vectores amplicón

ACTUALIZACIÓN
ACTUALIZACIÓN
SOBRE
SOBRE
NEURODEGENERACIÓN
NEURODEGENERACIÓN
Laboratorio
Laboratorio de
de Fisiología
Fisiología de
de la
la Conducta
Conducta
Febrero
-Abril 2005
Febrero-Abril
2005
Junio
Junio 2005
2005
SERIES
I.
I.
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
II.
II. PATOGENIA
PATOGENIA MOLECULAR
MOLECULAR
III.
III. ENFERMEDADES
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
NEURODEGENERATIVAS
IV.
IV. FUTURO
FUTURO EN
EN PREVENCIÓN,
PREVENCIÓN, DIAGNÓSTICO
DIAGNÓSTICO
YY TERAPÉUTICA
TERAPÉUTICA
Virus adeno-asociado
virus
virus
amplicón
integración
Vector
Terapia Genética
Transgen
Transgen
Plásmido
clonas
lentivirus
recombinante
HERPES
HERPES SIMPLE
SIMPLE 11
Virus
Virus “helper”
“helper”
genoma
retrovirus
ARN
ARN
replicación
USO DE
VECTORES VIRALES
IN VIVO
II parte
Laboratorio de Fisiología de la Conducta
2005
Aplicaciones
* Modelos animales de enfermedades
neurodegenerativas
* Terapia genética de enfermedades
neurológicas
VECTORES
PARA
LLEVAR TRANSGENES
AL
CEREBRO
¿QUÉ QUEREMOS HACER NOSOTROS?
Aplicaciones
Aplicaciones preclínicas
preclínicas
** Usar
Usar genes
genes que
que aumenten
aumenten oo disminuyan
disminuyan una
una determinada
determinada
función
función en
en un
un área
área particular
particular del
del cerebro
cerebro de
de ratas
ratas
** Esos
Esos genes
genes pueden
pueden ser
ser para
para enzimas,
enzimas, receptores,
receptores,
canales,
canales, factores
factores neurotróficos
neurotróficos etc.
etc.
** En
En los
los casos
casos particulares
particulares de
de enfermedades
enfermedades
neurodegenerativas
neurodegenerativas (modelos
(modelos animales)
animales) puede
puede ser
ser para
para
estudiar
estudiar mecanismos
mecanismos etiopatogénicos
etiopatogénicos oo para
para inducir
inducir
mejoría
mejoría
Si tenemos,
1.
1. El
El transgen
transgen de
de interés
interés insertado
insertado en
en el
el vector
vector
viral
viral apropiado
apropiado
2.
2. El
El vector
vector viral
viral en
en cantidad
cantidad suficiente
suficiente como
como
para
para lograr
lograr la
la expresión
expresión genética
genética esperada
esperada
Entonces,
Podremos
Podremos administrar
administrar el
el transgen
transgen
intracerebralmente
intracerebralmente simplemente
simplemente como
como
una
una DROGA!
DROGA!
Vectores
Vectores virales
virales
** AAV
AAV recombinantes
recombinantes::
Modelo
Modelo Alzheimer
Alzheimer en
en ratones
ratones
** HSV1
HSV1 amplicones
amplicones::
Modelo
Modelo EP
EP temporal
temporal en
en ratas
ratas
Virus Adeno-Asociado
Ventajas
Ventajas
°° Poco
Poco inmunogénicos
inmunogénicos
°° No
No son
son patógenos
patógenos
Desventajas
Desventajas
°Transgenes
°Transgenes pequeños
pequeños <4kb
<4kb
°Posible
°Posible mutación
mutación insercional
insercional
Virus Herpes Simple 1
Ventajas
Ventajas
°° Neurotropismo
Neurotropismo
°° Transgenes
Transgenes grandes
grandes
Desventajas
Desventajas
°° Son
Son patogénicos
patogénicos
°° Inmunogénicos
Inmunogénicos
Tecnología de Terapia Genética
1.
1. CONSTRUCCIÓN
CONSTRUCCIÓN TRANSGENES
TRANSGENES DE
DE INTERÉS
INTERÉS
2.
2. PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN VECTORES
VECTORES VIRALES
VIRALES
Desarrollo
Desarrollo de
de vectores
vectores derivados
derivados del
del virus
virus de
de
herpes
herpes simplex
simplex tipo
tipo 11 (HSV-1)
(HSV-1)
Alberto
Alberto L.
