CLART HPV2 v10 Feb 2013 castellano

CLART® PAPILLOMAVIRUS HUMANO 2
GENOTIPADO DE
PAPILLOMAVIRUS HUMANO
MEDIANTE
IDENTIFICACIÓN GENÓMICA
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
1
CLART® HPV2 está bajo la protección de 2 familias de patentes correspondientes a las
solicitudes de Patente Internacional PCT WO2007017699 y WO2011116797. Dichas
familias comprenden miembros que han entrado en fase nacional y regional en distintos
territorios, entre los cuales se incluyen patentes concedidas en España, Rusia, China e
Israel, y solicitudes de patente en tramitación en Europa, Brasil, Canadá, India y Méjico.
CLART® y CLART-Strip® son Marcas Registradas por GENOMICA.
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain
Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
www.genomica.es
Versión 10
Febrero 2013
2
ÍNDICE:
1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
3.1. Reactivos de extracción, purificación y amplificación
3.2. Reactivos de visualización
3.3. Otros componentes
4. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
4.1. Reactivos y material
4.2. Equipos
5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
5.1. Recomendaciones generales
5.2. Precauciones para la visualización
6. TOMA DE MUESTRAS
6.1. Frotis
6.2. Suspensiones celulares
6.3. Tejido fijado en formol e incluido en parafina
7. PROTOCOLO DE TRABAJO
7.1. Extracción del ADN de PVH
7.1.1. Extracción manual
7.1.2 Extracción automática
7.2. Reacción de amplificación
7.3. Visualización del producto amplificado en CLART-Strips® (CS)
8. LECTURA DE RESULTADOS
9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
11. BIBLIOGRAFÍA
12. TABLAS
3
1.
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Atención, ver instrucciones de uso
Fecha de caducidad
Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar a temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4 ºC y 8 ºC
4ºC
-18ºC
Conservar entre –30 ºC y –18 ºC
-30ºC
4
2.
DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
El kit está basado en la amplificación de fragmentos específicos del genoma vírico y su
posterior hibridación con sondas específicas para cada tipo de PVH. CLART®
Papillomavirus humano 2 es capaz de detectar infecciones y coinfecciones de hasta 35
genotipos en un único tubo, lo que conlleva un amplio número de ventajas:
1
2
3
4
Su alta sensibilidad permite la detección de cantidades mínimas de ADN vírico.
La elevada especificidad, al utilizar una secuencia correspondiente a una región
altamente conservada dentro del genoma vírico y sondas de captura específicas
para cada tipo de PVH.
Fácil de estandarizar en un laboratorio hospitalario.
Rapidez, se obtienen los resultados de los análisis en 8 h.
CLART® Papillomavirus humano 2 detecta la presencia de los 35 virus de PVH (6, 11, 16,
18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 70, 71,
72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89) con mayor importancia clínica, en distintos tipos de
muestras humanas (frotis, suspensiones celulares y tejido fijado en formol e incluido en
parafina).
La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de unos 450 pb
dentro de la región L1 del virus por tratarse de una secuencia que está altamente
conservada entre los distintos tipos de PVH. Sin embargo, esta región presenta
suficientes variaciones como para poder diferenciar cada tipo de virus con sondas
específicas. De esta manera, se asegura la especificidad de la detección.
La detección del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante una nueva
plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART® (Clinical Array
Technology). La plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez
muy cómodo y eficaz que consiste en incluir un microarray en el fondo de un pocillo de
placa microtiter (CLART-Strip®.CS) (Figura 1), lo que simplifica todo el proceso de
hibridación y visualización frente a los sistemas de arrays clásicos.
Figura 1. Plataforma CLART-Strip® en forma de tira de 8 pocillos.
5
El sistema de detección con CLART® Papillomavirus humano 2 se basa en la precipitación
de un producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la
hibridación de los productos amplificados con las sondas específicas. Durante la PCR, los
productos amplificados se marcan con biotina. Después de la amplificación, estos
productos se hibridan con sus respectivas sondas específicas que están inmovilizadas en
zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo que se incuba con un conjugado de
estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la estreptavidina con la
biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus
sondas específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto
insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del
microarray en las que ocurre la hibridación (Figura 2).
Sondas sobre array
Producto marcado
biotina
Hibridación
Incubación
con el conjugado
Conjugado
Reacción de revelado
Precipitación
del sustrato
Figura 2: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la
superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A
través de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de
rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la acción de la HRP, produce
un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación.
6
3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
El kit CLART® Papillomavirus humano 2 contiene suficientes reactivos para la
extracción y análisis del ADN de 48 ó 96 muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el kit
se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la temperatura a la que se han de
conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones indicadas de conservación
hasta la fecha de caducidad indicada.
3.1. Reactivos de extracción, purificación y amplificación
• El kit de Extracción y Purificación CLART® Papillomavirus humano 2 se envía a 4ºC o
a temperatura ambiente. La proteinasa K una vez resuspendida debe conservarse
a 4 ºC.
