Capítulo 3 - Elfos Scientiae

CAPÍTULO 3
LOS BACTERIÓFAGOS EN LA BIOLOGÍA MOLECULAR PASADA Y ACTUAL
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LOS BACTERIÓF
AGOS EN LA BIOL
OGÍA
BACTERIÓFAGOS
BIOLOGÍA
MOLECULAR P
ASADA Y ACTU
AL
PASADA
ACTUAL
JULIO RAÚL FERNÁNDEZ*, YAQUELIN PUCHADES*, NELSON SANTIAGO VISPO*
*
Centro de Ingienería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,
CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.
ANTECEDENTES
En 1896 EH Hankin informó que el agua de los rios Ganges y Jumna, en la India
tenía una acción bactericida marcada que se mantenía aún cuando ésta pasara
por un fino filtro de porcelana y que desaparecía si se hervía. Hankin, además,
estudió este efecto en particular sobre el Vibrio Cholerae y sugirió que si se
ingería ésta agua, la epidemia del cólera no se extendería pues en ella se encontraba la sustancia responsable de la acción bactericida [1]. Edward Twort en
1915 [2] y Félix d´Herelle en 1917 [3] informaron independientemente el aislamiento de entidades ultrafiltrables capaces de destruir cultivos de bacterias o
producir pequeñas áreas de color más claro cuando las bacterias crecían a
confluencia en placas de medio sólido. Fue el canadiense Félix d´Herelle, en el
instituto Pasteur de Paris, quien dio el nombre de “Bacteriófagos” a estas entidades y utilizó el sufijo fagos en el sentido de partículas que viven a expensas
de y no en el sentido estricto de comer [4].
Las primeras investigaciones con fagos estuvieron relacionadas con la definición de la naturaleza de estas partículas, sin embargo su capacidad de provocar
la lisis celular de microorganismos patógenos constituyó la base de muchos
trabajos encaminados a su uso en medicina. En 1921, Bruynogue y Maisin [5]
comenzaron el tratamiento de infecciones por estafilococos con bacteriófagos
y aunque los resultados fueron muy promisorios se hizo muy poco en los años
sucesivos. La idea de la aplicación terapéutica de los bacteriófagos se abandonó
después de la introducción en la practica médica asistencial de las sulfonamidas,
y con ellas, los antibióticos. A pesar de esto, la acción lítica de los bacteriófagos
in vitro permitió a los investigadores usar fagos específicos para diferenciar
entre varias especies de bacterias, y se desarrollaron métodos de diferenciación
actualmente muy útiles en las investigaciones epidemiológicas [6].
Independientemente del fracaso en el uso terapéutico de los bacteriófagos, grupos aislados de investigadores continuaron las investigaciones para la aplicación de estos agentes en el tratamiento de enfermedades infecciosas, como la
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CAPÍTULO 3
tuberculosis y la neumonía. La mayoría de los esfuerzos se concentraron en
Rusia y la India, donde los altos precios y la ausencia de disponibilidad de los
antibióticos estimularon la búsqueda de alternativas terapéuticas. La mayoría
de estas investigaciones aunque mostraron resultados positivos, carecieron
de cuantificación clínica y grupos controles, lo que impidió determinar la eficacia del tratamiento.
Las bacterias resistentes a antibióticos se propagan por el mundo, también
aquellas resistentes a los antibióticos de última generación como la vancomicina
[7, 8]. Esta resistencia se disemina principalmente a través de plásmidos,
transposones y elementos de inserción. El tratamiento con antibióticos para
eliminar microorganismos resistentes a múltiples medicamentos, generalmente, es inefectivo y el crecimiento de las bacterias patógenas resistentes es un
problema de gran importancia para la práctica medica asistencial.
En el período1987-1999 [9] se obtuvieron resultados que demostraron que el
uso de bacteriófagos en el tratamiento de diferentes enfermedades, es mucho
más eficaz en comparación con los antibióticos. En el estudio realizado, se incluyeron pacientes con enfermedades infecciosas persistentes causadas por
cepas resistentes a antibióticos. Inicialmente se aislaron y caracterizaron las
cepas patógenas, se determinó su sensibilidad a bacteriófagos y se preparó un
extracto estéril de fagos que se administró por varias vías. Además del efecto
curativo como fueron desaparición de los síntomas y exámenes bacteriológicos
negativos, se demostró que los bacteriófagos incrementaron la protección contra infecciones bacterianas mediante la destrucción de los microorganismos y
la regulación del sistema inmunitario. Estas alternativas pueden usarse en combinación con agentes antimicrobianos como los antibióticos o como único tratamiento en las infecciones ocasionadas por patógenos de importancia clínica
como las cepas de los géneros Enterococcus, Mycobacterium, Haemophilus,
Neisseria, Pseudamonas, Streptococcus y Staphylococcus, entre otras.
