universidad de costa rica sistema de estudios de posgrado

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO
CARACTERIZACIÓN DE DOS COMUNIDADES MICROBIANAS DE
AMBIENTES EXTREMOS ÁCIDOS DEL PARQUE NACIONAL VOLCÁN
RINCÓN DE LA VIEJA, GUANACASTE, COSTA RICA
Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de
Posgrado en Microbiología, Parasitología y Química Clínica para optar al
grado y título de Maestría Académica en Microbiología
WALTER ISMAEL HERNÁNDEZ ASCENCIO
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Ricá
2012
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a mi familia, quienes son la razón de mi existir y me han alentado
y apoyado con sus acciones y palabras a lo largo de mi vida: mis padres, Walter y Melany,
mis hermanos, Francisco y Sara, y mi esposa Vanessa. Este trabajo es por y para ustedes.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primer lugar a mi madre y a mi esposa por dedicar tanto tiempo,
esfuerzo y paciencia para ayudarme. También al personal del Centro de Investigación en
Biología Celular y Molecular (CIBCM), así como a Francisco Hemández y Ethel Sánchez
del Centro de Investigación en Estructuras Microscópicas (CIEMic), por haberme prestado
su invaluable ayuda y brindarme su amistad, y a todos aquellos profesores de la
Universidad de Costa Rica que me han transmitido parte de sus conocimientos.
ii
"Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en
Microbiología, Parasitología y Química Clínica de la Universidad de Costa Rica, como
requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología".
M.Sc. David Loría Masís
Representante de Ja Decana
Sistema de Estudios de Posgrado
M.Sc. Marielos Mora López
Directora de Tesis
Directora
/
Programa de Posgrado en Microbiología, Parasitoiogía y Química Clínica
\NQ /.fe~
I. H~Y-ndnde.2 A.
Walter Ismael Hemández Ascencio
Candidato
iii
TABLA DE CONTENIDOS
Portada . . ................................................................................................................... i
Dedicatoria y agradecimientos . . ............................................................................. ii
Hoja de aprobación .................................................................................................. iii
iv
Tabla de contenidos
Resumen . . . ............. ................. ...... .... ............ ........................... .... ...... .... .. .... ... ........ .. vii
Abstract . . •...•. ..••..••....... ..... ........•........... ..... ........ ....•.... .... .. .. ...... .•... .....................•. ....
viii
Lista de cuadros . . .................................................................................................... ix
Lista de figuras . . . ..................................................................................................... x
Lista de abreviaturas . . ............................................................................................ xii
Marco teórico ........................................................................................................... 1
Ambientes extremos, organismos extremófilos y su importancia
1
Ejemplo de un ecosistema extremo ácido: Río Tinto . . . ........................................ 5
Técnicas aplicadas al estudio de ambientes extremos . . . .. ........... .. .... ...... .... .. ... .... 7
Lámina de contacto
7
Cultivos
8
Técnicas moleculares
9
iv
Ejemplos de estudios realizados en ambientes extremos . . . ......... ..... ....... .. ........... 19
Ambientes extremos ácidos del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja
22
Referencias . . . ... ........ ..... .. .. .. ........ ...... .. ... ... .. ... .. .. ...... ... ... ... .... .. .. .... ... ..... .... ....... .. ... 24
Justificación . . ........................................................................................................... 31
Objetivos . . ................................................................................................................ 32
.
Primera descripción de una comunidad microbiana habitante de un ambiente
extremo ácido del campo geotermal Las Pailas, Parque Nacional Volcán
Rincón de la Vieja, Costa Rica . . ............................................................................. 33
Abstract . . . ......... ........ .............. ... .. ... .... ............. .. ... .. ... ..... .. ................ ... .. .. ..... .... .... 33
Introducción . . . ......... .... ......................................................................................... 34
Materiales y métodos . . . ........... ............ .. ............ ....... .. ................................. .. .. ... .. 36
Resultados . . . ........................................... ..... ...................... ........ .... ...... ... ............. . 42
Discusión . . . .. ........ ... .... ....... ....... .. ........ .... ...... ................... ... ..... ... ... .. ............. ........ 54
Resumen ............................................................................................................... 63
Referencias . . . ... ... ..... ...... ... .. ...... ... ....... ... ..... ..................... .. .. ................................. 63
Descripción de una comunidad microbiana habitante de una naciente de aguas
ácidas del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Costa Rica .. ................. 71
Abstract . . .............................................................................................................. 71
Introducción . . . ..... .. .... .. ... ... ... ......... .. .... ... .... .. .. ... ... .... ..... ......... ... ..... .. ...... ....... .... ... 72
Resultados . . . ..... .. ...... ...... ............... ........... .......................... ...... .... .... ....... ....... ...... 78
Discusión . . . .... ... .... ...... .... .. .... .. ... .. .. ... . ....... .................. ..... .... .... ........... ... .............. . 90
Resumen ............................................................................................................... 97
Referencias ........................................................................................................... 97
Conclusiones generales y perspectivas
103
Conclusiones generales
103
Perspectivas ......................................................................................................... 104
vi
RESUMEN
Primera descripción de una comunidad microbiana habitante de un ambiente extremo ácido del campo
geotermal Las Pailas, Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Costa Rica: Los microorganismos
extremófilos son aquellos que prosperan en ambientes con extremos de temperatura, salinidad, pH o
concentración de metales pesados, entre otros, y son interesantes por su ecología y fisiología únicas y por sus
aplicaciones biotecnológicas potenciales. Las regiones tropicales son sitios importantes de diversidad de
extremófilos, sin embargo, existen pocos reportes científicos, por ejemplo en Costa Rica hay solo algunos
informes de estudios en ambientes ácidos asociados a los volcanes Poás y Rincón de la Vieja. Este trabajo
intenta describir la composición de una comunidad microbiana habitante del borde de un pozos de lodo ácido
y caliente del campo geotermal Las Pailas, un conjunto de manifestaciones hidrotermales ácidas ubicado en el
Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, con el objetivo de aumentar el conocimiento de la diversidad de
microorganismos extremófilos de Costa Rica y del trópico. La comunidad microbiana estudiada se mostraba
como una película de color verde sobre la superficie de una acumulación de barro con un pH de 2.S,
concentraciones altas de iones sulfato y metálicos y expuesta a los vapores calientes del hervidero de lodo.
Los microorganismos se observaron mediante microscopio de luz, microscopio electrónico de transmisión y
microscopio electrónico de barrido. Se construyeron bibliotecas de ADNr 16S de cloroplasto, Bacteria y
Archaea, las cuales se agruparon de acuerdo a sus polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP) con el fin de secuenciar un representante de cada agrupamiento. Las secuencias se
alinearon y se construyeron árboles filogenéticos que evidenciaron varios de los grupos microbianos
presentes. Las observaciones microscópicas revelaron que la comunidad estaba dominada por algas
Cyanidiales y que además habían diatomeas pennadas y procariotas. Las secuencias de ADNr 16S se
relacionaron en su mayoría con clones de muestras ambientales procedentes de sitios con condiciones de
acidez o temperatura similares a Las Pailas. Las secuencias de cloroplasto mostraron que las algas Cyanidales
pertenecen al linaje Cyanidioschyzon merolae - Galdieria maxima. Las secuencias del dominio Bacteria
indicaron la presencia de los grupos Firmicutes, Bacteroidetes, TM7 y y-Proteobacteria, incluyendo dentro de
este último al género Acidithiobacillus. En cuanto al dominio Archaea, se encontraron secuencias de los
grupos Thermoplasmatales, nanoarqueas ARMAN-2 y organismos emparentados con metanógenos. Estos
resultados plantean la existencia de relaciones ecológicas complejas entre microorganismos con fisiologías y
morfologías diferentes que habitan un ambiente con al menos tres parámetros extremos: pH, temperatura y
concentración de químicos.
Descripción de una comunidad microbiana habitante de una naciente de aguas ácidas del Parque
Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Costa Rica: Los conocimientos de la biodiversidad microbiana
costarricense son muy escasos. La riqueza microbiana con la que cuenta el país incluye microorganismos que
habitan ambientes ácidos y que son fuentes promisorias de enzimas con potencial industrial. Se han descrito
solo algunos de estos organismos acidófilos en ambientes con pH bajo asociados .a los volcanes Poás y Rincón
de la Vieja. Este trabajo describe la composición de una comunidad microbiana habitante de una naciente de
aguas ácidas del sitio conocido como Pailas Frías, en el Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, con el
objetivo de aumentar el conocimiento de la diversidad de microorganismos extremófilos de Costa Rica. La
comunidad microbiana estudiada se mostraba como una masa de filamentos y sedimento de color verde en
una corriente de agua con un pH de 2.41 y concentraciones altas de iones. Los microorganismos se
observaron mediante microscopio de luz y microscopio electrónico de barrido. Se construyeron bibliotecas de
ADNr 16S de cloroplasto, Bacteria y Archaea, las cuales se agruparon de acuerdo a sus polimorfismos en la
longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) con el fin de secuenciar un representante de cada
agrupamiento. Las secuencias se alinearon y se construyeron árboles filogenéticos que evidenciaron varios de
los grupos microbianos presentes. Las observaciones microscópicas revelaron que la comunidad estaba
dominada por algas Zygnematales y que además habían diatomeas pennadas y células similares a Euglena
mutabilis. Las secuencias de ADNr 16S se relacionaron en su mayoría con organismos y clones de muestras
ambientales procedentes de sitios con condiciones extremas de acidez. Las secuencias de cloroplasto
correspondieron con los tres grupos de organismos fotosintéticos observados en el microscopio. Las
secuencias del dominio Bacteria indicaron la presencia de los grupos Acidobacteria, Planctomycetes, aProteobacteria (incluyendo el género Acidiphilium) y ~-Proteobacteria. En cuanto al dominio Archaea, se
encontraron secuencias del grupo Euryarchaeota. Estos resultados plantean la existencia de relaciones
ecológicas complejas entre microorganismos con fisiologías y morfologías diferentes que habitan un ambiente
con al menos dos parámetros extremos: pH y concentración de iones.
vii
ABSTRACT
First description of a microbial community inhabiting an extreme acidic environment at Las Pailas
geothermal field, Rincon de la Vieja Volcano National Park, Costa Rica. Extremophilic microorganisms
are those that thrive in environments with extremes of temperature, salinity, pH or concentration of heavy
metals, among others. They are interesting for their unique ecology and physiology and their potential
biotechnological applications. Tropical regions are hot spots of extremophile microbial diversity, however,
they are highly unreported in the scientific literature. In Costa Rica, for example, there are only a few reports
about studies conducted in acidic environments associated with Poas and Rincon de la Vieja volcanoes. This
paper describes the composition of a microbial community inhabiting the edge of an acidic hot mud pool that
belongs to a set of acidic hydrothermal manifestations, known as Las Pailas geothermal field, located in the
Rincon de la Vieja Volcano National Park. The aim is to increase the knowledge about diversity of Costa
Rican and tropical extremophilic microorganisms. The microbial community was evident as a green film on
the surface of a mud accumulation with a pH of 2.5, high concentrations of sulfate and metal ions and
exposed to hot vapors from the mud pool. The microorganisms were observed by light microscopy,
transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. 16S rDNA librarles were constructed
for chloroplast, Bacteria and Archaea. They were grouped according to restriction fragment length
polymorphisms (RFLPs) anda representative of each cluster was sequenced. Sequences were aligned to built
phylogenetic trees that showed severa] of the microbia] groups present in the sample. Microscopic
observations revealed that the community was dominated by Cyanidiales algae and that pennate diatoms and
prokaryotes also were present. 16S rDNA sequences were associated mostly with environmental clones from
sites with conditions of acidity or temperature similar to Las Pailas. Chloroplast sequences showed that
Cyanidales algae belong to the Cyanidioschyzon merolae - Galdieria maxima lineage. Sequences from
Bacteria domain indicated the presence of the groups Firmicutes, Bacteroidetes, TM7 and y-Proteobacteria,
including within the latter the genus Acidithiobacillus. Archaea domain sequences belonged to the groups
Thermoplasmatales, ARMAN-2 nanoarcheons and organisms related with methanogens. These results
suggest the existence of complex ecologica] relationships between organisms with different physiologies and
morphologies inhabiting an environment with at least three extreme parameters: pH, temperature and
concentration of chemicals.
Description of a microbial community inhabiting an acidic spring at Rincon de la Vieja Volcano
National Park, Costa Rica. The knowledge of Costa Rican biodiversity is scarce from a microbial point of
view. Country's microbial richness includes organisms that inhabit acidic environments and are promising
sources of enzymes with industrial potential. Only sorne acidophiles inhabiting low pH environments
associated with volcanoes Poas and Rincon de la Vieja have been described. This paper describes the
composition of a microbial comrnunity thriving in an acidic spring frorn a site known as Pailas Frias, located
in Santa Maria sector of Rincon de Ja Vieja Volcano National Park, aiming to increase the knoledge about the
diversity of extremophilic microorganisms in Costa Rica. The microbial community was revealed as a mass
of filaments and green sediment in water with a pH of 2.41 and high concentrations of ions. The organisms
were observed by light microscope and scanning electron microscope. 16S rDNA libraries were constructed
for chloroplast, Bacteria and Archaea. They were grouped according to restriction fragment length
polymorphisms (RFLP) and a represemative of each cluster was sequenced. Sequences were aligned to built
phylogenetic trees that showed severa! of the microbial groups present in the sample. Microscopic
observations revealed that the community was dominated by Zygnematales algae and that pennate diatoms
and cells similar to Euglena mutabilis were also present. 16S rDNA sequences were associated mostly with
organisms and environmental clones from sites with conditions of extreme acidity. Chloroplast sequences
corresponded to the three groups of photosynthetic organisrns observed in the microscope. Bacteria
sequences indicated the presence of groups Acidobacte1ia. Planctornycetes, a-Proteobacteria (including the
genus Acidiphilium) and P-Proteobacteria. In the other hand, Archaea sequences indicated the presence of
euryarchaeons. These results suggest the existence of complex ecological relationships between organisms
with different physiologies and morphologíes inhabitíng an enviromnent with at least two extreme
parameters: pH and ions concentration.
viii
LISTA DE CUADROS
.
Primera descripción de una comunidad microbiana habitante de un ambiente extremo
ácido del campo geotermal Las Pailas, Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja,
Costa Rica
Título
Página
Inventario de la biblioteca de ADNr 16S de cloroplasto, mitocondria y Bacteria
organizado en ribotipos de acuerdo a los patrones de RFLP y al resultado del
BLAST .................................................................................................................
48
Inventario de la biblioteca de ADNr 16S de Archaea organizado en ribotipos de
acuerdo a los patrones de RFLP y al resultado del BLAST . . . ..................... .... .....
49
Descripción de una comunidad microbiana habitante de una naciente de aguas ácidas
del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Costa Rica
Titulo
Página
Inventario de la biblioteca de ADNr 16S de cloroplasto y Bacteria organizado
en ribotipos de acuerdo a los patrones de RFLP y al resultado del BLAST . . . .. ...
82
Inventario de la biblioteca de ADNr 16S de Archaea organizado en ribotipos de
acuerdo a los patrones de RFLP y al resultado del BLAST . . . ... . . . ...... .................
84
LISTA DE FIGURAS
Marco teórico
Título
Página
Ubicación geográfica del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja y de los
sectores Las Pailas y Santa María ........................................... :...........................
24
Primera descripción de una comunidad microbiana habitante de un ambiente extremo
ácido del campo geotermal Las Pailas, Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja,
Costa Rica
Título
Página
Ubicación de Pailas de Agua dentro del sector Las Pailas del Parque Nacional
Volcán Rincón de la Vieja . . . ... . ...........................................................................
37
Comunidad microbiana del borde de un pozo de lodo ácido y caliente de Las
Pailas, Parque Nacional Volcán Rincón de La Vieja . . . ... . . ..................................
44
Alineamiento de la región hipervarible V6 de la secuencia R0435B3 con otras
secuencias de la división candidata TM7, tomando como referencia la
numeración de E. coli K-12 . . ... . .........................................................................
47
Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las
secuencias parciales de ADNr 16S de cloroplasto de Las Pailas y las secuencias
de GeneBank más cercanas según los resultados de BLAST . . . ... . ......................
51
Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las
secuencias parciales de ADNr 16S de Bacteria de Las Pailas y las secuencias de
GeneBank más cercanas según los resultados de BLAST
X
52
Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las
secuencias parciales de ADNr 16S de Archaea de Las Pailas y las secuencias de
GeneBank más cercanas según los resultados de BLAST . . . ... . . .........................
53
Descripción de una comunidad microbiana habitante de una naciente de aguas ácidas
del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Costa Rica
Título
Página
Comunidad microbiana creciendo en aguas ácidasº de Pailas Frías, sector Santa
María del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja . . . .. . . . ..............................
79
Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las
secuencias parciales de ADNr 16S de cloroplasto de Santa María y las
secuencias de GeneBank más cercanas según los resultados de BLAST . . ... . . . ..
87
Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las
secuencias parciales de ADNr 16S de Bacteria de Santa María y las secuencias
de GeneBank más cercanas según los resultados de BLAST . . . .. . . ......................
88
Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las
secuencias parciales de ADNr 16S de Archaea de Santa María y las secuencias
de GeneBank más cercanas según los resultados de BLAST . . . .. . . . ............ ...... ...
xi
89
LISTA DE ABREVIATUAS
ADN: ácido desoxirribonucleico.
ADNr 16S: nombre del gen o segmento de ADN a partir del cual se transcribe la subunidad
16S del ácido ribonucleico ribosomal.
ADNr 18S: nombre del gen o segmento de ADN a partir del cual se transcribe la subunidad
18S del ácido ribonucleico ribosomal.
ARMAN-2: grupo 2 de nanoarqueas acidofílicas de la mina Richmond (archaeal
Richmond mine acidophilic nanoorganisms).
ARN: ácido ribonucleico.
ARNr 16S: subunidad 16S de ácido ribonucleico ribosomal presente en procariotas y en
mitocondrias y cloroplastos de eucariotas.
ARNr 18S: subunidad 18S de ácido ribonucleico ribosomal presente en el citoplasma de
eucariotas.
ATP: siglas en inglés de trifosfato de adenosina (adenosine triphosphate).
BAC: siglas en inglés de cromosoma bacteriano artificial (bacteria/ artificial chromosome).
BLAST: siglas en inglés de la herramienta de búsqueda de alineamientos locales básicos
(basic local alignment search tool) con la cual es posible alinear una secuencia con las
secuencias disponibles en bases de datos de ADN como GeneBank.
BSA: siglas en inglés de albúmina de suero bovino (bovine serum albumin).
xii
CIBCM: Centro de Investigación den Biología Celular y Molecular.
CTAB: siglas en inglés de bromuro de cetiltrimetilamonio ( cetyltrimethylammonium
bromide).
DGGE: siglas en inglés de electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización
(denaturing gradient gel electrophoresis).
dNTP: siglas en inglés de trifosfato de desoxirribonucleótido ( deoxyribonucleotide
triphosphate).
EDTA: siglas en inglés de ácido etilendiamintetracético (ethylenediaminetetraacetic acid).
EEUU: Estados Unidos.
FISH: siglas en inglés de hibridación fluorescente in situ (fluorescence in situ
hybridization).
ICE: Instituto Costarricense de Electricidad.
PCR: siglas en inglés de reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction).
PLFA: siglas en inglés de ácidos grasos derivados de fosfolípidos (phospholipid-derived
fatty acids).
RFLP: siglas en inglés de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción
(restriction fragment length polymorphisms).
SDS: siglas en inglés de dodecilsulfato de sodio (sodium dodecyl sulfate).
TE: solución de Tris lOmM y EDTA lmM.
xiii
1
Marco teórico
AMBIENTES EXTREMOS, ORGANISMOS EXTREMÓFILOS Y SU IMPORTANCIA
La diversidad microbiana puede ser definida como el número de especies de
microorganismos y su abundancia relativa en una comunidad.
La magnitud de esta
diversidad es impresionante, ya que solo los organismos procarióticos posiblemente
constituyen millones de especies diferentes, abarcando los dominios Archaea y Bacteria.
La diversidad procariótica es producto de aproximadamente 3800 millones de años de
evolución, 2000 millones de años más de evolución que los organismos eucariotas, siendo
ésta una de las razones para su extraordinaria diversidad (Torsvik et al. 2002).
Esta
diversidad de especies va de la mano con la gran cantidad de ambientes diferentes que
pueden ser habitados, pues se han reportado microorganismos proliferando en condiciones
que a veces son consideradas increíbles, como por ejemplo en drenajes ácidos con pH
menor a 1 (Edwards et al. 2000), en fuentes termales subterráneas (Marteisson et al. 2001)
y hasta en fuentes termales submarinas con temperaturas cercanas a los lOOºC (Huber et al.
2002, Nakagawa et al. 2004).
En consecuencia, en las últimas décadas ha habido un
continuo replanteamiento de los límites de la vida, lo cual ha impulsado un importante
avance en el estudio de ambientes extremos y de los microorganismos extremófiJos
asociados.
La definición de ambiente extremo tiende a ser un tanto antropocentrista, ya que por
ejemplo, mientras que para el ser humano la concentración de oxígeno en la atmósfera es
adecuada, para un organismo anaerobio puede ser extrema e incluso fatal. Una manera
objetiva de definir lo que es un ambiente extremo es considerar un ámbito de valores y
tomar como ambientes extremos los que presenten valores ubicados en los límites de dicho
ámbito. De esta forma, dentro del ámbito posible de pH, se pueden considerar extremos los
ambientes cuyo pH sea cercano a O o a 14. Aplicando este mismo concepto se pueden
considerar extremos los ambientes cuya temperatura sea cercana al punto de congelación
por un lado, o cercana al punto de ebullición por el otro. La calificación de extremo puede
referirse a parámetros físicos como temperatura, radiación o presión, o a parámetros
químicos como desecación, salinidad, pH o potencial redox (Rothschild & Mancinelli
2
2001).
Por otro lado se debe definir lo que es un extremófilo. Este término está formado con
la palabra griega "philos" (amante), por lo que se puede decir que los organismos
extremófilos son "amantes de los extremos", o sea, organismos cuyo crecimiento óptimo se
da en ambientes que presentan al menos una característica que se pueda considerar extrema.
Organismos de este tipo han sido encontrados en los tres dominios de la vida: Archaea,
Bacteria y Eukarya (Rothschild & Mancinelli 2001).
Es importante hacer la distinción entre organismos extremófilos y extremotolerantes.
Estos últimos, si bien pueden encontrarse habitando ambientes extremos, no crecen ahí en
.
forma óptima o solo están presentes en formas latentes de resistencia, alcanzando su
desarrollo máximo hasta que las condiciones ambientales se toman moderadas. Ejemplo de
esto son algunas plantas y animales de zonas templadas, capaces de sobrevivir a las bajas
temperaturas del invierno disminuyendo su actividad y su metabolismo. Otro buen ejemplo
son ciertos estadios en el ciclo de vida de los tardígrados (Tardigrada), los cuales pueden
resistir temperaturas desde -253ºC hasta 151 ºC, así como rayos X, vacío y presiones de
hasta 600MPa (Rothschild & Mancinelli 2001).
Los extremófilos son clasificados en función del ambiente al cual estén adaptados.
Los psicrófilos son aquellos organismos cuya temperatura óptima de crecimiento es igual o
menor a 15ºC, por lo que se encuentran en ambientes permanentemente fríos y mueren
rápidamente si se exponen a temperaturas mayores. Un ejemplo de psicrófilo es el alga
Chlamydomonas nivalis, la cual crece sobre la nieve de los glaciares (Madigan et al. 1998).
Los termófilos son organismos cuya temperatura óptima de crecimiento está por
encima de los 45ºC, mientras que aquellos que la presentan por encima de los 80ºC son
llamados hipertermófilos (Reysenbach & Shock 2002). Un ejemplo de hipertermófilo es
Pyrolobus fumarii, una arquea capaz de crecer a temperaturas tan altas como 113ºC (BlOchl
1997).
Si se considera el pH, se habla de organismos acidófilos y alcalófilos.
Un buen
ejemplo de los primeros es Cyanidium caldarium, un alga roja cuyo crecimiento óptimo se
da a pH 2-3, pero que incluso puede crecer a pH 0.5 (Rothschild & Mancinelli 2001).
Bacterias del género Haloanaerobium y la arquea Halobacterium salinarium son
3
llamadas halófilas debido a que crecen en ambientes extremadamente salinos, tales como
lagunas de evaporación de agua de mar (Madigan et al. 1998).
Existen organismos que son extremófilos en más de un sentido, como por ejemplo la
arquea Sulfolobus acidocaldarius, un termoacidófilo que crece en fuentes termales ácidas
ricas en azufre, a temperaturas de hasta 90ºC y valores de pH entre 1 y 5 (Madigan et al.
1998).
El interés científico por los ambientes extremos, además de representar curiosidad por
hábitats con características inusuales, se centra en cuestiones referentes a la adaptación y
evolución de los organismos capaces de vivir en dichos hábitats. Los ambientes extremos
también han sido estudiados como modelos para entender la ecología microbiana, dado que
la comparativamente pequeña biodiversidad en tales ambientes podria permitir un mejor
entendimiento de la cooperación entre microorganismos, a diferencia de ambientes con
condiciones de vida moderadas, en los cuales la diversidad de especies es más variada y
compleja (Schink 1999).
Las comunidades microbianas extremófilas son particularmente interesantes debido a
que sus hábitats podrían parecerse a los hábitats volcánicos anóxicos que se cree que
existían inicialmente en la Tierra.
