min
72 °C 5 min
72®C S m m
72 C 5 m i l
7l"C 5 min
7 2 ° r ^ mía
7
Fin
Fin
Fin
Frn
Fin
Fui
_
4 reihsis del perfil de expresión dpi rancer
cervical
M. C. Virgilio í t a c a / i c g r a ( ¡ a r e ta
TABLA 9
CONDICIONES DE REACCIÓN DE RETROTRANSCRIPCIÓN
Reactivos
Volumen
BufTer 5 X (Prumega)
2
dNTPs 10 mM (Promega)
M
DTT (Promega)
iMl
^
RNAsin (promega)
o.5 ni
BSA (Invitrngcn)
0 . 2 ni
Agua MiliQ
0.9 ni
MMLV-RT (promega)
o.4 ni
RNA (desnaturalizado 5 min a 70°C)
3M1
OligodT (promega)
ini
Volumen final
10 ni ~ ~
TABLA l ü
CONDICIONES DE INCUBACIÓN PARA LA REACCIÓN D E
RETROTRANSCRIPCIÓN
Paso
Condiciones
1
25 U C
15 min
2
42°C
60 min
3
72°C
15 min
4
Fin
•Ináli.us del fvrlil de expresión del cáncer cervicaI
VI C V i r g i l i o R o c a n e g r a G a r c í a
Cantidades iguales (1
|jg) de RNA de tejido
cervical normal y de la
línea celular
1
A partir de cada
RNA se sintetiza
el DNAc en una
reacción de 10 pl
Se llevó a cabo una
PCR utilizando 1, 3 y
5 p I de cada cDNA
I
F i g u r a 7. P r o c e d i m i e n t o de v a l i d a c i ó n d e los g e n e s s e l e c c i o n a d o s m e d i a n t e R T - P C R s e m i c u a n t i l a t i v a .
Se t o m a r o n cantidades iguales de R N A de tejido cervical n o r m a l y de la linea celular correspondiente y se
llevó a c a b o una reacción de R T para obtener D N A c . La r e a c c i ó n ftie de un volumen total de 10 |jl. El resultado son 10 ni de D N A c de T C N y 10 ni de D N A c de la linea celular. En cada caso se llevó a cabo una
reacción de PCR. utilizando tres cantidades diferentes. I, 3 y 5 n i d e D N A c , para obtener un producto amplificado. Los productos amplificados se compararon en un g e l d e agarosa al 1.5%. Se utilizaron 3 cantidades para descartar la posibilidad de saturación de producto a m p l i f i c a d o q u e podría enmascarar los resultados.
Análisis JW ¡jerúl ríe e\pr?s'an
de! cáncer
cervical
M . (". V i r g i l i o B o c a n e g r a G a r d a
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1. Obtención del DNA y RNA.
4.1.1. Extracción de D N A
La extracción de DNA se realizó a partir de las tres líneas celulares SiHa, Casky y
Hela, con la técnica de TSNT-Proteinasa K. La cantidad de DNA extraído y los parámetros de calidad se muestran en la tabla 11, y en la figura 8 se observa un gel de agarosa
donde se visualiza el DNA extraído.
TABLALL
RESULTADOS DE LA EXTRACCIÓN DF. DNA DE LÍNEAS CELULARES
Vol. Total m> DXA tu tal
Muestra
Abs 260
Abs 280
260/280
I IHg/ml
SiHa
0.175
Ü.Ü95
1.84
235,3
50
11,7
CaSki
0.074
0.038
1.94
187.1
50
9.35
HeLa
0.088
0.045
1.95
219.7
50
10.9
Tejido
0.097
0.068
1.69
243.5
50
12,1
Análisis del ¡vrfil de expresión del cáncer cervical
VI. C Virgilio B o c a n c g r a G a r c í a
F i g u r a 8. E x t r a c c i ó n de D N A g e n ó m i c o a p a r t i r d e lineas c e l u l a r e s y t e j i d o c e r v i c a l . El carril 1 corresp o n d e a D N A d e SiHa, el 2 a D N A de C a S k i , el 3 a D N A de Hel.a y el 4 a TCN. El gel es de agarosa al 1 %
en T B E IX.
4.1.2. P r e p a r a c i ó n del RNA.
La extracción de RNA se realizó a partir de las tres líneas celulares y de 27 muestras
de TCN. Para la extracción se probaron métodos comerciales como el de Trizol de GibcoBRL, RNAeasy de Qiagen, High puré R N A tissue de Roche y el método no comercial de
Chomczynski 6 0 , pero con ninguno d e éstos se logró
obtener la cantidad necesaria de
RNA y en todos los casos el RNA obtenido estaba contaminado con DNA, lo cual implicaba un tratamiento posterior del R N A con DNAsa. lo que disminuía su calidad; además
de que para tratar las cantidades necesarias de RNA para nuestro estudio, se requerían
grandes cantidades de DNAsa (1.5 (al d e DNAsa por 1 pg de RNA).
Después de varios intentos, finalmente el protocolo de extracción de RNA se llevó a
cabo de la siguiente manera: se utilizó la solución de lisis contenida en el kit RNAeasy de
Qiagen sobre tejido cervical macerado (con mortero) o sobre suspensiones de líneas celulares, y la suspensión de tejido se procesó mediante el método de cloruro de cesio, como
Análisis del perfil de expresión del cáncer cervical
M. C. V i r g i l i o B o c a n e g r a G a r c í a
se describió previamente en la sección de métodos. En la figura 9 se observa la separación de los ácidos nucleicos después de la centrifugación.
Restos celulares
DNA
RNA total
F i g u r a 9. R e s u l t a d o de la u l t r a c e n l r i f u g a c i ó n del lisado c e l u l a r p a r a la o b t e n c i ó n de R N A . En la parte
superior del tubo se observan los restos celulares. En la parte central se o b s e r v a la banda correspondiente al
D N A y en el f o n d o se observa el botón de R N A . El R N A se extrae p e r f o r a n d o el tubo con una aguja y succ i o n á n d o l o con la jeringa.
Se puede observar la banda de DNA a la mitad del tubo, en la parte superior se observan los restos celulares y en la parte inferior se observa la pastilla de RNA. Las cantidades obtenidas por este método variaron dependiendo de la cantidad de tejido, entre 10 y
80 ng. Los valores superiores, de entre 50 y 80 jig. solo se pudieron lograr con suspensiones celulares. En las diferentes biopsias, la cantidad extraída varió entre 5 y 16 ng, por
lo que finalmente se hizo una mezcla del RNA de todas las biopsias de TCN y a esta
mezcla se le consideró como una muestra representativa del tejido cervical normal. En la
figura 10 se observa el RNA en gel de agarosa con isotiocianato de guanidina al 1% resuelto por electroforesis. En todos los casos de extracción por este método no se aprecia
fácilmente la tercera banda inferior (5S) del RNA. Sin embargo, estos datos fueron comentados y analizados con un grupo de expertos del Instituto de Fisiología Celular, quienes comentaron que utilizan un procedimiento similar, donde obtienen los mismos patro-
Anal,us M perfil ,/•- expremon
iV'ityr
(enwpf
M . C. Virgilio Bocancgra García
nes. y que esto no interfiere con los experimentos posteriores. La calidad del RNA es bastante alta, a pesar de que la banda 5S es p o c o apreciable por su tamaño y menor concentración
28S
18S
5S
F i g u r a 10. R N A o b t e n i d o p o r el m é t o d o d e u l t r a c c n t r i f u g a c i ó n de g r a d i e n t e en c l o r u r o de ccsio. Las
muestras fueron corridas en un gel de agarosa al 1 % c o n isotiocianato de guanidina (0.005 M ) en T B E D E P C lx.
4.2. Análisis del perfil d e e x p r e s i ó n de los genes virales
Se analizó la expresión de cinco genes virales: E7, E6. E4, E2 y L l , mediante el método de qPCR. Para esto, se midió el n ú m e r o d e copias del DNA de cada gen y el número
de copias de RNA expresadas y a partir de a h í se determinó la actividad de cada uno. En
general, se observó que la actividad de los g e n e s virales presentes en la línea celular SiHa
superaban ampliamente la actividad de éstos m i s m o s en la línea celular CaSki. Los resultados obtenidos para los 5 genes (número d e c o p i a s y número de transcritos), se muestran
en tres gráficas, agrupados por línea celular (Figuras 11-CaSki, 12-SiIla y 13-Hela). En
una cuarta gráfica se muestran las actividades comparativas de cada gen en cada línea
-jnfliusis »j'tf
ptrfil de expresión del cntcer
cervical
M C. V n g j l i o D a c d j i c g r s G a i u a
celular (número de transcritos entre número de copias del gen). Los resultados en detalle
para cada gen se describen a continuación.
4.2.1. Gen E6.
Se determinó que hay 41.8 veces más copias de E6 en la línea CaSki que en la línea
SiHa. Respecto a los niveles de expresión, CaSki tiene 4.4 veces más expresión que SiHa,
pero al determinar la actividad de cada gen (la cantidad de copias de DNAc entre la cantidad de copias de DNA), el gen es 9.5 veces más activo en Silla que en C.aSki, lo cual
implica que la línea celular CaSki tiene muchas más copias del gen E6 que la de SiHa.