Varios investigadores concuerdan en que el mayor obstáculo para el tratamiento médico con bacteriófagos es el propio sistema inmunitario que tiende a eliminarlos con rapidez. Este hecho sugiere que los fagos no permanecen viables, en
el torrente sanguíneo o los tejidos del organismo, el tiempo suficiente como para
alcanzar los sitios de infección e infectar las bacterias patógenas. Esta desventaja
potencial, unida a la aparición de bacterias resistentes a antibióticos, propició la
búsqueda de variantes novedosas de fagos capaces de evadir los mecanismos del
sistema inmunitario.
Con este objetivo se desarrollaron varios métodos, pero los más útiles fueron la
selección de fagos, mutados o no, con mayor tiempo de vida media en los tejidos
LOS BACTERIÓFAGOS EN LA BIOLOGÍA MOLECULAR PASADA Y ACTUAL
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del organismo mediante pases múltiples en ratones, y la obtención de bacteriófagos
modificados genéticamente que presenten en su superficie péptidos o moléculas
que antagonicen una o varias de las funciones del sistema inmunitario. Dentro de
las moléculas que pueden expresarse en la cápsida de los fagos filamentosos
con posibilidades de impedir la inactivación de estos virus, se encuentran: péptidos
y moléculas antagonistas de cualquiera de las vías del sistema del complemento,
interleuquinas y otras citoquinas, así como proteínas glicosiladas y factores de
inhibición [10].
ESTUDIOS DE BIOL
OGÍA MOLECULAR
IOLOGÍA
La era moderna de los estudios con fagos comenzó con los trabajos de Max
Delbrück en 1938. Otros investigadores entre ellos Salvadore Luria se unieron
a Delbrück en la realización de las investigaciones científicas sobre los
bacteriófagos como vía para comprender las características fundamentales de
la vida biológica. Mientras se desarrollaban estos estudios se definió la naturaleza viral de los fagos, se determinó la composición química del virión formado
por proteínas y ADN, se aislaron nuevos fagos a partir de diferentes hospederos microbianos y se obtuvieron algunos progresos en el entendimiento del ciclo
de vida viral. Thomas Anderson en 1942, obtuvo las primeras microfotografías
electrónicas de los fagos [11].
A pesar de que los fagos son virus simples estructural y genéticamente, han
resultado particularmente útiles en el estudio de varios fenómenos moleculares.
Los conocimientos alcanzados en las investigaciones científicas realizadas sobre bacteriófagos constituyeron la base del desarrollo de la biología molecular,
de hecho, durante los primeros años, posteriores a su descubrimiento y hasta
principios de la década del 60, el trabajo con estos virus permitió identificar los
ensayos de placas de lisis [12], la naturaleza del ciclo de vida viral [13, 14], los
tipos de mutaciones genéticas [15-17], los genes como segmentos de ADN
[18], la transferencia de genes entre células mediada por virus [19], las enzimas
de restricción y modificación [20, 21], la colinealidad de genes y proteínas[22],
y el ADN genómico de simple cadena del bacteriófago ΦX174 [23].
A partir de 1960 las investigaciones con bacteriófagos continuaron mostrando
resultados asombrosos como fueron la descripción del ARN mensajero [24], la
naturaleza del código genético[25], el carácter físico de la recombinación genética
[26], el mecanismo de acción de los factores de transcripción [27, 28], la
recombinación sitio específica [29-31], la ADN ligasa [32] y la anti-terminación
como mecanismo de regulación transcripcional [33]. Se describieron nuevas
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CAPÍTULO 3
características del mecanismo de replicación del ADN: la síntesis discontínua de
una de las cadenas mediante los fragmentos de Okazaki [34], el mecanismo de
replicación del círculo rodante [35] y el papel de los cebadores de ARN en la
etapa de iniciación de este proceso [36]. Se logró la separación y visualización de
proteínas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de
acuerdo a su peso molecular [37, 38]. Otros estudios con fagos conllevaron a la
identificación de las chaperoninas [39], la caracterización de secuencias de inserción y transposones [40], al hallazgo de genes sobrelapados [41], a la descripción
de la retroalimentación negativa como mecanismo de regulación transcripcional [42] y
al uso de fagos reporteros de actividad luciferasa para el diagnóstico médico [43].