De hecho, muchos de los linajes bacterianos
identificados a partir de aguas termales parecen estar relacionados con linajes cercanos a la
raíz del árbol bacteriano. Las fuentes termales también se han sugerido como sistemas
modelo de vida extraterrestre, a la vez que organismos aislados de fuentes termales han
demostrado ser valiosos para la biotecnología y la investigación (Mathur et al. 2007),
siendo el mejor ejemplo la bacteria Thermus aquaticus, encontrada en las fuentes termales
del Parque Nacional Yellowstone (EEUU) y de la cual se aisló y clonó la enzima Taq ADN
polimerasa (Brock 1997).
Existen varias razones que justifican la importancia de los ambientes extremos como
fuentes de microorganismos de interés biotecnológico.
Por ejemplo, los organismos
termófilos tienen la capacidad de producir enzimas termoestables y termoactivas que
pueden usarse industrialmente, y cuya principal ventaja es que al aumentar la temperatura
del proceso que catalizan incrementa también la velocidad de reacción, lo que a su vez
disminuye la cantidad de enzima necesaria. Además, gracias a la capacidad de tolerar altas
4
temperaturas aumenta la vida media de la enzima. El uso de temperaturas mayores a 60 ºC
también es inhibitorio para el crecimiento de gran cantidad de microorganismos,
disminuyendo la posibilidad de contaminación microbana durante los procesos (Zamost et
al. 1991).
En el otro extremo están las enzimas producidas por los microorganismos
psicrófilos, las cuales poseen una gran complementariedad entre el sitio activo y el sustrato,
con un bajo costo energético, dando como resultado una alta actividad específica a bajas
temperaturas.
Estas enzimas también ofrecen beneficios económicos en procesos
industriales, pues evitan el gasto de energía que implican los pasos de calentamiento,
funcionan en ambientes fríos y durante el invierno, minimizan reacciones químicas
indeseables que pueden ocurrir a altas temperaturas y exhiben labilidad térmica para una
rápida y fácil inactivación (Cavicchioli et al. 2002).
En general, muchos de estos
biocatalizadores muestran nuevos ámbitos sustrato/producto, a la vez que son altamente
estables bajo condiciones extremas, por lo que tienen aplicación potencial en industrias
tales como la industria alimenticia y la producción de químicos de primera calidad (Steele
et al. 2009).
Los
ambientes
extremos
ácidos
generalmente son muy
tóxicos
debido
a
concentraciones altas de protones y metales, por lo que los microorganismos que los
habitan resultan de interés en aplicaciones industriales, biotecnológicas y procesamiento
biológico de minerales.
Las comunidades microbianas acidófilas también están bajo
investigación porque las enzimas que confieren resistencia a metales tienen importancia por
su posible contribución a la descontaminación ambiental mediante biorremediación, como
por ejemplo en la remediación de drenajes de minas abandonadas (Lohr et al. 2006, Mirete
et al. 2007).
Sin embargo, para mejorar los procesos de biorremediación se necesita
aumentar el conocimiento relacionado con los procesos fisiológicos de las comunidades, así
como entender la relación entre la diversidad microbiana y las rutas fisiológicas ligadas a
estos procesos en ambientes contaminados (Cubillos-Ruiz et al. 2010).
Las aplicaciones biotecnológicas de los extremófilos han dado un mayor empuje al
estudio de ambientes extremos, para lo cual se requieren técnicas que permitan detectar los
microorganismos y aislarlos de su ambiente, y si esto no es posible, al menos aislar los
genes que codifican por las enzimas de interés.
5
EJEMPLO DE UN ECOSISTEMA EXTREMO ÁCIDO: RÍO TINTO
El Río Tinto nace en la franja de pirita ibérica (España), uno de los depósitos masivos
de sulfuro más grande de la Tierra que se formó corno una acumulación hidrotermal durante
el Paleozoico. Características importantes de este río son una alta concentración de iones
Fe3+ y sulfato producto de la biooxidación de la pirita, una concentración alta de iones
metálicos pesados y un pH ácido constante con un promedio de 2.3 (González-Toril et al.
2010). En gran parte de su recorrido el cauce es ancho y el agua poco profunda, lo que
permite la penetración de la luz hasta el fondo y facilita la proliferación de productores
primarios fotosintéticos y otros organismos asociados (López-Archilla 2005). Éstos forman
biopelículas en el lecho del río y en la superficie de las rocas que están constituidas
principalmente por algas filamentosas y hongos que atrapan a otros microorganismos tanto
eucariotas corno procariotas.
El grado de diversidad de estos eucariotas a veces es
considerado inesperado para este ambiente ácido único (González-Toril et al. 2010).
Dentro de los procariotas la mayoría parecen corresponder al dominio Bacteria, pues solo
3% dan señales positivas al hacer hibridación fluorescente in si tu (conocida como FISH por
sus siglas en inglés) con sondas para Archaea. Las especies bacterianas más representativas
en esta comunidad son Acidithiobacillus ferrooxidans (promedio de positivos 23%) y
Leptospirillum ferrooxidans (promedio de positivos 22%). El tercer grupo bacteriano más
abundante corresponde a miembros del género Acidiphilium (González-Toril et al. 2003).
La producción primaria en el río se debe tanto a la actividad fotosintética como
quimiolitoautótrofa. Se piensa que los principales proveedores de materia orgánica son los
organismos fotosintéticos, cuya gran biomasa se mantiene prácticamente durante todo el
año.
Entre éstos hay diatomeas emparentadas con el género Eolimna que debido a su
abundancia se piensa que juegan un papel fundamental en el mantenimiento del sistema.
También las euglenofitas tienen una población importante, habiéndose identificado
únicamente la especie Euglena mutabilis. En contraste con los dos grupos anteriores, las
clorofitas parecen ser más diversas, pues se han observado filamentos similares a algas del
género Klebsormidium y esporádicamente del género Zygnema, sin embargo, las más
ubicuas son algas unicelulares de los géneros Chlamydomonas y Chlorella.
En el río
6
también se ha detectado la presencia de algas rojas unicelulares del género Galdieria
(López-Archilla 2005).
Los sulfuros metálicos ofrecen los sustratos necesarios para la proliferación del otro
grupo de productores primarios: las bacterias quimiolitoautótrofas, de las cuales hay
cantidades elevadas de oxidadoras de hierro y azufre, del orden de 10 6 células por mililitro.
Los
principales
aislamientos
bacterianos
capaces
de
oxidar
hierro
han
sido
Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans, mientras que los oxidadores
de azufre elemental y tiosulfato, pero no de hierro, corresponden a la especie
Acidithiobacillus thiooxidans (López-Archilla 2005). El metabolismo de estas bacterias
hace pensar que el ecosistema de Río Tinto está bajo control, o al menos muy influenciado,
por la presencia de hierro.
El Fe2 + es la fuente de energía para A ferrooxidans y L.
ferrooxidans, resultando en la producción del Fe 3+ que es responsable del pH ácido
constante a lo largo del río. Por otro lado, A. ferrooxidans también puede crecer utilizando
compuestos de azufre reducido como donadores de electrones y Fe 3+ como aceptor de
electrones. Además, Acidiphilium sp. tiene la capacidad de respirar compuestos de carbono
reducido mediante el uso de Fe 3+ como aceptor de electrones. Por lo tanto, estas tres
bacterias (A ferrooxidans, L. ferrooxidans, y Acidiphilium sp.) completarían el ciclo del
hierro y explicarían la acidez de este hábitat (González-Toril et al. 2003). A pesar de que
otros géneros de microorganismos oxidantes y reductores de hierro han sido detectados en
el ecosistema de la columna de agua, como las actinobacterias Ferrimicrobium y
Acidimicrobium y la arquea termoplasmatal Ferroplasma, sus bajas concentraciones
sugieren que tienen una importancia menor en el ciclo del hierro (González-Toril et al.
2010).
La biomasa generada por los productores primarios es descompuesta por una gran
cantidad de bacterias heterótrofas, entre las cuales se halla el género Acidiphilium que,
como se mencionó anteriormente, se encuentra asociado con bacterias quimiolitoautótrofas,
habiéndose identificado las especies A cryptum, A organovorum y A. multivorum. Otro
grupo de bacterias heterótrofas numéricamente importante pertenece al género Bacillus, del
cual
se
han
aislado
las
especies
B.
megaterium,
B.
amyloliquefaciens,
B.
sthearothermophilus, B. cereus y B. subtilis, cuyo pH óptimo es próximo a la neutralidad y
7
cuya presencia en este ambiente puede deberse a su capacigad para excretar cantidades
abundantes de sustancias poliméricas durante su crecimiento en biopelículas (LópezArchilla 2005).
Al igual que en ambientes terrestres, los hongos parecen ser descomponedores muy
activos e importantes en el Río Tinto, dado el elevado número de hongos tanto filamentosos
como levaduriformes y su amplia diversidad. La mayoría de las levaduras presentes en el
río son basidiomicetes de los géneros Rhodotorula, Cryptococcus, Treme/la, Holtermannia,
Leucosporidium y Mrakia, pero también se han encontrado los géneros de ascomicetes
Gandida y Williopsis. Los hongos filamentosos son más abundantes que las levaduras y
forman parte estructural de las biopelículas que en muchas zonas tapizan el lecho del río,
encontrándose
Heteroconium.
los
géneros
de
ascomicetes
Scytalidium,
Bahusakala, Phoma
y
Otro género importante es el ascomicete Penicillium (López-Archilla
2005).
También hay protistas heterótrofos en la función de consumidores primarios, entre los
cuales hay distintos tipos de flagelados, amebas, heliozoos y ciliados. Por otro lado, se han
podido observar algunos rotíferos activos cuya presencia indicaría la existencia de
consumidores secundarios que aumentarían la complejidad de la cadena trófica (LópezArchilla 2005).
TÉCNICAS APLICADAS AL ESTUDIO DE AMBIENTES EXTREMOS
A pesar de que los ambientes extremos presentan características inusuales que
inducirían a pensar que su estudio no es sencillo, las técnicas aplicadas no son muy
diferentes de las utilizadas generalmente en microbiología ambiental. Algunas de las más
usadas se describen a continuación.
Lámina de contacto
Esta técnica fue desarrollada durante la primera mitad del siglo XX para la observación
8
in situ de microorganismos. Consiste en colocar láminas de microscopio (portaobjetos) en
el sitio de estudio, con el fin de proveer una superficie artificial para el crecimíento
microbiano. Después, mediante microscopía, es posible obtener imágenes de las formas
microbianas que colonizaron la lámina (Atlas & Bartha 1998).
Cultivos
Esta técnica consiste en hacer crecer los microorganimos en el laboratorio, utilizando
medios de cultivo artificiales que intentan reproducir las condiciones físicas y químicas
propias de su ambiente natural (Kaeberlein et al. 2002).
Los métodos de cultivo
tradicionales no lograban reproducir las condiciones necesarias para el crecimiento de
muchos microorganismos, sin embargo, las nuevas condiciones de aislamiento tratan de
reflejar de una mejor manera los ambientes naturales en términos de nutrientes
(composición y concentración), concentración de oxígeno, pH y asociaciones naturales con
otros organismos. El cultivo in situ introduce medios estériles en ambientes naturales con
el fin de utilizar las condiciones locales para el enriquecimiento de una o varias especies.
Debido a que los organismos raramente viven en cultivos puros, el cocultivo es otra
estrategia para el aislamiento (Cardenas & Tiedje 2008).
A pesar de los avances anteriormente mencionados, la mayoría de las veces resulta
difícil e incluso imposible mimetizar las condiciones existentes en los hábitats de donde
provienen las muestras, en especial cuando se trata de ambientes extremos, lo que lleva a
una selectividad intrínseca de los medios y de las condiciones de incubación.
Los
microorganismos pueden ser recalcitrantes al cultivo debido a la carencia de simbiontes,
nutrientes o superficies necesarias, al exceso de compuestos inhibitorios en el medio, a
combinaciones incorrectas de temperatura, presión o composición de gases, a la
acumulación de productos de desecho tóxicos consecuencia de su propio metabolismo o a
un crecimiento lento intrínseco a la especie que se está intentando cultivar. Lo anterior
impone límites a la naturaleza, número y diversidad de microorganismos recuperados en el
cultivo, siendo un ejemplo el que muchos organismos hipertermófilos no puedan ser
cultivados en medios con agar porque sus requerimientos de temperatura exceden el punto
9
de fusión de este agente gelificante (Zengler et al. 2002, Handelsman 2004, Stevenson et al.
2004).
Estos hechos explican que se estime que del número de especies microbianas
observables en la naturaleza, más del 99% aún no han logrado ser cultivadas (Hugenholtz
et al. 1998a).
En un inicio se subestimaba la diversidad de las comunidades bacterianas ya que ésta
se calculaba con base en el número de especies que lograban ser cultivadas, sin embargo, el
advenimiento de las técnicas moleculares y su aplicación para medir diversidad reveló la
verdadera magnitud del número de especies microbianas (Torsvik et al. 2002, Handelsman
2004, Kowalchuk et al. 2007). Otra desventaja de las técnicas de cultivo es que éstas
también subestiman la capacidad de los organismos de influir en el funcionamiento global
de sus ecosistemas, ya que su comportamiento en cultivo no necesariamente refleja sus
actividades in situ (Handelsman 2004, Cubillos-Ruiz et al. 2010).
Técnicas moleculares
Las técnicas moleculares, también llamadas técnicas independientes de cultivo, son
otra herramienta poderosa para realizar estudios de comunidades microbianas. La mayoría
se basan en el aislamiento directo del ADN genómico de un ambiente, evitando la
necesidad de cultivar el o los organismos bajo estudio, a la vez, existe la posibilidad de
clonar el ADN aislado en otro organismo que sea fácilmente cultivable con el fin de tenerlo
disponible para su estudio y preservación. Estos métodos incluyen, entre otras, técnicas
como el corte del ADN con endonucleasas de restricción, la reacción en cadena de la
polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés), la clonación molecular, la
secuenciación de ADN, la hibridación ADN-ADN y ADN-ARN y la síntesis de
oligonucleótidos marcados con fluorescencia. Gracias a estas técnicas se logran identificar
los tipos de organismos presentes en comunidades microbianas sin las limitaciones
inherentes a los sistemas de cultivo (Hugenholtz et al. 1998a, Spring et al. 2000,
Handelsman 2004). Una ventaja más de estas técnicas es que permiten la detección y
evaluación de comunidades microbianas que poseen biomasas muy pequeñas (Takai et al.
2001). La mayoría de las principales técnicas moleculares utilizadas para el estudio de
10
microorganismos, incluyendo aquellos habitantes de ambientes extremos, son descritas a
continuación.
Extracción de ADN
En la mayoría de los casos, el primer paso para aplicar una técnica molecular es la
extracción del ADN de los microorganismos objeto de estudio. La extracción de ADN es
muy importante, pues el éxito de los pasos siguientes de amplificación y clonación
dependerá en gran parte de la cantidad y la representatividad del ADN obtenido al inicio del
proceso (Martin-Laurent et al. 2001). En el caso de muestras provenientes de ambientes
extremos, el proceso de extracción puede enfrentar problemas como pH bajo, pH elevado y
concentraciones altas de mentales pesados, entre otros.
Por esto se deben conocer los
principios básicos del proceso, los problemas que se pueden enfrentar y la forma de
resolverlos.
Durante la extracción de ADN, un pH bajo puede causar hidrólisis y pérdida de
solubilidad del ADN liberado después de la lisis de las células y una alta concentración de
hierro podría contaminarlo, teniendo un efecto negativo sobre la subsiguiente reacción de
amplificación por PCR.
Este problema se puede disminuir utilizando un buen
amortiguador de pH 8 con agentes quelantes para el hierro, como el EDTA, o lavando la
muestra con amortiguador de pH 7-8 antes de extraer el ADN, con el fin de elevar el pH y
disminuir la concentración de hierro (Bond et al. 2000).
Existen dos estrategias para la extracción de ADN a partir de suelos y sedimentos, y de
éstas se derivan todas las demás. La primera es la lisis de las células en presencia de las
partículas de suelo, conocida como lisis directa.
La segunda estrategia es la lisis y
extracción de células previamente separadas del suelo. El fraccionamiento para separar las
células resulta en una menor extracción de ácidos húmicos, se obtiene un ADN de alto peso
molecular, no se recobra ADN extracelular y los procariotas pueden ser separados
eficientemente de los eucariotas, sin embargo, esta técnica consume mucho tiempo y está
sesgada en contra de las células que se mantienen unidas fuertemente a las partículas. La
lisis directa tiene la ventaja de que el ADN es más representativo de la comunidad, se
11
recobra mayor cantidad de ácidos nucleicos y consume menos tiempo; pero tiene la
desventaja de que se extraen grandes cantidades de ácidos húmicos y que el ADN obtenido
puede contener ADN extracelular (Ogram 1998).
Como se mencionó anteriormente, algunos grupos de bacterias se unen más
fuertemente a las partículas que otros, lo cual puede sesgar la representación de la
comunidad microbiana en la muestra. La lisis directa in situ tiene el potencial de minimizar
este problema de representatividad, ya que las células de todos los grupos de
microorganismos pueden ser lisadas en igual proporción; sin embargo, enfrenta el
inconveniente de diferencias en las propiedades celulares y el grado en que los ·
componentes del suelo protegen a las células contra los tratamientos de lisis. Además, el
ADN liberado de los organismos lisados puede llegar a ser adsorbido por partículas,
llevando a una subestimación de la cantidad de ADN (Frostegard et al. 1999). El uso de un
amortiguador de fosfatos (0.12M, pH 8.0) puede disminuir la adsorción del ADN a
partículas de sílica, pues mantiene desprotonado al ADN para que se mantenga en solución
y, además, los iones fosfato compiten con los fosfatos del ADN por los sitios de unión a la
sílica (Ogram 1998).
Análisis de genes de ARNr 1651185
Mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es posible
amplificar a partir de ADN ambiental todas las variantes de un gen determinado, utilizando
para ello regiones con secuencias conservadas. Los diferentes productos de amplificación
son separados mediante clonación, de manera que se construye una biblioteca con las
diferentes variantes del gen y luego los clones son secuenciados. La frecuencia de un cierto
tipo de don puede ser tomada como una medida de la frecuencia del organismo respectivo
solo si se asume que todos los organismos tienen el mismo número de copias del gen, que
todos los diferentes genes son igualmente amplificables a pesar de las diferencias entre los
sitios de unión a los oligonucleótidos utilizados como imprimadores y que la clonación no
es selectiva (Amann & Ludwig 2000). Este enfoque es aplicado principalmente a los genes
a partir de los cuales se transcribe el ARNr 165 o 185 (conocidos también ADNr), cuyo
12
estudio ha posibilitado realizar análisis complejos de la biodiversidad microbiana
(Hugenholtz et al. 1998a, Spring et al. 2000, Case et al. 2007), gracias a las propiedades
filogenéticas de estos genes y a la rápidamente creciente base de datos de secuencias de
ADNr accesible vía intemet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/). Lo anterior hace
posible comparar secuencias de cualquier parte del mundo y supone una enorme ventaja
para los estudios de diversidad (DahllOf 2002).
Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE)
La electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización, conocida como DGGE por
sus siglas en inglés, es una técnica en la cual los productos de amplificación mediante PCR
de los genes ADNr son separados en geles de acrilamida que poseen un gradiente con
concentraciones crecientes de agentes desnaturalizantes.
La separación se basa en las
diferencias en las propiedades de fusión de los ADN de doble banda, que a su vez dependen
de las diferencias en sus secuencias. El resultado es la observación simultánea de muchas
moléculas individuales de ADNr 16S/18S en forma de un perfil de bandas, cada una de las
cuales puede ser reamplificada y secuenciada (Ferris et al. 1996).
Hibridación fluorescente in situ (FISH)
La hibridación fluorescente in situ, conocida como FISH por sus siglas en inglés, es
una técnica muy útil para identificar microorganismos en su hábitat. Para ello se utilizan
sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia, las cuales son puestas a hibridar
con la muestra de manera que se unan a las secuencias blanco de ADN o ARN en el interior
de las células. La señal puede ser detectada con un microscopio de fluorescencia y es
registrada de manera manual o, mejor aún, mediante la ayuda de un software de análisis de
imágenes. La selección de la sonda adecuada permite la identificación, que puede ser a
nivel de dominio, de reino o incluso de especie. Uno de los inconvenientes de esta técnica
es la autofluorescencia de algunos microorganismos, lo cual puede distorsionar la señal de
la sonda.
En principio esta técnica es la más acertada para determinar la abundancia
13
relativa y absoluta de las poblaciones, ya que no se ve afectada por la variación del número
de copias del gen blanco de la sonda, que bien puede ser el ADNr 165 en el caso de
procariotas (Burlage 1998, Lehtola et al. 2005, Kunin et al. 2008).
Metagenómica
El campo de la metagenómica representa un enfoque totalmente nuevo al estudio de las
comunidades microbianas. Se desarrolló a partir de avances realizados en la extracción de
ADN y el clonaje de muestras ambientales y se define como el análisis funcional y de
secuencia de los genomas microbianos colectivos contenidos en una muestra ambiental,
basándose ya sea en expresión génica o en secuenciación de ADN (Bonilla-Rosso et al.
2008, Steele et al. 2009). Para lo anterior se aisla el ADN de una muestra ambiental, se
clona en un vector adecuado, se transforman los clones en una bacteria hospedera y luego
se exploran en busca de marcadores filogenéticos o expresión de rasgos específicos (tales
como actividad enzimática o producción de antibióticos), o pueden ser secuenciados
aleatoriamente (Handelsman 2004, Bonilla-Rosso et al. 2008). Los términos genómica de
comunidades, genómica ambiental y genómica de poblaciones son sinónimos de
metagenómica (Handelsman 2004).
La metagenómica permite una exploración de los genes de la comunidad como un
todo, lo cual no excluye la posibilidad de complementar con métodos de aislamiento y
cultivo para evaluar las habilidades metabólicas y estudiar más detalladamente los genomas
de miembros individuales de la comunidad (Cardenas & Tiedje 2008). Este enfoque ha
probado ser una herramienta importante en el descubrimiento de nuevos productos
naturales y enzimas de interés biotecnológico para aplicaciones industriales y ecológicas
(Mirete et al. 2007, Schloss & Handelsman 2008, Schipper et al. 2009).
Al realizar el aislamiento del ADN para la construcción de bibliotecas metagenómicas
con insertos grandes se deben considerar tres aspectos principales. El primero es que el
ADN debe ser extraído del ámbito más amplio posible de microorganismos para que sea
representativo de la población microbiana original. En segundo lugar se debe evitar que el
ADN se fragmente durante el proceso de extracción, ya que para un análisis adecuado se
14
requiere de ADN de alto peso molecular, además, los fragmentos pequeños de ADN pueden
llevar a Ja formación de pro.duetos quiméricos. Por último, el ADN debe estar libre de
sustancias contaminantes que interfieran con los procesos posteriores como restricción y
ligación (Schmeisser et al. 2007).
Existen dos formas generales de exploración de las bibliotecas metagenómicas: la
basada en función y la basada en secuencia.
La primera es más usada para estudios
biotecnológicos y está limitada por el hecho de que los genes metagenómicos deben ser
expresados en un ambiente heterólogo, lo cual dificulta una fiel transcripción y traducción
del gen o genes de interés, así como la secreción del producto del gen, siendo esto último
necesario si la exploración requiere que la función se exprese extracelularmente.
Para
estudios metagenómicos se prefiere a E. coli como hospedero a pesar de no poseer los
requerimientos específicos para la expresión de muchos genes. Para ayudar a solventar el
problema se han desarrollado hospederos alternativos como Streptomyces lividans y
Pseudomonas putida, sin embargo, muchos genes, quizás la mayoría, no serán expresados
en cualquier hospedero particular seleccionado para la clonación, dando como resultado
que la frecuencia de clones metagenómicos que expresan una actividad dada sea muy baja.
Aún con sus limitaciones intrínsecas, este enfoque tiene la gran ventaja de que no requiere
que los genes de interés sean reconocidos mediante el análisis de secuencias de las
bibliotecas, haciendo de este método el único en metagenómica que tiene el potencial de
identificar clases nuevas de genes con funciones ya sea nuevas o conocidas (Handelsman
2004, Schmeisser et al. 2007).
El segundo enfoque de exploración se basa generalmente en un método llamado
"shotgun", el cual es muy utilizado para la construcción de bibliotecas metagenómicas y su
posterior secuenciación. En este método el ADN total es cortado en fragmentos que son
separados por tamaño (3kpb, 8kpb y 40kpb). Los fragmentos pequeños son insertados en
cromosomas bacterianos artificiales (BACs) y los fragmentos grandes son insertados en
fósmidos, los cuales luego son clonados en Escherichia coli con el fin de amplificarlos.
Después, los fragmentos son extraídos y purificados para ser secuenciados. Este método es
caro y lleva mucho tiempo construir y purificar las bibliotecas, y es posible que regiones
enteras no puedan ser clonadas por contener genes letales.
Sin embargo, se producen
15
fragmentos de 600-800pb de longitud con una precisión de 99.97% (Bonilla-Rosso et al.
2008). El shotgun es sensible a diferencias en las abundancias relativas de especies, por lo
que muchas veces la especie ecológicamente más importante no es la numéricamente más
abundante (dominante) en las blibliotecas, de manera que es posible que secciones
importantes de la comunidad sean pasadas por alto (Bonilla-Rosso et al. 2008, Kunin et al.
2008, Wommack et al. 2008). Por otro lado, al analizar la secuencia del metagenoma de
una comunidad microbiana se debe considerar que ésta representa el potencial funcional a
disposición de la comunidad y no la verdadera funcionalidad de la misma, dado que la
presencia de genes en un genoma no implica su trans€ripción ni su traducción, a la vez que
se debe tomar en cuenta que la presencia de un gen sí permite medir el potencial
taxonómico de la comunidad incluso en condiciones donde dicho gen no se encuentre en
uso (Bonilla-Rosso et al. 2008).
