Caracterización y expresión molecular de una proteína con alto

Caracterización y expresión molecular de una proteína con alto valor
funcional: Lactoferrina
S.A. González Chávez1, S. Arévalo Gallegos1, J. Salazar Martínez2, Q. Rascón-Cruz1.
1
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Chihuahua, Cd. Universitaria
s/n, CP 31170. Chihuahua, México. Tel: (614) 414-4492. 2Proteo/MU–Technology/,
Monterrey, N.L.
[email protected]
Resumen.
La lactoferrina (Lf) es una proteína funcional reconocida por su potencialidad en
aplicaciones biológicas, farmacológicas y nutracéuticas ya que exhibe capacidad como
inmunomodulador, antiinflamatorio, antioxidante, anticancerigeno y sobre todo como
antimicrobiano natural. Debido a esto una de sus principales aplicaciones es la
suplementación de alimentos tanto para el consumo humano como para consumo animal
con Lf obtenida de manera nativa o recombinante de varias especies con el objetivo de
agregar un valor nutricional extra a estos alimentos a beneficio de la salud de quien los
ingiere. En el presente estudio se pretende obtener esta proteína mediante dos
estrategias, la primera es la clonación del gen de Lf bovina (bLf) para producirla de
manera recombinante y la segunda es la estandarización de un método rentable para la
obtención de fracciones enriquecidas en Lf a partir de productos lácteos y producirla a
mediana escala.
Introducción.
La lactoferrina (Lf) es una proteína no hemática de unión a hierro perteneciente a la
familia proteica de las transferrinas (Shanbacher et al., 1992) cuya función es el
transporte de hierro en el suero sanguíneo. Es producida por las células epiteliales de las
mucosas de varias especies de mamíferos. Esta glicoproteína se encuentra en
secreciones mucosas incluyendo lágrimas, saliva, fluidos vaginales, semen (Van Der
Strate, 2001), secreciones nasales y bronquiales, bilis, fluidos gastrointestinales, orina
(Öztaş Yeşim, 2005) entre otras, sin embargo es en la leche y principalmente en el
calostro en donde se encuentra en mayor concentración (7 g/l) (Rodríguez et al., 2005).
Otro sitio en donde la Lf es encontrada en cantidades considerables es en los gránulos
secundarios de los neutrófilos (1.5 g/106 neutrófilos) en donde juega un papel biológico
muy importante.
Estructuralmente la Lf es una proteína glicosilada de 80 kD que consiste en una cadena
polipeptidica simple doblada en dos lóbulos simétricos (lóbulo N y C) con capacidad de
unir un átomo de Fe+2 o Fe+3 conectados por una región de bisagra (Drago M.E., 2006).
Esta capacidad y su distribución en diferentes tejidos hacen que la Lf sea considerada
multifuncional teniendo varias actividades fisiológicas dentro de las que se incluyen la
regulación de la absorción de hierro, respuesta inmune, agente antioxidante,
anticancerígeno, antiinflamatorio y principalmente la protección contra infecciones
microbianas siendo considerada un componente importante del sistema inmune no
específico (Rodríguez et al., 2005).
Esta proteína inhibe el crecimiento, tanto de bacterias Gram negativas como Gram
positivas, mediante mecanismos directos (secuestro de hierro necesario para el patógeno
en los sitios de infección) e indirectos (prevención de la adherencia de los patógenos a
las células). También ejerce una acción protectora contra hongos y levaduras así como
contra un amplio espectro de virus.
Observando las capacidades fisiológicas de la Lf en la defensa del huésped sumado a las
necesidades farmacéuticas y nutricionales que existen en la actualidad, la Lf es una
proteína con potencial uso en ambos campos por lo que es considerada un nutracéutico y
desde hace varias décadas hasta la fecha, los investigadores han buscado la manera
mas conveniente de obtenerla, de tal forma que ha la fecha la podemos obtener como Lf
nativa, aislada principalmente de leche y calostro de varios mamíferos y Lf recombinante
para la cual a través de los años se han empleado varios modelos de expresión dentro de
los que se encuentran sistemas bacterianos, fúngicos y virales, además se ha logrado la
expresión de esta proteína en organismos superiores como son plantas y mamíferos.
En el presente trabajo se pretende obtener la bLf mediante dos estrategias con el objetivo
de tener una fuente de obtención a, la primera es clonar y expresar el cDNA que codifica
para la bLf para producir la proteína de manera recombinante y la segunda es obtener la
proteína de manera nativa mediante la estandarización de un método rentable para
obtener una fracción proteica enriquecida en bLf.
Materiales y Métodos.