Alrededor de 1970 el mundo de la Biología comenzó a transformarse debido
a la “Revolución del ADN recombinante”, con la cuál se logró introducir
genes de cualquier organismo, (sin importar su complejidad) en genes de
fagos. Esta revolución provocó profundos cambios en las investigaciones
con bacteriófagos, al igual que en otras áreas de la biología. El número de
investigadores que trabajaban “directamente” con bacteriófagos disminuyó
precipitadamente lo que hizo posible el estudio de genes de organismos más
complejos con métodos tan sencillos como los que permitieron el estudio de
los fagos y las bacterias. Al mismo tiempo se incrementó el número de
científicos que usaban algunas formas de bacteriófagos en sus estudios, ya
que la mayoría de las técnicas de la biología molecular moderna son derivadas de fagos. Y así como la tecnología de ADN recombinante y otras técnicas hicieron posible el estudio molecular de varios organismos, también
incrementaron la complejidad de los experimentos que se realizaban con
bacteriófagos. De manera que para aquellos problemas científicos donde
los fagos representan un sistema ventajoso, éstos continúan resultando una
herramienta de estudio sencilla y versátil.
En 1985 Smith [44] demostró que el genoma de los fagos filamentosos o fd podía
ser manipulado con facilidad para obtener partículas fágicas que presentaran
péptidos fusionados a proteínas de su superficie y estos péptidos expuestos podían ser reconocidos por el anticuerpo correspondiente. Estas observaciones estimularon las investigaciones posteriores en este campo y favorecieron el
establecimiento de la tecnología de presentación de péptidos y proteínas.
La tecnología proporciona un medio simple de clonaje de un gen cuando se dispone
de un anticuerpo contra el producto de ese gen y permite obtener información
acerca de los epítopos reconocidos por un anticuerpo determinado. Estas técnicas
pueden ser de utilidad para el diseño de vacunas, la identificación de genes, el
mapeo de epítopos, etc, sin necesidad de clonar los fragmentos relevantes del
gen natural [45]. Por otra parte, mediante este método es posible identificar
LOS BACTERIÓFAGOS EN LA BIOLOGÍA MOLECULAR PASADA Y ACTUAL
45
antígenos sin previa información sobre la especificidad del anticuerpo, así como
seleccionar a partir de bibliotecas peptídicas variantes novedosas con propiedades de unión ausentes en el ligando natural [46]. La secuencia aminoacídica de
los péptidos presentados por los clones de fago seleccionados puede proporcionar
información de utilidad para un análisis más profundo del mecanismo de
reconocimiento proteína–receptor y de las interacciones entre ellos [47]. Por
ejemplo: los clones seleccionados para la unión a un receptor hormonal pueden
ser analizados para estimulación o competición con la actividad de la hormona;
los clones que interactúan con una enzima pueden comportarse como inhibidores
de la actividad enzimática [48].
La presentación de moléculas en la superficie de los fagos filamentosos tiene
también utilidad en la obtención de agentes para el diagnóstico: los clones
seleccionados por afinidad a un suero contra un patógeno pueden ser utilizados
para diagnosticar la enfermedad. Los fagos son antigénicos e inmunogénicos.
La inmunización con fagos fusionados puede producir anticuerpos contra el
determinante foráneo con títulos comparables o superiores a los obtenidos
cuando se emplean péptidos conjugados en la misma secuencia. Esta
inmunización con fagos hace posible disponer del antígeno sin purificación
extensiva y a un costo mínimo [44, 49].