Como toda disciplina naciente, la metagenómica presenta nuevos retos y problemas a
resolver dentro del análisis ecológico de comunidades procarióticas.
El más obvio se
refiere a la ausencia de estandarización en las metodologías de obtención de datos,
causando una enorme heterogeneidad en la información contenida en los análisis
metagenómicos. Se usan diferentes protocolos de extracción de ADN que varían en sesgos
y eficiencia, se usan diferentes volúmenes de muestra, varía mucho el número de células
por muestra así como la cantidad de ADN total utilizada en la secuenciación, por lo que la
comparación confiable entre metagenomas es actualmente muy difícil. Este problema se
agrava debido a la falta de costumbre de emplear metodologías estadísticas para normalizar
las bases de datos y evitar problemas relacionados con la cobertura y redundancia de
secuencias. Todo lo anterior conduce a la subestimación de la similitud entre muestras,
composición de las comunidades y potencial funcional. Otro problema es que la capacidad
de secuenciación aumenta mucho más rápido que la capacidad de analizar los datos
producidos, de manera que hoy en día se tienen suficientes datos como para emplear los
próximos diez años en su análisis (Bonilla-Rosso et al. 2008).
16
Metaproteómica
Se conoce como metaproteómica al estudio a gran escala de las proteínas expresadas
por las comunidades microbianas. Este enfoque aprovecha técnicas como la electroforesis
en gel de dos dimensiones (2D), mediante la cual es posible separar proteínas individuales a
partir de mezclas complejas de extractos celulares, lo cual, acoplado a métodos altamente
eficientes de ionización de péptidos en espectrofotometría de masas, permite una
identificación proteica rápida y altamente sensible, teniendo esto varias aplicaciones, entre
ellas el análisis de respuestas bacterianas a variadas condiciones de crecimiento. Se espera
.
que la caracterización de metaproteomas, junto a la de metagenomas, brinde datos que
relacionen la diversidad funcional y genética de las comunidades microbianas (Maron et al.
2007).
Pirosecuenciación
La pirosecuenciación es una técnica de secuenciación basada en la detección del
piro fosfato (PPi) liberado durante la síntesis de ADN. Se inicia con la nebulización del
ADN para generar fragmentos de cadena sencilla de
adaptadores (oligonucleótidos de
~44pb)
~900pb,
a los que se les añaden
a partir de los cuales se sintetiza la cadena
complementaria. El pirofosfato liberado durante la reacción de la ADN polimerasa es
convertido por la ATP sulfurilasa en ATP, el cual provee la energía para que la luciferasa se
oxide a luciferina y genere luz de manera proporcional al número de nucleótidos
incorporados. La secuencia del ADN blanco puede ser determinada realizando cientos de
miles de estas reacciones en paralelo, ya que los nucleótidos añadidos son conocidos. El
método prescinde de la construcción de bibliotecas de clones, lo que a su vez reduce
drásticamente el precio y el tiempo de secuenciación, permitiendo la democratización de la
genómica y haciendo posibles investigaciones masivas en búsqueda de nuevos genes y
microorganismos. La pirosecuenciación también es muy valiosa para secuenciar regiones
técnicamente difíciles debido a fuertes estructuras secundarias o al alto contenido de GC y,
además, permite cubrir regiones de ADN que son recalcitrantes a la clonación en E. coli. A
17
pesar de sus ventajas, la pirosecuenciación tiene ciertas limitantes, siendo una de ellas que
la longitu,d de las secuencias producidas es muy pequeña (100-200pb) en comparación con
el método de secuenciación didesoxi o de Sanger, lo cual representa un enorme problema
cuando se intenta ensamblar las secuencias.
Otra limitante de este método es la
incapacidad de realizar una verificación de la función del ADN secuenciado debido a la
ausencia de clones (Acosta-Martínez et al. 2008, Bonilla-Rosso et al. 2008, Cardenas &
Tiedje 2008, Sleator et al. 2008, Wommack et al. 2008, MacLean et al. 2009).
M icroarreg los
Los microarreglos son una técnica de alto rendimiento para análisis simultáneo de
miles de moléculas blanco que cuenta con un gran potencial para la detección de
actividades y para monitorear la dinámica ambiental o metabólica de las comunidades
microbianas. Se basan en la hibridación con secuencias específicas de ADN de genes de
interés. Se pueden aplicar a genes filogenéticamente útiles, como los que codifican por
ARNr 16S (Garrido et al. 2008, Cubillos-Ruiz et al. 2010).
Los microarreglos se han utilizado vastamente para el análisis de la expresión de genes
y también están siendo utilizados para el análisis de muestras ambientales. Cuentan con la
ventaja de proporcionar, de manera rápida, información de un gran número de genes y
proporcionan datos de cuantificación sin tener que clonar el ADN (Cardenas & Tiedje 2008,
Cubillos-Ruiz et al. 2010).
La tecnología de microarreglos no ha sido tan utilizada para montajes ambientales
como sí lo ha sido para comparaciones genómicas o transcriptómicas de organismos únicos.
Esto se debe a las cantidades relativamente altas de ácidos nucleicos requeridos para
detectar una señal y a la complejidad relacionada con el diseño de sondas múltiples para
señalar y cubrir la diversidad no caracterizada. Es por esto que los arreglos diseñados para
la aplicación ambiental cuentan con sondas para la detección de familias de genes y
funciones bacterianas bien conocidas (Cubillos-Ruiz et al. 2010).
Debido a la dificultad para obtener grandes cantidades de ADN ambiental, estos
arreglos muchas veces requieren la amplificación de genes específicos por PCR antes de la
hibridación, lo cual puede introducir sesgos.
18
Una alternativa para evitar los sesgos
asociados con la amplificación por PCR sería extraer grandes cantidades de muestra o
amplificar el material genómico utilizando la ADN polimerasa phi29, enzima descubierta
hace aproximadamente 30 años y que posee la actividad de amplificación por
desplazamiento múltiple, lo que ha probado ser muy útil para obtener una mayor cantidad
de ADN microbiano a partir de cantidades muy pequeñas de ADN inicial (Garrido et al.
2008, Cubillos- Ruiz et al. 2010).
Otra de las limitantes de los microarreglos es que estos detectan los organismos y
moléculas presentes en mayor cantidad en el ecosistema estudiado y por esto existen
problemas asociados a baja sensibilidad. También existen dificultades relacionadas con la
recuperación de material genético debido a la baja cantidad de biomasa presente en la
muestra o a problemas con los procedimientos de extracción. Además, los resultados
pueden ser difíciles de interpretar debido a la gran cantidad de datos generados, que en
ocasiones pueden ser erróneos debido a señales generadas por hibridación cruzada con
secuencias relacionadas.
Finalmente, pero quizás lo más importante, es que los
microarreglos dependen de la información obtenida previamente para el diseño de las
sondas, lo cual se limita a lo conocido o a lo que pueda colocarse en un chip, y es por esto
que se pueden perder genes nuevos que se encontraban en la comunidad y que no están
representados en el arreglo. Por este motivo se dice que los microarreglos son más
apropiados para caracterizar ecosistemas que para descubrir nuevos genes y funciones
(Cardenas & Tiedje 2008, Cubillos-Ruiz et al. 2010).
Análisis de lfpidos
Las técnicas de análisis de lípidos, entre las que se incluye el análisis de ácidos grasos
derivados de fosfolípidos (PLFA por sus siglas en inglés), pueden proporcionar información
sobre toda una serie de características de las comunidades microbianas, como su biomasa,
fisiología, composición e identidad taxonómica y funcional. Por ejemplo, estas técnicas
son muy útiles para el estudio microbiológico de las aguas subterráneas, puesto que no
requieren cultivos y proporcionan datos cuantitativos de las comunidades completas.
19
Además, el análisis estadístico multivariado de los datos de lípidos permite relacionar
factores ambientales con los cambios espaciales o temporales en las comunidades
microbianas (Green & Scow 2000). Esto último se enmarca en el concepto de lipidómica,
que abarca no solo la caracterización completa de todos los lípidos en un tipo celular en
particular, sino también el entendimiento de la influencia de todos los lípidos de un sistema
biológico en referencia a las señales celulares, arquitectura de la membrana, modulación
transcripcional y traslacional, interacciones célula-célula y célula-proteína, y respuesta a los
cambios ambientales en el tiempo (Watson 2006).
Un punto importante a tomar en cuenta es que la acción combinada de los cambios
fisiológicos y filogenéticos en la composición de lípidos de una comunidad pueden
confundir la interpretación de los datos, por lo existen muchas cuestiones abiertas respecto
a la validez de algunas de estas técnicas (Green & Scow 2000).
EJEMPLOS DE ESTUDIOS REALIZADOS EN AMBIENTES EXTREMOS
Con el fin de ilustrar la diversidad microbiana de los ambientes extremos y la
aplicación de las diversas técnicas para su estudio, a continuación se da una muestra de la
gran cantidad de publicaciones existentes.
Marteisson y colaboradores (2001) estudiaron la diversidad de microorganismos
asociados con fluidos geotermales subterráneos en Islandia.
En su trabajo combinaron
varias técnicas, tales como FISH, amplificación, clonación y secuenciación de productos de
ADNr 16S, mediante las cuales detectaron la presencia de bacterias y arqueas en aguas con
temperaturas menores a lOOºC, muchas de las cuales correspondían a nuevas unidades
taxonómicas. Utilizando medios de enriquecimiento elaborados con las aguas geotermales
e incubados a 65ºC y 85ºC, lograron cultivar miembros del grupo Desulfurococcales.
En un estudio realizado en depósitos hipersalinos anóxicos del Mar Mediterráneo se
encontró diversidad de procariotas reductores de sulfato, metanógenos y con actividad
heterotrófica, entre ellos muchos de la rama Euryarchaeota. Esto se hizo utilizando las
20
técnicas de FI5H y la amplificación y construcción de bibliotecas de ADNr 165, entre otras
(van der Wielen et al. 2005).
Desde su descubrimiento en 1977, las fuentes hidrotermales submarinas han sido
reconocidas como uno de los principales hábitats para organismos termófilos (Takai &
Horikoshi 1999). Estas comunidades microbianas han sido muy estudiadas y en ellas se ha
encontrado diversidad de termófilos, tanto de Bacteria como de Archaea (Takai et al. 2001).
En Japón, las fumarolas submarinas han sido bien estudiadas en cuanto a diversidad
mediante análisis de ADNr 165 (Takai & Horikoshi 1999, Nakagawa et al. 2004) y técnicas
de cultivo, e incluso se han llegado a describir nuevas especies de bacterias oxidadoras de
azufre, tales como Sulfurimonas autotrophica (lnagaki et al. 2003).
A partir de fumarolas ubicadas en Islandia se cultivó una arquea hipertermófila
extremadamente pequeña, a la cual llamaron "Nanoarchaeum equitans". Esta no había sido
detectada anteriormente en otros estudios basados en la técnica de amplificación de ADNr
165. Al parecer se trata de algún tipo de parásito que solo puede ser cultivado en cocultivo
con otra arquea del género Ignicoccus (Huber et al. 2002).
En
el subsuelo marino también se han descrito comunidades halófilas e
hipertermófilas.
Un ejemplo es un estudio realizado en una fosa marina a 5719m de
profundidad en Filipinas (Inagaki et al. 2001), en el cual, a pesar de no lograr la obtención
de cultivos, se encontró una gran diversidad de arqueas mediante PCR de ADNr 165, las
cuales posiblemente son reliquias del pasado geotérmico del sitio.
Las fuentes termales superficiales son uno de los ambientes naturales más estudiados
en cuanto a organismos termófilos (Marteisson et al. 2001). Entre éstas el Parque Nacional
Yellowstone, en Estados Unidos, ha sido tal vez el ambiente que ha generado el mayor
número de publicaciones. En un artículo publicado en 1994 (Barns et al.) se realiza la
caracterización filogenética de arqueas de la fuente termal Obsidian Pool ("Jim's Black
Pool"), en Yellowstone. El estudio documentó la existencia de especies pertenecientes al
reino Crenarchaeota, no solo muchas ya conocidas, sino también otras desconocidas hasta
ese momento. Inesperadamente se obtuvo un gran número de secuencias, lo cual demostró
en aquel momento que el reino Crenarchaeota era mucho más diverso de lo que se pensaba.
En un estudio posterior
se caracterizó. la diversidad de bacterias en el mismo sitio,
21
encontrándose que la mayoría de las secuencias de ADNr 165 (70%) correspondían a
divisiones bacterianas previamente conocidas, mientras que las restantes (30%) no
coincidieron con ningún grupo conocido, lo que llevó a los autores a proponer 12 nuevas
divisiones.
Algunas secuencias fueron casi idénticas al ADNr 165 de termófilos
quimiolitotrofos previamente cultivados, como el oxidador de hidrógeno Calderobacterium
y los reductores de sulfato Thermodesulfovibrio y Thermodesulfobacterium. Un análisis de
hibridación con sondas específicas para cada dominio demostró que la comunidad
microbiana de la fuente termal Obsidian Pool está dominada por miembros del dominio
bacteria (Hugenholtz et al. 1998b).
En Yellowstone también se han realizado estudios sobre la bioenergética de los
ambientes extremos.
5pear y colaboradores (2005) estudiaron la diversidad de
comunidades microbianas con temperaturas mayores a 70ºC en diferentes fuentes termales.
Los estudios moleculares, basados en la abundancia de genes de ARNr 165, mostraron la
predominancia de organismos que obtienen su energía a partir de la oxidación de H2,
principalmente del grupo bacteriano Aquificales, tales como Hydrogenobacter sp. Esta
aparente dominancia de microorganismos metabolizadores de hidrógeno, sumada a los
análisis químicos realizados en las diferentes fuentes, permitieron diseñar un modelo que
explica como el H2 es la principal fuente de energía primaria de los ecosistemas que
presentan altas temperaturas en Yellowstone.
Los ambientes extremos ácidos también han sido objeto de estudios sobre diversidad
microbiana.
Por ejemplo, Bond y su equipo (2000) estudiaron la filogenia de
microorganismos en biopelículas encontradas en drenajes ácidos de túneles en una mina de
pirita.
El pH del agua asociada con la biopelícula estaba entre 0.8 y 1.2, tenía
concentraciones elevadas de iones metálicos y las temperaturas oscilaban entre 31 y 37ºC.
Luego de secuenciar y establecer relaciones filogenéticas mediante ADNr 165,
determinaron que los organismos predominantes eran acidófilos pertenecientes al dominio
Bacteria, muchos de los cuales aun no tienen representantes cultivables; además,
encontraron algunas secuencias de Archaea.
En un estudio realizado por Walker et al. (2005) se informa sobre una comunidad
endolítica ácida en la depresión del
géis~·
Norris, en Yellowstone. En este lugar las rocas de
22
sílica tienen una temperatura de 35ºC, debido a la actividad geotermal del sitio, y presentan
una banda interna de color verde de 1 a 15mm de ancho, a una profundidad entre 2 y lOmm
a partir de la superficie. El agua extraída de los poros de la roca tiene un pH de 1 y
contiene altas concentraciones de ácido sulfúrico, metales y silicatos (Sol- 1343ppm, Al
8893ppm, Mn 983ppm, Cu 551ppm, As 1038ppm, Fe 102ppm y Si02 166ppm). Se aisló el
ADN total de la comunidad fotosintética a partir de las muestras de roca y se utilizó para
amplificar mediante PCR los genes ADNr 16S y 18S, usando oligonucleótidos universales
para los tres dominios de la vida. Los productos obtenidos fueron clonados y segregados en
bibliotecas. En total se analizaron 864 clones, de los cuales se secuenciaron 342. El 26%
.
de los clones correspondió a ADNr 16S del cloroplasto de Cyanidium caldarium, lo que
indica que este podría ser el productor primario de la comunidad. El grupo más abundante
de clones (37%) correspondió a bacterias del género Mycobacterium.
De los clones
restantes, 37% fueron secuencias pertenecientes al dominio Bacteria y solo 5% fueron
representantes del dominio Archaea. A pesar de la diversidad encontrada, al hacer cultivos
de enriquecimiento solo se obtuvo el crecimiento de Cyanidium sp. Al observar muestras
frescas al microscopio de luz se vieron células de Cyanidium sp., mientras que la
observación en el microscopio electrónico de barrido reveló células tanto esféricas como
filamentosas que marcaban con su forma un complejo tejido de moldes en la sílica.
En Costa Rica también hay ejemplos de ambientes extremos ácidos similares al
descrito en el párrafo anterior, específicamente en el Parque Nacional Volcán Rincón de la
Vieja.
AMBIENTES EXREMOS ÁCIDOS DEL PARQUE NACIONAL VOLCÁN RINCÓN DE
LA VIEJA
El Parque Nacional Volcán Rincón de La Vieja fue establecido por la ley Nº 5398 del
23 de octubre de 1973.
Tiene una extensión de aproximadamente 14 OOOHa y está
localizado en la Cordillera Volcánica de Guanacaste, al noreste de la ciudad de Liberia
(http://www.guiascostarica.com/area13.htm).
23
El volcán que le da el nombre a este parque posee en su vertiente pacífica cuatro
sectores que representan las manifestaciones hidrotermales más significativas descritas en
Costa Rica: Borinquen, Hornillas, Las Pailas y Santa María (Molina 2000).
Estas
manifestaciones se encuentran alineadas en dirección NO-SE, en forma paralela al sistema
de fallamiento regional (Alvarado 2000).
El campo geotermal Las Pailas muestra la mayor actividad hidroterma1, tiene un área
de aproximadamente 0.4km2 y está localizado a una altitud de 700 a 800msnm. Las
manifestaciones incluyen fumarolas, fuentes termales, pozos de barro hirviente, lagunas
solfatáricas, pequeños conos de barro con vapor y chorros de vapor. Las rocas están
constituidas principalmente por arcillas (esmectita y kaolinita) y en algunos lugares existen
depósitos de óxidos de hierro y de azufre (Molina 2000). Las aguas que emanan de estos
sitios son ácidas (pH 1.85) y en muchos lugares alcanzan temperaturas de ebullición,
además, presentan altas concentraciones de iones. El bajo pH se debe al escape de SO 2 y
H2S provenientes de aguas subterráneas, lo que da como resultado aguas sulfatadas ácidas
que afloran a la superficie (Kempter 1997).
Estas características son suficientes para
clasificar a Las Pailas como un ambiente extremo en lo que respecta a acidez, temperatura y
concentración iónica, que además destaca por la presencia de microorganismos que son
capaces de vivir en estas condiciones (Romeu 2001), como por ejemplo Euglena
pailasensis, una especie de euglena sin flagelo que fue aislada de uno los pozos de barro
(Sittenfeld et al. 2002, Sittenfeld et al. 2004). En el sector Santa María se ubica un sitio,
llamado Pailas Frías, que contrasta con Las Pailas porque consiste en pozos de barro
burbujeante y nacientes de agua de los que emanan gases y aguas ácidas (pH 1.8) con altas
concentraciones de iones, pero que no presentan actividad termal, pues sus temperaturas de
alrededor de 19ºC son incluso menores que la temperatura ambiente (observaciones
realizadas durante el desarrollo de esta tesis). Ambos sectores, Las Pailas y Santa María, se
encuentran dentro de los límites del parque nacional (Fig. 1).
El hecho de que en Costa Rica existan ambientes de este tipo es un aliciente para
realizar estudios que describan la biodiversidad de extremófilos, su ecología y
bioprospección.
24
N
A
lOkm
PARQU NACIONAL
VOLCÁN RI ÓN DE LA VIEJA
Colonia Blanca
10U4ff N
Fig. l. Ubicación geográfica del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja y de los sectores Las Pailas y
Santa María. El inserto muestra la localización del área dentro de Costa Rica.
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31
Justificación
La diversidad en ecosistemas extremos tiene relevancia tanto en ciencia básica como
aplicada, ya que las características relativamente poco comunes de los microorganismos
que los habitan pueden ser el foco de estudios evolutivos, moleculares y ecológicos.
Además, mediante estudios de bioprospección se puede llegar al descubrimiento de nuevas
moléculas y sistemas que tengan la capacidad de aplicarse biotecnológicamente.
El
conocimiento de la biodiversidad también es el primer paso para el establecimiento de
estrategias de conservación.
En Costa Rica la biodiversidad está siendo ampliamente estudiada, y el número de
nuevas especies descritas está en aumento, sin embargo, hasta hace poco aún no se había
prestado mucha atención a los microorganismos presentes en ambientes extremos. En el
Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja ya se ha iniciado el estudio de estos
microorganismos, descubriéndose una nueva especie de euglenoide, Euglena pailasensis, la
cual tiene la capacidad de crecer a un pH muy bajo y de tolerar temperaturas elevadas
(Sittenfeld et al. 2002, Sittenfeld et al. 2004). Además, se ha descrito una comunidad
endolítica habitante de un ambiente ácido y dominada por diatomeas y algas cyanidales
(Hemández-Chavarría &
Sittenfeld 2006).
Es posible que aún queden muchos
microorganismos por describir, por lo que el presente estudio es un aporte importante al
conocimiento de la biodiversidad microbiana de ambientes extremos de nuestro país.
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32
Objetivos
GENERAL
Caracterizar la biodiversidad microbiana de dos ecosistemas ubicados en ambientes
extremos ácidos del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, mediante microscopía y
técnicas moleculares.
ESPECÍFICOS
l.
Seleccionar dos comunidades microbianas de ecosistemas extremos ácidos del Parque
Nacional Volcán Rincón de la Vieja.
2.
Describir mediante microscopía de luz y electrónica los microorganismos habitantes de
las dos comunidades microbianas seleccionadas.
3.
Extraer el ADN genómico total de las dos comunidades microbianas seleccionadas.
4.
Amplificar mediante PCR los genes ADNr 16S de las comunidades microbianas,
utilizando imprimadores generales para los dominios Bacteria y Archaea.
5.
Clonar los productos de amplificación obtenidos con el fin de construir bibliotecas de
ADNr 16S.
6.
Agrupar mediante polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP) los clones contenidos en las bibliotecas de ADNr 16S y secuenciar un representante
de cada grupo.
7.
Construir árboles filogenéticos utilizando las secuencias obtenidas y con ayuda de
éstos describir los principales grupos microbianos presentes en las dos comunidades
estudiadas.
33
Primera descripción de una comunidad microbiana habitante de un
ambiente extremo ácido del campo geotermal Las Pailas, Parque
Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Costa Rica
Walter Hernández-Ascencio1 , Ana Sittenfeld AppeF, Francisco Hernández-Chavarría2 ,
Lorena Uribe Lorío 1 & Marielos Mora López 1
l.
Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica, San José, Costa
Rica; [email protected]
2.
Centro de Investigación en Estructuras Microscópicas, Universidad de Costa Rica, San José, Costa
Rica; [email protected]
Abstract: First description of a microbial community inhabiting an extreme acidic environment at Las
Pailas geothermal field, Rincon de la Vieja Volcano National Park, Costa Rica.
Extremophilic
microorganisms are those that thrive in environments with extremes of temperature, salinity, pH or
concentration of heavy metals, among others. They are interesting for their unique ecology and physiology
and their potential biotechnological applications. Tropical regions are hot spots of extremophile microbial
diversity, however, they are highly unreported in the scientific literature. In Costa Rica, for example, there are
only a few reports about studies conducted in acidic environments associated with Poas and Rincon de la
Vieja volcanoes. This paper describes the composition of a microbial community inhabiting the edge of an
acidic hot mud pool that belongs to a set of acidic hydrothermal manifestations, known as Las Pailas
geothermal field, located in the Rincon de la Vieja Volcano National Park. The aim is to increase the
knowledge about diversity of Costa Rican and tropical extremophilic microorganisms.
The microbial
community was evident as a green film on the surface of a mud accumulation with a pH of 2.5, high
concentrations of sulfate and metal ions and exposed to hot vapors from the mud pool. The microorganisms
were observed by light microscopy, transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. 16S
rDNA librarles were constructed for chloroplast, Bacteria and Archaea. They were grouped according to
restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) and a representative of each cluster was sequenced.
Sequences were aligned to built phylogenetic trees that showed several of the microbial groups present in the
sample. Microscopic observations revealed that the community was dominated by Cyanidiales algae and that
pennate diatoms and prokaryotes also were present. 16S rDNA sequences were associated mostly with
environmental clones from sites with conditions of acidity or temperature similar to Las Pailas. Chloroplast
sequences showed that Cyanidales algae belong to the Cyanidíoschyzon merolae - Galdiería maxima lineage.
Sequences from Bacteria domain indicated the presence of the groups Firmicutes, Bacteroidetes, TM7 and y-
34
Proteobacteria, including within the latter the genus Acidithiobacillus. Archaea domain sequences belonged
to the groups Thennoplasmatales, ARMAN-2- nanoarcheons and organisms related with methanogens. These
results suggest the existence of complex ecological relationships between organisms with different
physiologies and morphologies inhabiting an environment with at least three extreme parameters: pH,
temperature and concentration of chemicals.
Key words: acidic hot mud pool, acidophiles, cyanidiales, diatoms, geothermal field, Las Pailas, microbial
community, Rincon de la Vieja Volcano National Park.
Los organismos extremófilos son aquellos que prosperan en ambientes con extremos
en parámetros físicos como temperatura, radiación o presión, o parámetros geoquímicos
como desecación, salinidad, pH, potencial redox o concentración de metales pesados
(Rothschild & Mancinelli 2001).
Los ambientes con tales condiciones resultan ser
inhóspitos para los seres humanos y para la mayoría de especies animales y vegetales, sin
embargo, son hábitat para una infinidad de especies microbianas en la mayoría de los casos
desconocidas debido a la dificultad de cultivarlas (Courtois et al. 2003).