Cuando se hace la comparación proporcional entre el número de copias del gen y transcritos detectados, SiHa produce más transcritos por cada copia de gen presente. Estos
resultados indican que la actividad gcnica de E6 es mayor en SiHa que en CaSki. De la
misma manera se realizó el análisis de actividad para todos los genes.
4.2.2 Gen E7.
Los resultados de la expresión de este gen en las líneas celulares estudiadas se observan en las figuras 11, 12 y 13. El perfil de expresión de E7 en CaSki sigue un comportamiento similar al de E6: se detectan 248.4 veces más cantidad de número de copias de
DNA de E7 en CaSki que en S i H a En cuanto al número de copias del DNAc, SiHa tiene
0.14 veces más que CaSki. Al traducir esto a actividad, el gen E7 en Silla está 283 veces
más activo que en CasKi. En la figura 14 se observan los detalles de la actividad de este
gen en cada línea celular.
•incl/nt Jtl perfil & expresión del cáncer cervical
M. C. Virgilio ü o c a n c g r a G a r d a
4.2.3. Gen L l .
Los resultados de la expresión de este g e n se observan en las figuras 11, 12 y 13. Se
detectaron 307 veces más copias de DNA d e L l e n CaSki que en Sil Ta. La expresión de
Ll en CaSki es 62.17 veces mayor que en S i H a . En la gráfica 14 se observan los niveles
de actividad comparativos para ambas líneas celulares. El gen Ll en SiHa tiene una actividad 4.9 veces mayor que el mismo gen el C a S k i , por lo que el patrón se sigue repitiendo: muchas copias de DNA en CaSki, pero b a j a actividad viral (pocos transcritos).
4.2.4. Gen E4.
Los resultados de la expresión de este g e n se observan en las figuras 11,12 y 13. En
el caso CaSki se detectaron 478,501 copias d e D N A del gen E4 pero una baja expresión
de éste con 81039 copias del transcrito. En el c a s o de SiHa, no se lograron detectar copias
de DNA de E4 aunque sí se detectaron transcritos para este gen. De cualquier manera, si
comparamos los niveles de expresión ( n u m e r o de transcritos únicamente) entre las líneas
celulares, observamos que esta es 11,000 v e c e s mayor en CaSki que en SiHa. Como no se
tienen los datos del número de copias del g e n e n SiHa, no se puede hacer comparación de
la actividad entre ambas líneas celulares.
4.2.5. Gen E2.
Los resultados de la expresión de este g e n se observan en las figuras 11, 12 y 13. En
el caso de E2 en la linca celular CaSki, se d e t e c t a r o n grandes cantidades de copias del gen
tnálisis del perfil de expresión de! cáncer cervical
M. C . Virgilio B o c a n e g r a G a r c í a
(1,420,000 copias) y bajo número de transcritos. En el caso de SiHa. no se detectaron ni
copias del gen ni transcritos. La sonda para E2 está diseñada para alinearse con la parte
central del gen. Los resultados pudieran indicar que el genoma viral de HPV está integrado en el genoma celular de SiHa y el gen E2 fraccionado no puede ser detectado por la
sonda. En la figura 14 se observan los detalles de la actividad de este gen en cada linea
celular.
4000000
34833333
:
3500000
17233333
3 0 0 0 0 0 0 4—
5
o
2500000
Ö
2000000
142E»06
1500000
1000000
725818 67
478501
500000
0
A
7.91 E*04
81339 1
E4
• •
i—1
DNA
DNAc
E2
DNA
DNAc
E7
444286
7 49E-04
910109
DNAc
DNA
DNAc
DNA
E6
L1
Genes
F i g u r a 11. Niveles d e e x p r e s i ó n y n ú m e r o d e c o p i a s d e los g e n e s s e l e c c i o n a d o s d e H P V - 1 6 e n C a S k i .
En esta figura se grafican en amarillo los niveles de expresión (transcritos) y en azul el n ú m e r o de copias,
para los g e n e s E4, E2, E7, E6 y Ll en la línea celular CasKi. Ñola: Los números de copias se indican en la
base de cada barra. En este caso, la barra correspondiente al D N A de E7 no se muestra c o m p l e t a , para poder apreciar el resto de los resultados.
Análisis JeI perfil Je expresión del cáncer cervical
M . C. Virgilio Rocancgra García
300000
243E+05
250000
1
200000
398E666 7
150000
100000
60353 6
50000
0
6 95
DNA
3 Q0E*00
DNAc
DNA
E4
J
2 49E-01
DNAc
1732«
•
3560.3
n
DMA
E2
10095
DNAc
DNA
E7
DNAc
DNA
E6
DNAc
L1
Ganes
F i g u r a 12. Niveles d e e x p r e s i ó n y n ú m e r o d e c o p i a s d e los g e n e s s e l e c c i o n a d o s d e H P V - 1 6 en S i H a .
En esta figura se g r a f i c a n los niveles de e x p r e s i ó n d e los g e n e s y el n ú m e r o d e copias de los genes E4, E2,
E7. E 6 y L1 en la linea c e l u l a r SiHa. Ñola: e n e s t e c a s o , la barra correspondiente al D N A c de E7 esta cortada (pero en la base se indica el n ú m e r o de c o p i a s ) , p a r a p o d e r apreciar el resto de los resultados.
80
70
60
50
40
30
20
2.B6M0
10
7 70E-01
222E-01
DNA
DNAc
1
¿
5
0
DNA
DNAc
E4
E2
DNA
DNAc
E7
DNA
DNAc
E6
DNA
DNAc
L1
Genes
F i g u r a 13. Niveles d e e x p r e s i ó n y n ú m e r o d e c o p i a s d e los g e n e s s e l e c c i o n a d o s d e H P V - 1 6 en H e L a .
En esta f i g u r a se g r a f i c a n los niveles de e x p r e s i ó n d e los g e n e s y el n ú m e r o de copias de los genes E4, E2,
E7, E 6 y L1 en la línea c e l u l a r HeLa. La m a y o r í a d e los resultados son de "cero'', y en la barra que muestra
algún valor, la d e s v i a c i ó n estándar es tan g r a n d e q u e los resultados n o son significativos. Esta línea celular
se usó c o m o control ya q u e es negativa para H P V 1 6 .
•tiuili.tli del perfil tle expresión deI cáncer
cervical
VI. C . V i r g i l i o B o e a n c g r a G a r c í a
0.7
0 582
<;Q
0.6
0.5
l CasKi
$
0.4
I SiHa
c
O
•
0.3
HeLa
2.00E 01
0.16
0 2
0 . 1
0
J]
8.50E-02
5.37I
0 0
E4
0
E2
147E-02
0.061
o
1.20E-03 0
L1
E6
i
Ira o
E7
Actividad
F i g u r a 14. Niveles de actividad d e los g e n e s s e l e c c i o n a d o s d e H P V - 1 6 en C a s K i , S i H a y H e L a . En esta
figura se grafican los niveles de actividad de los genes seleccionados en cada linea celular. La m a y o r actividad se observó en los genes de SiHa La barra de actividad de E7 en SiHa está recortada para p o d e r a p r e ciar el resto de los resultados.
4.3. Análisis del perfil d e expresión d e los genes celulares m e d i a n t e m i c r o a r r e g l o s .
Se analizaron los niveles de expresión de los genes celulares en tres sistemas diferentes: SiHa contra TCN, Caski contra T C N y HeLa contra TCN. El mareaje de los R N A
se llevó a cabo durante la síntesis de DNAc mediante incorporación de los colorantes
fluorescentes (Cy3 y Cy5). Las muestras marcadas se hibridaron competitivamente sobre
el microarreglo (Panlluman Cáncer Array). Los resultados obtenidos se normalizaron y
se transformaron en logaritmos base 2. Para cada sistema se seleccionaron los tres genes
más expresados y los tres genes con subexpresión más marcada a partir de las gráficas
obtenidas. Los niveles de expresión de los genes seleccionados se corroboraron mediante
RT-PCR semiquantitativa.
Análisis de! perfil de expresión del cáncer cervical
M. C. Virgilio Bocanígra García
4.3.1. Preparación del DNAc m a r c a d o .
El mareaje y generación del D N A c se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del
manual MWG Biotech, con c a n t i d a d e s de entre 30 y 60 ng de RNA de cada muestra que
se iba a hibridar. Después del p r o c e d i m i e n t o , éste se cuantiflcó con la finalidad de colocar
cantidades iguales de ambos D N A c en el arreglo para llevar a cabo la hibridación. La
figura 15 muestra imágenes d e d o s D N A c marcados: uno con el colorante Cy5 (rojo) y
otro RNA marcado con Cy5 ( v e r d e ) . Como se puede observar en los carriles donde no
hay RNA el colorante se a c u m u l a al final del gel. En los carriles donde hay RNA, se observan las bandas características d e éste, con el colorante respectivo incorporado.
F i g u r a 15. R e s u l t a d o de la síntesis y m a r c a d o d e DN Ac p a r a la h i b r i d a c i ó n a g r a n e s c a l a . En el c a n i l
1 está el colorante C y 5 sin R N A . e n e l carril 2 R N A m a r c a d o c o n Cy5, en el carril 3 R N A marcado con
C y 3 y en el carril cuatro C y 3 sin R N A . C o m o se p u e d e observar en los carriles d o n d e n o hay R N A el colorante se a c u m u l a al final del gel. En l o s c a r r i l e s d o n d e hay R N A se observan las bandas características de
éste con el colorante respectivo i n c o r p o r a d o .