TECNOL
OGÍA DE PRESENT
ACIÓN
TECNOLOGÍA
PRESENTACIÓN
DE PÉPTIDOS Y PRO
TEÍNAS EN LA CÁPSIDA
PROTEÍNAS
DE BAC
TERIÓF
AGOS FILAMENT
OSOS
BACTERIÓF
TERIÓFAGOS
FILAMENTOSOS
La tecnología de presentación de péptidos y proteínas sobre la cápsida de los
fagos filamentosos requiere de procedimientos básicos de microbiología y biología molecular como son el aislamiento y secuenciación de ADN. En este
trabajo se presentan los procedimientos que han sido utilizados exitosamente en
el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de La Habana, Cuba (CIGB)
y que cubren los aspectos básicos de manipulación de bacterias y fagos. Otros
procedimientos equivalentes pueden ser encontrados en la literatura [50-52] y
utilizados con excelentes resultados.
SELECCIÓN
Y CRECIMIENTO DEL HOSPEDERO
La infección por los fagos tipo M13 ocurre sólo en cepas de E. coli portadoras
del episoma F´, por lo que es sumamente importante la utilización de cultivos
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CAPÍTULO 3
puros. Las células infectivas tienen la tendencia de perder el episoma F´ lo
que hace necesario una adecuada selección de las colonias. Si la cepa de E.
coli utilizada es derivada de la JM101, el episoma F´ complementa la mutación de la prolina y la selección de células que contienen el episoma se realiza
por crecimiento de las bacterias en medio mínimo. Para otro tipo de bacterias
se debe chequear su fenotipo y seleccionar en un medio adecuado la presencia
del episoma.
Los cultivos puros de bacterias portadoras del episoma se preparan a partir de
colonias aisladas seleccionadas en placas de agar. A temperaturas por debajo de
34 ºC el pili F´ no se forma apropiadamente y se bloquea la infección. Por esto
es crítico realizar las incubaciones a 37 ºC.
MANTENIMIE
NT
O DE LOS FAGOS
ANTENIMIENT
NTO
1. Clarificar por centrifugación a baja velocidad (6 000-8 000 g, 10 min) el cultivo de células infectadas.
2. Congelar el sobrenadante que contiene el fago libre a –20 ºC sin la adición de
glicerol.
Las partículas infectivas de los fagos son estables por muchos años si se les
conserva a –20 ºC.
CONSERV
ACIÓN
ONSERVACIÓN
EN GLICEROL
1. Adicionar en un vial con tapa de rosca 0,15 volúmenes de glicerol estéril a
0,85 volúmenes de un cultivo que creció toda la noche en medio LB a 37 ºC.
2. Congelar en hielo seco/etanol y conservar a –70 ºC por tiempo indefinido.
SELECCIÓN
DE COL
ONIAS AISLADAS
COLONIAS
1. Descongelar las células y resupenderlas.
2. Con un asa de platino estéril, estriar una placa de agar con el medio apropiado
para la selección de las células con episoma de acuerdo a la cepa de E. coli.
3. Incubar las placas a 37 ºC durante toda la noche. Las colonias son viables
por varias semanas a 4 ºC si se sella con Parafilm (American National
Can. USA).
LOS BACTERIÓFAGOS EN LA BIOLOGÍA MOLECULAR PASADA Y ACTUAL
PREP
ARACIÓN
REPARACIÓN
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DE CÉL
ULAS COMPETENTES
CÉLULAS
1. Inocular una colonia aislada en 3 mL de medio 2XYT de una placa de medio
mínimo e incubar a 37 ºC toda la noche.
2. Diluir el cultivo 1/100 en medio 2XYT y cultivar a 37 ºC durante 3 h (la
DO590 nm debe ser 0,4-0,6). Un cultivo de 3 mL es suficiente para tres transformaciones.
3. Enfriar las células en hielo.
4. Adicionar 1 mL de un cultivo a un tubo eppendorf estéril y centrifugar a 5 000
rpm durante 2 min.
5. Resuspender las células en 1 mL de CaCl2 0,1M y mantener en hielo durante
5 min.
6. Centrifugar a 5 000 rpm durante 2 min y resuspender en 100 µl de CaCl2
0,1 M.
7. Mantener en hielo durante 1 h.
Este método de preparación de células competentes da un adecuado número de
colonias si se transforman plásmidos o reacciones de ligamiento, no así para la
transformación de las librerías donde deben ser utilizados otros métodos con
una mayor eficiencia de transformación. Las células pueden ser conservadas
a –70 ºC si se les adiciona ¼ de volumen de glicerol.
TRANSFORMACIÓN DE CÉL
ULAS COMPETENTES
CÉLULAS
1. Adicionar a los 100 µL de células competentes 10-100 ng de ADN en un
volumen de 3-5 mL.
