Untitled - Universidad de los Andes

BACTERIÓFAGOS:
VIRUS DE BACTERIAS
QUE CURAN INFECCIONES
MARÍA CATALINA GÓMEZ P. / MARTHA JOSEFINA VIVES F.
LOS VIRUS SON PARÁSITOS OBLIGADOS DE LAS CÉLULAS, PUES NO PUEDEN
REPRODUCIRSE FUERA DE ELLAS. SEGÚN SU HOSPEDERO, EXISTEN VIRUS
ANIMALES, VEGETALES, DE HONGOS, DE PROTISTAS (ANTES LLAMADOS
PROTOZOOS), DE BACTERIAS Y DE ARCHAEAS (OTRA CLASE DE ORGANISMOS
UNICELULARES PROCARIOTES). LOS BACTERIÓFAGOS, O FAGOS, SON VIRUS QUE
INFECTAN EXCLUSIVAMENTE BACTERIAS Y HAN SIDO IMPORTANTES DESDE LOS
AÑOS SETENTA EN LA EXPLORACIÓN DE DIFERENTES PROCESOS GENÉTICOS
CELULARES. RECIENTEMENTE HAN SIDO OBJETO DE RENOVADA ATENCIÓN
DEBIDO A SU POTENCIAL COMO CONTROLADORES BIOLÓGICOS DE BACTERIAS
PATÓGENAS, ESPECIALMENTE DEBIDO AL INCREMENTO EN LA RESISTENCIA A
LOS ANTIBIÓTICOS QUE DICHOS PATÓGENOS HAN DESARROLLADO.
> EL DESCUBRIMIENTO DE LOS BACTERIÓFAGOS
> MORFOLOGÍA Y CLASIFICACIÓN
La historia del descubrimiento de los bacteriófagos es materia
de gran debate y controversia. En 1896, el bacteriólogo británico
Ernest Hankin evidenció la presencia de actividad antimicrobial
contra Vibrio cholerae, la bacteria causante del cólera. Dos años
más tarde, el bacteriólogo ruso Nikolay Gamaleya observó un
fenómeno similar mientras trabajaba con Bacillus subtilis (bacteria
no patógena para humanos). Sin embargo, ninguno de estos dos
científicos exploró en profundidad sus hallazgos. Frederick Twort
(Figura 1), bacteriólogo británico, fue quien en 1913 infirió que
los agentes que mataban a las bacterias eran virus. No obstante,
debido a problemas económicos, este científico no concluyó sus
estudios. Tres años después, el microbiólogo francocanadiense
Félix d’Herelle (Figura 1), del instituto Pasteur de París, anunció
su descubrimiento [1]. Hoy se considera a los dos investigadores,
Twort y D’Herelle, los codescubridores de los fagos.
Al igual que los virus animales y vegetales, la estructura básica
de los fagos consiste de una cápside proteica y un tipo de ácido
nucleico, ADN o ARN. Uno de los fagos más estudiados es T4, cuya
morfología ha sido usada como modelo para la descripción de este
tipo de virus (Figura 2), e incluso ha servido de inspiración para la
construcción de módulos de exploración espacial.
Los bacteriófagos se clasifican según su morfología, el tipo de
ácido nucleico, el tamaño del genoma y la presencia o ausencia de
envoltura o capa de lípidos [2, 3]. Según la morfología, su simetría
puede ser binaria, cúbica, helicoidal o pueden ser pleomórficos
(Tabla 1) [5]. Los bacteriófagos de simetría binaria son los más
complejos desde el punto de vista estructural: poseen cabeza de
simetría cúbica, cola de simetría helicoidal y carecen de envoltura
(Figura 2).
Figura 1. Frederick Twort (izq.) y Félix d’Herelle
(der.). Codescubridores de los bacteriófagos.
Molecular Biology of Bacterial Viruses. Gunther S.