Sus componentes son:
1 Columnas de purificación acopladas a tubos de 2 ml
2 Tubos de 2 ml
3 Buffer T1
4 Buffer B1
5 Buffer B2
6 Buffer B5
7 Buffer BE
8 Buffer BW
9 Etiqueta para Buffer B3
10 Proteinasa K liofilizada
11 Buffer PB
• Los reactivos de amplificación se envían a -20 ºC. Son los siguientes:
Tubos de Amplificación contienen 45 µl de mezcla de reacción. Están listos para su
uso y deben mantenerse a -20ºC. Sólo se deben descongelar sobre hielo el número
preciso de tubos de amplificación que se vayan a procesar, conservando el resto de
los tubos a la temperatura indicada.
En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura;
la aparición de un color rojizo en la ventana de visualización indica que en algún
momento los productos han sobrepasado la temperatura de conservación de –
20oC y no deben utilizarse.
3.2. Reactivos de visualización
El kit de visualización se envía y se conserva a 4 ºC, a excepción de las tiras CLARTStrip® (CS) , que una vez recibido el kit, deben conservarse a temperatura ambiente.
1. Tiras CLART-Strip® (CS) (incluyendo todas las sondas específicas). Se suministran
en un sobre termosellado. Conservar siempre cerrado, a temperatura ambiente
(máx. 25ºC) y protegido de la luz.
7
2.
3.
4.
5.
6.
7.
SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4 ºC.
DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC.
CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes de usar.
RE (Solución de Revelado). Conservar a 4 ºC y protegido de la luz..
TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4 ºC.
Soporte y tapa para tiras de 8 pocillos.
3.3. Otros componentes
Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesitan los
siguientes componentes:
•
Lector CAR (Clinical Array Reader): permite la lectura e interpretación
automática de hasta 12 tiras de arrays CS, es decir, de hasta un máximo de
96 muestras. Está fabricado y distribuido por GENOMICA para su uso
exclusivo con los kits de diagnóstico.
•
Adaptador metálico que se coloca sobre la bandeja del CAR, sobre el cual se
acopla la placa antes de la lectura.
•
SAICLART®: software desarrollado por GENOMICA para el procesamiento de
imágenes.
•
Software específico del kit CLART Papillomavirus humano 2 diseñado y
validado por GENOMICA.

CAR
(Clinical Array Reader)
Figura 3. CAR
8
4.
MATERIAL REQUERIDO, NO SUMINISTRADO
4.1. Reactivos y material
• Agua destilada.
• Etanol 96%
• Guantes desechables.
• Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo.
• Recipiente con hielo picado.
• Tubos tipo Eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
• Gradillas para tubos de 1,5 ml.
• Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
• Suero salino (0.9% NaCl).
4.2. Equipos
• Microcentrífuga.
• Termociclador.
• Cabina de flujo laminar para el laboratorio de extracción.
• Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para
el laboratorio de extracción.
• Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para
el laboratorio de visualización.
• Termobloque con agitación ajustable a 25°C, 30°C y 65 ºC. Compatible
con placas de 96 pocillos.
• Vortex.
• Sistema de vacío (opcional).
5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
¡Muy importante para evitar contaminaciones! Leer detenidamente antes de comenzar
la técnica.
5.1. Recomendaciones generales:
1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar la
contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada
una de las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas,
puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas.
1. Área pre-PCR: En este área se hace la preparación de las muestras, la
extracción del ADN y la adición del material extraído a los tubos de amplificación.
Dicha preparación de las muestras para su extracción debe realizarse dentro de
9
una cabina adecuada y con las medidas de esterilización más amplias posibles para
evitar contaminaciones.
2. Área post-PCR: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la visualización
del producto amplificado. El material de esta área nunca ha de entrar en contacto
con el del área de extracción. Evitar ir al área de pre-PCR después de haber estado
trabajando en el área de visualización.
2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con
cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empieza a trabajar en las
áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se añada el
ADN a los tubos de amplificación.
3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas) en profundidad
con lejía diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras, y
obligatoriamente después de una contaminación. En el caso de termocicladores y
termomixers, se recomienda limpiarlos antes y después de su uso, en estas
mismas condiciones.
4. Emplear siempre puntas con filtro y pipetas de desplazamiento positivo para evitar
contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de
pipetas para cada área.
5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado.
6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes, aunque sean del mismo lote.
7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para evitar
contaminaciones.
8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo.
9. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se
emplean otras muestras distintas a las indicadas.
5.2. Precauciones para la extracción y la adición del material extraído al tubo de
amplificación.
• Utilizar guantes en todo momento.
• Limpiar las superficies de trabajo de la cabina con lejía diluida al 10%.
• Encender el flujo laminar y la luz UV al menos 20 minutos antes de comenzar la
extracción. Apagar la luz UV cuando se esté trabajando dentro de la cabina.
• La preparación de las muestras antes de su extracción, debe hacerse dentro de la
cabina.
5.3 Precauciones para la visualización
10
1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del pocillo, ya
que podría dañarse el microarray situado en el fondo/pocillo.