Entre los
ambientes extremos en los cuales se han descrito comunidades microbianas se pueden
mencionar capas de hielo árticas (Bottos et al. 2008), fuentes termales (Nakagawa & Fukui
2003, Meyer-Dombard et al. 2005), fumarolas submarinas (Takai & Horikoshi 1999,
Nakagawa et al. 2004), depósitos hipersalinos anóxicos del Mar Mediterráneo (van der
Wielen et al. 2005) y drenajes ácidos de mina (Bond et al. 2000, Hao et al. 2007).
Los extremófilos son conocidos en todos los campos biomédicos por ser fuente de una
de las enzimas más novedosas del último siglo: la ADN polimerasa termoestable de la
bacteria Thermus aquaticus, mejor conocida como Taq ADN polimerasa. La utilización de
esta enzima como reactivo de la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR por sus siglas
en inglés, ha tenido un impacto significativo en las ciencias de la vida, en las técnicas de
diagnóstico y en las aplicaciones forenses (Rossi et al. 2003). Es justo la estabilidad y
actividad en condiciones extremas lo que hace a las enzimas extremófilas alternativas útiles
a las enzimas de los microorganismos mesófilos, pues se mantienen catalíticamente activas
bajo extremos de temperatura, salinidad y pH, pueden dar pistas sobre los mecanismos de
resistencia molecular a estas condiciones y son vistas como una respuesta potencial al
35
conflicto entre las condiciones industriales y la fragilidad de los componentes biológicos
(Cardoso et al. 2011).
Las regiones tropicales son sitios importantes de diversidad de microorganismos
extremófilos, sin embargo, este hecho está poco reportado en la literatura científica
(Cardoso et al. 2011); por ejemplo, Costa Rica se caracteriza por poseer en su pequeño
territorio aproximadamente 5% de la diversidad de especies conocidas en el mundo, pero
este valor está basado casi exclusivamente en especies animales, vegetales, algas y hongos
(Obando 2002), dejando al margen las especies microbianas, en especial aquellas habitantes
de ambientes extremos. Los pocos reportes de estudios realizados en ambientes extremos
de Costa Rica se refieren a ambientes ácidos asociados a dos volcanes activos: el Poás y el
Rincón de la Vieja. En el primero, se reportó la presencia de microorganismos acidófilos
en el lago (pH 1, 30ºC) y en las fuentes termales (pH 2.2-2.5, 42.4-46.3ºC) del cráter
(Sugimori et al. 2002), así como en el Río Agrio, un torrente ácido (pH 2.3) que nace en sus
faldas (Pringle et al. 1993, Wydrzycka & Lange-Bertalot 2001).
En el segundo, se
describieron los principales grupos bacterianos de dos pozos de barro (pH 4-5.15, 94.197. 7ºC) (Wheeler 2006), se reportó la existencia de una comunidad endolítica fotosintética
en una zona de fuentes ácidas (pH 1-2) del sector Santa María (Hemández-Chavarría &
Sittenfeld 2006) y se describió una especie de euglena encontrada en un pozo de barro
caliente (pH 2-4, 35-40ºC) del campo geotermal Las Pailas y para la cual se propuso el
nombre de Euglena pailasensis (Sittenfeld et al. 2002, Sánchez et al. 2004), todo esto
dentro de los limites del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja. Ninguno de estos
estudios realizó una descripción amplia que incluyera miembros de los tres dominios de la
vida: Bacteria, Archaea y Eukarya, por lo que se tiene un conocimiento muy limitado de la
composición de las comunidades microbianas habitantes de ambientes extremos ácidos de
Costa Rica.
El campo geotermal Las Pailas, ubicado en la vertiente pacífica del volcán Rincón de
la Vieja, es uno de los conjuntos de manifestaciones hidrotermales más significativo de
Costa Rica. Estas manifestaciones incluyen fuentes termales, pozos de barro hirviente,
lagunas solfatáricas, pequeños conos de barro con vapor, fumarolas y chorros de vapor. Las
aguas que afloran de estos sitios son ácidas (pH 1.85) debido al escape de S0 2 y H 2 S,
36
además, presentan altas concentraciones de iones y en muchos lugares alcanzan
temperaturas
de · ebullición
(Kempter
1997).
Los
microorganismos
que
son
metabólicamente activos en ambientes ácidos como éste han atraído interés por su ecología
y fisiología únicas (Hamamura et al. 2005), por sus aplicaciones potenciales en biominería
y biorremediación (Bini 2010) y porque sus enzimas podrían ser útiles en procesos
industrias tales como la generación de maltosa y glucosa a partir de almidón, proceso que
es llevado a cabo a un pH de 4.2-4.5 y a una temperatura de 60ºC (Tumer et al. 2007).
El estudio presentado a continuación describe la composición de una comunidad
microbiana habitante del borde de un pozo de lodo ácido y caliente del campo geotermal
.
Las Pailas, utilizando para ello una combinación de técnicas moleculares y microscópicas.
Lo anterior pretende contribuir a aumentar el conocimiento de la diversidad de
microorganismos extremófilos de Costa Rica y del trópico en general, y además, constituye
un paso exploratorio previo a la búsqueda de microorganismos con posibles aplicaciones
biotecnológicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitio de estudio y recolección de muestras: Se tomaron muestras de barro cubierto
por una película de color verde ubicado en el borde oriental de un pozo de lodo con forma
de reloj de arena (Fig. 2A) que poseía las siguientes dimensiones aproximadas: largo
150cm, ancho 90 cm y profundidad 35cm, y cuyas coordenadas son 10º46'18.8" N y
85º20'37.0" W (762m de altitud), esto dentro del grupo de manifestaciones geotermales
conocido como Pailas de Agua localizado en el sector Las Pailas del Parque Nacional
Volcán Rincón de la Vieja (Fig. 1).
En marzo de 2005 se recolectó la primera muestra que fue trasladada al laboratorio sin
ningún tratamiento.
En agosto del mismo año se tomó una segunda muestra que se
fraccionó en tres partes: una de ellas se congeló en nitrógeno líquido para su transporte y
fue guardada a -70ºC en el laboratorio, otra se fijó en una solución de glutaraldehído al
2.5% en amortiguador de fosfatos O.lM (pH 7) y la tercera se transportó al laboratorio sin
ningún tratamiento. Además, en esta ocasión se midió el pH del fluido que emanaba del
37
Hacía estación de
guarclaparques
N
A
Lagun~_Fumarólica
,
--
"· º;
Pailas de Agua
75m
..
Pailas de Barro
Fig. l. Ubicación de Pailas de Agua dentro del sector Las Pailas del Parque Nacional Volcán Rincón de la
Vieja.
La equis (x) indica el lugar aproximado de muestreo, las líneas punteadas delimitan zonas de
manifestaciones geotermales y las líneas continuas representan los senderos del parque. El mapa inserto
indica la localización del área (rectángulo negro) dentro de Costa Rica.
Fig. l. Location of Pailas de Agua inside Las Pailas sector of Rincon de la Vieja Volcano National Park. The
cross (x) indicates sampling place, doted lines delimitate geothermal manifestation zones and continuous lines
represent trails. Inserted map indicates location of the area (black rentangle) in Costa Rica.
38
pozo de lodo utilizando cintas ColorpHast pH 0-2.5 (EM-Reagents), así como su
°temperatura y la temperatura superficial de la película verde sobre el barro, para lo cual se
utilizó un termómetro de mercurio.
Algunos parámetros fisico-químicos de los fluidos de Pailas de Agua se determinaron
en laboratorios del Instituto Costarricense de Electricidad (ICE) a partir de dos muestras
procedentes de pozos cercanos al estudiado en este trabajo, las cuales fueron tomadas en
agosto de 2004. Se utilizó un cromatógrafo líquido HP 1100 para el análisis de aniones y
un espectrómetro de absorción atómica Thermo Elemental SOLAAR para el análisis de
cationes.
Medición del pH: Se tomaron lOg del barro cubierto por la película verde y se
mezclaron con 25ml de agua destilada. Se agitó durante 20min, se dejó en reposo por un
minuto y se midió el pH del sobrenadante (Henríquez & Cabalceta 1999) con cintas
ColorpHast pH 0-2.5 (EM-Reagents).
Microscopía: A la fracción recolectada en agosto que no recibió ningún tratamiento se
le realizó un fino raspado de la película verde que la cubría, el cual se suspendió en agua
destilada estéril y se observó en un microscopio de luz BX41 (Olympus). Además, se
cortaron trozos de aproximadamente 3mm de lado de la película verde, se incluyeron en
agar al 3% y se fijaron en glutaraldehído al 2.5%. Posteriormente se aplicó el siguiente
proceso: lavado en amortiguador de fosfatos 0.lM (pH 7.4), postfijación con OsQ4 al 1%,
lavado en agua destilada, deshidratación en serie con gradiente ascendente de etanol, serie
con gradiente ascendente de óxido de propileno, serie con gradiente ascendente de resina
Spurr's y polimerización a 70ºC.
Se cortaron secciones de 0.5µm y 90nm con un
ultramicrotomo Reichert Ultracut S (Leica). Las primeras se tiñeron con azul de toluidina y
se observaron en un microscopio de luz BX41 (Olympus), mientras que las segundas se
contrastaron con acetato de uranilo y plomo y se observaron en un microscopio electrónico
de transmisión 7100 (Hitachi) a un voltaje de lOOkV (Bozzola & Russel 1992).
Una gota de la fracción fijada en glutaraldehído se colocó sobre un trozo de vidrio
tratado con poli-L-lisina (hidrobromuro, PM>200 000) y se incubó en cámara húmeda
39
durante 2.Shr. Posteriormente se aplicó el siguiente proceso: lavado en amortiguador de
fosfatos O.lM (pH 7), postfijación con Os04 al 1%, lavado en agua destilada y
deshidratación en serie con gradiente ascendente de etanol. Los pasos de lavado en agua y
deshidratación se realizaron en un horno de microondas Daytron 2 450MHz 700W a una
potencia de 126.5 (Hemández-Chavarría 2004).
Luego se realizó un lavado con ter-
butanol, se congeló y se secó a 4ºC en un sublimador ID-2 (Eiko). La muestra seca fue
recubierta con aproximadamente 30nm de oro en un cobertor iónico IB-3 (Eiko). Las
observaciones se realizaron en un microscopio electrónico de barrido S-570 (Hitachi) a
15kV, con un ángulo de inclinación de 45 grados y una distancia de trabajo máxima de
12mm.
Extracción y purificación de ADN: Se obtuvieron aproximadamente 70mg de la
película verde que cubría la muestra, raspándola cuidadosamente y tratando de arrastrar la
menor cantidad posible de barro.
El material obtenido se suspendió en 0.5ml de
amortiguador (0.12M fosfatos pH 8, O.lM Tris, O.lM EDTA y 0.lM Nad), se agregaron
50µ1 de solución de lisozima 50mg/ml y se incubó 30min a 37ºC.
Posteriormente se
añadieron 50µ1 de SDS al 20% y 10µ1 de proteinasa K 20mg/ml, se incubó 30min a 55ºC
agitando ocasionalmente.
Siguieron tres ciclos de incubación de lOmin en nitrógeno
liquido y lOmin a 85ºC. Después se añadieron 150mg de perlas de vidrio (106µm) y 250µ1
de cloroformo-isoamilo (24:1) y se realizaron diez ciclos de lmin de agitación y lmin de
reposo en hielo. Se centrifugó y al sobrenadante se le realizaron dos extracciones: primero
con fenol-cloroformo-isoamilo (25:24:1) y luego con cloroformo-isoamilo (24:1). El ADN
se precipitó con dos volúmenes de etanol al 95%, se lavó con etanol al 70%, se secó y se
disolvió en agua destilada estéril (Bams et al. 1994, Millar et al. 1999). La solución
obtenida se purificó utilizando el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), siguiendo las
instrucciones del fabricante, excepto que no se realizaron los pasos de purificación desde
gel. Con el ADN extraído a la muestra recolectada en marzo de 2005 se construyó una
biblioteca de ADNr 16S de Archaea, mientras que con el ADN obtenido a partir de la
fracción de agosto congelada a -70ºC se construyó una biblioteca ADNr 16S de Bacteria.
40
PCR y construcción de bibliotecas: Segmentos de los genes ADNr 16S fueron
amplificados utilizando los oligonucleótidos Ar109f (5'-ACKGCTCAGTAACACGT-3') y
Ar912r (5'-CTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3') para Archaea (GroBkopf et al. 1998,
modificados por Lueders
&
Friedrich 2000) y los
oligonucleótidos
27F
(5'-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') y 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') (Lane
1991) para Bacteria. La mezcla de reacción fue de 50µ1 con la siguiente composición:
amortiguador libre de magnesio para ADN polimerasa termofílica (Magnesium Free
Thermophilic DNA Polymerase Buffer de Promega) lX, 1.25mM de MgCb (Promega),
200µM de cada dNTP (Promega), 0.4µM de_ cada oligonucleótido, lU de Taq ADN
polimerasa en amortiguador de almacenamiento B (Taq DNA Polymerase in Storage Buffer
B de Promega), 4µg/ml de BSA (Promega) y 2µ1 de solución de ADN blanco.
Las
reacciones se incubaron en un termociclador PT-100 (MJ Research, Inc.) iniciando con
4min a 94ºC, seguido por 35 ciclos de 30s a 94ºC, 30s a 50ºC y 90s a 72ºC, y un paso final
de lOmin a 72ºC. El ADN amplificado se purificó utilizando el kit Wizard® PCR Preps
DNA Purification System de Promega. Los productos del PCR de Archaea fueron ligados
en el vector utilizando el kit InsTAclone™ PCR Cloning Kit de Fermentas, con una razón
inserto:vector de 2:1 y de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para la ligación de los
productos de PCR de Bacteria se utilizó el kit pGEM®-T Vector System de Promega,
siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la transformación en E. coli DH5a y el
aislamiento de los plásmidos recombinantes se siguieron los procedimientos descritos por
Sambrook et al. (1989).
Análisis de los clones mediante RFLP: Los genes clonados fueron reamplificados a
partir de los plásmidos recombinantes utilizando los oligonucleótidos y el procedimiento ya
descritos. Los ADNr de Archaea fueron digeridos con las enzimas Alul y CfoI (Promega)
en volúmenes de 20µ1 con la siguiente composición: 10µ1 de producto de PCR sin purificar,
amortiguador One-phor-all lX (Farmacia) y lOU de cada enzima. Los ADNr de Bacteria
fueron digeridos mediante dos digestiones dobles combinando Alul con BsuRI y Mspl con
Hin61 (Fermentas), en reacciones de 20µ1 con lOU de cada enzima, amortiguador Tango™
2X (Fermentas) y 10µ1 de producto de PCR sin purificar. Las reacciones se incubaron una
41
hora a 37ºC. Los fragmentos digeridos fueron separados mediante electroforesis en gel de
agarosa al 2% y visualizados mediante tinción con bromuro de etidio y luz ultravioleta.
Los patrones de restricción observados en cada biblioteca fueron comparados visualmente
entre sí y se agruparon en ribotipos considerando patrones de restricción idénticos.
Posteriormente un representante de cada grupo fue seleccionado al azar para su
secuenciación.
Secuenciación: Los productos de PCR seleccionados para secuenciar fueron
purificados con el kit Wizard® PCR Preps DNA Purification System de Promega, de
acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Las reacciones de extensión estuvieron
compuestas por lOOng de ADN, 8µ1 de la mezcla de reacción Big Dye® Terminator v3.1
Cycle Sequencing Ready Reaction Mix de Applied Biosystems, 2µ1 de solución 1.6µM del
oligonucleótido y agua hasta completar un volumen de 20µ1. Para la biblioteca de Archaea
se utilizaron los oligonucleótidos Ar109f y Ar912r, mientras que para la de Bacteria se
utilizaron los oligonucléotidos 27F, 1492R y 907R (S'-CCGTCAATICCTITRAGTIT-3')
(Lane 1991). Las secuencias de nucleótidos fueron leídas en un equipo ABI PRISM 377
(Applied Biosystems).
Análisis de las secuencias: Las secuencias fueron ensambladas, revisadas y corregidas
en el programa BioEdit Sequence Alignment Editor v7.0.S.2 (Hall 1999) y luego
comparadas con las bases de datos disponibles con el fin de estimar su afiliación
filogenética, para lo cual se utilizó la herramienta Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul et al. 1997).
quiméricas
se
detectaron
mediante
el
programa
(http://rdp.cme.msu.edu/cgis/chimera.cgi?su=SSU)
Ribosomales (Cole et al. 2003).
del
Las secuencias
CHIMERA_CHECK
Proyecto
Base
de
v2.7
Datos
Las secuencias de Las Pailas y algunas secuencias
relacionadas según el análisis BLAST se alinearon utilizando el programa CL USTAL X
vl.83 (Thompson et al. 1997).
Haciendo uso del paquete informático PHYLIP v3.66
(Felsenstein 1989) se construyeron filogramas a partir de los alineamientos, asumiendo una
tasa transición/transversión de 2.0 y utilizando dos métodos: el de unión de vecinos
42
(neighbor-joining) (Saitou & Nei 1987) aplicando el modelo de dos parámetros de Kimura
(Kimura 1980) y el de probabilidad máxima (maximum likelihood). La confiabilidad de las
topologías inferidas fue determinada a partir de 1 000 seudoréplicas de cada alineamiento.
Números de adquisición de la secuencias: Las secuencias parciales de ADNr 16S
obtenidas en este estudio están disponibles en la base de datos de GeneBank mediante los
números de adquisición GQ141744 a GQ141766.
RESULTADOS
Características de la muestra: Algunas características físico-químicas de los fluidos
de Pailas de Agua, según el promedio de dos muestras tomadas en agosto de 2004 en
lugares cercanos al sitio de este estudio, fueron las siguientes: temperatura 96ºC, pH 2.2,
conductividad 3735µS/cm, Na+ 10.4ppm, K+ 3.3ppm, Ca 2+ 24.2ppm, Mg 2+ 19.7ppm, Al
total 45.4ppm, Fe total 127.5ppm, c1- 6.5ppm,
Soi- 1042ppm
y Si02 256.5ppm.
Al
momento de tomar la muestra en agosto de 2005 la temperatura del fluido que emanaba del
pozo de lodo muestreado fue de 72ºC, mientras que su pH fue de 2.
Las muestras
recolectadas en marzo y agosto de 2005 estaban constituidas por trozos del barro
acumulado en el borde del pozo de lodo, sobre el cual se podía observar una película de
color verde (Fig. 2A) que estaba expuesta a los vapores calientes que emanaban del pozo y
a radiación solar directa. La temperatura medida sobre la película verde al momento de
colectar la muestra fue de 52ºC y la acidez del barro medida en el laboratorio fue de 2.5
unidades de pH.
Microscopía: La película verde adherida a la superficie del barro del borde del pozo
(Fig. 2A y 2B) consistía en un tapete microbiano de aproximadamente 30µm de espesor
dominado por células esféricas de color verde (Fig. 2D y 2E), las cuales tenían diámetros
entre 1.5µm y 3µm, con un promedio de 2.3µm (SD=0.3µm, n=50). Las observaciones
microscópicas también revelaron la presencia de agrupaciones de células procariotas
43
inmersas en el tapete (flecha en Fig. 2E) y de diatomeas pennadas con dos cloroplastos
discoidales (Fig. 2C).
Las imágenes de microscopio electrónico mostraron que las células esféricas eran
eucariotas con un solo cloroplasto que ocupaba la mayor parte del volumen celular (Fig.
2K). Además, revelaron células procariotas con morfología bacilar (Fig. 2G a 2K), algunas
de las cuales mostraban signos de división celular (Fig. 21) y de arreglos membranosos
internos (flecha en Fig. 21), y en una de ellas se visualizaron dos estructuras con aparente
simetría icosaédrica y un tamaño aproximado de 50nm (flecha en Fig. 2H). También se
evidenció de forma parcial la ultraestructura de las frústulas de las diatomeas, las cuales
eran lanceoladas, contaban con un rafe central recto, un área hialina a ambos lados del
nódulo central y estrías radiales en el centro de la teca y convergentes en los polos (Fig.
2F).
Análisis de genes ADNr 165: Los procedimientos realizados permitieron obtener
ADN de alto peso molecular (>10 OOOpb) adecuado para la amplificación mediante PCR de
los genes ADNr 16S. Con los oligonucléotidos 27F y 1492R, específicos para el dominio
Bacteria, se obtuvo un único producto de amplificación de aproximadamente 1 500pb. Con
los oligonucleótidos Arl09f y Ar912r, específicos para el dominio Archaea, también se
obtuvo un único producto de amplificación de aproximadamente 800pb. La clonación de
los productos de amplificación produjo una biblioteca de 13 clones para Bacteria y otra de
40 clones para Archaea, a las cuales se les asignaron los prefijos R0435B y R0425A,
respectivamente (Cuadros 1 y 2).
Los 13 clones de la biblioteca de genes ADNr 16S de Bacteria se agruparon según los
patrones de RFLP en siete ribotipos: cinco incluyeron un don cada uno, uno incluyó dos
clones y otro incluyó seis clones. Se tomó un don de cada ribotipo para secuenciar y se
obtuvieron secuencias que una vez ensambladas, revisadas y corregidas contenían entre 1
090 y 1 420pb.
El programa CHIMERA_CHECK indicó que la secuencia R0435B3 de 1 382pb
correspondía a una quimera formada por dos componentes contrastantes con un límite muy
marcado. En vez de eliminar esta secuencia, se decidió dividirla en dos (eliminando
44
45
Fig. 2. Comunidad microbiana del borde de un pozo de lodo ácido y caliente de Las Pailas, Parque Nacional
Volcán Rincón de La Vieja. (A) Pozo de lodo con la película de color verde tomada para este estudio (flecha).
(B) Acercamiento de un trozo pequeño del barro mostrando zonas con la película verde superficial (barra =
O.Scm). (C, D, E) Microorganismos revelados mediante microscopía de luz. (C) Diatomea (barra= 20µm).
(D) Grupos de algas Cyanidiales adheridos a la arcilla del barro (barra = lOµm). (E) Corte de la muestra en
donde se obseiva sobre el barro una capa de células de aproximadamente 30µm formada predominantemente
por algas Cyanidiales. Se observan agregados que posiblemente corresponden a microcolonias de procariotas
(flecha) (barra = lOµm). (F, G) Microorganismos observados mediante microscopía electrónica de barrido.
(F) Diatomea (barra= 6µm). (G) Bacilos (barra= lµm). (H, 1, J, K) Diversidad microbiana vista mediante
microscopía electrónica de transmisión.
(H) Célula procariota con dos estructuras de aparente simetría
icosaédrica en su interior (flecha) (barra = lOOnm). (1) Célula procariota en división con un arreglo de
membranas internas (flecha) (barra = 250nm).
(J) Procariota de forma bacilar (barra = 300nm).
(K)
Comunidad microbiana donde se obseivan algas Cyanidiales con un solo cloroplasto y células procariotas
(flecha) ubicadas entre las algas (barra = 3µm).
Fig. 2. Microbial community from the edge of an acidic hot mud pool at Las Pailas, Rincón de la Vieja
Volcano National Park. (A) Acidic hot mud pool with the green color film taken for this study (arrow). (B)
Enlargement of a small piece of mud showing zones with the superficial green film (bar = O.Scm). (C, D, E)
Microorganisms revealed by meaos of light microscopy.
(C) Diatom (bar = 20µm).
(D) Groups of
Cyanidiales algae adhered to mud clay (bar = lOµm). (E) Sample cut showing a layer of approximately 30µm
above the mud surface and consisted predominantly of Cyanidiales algae. There are groups (arrow) that
possibly belong to prokaryotic microcolonies (bar = lOµm). (F, G) Microorganisrns observed by meaos of
scanning electronic microscopy. (F) Diatom (bar= 6µm). (G) Bacilli (bar= lµm). (H, 1, J, K) Microbial
diversity viewed by meaos of transmition electronic microscopy. (H) Prokaryotic cell with two apparently
icosahedral structures inside (arrow) (bar= lOOnm). (1) Dividing prokaryotic cell with an intemal membrane
arrangement (arrow) (bar= 250nm). (J) Bacillary prokaryote (bar = 300nm). (K) Microbial community
where Cyanidiales algae with a single chloroplast and prokaryotic cells (arrow) located between the algae can
be obseived (bar= 3µm).
46
algunos nucleótidos de la región compartida) y tratar los fragmentos resultantes como
secuencias diferentes, ya que se contaba con pocos clones y eliminar éste significabamenos
información de los microorganismos presentes en la muestra, mientras que al fragmentar se
enriquecía el estudio. De esta forma se generaron las secuencias R0435B3F (750pb) y
R0435B3R (603pb) (Cuadro 1), cuya validez en el caso de la primera parece quedar
demostrada porque 749 de sus 750pb (99,87%) tienen identidad con dos genes de ARNr
16S del genoma secuenciado de Acidithiobacillus caldus cepa SM-1 (número de
adquisición CP002573). La validez de la secuencia R0435B3R se demostró de cuatro
formas:
l.
La
herramienta
RDP
Naive
Bayesian
rRNA
Classifier
v2.2
(http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) del Proyecto Base de Datos Ribosomales
(Wang et al. 2007) clasificó esta secuencia como perteneciente a la división candidata TM7
con un límite de confianza del 95%. 2. La secuencia contiene la región hipervariable V6
que corresponde con las posiciones 967 a 1046 del gen de ARNr 16S de E. coli K-12
(número de adquisición U00096) (Fig. 3) y que según Huse et al. (2008) es suficiente para
clasificar una secuencia a nivel de género con un 97% de exactitud, a nivel de familia con
un 98% de exactitud y a nivel de orden con un 99% de exactitud. 3. La región V6 de
R0435B3R contiene 96.3%, 77.5% y 75% de nucleótidos idénticos a otras tres secuencias
pertenecientes a TM7: los clones ERF-GlO (Mirete et al. 2007), SBR1071 (Hugenholtz et
al. 2001) y SBG3 (Marcy et al. 2007), respectivamente. 4. La secuencia R0435B3R posee
en las posiciones 911 y 912 (numeración de E. coli K-12) el motivo AT propio de la
división candidata TM7 (Hugenholtz et al. 2001) (Fig. 3).