L. Epstein
Epstein
Centre
Centre de
de Génétique
Génétique Moléculaire
Moléculaire et
et Cellulaire
Cellulaire
Université
Université Claude
Claude Bernard
Bernard Lyon
Lyon II
Université Claude Bernard Lyon 1
VIRUS HERPES SIMPLE 1
VIRUS
-1)
(HSV
VIRUS DEL
DEL HERPES
HERPES SIMPLE
SIMPLE TIPO
TIPO II (HSV(HSV-1)
glicoproteínas
1
proteína de
membrana
tegumento
capside
b ’ a’n c ’
UL
4
c a
US
152 kpb
2
Familia herpesviridae,
sub-familia α
herpesvirinae
3
ADN viral
an b
cubierta
bicapa
lipídica
Virus neurotrópico
con cubierta
Genoma lineal doble banda
de ADN 152kpb
El
El hombre
hombre es
es el
el huésped
huésped
natural
natural del
del HSV
HSV
La
La infección
infección es
es casi
casi
universal,
universal, casi
casi todos
todos los
los
adultos
adultos son
son seropositivos
seropositivos
1.
Replicación lítica en la puerta de entrada epitelial
2.
Viriones liberados del epitelio entran en los terminales sensoriales
3.
Nucleocápside y tegumento van por transporte axónico retrógrado al soma
4.
ADN viral entra al núcleo e inicia cascada lítica de expresión
genética o se vuelve latente
5.
Durante la latencia el genoma viral permanece episomal o nuclear, sólo los genes
LAT se expresan
6.
Inmunosupresión, enfermedad intercurrente u otros estímulos
“reactivan” la infección lítica
7.
Los viriones son formados por gemación de la membrana nuclear
8.
Nucleocápside y glicoproteínas transportadas separadamente por transporte
axonal anterógrado
9.
Ensamblaje del virion y salida del terminal
10.
Infección epitelial recurrente en el sitio de la lesión primaria o
cerca de ella
Genoma Virus Herpes Simple 1
°° Doble
Doble banda
banda de
de ADN
ADN lineal
lineal 152Kb
152Kb
Tiene
Tiene 81
81 genes,
genes, la
la mitad
mitad no
no esenciales
esenciales que
que pueden
pueden
reemplazarse
reemplazarse por
por 40-50kb
40-50kb de
de genes
genes extraños
extraños
GENES principales para la REPLICACIÓN
1
1. Alfa
Alfa o
o tempranos
tempranos inmediatos:
inmediatos:
ICPO,
ICPO, ICP4,
ICP4, ICP22,
ICP22, ICP27,
ICP27, ICP47
ICP47 que
que
son
son factores
factores transactivantes
transactivantes que
que
permiten
permiten producción
producción de
de los
los
2.
2. Tempranos
Tempranos :codifican
:codifican para
para metabolismo
metabolismo de
de
nucleótidos
nucleótidos yy replicación
replicación de
de
ADN
ADN
3.
3. Tardíos
Tardíos :: activados
activados por
por los
los anteriores
anteriores yy
codifican
codifican para
para proteínas
proteínas estructurales
estructurales
VECTORES DERIVADOS DE HSV
-1
HSV-1
Tropismo variado, neurotropismo
Células mitóticas y post-mitóticas
Se mantienen como episomas
Genoma de 152 kpb
Vectores
Vectores derivados
derivados de
de HVS1
HVS1
** Recombinantes
Recombinantes
** Amplicones
Amplicones
Recombinantes
Recombinantes HSV1
HSV1
** Son
Son virus
virus con
con replicación
replicación deficiente
deficiente
por
por eliminar
eliminar uno
uno de
de los
los genes
genes tempranos
tempranos
inmediatos
inmediatos como
como ICP4
ICP4
** Son
Son menos
menos patogénicos
patogénicos yy pueden
pueden
dirigir
dirigir la
la expresión
expresión del
del transgen
transgen en
en el
el
cerebro
cerebro
Amplicon
Amplicon
Un
Un término
término para
para cualquier
cualquier pequeño
pequeño
fragmento
fragmento replicante
replicante de
de ADN
ADN
Amplicones HSV1
Plásmidos
Plásmidos producidos
producidos en
en bacterias
bacterias que
que tienen:
tienen:
1.
1. Sitio
Sitio de
de origen
origen de
de replicación
replicación de
de E.
E. coli
coli (col
(col E
E ori)
ori)
2.
2. Sitio
Sitio de
de origen
origen de
de replicación
replicación de
de HSV
HSV 11 (OriS)
(OriS)
3.
3. Secuencia
Secuencia de
de empaquetamiento
empaquetamiento de
de HSV
HSV 11
4.
4. Transgen
Transgen bajo
bajo control
control de
de un
un promotor
promotor temprano
temprano
inmediato
inmediato
5.
5. Marcador
Marcador seleccionable
seleccionable
Plásmido amplicón
pA-EUA2
CGMC (Lyon)
°
°
°
°
°
colE1
oriS
Resist. Ampicilina
GFP
HCMV promotor
Ori
plásmido Amplicon
(pA)
pac
EL VECTOR AMPLICON
HSV-1
TRANSGEN
VECTORES AMPLICONES
1.
1. Desprovistos
Desprovistos de
de genes
genes virales
virales
-ausencia
-ausencia de
de toxicidad
toxicidad
-capacidad
-capacidad de
de transferir
transferir >130
>130 kpb
kpb ADN
ADN exógeno
exógeno
2.
