Laboratorio N6

Microbiología General
Facultad de Ciencias Exactas – UNLP
AISLAMIENTO Y TITULACIÓN DE BACTERIOFAGOS
1. Detección de bacteriófagos de Bacillus cereus a partir de una muestra de tierra

Enriquecimiento de bacteriófagos
a)
b)
c)
d)
e)
Agregar 10 g de la muestra en 90 ml de caldo nutritivo. Mezclar por agitación.
Agregar 0.1 ml del cultivo de B. cereus en fase estacionaria temprana.
Incubar 24 hs a 32ºC con agitación.
Tomar 5 ml del cultivo de enriquecimiento y centrifugar durante 10 minutos a 3600 rpm.
Filtrar asépticamente el sobrenadante (0,45 µm diámetro de poro)
Con el filtrado (libre de bacterias) realizar las siguientes determinaciones:
 Lisis de un cultivo fresco de B. cereus
a) Infección del cultivo bacteriano según el siguiente protocolo
Tubo de lisis Tubo control
Caldo nutritivo estéril
3 ml
3 ml
B.cereus
0,1 ml
0,1 ml
Filtrado (fago)
0,1 ml
Solución fisiológica
0,1 ml
b) Incubar ambos tubos a 32ºC con agitación y observar periódicamente.

a)
b)
c)
Prueba de la gota (Spot test)
Disponer de una placa de agar nutritivo.
Realizar diluciones seriadas 1/10 del filtrado en solución fisiológica hasta una dilución 10-5.
Fundir y termostatizar a 50ºC un tubo de agar blando (4 ml). Agregar 500 µl de un cultivo de B.
cereus. Mezclar por rotación y volcar sobre la placa de agar nutritivo. Secar en flujo laminar
durante 30 min.
d) Rotular en la caja la posición de cada dilución. Colocar 10 µl del filtrado y de cada dilución según
el esquema. Dejar sobre la mesada 15 min.
100
10-5
10-1
10-4
10-2
10-3
e) Incubar a 32ºC, durante 16 hs.
f) Estimar la concentración de fagos a partir de la observación de placas de lisis
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2. Titulación de fagos: Recuento de unidades formadoras de placas de lisis por ml
(UFP/ml) mediante la técnica de la doble capa de agar
A partir de un lisado se determinará la concentración de fagos
Técnica de la doble capa
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Disponer de un cultivo de B. cereus en fase exponencial.
Disponer de 6 placas de Petri conteniendo agar nutritivo.
Realizar diluciones seriadas 1/10 del filtrado de fagos (lisado) en solución fisiológica.
Fundir y termostatizar a 45ºC, 6 tubos conteniendo agar blando (4 ml)
Agregar a cada tubo 0,1 ml del cultivo de B. cereus
Agregar a los tubos 0,1 ml de la dilución correspondiente del lisado.
Homogeneizar en vortex y verter sobre las placas de agar nutritivo previamente rotuladas. Secar e
incubar a 32ºC, 16 hs.
h) Contar las placas de lisis (calvas) y calcular el título de la suspensión original (UFP/ml)
Agar blando a
45ºC
Lisado (fago)
(Bacteriófago
 B. cereus
 Dilución del fago
Diluciones en
SF
Base de agar
nutritivo
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CUESTIONARIO
1- ¿Qué es un virus? ¿Y un bacteriófago? ¿Qué criterios han sido utilizados para su clasificación?
¿En qué se basa la Clasificación Baltimore?
2- Describa brevemente los ciclos líticos y lisogénico de los bacteriófagos.
3- La reproducción de los virus animales se asemeja en cierta forma a la de los bacteriofagos, sin
embargo dependiendo del ácido nucleico, los diferentes virus han desarrollado diferentes
estrategias de reproducción. Describa qué tipo de estrategia desarrolla un virus +RNA
(picornavirus), y cuál es la desarrollada por el Retrovirus del HIV (+RNA)?
4- ¿Qué métodos de recuento de virus conoce?
5- Describa el método de recuento de fagos que utilizó en el TP. ¿Cómo interpreta los resultados del
Spot test?
6- ¿Cómo procedería para aislar virus bacterianos? ¿y virus animales?
7- Analice un grafico de crecimiento en un escalón: UFP/ml versus tiempo. Defina el período de
latencia y márquelo en la gráfica. ¿Cómo determinaría experimentalmente el período de eclipse?
8- ¿Cómo determinaría en forma experimental la fracción de bacterias sobrevivientes a una infección
fágica? ¿Cómo la calcularía en forma teórica? ¿Espera que sean coincidentes? Justifique.
9- A partir de una muestra de agua de río, usted realiza un aislamiento de fagos que infectan
Pseudomonas spp., siguiendo el protocolo que se realizó en el Trabajo Práctico. En un
experimento de crecimiento en un escalón, un stock del fago aislado fue ajustado a 1x109 UFP/ml
