Método de filtración por membrana para determinación de

METODO DE FILTRACIÓN POR
MEMBRANA PARA DETERMINACION DE
COLIFORMES Y E. coli EN AGUA
Sección Microbiología
de Alimentos
1.
PRT-712.03-009
Fecha emisión:
10/05/1992
Revisión: 5
Fecha revisión:
06/11/2008
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OBJETIVO
Este método se utiliza para medir la calidad sanitaria del agua potable.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Se aplica a agua clorada o agua naturales de muy baja contaminación y sin turbidez.
3.
4.
FUNDAMENTO
En la técnica de filtración por membrana, el grupo coliformes se define como todas las
bacterias aeróbicas y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas que desarrollan
una colonia roja con brillo metálico dentro de 24 horas de incubación en un medio tipo Endo
conteniendo lactosa. El grupo coliformes produce aldehídos por la fermentación de la lactosa.
E. coli bacteria perteneciente al grupo coliformes, que en un medio adecuado y a una
temperatura restrictiva de 44,5 ºC +/- 0,2ºC, fermenta la lactosa produciendo ácido, gas, posee
actividad β-D-glucoronidasa y actividad triptofanasa. Son negativas a la actividad oxidasa y
ureasa.
La norma NCh 409, en su versión 2005, señala que: “Todas las muestras que se analicen
mensualmente en un servicio de agua potable, deben estar exentas de E.coli. Para la
verificación de este requisito, en las muestras en las que se haya detectado la presencia de
coliformes totales, se debe confirmar adicionalmente la ausencia de E. coli”.
REFERENCIAS
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ª Ed. 2005. 9222B
Standard Total Coliform Membrane Filter Procedure.
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TERMINOLOGÍA
Grupo Coliformes: todas las bacterias que desarrollan una colonia roja con brillo metálico dentro
de 24 horas de incubación a 35 °C en un medio tipo Endo conteniendo lactosa.
7
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1. EQUIPOS
6.1.1. Bomba de vacío 15 cm Hg y < 25 Bar de presión
6.1.2. Baño de agua termoregulado a 44,5º ± 0,2ºC
6.1.3. Manifol o soporte
6.2. MATERIALES
6.2.1 Vasos de filtración plásticos de 47 mm de diámetro sin recipiente inferior (Millipore XX
11047.10).
6.2.2 Filtros de membrana de ésteres mezclados de acetato y nitrato de celulosa, poro de 0,45
um, superficie cuadriculada, que retengan los organismos a ser cultivados, estables, libres
de químicos que puedan inhibir o estimular el desarrollo microbiano, resistentes a la
filtración (5 minutos), envase de 200 unidades (Millipore HAWG 047 S1).
6.2.3 Placas Petri plásticas estériles de 47 mm. de diámetro, cj 100 unidades (Millipore PD10
047 00).
6.2.4 Matraces de 2000 mL con Silica gel.
6.2.5 Botellón de 25 000 mL.
6.3. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE
6.3.1 Agar M-Endo Les
6.3.2 Agua de dilución buffer fosfato estéril
6.3.3 Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST)
6.3.4 Caldo Bilis Verde Brillante (BVB)
6.3.5 Caldo EC-MUG
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DESARROLLO
7.1 RECUENTO COLIFORMES
7.1.1
Colocar la membrana de 0,45 mm en el soporte con pinza estéril.
7.1.2
Homogeneizar la muestra agitándola vigorosamente 25 veces, con movimientos de arriba
abajo.
7.1.3
Verter 100mL. de la muestra, en el vaso del filtro y aplicar vacío, para hacer pasar la
muestra a través de la membrana. El vacío no debe exceder de 15 libras de presión.
7.1.4
Enjuagar el vaso tres veces, con porciones de 20 a 30 mL. cada vez, de agua de dilución,
y aplicar vacío igual que en la muestra.
7.1.5
Cada vez que se procesen muestras incorporar un control de esterilidad de agua de
dilución. Si se procesa un mayor número de muestras incorporar este control cada 10
muestras.
7.1.6
Retirar la membrana con una pinza estéril y depositarla en una placa Petri plástica,
preparada previamente con 4 mL. de agar M Endo Les. Las placas preparadas se guardan
en refrigeración y protegidas de la luz, y pueden usarse hasta dos semanas después de su
preparación.
7.1.7
Presionar suavemente la membrana sobre el medio de cultivo utilizando pinza estéril.
7.1.8
Incubar 22 a 24 hrs. a 35+/- 0,5º C, en incubadora de aire con 15 % de humedad o en
caja plástica cerrada con esponja humedecida.
7.1.9
Contar las colonias típicas y atípicas. Ocasionalmente colonias típicas pueden ser
producidas por organismos no coliformes y colonias atípicas pueden ser producidas por
organismos coliformes, por lo que se recomienda verificar un número representativo de
colonias típicas y atípicas.
Colonias típicas: color rojo, con brillo metálico.
Colonias atípicas: color rojo intenso sin brillo metálico
7.1.10 Registrar el recuento de colonias presuntivo en el registro código RG-712.00-025 y
realizar las pruebas confirmativas para coliformes.
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7.2 TEST CONFIRMATIVO COLIFORMES Y E. COLI
7.2.1
Inocular al menos 5 colonias típicas y 5 atípicas, en caldo LST y caldo BVB,
simultáneamente.