Al realizar el BLAST se obtuvo que dos secuencias, representantes de siete clones,
pertenecían a cloroplastos de algas cyanidiales y que una secuencia, representante de dos
clones, correspondió a mitocondria de alga cyanidial.
La secuencia correspondiente a
mitocondria mostró un porcentaje de similitud relativamente bajo (87-89%) con una
secuencia perteneciente al alga Cyanidioschyzon merolae, mientras que las secuencias de
cloroplasto mostraron una mayor similitud (95-96%) con secuencias también pertenecientes
al alga C. merolae y a Galdieria maxima (Rhodophyta) (Cuadro 1).
Los análisis
filogenéticos utilizando los métodos de probabilidad máxima y unión de vecinos colocaron
a las dos secuencias de cloroplasto de Las Pailas en un dado que también incluye a las
47
especies C. merolae y G. maxima y a dos clones de rodófitas no cultivadas pr.ocedentes de
fuentes acidosulfatocloradas (Fig. 4).
***
E.co1iK-12_U00096
R0435B3R
CloneEBP--GlO DQ906081
CloneSBR107l_AF268996
CloneSBG3_AY144355
•••••
E.coliK-12_000096
R0435B3R
CloneEEF--GlO_DQ906081
CloneSBR107l_AF268996
CloneSBG3_AY144355
•••••••••••••••••••••••••••••••• * ••
•••••••••• •
•
•••••••••
AAiTGAATiGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTiAATTCGA
AA
AGGAATrGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCGTGCTGTTiAATTCG
AA
AGGAATiGACGGGGACCCGCI!CAAGCGGTGGAGCGTGTTGTTiAATTC
AA
AGGAATiGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCGTGTTCTTUATTCGA
AA
AGGAATiGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAri:::ATGTTCTTiAATTCG
910 ....... 920 ....... 930 ....... 940 ....... 950 ....... 960 ....... 970 ....... 980
*
•••••••••
• ••
*
•• •
• •
• ••••
** *
• ••••• ••
GTG
GTG
GTG
GTG
ATG
....... 990 ...... 1000 ...... 1010 ...... 1020 ...... 1030 ...... 1040 ...... 1050
Fig. 3. Alineamiento de la región hipervarible V6 (área sombreada) de la secuencia R0435B3 con otras
secuencias de la división candidata TM7, tomando como referencia la numeración de E. coli K-12. El motivo
AT típico de esta división candidata se indica en el recuadro.
Fig. 3. Alingment of V6 hypervariable region (shaded area) from sequence R0435B3 and other sequences
from candidate division TM7. Numbering is based on E. coli K-12. The AT motif typical for this candidate
division is boxed.
En cuanto a las secuencias propias del dominio Bacteria, la que se encuentra
relacionada en un 99,87% de identidad con la y-proteobacteria termoacidófila
Acidithiobacillus caldus mostró 100% de identidad con un don correspondiente a una
bacteria no cultivada moderadamente termofílica. Entre las secuencias restantes hubo otra
perteneciente al grupo de las y-Proteobacterias y dos correspondientes a los grupos
Firmicutes y Bacteroidetes, mostrando las tres un 98% de similitud con clones aislados en
un drenaje ácido de mina y dos sitios termales, respectivamente (Cuadro 1). Por último, la
secuencia perteneciente a la división candidata TM7 mostró 93% de identidad con el don
ERF-G 10 procedente de una bacteria no cultivada de la rizosfera de una planta adaptada a
un drenaje ácido de mina (Fig. 3 y Cuadro 1). Los análisis filogenéticos utilizando los
métodos de probabilidad máxima y unión de vecinos fueron consistentes en apoyar la
relación de las secuencias de Las Pailas con microorganismos habitantes de ambientes
termales o ácidos, además de agruparlas dentro de los cuatro grupos bacterianos
mencionados anteriormente (Fig. 5).
48
CUADRO 1
Inventario de la biblioteca de ADNr 165 de c/oroplasto, mitocondria y Bacteria organizado en ribotipos de acuerdo a los
patrones de RFLP y al resultado del BIAST
TABLE 1
Inventory of chloroplast, mitochondrion and Bacteria 165 rDNA library ribotypes according RFLP patterns and BLAST
results
Clon
representante"
No. de
clonesh
Afiliación
microbiana
Secuencia más cercana según
BLAST (No. adquisición)
% similitud con
secuencia más cercana
R043SB35
6
Cyanidiales
Cloroplasto de Galdieria
maxima (AY391361)
96
R043SBS4
1
Cyanidiales
Cyanidioschyzon merolae
Cloroplasto de
95
{AFS45617)
Mitocondria de
R043SB41
2
Cyanidiales
Cyanidioschyzon merolae
87-89
(D89861)
Acidithiobacillus
sp.
R043SB3Fc
Bacteria no cultivada
moderadamente termofílica
don BS-B42 (DQ661629)
100
TM7
Bacteria no cultivada de
rizosfera de planta adaptada a
drenaje ácido de mina don
ERF-GlO (DQ906081)
93
(y-Proteobacteriat
1
R043SB3Rc
R043SB25
1
y-Proteobacteria
Bacteria no cultivada de
drenaje ácido de mina don
DX25 (DQ458022)
98
R0435Bll
1
Firmicutes
Bacteria no cultivada de suelo
termal don YNPFFP6
(AF391987)
98
R0435Bl
1
Bacteroidetes
Bacteroidete no cultivado de
un sitio termal don SM2G05
(AF445737)
98
Total de clones
13
ª Clon secuenciado. Se obtuvieron secuencias entre 1 090 y 1 420 bp, utilizando los oligonucleótidos 27F y
1492R.
h Agrupados según patrones de RFLP.
e
d
Ambas secuencias, R043SB3F y R043SB3R, pertenecieron originalmente a una sola secuencia quimérica.
Deducido ya que Acidithiobacillus caldus cepa SM-1 (No. adquisición CP002573) estuvo entre las
secuencias más cercanas con 99,87% de identidad.
49
CUADR02
Inventario de la biblioteca de ADNr 165 de Archaea organizado en ribotipos de acuerdo a los patrones de
RFLP y al resultado del BLA5T
TABLE 2
Inventory of Archaea 165 rDNA library ribotypes according RFLP patterns and BLAST results
Clon
representanteª
No. de
donesh
R0425A26
R042SA21
R042SA82
R042SA39
R0425A57
R042SA70
11
2
1
1
1
1
R042SA68
R0425A84
R0425A35
R042SA48
10
3
1
1
R0425A59
2
R042SA74
2
R042SA2
1
R042SA20
1
R0425A9
2
Total de clones
40
Secuencia más cercana según
BLAST (No. adquisición)
% similitud con
secuencia más cercana
Euryarchaeota
Euryarquea acidofílica no
cultivada don ARMAN-2
(DQ848677)
90
93
96
96
91
90
Thermoplasmatales
(Euryarchaeota)
Arquea no cultivada clon
OuI-36 de estudio sobre
metanógenos termofílicos
(AJSS6510)
90
90
90
91
92
Euryarchaeota
Arquea no cultivada don
ORCMO.l de estudio sobre
riachuelo ácido rico en
metales en una mina de
azufre (EF396246)
Arquea no cultivada clon
SPS45 de pantano de turba
ácida (AJ606291)
89
Euryarchaeota
Euryarchaeota
Arquea no cultivada clon
SPS31 de pantano de turba
ácida (AJ606277)
Afiliación
microbiana
91
86
89
ª Clon secuenciado. Se obtuvieron secuencias entre 604 y 717 bp, utilizando los oligonudeótidos Ar109f y
Ar912r.
hAgrupados según patrones de RFLP.
Los 40 clones de la biblioteca de genes ADNr 165 de Archaea se agruparon según los
patrones de RFLP en 15 ribotipos: uno incluyó 11 clones, otro incluyó 10 clones, otro más
incluyó tres clones, tres incluyeron dos clones cada uno y ocho incluyeron un don cada
uno. Se tomó un don de cada ribotipo para secuenciar y se obtuvieron secuencias que una
vez ensambladas, revisadas y corregidas contenían entre 604 y 717pb.
50
Al realizar el
BLAST se encontró que dos secuencias mostraron similitudes del 96% con una secuencia
correspondiente al don del euryarchaeota no cultivado ARMAN-2 aislado de un drenaje
ácido de mina, mientras que el resto mostraron similitudes de entre 86 y 93% ya sea con
esta misma secuencia o con otras secuencias correspondientes a arqueas no cultivadas de
estudios sobre metanógenos termofílicos, un riachuelo ácido de una mina de azufre o
poblaciones metanogénicas en un pantano de turba ácida con pH
~s
(Cuadro 2). Los
análisis filogenéticos utilizando los métodos de probabilidad máxima y unión de vecinos
fueron consistentes en agrupar las secuencias de Las Pailas dentro de tres dados principales
que también incluyen representantes del reino Euryarchaeota entre sus ramas.
En el
primero de estos dados, dos de las secuencias de Las Pailas se encuentran cercanas al
grupo de los Therrnoplasmatales. En el segundo dado, cuatro secuencias de Las Pailas
están relacionadas con arqueas metanógenas.
En el tercer dado se encuentran nueve
secuencias de Las Pailas agrupadas junto con el don ARMAN-2 y otros clones procedentes
de pantanos de turba ácida, de los cuales ninguno está relacionado con grupos microbianos
que cuenten con representantes cultivados descritos (Fig. 6).
51
R085854
R085835
100
r---'-"•
99
R~nocultivédadonOTU2M2defuerteáidosulfctoclora:fa(EF629352)
R~ no cultivédadon OTUS M2 defuerteá:idosulfctoclora:fa (EF629357)
Gald~ia rraxírra
cepa 1PPAS P507 (A Y 391361)
Cyarida:dlyzon rra-ol ae CEfB DBV 201 (A f 545617)
1
Cyarida:dlyzon sp. no cultiva:b defuErt.etarrB don SK 114 (A Y882672)
Cyaridumcaldariumcepa RK 1 (AF022186.2)
6
Galdí~ia gJ¡iuaria cepa DBV009(Af545618)
Cyaniciumsp. Morte Retro (A Y391359)
Por¡:i7yriciumae-ugírrumcepa SAG 43.94 (A M084277)
0.1
Fig 4. Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las secuencias parciales de ADNr
165 de cloroplasto de Las Pailas (en negrita) y las secuencias de GeneBank más cercanas según los resultados
de BLA5T (números de adquisición entre paréntesis). El alga Rhodophyta Porphyridium aerugineum fue
usada como grupo externo. Los nodos respaldados por los métodos de probabilidad máxima y unión de
vecinos (neighbor-joining) están indicados con círculos cerrados (más de 75% de seudoréplicas) y círculos
abiertos (más de 50% de seudoréplicas). La escala representa el número estimado de cambios por posición.
Fig. 4. Maximum likelihood phylogram of chloroplast 165 rDNA partial sequences from Las Pailas (bolded)
and closest GeneBank sequences according BLA5T results (accession numbers between parenthesis).
Rhodophyte alga Porphyridium aerugineum was used as outgroup. Nodes supported by maximum likelihood
and neighbor-joining methods are indicated with closed circles (bootstrap values greater than 75%) and open
circles (bootstrap values greater than 50%). 5cale represents estimated number of changes per position.
52
lOO
70
81
99
Cla;lrid~ 00 aitivcrl:> don Tik_19desufog:Ue11 B cta::ta:b rrr V~ (AM 749765)
Grar¡:X>Sitivo de tJ..io G-tC oo cultiva:lo don YNPRH7QA. de suao l:a1r0 (AF465653)
Boctaia de suao t:mra oo cultivcda don Y NPFFP6 (AF391987)
RO&iBll
Adcitti003dl/us cald.s CEµi MTH-04 (Ay 427958)
8octaia rrodEralcnateterrofílica oo cultivédadon 85-842 (DQ661629)
ROrBSB3F
ROB5B25
8crtaia dec:frm::je 0000 de rrí na oo aitivcrla don DX 25 (00450022)
G~aooaitivédadonTik_lSdesuaoge:italrd cta::ta:b¡:rrvcµx-(AM749761)
8octaia oo cultivcda don ERF-GlO de rizosfaa de pérta alép:cda a~ 0000 de rrína (0(1-ffiOOl)
...,.__ 8crtaia oo cultivcdaclon IC-33 decorcren corroíoo (AB255Cfü)
r----"'lDO~
ROl35B3R
100
8octaia ocicbfíl ira oo cultivcrla don CV63 de l:i~íaia ooda colgai:e de pcrEd de ratana (DQ4993ffi)
Bé(j:er()jd:te oo cultiva:lo clon OTU lQIAPA de fuerte t:arrB sul:taTira:l (AM902638)
100
100
'--------=~
ROB581
Bcctatid:te oo aitiva::b don SM 2G05 de un sitio t:arrB (A F445737)
'------Aq.ifex pyrO{i'ilus KolSa (M83548)
66
'TI
i
2.
IR
í
~
111
11
0,1
Fig. 5. Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las secuencias parciales de ADNr
165 de Bacteria de Las Pailas (en negrita) y las secuencias de GeneBank más cercanas según los resultados de
BLA5T (números de adquisición entre paréntesis). Aquifex pyrophilus fue usado como grupo externo. Los
nodos respaldados por los métodos de probabilidad máxima y unión de vecinos (neighbor-joining) están
indicados con círculos cerrados (más de 75% de seudoréplicas) y círculos abiertos (más de 50% de
seudoréplicas). La escala representa el número estimado de cambios por posición.
Fig. 5. Maximum likelihood phylogram of Bacteria 165 rDNA partial sequences from Las Pailas (bolded) and
closest GeneBank sequences according BLA5T results (accession numbers between parenthesis). Aquifex
pyrophilus was used as outgroup. Nodes supported by maximum likelihood and neighbor-joining methods are
indicated with closed circles (bootstrap values greater than 75%) and open circles (bootstrap values greater
than 50%). 5cale represents estimated number of changes per position.
53
- Ttarrq:iamta ro ruliva:b dm ORCM0.1 rectm;¡e ilirorerrina!EF396246}
Ttarrq:iamta ro rulliva:bdCXl ORCM0.17 rectm;¡eiliro rerrina(EF396245)
44
51
95
Arq.m ro rultivaladm aia5 d3 río á:icb Río TíriD (DQ1B248)
ROl25A!9
RO«ZSA74
Matau;a"árá:alro a.llivocia dm LrhA.45 reriza;ferarearoz (AJ Bro26J
97
(
l
Melhtroaárá:al ro aJUvcdl dCXl HrhA. 74 re ríza;fera reifT<2 (Aj ll"/!9!2)
97 M~rá:al ro rultivala dm LrhA.53 re rizaterare aroz (AJ 87913.3)
100
M~rorultiva:bdmFffC1-165re¡B"tmdig:iniftco(AJ548941)
Mem5gero ro rultiv.rl:> dm Fa-C-165 re ¡xrt¡moli~ico (AJ 548940)
i
76
M~rorultiv.rl:>dmFffC2-165re¡xrt¡mdiglr(ftco(AJ~l
ArcµBro ruilivaladCXl WCHD3-02 rea:úfau C!JtJriíirl> (AFQS(Xi16)
1
L
56
Arq..a¡rocultivcdldmOul-36res..SoxiirocOOi:rrirW>cooOCEite(AJ556510)
R02iA48
60r
Í,1W:tl5Aei
44~
38fR~68
tR0125A35
64
100
-- ROl25A57
1
-~
L._ Arcµa ro rullivaladmSPSl re¡xrt¡m returh:lá:ida (AJ tm147)
~------51Jfd001s9Jfatarirus(X03235)
0,1
Fig_ 6. Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las secuencias parciales de ADNr
16S de Archaea de Las Pailas (en negrita) y las secuencias de GeneBank más cercanas según los resultados de
BLAST (números de adquisición entre paréntesis). El crenarqueota Sulfolobus solfataricus fue usado como
grupo externo.
Los nodos respaldados por los métodos de probabilidad máxima y unión de vecinos
(neighbor-joining) están indicados con círculos cerrados (más de 75% de seudoréplicas) y círculos abiertos
(más de 50% de seudoréplicas). La escala representa el número estimado de cambios por posición.
Fig. 6. Maximum likelihood phylogram of Archaea 16S rDNA partial sequences from Las Pailas (bolded) and
closest GeneBank sequences according BLAST results (accession numbers between parenthesis ).
Crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was used as outgroup. Nodes supported by maximum likelihood and
neighbor-joining methods are indicated with closed circles (bootstrap values greater than 75%) and open
circles (bootstrap values greater than 50%). Scale represents estimated number of changes per position.
54
DISCUSIÓN
La comunidad microbiana estudiada habita un ambiente que posee al menos tres
parámetros extremos: pH, temperatura y concentración iónica.
El pH se encuentra
alrededor de 2.5, mientras que la temperatura, que al momento de recolectar la muestra era
de 52ºC, se espera que en promedio sea superior a la ambiental debido a la exposición
directa a gases calientes y a la radiación solar. La alta conductividad eléctrica obtenida en
esta muestra (3 735µS/cm en comparación con los O.OSSµS/cm del agua ultra pura), indica
una elevada concentración de iones, con un predominio de iones
soi· según se desprende
del análisis químico realizado a los fluidos de sitios cercanos.
Estas características
fisicoquímicas permiten clasificar a los organismos de esta comunidad como extremófilos o
al menos extremotolerantes.
De los resultados obtenidos se puede concluir que la comunidad microbiana estudiada
contiene dos grupos de algas (Cyanidiales del linaje Cyanidioschyzon - Galdieria máxima y
diatomeas pennadas) que constituirían los principales productores primarios, al menos
cuatro grupos de bacterias (Firmicutes, y-Proteobacteria, Bacteroidetes y TM7) y tres de
arqueas (Thermoplasmatales, nanoarqueas ARMAN-2 y organismos emparentados con
metanógenos). Lo anterior plantea la existencia de relaciones ecológicas complejas entre
organismos con fisiologías y morfologías diferentes que habitan un ambiente ácido, caliente
en relación a la temperatura ambiente y con concentraciones relativamente elevadas de
iones metálicos y compuestos de azufre. Un grupo microbiano cuya presencia no fue
detectada en este estudio pero que posiblemente estaría presente es el de los hongos, dado
que han sido reportados en ambientes calientes y ácidos (Schinteie et al. 2007, Das et al.
2009, Chiacchiarini et al. 2010) y son importantes como descomponedores de materia
orgánica en los ecosistemas.
Un grupo de eucariotas fotosintéticos que usualmente habita en condiciones de
temperatura y pH como las mencionadas anteriormente es el de algas Cyanidiales
(Rhodophyta), las cuales a menudo forman biopelículas bien desarrolladas en sitios
geotermales ácidos (Corinne et al. 2007, Toplin et al. 2008). Por otro lado, una de las
características de las Cyanidiales es que son organismos unicelulares con un solo
55
doroplasto (Albertano et al. 2000, Barbier et al. 2005), lo que coincide con las células
eucariotas, esféricas y de color verde encontradas como organismos predominantes en la
comunidad de Las Pailas. Los datos anteriores, sumados a la identificación de genes de
ARNr 16S de cloroplasto y mitocondria de Cyanidiales, confirman la presencia de este
grupo de algas. La fina película que exhibe la estructura física de la comunidad (Fig. 2B y
2E) se explica debido al carácter fotosintético de las algas, ya que una película gruesa
evitaría el paso de la luz a los estratos más internos, impidiendo la fotosíntesis.
Las
observaciones al microscopio de luz parecen indicar que esta película se mantiene
firmemente adherida al sustrato gracias a la unión de las algas entre sí y con las partículas
de arcilla (Fig. 2D).
Las secuencias obtenidas no permitieron la identificación a nivel de especie de las
Cyanidiales, pues los resultados del BLAST no dieron valores de 100% de similitud entre
las secuencias de Las Pailas y las secuencias de la base de datos (Cuadro 1). Lo que se
puede inferir del BLAST y de la agrupación dada por el análisis filogenético es que las
algas detectadas en este estudio están más emparentadas con las especies Galdieria máxima
y Cyandioschyzon merolae que con el género Cyanidium.
El resultado del análisis
realizado con genes ADNr 16S de cloroplasto (Fig. 4) posiblemente no sería diferente al
que hubiese sido obtenido con genes ADNr 18S del núcleo, ya que los análisis filogenéticos
que utilizan éste último también agrupan en una misma rama a G. máxima y a C. merolae,
mientras que en otra rama cercana a ésta se ubica el género Cyanidium, y separada de las
dos anteriores, se encuentra la rama de Galdieria sulphuraria (Ferris et al. 2005, Toplin et
al. 2008).
Además de que las secuencias de Las Pailas no fueron idénticas a las secuencias de G.
máxima ni de C. merolae, los datos morfológicos tampoco permitieron realizar una
identificación, pues en la muestra se observaron células esféricas con un tamaño promedio
de 2.3µm que no corresponderían a las células de 10-16µm de G. maxima ni a las células
ovaladas o en forma de pera de 1.5x3.5µm típicas de C. merolae (Albertano et al. 2000,
Ferris et al. 2005). Esta incongruencia en cuanto a filogenia y morfología ya ha sido
documentada en otros estudios (Ferris et al. 2005, Corinne et al. 2007) y no es extraña dada
la ambigüedad en los análisis taxonómicos moleculares y en la nomenclatura de este grupo,
56
que no permite tener clara la delimitación de especies (Albertano et al. 2000, Ferris et al.
2005). Lo que queda claro es que las secuencias de Las Pailas se encuentra dentro del
linaje de G. máxima - C. merolae, uno de los cuatro linajes propuestos para el grupo de las
Cyanidiales (Ciniglia et al. 2004).
Otros eucariotas fotosintéticos presentes en esta comunidad fueron las diatomeas
pennadas (Bacillariophyta). No se obtuvieron clones de este grupo debido posiblemente a
su menor abundancia en comparación con las Cyanidiales y a que sus paredes de sílice
fueron resistentes al proceso de lisis aplicado para la extracción de ADN, sin embargo, las
observaciones al microscopio permitieron detectar la presencia de sus típicas células con
dos tecas y simetría bilateral (Stoermer & Julius 2003). La existencia de Si0 2 entre los
componentes del barro sobre el cual se encuentra la comunidad sería una de las razones que
permitiría el desarrollo de diatomeas, pues el silicio es la materia prima para la formación
de la frústula o pared celular silícea (Bates & Trainer 2006). Los datos obtenidos son
insuficientes para realizar una identificación certera de la especie o especies de diatomeas
presentes en la biopelícula, para lo cual habría que digerir la materia orgánica de las células
y observarlas en preparación fija (Stoermer & Julius 2003) con el fin de identificar
características taxonómicas de la pared celular, sin embargo, los datos recolectados hacen
pensar que se trata del género Pinnularia pues este incluye células lanceoladas con un
sistema de rafe central que tienen dos cloroplastos en forma de disco (Souffreau et al.
2011), además, varias especies de este género se caracterizan por presentar un rafe recto y
estrías radiales hacia el centro y convergentes en los extremos (Cambum & Charles 2000),
características que fueron observadas en las diatomeas de Las Pailas (Fig. 2C y 2F). Se
suma a lo anterior el hecho de que miembros de este género también se han reportado
asociados a Cyanidiales en comunidades criptoendolíticas en áreas volcánicas de Italia con
pH entre 2.1 y 2.45 (Gross et al. 1998), en biopelículas eucarióticas con pH cercano a 2 del
Río Tinto en España (Aguilera et al. 2007) y en una comunidad microbiana endolítica de
Pailas Frías, otro ambiente ácido (pH 1-2) y con presencia de azufre ubicado en el sector
Santa María del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja (Hemández-Chavarría &
Sittenfeld 2006). Pinnularia parece estar presente en una variedad de ambientes ácidos,
tales como lagos volcánicos ácidos con pH 2.2-3 y ricos en azufre en Japón (Battarbee et
57
al. 1999) y superficies de depósitos silíceos de fuentes termales sulfatadas y con pH
ligeramente superior a 2 en Nueva Zelanda (Schinteie et al. 2007). Otro sitio en Costa Rica
donde han sido reportadas Cyanidiales junto a diatomeas, pero de los géneros Navicula Y
Cymbella, es la superficie de rocas ubicadas en fuentes termales sulfatadas y ácidas (pH
2.2-2.5) del cráter del Volcán Poás (Sugimori et al. 2002).
Las células procariotas observadas al microscopio presentaron una ubicación dispersa
entre la matriz de algas Cyanidiales (Fig. 2E y 2K), de manera que no parece haber estratos
de diferentes tipos celulares, sino que en la misma capa se distribuyen todos los
microorganismos presentes. También se puede presumir que existen un crecimiento y
metabolismo microbiano activos debido a la presencia de células en evidente fisión binaria
y con posibles sitios de catálisis enzimática o fotosíntesis, deducido por los arreglos
membranosos internos observados (Fig. 21).
Es discutible la naturaleza de las estructuras icosaédricas observadas dentro de una de
las células procariotas (Fig. 2H), pues podría tratarse de carboxisomas o de partículas
virales. Los carboxisomas son inclusiones citoplasmáticas que encapsulan a la enzima
ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa encargada de realizar la fijación de C02, encontrándose
en procariotas fotoautótrofos y quimioautótrofos como los que podrían estar aquí presentes.