y un volumen de 0,01 ml fue inoculado en 10 ml de un cultivo de Pseudomonas aeruginosa en
fase exponencial (1x107 UFC/ml). Cada 10 minutos y durante una hora, un volumen del cultivo fue
procesado para determinar el número de UFP/ml. La tabla muestra los resultados obtenidos.
Tiempo*
(min)
Número de calvas en cada dilución (valor promedio de 2 placas/dilución final)
1x10-2
1x10-3
1x10-4
1x10-5
1x10-6
1x10-7
1x10-8
10
Incontable
247
34
9
1
0
0
20
Incontable
263
28
4
0
0
0
30
Incontable
Incontable
180
25
1
0
0
40
Incontable
Incontable
Incontable
311
35
6
0
50
Incontable
Incontable
Incontable
347
32
4
0
60
Incontable
Incontable
Incontable
368
40
11
1
* Minutos luego de la infección de Pseudomonas con el fago (tiempo postinfección).
a) Realice el gráfico de crecimiento en un escalón, y calcule los parámetros que definen
la curva. Explique cada uno de esos parámetros.
b) ¿Cuál fue la multiplicidad de infección utilizada en el experimento?
10- Un volumen de 8 ml de una cepa de Salmonella sensible al fago ST2 creciendo en caldo nutritivo
en fase log, DO600 = 0,4 (DO600 = 0,1 corresponde a 1 x 108 ufc/ml) se infecta con 8 ml de una
suspensión de fago T2 con un título de 3 x 109 ufp/ml. La cepa posee, en las condiciones del
experimento, un tiempo de duplicación de 30 min, entra en fase estacionaria cuando alcanza una
concentración de 5 x 109 ufc/ml. El fago lisa en 40 min produciendo 40 fagos/bacteria infectada.
a) Calcule la concentración de bacterias sobrevivientes a la infección (B(0)/B(T) = e-mdi) a los 10
min y 50 min después de infectar y la concentración de fagos infectivos después de 50 min de
incubación en el experimento.
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b) Grafique la curva de multiplicación del fago y la curva de crecimiento bacteriano.
c) Realice exactamente los mismos cálculos para una experiencia similar pero con una
multiplicidad de infección 50 veces menor.
11- Se dispone de un lisado de bacteriófagos que son capaces de infectar E. coli y un cultivo sensible.
La concentración del lisado es de 1.5 x109 UFP/ml y el cultivo bacteriano posee una
concentración de 108 UFC/ml. Se toman 5 ml de caldo adicionado de Ca++ al cual se le agregan
300 µl de cultivo bacteriano y 100 µl del lisado de fagos. Se incuba 10 minutos a 32°C con
agitación, se realizan diluciones con diluyente helado y se plaquean en agar nutritivo
obteniéndose los siguientes resultados:
DILUCION final en placa
N° DE COLONIAS
10-2
más de 1000
-3
10
298/320
10-4
15/12
Compare el número de bacterias sobrevivientes obtenido en forma experimental con el que
esperaría si lo calculara en forma teórica. Si encuentra diferencias justifíquelas.
12- Cuando se encontró que existen bacterias resistentes a los bacteriófagos, se plantearon dos
hipótesis típicas para estos problemas en las Ciencias Biológicas: adaptación versus selección. Si
hubiera una adaptación de las bacterias a los virus, la aparición de bacterias resistentes tendría
lugar solamente en contacto con los virus y sería inducida por éstos. Por el contrario, la hipótesis
de la selección implica que la población resistente es el resultado de la aparición de mutantes
resistentes a través de mutaciones espontáneas para lo cual no sería necesaria la presencia del
virus.
En 1952, Joshua y Ester Lederberg descubrieron que era posible hacer una réplica exacta de una
serie de colonias en una placa de Petri a través de la utilización de un trozo de terciopelo montado
sobre un bloque de madera circular. Al presionar este bloque sobre una placa madre y
posteriormente efectuar improntas en placas con medio de cultivo estéril, es posible obtener
réplicas de las colonias en la misma posición que en la caja madre (Fig.1) Los Lederberg
incubaron una placa madre sembrada con alrededor de 107 E. coli Tons (cepa sensible al fago)
durante varias horas para permitir a las bacterias comenzar a desarrollar. Esta placa madre se
presionó con el mango de terciopelo y se aplicó en varias placas que contenían una gran cantidad
de fagos T1. Un esquema de la técnica y los resultados al cabo de la incubación se muestra en la
Fig. 2.
¿Cuál de las dos hipótesis puede descartarse con estos resultados? ¿Qué resultado hubiera
esperado si la otra hipótesis fuera válida? Fundamente su respuesta.
Fig. 1
Fig. 2