7.2.2
Incubar los tubos de LST y BVB por 48 hrs. a 35 +/- 0,5º C y observar la formación de
gas. Si los tubos de caldo BVB, resultan negativos, y los de caldo LST presentan gas,
traspasar los tubos positivos nuevamente a caldo BVB, e incubar 48 hrs. a 35 +/- 0,5º C.
7.2.3
Observar la formación de gas en los tubos de fermentación de BVB, la presencia de gas
y crecimiento en caldo BVB, confirma la colonia como coliformes. Anotar los resultados
del test confirmativo en el registro código RG-712.00-025 y de las cepas control en el
registro código RG-712.00-004.
7.2.4
De los cultivos positivos en caldo LST inocular una asada a tubos con caldo EC-MUG
para confirmar la presencia de E. coli.
7.2.5
Incubar los tubos de caldo EC-MUG en un baño de agua a 44,5º ± 0,2º C durante 24 +/- 2
hrs.
7.2.6
Observar bajo una fuente de luz ultravioleta, los tubos que presenten crecimiento y
formación de gas, y registrar en RG-712.00-025 y las cepas control en el registro RG712.00-005.
7.2.7
Los tubos que presenten fluorescencia son considerados positivos para la presencia de E.
coli.
7.3 EXPRESION Y CALCULO DE RESULTADOS
7.3.1
Considerar aquellas placas que tienen entre 20-80 coliformes y un total de todo tipo de
colonias de no más de 200.
El recuento de coliformes se calcula de la siguiente forma:
Coliformes totales /100 mL=
Nº colonias coliformes contadas x 100
mL de muestra filtrada
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Ajustar el recuento inicial sobre la base del porcentaje de verificación positivo como:
x 100
Porcentaje de coliformes verificadas = Nº de colonias verificadas
Nº total de colonias coliformes
sujetas a verificación
7.4 INFORME DE RESULTADOS
7.4.1
Los resultados del Recuento de coliformes, se expresan cuantitativamente como Nº
coliformes/100 mL de muestra.
7.4.2
Si no se ha observado colonias coliformes informar como “<1 coliformes/100 mL de
muestra”.
7.4.3
Los resultados para
“Ausencia”.
7.4.4
En el caso de presentarse crecimiento confluente que no permite diferenciar separación
entre las colonias, expresar el resultado como “Desarrollo confluente por 100 mL con o
sin presencia de organismos coliformes”.
7.4.5
Cuando el número de colonias tanto coliformes como no coliformes es mayor a 200
colonias por membrana o si las colonias no son distinguibles para realizar un recuento
preciso, expresar el resultado como “Muy Numerosas Para Contar” o “Confluente”,
respectivamente.
E. coli, se expresan cualitativamente como “Presencia” o
7.5 CONTROL DE CALIDAD
7.5.1
Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una
de cepa de Staphylococcus aureus sembrada en caldo LST y BVB utilizados para
confirmación de coliformes. También incluir medios de cultivo sin inocular para
controlar la esterilidad de los medios de cultivo en el momento de uso.
7.5.2
Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una
cepa de Enterobacter aerogenes en Caldo EC_MUG. Tambien incluir medios de cultivo
sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo en el momento del uso.
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REGISTROS
Identificación
Almacenamiento Protección
Recuperación
del registro
Registro cepas control de Carpeta
roja Bajo custodia Papel
incubadoras, RG-712.00- Laboratorio 348 Jefe
004
Laboratorio
348
roja Bajo custodia Papel
Registro cepas control de Carpeta
baños de agua para análisis Laboratorio 348 Jefe
de coliformes fecales, RGLaboratorio
712.00-005
348
Registro
control
de Carpeta
roja Bajo custodia Papel
esterilidad de medios de Laboratorio 348 Jefe
cultivo RG-712.00-006
Laboratorio
348
Registro
control
de Carpeta
roja Bajo custodia Papel
ambiente RG-712.00-050 Laboratorio 348 Jefe
Laboratorio
348
Registro de resultados Carpeta
roja Bajo custodia Papel
análisis de coliformes, Laboratorio 348 Jefe
coliformes fecales y E. coli
Laboratorio
en muestras de agua RG348
712.00-025
Tiempo retención
y disposición
5 años y después
eliminar
a
la
basura
5 años y después
eliminar
a
la
basura
5 años y después
eliminar
a
la
basura
5 años y después
eliminar
a
la
basura
5 años y después
eliminar
a
la
basura
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TABLA DE MODIFICACIONES
Revisión Nº Pág.
Modificada
1
2
3
4
5
10. ANEXOS
No Aplica
Motivo del cambio
Cambio de nombre para adaptar a NCh
409/05. Agrega en item fundamento, los
requisitos de la NCh.
Actualizar referencia.
Se incluyo cado EC-MUG para adaptar a
NCh 409/05
Especificar vigencia del medio M Endo Les
plaqueado.
Acotar tiempos y temperaturas de
incubación. Se incluye algunas
recomendaciones
Los puntos referidos a control de calidad se
trasladaron al item 7.5 Control de Calidad.
Indicación para confirmación de coliformes.
Corrección formula
Agregar algunos cambios en la
interpretación de resultados.
Incluir item sobre Control de Calidad.
Fecha Aprobación