2. Expresión
Expresión TRANSITORIA
TRANSITORIA
3.
3. Construcción
Construcción de
de plásmido
plásmido amplicón
amplicón fácil
fácil yy
rápida
rápida
4.
4. Necesidad
Necesidad de
de un
un virus
virus AUXILIAR
AUXILIAR para
para su
su
producción,
producción, que
que provea
provea los
los genes
genes
reguladores
reguladores yy estructurales
estructurales que
que faltan
faltan para
para
replicación
replicación yy empaquetamiento
empaquetamiento de
de las
las
partículas
partículas virales
virales
VIRUS DEFECTUOSO AUXILIAR
(HELPER) HSV1-Lal∆J
Barreras
Barreras de
de seguridad
seguridad independientes:
independientes:
** Carece
Carece de
de los
los GENES
GENES que
que codifican
codifican para,
para,
°° proteína
proteína esencial
esencial ICP4
ICP4
°° factor
factor de
de virulencia
virulencia ICP34.5
ICP34.5
** No
No se empaqueta durante
durante la
la
producción
producción de
de vectores
vectores amplicones,
amplicones, por
por tanto
tanto
se
se producirán
producirán muy
muy pocos
pocos helpers
helpers que
que es
es lo
lo
deseable
deseable
Sistema auxiliar (helper)
basado en Cre-loxP
loxP
a
Deleción Sitio-específica
de secuencias «a» de
empaquetamiento
HSV-1
CRE
CRE
loxP
CRE
a
loxP
+
loxP
HSV-1 ∆a
HSV1-LaL∆J
Elementos del nuevo sistema de
producción de vectores amplicones
* Virus HSV-1 LaLdeltaJ (virus auxiliar):
ºº defectuoso
defectuoso (no
(no tiene
tiene ICP4;
ICP4; ICP34.5)
ICP34.5)
ºº encapsidación
encapsidación inhibida
inhibida en
en presencia
presencia de
de recombinasa
recombinasa
Cre
Cre
* Línea celular BHK CINA (ICP4+)
* Línea celular TE CRE GRINA (ICP4+; Cre+)
El sistema HSV-1 LaL-∆J/TE CRE GRINA
1.
∆a
LaL
∆a/ICP4
∆a/ICP4
HSV-1 LaL∆J
Virus HSV1
auxiliar
UL44
2.
HCMV
ICP4
IRES NeoR
GRE5
ICP4
IRES NeoR
Células BHK-CINA
3.
Células TE CRE GRINA
HCMV
CRE
Producción
Producción de
de AMPLICONES
AMPLICONES HSV1
HSV1
CGCM,
CGCM, Lyon
Lyon Francia
Francia
Etapa
Etapa II
Día
Día 0:
0: Células
Células BC6
BC6 (BHK
(BHK que
que expresan
expresan ICP4)
ICP4)
Día
Día 1:
1: Transfección
Transfección con
con pA-transgen
pA-transgen
Día
Super-infección con
con virus
virus defectuoso
defectuoso helper
helper LaL∆J
LaL∆J
Día 2:
2: Super-infección
Día
Día 3:
3: Esperar
Esperar
Día
Recoger STOCK
STOCK 1:
1:
Día 4:
4: Recoger
vector
vector amplicón
amplicón ++ virus
virus helper
helper
Etapa
Etapa 22
Día
Día 0:
0: Células
Células TE
TE CRE
CRE GRINA
GRINA 129
129 (expresan
(expresan ICP4
ICP4 yy CRE)
CRE)
Día
Infección con
con STOCK
STOCK 11
Día 1:
1: Infección
Día
Día 2:
2: Recoger
Recoger STOCK
STOCK 2:
2:
6
vectores
vectores amplicón
amplicón 55 xx 10
106
1%
1% max
max de
de contaminación
contaminación 55 xx 10
1044
Titulación
Titulación al
al final
final de
de cada
cada etapa
etapa
Producción Vectores Amplicones
oriS
Plásmido
Amplicon
a
TRANSFECCIÓN
CÉLULAS
BHK-CINA
Helper virus
INFECCIÓN
Replicación y
empaquetamiento
FASE I
Vectores
Amplicones
Virus
auxiliar
Producción Amplicones usando el sistema LaL-∆J
HSV-1 LaL-∆J
(VIRUS AUXILIAR)
pA
Infección
HSV-1 LaL-DJ
ICP4
CÉLULAS
BHK-CINA
ICP4
Amplicones
CRE
FASE I
AMPLICONES
FASE II
CÉLULAS
TECRE GRINA
El sistema HSV-1 LaL-∆J/TE CRE GRINA
∆a
LaL
∆a/ICP4
∆a/ICP4
HSV-1 LaL∆J
UL44
Amplicones +
Helper virus
FASE I
HCMV
ICP4
IRES NeoR
GRE5
ICP4
IRES NeoR
3:1
Células BHK-CINA
FASE II
Amplicones +
Células TE CRE GRINA
HCMV
CRE
Helper virus
200:1
TITULACIÓN
Amplicones
Amplicones células
células Gli
Gli 36
36 (glioblastoma)
(glioblastoma)
Día
Día 0:
0: Células
Células Gli
Gli 36
36
Día
Día 1:
1: infección
infección
Día
Día 2:
2: contar
contar número
número de
de células
células GFP+
GFP+
Virus
Virus helper
helper células