2. Incubar en hielo por 30-40 min. Mezclar ocasionalmente e incubar durante
2 min a 42 ºC.
3. Adicionar 3 mL de medio Top-YT previamente fundido y mantenido a 47 ºC
en el tubo de transformación y mezclar suavemente.
4. Vertir rápidamente la transformación sobre placas YT y mover circularmente para distribuir el líquido homogéneamente antes de que se solidifique.
5. Incubar a 37 ºC durante toda la noche.
Las placas se pueden observar después de 4 h de incubación. Usualmente el
término placa se refiere a la lisis de la célula hospedera por el bacteriófago. Los
fagos de origen M13 no lisan las células. Las placas representan zonas de infección
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CAPÍTULO 3
sobre una capa de células no infectadas. Las células infectadas se distinguen
por un retardo en el crecimiento, que es hasta dos veces el tiempo de crecimiento de las células sin infectar.
OBTENCIÓN DE LAS PARTÍCULAS DE FAGO M13
1. Inocular un precultivo de 2XYT con una colonia de bacteria que creció en
medio de selección del episoma durante toda la noche a 37 ºC.
2. Inocular 1/100 en un volumen de 3 mL de 2XYT.
3. Cultivar durante 3 h hasta que se alcance una DO590 nm de 0,3.
4. Con un palillo estéril, seleccionar una placa de M13 e inocular el cultivo de
bacterias.
5. Cultivar a 37 ºC durante 8 h con agitación fuerte.
6. Centrifugar durante 10 min a 15 000 rpm a 4 ºC. Transferir el sobrenadante
a un tubo limpio y repetir la centrifugación. Las partículas del fago deben
permanecer en el sobrenadante.
El título del sobrenadante de los cultivos sin concentrar es de alrededor de
1011-1012 UT/mL una vez finalizado el cultivo. Estos procedimientos pueden ser
escalados sin ninguna dificultad hasta 1 L de cultivo. El sobrenadante puede ser
conservado a 4 ºC, concentrado o ser utilizado para el aislamiento de ADN de
simple cadena. Las bacterias pueden ser utilizadas para el aislamiento de la
forma replicativa del ADN.
PRECIPIT
ACIÓN DE LAS PARTÍCULAS DE FAGO POR PEG
RECIPITACIÓN
1. A 1,2 mL del sobrenadante de cultivo adicionar 300 µL de una solución de
PEG-8000 al 30 % y Na Cl 1,5 M. Mezclar por inversión varias veces.
2. Incubar durante 1 h a 4 ºC o toda la noche.
3. Centrifugar durante 10 min a 15 000 rpm y 4 ºC.
4. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante y colocar los tubos boca abajo
hasta eliminar el líquido residual.
5. Resuspender el precipitado en 100 µL de H2O, TE u otra solución salina en
dependencia de la aplicación posterior.
6. Calentar la muestra a 65 ºC para eliminar las bacterias. Guardar a 4 ºC o
adicionar glicerol hasta un 15 % y conservar los fagos a –70 ºC.
LOS BACTERIÓFAGOS EN LA BIOLOGÍA MOLECULAR PASADA Y ACTUAL
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En algunos casos los fagos después de purificados por PEG necesitan ser purificados en gradientes de centrifugación de CsCl ya que cantidades de trazas de
PEG pueden interferir con la unión de los fagos a sus blancos.
TITULACIÓN DEL FAGO POR UNIDADES FORMADORAS
DE PLACAS (UFP)
Es muy frecuente la necesidad de cuantificar las partículas de fagos en los
experimentos. Un método muy conveniente es la infección de la bacteria por
diluciones de los fagos, y el conteo del número de placas que crecen sobre
una capa de células en una placa al día siguiente de la infección. Este método
es muy eficiente ya que el número de placas que se forman corresponde con
más del 50 % del número de partículas de fago. En los experimentos de presentación de proteínas en fagos es muy importante evaluar la cantidad de
partículas antes y después de los experimentos de afinidad.
1. Precalentar las placas a 37 ºC en una incubadora y eliminar el exceso de
humedad dejando la placa abierta durante unos minutos. Fundir los Top-YT y
mantenerlos a 47 ºC.
2. Distribuir 200 µL de las bacterias F´ que crecieron durante toda la noche, en
tubos de 15 mL de acuerdo al número de diluciones que se testarán.