Estudios de microscopía electrónica han mostrado que los carboxisomas poseen forma
icosaédrica y presentan tamaños aproximados entre 80 y 140nm (Tanaka et al. 2008); por lo
tanto, las estructuras observadas podrían corresponder a carboxisomas pequeños o en
formación. Otra posibilidad es que estas estructuras icosaédricas sean partículas virales,
pues en ambientes como las fuentes termales los virus son un componente abundante y
activo de la comunidad microbiana, siendo los únicos depredadores microbianos conocidos
tanto de bacterias como de arqueas (Breitbart el al. 2004). En fuentes termales ácidas se
han reportado virus con variedad morfológica que va desde icosaédrica y filamentosa hasta
esférica y en forma de botella, y con excepción de las formas filamentosas, los tamaños
oscilan alrededor de los 100 nm (Rice et al. 2001, Breitbart et al. 2004, Haring et al. 2005),
por lo que las estructuras intracitoplasmáticas observadas en este estudio tendrían la mitad
de este tamaño.
En cuanto a la biblioteca de ADNr 16S del dominio Bacteria, se obtuvieron 13 clones
58
que contendrían solo una parte de la variedad microbiana presente en la muestra y, como se
mencionó anteriormente, confirman la presencia de cloroplastos de algas cyanidiales.
Además, esta biblioteca indica la existencia de al menos cuatro grupos bacterianos
diferentes, incluyendo una especie ya descrita y cultivada (Cuadro 1 y Fig. 5). Por otro
lado, la biblioteca correspondiente al dominio Archaea fue más rica en información, con 40
clones que también contendrían solo una parte de la variedad de arqueas en la muestra
(Cuadro 2 y Fig. 6).
Las secuencias propias del dominio Bacteria se relacionaron principalmente con clones
ambientales de sitios con condiciones de acidez o temperatura similares a las
.
predominantes en el hábitat estudiado (Cuadro 1 y Fig. 5). Acidithiobacillus caldus es un
candidato muy fuerte para asociarlo como uno de los componentes propios del ecosistema
en estudio, pues uno de los clones de Las Pailas presentó una homología del 99,87% con el
gen ADNr 165 de esta especie.
Este organismo corresponde a un quimiolitoautótrofo
aerobio cuya energía deriva de la oxidación de compuestos de azufre y cuyas condiciones
óptimas de crecimiento son 45ºC y pH de 2 a 2.5 (Kelly & Wood 2000), ambas cercanas a
las condiciones determinadas para el sitio de estudio. En general estas secuencias, con
excepción de una que se afilió con la división candidata TM7, pertenecen a grupos
bacterianos con representantes cultivados: y-Proteobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes.
Algunos miembros de y-Proteobacteria, así como miembros del grupo Bacteroidetes
(Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides), han sido encontrados en fuentes termales con altas
temperaturas y valores de pH bajos en Indonesia (Baker et al. 2001), mientras que
miembros del grupo Firmicutes han sido encontrados en fuentes termales con temperaturas
altas y moderadas y en manifestaciones geotermales ácidas (Baker et al. 2001, Johnson et
al. 2003), tales corno las fuentes termales ácidas del cráter del Volcán Poás, donde se ha
reportado la presencia del firmicute Bacillus sp. (Sugirnori et al. 2002). En un estudio
anterior que incluía muestras del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja y de sitios
parecidos en Nueva Zelanda y en Estados Unidos, también se había encontrando mediante
DGGE (siglas en inglés de electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización) la
presencia de y-Proteobacterias y Bacteroidetes en las comunidades microbianas estudiadas;
sin embargo, no queda claro cual fue el sitio exacto que fue muestreado en Costa Rica y los
59
valores de pH reportados están entre 4 y 5 (Wheeler 2006), lo cual no permite realizar una
comparación válida, no obstante permite inferir que estos grupos bacterianos pueden
habitar ambientes ácidos con un amplio ámbito de pH.
Miembros de la división candidata TM7 también han sido encontrados en otros
ambientes ácidos como en la rizosfera de una planta adaptada a un drenaje ácido de mina
del Rio Tinto en España (Mirete et al. 2007) y en minerales de desecho con pH de 3 que
generan drenajes ácidos en China (Hao et al. 2007). Este grupo bacteriano es peculiar
puesto que hasta la fecha no cuenta con representantes cultivados y únicamente ha sido
posible obtener microcolonias mediante el uso de sistemas de membrana de policarbonato
que utilizan suelo como sustrato (Ferrari et al. 2005). Esta división candidata fue descrita a
partir de secuencias de ADNr 16S ambientales procedentes de pantanos de turba, suelos,
plantas de tratamiento de aguas residuales, aguas dulces y marinas y de la cavidad oral
humana (Hugenholtz et al. 2001), siendo de esta última fuente de donde se obtuvo buena
parte de un genoma gracias al aislamiento de células individuales con un chip de
microfluidos, seguido de la amplificación de su genoma y la pirosecuenciación del mismo
(Marcy et al. 2007). Una fuente importante de material para el estudio de este grupo
microbiano son los lodos activados en el tratamiento de aguas residuales (Dinis et al. 2011).
Tal vez el hallazgo más interesante, pues no se había descrito antes en ambientes
extremos de Costa Rica, es la presencia de organismos pertenecientes al dominio Archaea.
Los 15 dones secuenciados correspondieron a procariotas que se clasificaron dentro del
reino Euryarchaeota, organizándose en tres grupos (Cuadro 2 y Fig. 6). El primero de estos
corresponde al de los Thermoplasmatales, constituido por organismos autótrofos o
heterótrofos, carentes de pared celular en algunos casos, anaerobios facultativos y
termoacidófilos (Huber & Stetter 2006), por lo que era de esperar su presencia en Las
Pailas dadas las condiciones de extrema acidez y una temperatura superior a la ambiental.
Es interesante encontrar este grupo microbiano en el presente estudio, ya que su
distribución está restringida a sitios de extensión geográfica limitada, tales como drenajes
ácidos de mina (pH<2) con altas concentraciones de iones metálicos (conductividad
120mS/cm), y no está claro como estas células que se lisan a pH neutro se trasladan y
llegan a habitar estos ambientes aislados y distribuidos alrededor del mundo (Edwards et
60
al. 2000, Baker et al. 2006).
El segundo grupo de arqueas lo constituyen secuencias emparentadas con
metanógenos, que no se afiliaron con ningún grupo en particular y que presentaron
porcentajes de similitud de apenas 90-91 % con sus secuencias más cercanas según el
BLAST. Debido a que los metanógenos constituyen un grupo diverso y parafilético dentro
del dominio Archaea, las secuencias de Las Pailas podrían pertenecer a un linaje de
metanógenos aún no descrito o de organismos no metanógenos emparentados con estos. Lo
anterior podría dilucidarse con estudios que traten de detectar la presencia del gen de la
enzima metil CoM reductasa (mcr), presente únicamente en los organismos productores de
metano (Nercessian et al. 1999). Los metanógenos se han encontrado en ambientes con
temperaturas que van desde 4ºC hasta llOºC y la mayoría crece a pH entre 6 y 8; sin
embargo, estudios in vivo han demostrado que la metanogénesis ocurre en ambientes ácidos
como pantanos de turba (García et al. 2000) con valores de pH ligeramente superiores a 4
(Galand et al. 2003). Por lo anterior es que de confirmarse la presencia de metanógenos en
Las Pailas, éste sería uno de los pocos sitios con pH cercano a 2 en el que se reportaría la
presencia de este grupo microbiano. Por otro lado, sería interesante estudiar su interacción
con el medio y con el resto de organismos del ecosistema, ya que los metanógenos son
anaerobios y se esperaría que habitaran micronichos a los cuales no llegue el oxígeno
atmosférico ni el producido durante la fotosíntesis por la gran cantidad de algas presentes.
La presencia de metanógenos indicaría la formación de microambientes anoxigénicos en
esta comunidad, lo cual no sería extraño dentro de los aproximadamente 30µm de
profundidad de una comunidad microbiana que no está sujeta a flujos de aire o corrientes
de agua que alteren constantemente su estructura.
Los miembros del tercer grupo de clones de arquea de Las Pailas presentaron entre 90
y 96% de similitud con el grupo 2 de nanoarqueas acidofílicas de la mina Richmond
(Archaeal Richmond Mine Acidophilic Nanoorganism o ARMAN-2), el cual representa un
linaje del reino Euryarchaeota constituido por células muy pequeñas, con tamaños
promedios de 244xl 75nm y sin representantes cultivados, que fue descrito en un drenaje
ácido de la mina Richmond (Iron Mountain, California, EEUU) rico en metales como el
hierro procedente de la disolución de pirita (FeS2), con pH de 0.5 a 1.5 y temperaturas de
61
30 a 47ºC. Otros miembros de esta rama filogenética han sido clones detectados en un sitio
con temperatura de 78ºC y pH 7.5 y clones de un pantano de turba ácida con pH 4.2-4.8,
sin embargo, al compararlos con ARMAN-2 los porcentajes de similitud de secuencia son
menores al 90% (Baker et al. 2006). El hallazgo en el presente estudio de secuencias con
porcentajes de similitud mayores indica que las arqueas ARMAN-2 están más
emparentadas con algunos organismos habitantes de Las Pailas que con los detectados en
pantanos de turba ácida, lo que se explicaría por la mayor similitud de pH y concentración
elevada de iones que hay entre la mina Richmond y Las Pailas. Lo anterior también amplía
la presencia del grupo microbiano ARMAN-2 a comunidades microbianas dominadas por
organismos fotosintéticos en bordes de pozos de lodo ácido y caliente, lo cual sumado a la
detección de clones en pantanos de turba ácida y sitios calientes con pH cercano a la
neutralidad, indica que este grupo microbiano no se encuentra restringido a ambientes
termoácidos.
Debido a las condiciones ambientales de la muestra estudiada era de esperar que los
microorganismos habitantes de la comunidad microbiana fuesen termoacidófilos o al menos
termoacidotolerantes, muchos de ellos con metabolismos fotosintéticos o litotróficos que
utilizan azufre.
Los resultados obtenidos, tanto de microscopía como moleculares, se
acercan a lo esperado, pues se trata de una comunidad dominada por eucariotas
fotosintéticos en la cual se encuentran también procariotas de los dominios Archaea y
Bacteria, entre los cuales incluso se detectó la presencia de una bacteria litotrófica que
oxida azufre: Acidithiobacillus caldus. No se encontraron clones derivados de procariotas
fotótrofos, lo cual no es de extrañar, pues no se conocen organismos de este tipo habitando
ambientes con pH por debajo de 4 (Toplin et al. 2008).
La existencia de hierro en la comunidad estudiada da la idea de que algunos
microorganismos presentes podrían utilizar iones de este elemento como aceptores finales
de electrones mediante respiración anaeróbica, puesto que esta habilidad parece estar
particularmente presente entre bacterias acidofílicas, dado que en ambientes ácidos el
potencial redox del par Fe2+/Fe3+ es similar al del par 02/H20 (Johnson & Bridge 2002).
El hecho de que la mayoría de las secuencias obtenidas estuvieron relacionadas con
organismos encontrados en otros ambientes ácidos indica que la contaminación con ADN
62
de organismos ajenos a la comunidad microbiana estudiada no fue un problema durante la
construcción de las bibliotecas.
Hay evidencias que sugieren que la abundancia relativa de genes de ARNr 165
obtenidos mediante PCR refleja razonablemente la abundancia relativa in sítu de éstos
(Hugenholtz et al. 1998); sin embargo, existen al menos tres razones por las cuales no se
puede asumir que la abundancia de clones refleje la diversidad o la abundancia relativa de
los microorganismos presentes en la comunidad estudiada. La razón más importante es el
hecho de que siendo las diatomeas un componente importante de la comunidad, según se
concluye de las observaciones microscópicas, no se obtuvieron clones correspondientes a
.
estos organismos, lo cual sería evidencia de una deficiencia en el proceso de extracción de
ADN que también podría aplicar para otros microorganismos que pudieron estar presentes
en la muestra, corno por ejemplo hongos. La segunda razón es que el número de clones
obtenidos para cada biblioteca fue relativamente bajo, lo cual es particularmente evidente
en el caso de la biblioteca de Bacteria. La tercera es que los oligonucleótidos utilizados, a
pesar de considerarse universales por alinearse con regiones conservadas en la mayoría de
secuencias de las bases de datos, no es seguro que sean útiles para amplificar todos los
genes de ARNr 165 existentes en la naturaleza, dado que los genes de algunos grupos
microbianos poseen secuencias inusuales (Baker et al. 2006).
La descripción realizada para esta comunidad microbiana será útil para desarrollar
futuras investigaciones con el propósito de ahondar en las relaciones ecológicas entre los
diferentes microorganismos que la componen. Por ejemplo, las secuencias obtenidas en
este estudio serían útiles para el diseño de sondas que permitan realizar estudios de
hibridación fluorescente in situ (FI5H por sus siglas en inglés) con el fin de ubicar los
diferentes grupos microbianos dentro de la estructura de la comunidad, así corno cuantificar
su abundancia. Lo anterior, sumado al conocimiento de la composición química del sitio,
permitiría profundizar en el papel ecológico jugado por los microorganismos que
componen estas comunidades.
Además, estos resultados aportan nuevos elementos a
considerar dentro de la biodiversidad costarricense y en las estrategias de conservación de
los recursos naturales, y constituyen la base para iniciar la búsqueda de genes u organismos
con potencial biotecnológico.
63
RESUMEN
Los microorganismos extremófilos son interesantes por su ecología, fisiología y potenciales aplicaciones
biotecnológicas, sin embargo, en Costa Rica hay solo algunos informes de estudios en ambientes ácidos. Este
trabajo describe una comunidad microbiana del borde de un pozo de lodo ácido y caliente del campo
geotermal Las Pailas del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, con el objetivo de aumentar el
conocimiento sobre extremófilos de Costa Rica y del trópico. Esta comunidad consistía en una película de
color verde cubriendo un barro con pH de 2.5, concentraciones altas de iones sulfato y metálicos y expuesto a
los vapores del pozo. Los microorganismos se observaron mediante microscopía óptica y electrónica. Se
construyeron bibliotecas de ADNr 16S de cloroplasto, Bacteria y Archaea, se agruparon de acuerdo a sus
polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y se secuenció un representante de cada
agrupamiento. Las secuencias se alinearon y se construyeron árboles filogenéticos. La comunidad estaba
dominada por algas Cyanidiales, además habían diatomeas pennadas y procariotas. Las secuencias de ADNr
16S se relacionaron con clones de ambientes con condiciones de acidez o temperatura similares a Las Pailas y
mostraron que las Cyanidales pertenecen al linaje Cyanidioschyzon merolae - Galdieria maxima.
Las
secuencias de Bacteria indicaron la presencia de Firmicutes, Bacteroidetes, TM7 y y-Proteobacteria,
incluyendo dentro de este último al género Acidithiobacillus. Las secuencias de Archaea evidenciaron la
presencia de Thermoplasmatales, nanoarqueas ARMAN-2 y organismos emparentados con metanógenos.
Estos resultados plantean la existencia de relaciones ecológicas complejas entre microorganismos con
fisiologías y morfologías variadas.
Palabras clave: acidófilos, campo geotermal, comunidad microbiana, cyanidiales, diatomeas, Las Pailas,
Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, pozos de lodo ácido y caliente.
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71
Descripción de una comunidad microbiana habitante de una naciente de
aguas ácidas del Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Costa Rica
Walter Hemández-Ascencio1, Ana Sittenfeld AppeI1, Lorena Uribe Lorío 1 & Marielos Mora
López 1
l.
Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica, San José, Costa
Rica; [email protected]
Abstract: Description of a microbial community inhabiting an acidic spring at Rincon de la Vieja
Volcano National Park, Costa Rica. The knowledge of Costa Rican biodiversity is scarce from a microbial
point of view. Country's microbial richness includes organisms that inhabit acidic environments and are
promising sources of enzymes with industrial potential. Only sorne acidophiles inhabiting low pH
environments associated with volcanoes Poas and Rincon de la Vieja have been described.
This paper
describes the composition of a microbiaJ community thriving in an acidic spring from a site known as Pailas
Frias, located in Santa Maria sector of Rincon de la Vieja Volcano NationaJ Park, aiming to increase the
knoledge about the diversity of extremophilic microorganisms in Costa Rica. The microbial community was
revealed as a mass of filarnents and green sediment in water with a pH of 2.41 and high concentrations of
ions.
The organisms were observed by light microscope and scanning electron microscope. 16S rDNA
libraries were constructed for chloroplast, Bacteria and Archaea. They were grouped according to restriction
fragment length polymorphisms (RFLP) and a representative of each cluster was sequenced. Sequences were
aligned to built phylogenetic trees that showed several of the microbial groups present in the sample.
Microscopic observations revealed that the community was dominated by Zygnematales algae and that
pennate diatoms and cells similar to Eug/ena mutabilis were also present. 16S rDNA sequences were
associated rnostly with organisms and environmental clones from sites with conditions of extreme acidity.
Chloroplast sequences corresponded to the three groups of photosynthetic organisms observed in the
microscope.
Bacteria sequences indicated the presence of groups Acidobacteria, Planctomycetes, a-
Proteobacteria (including the genus Acidiphilium) and P-Proteobacteria. In the other hand, Archaea sequences
indicated the presence of euryarchaeons. These results suggest the existence of complex ecologica1
relationships between organisms with different physiologies and morphologies inhabiting an envi.ronment
with at least two extreme parameters: pH and ions concentration.
Key words: acidic spring, acidophiles, diatoms, Euglena, microbial community, Pailas Frías, Rincon de la
Vieja Volcano National Park, Zygnematales.
72
Costa Rica es un país que pese a su reducida superficie terrestre de apenas 51100km 2
es muy rico en biodiversidad, pues se estima que en su territorio conviven más de medio
millón de especies que representarían el 4% de las especies que se cree que existen en el
mudo, sin embargo, estos valores están basados casi exclusivamente en especies animales,
vegetales y hongos, dejando al margen las especies microbianas, ya que por ejemplo, del
número de especies registradas en el país al año 2002 solo 213 pertenecían al dominio
Bacteria, a pesar de que se estimaban unas 26 350 especies (Obando 2002). Lo anterior es
contradictorio si se considera que la mayor diversidad biológica del planeta se encuentra en
el mundo microbiano, distribuida en los tres dominios de la vida: Eukarya, Bacteria y
Archaea. Esta diversidad microbiana va de la mano con la gran cantidad de ambientes
diferentes que pueden ser habitados, reportándose microorganismos proliferando en
condiciones que a veces son consideradas increíbles, como por ejemplo en fuentes termales
subterráneas (Marteisson et al. 2001), fuentes termales submarinas con temperaturas
cercanas a los lOOºC (Huber et al. 2002, Nakagawa et al. 2004), drenajes de mina ácidos
con pH menor a 1 (Edwards et al. 2000) y el Río Tinto en España, el cual posee una acidez
extrema (pH
&
~3)
y concentraciones elevadas de iones metálicos como el hierro (Whitaker
Banfield 2005).
Ambientes con condiciones físico-químicas extremas como los
anteriores son el hábitat de microorganismos llamados extremófilos, los cuales son fuentes
promisorias de enzimas con gran potencial en la industria, dado que han desarrollado
mecanismos moleculares de adaptación que les permiten ser activos o estables en
condiciones de extrema acidez, temperatura, etc. (Ferrer et al. 2007). Las comunidades
microbianas habitantes de ambientes extremos pueden ser utilizadas como sistemas modelo
para el estudio de dinámica de islas (Staley & Gosink 1999), ya que estos sitios están a
menudo separados uno del otro por grandes espacios, reduciendo la dispersión de
individuos entre ellos (Whitaker & Banfield 2005).
Costa Rica cuenta con una riqueza de microorganismos en ambientes extremos ácidos
que apenas está empezando a ser descubierta. Gracias a algunos estudios realizados se ha
constatado la presencia de diatomeas acidófilas en el Río Agrio de las faldas del volcán
Poás (Wydrzycka & Lange-Bertalot 2001), Euglena en un río ácido de la vertiente norte del
país (Rosowski 2003, Wehr & Sheath 2003) y diatomeas, algas Cyanidiales y bacterias en
73
manifestaciones hidrotermales del cráter del Volcán Poás. En el Parque Nacional Volcán
Rincón de la Vieja, el cual cuenta con gran cantidad nacientes superficiales de las cuales
emanan fluídos ácidos, la mayoría de las cuales también están asociadas a altas
temperaturas, se ha descrito la presencia de otros microorganismos habitantes de ambientes
ácidos: una nueva especie de Euglena con la capacidad de tolerar temperaturas
relativamente elevadas (Sittenfeld et al. 2002, Sánchez et al. 2004) y una comunidad
microbiana endolítica dominada por diatomeas y algas Cyanidiales, la cual fue descrita
dentro de un sector de manifestaciones no termales conocido como Pailas Frías
(Hemández-Chavarría & Sittenfeld 2006). El presente trabajo expone el estudio de otra
comunidad microbiana habitante de Pailas Frías, en el cual se aplica la construcción de
bibliotecas de ADNr 16S junto con observaciones microscópicas. La información recabada
representa un aporte importante al conocimiento de la biodiversidad microbiana del país y
se espera que contribuya a propiciar futuros estudios ecológicos y de bioprospección, así
como al establecimiento de estrategias de conservación para el Parque Nacional Volcán
Rincón de la Vieja.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitio de estudio y recolección de muestras: Las manifestaciones geológicas ácidas
seleccionadas para el estudio, conocidas como Pailas Frías, se ubican en el sector del
Parque Nacional Volcán Rincón de La Vieja conocido como Santa María y localizado al
sureste del Parque. Consisten en fuentes con emanaciones de gases y dos tipos de aguas:
unas contienen un material blanquecino fino y abundante en suspensión que se acumula en
los bordes de los pozos originando un barro de textura arcillosa, y otras son cristalinas,
fluyen sobre la superficie y contienen masas filamentosas con coloraciones verdosas,
moradas y cafés (Fig. la). De estas últimas se tomó una muestra el 8 de diciembre de 2004,
al tiempo que se midió el pH, la temperatura y la conductividad. Estas aguas cristalinas
confluyen formando un riachuelo cuyos parámetros físico-químicos se determinaron en
laboratorios del Instituto Costarricense de Electricidad (ICE) a partir de una muestra
74
recolectada en la misma fecha, utilizándose un cromatógrafo líquido HP 1100 para el
análisis de aniones y un espectrómetro de absorción ·atómica Thermo Elemental SOLAAR
para el análisis de cationes. La muestra de masa filamentosa se fraccionó en tres partes:
una se mantuvo a temperatura ambiente hasta su observación en el microscopio de luz al
día siguiente, otra se congeló en nitrógeno líquido para su transporte y fue guardada a
-70ºC en el laboratorio y la tercera se fijó en solución de glutaraldehído al 2.5% y
paraformaldehído al 2% en amortiguador de fosfatos 0.2M (pH 7.4).
Microscopía: Un día después de recolectada algunos trozos de filamentos y gotas de
la muestra que había sido transportada a temperatura ambiente y sin fijar se observaron en
un microscopio de luz BX41 (Olympus). La muestra que había sido fijada fue procesada
para microscopía electrónica de barrido, siguiendo un procedimiento basado en las técnicas
generales descritas por Bozzola & Russel (1992). Se tomó aproximadamente un mililitro
de muestra, incluyendo una pequeña porción de la masa filamentosa que debido a la
resistencia y longitud de los filamentos debió ser cortada con tijera, se centrifugó por 5min
a 3000rpm y se eliminó el sobrenadante. Este mismo paso de centrifugación se realizó
entre cada uno de los lavados y cambios de disolución indicados a continuación: lavado en
amortiguador de fosfatos O.lM (pH 7.4), postfijación con Os04 al 1%, lavado en agua
destilada, deshidratación en serie ascendente de etanol (30 a 100%) y lavado en terbutanol,
tras lo cual la muestra se cubrió nuevamente. con terbutanol y se congeló a -20ºC.
Posteriormente la muestra se secó por sublimación en un secador a presión reducida Freeze
Dryer VFD-20 (Vacuum Device Inc.), se montó en una base de aluminio para el
microscopio empleando cinta adhesiva de carbón, se recubrió con aproximadamente 30nm
de oro en un cobertor iónico IB-3 (Eiko) y se observó en un microscopio electrónico de
barrido S-570 (Hitachi) a 15kV.
Extracción y purificación de ADN: Después de realizar varias pruebas se optó por
aplicar un procedimiento basado en el descrito por Barns et al. (1994), con modificaciones
que incluyeron el uso de amortiguador de fosfatos, EDTA y la variación de las
concentraciones de algunos componentes de las soluciones.
La muestra que estaba
75
congelada a -70ºC se descongeló y se tornaron aproximadamente 250rng, a los cuales se le
añadieron O.SrnL de amortiguador (0.12M fosfatos pH 8, O.lM Tris, O.lM EDTA y O.lM
NaCl), después de agitar se agregaron 150µL de solución de lisozirna 50rng/rnL, se agitó y
se incubó una hora a 37ºC con agitación ocasional. Posteriormente se añadieron lOOµL de
SDS al 20% y 30µL de proteinasa K 20rng/rnL, se agitó y se incubó a 55ºC por hora y
media, agitando ocasionalmente. Se aplicaron tres ciclos de 10rnin en nitrógeno líquido y
1Ornin en un baño a 80ºC. Se centrifugó 5rnin a 1O OOOrprn y el sobrenadan te se pasó a un
nuevo tubo.
Se realizó una extracción con un volumen de fenol-cloroformo-isoarnilo
(25:24:1) y después se hizo otra extracción con un volumen de cloroformo-isoarnilo (24:1).
La fase acuosa se pasó a un nuevo tubo y se aplicó el procedimiento de purificación
descrito por Ograrn (1998), para lo cual se añadió 1/10 de volumen de NaCl 5M y 1/10 de
CTAB al 10% en NaCl 0.7 M y después de mezclar se incubó a 65ºC durante 10rnin.