células E5
E5 (Vero
(Vero que
que expresan
expresan ICP4)
ICP4)
Días
Días 00 yy 1:
1: igual
igual aa amplicón
amplicón
Días
Días 33 yy 4:
4: contar
contar número
número de
de placas
placas de
de lisis
lisis
Recombinante
Recombinante células
células Vero
Vero
(African
(African green
green monkey
monkey kidney)
kidney)
Igual
Igual aa E5:
E5: ver
ver signos
signos de
de citotoxicidad
citotoxicidad
Células GFP +
PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN DE
DE VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES CON
CON EL
EL SISTEMA
SISTEMA LAL-∆J
LAL-∆J
1E+09
1E+08
1E+07
Helper virus
(pfu/ml)
1E+06
Amplicons
(tu/ml)
1E+05
1E+04
Líneas
celulares
BHK CINA
TE CRE GRINA
En células BHK-CINA, la razón vector/auxiliar es 3:1
En células TE CRE GRINA, la razón vector/auxiliar es 200:1
Ausencia
Ausencia de
de citotoxicidad
citotoxicidad de
de VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES (48
(48 p.i)
p.i)
Marcaje
Marcaje con
con ioduro
ioduro de
de propidium
propidium (PI)
(PI)
104
103
PI
PI
100 101
101
100
100
101
102
103 104
GFP
No infectadas
100
PI+ = 36,2%
102
102
103
102
100 101
PI
PI+ = 2,1%
103
104
PI+ =1,8%
104
Línea celular Gli36
101
102
103 104
GFP
Vector amplicon
(5 TU/cell)
100
101
102
103 104
GFP
Vector amplicon (5 TU/cell)
+ HSV-1 LaLDJ (2 PFU/cell)
AUSENCIA
AUSENCIA DE
DE CITOTOXICIDAD
CITOTOXICIDAD DE
DE
VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES (48
(48 P.I.)
P.I.)
(coloración
(coloración cristal
cristal violeta)
violeta)
% de supervivencia
Línea celular Gli36
No infectadas
120
Vector amplicon
( 5 TU/cel)
100
Vector amplicon
(5 TU/cel)
+ HSV-1 LaL∆J
(2 PFU/cel)
80
60
40
20
0
43 %
27 %
1,6 %
HSV-1 LaL∆J
(5 PFU /cel)
HSV-1 17+
(5 PFU/cel)
VECTORES AMPLICONES
derivados de HSV-1
Terapia genética
Enf. cerebrales
Vacunas
VHC, VIH
bacteria
Transferencia de genes
Bibliotecas genómicas
humanas y murinas
PROCESO
PROCESO DESDE
DESDE DISEÑO
DISEÑO HASTA
HASTA LA
LA
PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN DE
DE UN
UN VECTOR
VECTOR
1.
1.
Diseñar
Diseñar el
el “INSERTO”
“INSERTO”
2.
2. Hacer
Hacer el
el plásmido
plásmido con
con el
el transgen
transgen
3.
3. Amplificar
Amplificar plásmido
plásmido VECTOR
VECTOR yy VIRUS
VIRUS
HELPER
HELPER
4. Producir VECTORES
pA-GFP-loxP
Plásmido amplicón
E. Coli
Cre
loxP
loxP
Bac-Contig X
Secuencia genómica
CLONAJE
CLONAJE DE
DE UNA
UNA SECUENCIA
SECUENCIA
GENÓMICA
GENÓMICA
DENTRO
DENTRO DE
DE UN
UN PLÁSMIDO
PLÁSMIDO
AMPLICÓN
AMPLICÓN
pA-Contig
Contig X
pAmplicon
X
Plásmido amplicón
con el transgen
Construcción de un plásmido amplicón
que lleva una secuencia genómica
p Amplicón
virus auxiliar
pA-Contig X
Transfección
Infección
Contig X
pAmplicon
Encapsidación
Vector amplicón que porta
150 kbp de ADN exógeno
Replicación
Encapsidación
Vectores amplicones
No contaminados
Clonaje
Clonaje de
de la
la biblioteca
biblioteca genómica
genómica humana
humana en
en amplicones
amplicones
loxP
loxP
Contig A
B
genes
Plásmido amplicón
10 kbp
C
E. coli-CRE
pA-Contig
A
pA-Contig
B
pA-Contig
Encapsidación
C
Vectores
Vectores virales
virales
** AAV
AAV recombinantes
recombinantes::
Modelo
Modelo Alzheimer
Alzheimer en
en ratones
ratones
** HSV1
HSV1 amplicones:
amplicones:
Modelo
Modelo EP
EP temporal
temporal en
en ratas
ratas
* Modelo de EPILEPSIA
Parcial Compleja, o del lóbulo temporal
(ratas
(ratas TRANSGÉNICAS)
TRANSGÉNICAS)
VECTOR:
VECTOR: HSV1
HSV1 amplicon
amplicon
Gen:
Gen: enzima
enzima glutamato
glutamato decarboxilasa
decarboxilasa (GAD)
(GAD)
GEN
GEN REPORTERO
REPORTERO: GFP
GFP junto
junto con
con el
el transgen
transgen
CGMC (Lyon, Francia)
¿Qué es EPILEPSIA?
