A nivel de ADN: Hibridación, PCR, ligación: Muestra: in situ

A nivel de ADN: Hibridación, PCR, ligación:
Muestra: in situ (localización física), amplificación de ADN de muestra, extracción de ADN, microdisección
con rayo laser.
Técnicas:
Se utilizan para detectar:
Rearreglos cromosómicos
variación en número de cromosomas: FISH, CGH, MLPA
Pérdidas o ganancias cromosomales o de
porciones de cromosomas
Rearreglos cromosomales: FISH
Mutaciones puntuales y polimorfismos
PCR, RT-PCR (algunas translocaciones) Grado de metilación
Ganancia o pérdida de genes: MLPA, CGH
detección de mutaciones conocidas: PCR-OLA (ensayo de
ligación de oligonucleótido, SNuPE (primer extension de un
único nucleótido), OSA (hibridación con oligonucleótidos
específicos), PASA (amplificación alelo específica),
alineamiento competitivo de oligonucleótidos, RFLP, MLPA.
Real time PCR. Microarray, secuenciación
detección de mutaciones desconocidas: Secuenciación,
SSCP, RNAsa, clivaje químico, PCR-DGGE. Real time PCR.
Permiten:
Detección y diagnóstico de desórdenes genéticos que
determinan la enfermedad
Diagnóstico de individuos portadores de mutación
recesiva
Diagnóstico prenatal
Diagnóstico preimplante en fecundación in vitro (PGD).
Mutaciones o alteraciones somáticas: determinación de
la base genética de la enfermedad, diagnóstico,
clasificación de tumores, ERM, prognosis).
Identificación de SNP´s asociados a enfermedades
complejas.
Determinación de grado de metilación de ADN
1
Real time PCR
Este método se aplica tanto para la determinación de duplicaciones y deleciones y para
alteraciones puntuales (polimorfismos y mutaciones). Diagnóstico
Cuantificación relativa (duplicaciones y deleciones) (MLPA y CGH)
Comparación de cantidad de una determinada región en el genoma entre dos situaciones (enfermo vs sano)
A
B
No de copias relativo
A
RA
RB
B
= 2 -(ΔCtA-ΔCtB)= 2 -(ΔCtGen-ΔCtRef)
Si la eficiencia es del 100%
Para calcular eficiencia: pendiente de la variación del Ct con la dilución para cada gen
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La PCR en tiempo real se puede hacer para los genes en estudio y para el gen de referencia en tubos
distintos o en el mismo tubo usando sondas marcadas con distintos compuestos fluorescentes.
Cancer de mama: amplificacion de 2 genes.
Housekeeping: gen de la albumina
Sybr Green combinado con sonda marcada (FRET)
Una sonda para cada gen
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Alteraciones puntuales (mutaciones y polimorfismos)
Análisis de variación de Tm
PCR en tiempo real
Discriminación de alelos con primers específicos
o con sondas específicas
Variación en el Tm:
a) Usar sonda FRET ó molecular beacon que hibride en la zona en que se encuentra la mutación a analizar.
(no se usa sonda de hidrólisis ni Sybr green)
b) Análisis del Tm del producto formado
Mezcla de
reacción
Ej.: FRET
ADN del paciente ó producto de PCR
de una zona acotada
primer forward
primer reverse
sonda de anclado: 5´LCRed-oligo
sonda sensora: oligo-fluoresceína
dNTP
Taq pol
Sonda sensora
Aplicación de Real time PCR para detección de variantes conocidas y desconocidas dentro de la secuencia de la sonda
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PCR en tiempo real
Discriminación de alelos
(en la reaccion de amplificacion)
con sondas específicas
ó con primers específicos
Análisis de variación de Tm
Discriminación de alelos con primers específicos
En tubos separados. Detección con Sybr green o sondas fluorescentes
En el mismo tubo: Ensayo Flag (primers con marca fluorescente)
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Discriminación de alelos con sondas específicas
Mutación responsable
de la enfermedad de Tay Sachs
(inserción de 4 pb)
Molecular Beacon
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Para aumentar el poder de discriminación entre alelos hay que utilizar una sonda sensora lo más corta posible
Se puede acortar aún más el tamaño de la sonda mediante modificaciones que aumenten la estabilidad de la
doble cadena
Sistema de detección eclipse
Se puede utilizar una sonda PNA
(ác nucleico peptídico)
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Identificación de la/s alteraciones responsables o que se asocian con una enfermedad
genética
Clonado de un gen candidato
Aneuploidías
en meiosis
variación en
número de
cromosomas
dada una enfermedad genética
analizar síntomas y parámetros
que caracterizan la enfermedad.
Buscar gen candidato
Análisis de ligamiento y clonado
posicional del gen
Si dos genes están localizados en el
mismo cromosoma, en forma cercana
uno del otro es muy probable que se
hereden en forma conjunta
Estudios de asociación
en una población
Aplicable a enfermedades
Complejas.