Stent. 1963. W. H. Freeman and company
38 | Hipótesis | Apuntes científicos uniandinos | no. 10 | diciembre 09
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa que causa infecciones graves, especialmente en
pacientes hospitalizados. Su tratamiento con antibióticos es cada día menos exitoso, debido a la gran
capacidad de la bacteria para desarrollar resistencias y
a su capacidad para formar biopelículas. Una biopelícula
es un ecosistema microbiano organizado, conformado
por microorganismos pertenecientes a la misma o diferentes especies, asociados a una superficie viva o
inerte y embebidos en una matriz adhesiva protectora.
cápside o cabeza
ADN en el interior
de la cabeza
collar
barbas
Figura 2.
Estructura de fago T4.
(modificado de John Wiley
and Sons Publishers, 2003,
tomado de faculty.mc3.edu/
lrehfuss/bit220/ch16.ppt).
tubo interno de la
cola (hueco)
envontura contráctil
de la cola
fibra caudal
placa basal
espículas
superficie celular bacteriana
Ilustración: CastaFeletti
> CICLO DE VIDA
El ciclo de vida de un fago inicia con la infección de la bacteria
susceptible. La infección ocurre cuando el bacteriófago reconoce
receptores específicos de la superficie bacteriana e inocula su
material genético en la célula (Figura 3). Dichos receptores (proteínas o carbohidratos) pueden estar presentes en la cápsula,
la pared, el flagelo o el pilus; estructuras presentes en procariotes exclusivamente, y cuya composición es especie-específica
o incluso cepa-específica. Una vez en el citoplasma, dependiendo
del tipo de virus, de las condiciones ambientales y de la célula hospedera, los bacteriófagos pueden llevar a cabo un ciclo lítico o uno
lisogénico. La diferencia fundamental entre los dos ciclos radica
en que, en el primero, los fagos utilizan la maquinaria celular
inmediatamente para producir su progenie, que es liberada al
ambiente luego de la lisis o ruptura de la membrana y pared de la
célula hospedera. En el ciclo de vida lisogénico los bacteriófagos
reprimen sus funciones líticas e integran su genoma al cromosoma
de la bacteria para que se replique con el de ésta, pero en algún
punto también harán un ciclo lítico. Existen, además, fagos con
estructura filamentosa que producen continuamente progenie sin
lisar la célula hospedera, y otros fagos no filamentosos que pasan
por un estado llamado pseudolisogenia, muy poco estudiado, en el
que hay producción constante de progenie de fagos en presencia
de alta densidad celular bacteriana [6].
40 | Hipótesis | Apuntes científicos uniandinos | no. 10 | diciembre 09
El ciclo lítico (Figura 4) ha sido descrito en detalle para el fago T4,
de la familia Myoviridae que infecta a Escherichia coli, bacteria que
forma parte de la microbiota intestinal. Después de la infección,
el fago emprende la síntesis de sus propias proteínas y detiene la
de las proteínas bacterianas. El genoma de T4 no codifica para
ninguna ARN polimerasa, enzima encargada de la transcripción del
ADN, pero el fago resuelve esta constricción de forma exquisita:
modifica la subunidad alfa de la ARN polimerasa de la bacteria
mediante la adición de un grupo ADP ribosa, inhibiendo así el
reconocimiento de promotores bacterianos por parte de la misma
ARN polimerasa bacteriana, y permitiendo el reconocimiento de
los promotores virales tempranos (promotores de los genes que
deben expresarse en los primeros minutos postinfección). Las
proteínas virales sintetizadas estimulan la replicación del genoma
viral y la transcripción de los genes intermedios y tardíos (genes
que se expresan hacia la mitad y el final del ciclo, respectivamente)
mediante sucesivas modificaciones de la polimerasa y el reconocimiento de los respectivos promotores del fago. Las nucleasas
codificadas por el virus digieren el cromosoma de la bacteria
hospedera para proveer los nucleótidos necesarios en la síntesis
del genoma del fago. Entre los genes virales tardíos se cuentan
proteínas estructurales y de ensamblaje del virus, y enzimas que
degradan la pared de la bacteria. Al final del ciclo, que toma entre
22 y 25 minutos, se lisa la célula y se libera la nueva progenie de
fagos que infectará a las bacterias cercanas [4].