** Crisis
Crisis recurrentes
recurrentes que
que resultan
resultan de
de descargas
descargas
anormales
anormales en
en el
el cerebro
cerebro
Alteración
Alteración de
de conciencia,
conciencia, movimiento
movimiento oo
sensación
sensación
** Causas
Causas desconocidas
desconocidas
Predisposición
Predisposición genética
genética aa heredar
heredar umbral
umbral
bajo
bajo para
para descargas
descargas en
en algunos
algunos casos
casos
Trauma,
Trauma, infección,
infección, tumor
tumor oo ACV
ACV
** No
No hay
hay cura,
cura, puede
puede haber
haber buen
buen control
control
farmacológico
farmacológico
BALANCE
Inhibición
Reducción glutamato
Aumento GABA
Excitación
Aumento glutamato
Reducción GABA
Epilepsia
Aumento
Aumento de
de excitabilidad
excitabilidad y/o
y/o
Disminución
Disminución de
de inhibición
inhibición en
en la
la
función
función cerebral
cerebral
Síndrome EPILÉPTICO
1.
1. Exceso
Exceso función
función excitadora
excitadora (( Glutamate)
Glutamate)
2.
2. Déficit
Déficit función
función inhibidora
inhibidora (( GABA)
GABA)
3.
3. Exceso
Exceso de
de función
función Na+
Na+ canales
canales
Síndrome epiléptico:
* Crisis generalizadas (Grand Mal, ausencias)::
Involucra
Involucra todo
todo el
el cerebro
cerebro
Pérdida
Pérdida de
de conciencia
conciencia
* Crisis parciales::
Involucra
Involucra sólo
sólo una
una parte
parte del
del cerebro
cerebro
No
No siempre
siempre hay
hay pérdida
pérdida de
de conciencia
conciencia
1.
1. Simple
Simple
Sensaciones
Sensaciones oo movimientos
movimientos locales
locales no
no
usuales
usuales
2. Compleja
Compleja (EP
(EP temporal)
temporal)
Una
Una disminución
disminución en
en el
el estado
estado de
de
conciencia
conciencia con
con movimientos
movimientos repetitivos
repetitivos
Epilepsia Parcial
EP del Lóbulo Temporal
EP compleja parcial
puede comenzar en una
pequeña área del lóbulo
temporal: AMÍGDALA,
parte del sistema límbico
Estos pacientes
presentan alteraciones
del estado de
conciencia y con
frecuencia síntomas
psíquicos
Epilepsia parcial compleja
(psycomotora
(psycomotora or
or temporal)
temporal)
** Deterioro
Deterioro de
de la
la conciencia
conciencia
** Compleja
Compleja distorsión
distorsión de
de sensaciones
sensaciones yy
pensamiento
pensamiento (gozo,
(gozo, temor,sonidos,
temor,sonidos, olores)
olores)
Actividad
Actividad motora
motora parcialmente
parcialmente
coordinada
coordinada (automatismos)
(automatismos)
** Con
Con frecuencia
frecuencia difícil
difícil de
de controlar
controlar
Tratamiento
Tratamiento quirúrgico
quirúrgico para
para 30%
30% de
de casos
casos
(sólo
(sólo 50%-60%
50%-60% mejoran)
mejoran)
“KINDLING”
“KINDLING”
Modelo
Modelo animal
animal EP
EP Parcial
Parcial Compleja
Compleja
** Estimulación
Estimulación eléctrica
eléctrica repetida
repetida con
con
intensidad
intensidad subumbral
subumbral
** En
En regiones
regiones específicas
específicas del
del cerebro
cerebro como
como la
la
amígdala
amígdala
** Esto
Esto lleva
lleva aa aumento
aumento permanente
permanente de
de la
la
susceptibilidad
susceptibilidad aa crisis
crisis EP
EP
Sustrato anatómico
-- EP
EP parcial
parcial compleja
compleja
-- ‘kindling’
‘kindling’
SISTEMA LÍMBICO
Una red de estructuras localizadas debajo de la
corteza implicadas en el control de emociones,
afecto y memoria.