Marcadores usados: SNP´s
Diabetes, asma, autismo,
transtornos mentales, lupus,
migraña, hipertensión,
epilepsia, Alzheimer, etc.
Cancer
Alteración en cromosomas
Comparación de genomas
Comparación de transcriptomas
Aplicable a enfermedades monogenéticas,
Proteómica
algunos cánceres en los que el gen que
Patrones de metilación de ADN
predispone se hereda en forma mendeliana (gen de
o histonas.
Retinoblastoma).
Marcadores de posicionamiento usados: RFLP, SSLP´s
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Enfermedades genéticas complejas
Estudios de asociación en población:
Estudios de gran escala de asociación comparando en una población casos vs controles sanos.
Se testea dentro de una población la correlación de la presencia de un alelo dado con la
presencia de la enfermedad.
Un marcador alélico que se encuentra en una colección de individuos afectados con una
frecuencia diferente a la de la población control, se dice que está asociado. Puede ser una
asociación positiva (suceptibilidad) o negativa (resistencia). El marcador puede estar en el
mismo gen de suceptibilidad o puede ser un marcador asociado al alelo que causa suceptibilidad
(Desequilibrio de unión).
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Desequilibrio de unión: ocurre cuando una combinación
de alelos en diferentes locus ocurre más frecuentemente en una población
de lo que podría ser esperado por una asociación al azar.
Cuanto más cercanos más probable que se hereden juntos.
SNP´s:
Polimorfismos de un único nucleótido. Estos son diferencias en la secuencia de ADN en una única
base que puede ser observada entre individuos de una población. Se trata de polimorfismo si el
alelo menos común ocurre en un porcentaje de 1% o mayor en una población. Los SNP´s se
presentan en el genoma humano con una frecuencia promedio de 1 cada 1000 pb. Son
generalmente bialélicos entonces para aumentar el polimorfismo se debe determinar la asociación
combinada de varios SNP´s cercanos al gen de suceptibilidad (haplotipo).
Ejemplos de Genes de suceptibilidad:
Diabetes mellitus insulino-dependiente:gen de suceptibilidad del locus HLA.
Alzheimer: gen de suceptibilidad en el cromosoma 19 (ApoE) y en cromosoma 12.
Migraña: Gen de suceptibilidad en el cromosoma 19 y en cromosoma X.
Psoriasis: Gen de suceptibilidad en el cromosoma 3.
Diabetes no insulino-dependiente: cromosoma 12 y cromosoma 2
Asociación de distintos tipos de cancer con SNP´s
La asociación no es del 100% ya que otros genes son necesarios para para que la enfermedad se
desarrolle.
La fuerza de asociación es una indicación de la contribución relativa del locus a la etiología de la
enfermedad.
La gran mayoría es un desequilibrio de unión entre un determinado alelo en un locus y un locus de
suceptibilidad a la enfermedad. Aquí la fuerza de asociación es función de la distancia de
recombinación entre el marcador y el locus de suceptilbilidad y de la contribución relativa del locus a
la etiología de la enfermedad.
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Se están elaborando actualmente mapas de alta densidad de SNP´s del genoma humano. Se calcula que
hay mas de 10 millones de SNP´s en el genoma humano.
De la gran cantidad de SNP´s totales, interesan los que se encuentran en zonas codificantes, o
aquellas que afecten la regulación de la transcripción, el splicing o la traducción de genes o sea que
el polimorfismo tenga una consecuencia funcional.
También se estudian para cada enfermedad en particular, alrededor de genes que se sospecha
que puedan tener algún efecto en el desarrollo de la misma.
Utilidad en biomedicina de los SNP´s
* Análisis forénsico
* Establecimiento de relaciones entre diferentes poblaciones y dilucidar migraciones ancestrales
* Estudio de desordenes multifactoriales o complejos. Monitoreo de suceptibilidad y resistencia
Cononcer cuales son los genes de suceptibilidad permite contar con nuevos target para una terapia.
* Farmacogenómica
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Métodos de estudio de SNP´s:
SNP´s desconocidos: Secuenciación (pyrosecuenciación), SSCP, DGGE, Clivaje enzimático de
heteroduplex,
microarray (variant detection array (VDA))
SNP´s conocidos: Secuenciación,
Cualquiera de los métodos descriptos para detección de mutaciones conocidas
Microarray.
Ensayo a gran escala con miles de SNP´s
Microarrays (análisis múltiple)
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Microarrays
Hibridación alelo específica
Unir al soporte oligos correspondientes a las distintas variantes posibles para cada SNP. Cada
chip se tendrá miles de oligos (array de alta densidad). Cada chip se hibrida con ADN
amplificado marcado de un individuo y se visualiza la señal positiva en las posiciones
correspondiente a los oligos complementarios a sus SNP´s. Se puede aplicar tanto para la
detección de SNP´s desconocidos como la determinación de SNP´s conocidos.