Anal sis del perfil de expresión de! cáncer eervtrcil
M. C Virgilio B o c a r c g r a G a r d a
4.3.2. Hibridación.
Las imágenes de los resultados de las hibridaciones en los arreglos M W G PanHuman cáncer array se aprecian en la figura 16. Las imágenes fueron obtenidas con el
escáner Axon 4000 de Axon Instruments, Inc. Cada uno de los puntos representa un gen
y la intensidad y color de la serial. El escáner convierte estás imágenes en valores numéricos y los organi 72 en una hoja de Micro soft-Excel, donde se realizan posteriormente los
análisis matemáticos.
4.3.3. Normalización y transformación de los datos.
Los resultados generados incluyen entre otros datos: el valor numérico de la señal y
el valor del fondo (background). Se obtiene el Factor de Normalización como se describió
en métodos. Los datos exportados a la hoja de Microsoft-Excel se procesaran de la siguiente forma: a cada dato se le restó la señal de fondo registrada y luego se le aplicó el
factor de normalización. En la figura 17 se observan las gráficas de dispersión no normalizada (NN) y dispersión normalizada (N) de los datos obtenidos del sistema C33A /
TCN.
Au(ïti\<nld
perfil <k< twretion dd çàmrr servirai
M C. Virgilio Bocant-gra Garcia
C33A / Tejido normal
HeLa / Tejido normal
SiHa / Tejido normal
F i g u r a 16. I m á g e n e s d e los r e s u l t a d o s d e la h i b r i d a c i ó n a g r a n escala en los t r e s s i s t e m a s d e a n á l i s i s
de e x p r e s i ó n . De arriba hacia a b a j o corresponde a: C 3 3 A / T e j i d o cervical normal. H e L a / T e j i d o cervical
normal y SiHA/tejido cervical normal.
•IIUÍIÍKIS
del ¡xrrfil de exfirffion del ¡.piicer tfnit yl
M. C. Virgilio Bocuncgra García
Gráfica de Dispersión N
• *
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2
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O
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jm
•
v
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B
C33A
F i g u r a 17. N o r m a l i z a c i ó n d e los d a l o s o b t e n i d o s d e la h i b r i d a c i ó n a g r a n escala. En A se muestran los
datos no normalizados, graficando los resultados de expresión en de TCN en el eje y los resultados de expresión en el e j e x. En B se muestran la misma gráfica después de aplicado el procedimiento de normalización. Se puede observar que la dispersión de los puntos en el inciso B es menor que en el inciso A. En la
figura solo se muestra la normalización del sistema C 3 3 A / T C N . Un procedimiento igual se siguió en los
otros d o s sistemas.
Los dalos normalizados se toman para dividir la señal de hibridación de las muestras en cáncer entre la señal de hibridación de las muestras de tejido cervical normal y se
grafican. Así, se pueden observar los niveles de expresión de cada gen, como se muestra
en la figura 18. generando valores negativos para los genes subexpresados y positivos
para los genes sobreexpresados.
•huillas del perfil de expresión deI cáncer cervical
M. C. Virgilio Bocancgra García
C33A / TCN
40
c
20
'35
0
o
o
o.
x
a>
-20
Q)
-40
d>
>
-60
109
17
3; 5
43¿
541
649
757
865
973
1081
1 1 8 9 I 2 9 7 1405 1 5 1 3 1621 1 7 2 9 H837
-80
-100
Número del gen
F i g u r a 18. G r á f i c a de los d a t o s n o r m a l i z a d o s . Una vez p r o c e s a d o s los datos se obtuvieron las diferencias
en los niveles de expresión de cada gen en cada sistema d e e x p r e s i ó n estudiados. Al graficar, p o n i e n d o el
nivel de expresión en el e j e " y " los genes en el e j e " x " se o b t u v o u n a gráfica c o m o la que se muestra. C o m o
p u e d e apreciarse, a l g u n o s g e n e s presentan picos muy p r o n u n c i a d o s . La gráfica que se muestra es la correspondiente al sistema C 3 3 A / T C N . Un tratamiento idéntico d e los datos se llevó a c a b o en los otros 2 sistem a s de expresión estudiados.
Como las diferencias en expresión de algunos genes son muy grandes, esto hace que
la gráfica sea difícil de manejar y de analizar, así c ó m o de comparar los niveles de expresión que no están tan marcados, por lo que todos los datos obtenidos de la división de la
señal de las muestras de cáncer entre la señal de las muestras de tejido cervical normal se
transforman a logaritmo base 2, obteniéndose una imagen que se muestra en la figura 19.
hitilins del nerfíl de expresión deI cancer cenncai
M. C. Virgilio Bocanegra Garcia
C33A ITCN n o r m a l i z a d o y t r a n s f o r m a d o a Log2
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Número del G e n
F i g u r a 19. D a t o s n o r m a l i z a d o s y t r a n s f o r m a d o s . C o m o se apreciaba en la figura 18. los c a m b i o s en la
expresión en algunos genes eran muy pronunciados, lo cual al graficar enmascara los niveles de expresión
de genes que no tienen cambios tan grandes. Para evitar esta situación, todos los datos son t r a n s f o r m a d o s al
log2 para obtener una gráfica c o m o la que se muestra en esta figura, la cual corresponde al sistema
T C N / C 3 3 A . Un tratamiento idéntico de los datos se llevó a cabo en los otros dos sistemas de expresión
Como se puede observar, los niveles de expresión están en forma más uniforme en
la figura 19, que los que se observan en la gráfica de la figura 18, sin que afecte la apreciación sobre los genes que están considerablemente sobreexpresados o subexpresados.
Las gráficas obtenidas de los tres sistemas analizados mediante este método se muestran
en la figura 20.
I'i'il^is J(1 (\-r¡¡¡
e.xprwM
ccwtfr <¿<;nm¡
M. C Virgilio Bocanegra García
C33A / T C N Normalizado transformado a log2
N ú m e r o del G e n
N ú m e r o de g e n
C)
SiHa / T C N n o r m a l i z a d o transformado a log 2
N ú m e r o de Gen
F i g u r a 20. G r á f i c a s de los t r e s s i s t e m a s a n a l i z a d o s , c o n los r e s u l t a d o s n o r m a l i z a d o s y t r a n s f o r m a d o s .
Se muestran los tres sistemas de e x p r e s i ó n a n a l i z a d o s : a) C 3 3 A / T C N . b ) HeLa/TCN y c) S i H a / T C N .
Aníilisis M perfil de expresión del cáncer cerní a!
M. C. Virgilio Bocancgra García
Con base a los objetivos de esta tesis, a partir de las gráficas de logaritmo base 2
generadas (Figura 20), se descartaron todos los genes en los cuales n o hubiera por lo menos una diferencia de expresión de 2.5 veces. De los genes que sí cumplían con este criterio, solo se eligieron los 3 genes con sobreexpresión o subexpresión más marcada en cada
sistema.
4 .3.4. Selección d e los genes.
Con base en el análisis matemático, se seleccionaron los genes con mayor diferencia
en la expresión. En las figuras 21, 22 y 23 se observan los genes seleccionados en el sistema C33A/TCN. HeLa/TCN y SiHa/TCN respectivamente.
Genes seleccionados de C33A / 1 H U
6
4
2
-
2
-4
#
N
•
ÍHI
/
Gen
F i g u r a 21. G e n e s s e l e c c i o n a d o s en el s i s t e m a C 3 3 A / T C N . En el eje y se m u e s t r a n los niveles de expresión y en el eje x los genes seleccionados. Los g e n e s sobre-expresados son s i x l , r a b 3 d y d c c l y los genes
sub-expresados son m d m 2 c . hla-e y ptgs2.
•M/AK J,iperfil
,/< exprfsián dfl cáncer
wical
M. C. Virgilio Bocanegra García
F i g u r a 22. G e n e s s e l e c c i o n a d o s en el s i s t e m a H e L a / T C N . En el e j e y se muestran los niveles de expresión y en el e j e x los genes s e l e c c i o n a d o s . L o s g e n e s sobre-expresados son b r i p l . pah y r a b 2 7 y los genes
sub-expresados son mdm2c. hla-e y e m k - 1 .
F i g u r a 23. G e n e s s e l e c c i o n a d o s en el s i s t e m a S i H a / T C N . En el eje y se muestran los niveles de expresión
y en el e j e x los genes seleccionados. L o s g e n e s sobre-expresados son ppp4c, rab3 y stat5 y los genes sube x p r e s a d o s son mdm2c, hla-e y frap 1.
Análisis del perfil de expresión de! cáncer cervical
VI. C. Virgilio Bocanegra García
4 3 . 5 . Validación de los resultados de microarreglos.
Los resultados de la validación de la expresión de los genes seleccionados se
muestran a continuación.