‘Kindling’
‘Kindling’
Unas
Unas 22 semanas
semanas luego
luego de
de repetida
repetida estimulación
estimulación subsubumbral
umbral los
los animales
animales exhiben
exhiben convulsiones
convulsiones al
al aplicarse
aplicarse la
la
estimulación
estimulación eléctrica
eléctrica
Sus
Sus cerebros
cerebros se
se “sensibilizan”
“sensibilizan” al
al estímulo
estímulo sub-umbral!
sub-umbral!
El
El nombre
nombre viene
viene del
del término
término inglés
inglés “encender”
“encender” por
por la
la
comparación
comparación de
de encender
encender leña
leña con
con pequeños
pequeños tizones,
tizones,
Es
Es como
como “encender”
“encender” el
el cerebro
cerebro
La teoría detrás del kindling…
Pequeños eventos repetidos de
estimulación aumentan la susceptibilidad
para futuros episodios que finalmente
pueden ocurrir espontáneamente
Algo pasa en el cerebro en el tiempo que
aumenta la vulnerabilidad del sujeto para
las crisis.
“Kindling” puede modificar “conexiones” del cerebro
Morimoto K. Progress in Neurobiology, 2004
° Crecimiento de nuevas conexiones.
° Pérdida de las conexiones existentes
En respuesta a exceso de activación neural
(kindling) que lleva a alteración permanente
de la susceptibilidad a las crisis
Epilepsia
Desbalance
Desbalance neuroquímico
neuroquímico en
en el
el cerebro
cerebro
Cambios
Cambios en,
en,
** Amino
Amino ácidos:
ácidos: GLU,
GLU, GABA
GABA
** Neuropéptidos:
Neuropéptidos: NPY
NPY oo Galanina
Galanina
** Factores
Factores neurotróficos
neurotróficos :: BDNF
BDNF
** Citokinas
Citokinas
Pueden
Pueden inducir
inducir crisis
crisis epilépticas
epilépticas
AMIGDALA
electrodo
Estimulación
Eléctrica
DENTATE GYRUS
Cánula Microdiálisis
Animal durante estimulación eléctrica y microdiálisis
Microdiálisis en hipocampo
durante kindling en amígdala
anterior
Amígdala
Dentate Gyrus
posterior
Cerebro de rata
MD
EE
Estimulación Eléctrica “kindling” en AMÍGDALA
Temporal lobe
Cerebro rata AP:–3.4 mm bregma
L: 4.5 mm sagittal sinus
MD
ES
Microdiálisis DENTATE GYRUS (hippocampus)
Cerebro de rata AP:–4.5 mm bregma
L: 2.2 mm sagittal sinus
Hipocampo
Dentate gyrus
astrocitos
microglia
neuronas
P. Rada Lab. Fisiología Conducta
Larisa Poluektova CNND Omaha 2005
Hipocampo
dentate gyrus ratas
astrocitos
microglia
neuronas
P. Rada Lab. Fisiología Conducta
Larisa.Poluektova CNND Omaha 2005
Microambiente bioquímico alrededor de sinapsis
SINAPSIS
SINAPSIS
Espacio
Espacio
Extracelular
Extracelular
Microdiálisis
Microdiálisis
Transmisión
Transmisión
química
química
Microdiálisis en movimiento…
Análisis de muestras
Mediciones de glutamato y otros
* HPLC
* CE-LIFD
alta sensibilidad,
buena resolución
muy bajos volúmenes de muestras
recolección en tiempos muy cortos !!
Porcentaje del nivel basal
Primera microdiálisis hipocampo
2da sesión de estimulación eléctrica – No convulsiones
600
Estimulación
Eléctrica
500
400
300
200
control
100
0
0
100
200
300
400
Tiempo (sec.)
Glutamato aumentó > 300% (CE-LIFD)
Segunda microdiálisis hipocampo
15ema estimulación eléctrica - Convulsiones
Glutamate (1x10-8 M)
8
Glutamato Gyro dentado
7
6
5
4
3
2
1
0
Control
CONTROL
Antes de Ultima
estimulacion
Antes
última estimulación
Niveles basales de glutamato están ya aumentados
antes de la estimulación eléctrica
Manipulación de Sistemas
Aminoacidérgicos
por
Transferencia Genética
En “kindling” en ratas
(modelo de EP compleja parcial)
Transgen enzima
Glutamato
descarboxilasa
(GAD)
en HSV1 amplicones
º Más GABA en
hipocampo
º Modificación de
“Kindling” y su
correlato bioquímico ??
Sinapsis aminoacidérgicas
RESULTADOS esperados
* Cambios de conducta
-tests conductuales-
* Cambios químicos:
-microdiálisis y análisis de muestras-
Con respecto a los cambios ya conocidos durante
“kindling”
TENDENCIAS EN TECNOLOGÍA
TRANSFERENCIA GENÉTICA
1.