Figura 3. (arriba) Fago Lambda, adsorbido a la superficie de Escherichia coli, inyectando
su ADN. Referencia: http://www.sunum.org/index.php/kulphages2biotek2006-ppt/
adsorción
lisis y liberación de
las partículas virales
inyección del material
genético viral
ensamblaje
Figura 4. (abajo) Ciclo de vida del Fago T4, fago lítico de Escherichia coli. (modificado
de http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBacteriófagos.htm)
síntesis de enzimas
virales y replicación del
material genético viral
síntesis de las cubiertas proteícas y
encapsidación del material genético viral
Ilustración: CastaFeletti
| Universidad de los Andes | Facultad de Ciencias | 41
En el ciclo lisogénico, el genoma del virus es integrado al material
genético de la bacteria hospedera; el ADN del fago (denominado
profago) se replica junto con el genoma de la bacteria y las células
hijas heredan el genoma viral. La bacteria puede llevar a cabo
varias divisiones celulares, hasta que eventualmente se induce el
ciclo lítico y la célula libera la progenie de fagos [7]. La decisión
entre seguir el ciclo lítico o el lisogénico al momento de infectar
una E. coli ha sido estudiada en profundidad en el fago Lambda
(familia Siphoviridae), siendo uno de los modelos clásicos de
regulación de la expresión génica. Algunos fagos, como el Mu
(Myoviridae), tienen la capacidad de cambiar entre el ciclo lisogénico y el lítico bajo la influencia de factores ambientales tales
como las temperaturas altas [4].
> IMPORTANCIA ECOLÓGICA DE LOS FAGOS
Los bacteriófagos son diez veces más numerosos en el ambiente
que las bacterias, lo que los convierte en los organismos más
abundantes del planeta. Son frecuentemente aislados de ambientes acuáticos, reportándose 1010 fagos por litro de agua marina
superficial, y entre 107 y 109 por gramo de sedimento o tierra.
Dado el volumen de los océanos, los científicos han calculado
la existencia de 1031 bacteriófagos; lo que en términos de masa,
es igual a cien millones de toneladas, medida equivalente a un
millón de ballenas azules [8]. Aún más asombrosa es la idea de
que estos 1031 bacteriófagos puestos en fila, cabeza con cola,
cubrirían una distancia de doscientos millones de años luz. Por
lo tanto, es seguro que la variedad de fagos aislados y caracterizados hasta ahora representa una pequeña fracción del total de
bacteriófagos existentes.
Una de las contribuciones de los bacteriófagos es el papel que
juegan en el ciclo del carbono y el oxígeno, regulando la atmósfera del planeta y cooperando en la cadena alimenticia. La mitad
del oxígeno presente en la atmósfera terrestre es generado por
la actividad fotosintética de microorganismos marinos. Debido a
que el 20% de la microbiota oceánica es destruida por infecciones virales, los bacteriófagos afectan dicho ciclo. Además, estos
organismos participan en el intercambio genético mediante el proceso de transducción (mecanismo de intercambio genético entre
bacterias mediado por un bacteriófago), aportando un estimado
de 10 25 a 10 28 pares de bases de ADN por año a los distintos
microorganismos acuáticos [8].
Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas
aeruginosa (agentes causales de infecciones sistémicas o localizadas en diferentes órganos; entre ellos pulmones, corazón, piel,
etc.), especialmente porque el número de antibióticos actualmente
en estudio por parte de las compañías farmacéuticas es muy
bajo (menos de diez) y ninguno de ellos corresponde a moléculas
nuevas, sino a modificaciones de compuestos ya conocidos [4].
Por lo anterior, se espera que las bacterias desarrollen también
resistencia a estos compuestos de forma muy rápida, y las opiniones más pesimistas hablan del fin de la era de los antibióticos.
