Mantenimiento y Criopreservacion VPerdomo 12

MANTENIMIENTO DE LINEAS
CELULARES Y
CRIOPRESERVACIÓN
Dra. Virginia Perdomo
CRIOPRESERVACIÓN
La criopreservación es el proceso
proceso en el cual las células son
congeladas a muy bajas temperaturas (entre -130 ºC y -196 ºC),
para disminuir las funciones vitales y poderlas mantener en
condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas
temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las
reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una
célula, quedan efectivamente detenidas.
¿Porqué criopreservar?
Evitar:
• La deriva genotípica debido a la inestabilidad genética
• Senecencia y extinción en una línea celular finita
• Transformación de las características de crecimiento y adquisición de
propiedades asociadas a la malignidad
• Inestabilidad fenotípica debido a la selección y desdiferenciación
• Contaminaciones con micoplasma
• Contaminación con otros microorganismos
• Contaminación cruzada con otras líneas (contaminación cruzada)
• Perdida de identificación debido a la manipulación descuidada
• Falla en el incubador
• Minimización de gasto de tiempo y materiales en mantener una línea
celular que no será utilizada a la brevedad
• Necesidad de distribución a otros usuarios
• Una línea celular establecida es un recurso valioso, su reemplazo es
costoso y consume mucho tiempo.
Dentro de las células de mamíferos, se criopreservan líneas celulares
inmortalizadas, células primarias aisladas a partir de tejidos y células
madre.
Principios de la Criopreservación
Criopreservación..
Temperatura
ambiente
 Se enlentece el metabolismo celular.
 Se interrumpe el transporte activo y
bombeo de iones.
 No se produce daño celular
0ºC
-20ºC
 Formación de cristales en el extracelular.
 Aumenta la concentración de solutos en medio de cultivo
 Sale agua de la célula. Deshidratación y disminución del
tamaño celular (shrinkage)
Rápido
Lento
Formación de hielo intracelular
Rotura organelas y membrana
Muerte celular
Salida por ósmosis del agua IC
Deshidratación y disminución del
tamaño celular.
Muerte celular. Mecanismo aun
no acordado. (estrés físico/ alta
conc de soluto en medio EC que
quedó sin congelar).
El éxito del proceso de congelamiento depende entonces
de cuatro puntos críticos:
1. Manejo adecuado y recolección suave del cultivo.
2. Uso correcto de los agentes de criopreservación.
3. Una tasa de congelamiento controlada.
4. Almacenaje en condiciones de criopreservacion
apropiadas.
1. Preparación de células para su criopreservación
Procedimiento de examinación:
• Las células deben ser mantenidas en un estado de crecimiento activo.
• El medio de cultivo debe ser cambiado el día anterior.
• Comprobar el aspecto general del cultivo, buscando señales de contaminación
microbiana.
• Es mejor si los cultivos se mantienen libre de antibióticos durante al menos una
semana antes de la congelación (contaminantes).
Significancia de la morfología celular:
• Confirmar la ausencia de contaminación.
• Comprobar, ausencia de signos de deterioro (granularidad alrededor del núcleo,
vacuolización citoplásmica, y redondeo de las células con el desprendimiento del
sustrato o soporte).
•El cultivo requiere un cambio de medio
•Medio o suero, inadecuados o tóxicos,
•Contaminación microbiana
•Senescencia de la línea celular.
• Detectar contaminación cruzada o identificación errónea.
Recolección de células y congelación:
Tratar las células con suavidad durante la cosecha, ya que es muy difícil
para las células dañadas durante la cosecha, sobrevivir al daño adicional
que se produce durante los procesos de congelación y descongelación.
2. Medio de congelamiento y Criopreservantes
Criopreservantes:
Reducen el punto de congelación permitiendo una velocidad de enfriamiento más lenta, lo
que reduce el riesgo de formación de cristales de hielo que puede dañar las células y la
muerte celular a causa de ello.
DMSO,
• Concentración final de 5 a 15 % (v/v).
• Penetra mejor en la célula
• Algunas líneas celulares son afectadas de manera adversa por el contacto
prolongado con DMSO, resultando ser toxico o inducir la diferenciación celular.
Glicerol,
• Cconcentración final de 5 a 20 % (v/v).
• Menos toxico que el DMSO,
• Puede causar problemas osmóticos después del descongelamiento.
• Permiten una disminución en la temperatura del tubo a una velocidad de 1°C/
minuto para evitar los efectos perjudiciales de la formación de cristales de hielo
del agua dentro de la célula.
Otros criopreservantes: polivinilpirrolidina (PVP), el polietilenglicol (PEG) y el hidroxietil
almidon (HES)
Medio de congelamiento:
Altas concentraciones de suero pueden también ayudar a las células a sobrevivir
durante el congelamiento (95% de suero y 5% de DMSO).
3. Velocidad de congelamiento
La tasa de enfriamiento utilizada para congelar
cultivos debería ser lo suficientemente lenta para
permitir que las células tengan tiempo de
dehidratarse, y lo suficientemente rápida para
prevenir el daño por exceso de dehidratación.
Tasa de congelamiento: -1°C a -3°C por minuto.
4. Almacenaje de células
No debe almacenarse células en freezers de -20°C o -80°C.
Deben almacenarse a temperaturas menores a -130ºC.