1. Más
Más aplicaciones
aplicaciones pre
pre clínicas
clínicas yy clínicas
clínicas
Probar
Probar en
en más
más enfermedades
enfermedades mono,
mono, multigénicas
multigénicas yy
otras:
otras
otras::
PD,
epilepsia
hipertensión
PD, ALS,
ALS, epilepsia,
epilepsia,, diabetes,
diabetes, hipertensión,
hipertensión,, AR
AR etc.
etc.
2.
2. Optimización
Optimización de
de vectores
vectores como
como “drogas”
“drogas”
Seguridad:
Seguridad
Seguridad:: inmunogenicidad
inmunogenicidad de
de vectores
vectores
Prevención
Prevención de
de replicación
replicación viral
viral
Evitar
Evitar agentes
agentes contaminantes
contaminantes
Prevención
Prevención de
de mutaqgénesis
mutaqgénesis insercional
insercional
Prevención
Prevención de
de paso
paso de
de ADN
ADN exógeno
exógeno yy viral
viral aa la
la línea
línea
germinal
germinal
Para el futuro……
Expresión
Expresión genética
genética más
más eficientemente
eficientemente
dirigida
dirigida al
al blanco,
blanco, para
para resolver
resolver más
más
problemas
problemas médicos,
médicos, sin
sin causar
causar daño
daño aa los
los
pacientes,
pacientes, investigadores
investigadores oo ambiente!!!
ambiente!!!
Pero
Pero actualmente,
actualmente,
No
No podemos
podemos utilizar
utilizar los
los vectores
vectores preparados
preparados
fuera
fuera de
de Venezuela
Venezuela por
por regulaciones
regulaciones
aduanales
aduanales internacionales
internacionales
Por
Por tanto
tanto tenemos
tenemos que
que producir
producir aquí
aquí los
los
vectores
vectores virales
virales si
si queremos
queremos hacer
hacer algo
algo de
de lo
lo
anterior
anterior
INFRAESTRUCTURA
INFRAESTRUCTURA
PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN DE
DE VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES
A.
A. Cultivo
Cultivo de
de BACTERIAS
BACTERIAS E.
E. Coli
Coli competentes
competentes
clonaje
clonaje de
de secuencia
secuencia genómica
genómica en
en plásmido
plásmido amplicón
amplicón
producción
producción de
de plásmido
plásmido amplicón
amplicón
B.
B. Cultivo
Cultivo de
de CÉLULAS
CÉLULAS
producción
producción del
del amplicón:
amplicón: células
células BHK
BHK yy TE
TE CRE
CRE GRINA
GRINA
titulación
titulación de
de los
los vectores:
vectores: células
células GLI
GLI 36,
36, E5,
E5, VERO
VERO
C.
C. Producción
Producción de
de VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES
FASE
FASE I:
I: amplicones
amplicones yy helper
helper virus
virus
FASE
FASE II:
II: amplicones
amplicones
A
Laboratorio de
BACTERIAS (clonaje)
Campana de trabajo
Centrífuga
con bacterias
regrigerada
maxipreparación
Trabajo en la campana
cultivo de bacterias
A
Laboratorio de
BACTERIAS (clonaje)
Campana, nevera y mesón
Sonicador y centrífuga
A
Laboratorio de
BACTERIAS
(clonaje)
Incubador y agitador
crecimiento de
bacterias
(tubos y matraces)
B LABORATORIOS NIVEL 2 DE SEGURIDAD
B LABORATORIOS NIVEL 2 DE SEGURIDAD
GRUPO
GRUPO 22 DE
DE RIESGO
RIESGO: riesgo
riesgo individual
individual moderado,
moderado,
riesgo
riesgo comunidad
comunidad bajo
bajo
** Cualquier
Cualquier patógeno
patógeno que
que pueda
pueda causar
causar enfermedad
enfermedad humana
humana
en
en CN
CN improbable
improbable que
que sea
sea un
un peligro
peligro serio
serio para
para trabajadores,
trabajadores,
comunidad,
comunidad, animales
animales oo el
el ambiente.
ambiente.
** Exposiciones
Exposiciones en
en el
el laboratorio
laboratorio rara
rara vez
vez causan
causan infección
infección que
que lleve
lleve aa
enfermedad
enfermedad grave
grave
** Debe
Debe haber
haber tratamiento
tratamiento efectivo
efectivo yy medidas
medidas preventivas
preventivas disponibles
disponibles
** El
El riesgo
riesgo de
de diseminación
diseminación es
es limitado
limitado
LABORATORIO
LABORATORIO NIVEL
NIVEL 2
2
..
** Los
Los riesgos
riesgos de
de exposición
exposición primaria
primaria nivel
nivel 22 son
son aa través
través de:
de:
ingestión,
ingestión, inoculación
inoculación yy vía
vía de
de entrada
entrada mucosa.
mucosa.