Luego se realizó una extracción con un volumen de cloroformo-isoarnilo (24:1).
Posteriormente se añadió un volumen de polietilenglicol al 13% en NaCl 1.6M, se agitó e
incubó en hielo durante 10rnin. · Se centrifugó a 13 200rprn durante 15rnin y se descartó el
sobrenadante. El botón se lavó con 200µL de etanol al 70% y una vez seco se disolvió en
50µL de TE {pH 8). Después se añadió Vi volumen de acetato de amonio lOM y se incubó
en hielo durante 20rnin, tras lo cual se centrifugó por 10rnin a 13 200rprn y se trasladó el
sobrenadante a un nuevo tubo. Se precipitó añadiendo dos volúmenes de etanol absoluto,
se centrifugó 15rnin a 13 200rprn y se descartó el sobrenadante. El botón se lavó con
200µL de etanol al 70% y una vez seco se disolvió en 50µL de TE (pH 8).
PCR y construcción de bibliotecas: Los genes ADNr 16S de la comunidad fueron
amplificados mediante PCR utilizando los oligonucleótidos específicos para Archaea
Ar109f (5'-ACKGCTCAGTAACACGT-3') y Ar912r (5'-CTCCCCCGCCAATTCCTTTA3') (GroBkopf et al. 1998, rnodicados por Lueders & Friedrich 2000) y los oligonucleótidos
específicos para Bacteria 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') y 907R (5'CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3') (Lane 1991). La mezcla de reacción fue de 50µL con
la siguiente composición: amortiguador Taq con KCl sin MgCI2 (Taq Buffer + KCI -MgCl2,
76
Fermentas) lX, l.25mM de MgCh (Fermentas), 200µM de cada dNTP (Promega), 0.4µM
.
de cada oligonucleótido, lU de Taq ADN polimerasa recombinante (Fermentas) y lµL de
una dilución 1/10 del ADN blanco. Las reacciones se incubaron en un termociclador PT100 (MJ Research, Inc.) iniciando con 4min a 94ºC, seguido por 35 ciclos de 30s a 94ºC,
30s a SOºC y 90s a 72ºC, y un paso final de lOmin 72ºC. Los productos fueron purificados
utilizando el sistema Wizard de purificación de ADN a partir de geles y de reacciones de
PCR (Wizard® SV-Gel and PCR Clean-Up System de Promega) y luego fueron ligados al
vector haciendo uso del sistema de vector pGEM-T (pGEM®-T Vector System de
Promega), con una razón inserto:vector de 2:1 y de acuerdo a las instrucciones del
fabricante.
Para la transformación en E. coli JM109 (Promega), así como para el
aislamiento de los plásmidos recombinantes, se siguieron los procedimientos descritos por
Sambrook et al. (1989).
Análisis de los clones mediante RFLP: Los insertos de ADNr fueron reamplificados
a partir de los plásmidos recombinantes utilizando oligonucleótidos para pUC/Ml3 y el
procedimiento ya descrito.
Los productos de PCR fueron digeridos mediante dos
digestiones dobles separadas combinando AluI con Hin6I y MspI con BsuRI (Fermentas),
en reacciones de 20µL con lOU de cada enzima, amortiguador Tango™ 2X (Fermentas) y
lOµL de producto de PCR sin purificar. Las reacciones se incubaron 1 hora a 37ºC. Los
fragmentos digeridos fueron separados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% y
visualizados mediante tinción con bromuro de etidio y luz ultravioleta. Los patrones de
restricción observados para cada biblioteca fueron comparados visualmente entre sí y se
agruparon en ribotipos considerando patrones de restricción idénticos. Posteriormente un
representante de cada grupo fue seleccionado al azar para la secuenciación.
Secuenciación:
Los productos de PCR seleccionados para secuenciar fueron
purificados con el sistema Wizard de purificación de ADN a partir de geles y de reacciones
de PCR (Wizard® SV-Gel and PCR Clean-Up System de Promega), de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
Las reacciones de amplificación para la secuenciación
estuvieron compuestas por 20ng de ADN, 4µL de la mezcla de reacción Big Dye®
77
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Mix de Applied Biosystems, 2µL de
amortiguador de secuenciación 5X (Applied Biosystems), 2µL de solución l.6µM del
oligonucléotido y agua hasta completar un volumen de 20µL. Para la biblioteca de Archaea
se utilizaron los oligonucleótidos Ar109f y Ar912r, mientras que para la biblioteca de
Bacteria se utilizaron los oligonucleótidos 27F y 907R. Las secuencias de nucleótidos
fueron determinadas en un secuenciador Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Análisis de las secuencias:
Las secuencias fueron ensambladas, revisadas y
corregidas en el programa BioEdit Sequence Alignment Editor v7.0.5.2 (Hall 1999) y luego
comparadas con las bases de datos disponibles con el fin de estimar su afiliación
filogenética, para lo cual se utilizó la herramienta Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul et al. 1997). Las secuencias
quiméricas
se
detectaron
mediante
el
programa
(http://rdp.cme.msu.edu/cgis/chimera.cgi?su=SSU)
del
CHIMERA_CHECK
Proyecto
Base
de
v2.7
Datos
Ribosomales 11 (Cole et al. 2003). Las secuencias de Santa María y algunas secuencias
relacionadas según el análisis BLAST se alinearon utilizando el programa CL USTAL X
vl.83 (Thompson et al. 1997).
Haciendo uso del paquete informático PHYLIP v3.66
(Felsenstein 1989) se construyeron filogramas a partir de los alineamientos, asumiendo una
tasa transición/transversión de 2.0 y utilizando dos métodos: el de unión de vecinos
(neighbor-joining) (Saitou & Nei 1987) aplicando el modelo de dos parámetros de Kimura
(Kimura 1980) y el de probabilidad máxima (maximum likelihood). La confiabilidad de las
topologías inferidas fue determinada a partir de 1 000 seudoréplicas de cada alineamiento.
Números de adquisición de la secuencias: Las secuencias parciales de ADNr 165
obtenidas en este estudio están disponibles en la base de datos de GeneBank mediante los
números de adquisición GQ141767 a GQ141804.
78
RESULTADOS
Características de la muestra:
La muestra recolectada estaba constituida en su
mayoría por una masa de filamentos de color verde oscuro (Fig. la) y por agua turbia
debido a la presencia de un sedimento también de color verde oscuro, presentando un pH de
2.41, una temperatura de 27.3ºC y una conductividad de 2870µS/cm.
Además, se
determinaron algunos parámetros físico-químicos del agua del riachuelo contiguo al sitio de
colecta de la muestra: temperatura 20.3ºC, pH 3.14, conductividad 400µS/cm, Na+ 3.Sppm,
K+ 2.9lppm, Ca2+ 6.03ppm, Mg2+ 2.4ppm, Fe total 3.15ppm, c1- Sppm, SOi- 140ppm, NH3
l.29ppm, As l.66ppm, Si0 2 44ppm y sólidos totales disueltos 249ppm.
Microscopía: Al obseivar los filamentos en el microscopio de luz se distinguieron
extensas cadenas uniseriadas y no ramificadas, formadas por células cilíndricas que medían
entre 19 y 25µm de largo y entre 16.5 y 18µm de ancho, además, parecían contener dos
cloroplastos en forma de huso (Fig. lb y le). El sedimento de la muestra estaba constituido
por diatomeas pennadas de formas rectangulares y ovaladas (Fig. le), así como euglenas
que se desplazaban con su particular movimiento euglenoide de contracción y expansión
(Fig. lf). En el microscopio electrónico de barrido las algas filamentosas presentaron un
aspecto rugoso debido posiblemente a alteraciones sufridas durante el procesamiento de la
muestra (Fig. lk). Junto a estos filamentos se obseivó una gran cantidad de diatomeas (Fig.
ld, lh y lk), algunas euglenas con forma de huso que presentaban su característico sistema
de estrías o mionemas recorriendo la superficie celular (Fig. lg y lh) y gran cantidad de
células procariotas, entre las cuales predominaban las de forma bacilar (Fig. li). También
estaban presentes células de tamaño similar al de las diatomeas, que en su mayoría
presentaban forma de bacilo aunque algunas eran redondas (Fi. lj), sin embargo, estas
células no fueron obseivadas en el microscopio de luz.
Análisis de genes ADNr 16S: Los genes ADNr 16S fueron amplificados a partir del
ADN total obtenido de la muestra. Con los oligonucléotidos 27F y 907R específicos
80
Fig. l. Comunidad microbiana creciendo en aguas ácidas de Pailas Frias, sector Santa María del Parque
Nacional Volcán Rincón de la Vieja. (a) Superficie donde fluyen aguas procedentes de una fuente ácida
presentando una masa filamentosa de color verde, de la cual se tomó la muestra para el estudio (inserto). (b,
c, e, f) Microorganismos revelados mediante microscopía de luz. (b) Alga filamentosa (barra = lOµm). (c)
Masa de algas filamentosas (barra= 20µm). (e) Diatomeas (barra =20 µm). (f) Euglena sp. (barra= lOµm).
(d, g, h, i, j, k) Microorganismos observados mediante microscopía electrónica de barrido. (d) Diatomeas
(barra = Sµm). (g) Euglena sp. en la cual se aprecian algunas estrías de la superficie celular (barra = Sµm).
(h) Euglena sp. mostrando estrias en la superficie celular, así como dos diatomeas (barra = Sµm). (i) Grupo
de bacilos (barra = lµm).
Ü)
Grupo de células, algunas de forma bacilar y otras esféricas (barra = 12.Sµm).
(k) Vista general de la comunidad microbiana en la cual se aprecian filamentos de forma rugosa y gran
cantidad de otras células que en su mayoría corresponden a diatomeas (barra= 88µm).
Fig. l. Microbial community thriving in acidic waters from Pailas Frias, Santa María sector of Rincon de la
Vieja Volcano National Park. (a) Filamentous green mass growing in surface acidic waters where the sample
was taken for this study (inset). (b, c, e, f) Microorganisms revealed by menas of light microscopy. (b)
Filamentous alga (bar= lOµm). (c) Mass of filamentous algae (bar= 20µm). (e) Diatoms (bar= 20 m). (f)
Euglena sp. (bar = lüµm).
(d, g, h, i, j, k) Microorganisms observed by means of scanning electron
microscopy. (d) Diatoms (bar = Sµm). (g) Euglena sp. showing sorne pellicle strips on cell surface (bar =
Sµm). (h) Euglena sp. exhibiting pellicle strips on cell surface, and two diatoms (bar= Sµm). (i) A group of
bacilli (bar = lµm).
Ü)
A group of cells, sorne bacillary and others spherical in shape (bar = 12.Sµm). (k)
General view of the microbial community. There are wrinkled surface filaments and and lots of other cells
that mostly correspond to diatoms (bar= 88µm).
para el dominio Bacteria se
obtuvo un único
81
producto de amplificación de
aproximadamente 900pb. Con los oligonucleótidos Ar109f y Ar912r específicos para el
dominio Archaea también se obtuvo un único producto de aproximadamente 800pb. Los
productos de amplificación fueron purificados y ligados en el vector, obteniéndose una
biblioteca de Bacteria para la cual se analizaron mediante RFLP 102 clones, de los cuales
cuatro correspondieron a quimeras y fueron eliminados del análisis posterior. En cuanto a
la biblioteca de Archaea, fueron analizados mediante RFLP 133 clones. A los clones de la
biblioteca de Bacteria se les asignó el código R0423B (Cuadro 1) y a los de la biblioteca de
Arquea el código R0423A (Cuadro 2).
Al analizar mediante RFLP los 98 clones de la biblioteca de genes ADNr 16S de
Bacteria se obtuvieron 23 ribotipos diferentes: tres incluyeron 54, 14 y 6 clones
respectivamente, en tanto que cuatro fueron de dos clones y 16 estuvieron constituidos por
un solo don. Se tomó un representante de cada uno de estos ribotipos para secuenciar,
obteniéndose secuencias de entre 412 y 835pb, las cuales fueron revisadas y corregidas
comparándolas con sus respectivos electroferogramas y luego su afiliación fílogenética fue
establecida haciendo uso del BLAST.
Nueve secuencias de la biblioteca de Bacteria,
representantes de 67 clones, correspondieron a cloroplastos, mientras que las 14 secuencias
restantes, representantes de 31 clones, pertenecían a organismos propios del domino
Bacteria (Cuadro 1).
En cuanto a las secuencias correspondientes a cloroplastos, seis de ellas, representantes
de 59 clones, mostraron similitudes de 98-99% con una secuencia correspondiente a un
don de una diatomea pennal. Dos secuencias, representantes de siete clones, mostraron un
97% de similitud con una secuencia correspondiente a Euglena mutabilis. Una de las
secuencias, representante de un solo don, mostró 95% de similitud con el cloroplasto del
alga Zygnema circumcarinatum (Cuadro 1). Los análisis filogenéticos mediante máxima
probabilidad y vecino más cercano fueron consistentes en agrupar las secuencias de la
comunidad microbiana de Santa María dentro de tres grupos diferentes de organismos
fotosintéticos. El primero de estos grupos coloca a seis de las secuencias de Santa María
juntas en un subgrupo cercano a las diatomeas Naviculales (Bacillariophyta). El segundo
82
CUADRO 1
Inventario de la biblioteca de ADNr 165 de cloroplasto y Bacteria organizado en ribotipos de acuerdo a los
patrones de RFLP y al resultado del BLAST
TABLE 1
Inventory of chloroplast and Bacteria 165 rDNA library ribotypes according RFLP pattems and BLAST results
Secuencia más cercana según
BLAST (No. adqusición)
% similitud con
secuencia más cercana
Bacillariophyta
Cloroplasto de diatomea
pennal CCAP 1008/1
(FJ002185)
99
99
99
98
99
99
6
1
Euglenales
Euglena mutabilis cepa SAG
1224-9b (AY626044)
97
97
R0423B69
1
Zygnematales
Zygnema circumcarinatum
(AY958086)
95
R0423B53
R0423B72
14
1
1
Bacteria no cultivada don
fg7 de filamentos
macroscópicos flotantes del
extremadamente ácido Rio
Tinto (DQ303265)
99
99
R0423B47
Acidiphi/iumc
(Acetobacteraceae:
a-Proteobacteria)
Acetobacteraceae
(a-Proteobacteria)
R0423B35
1
Acidiphiliumd
(Acetobacteraceae:
a-Proteobacteria)
Bacteria no cultivada don
TRB3 de drenaje ácido de
mina (AF047648)
97
R0423B45
R0423B38
R0423B88
2
1
1
Acetobacteraceae'
(a-Proteobacteria)
Bacteria no cultivada don
M5-G2 de intestino de
Agrilus planipennis, un
escarabajo invasivo
perforador de madera
(EU148696)
95
95
95
99
Planctomycetes
Bacteria no cultivada don
ERF-F6 de rizosfera de
planta adaptada a drenaje
ácido de mina (DQ906078)
Proteobacteria
Bacteria no cultivada don
QBS9 de drenaje ácido de
una mina de cobre
(DQ840470)
Clon
representanteª
No. de
clonesb
R0423B36
R0423B7
R0423B21
R0423B56
R0423B84
R0423B87
54
1
1
1
1
1
R0423B68
R0423B269
R0423Bl0
R0423B12
2
2
Afiliación
microbiana
94
98
83
R0423B13
2
Acidobacteria
Bacteria Acidobacteriaceae
don Tharsl de drenaje de
mina de cobre abandonada
(EF219138)
R0423B86
1
Acidobacteria
Bacteria no cultivada don
El 52 de un depósito
volcánico (FJ466347)
98
R0423B37
1
·?
¿.
Bacteria no cultivada don
3BCL88 de agua de
hemodiálisis (AM087547)
89
1
~-Proteobacteria
Thiobacillus sp. ML2-40 de
un estudio sobre la estructura
de una comunidad
microbiana de una fuente
azufrada (DQ145974)
94
R0423B244
1
·?
¿.
Bacteria no cultivada don
SBNBlClO detectado en
sedimento de laguna ácida de
mina (FJ228239)
98
Total de clones
98
R0423B89
98
ª Clon secuenciado.
b
Agrupados según patrones de RFLP.
e
Deducido ya que Acidiphilium sp. cepa N0-17 (No. adquisición AF376026) estuvo entre las secuencias más
cercanas con 99% de similitud.
d
Deducido ya que Acidiphilium rubrum cepa ATCC 35905 (No. adquisición D30776) estuvo entre las
secuencias más cercanas con 97% de similitud.
e
Deducido ya que una secuencia bacteriana de la familia Acetobacteraceae don AhedenU14 (No. adquisición
FJ475408) estuvo entre las secuencias más cercanas con 95% de similitud.
84
CUADR02
Inventario de la biblioteca de ADNr 165 de Archaea organizado en ribotipos de acuerdo a los patrones de
RFLP y al resultado del BLAST
TABLE 2
Inventory of Archaea 165 rDNA library ribotypes according RFLP patterns and BLAST results
Clon
representante"
No. de
clonesb
R0423Al43
59
R0423A218
24
R0423A302
7
R0423A316
1
R0423A331
1
93
R0423A164
18
86
R0423A171
R0423A169
R0423A339
R0423A343
R0423A345
10
2
1
1
1
Euryarchaeota
R0423A211
5
Euryarchaeota
Euryarquea acidofílica don
ARMAN-2 (DQ848677)
R0423A217
R0423A293
Euryarchaeota
1
Arquea no cultivada don
SPS31 de estudio sobre
poblaciones metanogénicas
en un pantano de turba ácida
(AJ606277)
R0423A224
1
Total de clones
133
Afiliación
microbiana
Secuencia más cercana según
BLAST (No. adquisición)
% similitud con
secuencia más cercana
90
• Euryarchaeota
·?
<'..·
Arquea no cultivada don
SnDF3 de turba de un
pantano boreal (AM905392)
Arquea no cultivada don
SnD05 de turba de un
pantano boreal (AM905420)
Arquea no cultivada don
SK347 de aguas de fuente
termal (DQl 79033.2)
93
85
93
86
86
87
86
86
85
90
90
89
ª Clon secuenciado.
b Agrupados según patrones de RFLP.
grupo ubica dos secuencias de este estudio juntas entre sí y cercanas en primer lugar a
Euglena mutabilis y en segundo lugar a Euglena deses.
La secuencia de cloroplasto
restante se ubica muy cercana a un don de un fotótrofo no cultivado de un riachuelo ácido
85
rico en metales, y cercana en segundo lugar a la especie de algas filamentosas Z.
circumcarinatum, las cuales a su vez forman un subgrupo emparentado con el alga
unicelular Staurastrum punctulatum (Fig. 2).
En cuanto a las secuencias propias del dominio Bacteria, diez de ellas, representantes
de 26 dones, presentaron similitudes de entre 94 y 99% con secuencias correspondientes a
clones bacterianos que, según los datos depositados en las bases de datos examinadas
mediante BLAST, proceden de varios ambientes ácidos, un depósito volcánico y una fuente
azufrada. Tres secuencias, representantes de cuatro clones, mostraron 95% de similitud con
un don de bacteria procedente del intestino de un escarabajo perforador de madera,
mientras que una secuencia representante de un solo don mostró solo 89% de similitud con
un don procedente de agua de hemodiálisis (Cuadro 1).
Los análisis filogenéticos
mediante máxima probabilidad y vecino más cercano agruparon las secuencias de Santa
María y sus secuencias más cercanas según el BLAST en siete grupos principales. En dos
de estos grupos no se obtuvo una asociación filogenética clara: uno de ellos fue el formado
por la secuencia R0423B37 y el don procedente de agua de hemodiálisis, mientras que el
otro fue el grupo formado por la secuencia R0423B244 y el don detectado en una laguna
ácida de una mina. De los cinco grupos restantes uno de ellos correspondió al grupo
filogenético Acidobacteria e incluyó dos secuencias de Santa María y clones obtenidos de
drenajes ácidos de mina, un suelo de pastizal y un depósito volcánico. Otro grupo fue el de
los Planctomycetes, que incluyó una sola secuencia de Santa María y un don procedente de
la rizosfera de un drenaje ácido de mina. El tercer grupo fue el de las Acetobacteraceae (aProteobacteria), el cual se dividió en dos subgrupos: el género Acidiphilium con tres
secuencias de Santa María y otro subgrupo con otras cuatro secuencias de Santa María
junto a clones procedentes de ambientes contaminados y del intestino de un escarabajo
perforador de madera.
El cuarto grupo, también de Proteobacteria, fue el del don
R0423B12 y un don aislado de un drenaje ácido de mina. El quinto grupo correspondió a
J3-Proteobacteria e incluyó una secuencia de Santa María cercana al género Thiobacillus
(Fig. 3).
En cuanto a los 133 clones de la biblioteca de genes ADNr 16S de Archaea, al
analizarlos mediante RFLP se obtuvieron 15 patrones de restricción diferentes, según los
cuales se formaron siete ribotipos con 59, 24, 18, 10, 7, 5 y 2 clones.
86
Ocho clones
presentaron patrones de restricción únicos. Se tomó un representante de cada uno de estos
ribotipos para secuenciar, obteniéndose secuencias de entre 510 y 743pb, las cuales fueron
revisadas y corregidas comparándolas con sus respectivos electroferogramas y luego su
afiliación filogenética fue establecida haciendo uso del BLAST.
Cinco secuencias,
representantes de 92 clones, mostraron similitudes de 85-93% con un don de arquea no
cultivada procedente de turba de pantano, mientras que otras seis secuencias, representantes
de 33 clones, mostraron similitudes de 86-87% con otro don de una arquea no cultivada
procedente de la misma turba de pantano. Una secuencia que representaba cinco clones
o
mostró 85% de similitud con el don de la euryarquea no cultivada ARMAN-2, aislada de
un drenaje ácido de mina. Dos secuencias representantes de otros dos clones mostraron
90% de similitud con un don de arquea no cultivada de un pantano de turba ácida. Por
último, una secuencia que representaba a un único don mostró 89% de similitud con un
don procedente de aguas de una fuente termal (Cuadro 2). Los análisis filogenéticos
mediante máxima probabilidad y vecino más cercano agruparon las secuencias de Santa
María y sus secuencias mas cercanas según el BLAST dentro de tres grupos principales,
dos de los cuales se ubicaron dentro del reino Euryarchaeota y el tercero, que contenía una
sola secuencia de Santa María, no tuvo una posición filogenética definida (Fig. 4).
87
R0423B21
R0423B56
R0423B36
R0423B87
R0423B7
1000
R0423B84
Amphora cojfeaeformis CI07 (FJ002183)
Amphiprora paludosa C52 (FJ002240)
Diatomea pennada no clasificada CCAP 1008/1 (FJ002185)
Phaeodactylum tricornutum (EF067920)
Navicula sp. C2 l (FJ002227)
Nm•icula pl~vllepta C 15 (FJ002222)
Euglena mutabilís SAG 1224-9b (AY626044)
1000
~--- R0423B269
~---HJOOR0423B68
Euglena deses SAG 1224-19b (AY626043)
Zygnema circwncarinatum SAG 698-la (AY958086)
R0423B69
!COO
Fotótrofo no cultivado de un riachuelo ácido rico en metales (EF219137)
Staurastrum punctulatum SAG 679-1 (AY958085)
~-- Cyanophora paradoxa Pringsheim LB555 (NC_001675)
0.1
Fig. 2. Filograma de probabilidad máxima (maximum /ikelihood) agrupando las secuencias parciales de ADNr
16S de cloroplasto de Santa María (en negrita) y las secuencias de GeneBank más cercanas según los
resultados de BLAST (números de adquisición entre paréntesis). El alga Glaucophyta Cyanophora paradoxa
fue usada como grupo externo. Los nodos respaldados por los métodos de probabilidad máxima y unión de
vecinos (neighbor-joining) están indicados con círculos cerrados (más de 75% de seudoréplicas) y círculos
abiertos (más de 50% de seudoréplicas). La escala representa el número estimado de cambios por posición.
Fig. 2. Maximum likelihood phylogram of chloroplast 16S rDNA partial sequences from Santa Maria
(bolded) and closest GeneBank sequences according BLAST results (accession numbers between
parenthesis). Glaucophyte alga Cyanophora paradoxa was used as outgroup. Nodes supported by maximum
likelihood and neighbor-joining methods are indicated with closed circles (bootstrap values greater than 75%)
and open circles (bootstrap values greater than 50%). Scale represents estimated number of changes per
position.
88
Bactena oo cultivad• tkm ERF-lB3 de rizod'era de planta adaptada •un drenaje ócido de mina (DQ9(l6053)
"'
Arioobocteriaceae Thlfrsl de drenaje ácido de minae (Ef2191JS')
-
RJl4ZJ:llU
Aci<l®octena don U00()1072)8d< suelo departiza! de i. Amawnu {FJ037276)
..., Lr Bacteria no culti...-ada don E152 de un depósito 1,;·okánico (TJ4f6347)
"'L RD4!31186
~--R.04!31137
'------
S.cteri>no rultív>d! d"" 3BCL88 de agua de bemodiálisi• (AMOS7547)
RO-l23B?44
Bacteria ao cultivado <km SBNB l C1 O de <edimenro p1ocedente de tm lago ácido de mina (FJ22S239)
_ Rll4?3B!O
Batteria no eulliv><l> oou ERF-F6 de n__=rera de planta ad"Pmda • un drenaje kldo de mina (j}Q9C©78)
- - Plaoctom)''Cete no cu1ti1lad.-o ci-On Csp 1911 del m.t-estino de la renn.ira comeOOra de ~nelo Cubitermgs: !p (.AM7 74208)
Arnliphili•m q:. N0-17 (AFJ76-026)
Bacreria no cruti~'arla don fg7 de Río IIDto, un rio ácido (DQ303265)
R04?3B72
R04!3B!'3
Bacteria no <:nltivado don TRB3 de drenaJ• acido de mma {AFO-F648)
R04:23BJS
r
~----~-o
.fodipiiilium ro!>ntm ATCC 35905 0-"R_015&S4)
;.-¡~ R04?3B45
R0413B88
"'
Jr
l y
~1
R04!3B3S
111':',1 B>tcteri!- uo crtltivad!. dooi F5 7_Pire.~ri de
n.
sllf"io cun.!2'mmadoQ- ron .aceite (DQ3 78219)
Blict-ena no .cultivada don \\:U295 de :meW coo':mim>ldo GJll bdenit polidorinado (AJ:'!9 ~tt06)
l Bacteria no cultivad.a dan M5-G2 dfl intestino det e~ar~lrnjo Agrilm plantpnmts (EU14B696)
R04Z.'B47
r----~-=. Bacteria no cu!ti\•ada den QBS.9 de drena_¡e OCido de mina (DQS~fi47ü)
RO.!ZJBIZ
~---~._.