2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del pocillo CS, nunca
directamente sobre el fondo.
3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los productos
desnaturalizados de PCR.
4. El array no debe quedar seco.
5. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el microarray
para evitar que queden restos de éste y que reaccionen con la solución RE,
produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar a interpretaciones
erróneas del resultado.
6. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las
distintas soluciones.
7. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de
posición y que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso
contrario, limpiar el fondo del pocillo con un papel de celulosa impregnado de
alcohol.
6. TOMA DE MUESTRAS
6.1. Frotis
Tomar la muestra con una torunda seca y estéril, de algodón o alginato, lo
suficientemente grande como para obtener una buena cantidad de muestra. No utilizar
dispositivos que produzcan el sangrado de la lesión. Volver a introducir la torunda en su
tubo sin ningún tipo de medio. Conservar la muestra a 4ºC si se va a procesar antes de 7
días o a –20ºC si se va procesar después.
6.2. Suspensiones celulares
Estas suspensiones celulares son del tipo de las utilizadas para realizar citologías
cervicovaginales de capa fina por filtración a través de membranas (ThinPrep®, Cytyc).
Tomar la muestra con un cepillo o espátula. Resuspender la muestra agitando el
dispositivo utilizado en un vial con medio de transporte. Desechar el dispositivo utilizado
y conservar la muestra a 4ºC hasta su procesamiento.
6.3. Tejido fijado en formol e incluido en parafina
Fijar las muestras en formol tamponado durante el menor tiempo posible (nunca más de
24 horas). El empleo de formol no tamponado o la fijación durante más de 24 horas
11
puede degradar el ADN de la muestra. Es importante limpiar cuidadosamente la cuchilla
con xileno, antes y después de cortar la muestra, para evitar arrastrar restos de otra
muestra cortada anteriormente. Quitar con una cuchilla la parafina sobrante alrededor
de la pieza. Hacer con el microtomo 2-3 cortes de 5 µm y ponerlos en un tubo estéril de
1,5 ml.
7. PROTOCOLO DE TRABAJO
7.1.1. Extracción manual del ADN de PVH
Recomendaciones específicas antes de comenzar la extracción:
1
Preparar la solución B3: añadir el Buffer B1 al Buffer B2 y agitar. El Buffer
resultante B3, ha de almacenarse protegido de la luz y a temperatura ambiente;
en estas condiciones, es estable durante 5 meses.
2
Disolver la proteinasa K en PB antes de usar (la cantidad de PB está indicada en
el bote de proteinasa K), para alcanzar una concentración de 20 mg/ml. La
proteinasa K, una vez disuelta, debe almacenarse a 4°C.
3
Añadir etanol (96-100 %) al Buffer B5 antes de usar. El volumen de etanol está
indicado en el bote Buffer B5.
4
Calentar la Solución BE a 70°C antes de usar.
5
Todas las centrifugaciones del proceso se realizarán a temperatura ambiente, a
no ser que se especifique otra cosa.
Atención: Las Soluciones B3 y BW contienen hidrocloruro de guanidino. Se recomienda el
uso de guantes, gafas y bata de laboratorio para su manejo.
Extracción del ADN de PVH.
1. Preparación de la muestra
Frotis:
•
Añadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9%) al tubo que contiene la
torunda y agitar vigorosamente en un vortex durante 1 minuto.
•
Decantar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml estéril.
•
Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a
12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de líquido, cuidando de
no llevarse el precipitado.
12
•
Resuspender en 180 µl de Solución T1. Continuar con el paso 2.
Tejido fijado en formol e incluido en parafina:
•
Introducir 4 o 5 cortes de tejido de unos 5 m en un tubo estéril de
microcentrífuga de 1,5 ml y añadirles 180 µl de Solución T1.
•
Tras machacar el tejido con la punta de la pipeta, mezclar en el vortex para
facilitar la lisis. Continuar con el paso 2.
Suspensiones celulares:
•
Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que está contenida y
pasar 1 ml a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml.
•
Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a
12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de líquido, cuidando de
no arrastrar el precipitado.
•
Resuspender el precipitado con 1 ml de agua destilada estéril.
•
Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a
12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de líquido, cuidando de
no llevarse el precipitado.
•
Resuspender en 180 µl de Solución T1.
•
Transferir a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml.
A partir de este paso, todas las muestras serán tratadas de la misma manera, de acuerdo
con el siguiente protocolo:
2. Añadir 25 µl de la solución de Proteinasa K.
•
Mezclar en vortex.
•
Incubar a 56°C, 1-3 horas, (toda la noche en el caso de las muestras en
parafina), en un baño o un Termomixer con agitación, hasta que la muestra
esté totalmente lisada. Para acelerar esta lisis, se recomienda agitar las
muestras en un vortex cada 15 minutos.
13
3. Una vez lisada la muestra, añadir 200 µl de Solución B3 a cada muestra. Mezclar en
vortex e incubar a 70°C durante 10 min.
4. Añadir 210 µl de etanol 96% a cada muestra y agitar en vortex inmediatamente.
Nota: No descartar ningún precipitado blanquecino que se pueda haber formado tras la
adición del etanol; este precipitado debe añadirse con el resto de la solución a la columna
de purificación en el siguiente paso.
5. Preparar una columna de purificación por muestra y colocarla en un tubo de recogida
de 2 ml. Añadir la muestra y centrifugar durante 1 minuto a 12.000 r.p.m.
Si el líquido no ha atravesado completamente la membrana, repetir la centrifugación.
Descartar el fluído filtrado y el tubo de recogida de 2 ml.
6. Colocar la columna en otro tubo colector y añadir 500 µl de la Solución BW a la
columna. Centrifugar a 12000 r.p.m.
durante 1 min. Descartar el fluido filtrado y el tubo colector.
7. Colocar la columna en otro tubo colector y añadir 600 µl de Solución B5 a la columna.
Centrifugar a 12000 r.p.m.
durante 1 min. Descartar el fluido filtrado.
14
8. Reinsertar la columna en el tubo de recogida. Centrifugar a 12000 r.p.m.
durante 1 min para eliminar cualquier resto de la Solución B5.
Nota: El etanol residual que pueda quedar de la Solución B5 inhibe reacciones
enzimáticas, por lo que se debe eliminar completamente mediante esta centrifugación.
9. Colocar la columna en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir el ADN con
100 µl de la Solución BE (previamente calentada a 70°C). Incubar esta Solución caliente
en la columna a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar a 12.000 r.p.m.
durante 1 min.
10. Recuperar el filtrado (aproximadamente 100 l) en el tubo de microcentrífuga de 1,5
ml. Utilizar 5 l para la reacción de amplificación y guardar el resto a –20°C.
7.1.2. Extracción automática del ADN de PVH
7.1.2.1. Equipo easyMAG de Biomérieux
Se recomienda realizar el método siguiente:
15
1. Preparación de la muestra para la lisis interna (se realiza dentro del equipo).
Frotis:
•
Añadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9%) al tubo que contiene la
torunda y agitar vigorosamente en un vortex durante 1 minuto.
•
Decantar el sobrenadante en un tubo estéril de 1,5 ml.
•
Transferir 1 ml a un pocillo de la cubeta (cada cubeta tiene 8 pocillos).
Suspensiones celulares (volúmenes inferiores a 3 ml):
•
Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que está contenida.
Transferir 1 ml a un pocillo de la cubeta.
Medio de Captura de híbridos:
•
Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que está contenida.
Transferir 0.5 ml a un pocillo de la cubeta.
2. Lisis interna y extracción del ADN: seguir la guía de usuario del equipo. Hay que
identificar en el programa que el volumen de elucción es 110 µl.
3. Una vez finalizada la extracción se toman con pipeta los 110 µl de ADN eluido y se
introducen en tubos eppendorf de 1,5 ml. Utilizar 5 l para la reacción de amplificación y
guardar el resto a –20°C.
7.1.2.2. Equipo BioSprint 96 de Qiagen.
Se recomienda realizar el método siguiente:
PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES
Asegúrese de que las soluciones estén preparadas antes de comenzar el proceso de
extracción.
1. La proteasa se encuentra liofilizada, antes de su uso añadir 4.4 ml del buffer indicado
en la etiqueta, a partir de este momento conservar a 4º C, hasta 2 meses.
2. Preparación Buffer AW1
Volumen AW1 concentrado
(ml)
19
27
Volumen de Etanol 96% a
añadir
25
35
Volumen Final (ml)
44
62
16
98
130
228
Nota: guardar a Tª ambiente. Antes de utilizar agitar la botella unas 5 veces.
3. Preparación Buffer AW2
Volumen AW2 concentrado
Volumen de Etanol 96% a
Volumen Final (ml)
(ml)
añadir
17
40
57
68
160
228
Nota: guardar a Tª ambiente. Antes de utilizar agitar la botella unas 5 veces.
4. Preparación de Tween 20 al 0.0002%.
H2O RNasa free
30 ml
Tween 20
6µl
Nota: Una vez hecha la mezcla se guarda a 4º C.
250 ml
50 µl
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1. ¡Importante, encender el Termomixer a 70ºC para la lisis con Proteasa!.
Frotis:
•
Cortar e introducir el bastoncillo en un microtubo de 1.5 ml. Añadir:
- 400 µl de buffer ATL
- 20 µl de Proteasa
Suspensiones celulares (volúmenes inferiores a 3 ml):
•
Citologías líquidas: agitar previamente en vortex y añadir a la placa (S-Block).
-200 µl de muestra
-20 µl de Proteasa
2. Incubar en el Termomixer 10 min. a 70ºC. Si la incubación se realiza en la placa, cubrir
ésta con un film transparente y colocar una placa metálica previamente calentada a
70ºC encima. De esta manera se evita la condensación de la muestra y por tanto una
posible contaminación.
3. Preparación de la master mix. Preparar volumen para una muestra extra por cada
serie de 10.
Añadir los siguientes volúmenes:
Componentes
Buffer AL
Isopropanol
MagAttract Suspension G
Volumen por muestra (µl)
200
200
20
17
4. Dispensar las soluciones en las placas.
Se van a necesitar 6 S-Block y 2 Microplate MP.
En la tabla 1 aparece el orden de carga de las placas en el equipo y los distintos
volúmenes que hay que añadir a las placas.
Posición en el equipo
Placa
A añadir…
8
Microplate MP
7
Microplate MP
6
S-Block
5
4
3
2
1
S-Block
S-Block
S-Block
S-Block
S-Block
Situar el soporte con el
cobertor encima.
Buffer AE (Buffer de
Elución)
H2O RNasa free + Tween
20
Buffer AW2(2)
Buffer AW2(1)
Buffer AW1(2)
Buffer AW1(1)
Muestras lisadas + Master
mix (*)
Volumen por pocillo
(µl)
-----100 ó 200
500
500
500
500
500
200 + 420
(*)En el caso de frotis, antes de añadir el lisado, se da un pequeño spin a las muestras.
Añadir primero los 200 µl de muestra lisada y sobre ella los 420 µl de la master mix por
pocillo. En el caso de haber lisado en placa, añadimos directamente los 420 µl de master
mix a cada pocillo. En ambos casos, se mezcla con la pipeta.
5. Extracción.
• Una vez que están todas las placas preparadas con el volumen correspondiente,
encender el equipo con el botón de encendido.
• Abrir la ventana protectora.
• Seleccionar mediante las flechas superior e inferior el programa ADN Swab y se
pulsa START.
Aparece un mensaje en el LCD pidiendo que se introduzca la placa de la posición 8
(ver tabla 1). Después de cargar la placa 8 presionar “Star”. El carrusel gira y aparece
un mensaje pidiendo que se introduzca la placa de elusión en la posición 7. Después
de cargar la placa 7 presionar “Star”. Continuar el proceso hasta tener todas las
posiciones cubiertas.
La tabla 1 muestra la posición que debe ocupar cada una de las placas. Todas las
placas deben quedar con las etiquetas hacia el interior.
• Una vez colocadas todas las placas se cierra la ventana protectora del Biosprint
96.
18
• El proceso de extracción durará unos 20 minutos. El ADN extraído se puede
almacenar en la placa de elución (posición 7) a -20ºC, tapando los pocillos con un
film transparente. Si no se utiliza la placa entera, tomar el ADN extraído mediante
pipeta e introducirlo en un microtubo de 1,5 ml para el posterior almacenamiento a
-20ºC.
7.2. Reacción de amplificación
Recomendaciones específicas para la amplificación:
• Trabajar en el área pre-PCR, siempre en campana y siguiendo las
recomendaciones del punto 5.1.
• Añadir el ADN, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto
5.1. Durante el proceso mantener los tubos separados y en hielo.
1. Descongelar un Tubo de Reacción por cada muestra que se va a estudiar y
mantenerlos en hielo. No usar temperaturas superiores a 37ºC para la
descongelación.
2. Centrifugar unos segundos los Tubos de Reacción en la microcentrífuga para
que quede todo el líquido en el fondo del tubo (si no se dispone de
adaptadores de microcentrífuga para los Tubos de Reacción, se pueden utilizar
en su lugar tubos de un tamaño mayor a los que se les haya cortado la tapa).
3. Si el ADN ha sido obtenido de muestras incluidas en parafina, añadir 1,5 l de
Cloruro de Magnesio 25mM en los tubos de amplificación.
4. Añadir 5 µl del ADN extraído de las muestras a los Tubos de Reacción y
resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo.
5. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas:
- Para Tubos de Reacción de 0,2 ml:
1 ciclo
40 ciclos
95ºC 5 min
94ºC 30 seg
55ºC 60 seg
72ºC 90 seg
1 ciclo
72ºC 8 min
20ºC continuo hasta la recogida de tubos (opcional)
6. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reacción en el termociclador
19
cuando el bloque haya sobrepasado los 90 ºC. De este modo se minimizan las
posibles amplificaciones inespecíficas debidas a incubación por debajo de la
temperatura de hibridación. La duración de la amplificación es de unas 4 horas,
aunque puede variar ligeramente dependiendo del termociclador.
7.3. Visualización del producto amplificado en CLART-Strip® (CS)
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL
ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL ÁREA DE PREPCR.
1. Encender el CAR (Clinical Arrays Reader) al comienzo del proceso. La
autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario además introducir
el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura.
2. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de placas ha
estado a 65ºC al menos 1 hora.
3. Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente.
4. Preparar la solución de lavado antes de cada ensayo, no reutilizar soluciones o
restos preparadas con anterioridad.
5. Usar una punta con filtro diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se
añada un reactivo.
6. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para
aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o
descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada ensayo.
Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja restos en el fondo
del pocillo.
7. Aspirar completamente las diferentes soluciones dentro de los pocillos sin tocar
el array.
VISUALIZACIÓN:
1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de
PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar
a 95ºC durante 10 minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que
una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95ºC. Sacar los
tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con
hielo.
20
2. Preparación de la Solución TL diluida:
Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado
diluida, añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada.
3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los tubos AT
añadiendo 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10
a15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la
superficie del array. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente
con bomba de vacío.
El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer
seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente.
4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª ambiente. Una vez
desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de solución SH (evitar que
se forme espuma) a cada pocillo de los CS. Añadir 5 µl de producto de PCR
desnaturalizado a cada pocillo de los CS, resuspender varias veces para que se
mezcle con la solución de hibridación, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar
la tira cubierta con la tapa de plástico transparente en el termomixer de placa
tapado durante 1 hora a 65º C, agitando a 550 rpm.
Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH con pipeta o
bomba de vacío. (Dejamos programado el termomixer de placa a 30º C y en
movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa
para que baje antes la temperatura).
5. Doble Lavado: usar puntas diferentes para cada pocillo en ambos lavados. Añadir
200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a15 veces
con la pipeta multicanal. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o
preferiblemente con bomba de vacío multicanal. Repetir la operación. Si llegado
a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los pocillos
con esta solución hasta que el termomixer alcance la temperatura.
6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridación, se debe
preparar la solución CJ diluida y mantener en hielo. Se recomienda centrifugar la
solución CJ durante 10 segundos antes de usarla. A continuación, preparar la
solución CJ diluida. Por cada CS, se añade 1 ml de solución DC y 7.5 µl de
Solución CJ. Se debe dar un vórtex a la solución una vez diluida para
homogenizar.
Desechar la Solución TL diluida sin dejar seco el array y añadir a cada pocillo del
CS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el
termomixer de placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la
placa y desechar la solución rápidamente con pipeta o bomba de vacío
multicanal. (Dejar programado el termomixer de placa a 25º C y en movimiento
para su utilización posterior en el paso 8. Podemos quitar la tapa para que baje
antes la temperatura).
21
7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a cada
pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar
la solución con la pipeta o vacío sin dejar seco el array. Repetir la operación dos
veces más.
Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría
con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica.
8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida sin dejar seco el array,
añadir 100 µl de solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a 25 º C
en el termomixer de placa sin agitación.
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación
9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe quedar
seco
10. CAR (Clinical Arrays Reader): Se coloca un adaptador especial sobre la bandeja
del CAR y a continuación se colocará la placa en el CAR para tomar las imágenes
de todos los pocillos para posteriormente ser analizadas automáticamente.
8. LECTURA DE RESULTADOS
El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de
forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe en el que se
indican los resultados.
9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos
negativos debidos, bien a una calidad inadecuada del ADN de la muestra (por toma de
cantidad insuficiente de muestra, por degradación del ADN debida a una incorrecta
conservación o por pérdida del ADN de la muestra durante su extracción), o bien a la
presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las muestras en las que se quiere
analizar la presencia del virus (hemoglobina, restos de parafina, sales, etc). Con el kit
CLART® Papillomavirus humano 2 se han eliminado estos falsos negativos gracias a la
introducción de dos controles internos en el mismo tubo de reacción donde se analiza la
muestra.
Cada tubo de amplificación contiene los siguientes oligos:
•
•
Un par de oligonucleótidos que amplifican un fragmento del gen CFRT humano.
Éste es el control de extracción de ADN genómico o control del ADN del
paciente.
Un par de oligonucleótidos que amplifican un plásmido modificado incluido en el
tubo de amplificación y que se usa como control de amplificación de la reacción
de PCR.
22
•
Oligonucleótidos específicos de PVH.
El tubo de PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de PVH frente a la de los
dos controles. En relación a estos últimos, la amplificación del control de ADN genómico
prima sobre la del control de la reacción de amplificación.
La razón de este diseño es:
El control interno de ADN genómico es necesario para la confirmación de un verdadero
resultado negativo, ya que nos informa de la presencia de ADN del paciente en la
muestra, aunque no haya habido amplificación de ningún tipo de VPH.
El control interno de amplificación nos permitirá distinguir entre los casos de inhibición
de la reacción de PCR y aquéllos en los que no se encontró ADN en la muestra.
En ciertas condiciones (ej. cuando hay un elevado número copias de un virus de PVH o
cuando la muestra presenta varios tipos de PVH a la vez) puede suceder que no se
amplifiquen los dos controles o alguno de ellos y aparezca una lectura de: SIN SEÑAL.
23
Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes
interpretaciones de los resultados de lectura:
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
√
CONTROL
GENÓMICO
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
√
POSITIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO
Control Genómico
Control de amplificación
VPH
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
√
CONTROL
GENÓMICO
√
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
POSITIVO
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque el control de amplificación se muestre
SIN SEÑAL. Esto se debe al efecto de la competencia entre los tres tipos de ADN.
VPH
Control Genómico
24
MUESTRA
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
√
√
SIN
SEÑAL
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
SIN SEÑAL
POSITIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque ambos controles se muestren SIN
SEÑAL. Esto se debe, bien a que hay una gran cantidad de copias de virus, o a un elevado
número de genotipos de VPH presentes en la muestra.
VPH
MUESTRA
POSITIVO
para algún
genotipo
√
CONTROL
GENÓMICO
√
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
NEGATIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO. En este caso podemos decir que se trata de
un verdadero resultado negativo.
Control de amplificación
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
Control Genómico
CONTROL
GENÓMICO
√
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
SIN SEÑAL
NEGATIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque no haya aparecido la señal del control
de amplificación, debido a una elevada concentración de ADN genómico.
25
Control Genómico
MUESTRA
POSITIVO
para algún
genotipo
AGUA
CONTROL
GENÓMICO
SIN SEÑAL
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
NEGATIVO
Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO, ya que en este caso se trata de una “muestra
blanco” (en vez de muestra, ponemos agua destilada en los tubos de PCR), donde sólo
debe aparecer el control de amplificación, porque no hay ADN en la muestra que se
pueda amplificar.
Control de amplificación
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
SIN SEÑAL
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
√
NO HAY ADN
Éste se considera un RESULTADO NO VÁLIDO. Se debe a que no hay ADN en la muestra,
por distintas razones:
1. Insuficiente material celular en la toma de muestra.
2. Pérdida de ADN durante el proceso de extracción.
La solución en estos casos es repetir la técnica desde la extracción o bien pedir al
facultativo una nueva toma de muestra al paciente.
26
MUESTRA
√
POSITIVO
para algún
genotipo
CONTROL
GENÓMICO
SIN SEÑAL
CONTROL DE
AMPLIFICACIÓN
INTERPRETACIÓN
SIN SEÑAL
PCR INHIBIDA
Éste se considera un RESULTADO NO VÁLIDO. Esto se debe a que algunas sustancias
pueden inhibir la reacción de PCR al perjudicar la actividad de la enzima ADN polimerasa.
La solución es verificar que en las muestras o en el material genético extraído no hay
presencia de ninguna de estas sustancias. En la mayoría de los casos se recomienda
repetir la extracción o, si esto no es posible, pedir al facultativo una nueva toma de
muestra al paciente.
Marcadores
Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de Virus No Concluyente:
•
En aquellos casos en que las tres réplicas de una sonda sean muy distintas
entre sí.
•
En coinfecciones para aquellos virus que se encuentren en el límite de
detección de la técnica.
10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
Control de interferencias conocidas:
Existen sustancias que pueden interferir en funcionamiento del kit CLART®
Papillomavirus humano 2. Principalmente, son sustancias que inhiben la ADN polimerasa
y, por tanto, la reacción de amplificación. Las interferencias más conocidas son:
27
1
Presencia de hemoglobina o parafina. Tanto el ADN extraído a partir de frotis
cervicovaginales como el obtenido a partir de muestras de tejidos incluidos en
parafina puede contener restos de hemoglobina. No obstante, el kit de ExtracciónPurificación de GENOMICA minimiza estos efectos.
2
Presencia de ácido acético o iodina en la muestra a analizar. Si la toma de muestra
para el análisis con el kit CLART® Papillomavirus humano 2 se realiza después de una
colposcopia, esta muestra puede contener ácido acético o iodina, que inhiben la PCR.
Para evitar esto, realizar la toma de muestra para el análisis con CLART®
Papillomavirus humano 2 previamente a la colposcopia.
3
Utilización de muestras no adecuadas. El análisis de cualquier otro tipo de muestra
clínica distinta a las indicadas en el manual del kit CLART® Papillomavirus humano 2,
así como una toma incorrecta de las muestras, puede conllevar que el resultado del
análisis no sea concluyente. Por ejemplo, si la torunda ha sido incluida en algún tipo
de medio, la PCR puede resultar inhibida. Si el tiempo de fijación de un tejido en
formol es excesivo, el ADN puede degradarse, resultando la muestra inhibida por
falta de amplificación del control del ADN de la muestra.
4
Actividad residual de la Proteinasa K. En el proceso de extracción de ADN, se tiene
que inactivar la Proteinasa K mediante incubación a 70 ºC durante 10 minutos. Bajo
estas condiciones, la inactivación se produce de forma completa. Si este paso fuera
omitido o las condiciones se suavizaran significativamente, podría ocurrir que
permaneciese una actividad residual de la Proteinasa K, lo que podría resultar en
una degradación de la ADN polimerasa y, por tanto, inhibición de la PCR.
5
La conservación inadecuada de las muestras puede influir en el resultado del
análisis. Si las muestras se someten a condiciones que puedan provocar una
degradación del ADN que contienen, el resultado del análisis será de muestra
inhibida por falta de amplificación del control del ADN de la muestra.
Especificaciones técnicas:
1. Parámetros Analíticos:
• Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se determinó mediante la
amplificación de los fragmentos específica de la región L1 para los diferentes genotipos
de VPH clonados en plásmidos recombinantes. La sensibilidad para los tipos 16 y 18
también fue determinada a partir de la detección de muestras del programa de
evaluación de herramientas de laboratorio para el tipado del VPH, de la organización
mundial de la salud OMS (2010 WHO HPV LabNet Proficiency Study of HPV DNA Typing).
