Bacteriófago: Félix d´Herelle. Instituto Pasteur. París. Fago: vivir

Identificación de epitopes
específicos a virus dengue
mediante la tecnología de
expresión en fagos filamentosos.
Resultados preliminares.
Ela María Pérez*, Félix Daphnis*, Nevis Amin*, Alicia Aguilar, Frank
Camacho, Raiza Martínez, David I. Stott**.
*Dpto. Virología, Instituto Finlay.
**Department of Immunology and Bacteriology, University of
Glasgow.
Bacteriófago: Félix d´Herelle. Instituto
Pasteur. París.
Virus más estudiados
12 familias de bacteriófagos: Diferentes
características estructurales y genéticas
•Uso terapéutico.
•Investigaciones epidemiológicas
•Estudios de Biología Molecular
• Los Inovirus son fagos
filamentosos.
• Infectan bacterias Gram negativas
• Envoltura proteica tubular
• Ácido nucleico: ADN circular,
simple cadena 6,4 Kb.
• 900 nm de largo y 6,5 nm
diámetro.
• 5 proteínas estructurales: pIII,
pVI,pVII, pVIII, y pIX.
• 2700 copias de p VIII y de 4-5
copias de las restantes.
• Solamente infectan bacterias
que expresan pillis sexual
• Fagos no líticos
Tecnología de presentación de péptidos y
proteínas en la superficie de los fagos
filamentosos (TPFF).
Expresión PIII
Expresión PVIII
Purificación por afinidad: la biblioteca se hace
reaccionar con Acs (Biopaning)
Incubación de la librería, con
el blanco en fase sólida
Lavado
Elución
Amplificación de los clones eluídos
Después de 3-4 pasos de selección: aislamiento y
secuenciación de clones positivos
Usos de la tecnología (TPFF).
•Localización de epítopos
•Fagotopos que imitan
epítopos no peptídicos
•Fagotopos como
inmunógeno.
•Selección de fagotopos
específicos del agente
causal de una patología
dada.
• Selección mediante Ac
policlonales en el suero.
• Juegos de muestras
de sueros de
pacientes afectados por
la enfermedad
en estudio y
de sueros de individuos
sanos.
Hepatitis C. Prezzi C y cols. J Immunol.1996
Papillomavirus. Santamaria H ycols. Clinical Immunology.2001
Hepatitis A. Departamento de Virología Molecular. Instituto
Finlay.
Dengue???
Necesidad de una vacuna contra
el dengue
J404 PDPL 1012 PFU/mL
Biblioteca lineal de nonapétidos que
contiene 5x108 fagos diferentes. Construida
en la proteína de la cápside viral pIII (5
copias/fago) de un vector tipo M13 (Burritt y
cols, 1996)
Sueros positivos a Dengue 3
Sueros negativos : Donantes sanos
sin APP de la enfermedad
Selección de fagotopos
J404PDPL(1012 pfu/mL)
Afinidad con 1 suero positivo
S982
Fago unido (2.4x 104pfu/mL)
Amplificación de los fagos eluidos
Immunoscreening Dot Blott con 2 sueros positivos S219, S6410
1 suero negativo S81.
De los 84 clones seleccionados se
encontraron 12 que reconocieron a
los sueros positivos a dengue
Ninguno de estos 12 fagotopos
seleccionados reconoció a los
sueros negativos.
Los clones obtenidos en la selección
indican que ellos pudieran
mimetizar determinantes
antigénicos relacionados con el
virus dengue.
•Aumentar el estudio con una
seroteca de sueros positivos y
negativos al virus dengue.
•Secuenciación de los fagotopos
seleccionados y comparación con la
secuencia del virus dengue.
•Inmunización de animales con los
fagotopos seleccionados para evaluar
su capacidad para inducir respuesta
inmune.