Clonación del cDNA de bLF. Para clonar el gen de la bLf primero se obtuvo el RNA total
a partir de tejido de glándula mamaria de bovino raza Holstein utilizando el reactivo de
TRIzol (Invitrogen) que actúa mediante la separación del RNA con isotiocianato de
guanidina, posteriormente se purificaron del RNA total los RNA’s mensajeros empleando
perlas magnéticas poli-T del kit Dynabeads (DynaL, OSLO). El cDNA de la bLf se obtuvo
a partir del mRNA mediante RT-PCR (Super-Script One step RT-PCR, Invitrogen)
utilizando dos juegos de primers diseñados en base a la secuencia del gen de Lf de Bos
taurus (BC116051) (Lacto5/Lacto3 y Lacto5Bgl2/Lacto3SacI), de los cuales un juego
tiene sitios de digestión para enzimas de restricción específicas. El cDNA fue clonado en
el vector pCR2.1 TOPO utilizando el kit TOPO TA Cloning (Invitrogen) y se transformaron
las células competentes químicas de E. coli Mach1-T1.
Obtención de una fracción enriquecida en Lf. Se han fraccionado proteínas de leche
de bovino mediante un gradiente de pH (pH 1.4 a 11.8) y diferentes concentraciones de
(NH4)2SO4 (5-40%), las fracciones obtenidas fueron separadas en un SDS-PAGE y
posteriormente trasferidas a membranas de nitrocelulosa a las que se les realizará un
Western blot empleando anticuerpos policlonales anti-bLf (USBiological, USA), para
identificar la fracción en la cual se obtiene mayor cantidad de bLf. Las condiciones en las
que se obtenga la fracción más enriquecida en bLf serán aplicadas a mediana escala de
producción de donde se obtendrá como producto final un liofilizado enriquecido en bLf.
Resultados.
Clonación del cDNA de bLF. A partir de tejido de glándula mamaria de bovino se
obtuvo el RNA total y de este el mRNA. La Figura 1 muestra el producto de la reacción de
RT-PCR en donde se obtuvo el cDNA de bLf, el gel de agarosa muestra una banda de
2102 pb que corresponde al tamaño esperado (~2100 pb) la cual fue obtenida con ambos
juegos de iniciadores. El cDNA fue clonado en el vector pCR2.1-TOPO y se
transformaron las células de E. coli Mach1-T1 las cuales fueron cultivadas en medio LB
con 100 (g/ml de ampicilina y X-gal que permitió la diferenciación de colonias
transformadas (blancas) y no transformadas (azules). A las colonias transformadas se les
extrajo el DNA plasmídico mediante lisis alcalina y posteriormente fue sometido a PCR
utilizando los iniciadores de bLf y M13 que permitieron la amplificación del fragmento
insertado del vector. Los productos de PCR obtenidos fueron identificados en un gel de
agarosa (Figura 2) en donde se observan bandas de alrededor de 2200 pb para 3 de las
clonas obtenidas. De las clonas obtenidas se determinó la orientación del gen en el
vector mediante digestión con enzimas de restricción caracterizando dos construcciones
en donde el gen de bLf se clonó en diferente orientación con respecto al promotor T7 del
vector (Figura 3).
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2
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5
4,090 bp
2,954 bp
2,036 bp
1,636 bp
2233 bp
1,018 bp
517 bp
Figura 1. Obtención de cDNA de bLf a partir de tejido. Gel de agarosa 1%. El cDNA se
obtuvo mediante RT-PCR a partir de mRNA utilizando iniciadores Lacto 5 y Lacto 3 (Carriles 2
y 3) y Lacto5Bgl2 y Lacto3SacI (Carriles 4 y 5). El carril 1 contiene el MWM 1Kb DNA Ladder.
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4,090 bp
2,954 bp
2,036 bp
1,636 bp
1,018 bp
517 bp
Figura 2. Caracterización de los cDNAs clonados de bLf. Gel de Agarosa 1% donde se
separaron los productos de amplificación del cDNA de bLf que fueron clonados en el vector
pCR 2.1-TOPO. Las clonas se analizaron por PCR utilizando los iniciadores Lacto 3 y Lacto 5
(carriles 2, 4 y 6) y M13 (3, 5 y 7). Carriles 9, 10 y 11 controles negativos. Carril: MWM 1Kb
DNA Ladder.
Figura 3. Construcciones obtenidas con el gen de bLf. De acuerdo a la caracterización
mediante enzimas de restricción se determinaron dos diferentes construcciones plasmídicas
que contiene el gen de bLf, pCRbLf53 en donde en gen de bLf se encuentra en orientación de
5’ a 3’ con respecto al promotor T7 y pCRbLf35 en donde se encuentra el gen orientado de 3’
a 5’ con respecto al promotor.