Sistemas de almacenaje en nitrógeno líquido:
Fase vapor: boca ancha
• minimizan el riesgo de explosión de tubos de
criopreservación
• son requeridos para el almacenaje de materiales
de peligrosidad biológica
• acceso más fácilmente
• mayor capacidad de almacenaje
Fase liquida: boca estrecha
• tienen tasa de evaporación de nitrógeno
más lenta
• suelen ser más económicos
Crioviales (Tubos para criopreservación
criopreservación))
• Debido a las temperaturas extremadamente bajas durante el almacenamiento, no
cualquier tubo sirve para congelar las células.
• Dos tipos de recipientes son comúnmente usados para almacenamiento criogénico:
Ampollas de vidrio selladas por calor y viales de plástico (generalmente de
polipropileno) con tapa a rosca.
Recomendaciones para la criopreservación:
• Seguir las instrucciones provistas con su línea celular.
• Congelar las células cultivadas en una alta concentración y al menor
número de pases posible.
• Asegurar que las células tienen al menos 90% de viabilidad antes de
la congelación.
• Congelar las células lentamente mediante la reducción de la
temperatura a aproximadamente 1°C/minuto, utilizando un criocongelador de velocidad de enfriamiento controlada o un recipiente
crio-congelación tales como "Mr. Frosty “.
• Utilizar siempre el medio de congelación recomendado, conteniendo
un agente crioprotector como DMSO o glicerol.
• Guardar las células congeladas debajo de -70°C; las células
congeladas comienzan a deteriorarse por encima de -50°C.
• Utilizar siempre crioviales, y soluciones estériles para el
almacenamiento de células.
• Las células pueden ser almacenadas sumergiéndolas en nitrógeno
líquido o en la fase de gas por encima del mismo.
DESCONGELAMIENTO Y RECUPERACIÓN
CELULAR
Descongelado:
Es vital descongelar las células correctamente para mantener la vitalidad
del cultivo y permitir que el cultivo se recupere lentamente.
Se recomienda:
• Descongelar rápidamente: 60 a 90 segundos a 37°C con agitación leve,
mejora la recuperación del cultivo, reduce el daño por los cristales de
hielo dentro de las células durante la rehidratación.
• Retirar los agentes lo más rápido y suavemente como sea posible.
¿Qué es el subcultivo?
Subcultivar, referido normalmente como “pasaje”, es la
acción de cambiar el medio de cultivo y transferir las
células de un cultivo previo a medio de crecimiento
fresco, un procedimiento que permite la propagación
adicional de la línea celular.
El número de pasaje es entonces el número de veces que
el cultivo ha sido subcultivado.
Fases del cultivo:
Fase de
Meseta
Fase Log
Fase
Lag
Criterios para subcultivar:
•
•
•
•
•
Densidad del cultivo.
Agotamiento del medio y descenso del pH.
Tiempo transcurrido desde el último subcultivo.
Requisitos para otros procedimientos.
Deterioro morfológico.
Subcultivo de líneas celulares adherentes en monocapa:
• Implica la eliminación del medio y la disociación de las células en la monocapa con
algún agente disociante, que rompe la unión de las células entre sí y al soporte de
cultivo, que está mediada por:
• glicoproteínas de la superficie celular y Ca+2.
• Otras proteínas y proteoglicanos, derivados de las células y del suero, se unen
a la superficie del sustrato y de otras células, y facilitan la adhesión celular.
Disociación de células:
Procedimiento
Sacudir
Scrapear
Agente de disociación
Agitar o sacudir gentilmente
el frasco de cultivo, o
pipetear vigorosamente.
Scrapper de células
Tripsina
Tripsina + colagenasa
Disociación enzimática
Quelación
Aplicación
Células de adhesión leve,
células mitóticas.
Líneas celulares sensibles a
proteasas; puede dañar
algunas células.
Células de adhesión fuerte.
Cultivos de alta densidad,
cultivos que han formado
múltiples capas,
especialmente fibroblastos.
Dispasa
Despegado de células
epiteliales confluentes,
laminas intactas de la
superficie de placas de
cultivo sin disociar las
células.
EDTA, Verseno
Quelación de Ca+2 de células
sensibles a la disociación
enzimática.
Subcultivo y Propagación de células en suspensión:
Existen células que crecen continuamente en suspensión, ya sea porque no son adherentes
(por ejemplo, muchas leucemias y tumores murinos) o porque han sido mantenidos en
suspensión mecánica o seleccionadas.
• Es menos complicado que los pasajes de células adherentes:
• no hay necesidad de tratarlas enzimáticamente para separarlos de la superficie del
recipiente de cultivo,
• el proceso es más rápido,
• menos traumático para las células.
• dilución de las células en el frasco de cultivo y que continúen en expansión,
• o mediante la retirada de una parte de las células del frasco de cultivo y diluyendo las
células restantes a una densidad de siembra apropiada para la línea celular.
• Ciclo de crecimiento similar al de células en monocapa, con un período de latencia más corto.
Manejo de diferentes líneas celulares
Diferentes líneas celulares deberán tratarse por separado,
con un conjunto independiente de medios y reactivos.
Si se manejan al mismo tiempo, hay un riesgo
significativo de contaminación cruzada, particularmente
si una línea de rápido crecimiento.
Normalización de condiciones de cultivo
La normalización de las condiciones de cultivo es esencial para mantener
la estabilidad fenotípica.
• Medio.
• Suero.
• Plásticos.
• Mantenimiento de la línea celular.
• Uso de Antibióticos.
• Mantenimiento de Registros.
Traslado de células: