REVISTA COLOMBIANA DE FÍSICA, VOL. 38, No. 1, 2006 321

REVISTA COLOMBIANA DE FÍSICA, VOL. 38, No. 1, 2006
CARACTERIZACIÓN DE SISTEMAS BIOLÓGICOS A TRAVÉS DE LA TÉCNICA
DE ESPECTROSCOPIA DE IMPEDANCIA BIOELÉCTRICA (EIB)
D. Llamosa P. 1, E. Muñoz A. 1, P. Cárdenas M. 1, B. Segura G. 1, A. Rosales R.1
1
Laboratorio de Magnetismo y Materiales Avanzados
Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales
(Recibido 26 de Oct.2005; Aceptado 10 de Enr.2006; Publicado 28 de Abr. 2006)
RESUMEN
En este artículo se presentan resultados de la caracterización de cultivos de levadura
Sacharomyce Cereviseae spp mediante la técnica de Espectroscopia de Impedancia Bioeléctrica
(EIB). Se diseño un sistema para realizar medidas de EIB sobre estos cultivos en un rango de frecuencias comprendido entre 25KHz y 30MHz, por el cual se determino información sobre las
condiciones de la membrana celular. Ademas, se analizo el tamaño celular por comparación con el
espectro de impedancia de la bacteria Lactobacillus. Para calibrar el sistema se usaron resistencias
y capacitores de alta precisiòn y sustancias phantoms (muestras de solución salina al 0.9%). Asì
mismo, se desarrolló un modelo circuital de una célula para validar los datos teóricos con los experimentales. Con este trabajo se pretende contribuir a la caracterización de sistemas biológicos de
mayor complejidad en sus propiedades estructurales, morfológicas y fisicoquímicas.
Palabras Clave. Sacharomyce Cereviseae spp, Espectroscopia de Impedancia Bioeléctrica (EIB),
Membrana Celular.
ABSTRACT
This paper shows results of Sacharomyce Cereviseae spp culture cell characterization via the Bioelectric Impedance Spectroscopy (BIS) technique. A system designed to make BIS measurements
on these cultures is presented, it makes measurements in a frequency range between 25Khz and
30Mhz, which was used to find information about the cellular membrane condition. Furthermore, an analysis of cellular size was made by comparison with the bacterium Lactobacillus spectrum. To calibrate the system, high-precision resistors and capacitors and phantom (saline solution at 0.9%) substances were used. Also, a cellular circuital model to validate theoretical data
with experimental data was developed. This work seeks to contribute in the characterization of
complex biological systems and its structural, morphological and physical-chemical properties.
Keywords. Sacharomyce Cereviseae spp, Bioelectric Impedance Spectroscopy (BIS), Celular
Membrane
1. INTRODUCCIÓN
Las medidas de EIB basadas en el modelo de Cole permiten determinar características
de sistemas y tejidos biológicos tales como la integridad de membrana y tamaño celular por la
valoración de sus propiedades eléctricas pasivas (σ y є0 ). Esta técnica ha sido empleada exitosamente para detección de isquemia cardiaca, tejidos cancerosos, valoración de composición
grasa corporal [2], actividad bacteriana [4] entre otros. Recientemente se ha fortalecido la aplicación de esta técnica en la estimación de biomasa por la obtención de espectros de impedancia
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en cultivos celulares, a esta técnica se le conoce como microbiología de impedancia (MI), y
permite monitorear, detectar, cuantificar y en ciertos casos identificar microorganismos [3]. El
sistema EIB se basa en el modelo de Cole-Cole para la obtención del espectro de impedancia
de las muestras; el valor de impedancia presenta una componente real y una compleja que
reflejan el comportamiento de las propiedades eléctricas pasivas de los cultivos; la parte real
muestra el comportamiento resistivo del citoplasma celular y la parte compleja refleja el comportamiento capacitivo de la membrana celular esperando así valores altamente capacitivos para
membranas celulares integras [8].
Z ( f ) = R∞ +
R0 − R∞
[ ]
1+ j
(1)
f 1−α
fc
Por el modelo de Cole-Cole se obtienen además parámetros que facilitan la caracterización de
las muestras; Ro indica la resistencia de la muestra a una baja frecuencia, R ∞ es el valor de la
resistencia a una teórica frecuencia infinita (altas frecuencias), fc la frecuencia característica es
la frecuencia a la que la componente imaginaria de la impedancia eléctrica alcanza el máximo.
De esta forma se obtiene información sobre el tamaño de la célula, cuanta más pequeña es ésta,
mayor es la frecuencia característica. Finalmente si se representa la parte imaginaria de la impedancia eléctrica de un sistema biológico respecto a la parte real de dicha impedancia la figura
resultante se aproxima a un semicírculo, así α nos da información sobre la desviación respecto a
un semicírculo perfecto [7]. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un sistema de Espectroscopia de Impedancia Bioeléctrica basado en el método de las cuatro puntas y que admita
medidas de MI para el hongo Sacharoyces Cereviseae spp en un rango de frecuencias comprendido entre los 25 KHz hasta 30MHz y su posterior aplicación a sistemas biológicos en general.
METODOLOGIA.
Para la medición se utilizó un sistema de Impedancia Bioeléctrica cuyo diagrama de
bloque se muestra en la Figura 1, constituido de un Lock-In Stanford Research SR844 encargado de la medición de las señales, un generador de señales Stanford Research DS360 para suministrar la corriente AC a la muestra a estudiar, adicionalmente se diseñó un circuito electrónico
de acondicionamiento de la señal, se cuenta también con un PC encargado de gobernar todos los
dispositivos que conforman el sistema y procesar los datos. Se aplica la técnica a sustancias
phantoms y a un modelo circuital para calibrar. Se realiza un cultivo de Sacharomyces Cereviceae y Lactobacillus, los cuales se mantienen en condiciones de temperatura y PH controlados
(30°C y 4±0.1), se efectuan mediciones de espectroscopia de impedancia bioelectrica por 34
horas, cada hora.
Figura No.1. Diagrama de bloques del sistema EIB.
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Se realizaron pruebas de calibración del equipo midiendo la impedancia eléctrica en resistores
de precisión de 47.5Ω ±1% y capacitores de 47 nF±5%. Además, se tomaron medidas en soluciòn salina al 9% (sustancia phantoms), las cuales no sufren variación con la frecuencia en el
comportamiento ya conocido de sus propiedades eléctricas pasivas y en un modelo circuital
formado por una resistencia de 47.5Ω, que imita el comportamiento extracelular del medio, en
paralelo con una resistencia de 20 Ω y un capacitor de 47 nF, que simulan el comportamiento
capacitivo de la membrana celular y resistivo del medio intracelular respectivamente; el objetivo de estas pruebas sobre este circuito es representar de una forma más clara los procesos fisiológicos, ya que estos mecanismos fisiológicos se pueden asociar de una manera más sencilla a
comportamientos de elementos resistivos o capacitivos, que a los coeficientes de la ecuación
matemática. Este modelo representado a través de la Figura 2.a) simula solamente a una célula
inmersa en un medio iónico, si nos referimos a tejidos sería necesario ampliar nuestro modelo
en forma de ramas para obtener efectos de doble capa, además el modelo de la capacitancia y
resistencias en serie es el mas apropiado para un solo tipo de relajaciones [5].
Resultados y Discusión
14
18
22
Resistencia (Ω)
30
26
34
38
42
-1
-3
-5
Reactancia (Ω)
-7
-9
-11
-13
-15
-17
Figura No. 2. a. Modelo circuital del comportamiento eléctrico de una célula para una sola relajación.
b. Espectro de Impedancia Bioeléctrica en solución salina al 9%
La figura 2.b, muestra el resultado del espectro de impedancia en solución salina al 9%, en el
cual se observa el comportamiento constante de la impedancia eléctrica en la muestra al variar
la frecuencia, de acuerdo con lo esperado. Por lo tanto es posible utilizar este tipo de sustancias
como medio de calibración para el diseño propuesto.
t0
t5
t15
t19
t23
t29
t33
250
10
110
160
-10
200
-30
150
Reactancia Ω
Impedancia (Ω)
60
100
-50
-70
50
-90
0
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Frecuencia (KHz)
to
t5
t15
t19
t23
t29
-110
Resistencia
323
210
260
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Figura No.3. a. Magnitud de Impedancia en el rango de frecuencias. b.Modelo de Cole, para diferentes
fases de crecimiento del cultivo (Sacharomyces cereviceae).
En la Figura 3.a, se observa que la componente resistiva de la impedancia eléctrica presenta
disminución a medida que la frecuencia aumenta, facilitando el paso de la corriente desde el
medio extracelular hasta la membrana; la componente capacitiva de la impedancia muestra un
aumento a medida que la frecuencia se incrementa, por lo tanto se acumula energía en la membrana celular, lo cual es característico de membranas celulares integras. A altas frecuencias las
resistencias se encontrarán en paralelo, lo cual permite una disminución en la resistencia total.
Como parte de la caracterización del cultivo celular se obtienen el parámetro fc tanto para Sacharomyces Cereviceae como para la Bacteria Lactobacillus, teniendo como valores de este
parámetro 6.525 KHz y 8.025 KHz respectivamente, siendo fc inversamente proporcional al
tamaño de la célula, es posible determinar que el tamaño del Sacharomyces Cereviceae es superior al de la bacteria.
CONCLUSIONES.
Los resultados obtenidos en las diferentes medidas de calibración sugieren que la técnica EIB,
basada en el modelo de Cole para una sola relajación, es válida para realizar medidas en sistemas biológicos. La caracterización del cultivo celular Sacharomyces cereviceae permite determinar que la membrana celular esta en condiciones de integrida, por su comportamiento altamente capacitivo y la relación del tamaño celular presento una relación de 1,28 veces mayor
que el tamaño celular de la bacteria.
AGRADECIMIENTOS.
Este trabajo fue realizado con el apoyo de la Dirección de Investigación (DIMA) de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales y COLCIENCIAS. Los autores agradecen también
la colaboración en los experimentios del crecimiento del cultivo celular realizados en los Laboratorios de Catálisis y Procesos Productivos.
REFERENCIAS
[1] B.H. Brown, A.J. Wilson And P. Bertemes-Filho, Bipolar And Tetrapolar Transfer Impedance
Measurements From Volume Conductor, Electronics Letters 7th December 2000 Vol. 36 No. 25.
[2] J.R. Bourne, B. Rigaud, J.P. Morucci, N. Chauveau, Biolectrical Impedance Techniques in Medicine,
Critical Reviews in Biomedical Engineering, 24(4-6), pp. 323-351, 1996.
[3] Carmelo J. Felice, Microbiología De Impedancia, Tesis Doctoral, Universidad Nacional de Rosario,
Rosario. 1987
[4] Gersing E, Measurement of Electrical Impedance in Organs-measuring Equipment for Research and
Clinical Applications, Biomedizinische Technik 1991; 36: 6-11.
[5] J. O. Casas. Contribución a la Obtención de Imágenes Paramétricas en Tomografia de Impedancia
Eléctrica para la Caracterización de Tejidos Biológicos, Tesis Doctoral, Universidad Politécnica de
Cataluña, Barcelona España (1998).
[7] Jordi Elvira, Josep Bujan, Pilar Urpí, Ramon Bragós,Medida en línea de biomasa viable mediante el
uso de la espectroscopia de impedancia eléctrica, Revista de Enología.
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