3. Diluir los fagos de acuerdo al estimado de la concentración. Por ejemplo 10
µL en 1 mL de TE, PBS, 1X o TBS 1X.
4. Adicionar 100 µL a los tubos que contiene los 200 µL de células y mezclar.
5. Adicionar 3 mL del top agar a cada tubo y mezclar golpeando con un dedo el
fondo del tubo.
6. Vertir rápidamente el contenido sobre la placa y con movimientos circulares
distribuir el líquido sobre toda la superficie. Se debe evitar la formación de
burbujas.
7. Esperar a que se solidifique el agar y colocar las placas en la incubadora a
37 ºC durante toda la noche.
8. Contar el número de placas de fagos y multiplicar por el factor de dilución.
Las placas de M13 son pequeñas y turbias. Si se necesita titular un número
elevado de fagos se pueden realizar las diluciones seriadas en una placa de 96
pocillos con la utilización de una pipeta de 8 o 12 canales.
50
CAPÍTULO 3
TITULACIÓN DE UNIDADES FORMADORAS DE COL
ONIAS (UFC)
COLONIAS
En los experimentos de presentación de proteínas en fagos se utilizan vectores
fagómidos en lugar de los fagos. Debido a que los fagómidos codifican para un
marcador de resistencia a antibióticos la titulación se realiza con la cuantificación
del número de colonias capaces de crecer en un medio con antibiótico.
1. Distribuir 200 µL de las bacterias F´ que crecieron durante toda la noche, en
tubos de 15 mL de acuerdo al número de diluciones que se testarán.
2. Diluir los fagos de acuerdo al estimado de la concentración, por ejemplo
10 µL en 1 mL de TE, PBS 1X o TBS 1X.
3. Adicionar 100 µL a los tubos que contienen los 200 µL de células y mezclar.
4. Adicionar 700 µL de 2XYT e incubar durante 15-20 min a 37 ºC.
5. Tomar con una pipeta 100 µL de la solución y extender el líquido sobre las
placas con el antibiótico apropiado.
6. Colocar las placas en la incubadora a 37 ºC durante toda la noche.
7. Contar el número de colonias y multiplicar por el factor de dilución.
Si necesita titular un número elevado de fagómidos, se pueden realizar diluciones seriadas en una placa de 96 pocillos con la utilización de una pipeta de 8 o
12 canales. En este caso, dividir una placa con el antibiótico apropiado en sectores y gotear 1µL de cada dilución sobre cada una de las divisiones. Al día
siguiente contar el número de colonias en las diluciones que sea posible y multiplicar por el factor de dilución. Este procedimiento ahorra tiempo de manipulación y reduce considerablemente el número de placas a preparar.
PROCEDIMIENT
OS GENERALES PARA LA PREP
ARACIÓN DE ADN
ROCEDIMIENTOS
PREPARACIÓN
Existe un número elevado de procedimientos publicados para la preparación de
ADN de simple cadena para los vectores de M13 y para los fagómidos. Los
que se ofrecen a continuación aportan buenos resultados.
MINI-PREP
ARACIÓN DE ADN DE SIMPLE CADENA
PREPARACIÓN
1. Preparar una solución de fagos de acuerdo con los procedimientos descritos
para la obtención y precipitación de las partículas de fagos.
2. Resuspender los fagos provenientes de 1 mL de sobrenadante en 100 µL de
TE y adicionar 50 µL de una mezcla de fenol y cloroformo (1:1). Agitar
vigorosamente hasta formar una emulsión.
LOS BACTERIÓFAGOS EN LA BIOLOGÍA MOLECULAR PASADA Y ACTUAL
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3. Centrifugar el tubo a 15 000 rpm durante 5 min. Utilizar una centrifuga
eppendorf.
4. Transferir 80 µL de la parte superior acuosa a un tubo limpio sin tocar la
interfase o la fase inferior orgánica.
5. Adicionar 10 µL de una solución de acetato de sodio 3M, pH 5,0 y 200 µL de
etanol absoluto. Cerrar el tubo y mezclar por inversión.
6. Colocar el tubo a –20 ºC durante 20-30 min.
7. Colectar el precipitado mediante centrifugación a 15 000 rpm durante
5 min.
8. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
9. Adicionar 300 µL de etanol al 70 %.
10. Centrifugar a 15 000 rpm durante 5 min.
11. Una vez secado el precipitado resuspender el ADN en 25 µL de TE.
12. Analizar 1-2 µL de la solución de ADN por electroforesis en gel de agarosa
al 1 %.
MINI-PREP
ARACIÓN
PREPARACIÓN
DE SIMPLE CADENA DE FAGÓMIDOS
Existe un número importante de vectores plasmídicos que contienen en su
secuencia el origen de replicación de simple cadena de los fagos. La ventaja de
estos vectores es que cuando la célula es infectada por un fago auxiliador, el
plásmido es capaz de producir ADN de simple cadena que se empaqueta y
puede ser purificado facilmente para secuencia o mutagénesis.
1. Inocular la colonia de bacteria con el clon deseado en 3 mL de medio 2XYT
con el antibiótico apropiado e incubar toda la noche a 37 ºC con agitación. No
usar un cultivo que se haya mantenido por varios días a temperatura ambiente porque puede haber perdido el episoma F´.
2. Inocular 1/100 en un cultivo fresco de 3 mL de 2XYT e incubar a 37 ºC con
agitación vigorosa durante 30 min.
3. Infectar el cultivo con 5-20 µL del fago auxiliador (por ejemplo M13KO7).
La multiplicidad de infección debe de ser 20 UT por célula. Considerar que 1
µL de cultivo contiene alrededor de 109 células.
4. Mantener la agitación durante 30 min. Evitar la agitación vigorosa después de
la infección con M13 para evitar daños en el pili. Adicionar 5 µL de kanamicina
(50 mg/mL) y agitar durante 12-14 h para propiciar el crecimiento.
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CAPÍTULO 3
5. Centrifugar el cultivo durante 5 min a 15 000 rpm y 4 ºC. El sobrenadante
contiene las partículas de fago con el ADN del fagómido en forma de simple
cadena de ADN.
6. El resto del procedimiento es similar al descrito anteriormente.
MINI-PREP
ARACIÓN DE ADN DE FORMA REPLICA
TIV
A
PREPARACIÓN
REPLICATIV
TIVA
De los procedimientos utilizados el que se propone a continuación es muy sencillo,
rápido, con buenos rendimientos de ADN y con resultados reproducibles. A
pesar de lo sencillo se obtienen secuencias de muy buena calidad.
1. Centrifugar a 12 000 rpm durante 3 min las células de los cultivos que han
crecido según los procedimientos anteriores.
2. Resuspender las células en 200 µL de solución de TE fría.
3. Adicionar 400 µL de una solución de NaOH 0,2 N y SDS al 1 %. Mezclar
por inversión hasta que el contenido se vuelva claro y vizcoso.
4. Incubar en hielo durante 5 min.
5. Adicionar 300 µL de una solución de acetato de amonio 7,5M, pH 7,8 sin
ajustar. Mezclar el contenido del tubo por inversión varias veces.
6. Incubar en hielo durante 5 min.
7. Centrifugar a 12 000 rpm durante 5 min.
8. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio. Evitar transferir el precipitado.
En caso de necesidad repetir este paso.
9. Adicionar 450 µL de isopropanol al sobrenadante y mezclar vigorosamente.
10. Centrifugar lo más rápidamente posible a 12 000 rpm durante 5 min.
11. Eliminar al máximo el sobrenadante y lavar el pellet con 700 µL de etanol 70
%. Invertir el tubo varias veces.
12. Centrifugar durante 5 min a 12 000 rpm. Secar el precipitado y disolverlo en
50 µL de H2O.
13. Chequear la concentración del ADN, para ello, correr 1-2 µL de la solución
de ADN en un gel de agarosa al 1 %.
El ARN presente en la muestra no interfiere con las reacciones enzimáticas de
digestión y de secuencia. Si se presentaran problemas al resuspender el precipitado de ADN, y una parte no se disuelve, se debe centrifugar y pasar el
sobrenadante a un tubo limpio. Si lo desea se puede incubar con 1 µL de 10 mg/mL
de ARNasa a 37 ºC durante 15 min y volver a precipitar el ADN.
LOS BACTERIÓFAGOS EN LA BIOLOGÍA MOLECULAR PASADA Y ACTUAL
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REFERENCIAS
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Ann de l’Ins Pasteur 1896;10:511.
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II:1241.
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Paris 1917;165:373.
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Co./Waverly Press; 1922.
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