En consecuencia, se han realizado estudios alrededor del mundo
para certificar otros métodos de tratamiento, como cócteles
de antibióticos o antibióticos novedosos con blancos de acción
diferentes [1]; la creación de vacunas que interfieran en la colonización y, por lo tanto, en la infección de agentes patógenos; o
anticuerpos monoclonales para cada tipo de bacteria. En el caso
de P. aeruginosa y Acinetobacter sp. se han reportado estudios
con buenos resultados [10, 11].
La fagoterapia es otra modalidad de tratamiento antibacteriano
muy promisoria, en la que se utilizan bacteriófagos de ciclo de vida
lítico para combatir infecciones causadas por bacterias. Aunque
la fagoterapia parezca una alternativa novedosa, en realidad este
tratamiento empezó a ser utilizado en 1917, cuando Félix d’Herelle
investigó una epidemia de disentería padecida por tropas francesas y descubrió la existencia de los bacteriófagos. A partir de
ese momento, D’Herelle produjo en su laboratorio cinco preparaciones de fagos que fueron comercializadas. Posteriormente, en
1940, cuando los bacteriófagos ya se habían dado a conocer, la
compañía estadounidense Eli Lilly produjo siete medicamentos a
base de fagos. Sin embargo, con el descubrimiento de la penicilina, la fagoterapia fue opacada. Y aunque la terapia basada en
antibióticos rápidamente mostró sus falencias, el gran número de
antibióticos descubiertos en la década de los cincuenta fue eficaz
para el tratamiento de las infecciones bacterianas en el mundo
occidental. En cambio, la antigua Unión Soviética y otros países
del Este, como Polonia, continuaron utilizándola con excelentes
resultados, que evidencian su efectividad y ventajas comparativas
respecto a los antibióticos [1]. A pesar de esto, la fagoterapia no
ha sido utilizada en Occidente debido a la falta de estudios, la
dificultad de acceso a la literatura de países del antiguo bloque
soviético, la desconfianza en sus resultados, la preferencia de los
antibióticos y la dificultad de comercialización de los preparados
observada en la década de los años cuarenta.
> IMPACTO DE LOS FAGOS EN LA SALUD: FAGOTERAPIA
Las bacterias patógenas oportunistas, causantes de infecciones
contraídas en los hospitales o en la comunidad, se han convertido en un problema de salud pública en todo el mundo, debido
a la emergencia de cepas resistentes a múltiples medicamentos
[9]. Existe gran preocupación por la aparición de cepas resistentes de Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis,
42 | Hipótesis | Apuntes científicos uniandinos | no. 10 | diciembre 09
No obstante, con al aumento de cepas bacterianas multirresistentes, la fagoterapia ha retomado su importancia, y se le
considera una excelente alternativa para tratar infecciones. Estudios preclínicos han reportado alta eficacia y ausencia de efectos
tóxicos en la aplicación de fagos para combatir organismos como
Klebsiella sp., Shigella sp., Proteus sp., E. coli enterotoxigénica
( ETEC ), P. aeruginosa, Streptococcus sp.y S. aureus, entre otros.
Ensayo en placa del bacteriófago F3 y la bacteria Pseudomonas aeruginosa P4.
Los halos claros que se observan son las placas de lisis, zonas en las que no
hay bacterias debido a la actividad lítica del fago. Fotografía Marcela Mantilla.
Tabla 1. Clasificación de los bacteriófagos
44 | Hipótesis | Apuntes científicos uniandinos | no. 10 | diciembre 09
foto: castafeletti.blogspot.com
abriendo perspectivas para su aprovechamiento. Además, se aislaron, a partir de tres muestras de materia fecal equina, catorce
fagos –aparentemente diferentes– activos contra siete cepas de P.
aeruginosa. De igual manera, se aislaron tres bacteriófagos activos
contra doce cepas de S. aureus a partir de dos muestras.