Detección de SNP´s desconocidos
A y B: Distintos individuos
Array de detección de variantes (VDA)
1-25
2-26
3-27
4-28
etc
A
C
G
T
Oligos sintetizados sobre el soporte de 25 nt de longitud
Tamaño 8L
Homocigotas, heterocigotas
Se amplifican distintas regiones del ADN, se marca y se hibrida sobre el chip (también es utilizable para detección de SNP´s conocidos)
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Sobre SNP´s conocidos
1) Amplificación de ADN y Hibridación alelo específica
(discriminación sobre el array):
demasiados spots, demasiadas amplificaciones.
2) Amplificación de ADN
Hibridación alelo específica (discriminación sobre el array)
Cortar ADN con enzima de restricción
Ligar adaptadores a los extremos de los fragmentos
Amplificar con un solo par de primers
3) Amplificación de ADN
Hibridación alelo específica (discriminación sobre el array)
PCR múltiple
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4) Amplificación de ADN
Discriminación de alelo en
Solución y utilizacion de tags
PCR múltiple
Detección sobre array
Hibridación con productos de extensión de un único nucleótido (SNuPE ó SBE).
Protocolo
142 SNP´s
9 reacciones (9 pooles, los SNP´s
de cada pool comparten el mismo
polimorfismo,multiplex PCR)
9 multiplex SBE
ddUTP-biotina, ddCTP-fluoresceína
Se combinan los pooles
Se hibridan a un chip que tiene
las secuencias complementarias
a los tags unidos a cada SNP
Lavado y tinción con
Phycoerytrina-streptavidina
escaneado
Variante genérica: Tag-SBE (array de oligonucleótidos
genéricos de alta densidad-
Colección de fluorescencia
A 530 y 560 nm
Los oligos (tag) no deben dar reacción cruzada y deben
tener similares características de
hibridación.
15
5) Discriminación de alelo sobre el ADN
Amplificación de los targets
discriminados con un solo par
de primers (ó 3 primers)
genómico
Detección s/array
(array de secuencias
complementarias
a tags)
P1
Molecular Inversion probe
Discriminación en la reacción de
extensión de un solo nucleótido
Golden Gate assay
Discriminación por hibridación
alelo específica
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Enfermedad determinada por alteraciones genéticas: estudios que se pueden realizar
A nivel de proteínas
A nivel de ARNm
A nivel de ADN
Detección de apoptosis
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A nivel de ARNm:
Variación en niveles de expresión de genes :
Hibridación sustractiva por supresión
SAGE
Microarray
RT-PCR cuantitativa (RT-PCR en tiempo real)
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RT-PCR en tiempo real
IL1-b A
Referencia B
Referencia A
Numero de veces diferentemente expresado en el estado A respecto del estado B
IL1-b B
= Eficiencia –(ΔCtA-ΔCtB)
ΔCtA= Ct gen-Ct referencia en la condición A (patológica)
ΔCtB= Ct gen- Ct referencia en la condición B (sano)
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A nivel de ARNm:
Variación en niveles de expresión de genes :
Hibridación sustractiva por supresión
SAGE
Microarray
RT-PCR cuantitativa (RT-PCR en tiempo real)
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Tester cDNA with adapter Driver
1
cDNA (en exceso) Tester cDNA with adapter 2
Hibridacion sustractiva
(por supresión, SSH)
Construcción de biblioteca
Microarray
PCR c/ambos
primers
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SAGE
AAAAA
TTTTT b
cDNA synthesis
Cleave with anchoring enzyme (AE)
Bind to streptavidin beads
AAAAA
TTTTT b
GTAC
Divide in half
Ligate to linkers
A
+
B
CATG
GTAC
CATG
GTAC
AAAAA
TTTTT b
AAAAA
TTTTT b
Cleave with tagging enzyme (TE), Blunt end
Primer A
Primer B
GGATGCATGOOOOOOOOO
CCTACGTACOOOOOOOOO
TE AE
GGATGCATGXXXXXXXXX
CCTACGTACXXXXXXXXX
TE
AE
Ligate and amplify with
primers A and B
GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC
CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACCTAGG
Ditag
Cleave with anchoring enzyme
Isolate Ditags
Concatenate and clone
-----CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG---------GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC----AE
Tag 1
Tag 2
Ditag
AE
Tag 3
Tag 4
Ditag
AE
Serial analysis of Gene Expression (SAGE)
redrawn from (Velculescu et al., 1995)
mRNA is reverse transcribed using biotinylated
oligo(dT) primers to produce cDNA, and this is
subsequently cleaved with a 4 bp recognition site
restriction endonuclease (e.g. NlaIII) termed the
‘anchoring enzyme’ (AE). Restriction fragments,
biotinylated at the 3’ end, are immobilised using
streptavidinated beads and then divided in half.