4.3.6. Estudios de expresión en C33AyTCN mediante RT-PCR scmicuantitativa.
4.3.6.1. Genes sobre-expresados en el sistema C33A/TCN.
4.3.6.1.1. Gen six 1 (GC14M059102).
En la figura 24 se observan los resultados de las RT-PCR semicuantitativas.
F i g u r a 24. Gel d e la a m p l i f i c a c i ó n d e l gen six-1 y g r á f i c a d e m i c r o d e n s i t o m e t r í a . En p r o m e d i o se detecta 0.8 veces mas expresión del gen en la C33A que en T C N . Los carriles 2 a 4 son el producto amplificad o del D N A c de tejido cervical normal, los carriles 6 a 8 son el producto amplificado del D N A c de C 3 3 A y
lo carriles 5 y 9 son el producto a m p l i f i c a d o de G A P D H de tejido cervical normal y C33 A respectivamente.
Los niveles de expresión de G A P D H en ambas muestras varian muy poco 0.1 veces.
Los resultados de la RT-PCR confirman la sobreexpresión de six 1 en la línea celular
C33A. Como se puede observar en la gráfica hay una sobrexpresión sostenida en las tres
Análisis deI perfil de expresión del cáncer cervical
M. C. Virgilio Bocancgra García
cantidades de DNAc utilizadas para llevar a cabo la amplificación. En promedio se detecta 0.8 veces mas expresión del gen en la C 3 3 A que en TCN.
4.3.6.1.2. Gen rab3d ( G C 1 9 M 0 1 1 2 % ) .
La figura 25 muestra los resultados d e la RT-PCR semicuantitativa.
1
2
3
' 4
5
6
Rab3d
7
14
C 1}
5 »
HS
£a. •,
M.
UJ
• =
•
i s n i1 1
800
400
200
- — j
b
s a
trea 3TCM STCfc OPCXTCa 1CSM ÍCW SCtt CP»
Muestra
F i g u r a 25. Gel d e la a m p l i f i c a c i ó n del gen r a b 3 d y g r á f i c a d e m i c r o d e n s i t o m e t r í a . N o se detecta una
diferencia de expresión significativa entre los dos s i s t e m a s . Los carriles 2 a 4 corresponden a la muestra de
t e j i d o cervical normal, los carriles 6 a 8 a la m u e s t r a d e C 3 3 A y los carriles 5 y 9 a G A P D H de T C N y
C 3 3 A respectivamente. El nivel de expresión de G A P D H aunque tenue está sostenido en a m b a s muestras y
se hace evidente en la gráfica con una variación d e 0 . 0 7 veces.
En los resultados de la RT-PCR semicuantitativa no se observa diferencia entre los
niveles de expresión del tejido cervical normal y el de las células C33A. E incluso según
esta amplificación, los niveles de expresión serían algo menores en C33A; por lo tanto no
se detecta una diferencia de expresión significativa entre los dos sistemas.
4.3.6.1.3. Gen d c c l . (MGC5528).
Este gen no fue posible amplificarlo d e manera satisfactoria. Se probaron dos juegos
de iniciadores diferentes, pero en ambos c a s o s la presencia de bandas adicionales desde la
Análisis del perfil de expresión del cáncer cervical
M . C. Virgilio B o c a n e g r a G a r c í a
estandarización no permitió llevar a cabo un análisis comparativo de su expresión en las
muestras biológicas de interés de este trabajo.
4.3.6.2. Genes subcxpresados en el sistema C33A/TCN
4.3.6.2.1. Gen ptgs2 (GC01 MI 83879).
En la figura 26 se muestran los resultados de la RT-PCR semicuantitativa.
400
V
•
mmm
200
F i g u r a 26. Gcl d e la a m p l i f i c a c i ó n del gen p t g s 2 y g r á f i c a s de m i c r o d e n s i t o m e t r í a . En p r o m e d i o se
detecta una expresión 3.7 veces mayor en T C N que en C 3 3 A . Los carriles 2 a 4 representan el D N A c del
t e j i d o cervical normal, los carriles 6 a 8 el producto amplificado del DNAc de C33A y los carriles 5 y 9 el
producto amplificado obtenido de G A P D H de tejido cervical normal y de C33A respectivamente. Los niveles de expresión de G A P D H son iguales también en a m b a s muestras.
En el caso de este gen, se observan de manera muy evidente, tanto en el gel como
en la gráfica, las diferencias en los niveles de expresión en el tejido cervical normal y en
la linea celular C33A. existiendo una menor expresión de este gen en la linea celular. En
promedio se detecta una expresión 3.7 veces mayor en TCN que en C33A.
4.3.6.2.2. Gen mdm2c (GC12P067488).
En la figura 27 se muestran los resultados de la RT-PCR semicuantitativa.
huilins del per/¡i Je expresión de! cáncer
ccivical
M . C. V i r g i l i o B o c a n c g r a G a r d a
1
2
3
4
6.
5
(TtinCc
7
•ta
200
na
iic* GPtxr«
ta»
Muestra
F i g u r a 27. G e l de la a m p l i f i c a c i ó n d e l gen m d m 2 c y g r á f i c a de m i c r o d e n s i t o m e t r í a s i s t e m a
C 3 3 A / T C N . El gen está en p r o m e d i o s o b r e e x p r e s a d o 0.7 veces mas en TCN que en C 3 3 A . Los carriles 2 a
4 corresponden a las muestras de T C N , los carriles 6 a 8 corresponden a C 3 3 A y los carriles 5 y 9 a
G A P D H de T C N y C 3 3 A r e s p e c t i v a m e n t e . Los niveles de expresión de G A P D H varían 0.09 veces en las
muestras.
Los resultados de este gen siempre generaron bandas adicionales en las muestras,
mas no así en la estandarización. La expresión en células C33A es menor que en tejido
cervical. El gen está en promedio sobreexpresado 0.7 veces mas en TCN que en C33A.
4.3.6.2.3. Gen hla-e (GC06P030563).
En la figura 28 se muestran los resultados de la RT-PCR semicuantitativa.
.12
800
3 4 5 6
7
pb
s
400 p b ^
200 pb
F i g u r a 28. G e l de la a m p l i f i c a c i ó n del gen hla-e y g r á f i c a s d e m i c r o d e n s i t o m e t r í a s i s t e m a
C 3 3 A / T C N . El gen esta 0.3 veces m á s e x p r e s a d o en T C N que en C 3 3 A . Los carriles 2 a 4 corresponden a
la muestra de T C N , los de 6 a 8 a la m u e s t r a de C 3 3 A y los carriles 5 y 9 a G A P D H de T C N y C 3 3 A respectivamente. El nivel de expresión d e G A P D H en a m b o s casos es similar con una variación de 0.09 veces.
Análisis del perfil de expresión deI cáncer
cervical
M. C. Virgilio Bocunegra García
En los resultados de la RT-PCR semicuantitativa se observa que los niveles de expresión de este gen son menores en la línea celular C33A que en tejido cervical normal.
El gen está 0.3 veces más expresado en promedio en TCN que en C33A.
4.3.7. Estudios de expresión de HeLa/TCN.
4.3.7.1. Genes sobrexpresados en el sistema HeLa/TCN
4.3.7.1.1. Gen bripl (GC17M060234).
En la figura 29 se muestran los resultados de la RT-PCR semicuantitativa.
1 2
3 4
5
6 7 8
9
F i g u r a 29. Gel de la a m p l i f i c a c i ó n del gen b r i p l y g r á f i c a de m i c r o d e n s i t o m e t r í a . El gen esta 0.8 v e c e s
más e x p r e s a d o en HeLa que en T C N . Los carriles 2 a 4 corresponden a la muestra de T C N , los de 5 a 7 a la
muestra de HeLa y los carriles I y 8 a G A P D H de T C N y H e L a respectivamente. Los niveles de expresión
de G A P D H varían 0.1 veces.
El gen muestra niveles de expresión más altos en la línea celular HeLa que en el tejido cervical normal, como puede observarse en el gel y en la gráfica. El gen esta 0.8 veces más expresado en HeLa que en TCN.
Análisis del perfil de expresión del cáncer cervical
M. C. Virgilio Bocanegra García
4.3.7.1.2. Gen rab27B ( G C 1 8 P 0 5 0 6 4 4 )
En la figura 30 se muestran los resultados de la RT-PCR semicuantitativa.
F i g u r a 30. G e l d e la a m p l i f i c a c i ó n del g e n r a b 2 7 b y g r á f i c a de m i c r o d e n s i t o m e t r í a . R a b 2 7 b n o muestra
c a m b i o s s i g n i f i c a t i v o s en su expresión en t e j i d o cervical o en la linea HeLa. Los carriles 2 a 4 corresponden a la m u e s t r a d e T C N , los de 10 a 12 a la m u e s t r a de H e L a y los carriles 5, 9 y 13 a G A P D H de T C N y
H e L a respectivamente, los carriles de 6 a 8 s o n c o n t r o l e s de amplificación. Los niveles de G A P D H varían
0.1 veces, s i e n d o m e n o r la expresión en H e l . a .
Al igual que en sistema TCN / C 3 3 A este gen de la familia Rab, el Rab27b no
muestra cambios significativos en su expresión en tejido cervical o en la línea HeLa.
4.3.7.1.3. Gen pah (GC12M101735).
El gen pah fue imposible de amplificar. No se obtuvo señal en ninguna de las condiciones probadas con el juego de iniciadores disponibles.