Obtención de una fracción enriquecida en Lf. La Figura 4 y 5 muestra las fracciones
obtenidas de la precipitación de las proteínas a diferentes pH´s y concentraciones de
(NH4)2SO4 respectivamente. En estas podemos observar que existe diferente patrón de
precipitación de las proteínas de leche para cada condición. Sin embargo, la identificación
específica de la bLf se obtendrá mediante el Western Blotting con el anticuerpo policlonal
anti-bLF (Figura 6).
190 kDa
120 kDa
85 kDa
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190 kDa
120 kDa
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60 kDa
50 kDa
60 kDa
50 kDa
40 kDa
40 kDa
25 kDa
25 kDa
20 kDa
15 kDa
20 kDa
15 kDa
10 kDa
(A)
10 kDa
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(B)
Figura 4. Fraccionamiento de proteínas de leche a diferentes pH’s. SDS-PAGE de
proteínas de leche de bovino precipitadas a diferentes pH´s utilizando solución de HCl 1N y
NaOH 1N según fuera necesario. (A) Carril 1: MWM BenchMark, carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7:
proteínas precipitadas a pH’s 1, 2, 3, 4, 5 y 6 respectivamente. (B) Carril 1: MWM BenchMark,
carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7: proteínas precipitadas a pH’s 7, 8, 9, 10, 11 y 12 respectivamente.
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85 kDa
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50 kDa
40 kDa
25 kDa
20 kDa
15 kDa
10 kDa
Figura 5. Fraccionamiento de proteínas de leche a diferentes concentraciones de
(NH4)2SO4. SDS-PAGE de proteínas de leche de bovino precipitadas a diferentes
concentraciones de (NH4)2SO4. Carril 1: MWM BenchMark, carriles 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8:
proteínas precipitadas a 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 40% de (NH4)2SO4 respectivamente.
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190 kDa
120 kDa
190 kDa
120 kDa
85 kDa
85 kDa
60 kDa
60 kDa
50 kDa
50 kDa
40 kDa
40 kDa
25 kDa
25 kDa
20 kDa
20 kDa
(A)
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(B)
Figura 6. Detección de Lactoferrina en leche a diferentes pH’s. Western Blot de
proteínas de leche de bovino precipitadas a diferentes pH´s utilizando el anticuerpo
policlonal anti-bLf acoplado a fosfatasa alcalina y revelado por quimioluminisencia. (A)
Carril 1: MWM BenchMark, carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7: proteínas precipitadas a pH’s 1, 2, 3, 4, 5
y 6 respectivamente, carril 8: proteínas de leche sin modificacion de pH, carril 10: bLf
(Bioferrin 2000). (B) Carril 1: MWM BenchMark, carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7: proteínas
precipitadas a pH’s 7, 8, 9, 10, 11 y 12 respectivamente, carril 8: proteínas de leche sin
modificacion de pH, carril 10: bLf (Bioferrin 2000).
Conclusiones.
Se clonó y caracterizó el cDNA que codifica para la Lf bovina con un tamaño aproximado
de 2100 pb muy cercano al tamaño reportado en la literatura logrando la construcción de
dos plasmados con el gen de bLf orientado en posición contraria en el vector. Se ha
avanzado para la obtención de un método para el enriquecimiento de una fracción de
leche rica en bLf nativa.
Este trabajo podrá proveer de bLf recombinante y un procedimiento para la obtención de
fracciones enriquecidas en bLf a partir de productos de leche a bajo costo de producción
para su aplicación en el área alimentaria
Bibliografía.
Drago, S.M.E. 2006. Actividades antibacterianas de la lactoferrina. Enf. Inf. Microbiol.
26:58-63.
Öztaş Yeşim, E.R. y Özgüneş, N. 2000. Lactoferrin: A multifunctional protein. Adv. Mol.
Med. 1:149-154
Rodríguez, D.A., Vázquez,
L. y Ramos, G. 2005. Actividad Antimicrobiana de la
lactoferrina: Mecanismos y aplicaciones clínicas potenciales. Rev. Latinoam.
Microbiol. 47:102-111.
Shanbacher, F.L., Goodman, R.E. y Talhouk, R.S. 1992. Bovine mammary lactoferrin:
Implications from messenger ribonucleic acid (mRNA) sequence and regulation
contrary to other milk proteins. J. Dairy Sci. 76:3812-3831.
Van Der Strate B.W.A., Belijaars, L., Molema, G., Harmsen, M.C. y Meijer, D.K.F. 2001.
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