2
GENOTIPO VPH
10 copias
6
11
16
100%
100%
100%
50 copias*
10 copias
100%
40%
60%
80%
28
18
26
31
33
35
39
45
51
52
53
56
58
59
66
68
82
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
80%
80%
80%
100%
100%
60%
80%
80%
80%
100%
100%
80%
100%
80%
100%
N=95 * Datos expresados en equivalentes genómicos..
®
Tabla 1. Sensibilidad analítica del kit CLART HPV2 kit
Dado el significado clínico de los genotipos de VPH 16 y 18, se ha incluido los datos de
sensibilidad para esos tipos obtenidos a partir de la detección de muestras del programa
de evaluación de herramientas de laboratorio para el tipado del VPH de la organización
mundial de la salud OMS. Este programa compara y evalúa las diferentes metodologías
de detección de VPH comerciales disponibles para una efectiva implementación y
monitorización de los programas de vacunación para VPH. Basado en este programa, se
considera una herramienta como apta para el diagnóstico si detecta al menos 50
unidades internacionales (equivalentes genómicos o copias) de los tipos de VPH 16 y 18,
hecho demostrado con CLART® Papillomavirus humano 2.®
•
Especificidad analítica. La especificidad analítica es de un 100%. Con el kit CLART®
Papillomavirus humano 2 no se produce detección inespecífica de otros virus
patógenos habituales de muestras cervicovaginales, como son los herpesvirus.
2. Parámetros de utilidad diagnóstica.
Para determinar los parámetros de utilidad diagnóstica del nuevo kit CLART®
Papillomavirus humano 2, se han realizado estudios comparativos frente a la versión
antigua del mismo producto.
Dichos estudios se realizaron en colaboración con dos hospitales españoles y uno
portugués.
•
•
Servicio de Microbiología del Hospital Universitari Germans Trías i Pujol
de Badalona.
Unidad de Virología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.
29
•
Departamento de enfermedades infecciosas. Instituto Nacional de Salud
Ricardo Jorge, I. P. Lisboa (Portugal).
Se analizaron 386 muestras de las cuales 9 fueron torundas, 25 tejidos incluidos en
parafina y 352 citologías líquidas.
En la siguiente tabla se ilustran los datos de sensibilidad y especificidad diagnósticas
para los tipos de VPH detectados por el kit CLART® Papillomavirus humano 2:
Tipo HPV
6
11
16
18
26
31
33
35
39
42
43
44
45
51
52
54
Sensibilidad
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
Especificidad
100,00
100,00
99,70
100,00
100,00
100,00
99,73
99,74
100,00
99,47
99,50
100,00
99,74
100,00
100,00
100,00
Tipo HPV
56
58
59
61
62
66
68
70
71
73
81
82
83
84
85
Sensibilidad
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
94,44
100,00
100,00
100,00
Especificidad
100,00
100,00
99,73
100,00
99,47
100,00
98,35
100,00
100,00
99,74
100,00
99,48
100,00
100,00
100,00
®
Tabla 2. Parámetros diagnósticos de la técnica CLART HPV2.
30
11. BIBLIOGRAFÍA
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23rd International papillomavirus conference and clinical workshop. September 2006.
Praga.
32
12. TABLAS
En la siguiente tabla se indica el riesgo oncogénico de los PVH que se detectan en este kit.
TIPO
RIESGO
TIPO
ONCOGÉNICO *
RIESGO
ONCOGÉNICO *
PVH 6
Bajo Riesgo
PVH 56
Alto Riesgo
PVH 11
Bajo Riesgo
PVH 58
Alto Riesgo
PVH 16
Alto Riesgo
PVH 59
Alto Riesgo
PVH 18
Alto Riesgo
PVH 61
Bajo Riesgo
PVH 26
Alto Riesgo
PVH 62
Bajo Riesgo
PVH 31
Alto Riesgo
PVH 66
Alto Riesgo
PVH 33
Alto Riesgo
PVH 68
Alto Riesgo
PVH 35
Alto Riesgo
PVH 70
Alto Riesgo
PVH 39
Alto Riesgo
PVH 71
Bajo Riesgo
PVH 40
Bajo Riesgo
PVH 72
Bajo Riesgo
PVH 42
Bajo Riesgo
PVH 73
Alto Riesgo
PVH 43
Bajo Riesgo
PVH 81
Bajo Riesgo
PVH 44
Bajo Riesgo
PVH 82
Alto Riesgo
PVH 45
Alto Riesgo
PVH 83
Bajo Riesgo
PVH 51
Alto Riesgo
PVH 84
Bajo Riesgo
PVH 52
Alto Riesgo
PVH 85
Alto Riesgo
PVH 53
Alto Riesgo
PVH 89
Bajo Riesgo
PVH 54
Bajo Riesgo
* Clasificación riesgo oncogénico según Dunne et al. (2007).
33