4.3.7.2. Genes subexpresados e n el sistema HeLa/TCN
4.3.7.2.1. Gen mdm2c (GC12P067488). En la figura 31 se observan los resultados
de la RT-PCR semicuantitativa.
•Ináiins del perfil de ewreswr deI cáncer
cervical
M . C. Virg 10 B o c a n e g r a G a r c í a
Ivtim2c
F i g u r a 31. Gel de la a m p l i f i c a c i ó n del gen m d r o 2 c y g r á f i c a d e microdensnometria s i s t e m a
H e L a / T C N . El gen esta 0.7 veces m á s expresado en promedio en TCN que en HeLa Sin e m b a r g o , l o s
niveles de expresión de G A P D H son muy dispares en a m b a s muestras con una variadón de 0.5 v e c e s ,
h a b i e n d o mayor expresión en HeLa. Los carriles 2 a 4 corresponden a la muestra de TCN, los de 6 a 8 a la
muestra de HeLa y los carriles 5 y 9 a CiAPDH de T C N y HeLa respectivamente Sin embargo, los n i v e l e s
de expresión de G A P D H son muy dispares con una diferencia de 0.5 veces. Existiendo mayor e x p r e s i ó n en
HeLa.
En este ensayo, en el punto de 1 ni de DNAc de HeLa no se obtuvo señal, pero en el
resto de los puntos ensayados se ve claramente que el nivel de expresión de este gen está
disminuido en la línea celular HeLa. El gen esta 0.7 veces más expresado en promedio en
TCN que en HeLa.
4.3.7.2.2. Gen hla-e (GC06P030563).
Los resultados de la RT-PCR se muestran en la figura 32.
Análisis J<¡perfil
expresión de! cqn^er cernea!
M. C. Virgilio Bocancgra García
F i g u r a 3 2 . Gel d e la a m p l i f i c a c i ó n del g e n h l a - e y g r á f i c a d e m i c r o d e n s i t o m e t r í a s i s t e m a H e L a / T C N .
El g e n esta 0 5 veces más e x p r e s a d o en p r o m e d i o en T C N q u e en HeLa. Los c a n i l e s 2 a 4 corresponden a la
m u e s t r a d e T C N , los de 6 a 8 a la muestra de H e L a y los carriles 5 y 9 a G A P D H de T C N y H e L a respectiv a m e n t e . Los niveles de G A P D H son similares c o n una variación de 0.05 veces, detectándose menor expresión en H e L a .
En este gen se muestra una clara disminución de sus niveles de expresión en la línea
celular HeLa que en tejido cervical normal. El gen esta 0.5 veces más expresado en promedio en TCN que en HeLa.
4.3.7.2.3. Gen emk-1 (GC11P063382).
Los resultados de la RT-PCR semicuantitativa se muestran en la figura 33.
F i g u r a 3 3 . G e l d e la a m p l i f i c a c i ó n del gen e m k - l y g r á f i c a d e m i c r o d e n s i t o m e t r í a . El gen esta 0.6 vec e s m á s expresado en p r o m e d i o en T C N q u e en HeLa. Los carriles 2 a 4 corresponden a la muestra de
T C N , los d e 6 a 8 a la muestra de HeLa y los c a r r i l e s 5 y 9 a G A P D H de T C N y H e L a respectivamente. La
expresión de G A P D H es m e n o r también en H e L A con una diferencia de 0.4 veces.
Análisis del perfil de expresión del cáncer
ccnical
M C. Virgilio Bocanegra García
Para este gen se observa menor expresión en HeLa que en tejido cervical normal. El
gen esta 0.6 veces más expresado en promedio en TCN que en HeLa.
4.3.8. Estudios de expresión en SiHa/TCN
4.3.8.1. Genes sobreexpresados en el sistema SiHa/TCN
4.3.8.1.1. Gen ppp4c (GC16P030126). Los resultados de la RT-PCR semicuantitativa se observan en la figura 34.
F i g u r a 34. G e l de la a m p l i f i c a c i ó n d e l gen p p p 4 c y g r á f i c a d e m i c r o d e n s i t o m e t r i a . El g e n esta 0 . 2 veces más expresado en SiHa que en T C N . Los carriles 2 a 4 corresponden a la muestra de T C N , los de 10 a
12 a la muestra de SiHa y los carriles 5, 9 y 13 a G A P D H de T C N y SiHa respectivamente, los carriles de 6
a 8 son controles de amplificación.
En este gen se observa una sobrexpresión ligera en la línea celular SiHa. El gen está
0.2 veces más expresado en SiHa que en TCN.
4.3.8.1.2. Gen stat5b (GC17M040726).
Los resultados se muestran en la figura 35.
Ifirito/j perfil de <xpr<fjón del cánstr (ervfcal
M. C. Virgilio Bocanegra García
4.3.8.1.3. Gen rab23 ( G C 0 6 M 0 5 7 1 0 0 ) .
Los resultados del análisis de a m b o s genes (stat5b y Rab23) por RT-PCR semicuantitativa se muestran en la figura 35.
F i g u r a 35. Gel d e la amplificación d e los g e n e s s t a t S b y r a b 2 3 y g r á f i c a s d e m i c r o d e n s i t o m e t r í a .
Stat5b esta 0.3 veces más expresado en SiHa q u e en T C N . El gen rab23 también presenta este mismo comportamiento. el gen esta 0.5 veces más e x p r e s a d o en SiHa que en TCN. Los carriles 1 y 2 representan la
amplificación para el gen Stat5 de la linea c e l u l a r S i H a y TCN respectivamente; los carriles 4 y 6 son la
amplificación de G A P D H de SiHa y T C N r e s p e c t i v a m e n t e . Los carriles 4 y 5 representan a TCN y SiHa
respectivamente. Los niveles de expresión d e G A P D H son similares en ambos tejidos con una variación de
0.05 veces en el caso de Rab23.
En el análisis por RT-PCR semicuantitativa, la expresión del gen Stat5b es mayor
en la línea celular SiHa que en el tejido cervical normal, el gen esta 0.3 veces más expresado en SiHa que en TCN. El gen r a b 2 3 también presenta este mismo comportamiento, el
gen esta 0.5 veces más expresado en S i H a que en TCN.
4.3.8.2. Genes subexpresados en e l sistema SiHa/TCN.
4.3.8.2.1. Gen frapl. (GCOIMO10876).
Los resultados de la RT-PCR semicuantitativa se muestran en la figura 36.
•Iw/isis <Jdj><rftl (le fvp'ewn (Jfl ráiiftr igrviffl/
M . C . Virgilio H o c a n e g r a (Jarcia
1TCN GPOH
5
GPCH
TCN SiHa SiHa
Muestra
F i g u r a 3 6 . Gel d e la a m p l i f i c a c i ó n d e l gen f r a p l y g r á f i c a de m i c r o d c n s i t o m c t r í a . N o se observa una
diferencia significativa en los niveles de expresión en las muestras analizadas, la diferencia detectada es de
0.1 veces.
En este gen no se observa diferencia en los niveles de expresión en ambas muestras.
En el caso de GAPDH se observa una expresión mas marcada en el caso de tejido cervical normal.
4.3.8.2.2. Gen mdm2c (GC12P067488).
Los resultados de la RT-PCR semicuantitativa se muestran en la figura 37.
F i g u r a 37. Gel de la a m p l i f i c a c i ó n del gen m d m 2 c y g r á f i c a de m i c r o d e n s i t o m e t r i a . El gen esta 0 . 5 5
veces más expresado en T C N que en SiHa. Los c a n i l e s 2 a 4 corresponden a la muestra de T C N , los de 6 a
8 a la muestra de SiHa y los carriles 5 y 9 a G A P D H de T C N y SiHa respectivamente. La diferencia de
expresión de G A P D H es de 0.12 veces
cervical
M. C . V i i ^ i l i o B o c a n e g r a G a r c í a
El punto de 1 |al de D N A c no dio señal, pero en el resto de los puntos se observa
una disminución clara en los niveles de expresión del gen mdm2c en la línea celular
SiHa. El gen esta 0.55 veces más expresado en TCN que en SiHa.
4.3.8.2.3. Gen hla-e (GC06P030563).
Los resultados de la R T - P C R semicuantitativa se muestran en la figura 38.
3 4 5
6
7 8 9
800
400
200
F i g u r a 38. C e l d e la amplificación d e l gen hla-e y gráfica d e m i c r o d c n s i t o m e t r í a . El gen esta 0.4 veces
más expresado en TCN que en SiHa. Los carriles 2 a 4 corresponden a la muestra de TCN, los d e 6 a 8 a la
muestra de SiHa y los carriles 5 y 9 a G A P D H de TCN y SiHa respectivamente
El nivel de expresión de hla-e es considerablemente menor en la línea SiHa que en
el tejido cervical normal. El gen esta 0.4 veces más expresado en TCN que en SiHa.
4.3.9. Resumen de resultados d e validación de los genes seleccionados de los experimentos de m i c r o a r r e g l o s .
Los resultados de la validación en los tres sistemas se muestran en la tabla 12. De
los 18 genes seleccionados 13 pudieron ser corroborados, y al hacer un análisis de su me-
4 rial ¿su citi perfil lie expresión de! cttnctr cervici! I
M. C". Virgilio B o c a n e g r a G a r c í a
canismo de acción se determinaron seis r u t a s de señalamiento donde estos genes participan.
T A B L A 12
R E S U L T A D O S DE LA C O R R O B O R A C I Ó N D E LA EXPRESIÓN DE LOS
GENES S E L E C C I O N A D O S .
Sistema C 3 3 A / T C N
Genes sobrexpresados
Genes subexpresados
Gen
Corroboración
Gen
Corroboración
sixl
SI
mdm2c
SI
rab3d
NO
hla-e
SI
dcc
NO
ptgs2
SI
Sistema H c L a / T C N
Genes sobrexpresados
Genes subexpresados
Gen
Corroboración
Gen
Corroboración
bripl
SI
emkl
SI
pah
NO
mdm2c
SI
rab27
NO
hla-e
SI
Sistema S i H a / TCN
Genes sobrexpresados
Genes subexpresados
Gen
Corroboración
Gen
Corroboración
ppp4c
SI
frapl
NO
rab3
SI
mdm2c
SI
stat5b
SI
hla-e
SI
•ínahsis dtl perfil de exon-n^r, de! cáncer
cervical
M C Virgilio !3ocar.¿gra (iarCia
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN
El CaCU es un gran problema de salud mundial al que muchos investigadores de diferentes áreas del mundo han dedicado su esfuerzo. Gracias a las herramientas moleculares fue posible estudiar y caracterizar con detalle al agente etiológico o al menos altamente asociado a esta patología: al HPV. En la actualidad, virtualmente existe una explosión
de información y de nuevas investigaciones sobre la biología molecular del virus y su
papel en el desarrollo del cáncer de cérvix. A la vez, se amplia la lista de genes del huésped que se asocian y/o participan en el desarrollo de esta patología. Recientemente, a raíz
de la información de miles de genes secuenciados con el Proyecto del Genoma Humano y
del surgimiento de nuevas herramientas de alto rendimiento (que permiten el estudiar de
genomas completos en un mismo ensayo), la manera de abordar tales investigaciones es
ahora diferente. Por un lado, se cuenta con metodologías que permiten detectar y cuantificar en forma muy precisa, cantidades mínimas de secuencias de DNA; y por otro lado,
existen con metodologías que permiten hacer tamizajes de la expresión de cientos y miles
de genes en un solo ensayo. Sin embargo, hasta ahora son muy escasos los trabajos que se
han reportado en los que se analiza en forma global la expresión de genes celulares y virales en un modelo de cáncer de cérvix.
Análisis deI perfil de ewetiói11leí
"á'icer
ce^iccl
M . C. Virgilio i í o c a n e g r a G a r c í a
El objetivo de este trabajo fue el de analizar y comparar los cambios en los perfiles de expresión de los genes virales y celulares en sistemas de CaCU en los que se terna
incorporado el genoma del V P H ; para ello, se utilizaron líneas celulares que estaban infectadas con HPV-16 (Caski y SiHa), con HPV-18 (HeLa) y sin infección (C33A). A su
vez, cada línea celular se comparó contra un mismo conjunto de tejidos de cérvix normal,
lo que permitió tener un patrón d e expresión constante entre los tres sistemas para validar
los datos obtenidos.
En este trabajo encontramos que la expresión de los genes seleccionados en la linea celular SiHa esa sostenidamente mas elevada que en CaSki. En los estudios de expresión de los genes celulares, hubo cambios en un número considerable de los genes seleccionados en el arreglo, pero solo elegimos los genes con mayor o menor subexpresión.
Con base a esto, 18 genes fueron estudiados por RT-PCR semicuantitativa y 13 pudieron
ser corroborados. Los detalles de los hallazgos se discuten a continuación.
S.l. Perfil de expresión de los genes virales.
Para estos experimentos se utilizaron únicamente las líneas celulares Caski y SiHa,
que son las que tienen integrado el genoma de HI'V 16. Se determinó el número de copias
y los niveles de expresión de los genes E4, E6, E7, L1 y L2, ya que éstos dan una clara
idea de la actividad viral. Se observó que la línea celular CaSki tiene consistentemente
mayor número de copias que los que tiene SiHa; sin embargo, cuando analizamos la acti-
•Ing/his del perfil de exprefiór
del cáncer
cervical
M . C'. V irgilio B o c a n c g r a G a r ú a
vi dad de los genes, ésta no es proporcional al número de copias observado, ya que SiHa
es la que presentó mayor actividad.
El hecho de que los genes de la línea celular Caski no presenten niveles de expresión elevados, como se esperaría, indica que debe existir algún mecanismo que inhiba la
expresión de los genes en esta línea celular. Recientemente, en un trabajo reportado por
Badal S. y cois., en el 2004 6 ' reportan que el genoma de IIPV p u e d e ser eficientemente
metilado por las enzimas metilasas del hospedero, y que diferencias en el patrón de metilación podrían explicar las diferencias de la expresión. En este estudio, no se exploraron
los patrones de metilación de las líneas celulares analizadas, pero es interesante considerar que cuando se hace el diagnóstico de HPV en una muestra clínica, solamente se detecta la presencia del genoma viral, pero nunca se determina si los genes de éste, están o no
expresándose, ni tampoco se determina la actividad de estos; lo cual pudiera tener implicaciones importantes en la evolución de la infección del HPV en el tejido cervical.
Finalmente, debido a que los niveles de expresión y la actividad de los genes virales
varían ampliamente entre si, se dificulta establecer una relación entre éstos y el estado
fisiológico
de las lineas celulares o determinar la situación funcional del virus en estas
líneas de manera clara.
A pesar de estas diferencias de niveles de expresión en las líneas celulares y entre
genes, las células están transformadas o como en el caso de la línea celular C33A la cual
está transformada sin siquiera estar infectada por HPV. Esto indicaría que los niveles de
expresión de las proteínas E6 y E7, necesarios para iniciar la transformación maligna son
Anal'sis de! f t ' f i l de expresión de i cáncer
cervical
M . C. V írgilio B o c a n e g r a G a r c í a
muy bajos, o que se requiere una susceptibilidad previa dentro de los mecanismos de regulación celulares, para que pequeñas cantidades de las oncoproteínas E6 y E7 puedan ser
efectivas. Tampoco se descarta que sea necesaria una serie de eventos moleculares posteriores para lograr la transformación maligna, d e los cuales la infección viral y la interacción de las oncoprotéinas E6 y E7 serían solamente unos de los primeros fenómenos requeridos.
Dentro de la biología estos sistemas, la integración del genoma viral en el genoma
celular, y el posterior descontrol de la expresión de los genes virales que lleva a un "secuestro" de las proteínas E6 y E7, genera u n a situación desfavorable para el desarrollo
natural del virus, por lo que es evidente que el m i s m o virus se ve afectado al momento en
que las células se transforman, dejando de lado el modelo del patógeno que daña al hospedero para favorecer su propia biología.
Con todo ésto el papel del virus de HPV-16 en el CaCU parece ser un elemento secundario a un desbalance en los mecanismos d e regulación y/o vigilancia celulares, lo que
a su vez favorece la integración del virus y hace que la célula sea más susceptible al efecto de las oncoproteínas E6 y F.7 y lleva a la posterior transformación.
En cuanto a los genes E2, E4, y L1 solo se observó una variación en sus niveles de
expresión y actividad en ambos sistemas, pero siguiendo el mismo comportamiento, estando estos más activos en la línea celular SiHa. Los efectos y actividad de los productos
de estos genes en las células son menos claras q u e las actividades de E6 y E7.
Inaliws Je! perfi' de expresión del enriar
cervical
M C. V n g . l i u B o u u i e ^ i a ( i a i c i a
S.2. Perfil de expresión de los genes celulares.
A partir de los experimentos de microarreglos se seleccionaron 18 genes en los tres
sistemas de expresión estudiados, de los cuales 13 fueron validados por RT-PCR semicuantitativa. Estos genes pertenecen a diferentes rutas, de las cuales seis pudieron ser
identificadas, y se describen en el apéndice 1. Sin embargo las rutas donde participan
estos genes son de mecanismos muy diversos, que van desde mecanismos relacionados
con el sistema inmune, hasta rutas metabólicas, pasando por cascadas de señalamiento y
formación y estabilidad de los micrntúbulos.
Con relación a los estudios ya reportados sobre el perfil de expresión del CaCU, en
todos los casos se detectan rutas de señalamiento diversas alteradas en cumparación a las
diversas muestras que se usan como control. Nuestro estudio coincide con el de Ruutu M
y cois del 2002 en que el gen FRAP está subexpresado, aunque en este trabajo ese gen no
se pudo validar por RT-PCR semicuantitativa. Con relación a los demás trabajos, todos
reportan modificaciones en genes y rutas de señalamiento diferentes. Sin embargo, hay
una coincidencia entre los reportes de Nees M y cois 2001, Ruutu M y cois 2002 y Achary y cois 2000, quienes encuentran al gen NF-kappa B sobrexpresado en los tumores. En
nuestro trabajo también se incluyó este gen, pero en los tres sistemas estudiados se encuentra dentro de los genes con cambio no significativo. El gen NF-kappa beta esta involucrado en la generación de p50, p l 0 5 y en el desarrollo de la apoptósis. En este trabajo
encontramos a los genes mdm2b y a hla-e con baja expresión en los tres sistemas, lo cual
Ar.chsis de!pprftI de. e~cpresidí de!roncee
cervical
M L. Virgilio B o a i r i e - p a G a i c í a
es de notar, ya que en otros tumores, la expresión de mdm2b siempre está elevada, y al
ser una molécula de control de P53, f a v o r e c e la desregulación del ciclo celular; la pro teína hla-e es un molécula de identificación de las células, si esta molécula no está correctamente expresada o en las cantidades adecuadas, las células NK lo detectan y eliminan a
las células con está molécula expresada defectuosamente, según nuestros resultados, las
células de CaCU utilizadas deberían de ser muy susceptibles al ataque de los NK.
Es importante recalcar que no s ó l o el papel de las rutas de señalamiento identificadas queda por esclarecer, sino también el papel de los mismos genes, ya que aunque todos
han sido previamente relacionados con cáncer en otros tejidos, no se ha determinado el
papel concreto que juegan en cada caso y mucho menos en el caso específico del CaCU.
Por lo tanto, es necesario que éstos g e n e s sean explorados individualmente con mayor
detalle para poder establecer o descartar un papel importante en el desarrollo del CaCU.
Las variaciones entre los trabajos s o n debidas en parte a que no se utilizan los mismo sistemas de estudio del transcriptmna, e incluso, los grupos de genes incluidos en los
aríeglos estudiados son diferentes; pero también debido a que las alteraciones del transcriptoma son muy considerables, no s o l o en el impacto sobre la expresión de un gen determinado, sino sobre la cantidad de g e n e s que se alteran en relación con un tejido no
transformado.
Finalmente, además del posible p a p e l que tengan los genes descritos en este trabajo
sobre la biología del CaClJ, un análisis de la expresión en muestras de displasias sería
muy útil para poder determinar si alguno de los genes identificados pueda servir como
-tnáh.MS le! perfil de expresión del cáncer cervical
M C. \ irgilio l i o c a n c g r a G a r c í a
marcador temprano de desarrollo del CaCU o si el efecto en su expresión solo se da
cuando la célula ya ha sido transformada.
Añedías dt.l perfil de expresión de! cáncer
cervccil
M C. V ' i r g ü b B o c d n e g r a G a r d a
C A P Í T U L O VI
CONCLUSIONES
• Se impleraentó un sistema de cuantificación de la expresión de los genes del HPV
mediante la técnica de PCR y qPCR y se determinaron los niveles de expresión de los
genes clave del I1PV-16.
• Se determinó la actividad de los genes E4, E6, E6, L1 y L2 de HPV 16, con base a
los resultados de expresión, en las lineas celulares Caski y SiHa (que tienen integrado el
genoma de HPV-16)
• Se analizaron tres sistemas de lincas celulares de cérvix en relación a tejido cervical normal y se seleccionaron 18 genes con los niveles de expresión mas diferenciados (6
por cada sistema)
• De estos genes 13 fueron corroborados por RT-PCR semicuantitativa y se detectaron 6 rutas de señalización celular donde estos genes están involucrados.
• Se implemento el sistema básico de estudio del transcriptoma (para HPV y celular) en CaCU.
.Análisis del perfil de eyp'CS'on deI cc-ncer ce mi yo!
M . ('. V i r g i l i o B u c a n e g r a Gaj-cií,
CAPÍTULO VII
PERSPECTIVAS
Es necesario determinar las causas de la elevada expresión de los genes de HPV en
la línea celular Silla y en diferentes tejidos de cáncer de cérvix para identificar si estos
cambios en los niveles de expresión son debidos a multiplicación de los genes o a alteraciones en la maquinaria transcripcional,
Se deben llevar a cabo un análisis con un número mayor de genes, para poder establecer posibles relaciones sutiles entre los niveles de expresión de grupos determinados
de genes y el desarrollo del CaCU.
•inclín
del[ffíil
de etpres iw del ccicer
cervical
Vf C. Virgilio Btiomegia Garcm
CAPÍTULO VIII
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APÉNDICE 1
CARACTERÍSTICAS D E LOS GENES SELECCIONADOS.
I.as características de los genes se recopilaron de las bases de datos del internet mencionadas en los materiales y métodos.
Gen six 1 (GC14M059102).
Los genes SIX de los vertebrados s o n homólogos de los genes "sine oculis" de
Drosophila,
los cuales son expresados primariamente en el sistema visual en desarrollo de la mosca. Los
miembros de la familia de genes SIX codifican para proteínas que están caractenzadas por
un heterodominio divergente de u n i ó n al DNA y un dominio SIX río arriba, el cual puede
estar involucrado en determinar la especificidad de unión al D N A y en mediar las interacciones proteína • proteína. Los genes de la familia SIX han mostrado que juegan papeles en
el desarrollo de insectos y vertebrados o han sido implicados en el mantenimiento del estado diferenciado de los tejidos. El g e n six-1 se expresa principalmente en tejido muscular
esquelético y liso. Su producto es u n a proteína de 284 aminoácidos de 32210 Da, cuya función parece estar involucrada en el desarrollo de tendones y ligamentos (por similitud). Su
localización celular es nuclear y pertenece a la familia de genes SIX/SINE oculis homeobox.
Gen rab3 d (GC19M011296).
El producto del gen rab3d es una GTPasa Ras-like, la cual es un regulador clave del transporte intracclular de vesículas durante la cxocitosis. Se ha mostrado que las GTPasas Rab3
son abundantes en las células con rutas de secreción reguladas v se piensa que confieren la
especificidad de anclaje y fusión durante la exocitosis regulada. A diferencia de otras isoformas Rab3, la rab3d está enriquecida en un número de tejidos no neuronales y localizada
en los granulos secretorios en el citoplasma de estas células. La proteina que codifica es de
219 aminoácidos con un peso de 24267 D a El gen es altamente expresado en granulocitos
de sangre periférica Se expresa constitutivamente a bajos niveles en todas las líneas celulares hematopoyéticas que se han investigado y se activa durante la diferenciación micloide.
Pertenece a la subfamilia Rab y a la superfamilia de las GTPasas pequeñas. Se le ha asociado a tumores de glioma recurrente, tumores metastáticos de colon, tumores de mama, próstata y cerebro.
Gen ptgs2 (GC01M183879).
El producto de este gen es la prostaglandin endoperoóxido sintasa (PTGS), también conocida como ciclooxigenasa, que es la enzima clave en la biosíntesis de prostaglandinas, y
actúa como una dioxigensasa y como una peroxidasa. Existen dos isotipos de la PTGS: una
PTGS1 que es constitutiva y la PTGS2 que es inducible, las cuales difieren en su regula-
ción de la expresión y en la distribución en los tejidos. Este gen codifica para la PTGS2,
que en los h u m a n o s se expresa en un número limitado de tipos celulares y es regulada por
eventos estimulantes específicos, sugiriendo que es responsable de la biosíntesis de prostanoides, los cuales a su vez están involucrados en la inflamación y en la mitogénesis. La
expresión de este gen está desregulada e n tumores epiteliales. PTGS2 un potente mediador
de la inflamación y mitógeno y juega un papel menor en la carcinogenesis colorectal, se
sobrexpresa e n carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, y putativamente ha
sido involucrada en la respuesta del tejido tumoral a la necrosis. Otra de sus funciones es
como transportador de electrones, ya que es una óxidorrcductasa. PTGS2, de 604 aminoácidos, y 68,996 D a de masa molecular, participa en el primer paso en la formación de prnstaglandinas y tromboxanos. Se le encuentra asociada a membrana de los microsomas. Su
expresión se induce por la presencia de citocinas y mitógenos. Esta enzima es el blanco de
los antiinflamatorios no esteroideos como la aspirina Pertenece a la familia de protaglandina G/H sintasa. Se le ha encontrado sobreexpresada en carcinomas de células escamosas de
cabeza y cuello y en retinoblastoma, en adenocarcinomas de colon y tumores mamarios. En
la figura 39 se observa un esquema de las rutas en las que participa.
FLAP
AlOXS
PLA2
PLC •
"il
COX1
Arachidonic aad
1X1
I
^
COX2
r-
Citocromo p450
i
epoxigenasa
LProstaoclina
1
Tromboxano
sintasa
sintasa
Epoxido
e
hidrolasa
K
C
•
a
_J
a
-J-
a
a
a
Ul
a.
M
I
Figura 39. Rutas metabólicas d o n d e participa el gen ptgs2, también d e n o m i n a d o C O X 2 . Marcado con
un circulo rojo se localiza el gen ptgs2 en la esquina superior derecha. Como puede observarse es uno de los
elementos iniciales que participa en una cadena de reacciones que termina en muchos efectos como dolor,
fiebre, vasodilatación, contracción uterina, contracción del músculo liso, vasoconstricción, activación de
plaquetas y coagulación, www.biocarta.com
Gen mdm2c (GC12P067488).
