Gestión de la Reproducción: Crio

CRIOPRESERVACIÓN
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María Miró Arias
22/01/2015
CRIOPRESERVACIÓN
La criopreservación es la conservación a largo plazo de
células vivas a bajas temperaturas, tales como el punto de
ebullición del nitrógeno líquido (–196 ºC). Estas
temperaturas hacen que disminuya el metabolismo celular,
provocando un estado de inactividad total en las células
espermáticas, del cual sólo se recuperan cuando son
descongeladas y llevadas a temperatura ambiente
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María Miró Arias
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CRIOPRESERVACIÓN
La crioconservación es una importante herramienta
complementaria a la conservación in situ que puede actuar
como un reservorio genético en caso de pérdida excesiva
de variación genética. Es una seguridad en caso de
catástrofe, o si un problema genético aparece como
consecuencia de la acumulación de genes recesivos
nefastos para la población viva
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María Miró Arias
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CRIOPRESERVACIÓN
Puede plantearse como la mejor opción cuando las
estrategias de conservación in situ no son lo
suficientemente efectivas como para evitar esta pérdida
de variación genética e, incluso, cuando está en riesgo la
supervivencia de la raza
Así, la primera exigencia para la criopreservación es la
disponibilidad de instalaciones que permitan el
almacenamiento de las muestras en nitrógeno líquido.
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María Miró Arias
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CRIOPRESERVACIÓN
La congelación seminal en la reproducción equina es una
de las técnicas más empleadas en la actualidad; pero, el
daño ocasionado en las células espermáticas tras la
descongelación, sigue siendo su principal hándicap. A este
inconveniente hay que añadirle que el eyaculado de un
gran número de sementales no puede ser procesado para
su congelación. Tanto es así que, en algunos casos, es
necesario adaptar los protocolos individualmente.
Además, en la inseminación con semen congelado, la tasa
de fertilidad de las hembras es menor que con el empleo
de semen fresco o refrigerado
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CRIOPRESERVACIÓN
El plasma seminal tiene varias funciones como: permitir
una motilidad progresiva durante la eyaculación y dentro
del tracto de la hembra; actuar como un medio de
transporte que proporciona substratos metabólicos para
mantener la viabilidad de los espermatozoides hasta la
fertilización; y finalmente, debido a su volumen, aumenta
la oportunidad de distribución igual de espermatozoides
dentro del cuerpo y cuernos uterino, (Metz et al.,1990).
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Pero, a pesar de todo, algunos componentes del plasma
seminal pueden tener un efecto perjudicial sobre los
espermatozoides, reduciendo su motilidad e, incluso,
acelerando su muerte durante la criopreservación. Es por
ello que, tras la recolección con vagina artificial, se
procede a la centrifugación de la muestra para separar el
plasma seminal y concentrar los espermatozoides.
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CRIOPRESERVACIÓN
Pero, a pesar de todo, algunos componentes del plasma
seminal pueden tener un efecto perjudicial sobre los
espermatozoides, reduciendo su motilidad e, incluso,
acelerando su muerte durante la criopreservación. Es por
ello que, tras la recolección con vagina artificial, en
algunas especies, se procede a la centrifugación de la
muestra para separar el plasma seminal y concentrar los
espermatozoides.
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María Miró Arias
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CRIOPRESERVACIÓN
La centrifugación del semen no es del todo beneficiosa
para los espermatozoides: Se sabe que en dicho proceso
se pierden alrededor del 15 – 20 % (Hafez, 2000) de
espermatozoides viables. Por otra parte, también es
sabido que la supervivencia de las células espermáticas en
el plasma seminal sólo está limitada a una pequeña
porción de tiempo. En términos generales, el plasma
seminal es beneficioso solamente en la monta natural.
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Una vez que la centrifugación se ha realizado, las muestras
son resuspendidas en el segundo diluyente. En este
momento se deben hacer los cálculos en la concentración
espermáticas que llevarán las muestras a conservar. En
relación a los diluyentes, es muy difícil determinar cuál es
el mejor, pues en los estudios comparativos deben ser
tenidos en cuenta factores como el semental, el sistema
de envasado, el enfriamiento y la velocidad de congelación
así como la subjetividad de la estimación de la motilidad
pos-descongelación. Además, son limitados los estudios en
los cuales más de un diluyente es incluido en un mismo
experimento.
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Diluyentes para la dilución inicial y la centrifugación. Su
principal objetivo es mantener la motilidad así como
proteger a los espermatozoides del efecto de la
centrifugación.
Diluyentes para la congelación y posterior
almacenamiento. Estos tipos de diluyentes se diferencian
de los anteriores en que en su fórmula incorporan
crioprotectores.
Ambos son de suma importancia para el éxito de la
técnica de congelación.
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CRIOPRESERVACIÓN
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El semen puede ser congelado sobre vapores de
nitrógeno líquido o mediante el uso de un congelador
programable. La mayor parte de los laboratorios utilizan
congeladores programables a un ritmo de congelación de
– 10ºC/min entre 20ºC y -15ºC y de -25ºC/min ó 60ºC/min entre -15ºC y -120ºC.
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Para la congelación con vapores de nitrógeno, las pajuelas
deberán estar dispuestas horizontalmente en un soporte
metálico de uno a cuatro centímetro por encima de la
interfase líquida. La distancia del nitrógeno y el tiempo de
permanencia determinan la velocidad de enfriamiento y la
temperatura final. El semen congelado en pajuelas de 0,5
ml deben estar mantenidas 10 minutos en los vapores
antes de ser transferida al nitrógeno líquido.
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Al menos tres pajuelas pos-congeladas deben de
descongelarse para evaluar su calidad, ya que es sabido
que el porcentaje de espermatozoides motiles después de
la descongelación está relacionado con la fertilidad del
semental. El semen, para ser usado en inseminación, debe
de tener un porcentaje de motilidad entre el 35%
(Vidament y col., 1999) y el 50% (Squire y col., 2001).
Cuando estos valores no son alcanzados, las muestras
deben descartarse.
La descongelación se realiza comúnmente por inmersión
en un baño maría a 37ºC durante 30 segundos o a 75ºC
durante 7 segundos.
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