• .--Thwbaciilu; sp Ml..240
(DQ145974)
R04!3BS9
~----------Aq>•ífn
pymphüuz Kol 5a (MB3548)
0.l
Fig. 3. Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las secuencias parciales de ADNr
16S de Bacteria de Santa María (en negrita) y las secuencias de GeneBank más cercanas según los resultados
de BLAST (números de adquisición entre paréntesis). Aquifex pyrophilus fue usado como grupo externo.
Los nodos respaldados por los métodos de probabilidad máxima y unión de vecinos (neighbor-joining) están
indicados con círculos cerrados (más de 75% de seudoréplicas) y círculos abiertos (más de 50% de
seudoréplicas). La escala representa el número estimado de cambios por posición,
Fig. 3. Maximum likelihood phylogram of Bacteria 16S rDNA partial sequences from Santa Maria (bolded)
and closest GeneBank sequences according BLAST results (accession numbers between parenthesis).
Aquifex pyrophilus was used as outgroup. Nodes supported by maximum likelihood and neighbor-joining
methods are indicated with closed circles (bootstrap values greater than 75%) and open circles (bootstrap
values greater than 50%). Scale represents estimated number of changes per position.
89
Arquea no cultivada don SnDF3 de turba de pantano (AM9g5392)
621
R0423A331
R0423A316
""' R0423A21S
R0423Al43
Emyarquea no cnllivada clon ARMA.~-2 de drenaje ácido de mina (DQ848677)
Arquea no cultivada clon SnD05 de turba de pantano (AM90S420)
Arquea no cultivada clon MBOJ_40 de pantano de turba ácido (EF153140)
Arquea no cultivada don SPS45 de pantano de turba ácido (AJ606291)
1000
Arquea no cultivada don SPS31 de pa:ntano de lmba ácido {AJ606277)
R0423A2l1
~t----
R0423A217
R0423A343
932
R04.23Al39
R0423Al64
R0423Al7l
R0423Al69
,OOG
t-----•
000
-
Arquea no cultivada don SKI 54 de fuente tennal. del Parque Nacional Y ellowstone (AYS827 l l)
Arquea no cultivada clon SK.347 de fuente tmna1 de Parque Nacional Yellowstone (DQl 79033)
R0423A124
~--------
Sulfoiolms solfatarints (X03235)
O)
Fig. 4. Filograma de probabilidad máxima (maximum likelihood) agrupando las secuencias parciales de ADNr
16S de Archaea de Santa Maria (en negrita) y las secuencias de GeneBank más cercanas según los resultados
de BLAST (números de adquisición entre paréntesis). El crenarqueota Sulfolobus solfataricus fue usado
como grupo externo. Los nodos respaldados por los métodos de probabilidad máxima y unión de vecinos
(neighbor-joining) están indicados con círculos cerrados (más de 75% de seudoréplicas) y círculos abiertos
(más de 50% de seudoréplicas). La escala representa el número estimado de cambios por posición.
Fig. 4. Maximum likelihood phylogram of Archaea 16S rDNA partial sequences from Santa Maria (bolded)
and closest GeneBank sequences according BLAST results (accession numbers between parenthesis).
Crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was used as outgroup. Nodes supported by maximum likelihood and
neighbor-joining methods are indicated with closed circles (bootstrap values greater than 75%) and open
circles (bootstrap values greater than 500/o). Scale represents estimated number of changes per position.
90
DISCUSIÓN
La comunidad microbiana estudiada en Pailas Frías del sector Santa Maria del Parque
Nacional Volcán Rincón de la Vieja habita un ambiente extremo en relación al pH (valor
2.41) y a la concentración de iones disueltos (conductivad de 2870µS/cm). La composición
de iones seria variada con predominio de
Soi- si se asume que es similar a la del agua del
riachuelo contiguo al sitio de recolección de la muestra.
Con respecto a su composición biológica, la comunidad presentó un predominio de
eucariotas fotosintéticos formando largas cadenas de células que constituían los filamentos
observados microscópicamente (Fig. lb y le).
Estos filamentos uniseriados, no
ramificados y formados por células cilíndricas, son típicos de las algas Zygnematales,
grupo dentro del cual el género Zygogonium se caracteriza por poseer dos doroplastos de
forma ahusada por célula. Además, este género de Zygnematales tiene preferencia por
hábitats acuáticos ácidos (pH 2.4-4.5) y se sabe que forma masas flotantes en estanques
cercanos a fuentes termales del Parque Nacional Yellowstone (Estados Unidos), además se
ha reportado en lagos afectados por_ lluvia ácida y en riachuelos con pH<3 influenciados por
drenajes ácidos de mina (Gerrath 2003). En la biblioteca de ADNr 16S se encontró un don
que mostró un 95% de similitud con el cloroplasto de una especie del género Zygnema
(Cuadro 1), sin embargo, esta aparente incongruencia se explica por el hecho de que éste
género es muy similar a Zygogonium y a que no existen secuencias de doroplasto de
Zygogonium en la base de datos del GeneBank. El análisis filogenético ubica claramente a
la secuencia detectada en Santa Maria junto a un fotótrofo no cultivado proveniente de un
riachuelo ácido rico en metales (Fig. 2), lo cual no es extraño dada la composición química
de la muestra en estudio. Ambas secuencias se encuentran relacionadas con el género
Zygnema, formando un grupo cercano a Zygnematales unicelulares del género Staurastrum
(Gerrath 2003). El hecho de que se encontrara un solo don de este grupo, siendo el más
abundante en la comunidad, se debe posiblemente a que el procedimiento de extracción de
ADN no fue capaz de romper sus paredes celulares, de manera que la cantidad de ADN
liberado pudo ser menor que la liberada por las células de los demás grupos microbianos.
Otros eucariotas fotosintéticos presentes en gran número en la muestra fueron las
diatomeas pennadas (Bacillariophyta) (Fig. ld, le, lh y lk).
91
Las observaciones al
microscopio permitieron detectar la presencia de células con dos valvas y con simetría
bilateral características de este grupo (Stoermer & Julius 2003). La existencia de Si02
disuelto en el agua sería una de las razones que permitiría su desarrollo, pues el silicio es la
materia prima para la formación de la frústula o pared celular silícea (Bates & Trainer
2006).
No se puede realizar una identificación certera de la especie o especies de
diatomeas presentes en esta comunidad hasta no digerir la materia orgánica de las células y
observarlas en preparación fija (Stoermer & Julius 2003), con el fin de identificar algunas
características taxonómicas de la pared celular, sin embargo, los datos que se lograron
recolectar en este estudio hacen pensar que el género Pinnularia está presente por dos
razones: la presencia de estrías similares a las presentadas por este género en la pared
celular de una de las células observadas en el microscopio electrónico de barrido (Fig. ld) y
la preferencia que tienen los miembros de este grupo taxonómico por aguas ácidas
(Kociolek & Spaulding 2003, Wehr & Sheath 2003). El género Pinnularia se ha reportado
en lagos volcánicos ácidos ricos en azufre con pH entre 2.2 y 3 en Japón (Battarbee et al.
1999), en la superficie de depósitos silíceos de fuentes termales sulfatadas con pH
ligeramente superior a 2 en Nueva Zelanda (Schinteie 2007) y en una comunidad
microbiana endolítica de un ambiente ácido {pH 1-2) ubicado a tan solo unos metros de
donde se recolectó la muestra del presente estudio en Pailas Frías del sector Santa María
(Hemández-Chavarría & Sittenfeld 2006).
El análisis filogenético agrupó todas las
secuencias de diatomeas de Santa María junto con otras diatomeas pennadas que no son
usualmente encontradas en ambientes ácidos y cuya morfología es ligeramente diferente a
la observada en las diatomeas de Santa María (Cuadro 1 y Fig. 2), lo cual se explicaría por
la ausencia de secuencias de ADNr 16S de cloroplasto de diatomeas acidófilas en la base de
datos examinada mediante BLAST.
El tercer grupo en abundancia en lo que respecta a eucariotas fotosintéticos fue el de
las euglenas.
Los ejemplares observados en la muestra presentaban su característico
movimiento euglenoide; por otro lado, las observaciones en el microscopio electrónico de
barrido evidenciaron los mionemas característicos de la superficie celular de estos
organismos y, además, no hubo evidencia de flagelo (Fig. lf, lg y lh). A simple vista las
92
euglenas observadas en el microscopio de luz mostraban similitud morfológica con
Euglena mutabilis, la cual es una especie que puede no mostrar flagelo emergente y que
está distribuida en ambientes altamente ácidos con pH de hasta 1.5, habiendo sido ya
descrita en el Río Agrio (pH 2.3) en Costa Rica (Rosowski 2003, Wehr & Sheath 2003). El
hecho de que no presente flagelo y de que se encuentre dentro de los límites del Parque
Nacional Volcán Rincón de la Vieja hace pensar que puede tratarse de Euglena pailasensis,
una especie terrnotolerante, carente de flagelo, que presenta morfología similar y está
emparentada con E. mutabilis, descrita en pozos de barro ácido y caliente llamados Pailas
de Barro, ubicados a algunos kilómetros de distancia de Pailas Frías (Sittenfeld et al. 2002,
Sánchez et al. 2004, Sittenfeld et al. 2004).
El análisis de BLAST y los análisis
filogenéticos mostraron que las secuencias de euglena de Santa María son muy cercanas a
E. mutabilis (Cuadro 1 y Fig. 2), sin embargo, no se pudo establecer relación filogenética
con E. pailasensis debido que no existen secuencias de ADNr 16S de cloroplasto de esta
última.
De lo anterior se resume que existen tres grupos predominantes de eucariotas
fotosintéticos que constituirían los productores primarios principales de la comunidad, lo
cual está bien apoyado por el análisis filogenético y coincide con lo visto al microscopio, en
donde se observaron infinidad de diatomeas, euglenas similares a E. mutabilis y a E.
pailasensis y algas filamentosas similares al género Zygogonium. Otro ejemplo de una
comunidad de un ambiente extremadamente ácido (pH
~2),
donde han sido encontradas
diatomeas, Euglena mutabilis y un Zygnematal, es el Río Tinto en España (López-Archilla
2005), indicando que esta composición microbiana es común en ambientes de este tipo.
Las células bacilares y redondeadas de tamaño similar al de una diatomea, vistas solo en el
microscopio electrónico de barrido (Fig. lj), no se identificaron debido a que no se
detectaron en el microscopio de luz y a que no se obtuvieron clones que las representaran,
sin embargo, por su gran tamaño es probable que correspondan a algún tipo de eucariota.
En estudios posteriores se podría poner especial atención a este grupo de células para su
respectiva identificación. Un grupo eucariota cuya presencia no fue detectada en este
estudio pero que posiblemente estaría presente es el de los hongos, dado que han sido
reportados en ambientes similares como Río Tinto (López-Archilla 2005, Aguilera et al.
93
2007) y drenajes ácidos de mip.a (Das et al. 2009), y son importantes como
descomponedores de materia orgánica en los ecosistemas.
Los 17 clones congruentes con el género Acidiphilium (similitud:;::: 94%) y los cuatro
clones de la familiá Acetobacteraceae (a-Proteobacteria), a la cual pertenece este género
(Cuadro 1), coinciden con el hecho de que ambientes no termales con acidez extrema a
menudo son dominados por miembros de este grupo (Keller &
Zengler 2004).
Acidiphilium sp. es un heterótrofo que tiene la capacidad de respirar compuestos de carbono
reducidos, utilizando hierro férrico como aceptor final de electrones en ausencia o incluso
en presencia de 60% de oxígeno (González-Toril et al. 2003), por lo que se considera que
este género es un descomponedor de la biomasa producida por los autótrofos con los cuales
se encuentra usualmente asociado en comunidades microbianas, tales corno las aguas
extremadamente ácidas y ricas en hierro del Río Tinto en España (López-Archilla 2005,
García-Moyano et al. 2007) o drenajes ácidos de mina (González-Toril et al. 2003). En el
caso de Santa María, Acidiphilum sp. estaría aprovechando el hierro disuelto en el agua de
este sitio y la materia orgánica producida mediante fotosíntesis por Zygogonium sp.,
diatomeas y euglenas.
El género Thiobacillus (p-Proteobacteria), con el cual se relaciona una de las
secuencias detectadas (Cuadro 1), está constituido por organismos quirniolitoautótrofos,
que tienen la posibilidad de oxidar compuestos reducidos de azufre o incluso azufre
elemental para la obtención de energía y han sido aislados en variedad de ambientes, desde
suelos hasta fuentes termales y drenajes ácidos de mina (Kelly et al. 2005). En ambientes
con pH extremo, este género se encuentra asociado habitualmente al género Acidiphilium,
por lo que se ha sugerido que existe una relación mutualística entre ambos (Peccia et al.
2000).
Además de los grupos anteriores se encontró una secuencia de Proteobacteria cuya
relación con organismos cultivados no fue establecida en el análisis realizado, sin embargo,
fue similar a un don aislado a partir del drenaje ácido de una mina de cobre, indicando que
se trataría de un organismo acidófilo o acidotolerante.
El filo Acidobacteria cuenta con muy pocos representantes cultivados y ha sido
detectado mediante secuencias de ADNr 16S en una amplia variedad de ambientes corno
94
suelos, sedimentos y drenajes ácidos de mina ricos en metales, sin embargo, se conoce poco
de su fisiología y ecología (Barns et al. 2007, Rowe et al. 2007). Con base en estudios
genómicos, se ha propuesto que los miembros de este grupo son heterótrofos versátiles que
pueden utilizar desde azúcares simples hasta complejos, tales como hemicelulosa, celulosa
y quitina (Ward et al. 2009), lo cual explicaría su presencia en la comunidad de Santa
María, dada la gran cantidad de celulosa y otros compuestos orgánicos sintetizados por
Zygogonium.
El grupo de los Planctomycetes, representado por dos clones en esta comunidad, es un
filo que parece ser ubicuo en el ambiente, según se deduce de la gran cantidad de
secuencias de ADNr 16S reportadas provenientes de sitios como suelos, sedimentos,
fuentes termales, plantas de tratamiento de aguas residuales, lagos salinos, agua ácida de
pantano y fuentes ricas en compuestos azufrados, lugares de donde además se han aislado
los pocos representantes cultivados de este filo (Fuerst 1995, Elshahed et al. 2007).
Por último, en lo que respecta al dominio Bacteria, se obtuvieron dos secuencias cuya
filogenia no se pudo establecer (Fig. 3), por lo que es posible que pertenezcan a filos aún no
descritos.
Es interesante que muchas de las secuencias bacterianas encontradas en Santa María se
relacionaron con clones aislados de drenajes ácidos de mina, pues la comunidad estudiada
en este trabajo no es tan rica en metales disueltos, indicando que la presencia de estos
organismos en el ambiente no estaría determinada exclusivamente por las altas
concentraciones de iones metálicos, sino más bien por el pH tan bajo y posiblemente por la
presencia de compuestos de azufre.
En cuanto al dominio Archaea, ninguna de las secuencias de Santa María mostró
porcentajes de similitud mayores al 93% con las secuencias de GeneBank (Cuadro 2),
significando que las secuencias de Santa María serían las primeras de su grupo reportadas.
A pesar de lo anterior, todas las secuencias, con excepción de una, se clasificaron
claramente dentro del reino Euryachaeota y se relacionaron con el grupo 2 de Nanoarqueas
Acidofílicas de la Mina Richmond (Archaeal Richmond Mine Acidophilic Nanoorganism o
ARMAN-2), así como con secuencias obtenidas a partir de estudios realizados en pantanos
de turba ácida (Fig. 4).
ARMAN-2 representa un linaje constituido por células muy
95
pequeñas, con tamaños promedios de 244xl 75nm y sin representantes cultivados, que fue
descrito en un drenaje ácido de la mina Richmond (Iron Mountain, California, EEUU), rico
en metales como el hierro procedente de la disolución de pirita (FeS2), en condiciones de
pH de 0.5 a 1.5 y temperaturas de 30 a 47ºC. Otros miembros de esta rama filogenética
han sido clones detectados en un sitio con temperatura de 78ºC y pH 7 .5, y clones de un
pantano de turba ácida con pH 4.2-4.8, presentando porcentajes de similitud de secuencia
con ARMAN-2 menores al 90% (Baker et al. 2006).
La única secuencia cuya afiliación al reino Euryarchaeota no pudo ser dilucidada en
este estudio presentó similitud de apenas un 89% con una secuencia obtenida de fuentes
termales (Cuadro 2), por lo que correspondería a un grupo versátil en cuanto a sus
temperaturas de crecimiento, ya que Santa María sería un sitio frío en comparación a una
fuente termal.
A partir de estos resultados generales, se concluye que en esta comunidad están
presentes muchos grupos microbianos pertenecientes al dominio Archaea, de los cuales aún
no hay representantes cultivados y cuyas secuencias se están reportando por primera vez en
este estudio, sin embargo, pertenecen a un grupo con gran importancia ambiental ya que al
parecer es ubicuo en ambientes ácidos.
En general, la mayoría de las secuencias obtenidas estuvieron relacionadas con
organismos encontrados también en ambientes ácidos, lo cual indica que la contaminación
con ADN de organismos ajenos a las comunidades microbianas estudiadas no fue un
problema durante la construcción de las bibliotecas.
Hay evidencias que sugieren que la abundancia relativa de genes de ARNr 16S (ADNr
16S) obtenidos mediante PCR refleja razonablemente la abundancia relativa in situ de éstos
(Hugenholtz et al. 1998); sin embargo, existen al menos tres razones por las cuales no se
puede asumir que la abundancia de clones refleje la diversidad o la abundancia relativa de
los microorganismos presentes en la comunidad estudiada. La razón más evidente es el
hecho de que siendo las algas Zygnematales las más abundantes, según se concluye de las
observaciones microscópicas, solo se obtuviera un don correspondiente a estos organismos,
lo cual sería evidencia de una deficiencia en el proceso de extracción de ADN que también
podría aplicar para otros microorganismos que podrían haber estado presentes en la
96
muestra, como por ejemplo hongos. La segunda razón es que el total de clones obtenidos
para cada biblioteca fue relativamente bajo, por lo que no podría considerarse un número
representativo de la comunidad. La tercera es que los oligonucleótidos utilizados, a pesar
de considerarse universales por alinearse con regiones conservadas de la mayoría de
secuencias de las bases de datos, no es seguro que sean útiles para amplificar todos los
genes de ARNr 16S existentes en la naturaleza, dado que los genes de algunos grupos
microbianos poseen secuencias inusuales (Baker et al. 2006).
En resumen, es posible asumir que los organismos eucariotas fotosintéticos
encontrados (zygnematales, diatomeas y euglenas) constituyen los productores primarios de
la comunidad estudiada. Junto a estos organismos fotosintéticos hay bacterias heterótrofas
de la familia Acetobacteraceae y el filo Acidobacteria y bacterias quimiolitoautótrofas del
género Thiobacillus, cuyo metabolismo, en el caso de las primeras, estarla basado en los
compuestos orgánicos derivado del metabolismo de los fotosintéticos, y en el caso de las
segundas, en la utilización de los compuestos de azufre como donadores de electrones. Por
otro lado, también existe la presencia de arqueas relacionadas con euryarqueas acidófilas
aún no cultivadas y cuya fisiología y posibles relaciones ecológicas son aún un misterio.
La descripción realizada será útil para desarrollar futuras investigaciones que estudien
las relaciones ecológicas entre los diferentes microorganismos de la comunidad.
Por
ejemplo, las secuencias obtenidas serían útiles para el diseño de sondas que permitan
realizar estudios de hibridación fluorescente in situ (FISH por sus siglas en inglés), con el
fin de cuantificar la abundancia de los diferentes grupos microbianos descritos. Lo anterior,
sumado al conocimiento de la composición química del sitio, permitirla profundizar en el
papel ecológico jugado por los microorganismos presentes.
Estos resultados incrementan el conocimiento de la biodiversidad de Costa Rica y
contribuyen a incrementar los datos adquiridos en muchas otras investigaciones de este tipo
alrededor del mundo, las cuales buscan evaluar la biodiversidad con el fin de preservar y
tener un entendimiento completo de los recursos naturales, además, constituyen la base para
iniciar la búsqueda de genes u organismos con potencial biotecnológico.
97
RESUMEN
La biodiversidad microbiana costarricense es poco conocida e incluye microorganismos que habitan
ambientes ácidos y son promisorios como fuente de enzimas industriales. Se han descrito algunos de estos
acidófilos en ambientes asociados a los volcanes Poás y Rincón de la Vieja.
Este trabajo describe una
comunidad microbiana de una naciente de aguas ácidas (pH 2.41) y concentraciones altas de iones del sitio
Pailas Frías en el Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, con el objetivo de incrementar el conocimiento
sobre microorganismos acidófilos de Costa Rica. La comunidad se mostraba como una masa de filamentos y
sedimento de color verde. Los microorganismos se observaron mediante microscopía de luz y electrónica. Se
construyeron bibliotecas de ADNr 16S de cloroplasto, Bacteria y Archaea,
s~
agruparon de acuerdo a sus
polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y se secuenció un representante de cada
agrupamiento. Las secuencias se alinearon y se construyeron árboles filogenéticos que evidenciaron varios de
los grupos microbianos presentes. La comunidad estaba dominada por algas Zygnematales, además habían
diatomeas peonadas y células similares a Eug/ena mutabi/is. Las secuencias de ADNr 16S se relacionaron
con organismos y clones de muestras procedentes de ambientes ácidos: las secuencias de cloroplasto
correspondieron con los tres grupos de eucariotas fotosintéticos observados, las secuencias del dominio
Bacteria indicaron la presencia de los grupos Acidobacteria, Planctomycetes, a-Proteobacteria (incluyendo el
género Acidiphilium) y
Euryarchaeota.
~-Proteobacteria,
y las secuencias del dominio Archaea correspondieron al grupo
Estos resultados plantean la existencia de relaciones ecológicas complejas entre
microorganismos con fisiologías y morfologías diferentes.
Palabras clave: acidófilos, comunidad microbiana, diatomeas, Euglena, naciente de agua ácida, Pailas Frías,
Parque Nacional Volcán Rincón de la Vieja, Zygnematales.
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103
Conclusiones generales y perspectivas
CONCLUSIONES GENERALES
l.
Las características fisicoquímicas de los dos hábitats estudiados son propias de
ambientes extremos en cuanto a acidez y concentración iónica, así como temperatura
en el caso de Las Pailas.
2.
Los hallazgos sugieren que en ambas comunidades microbianas los principales
productores primarios son algas eucariotas, dado que en la comunidad de Las Pailas
predominan algas Cyanidiales con presencia de diatomeas pennadas y en la comunidad
de Santa María predominan algas Zygnematales, diatomeas pennadas y Euglena sp.
3.
Pinnularia sp. se encontró en ambas comunidades estudiadas, lo que sugiere que este
género de diatomeas pennadas se adapta a ambientes ácidos tanto calientes como
templados.
4.
En las dos comunidades estudiadas los organismos consumidores de la materia
orgánica producida por las algas son procariotas de los dominios Bacteria y Archaea.
5.
En ninguna de las comunidades se detectaron hongos a pesar de que este grupo
eucariota se ha encontrado en ambientes ácidos similares y sería importante como
consumidor de la gran cantidad de materia orgánica producida por las algas.
Lo
anterior pudo deberse a que su concentración fue baja, a que estuvieron en forma de
levaduras y a que los oligonucleótidos utilizados no fueron aptos para amplificar los
ADNr 16S mitocondriales de este grupo.
6.
La composición química de los dos sitios y las secuencias de ADNr 16S indican que en
ambas comunidades estudiadas existen bacterias quimiolitoautótrofas que estarían
participando en los ciclos del hierro y del azufre.
104
7.
Las secuencias de ADNr 16S emparentadas con las émyarqueas ARMAN-2 que fueron
encontradas en ambas comunidades estudiadas sugieren que este grupo no está
restringido a drenajes ácidos de mina.
8.
Los organismos encontrados en ambos sitios estudiados son una fuente potencial de
enzimas para procesos biotecnológicos realizados a pH bajo.
PERSPECTIVAS
l.
Amplificar segmentos de ADNr 18S a partir de las comunidades microbianas
estudiadas, con el fin de caracterizar mejor los organismos eucariotas encontrados y
tratar de detectar la presencia de hongos.
2.
Realizar estudios metagenómicos que permitan caracterizar mejor los grupos
taxonómicos, detectar nuevos grupos e iniciar la búsqueda de genes de interés
biotecnológico.
3.
Cultivar en el laboratorio aquellos microorganismos identificados en este estudio que
tengan alguna importancia como modelos para entender los mecanismos de resistencia
a pH bajo y que puedan ser fuente de moléculas de interés biotecnológico.
4.
Considerar los datos de este trabajo en los estudios de impacto ambiental de los
proyectos de generación de energía geotérmica que se están desarrollando en el campo
geotermal Las Pailas.