El producto del gen mdm2c es una fosfoproteína nuclear con una masa molecular aparente
de 90 kd que forma un complejo con p53. El mdm2 humano fue identificado como un producto homólogo del gen "murine double minute 2 " del ratón. El gene mdm2 aumenta el
potencial turaorigénico de las células cuando e s t á sobreexpresado y codifica para un factor
de transcripción putativo. La formación de un c o m p l e j o fuerte con el gen p53 puede inhibir
la transactivación mediada por p53. MÜM2 se enlaza a p53 y la amplificación de M D M 2
en sarcomas lleva a un escape del control de crecimiento regulado por p53. Este mecanismo
de tumorogénesis paralelo al de los tumores inducidos por virus en los cuales los productos
de los oncogenes virales se enlazan e inactivan funcionalmente a p53. La sobreexpresión
del oncogen mdm2c se encontró en leucemias. L a inactivación de los genes supresores de
tumor lleva a una dcsrcgulación de la proliferación celular y es un factor clave en la tumorogénesis humana. M D M 2 interactúa físicamente y funcionalmente con la proteína RB y
puede inhibir su capacidad de regulación de crecimiento. Tanto la proteína p53 como RB
pueden ser sujetas de regulación negativa por el producto de un solo protooncogene celular.
El gen mdm sufre empalme alternativo produciendo 5 variantes de transcrito a partir del
gen completo. Los transcritos alternativos tienden a ser expresados en tejido tumoral, mientras que el mdm2 completo es expresado en t e j i d o normal. Su función principal es como
punto de control en G1 para la superviviencia celular. Su expresión está amplificada en
sarcomas humanos, en gliomas malignos, angi o sarcomas, liposarcomas bien diferenciados
y en astrocistoma anaplástico y en linfomas d i f u s o s de células B. Se encuentra sobreexpresado en lcuccmios. En la figura 40 se muestra u n diagrama de las rutas de señalamiento en
las que participa.
el gen m d m 2 c en el ciclo celular. El gen mdm2 interactúa con p53 y la
inactiva, previniendo con esto las funciones de p53. También capacidad de bloquear las funciones de Rb.
Debido a que tiene efectos de regulación negativa sobre dos de los principales controladores del ciclo celular
a este gen se le ha relacionado con muchos procesos de desarrollo de cáncer, vnvw.biocarta.com
F i g u r a 40. R u t a s d o n d e p a r t i c i p a
Gen hla-e (GC06P030563).
El hla-e pertenece a la clase I de HLA de parálogos de cadenas pesadas. Esta clase I de molécula es un heterodímero que consiste de una cadena pesada y una cadena ligera (beta-2
microglobulina). La cadena pesada está anclada a la membrana. La proteína hla-e se enlaza
a un subgrupo de pcptidos derivados de los péptidos líderes de otras moléculas clase I. La
cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exón uno
codifica para el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican para los dominios alfa 1 y alfa2,
los cuales se enlazan al péptido, el exón 4 codifica para el dominio alfa 3, el exón 5 para la
región transmembranal y los exones 6 y 7 para la cola citoplasmàtica. Se localiza en la
membrana plasmática y su función parece tener características estructurales que le confieren especificidad para el enlace con el péptido a presentar en correlación con la unión de un
péptido líder de la clase I de MHC. También juega un papel central en la inmunotolerancia
durante el embarazo temprano, modulando la producción de citocinas de células dendríticas
generadas de monocitos durante las primeras etapas del embarazo. La expresión de este gen
y la interacción de su producto con el receptor CD94/NKG2 de las células NK, evita que
las células sean atacadas por ellos. La proteína es de 358 aminoácidos con un peso de
40130 Da. En la figura 41 se muestra un diagrama esquemático de su función como marcador de membrana.
F i g u r a 41. E s q u e m a d o n d e se m u e s l r a la función de hla-e. Este marcador d e membrana debe interactuar
con el receptor C D 9 4 / N K G 2 para evitar que este ataque a la célula. Las células que no presentan la proteína
hla-e son atacadas por perforinas del NK. www.bioarta.com
Gen bripl (GC17M060234).
La proteína codificada por este gen es un miembro de la familia RecQ DEAH hclicasa e
interactúa con las repeticiones BRCT del BRCA1. El complejo unido es importante en la
función normal de reparación de rupturas de la doble hebra de BRCA1. Al igual que el gen
BRCA1, este gen puede ser un blanco de mutaciones inductores de cáncer de línea germinal. Mutaciones en este gen han sido asociadas a cáncer de mama. En la figura 42 se observa un diagrama esquemático de su participación en la ruta de señalamiento del BRCA1.
F i g u r a 42. D i b u j o e s q u e m á t i c o d e la f u n c i ó n del g e n B R C A I . Para que B R C A 1 sea activo este tiene q u e
interactuar primero con b r i p l para que sea funcional y pueda participar en el resto de la cascada de reacciones.
www.biocarta.com
1 16
Gen rab27B (GC18P050644).
Este gen codifica para una proteína de 218 aminoácidos con un peso de 24608 Da, Esta
proteína se encuentra asociada a membrana, y pertenece a la superfamilia de pequeñas
GTPasas, de la subfamilia RAB. También se encuentra en granulos del citoplasma. Su expresión primaria es en testículos. Juega un efecto clave de exocitosis de granulos citotóxicos, vesículas de transporte y en la dinámica de organelos, manejando el transporte y fusión
de vesículas con sus receptores de membrana apropiados.
Gen emk-1 (GC11P063382).
La proteina LMK (hLKL motif kinasa) es m i e m b r o de una pequeña familia de protcin cinasas ser/thr involucradas en el control de la polaridad de la célula, estabilidad de microtúbulos y cáncer. Varias clonas de DNAc han sido aisladas que codifican dos isoformas de la
protcin cinasas scr/thr F.MK1. Estas isoformas f u e r o n caracterizadas por la presencia de un
exón alternativo de 162 pb que da lugar a dos formas, una que contiene el exón y otra que
no. Ambas formas se encontraron coexpresadas e n un número de líneas celulares seleccionadas y muestras de tejido. La E M K l humana m o s t r ó estar codificada por un solo mRNA
que se expresa de manera ubicua.
Gen ppp4c (GC16P030126).
Este gen produce una proteína de 307 aminoácidos con un peso de 35080 Da. Puede estar
involucrado en la organización de microtúbulos. Se localiza en el citoplasma y en el núcleo,
así como en los centrosomas. Pertenece a la familia PPP de fosfatasas, de la subfamilia PPX. Putativamente involucrada en la regulación de la mitosis. Se localiza en el citoplasma,
cítocsquclcto, microtúbulos, y centrosomas. Varias translocacioncs de este gen han sido
asociadas con leucemia agua.
Gen stat5b (GC17M040726).
T s. proteína codificada por este gen es un miembro de la familia STAT de factores de transcripción. En respuesta a citocinas y a factores de crecimiento, los miembros de la familia
stat son fosforilados por el receptor asociado a cinasas, y luego forman homo o heterodímeros que se van al núcleo celular donde actúan como activadores transcripcionales. Esta proteína media la señal de transducción activada por varios ligandos celulares tales como la
IL2, IL4, el CSF1 y diferentes hormonas de crecimiento. Se ha demostrado que está involucrada en diversos procesos biológicos, tales como señalador de TCR, en la apoptosis, en el
desarrollo de las glándulas mamarias en los adultos, y en el dimorfismo sexual de la expresión genética del hígado. Este gen se encontró que se fusiona al receptor alfa del ácido retinoico (RARA) en un pequeño subgrupo de leucemias promielocíticas agudas (APLL). La
desregulación de las rutas de señalamiento mediadas por esta proteína puede ser la causa de
APLL. La proteína es de 786 aminoácidos con un peso de 89880 Da. Funciona en la trans-
ducción de señales y activación de la transcripción. Se localiza en el núcleo, llevada ahí en
respuesta a fosforilación. Es reprimida por NCOR2. En la figura 43 se observa un diagrama
esquemático de su participación en las cascadas de señalamiento.
F i g u r a 43. D i b u j o e s q u e m á t i c o q u e m u e s t r a las m ú l t i p l e s r u t a s d e s e ñ a l a m i e n t o d o n d e p a r t i c i p a la
p r o t e í n a s t a t 5 . Stat5 p u e d e actuar c o m o m o n ó m e r o o c o m o d í m e r o , la fosforilación p r o m u e v e la dimerización. Su acción es c o m o factor transcripcional direactamente sobre el D N A . mivw.biocarta.com
Gen rab23 (GC06M057100).
Codifica para una proteína de 237 aminoácidos, de 26659 Da de peso. Pertenece a la superfamilia de GTPasas pequeñas de la familia Rab considerándosele un protooncogen.
Gen frapl. (GCOIMO 10876).
I.a proteína codificada por este gen pertenece a la familia de las cinasas relacionadas a fosfatidilinositol cinasa. Estas cinasas median respuestas celulares a estrés tales como daño al
DNA y falta de nutrientes. Esta proteína actúa como el blanco del FKBP12-rapamicina que
arrestan el ciclo celular y genera efectos inmunosupresivos. El gene C-DT6 esta localizados
en un intrón de este gen. La proteína es de 2549 aminoácidos de 288888 Da. Se considera
un anti-oncogen. Lleva a G1 en la progresión del ciclo celular.