Each fraction is ligated to one of two adapter linkers
(A and B), designed to contain sequence
complementary to the overhangs produced by the
anchoring enzyme, a type IIS restriction enzyme
recognition site (e.g. BsmFI) known as the ‘tagging
enzyme’ (TE), and sufficient additional sequence
complementary to adaptamer PCR primers.
Cleavage with the tagging enzyme releases the
linker and a short cDNA sequence known as the
‘tag’. Tags from pools A and B are blunt ended and
ligated to each other to form ‘ditags’. Ditags serve
as amplification templates for PCR using adaptamer
primers A and B, and cleavage of amplification
products with the anchoring enzyme releases the
ditags. Ditags are concatenated by ligation and
concatemers cloned and subsequently sequenced.
Serial sequence analysis of ditags of fixed length is
achieved using the anchoring enzyme recognition
site as punctuation in the sequence.
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23
24
Microarray aplicado a expresión genómica: el mRNA proveniente de una dada línea
celular o tejido se usa para generar una muestra marcada que se hibrida en paralelo, a un gran
número de secuencias de ADN, inmovilizado sobre una superficie sólida en forma ordenada.
Miles de transcriptos pueden ser detectados simultáneamente.
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Aumento de cantidad de RNA para microarray
(cuando hay poca muestra) por técnica de transcripción in vitro
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Objetivos
Interés en hallar el cambio en la expresión
génica, causa de la alteración del fenotipo
También para análisis
de hipermetilación
Redundancia
Insuficiencia
Reg. Traducc.
Muestras a
comparar
Estudiar patrones de expresión global
# estadíos
#etapas del
ciclo celular
Activacion
por # factores
Software:
para
comparaión
de
# patrones de
expresión
Causa o efecto?
validación de los resultados
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Ejemplo: Distinguir distintos tipos de linfoma difuso de células B (DLBCL)
Morfologica y inmunohistoqcamente
homogeneo.
DLBCL
Clinicamente heterogéneo, solo el
40% responde bien a la terapia.
FL
Array de 18000 cADN:
Genes que se inducen o reprimen durante
la activacion de células B y T por
mitógenos. cADN de células B
germinales. Biblioteca de DLBCL.
Clones con cADN de linfoma folicular
(FL), de leucemia linfocítica(CLL) y de otros
linfomas y otros genes de importancia en
linfocitos y en biología del cancer
(reproducibilidad)
Muestras cuyo perfil de mRNA se
estudió: DLBCL, FL, CLL, linfocitos
en distintos estadíos. Del mRNA
proveniente de cada muestra se
obtuvo un cADN marcado con Cy5.
Se compara con un cADN de calibración
(obtenido de pool de mRNA de 9 líneas
celulares de linfomas) marcado con Cy3.
CLL
G
E
N
E
S
En total: 1.800.000 medidas en 96
muestras usando 128 microarrays.
<
>
Genes coordinadamente
expresados en muestras
relacionadas
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Cel B s/act
Cel B Germinales
DLBCL
FL
CLL
Distincion entre FL y CLL por un lado
Y DLBCL
Inhomogeneidad en
DLBCL
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Descubrimiento de distintos tipos
en el linfoma difuso de celulas B (DLBCL)
Hay dos grupos bien diferenciados en base a
la expresion de genes de B germinal y de
genes de B activados (no histologica ni
inmunologicamente).
Clasificacion de paciente: en base a los dos
sets de genes (heterogeneidad)
A los 5 años de tratamiento
sobrevive el 52% del total
(76% delos GC-like
Y 16% de los B-like.
Potencial del análisis de cluster
Buscar dentro de cada tipo
subgrupos en base a expresión
de otros genes
Identificar función de genes desconocidos por asociación con genes conocidos
Identificar la firma de un tipo celular o estadío. Util para clasificación de tumores
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Cambios epigenéticos
Hipermetilación
Metilación aberrante
de DNA e histonas
miRNA ( silenciamiento estable y heredable en la division
celular)
Identificación sitios de hipermetilación
Análisis de la alteración de expresión por desmetilación por la técnica de microarray
Diagnóstico: Detección, clases de tumor, prognosis
1) Efecto de metilación sobre corte con enzimas de restricción
2) PCR y secuenciación post tratamiento con bisulfito de sodio
o microarray
3) Cambio de nucleótido por acción del bisulfito de sodio y detección alelo específica
Ejemplo PCR en tiempo real: -discriminación alelo específica
-Variación en Tm
4) Silenciamiento de transcripción por metilación por RT-PCR en tiempo real (Sybr green)
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