Además, se ha observado que la selección de fagos nuevos para
luchar contra bacterias fagorresistentes es un proceso relativamente fácil en cuanto a tiempo y costo. Dieciocho de los estudios
más promisorios que utilizan fagos para controlar infecciones,
muestran resultados confiables y eficientes en el tratamiento de
la disentería y la meningitis; así como de las infecciones urinarias,
gastrointestinales, de piel, mucosas y quirúrgicas. El bajo costo
en el aislamiento de bacteriófagos y la facilidad con que se producen, hacen de la fagoterapia una excelente opción para combatir
bacterias fármacorresistentes. Adicionalmente, múltiples ventajas
–entre las que se encuentran su modo de acción, la especificidad de los bacteriófagos para infectar una cepa determinada, la
muerte exclusiva de las bacterias patógenas blanco y la utilización
de una sola dosis– hacen que la fagoterapia se perfile como un
procedimiento viable.
> FAGOS EN COLOMBIA
Teniendo en cuenta que Colombia es considerada como la cuarta
nación en biodiversidad mundial –siendo, por grupo taxonómico, la
segunda en biodiversidad a nivel de plantas, la primera en anfibios
y aves, la tercera en reptiles y la quinta en mamíferos [12]–, es
de esperarse que, en cuanto a diversidad de bacteriófagos, el
país se encuentre también entre los primeros lugares. La premisa
anterior se ve confirmada por los resultados preliminares de un
proyecto financiado por la Convocatoria Interfacultades 2007 de
la Universidad de los Andes, en el cual el Grupo de Microbiología
Ambiental y Bioprospección del Centro de Investigaciones Microbiológicas de la Facultad de Ciencias – CIMIC – y el Grupo de Diseño
de Productos y Procesos de la Facultad de Ingeniería – GDPP –,
trabajan conjuntamente. El objetivo del estudio es aislar bacteriófagos líticos contra cepas de P. aeruginosa y Staphylococcus
aureus resistentes a múltiples medicamentos provenientes del
Hospital Federico Lleras Acosta de Ibagué y de la Fundación Santa
Fe de Bogotá respectivamente, y proponer modelos deterministas,
y posteriormente estocásticos, que describan la interacción fagobacteria. Durante el desarrollo del proyecto se estandarizó una
metodología de recuperación de fagos líticos (Figura 6) a partir
de muestras de materia orgánica. Los resultados brindan indicios
interesantes acerca de la diversidad de microorganismos nativos,
Los fagos recuperados han sido probados mediante curvas de
infección de células libres en la especie de la que fueron aislados,
en ensayos sobre biopelículas (ecosistema microbiano organizado,
conformado por microorganismos pertenecientes a la misma o
diferentes especies, asociados a una superficie viva o inerte y
embebidos en una matriz adhesiva protectora) y con explantes de
hojas de lechuga. Los datos obtenidos de las curvas de infección
y en biopelículas están siendo usados para desarrollar modelos
de la interacción fago-bacteria que permitan predecir su comportamiento y actividad bactericida.
Los datos obtenidos hasta el momento en los ensayos con biopelículas son interesantes; las biopelículas constituyen uno de los
factores más importantes en la virulencia de una bacteria patógena, ya que le permiten adherirse firmemente a la superficie de
un tejido y desde alli colonizar otros así como también neutralizar el
efecto de los antibióticos, por ser una barrera física entre fármaco
y célula blanco y porque las bacterias incrementan su resistencia.
Viviana Clavijo, estudiante en Ciencias Biológicas-Microbiología,
realiza actualmente su tesis de Maestría probando la efectividad
de tres fagos (individuales y en mezcla) contra diferentes cepas
de P. aeruginosa. Sus resultados evidencian la importancia del
uso de las mezclas de fagos (conocidas como coctel de fagos) y
la capacidad de los fagos nativos para controlar la formación y el
mantenimiento de las biopelículas en un modelo in vitro, llegando
en algunos casos a eliminar hasta en 80% las biopelículas ya
establecidas (manuscrito en preparación). Los ensayos con las
hojas de lechuga han servido en la evaluación de la capacidad de
los fagos para evitar una infección y han sido realizados con la
colaboración entusiasta y generosa de estudiantes de pregrado
del curso de Microbiología. En estos ensayos se observa la formación de una lesión necrótica en la hoja al ser inoculada con
una suspensión de la bacteria P. aeruginosa pero al ser inoculada
con una mezcla de la bacteria y el fago, se previene la formación
de la lesión.
Aunque todavía queda mucho por investigar en materia de fagoterapia, el futuro de este tratamiento es realmente prometedor.
Por eso, el Grupo de Microbiología Ambiental y Bioprospección y
el Grupo de Diseño de Productos y Procesos continúan trabajando
en modelos para la optimización de dicha alternativa. Entre los
temas relevantes que requieren de desarrollos futuros se cuentan
el diseño de cócteles de fagos para prevenir la aparición de bacterias fagorresistentes, la selección de fagos sin genes que puedan
incrementar virulencia en bacterias, y la búsqueda de actividades
hidrolíticas en los fagos que permitan optimizar la remoción de
las biopelículas.
| Universidad de los Andes | Facultad de Ciencias | 45
> REFERENCIAS
[1]
Sulakvelidze A, Aladidze Z. 2001. Bacteriophage therapy.
Antimicrobial Agents and Chemeotherapy 45(3):3677-3696
[2]
Chibani-Chennoufi et al. 2004. Phage-Host interaction: an
ecological perspective. Journal of Bacteriology 186(12):36773686.
[3]
Dabrowska et al. 2005. Bacteriophage penetration in vertebrates.
Journal of Applied Microbiology 98(1):7–13.
[4]
Hanlon G. 2007. Bacteriophages: an appraisal of their role in
the treatment of bacterial infections. International Journal of
Antimicrobial Agents 30: 118–128.
[5]
Calendar R. (ed). 2006. The bacteriophages. Chapter 2,
Classification of Bacteriophages. Oxford University Press, US.
[6]
Paul JH et al. 2002. Marine phage genomics. Comparative
Biochemistry and Physiology. Part B, pp. 463–476.
[7]
Purves WK et al. 2004. Life: the science of biology. Seventh
edition. W.H. FREEMAN & CO. LTD. Chapter 13, The genetics of
viruses and prokaryotes, pp. 260- 261.
[8]
Rohwer F, Edwards R. 2002. The phage proteomic tree: a
genome-based taxonomy for phage. Journal of Bacteriology
118(16):4529-4535.
[9]
Organización mundial de la salud. 2003. Prevención de las
infecciones nosocomiales. Guía práctica segunda edición, p. 1.
[10]
Pucci MJ 2006. Use of genomics to select antibacterial targets.
Biochemical Pharmacology 71: 1066-1072.
[11]
Wróblewska M. 2006. Novel therapies of multidrug-resistant
pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. infections: the
state of the art. Arch. Immunol. Ther. Exp. Vol. 54: 113-120.
[12]
CHM Colombia. Mecanismo de facilitación del convenio sobre
diversidad biológica. Biodiversidad en Colombia. http://www.
humboldt.org.co/chmcolombia/biodiversidad.htm
> RESEÑA DE LOS AUTORES
María Catalina Gómez P
[email protected]
Microbióloga de la Universidad de los Andes (2004). Recibió una
beca para iniciar sus estudios de maestría en septiembre de 2009
en la Universidad de Utrecht, Holanda.
Martha J. Vives Flórez
[email protected]
Microbióloga, M.Sc. Ph.D. en Ciencias y Biología. Profesora
asociada del Departamento de Ciencias Biológicas de la
Universidad de los Andes
Profesores, investigadores
y estudiantes que participan en el trabajo.
Departamento de Ciencias Biológicas
Martha J. Vives Flórez / María Catalina Gómez Puerto / Ángela Victoria
Holguín Moreno / Ingrid Viviana Clavijo López / Stefany Moreno /
Andrés D. Torres González / Natalia Pacheco / Camilo Barbosa
Departamento de Ingeniería Química
Andrés González / Diana Catalina Ardila / María Catalina Prada
Otras instituciones: Claudia Echeverri Erk, Hospital Federico Lleras
Acosta de Ibagué, Clara Luz Rico, Fundación Santa Fe de Bogotá,
Marcela Mantilla practicante de la UIS
46 | Hipótesis | Apuntes científicos uniandinos | no. 10 | diciembre 09