** Aunque
Aunque los
los agentes
agentes nivel
nivel 22 no
no son
son trasmitidos
trasmitidos por
por vía
vía aérea,
aérea,
al
al generarse
generarse aerosoles
aerosoles en
en los
los mesones
mesones pueden
pueden volverse
volverse un
un
riesgo
riesgo de
de ingestión
ingestión por
por contaminación
contaminación de
de manos
manos oo salpicaduras
salpicaduras
** Usar
Usar dispositivos
dispositivos de
de contención
contención primaria
primaria como
como centrifugas
centrifugas con
con
rotores
rotores sellados
sellados oo tapas
tapas de
de seguridad
seguridad
** Usar
Usar epuipo
epuipo apropiado
apropiado de
de protección
protección para
para el
el personal
personal (guantes,
(guantes,
batas
batas de
de laboratorio,
laboratorio, protección
protección de
de los
los ojos).
ojos).
** Minimizar
Minimizar la
la contaminación
contaminación ambiental
ambiental por
por el
el uso
uso de
de lavamanos
lavamanos yy
dispositivos
dispositivos de
de decontaminación
decontaminación (autoclaves)
(autoclaves)
Laboratorio P2
CULTIVO
CULTIVO DE
DE CÉLULAS
CÉLULAS
Y
Y TRABAJO
TRABAJO CON
CON
VECTORES
VECTORES
ambiente
ambiente cerrado
cerrado aire
aire
acondicionado
acondicionado
Puerta externa al
corredor
1
2
1
Cuartos con flujo laminar
Laboratorio P2
2
Neveras a la entrada de cuartos
de FLUJO LAMINAR
Laboratorio P2
Campana células
Campana
vectores
congelador
nevera
Campanas de flujo laminar separadas, para trabajo con vectores
(fondo) para trabajo de cultivo de células (frente)
Laboratorio P2
CAMPANA para TRABAJO CON CÉLULAS
Laboratorio P2
CAMPANA TRABAJO
CON CÉLULAS
Laboratorio P2
Campana células
Laboratorio P2
Campana
Campana antes
antes de
de comenzar
comenzar
Laboratorio P2
CAMPANA
CAMPANA TRABAJO
TRABAJO
CON
DESPUÉS
CON VECTORES
VECTORES DESPUÉS
DE
DE USO
USO
Área
Área dentro
dentro de
de la
la
campana
campana
para
para descartar
descartar material
material
contaminado
contaminado con
con vectores
vectores
yy virus
virus
desechos
Laboratorio P2
Campana vectores
campana
vectores
campana células
Eliminación
Eliminación de
de desechos
desechos en
en P2
P2
Laboratorio P2
Tanque CO2
Incubador 37°C 5% CO2
Líneas celulares
Incubador 34° C 5% CO2
Células infectadas
Laboratorio P2
Material autoclavado
guantes
Pipetas y tubos cónicos
Laboratorio P2
Microscopio
Microscopio de
de inversión
inversión para
para ver
ver células
células en
en cultivo
cultivo
Laboratorio P2
Sonicador
Sonicador para
para romper
romper células
células yy agitador
agitador
Protectores
Protectores de
de ultrasonido
ultrasonido
FREGADERO
FREGADERO DE
DE P2
P2
Fuera
Fuera de
de los
los laboratorios
laboratorios con
con flujo
flujo laminar
laminar
FREGADERO
FREGADERO DE
DE P2
P2
Fuera
Fuera de
de los
los laboratorios
laboratorios con
con flujo
flujo
laminar
laminar
Recipientes
Recipientes desechables
desechables con
con
hipoclorito
hipoclorito de
de sodio
sodio antes
antes de
de
descartarlos
descartarlos
WATER
WATER BATH
BATH 37°C
37°C
FREGADERO
FREGADERO DE
DE P2
P2
MATERIAL
MATERIAL PARA
PARA DESCARTAR
DESCARTAR
CUARTO DE LIMPIEZA
GENERAL
Material
Material vidrio
vidrio yy plástico
plástico reusable
reusable
Autoclave
Laboratorio Biología Molecular
Laboratorio
Laboratorio Biología
Biología Molecular
Molecular
Laboratorio Biología Molecular
pipetas
papel
vidrio
químicos
Laboratorio Biología Molecular
Campana para químicos
Laboratorio Biología Molecular
Cuarto frío a 4°C
Laboratorio Biología Molecular
Centrífuga
Centrífuga para
para eppendorfs
eppendorfs
minipreps
minipreps
Centífuga
Centífuga refrigerada
refrigerada eppendorfs
eppendorfs
PCRs
Laboratorio Biología Molecular
Incubador
Incubador diferentes
diferentes temperaturas
temperaturas
Vortex,
Vortex, spinner
spinner
Laboratorio
Biología Molecular
Electroforesis
Electroforesis de
de geles
geles
de
de agarosa
agarosa
Laboratorio
Biología Molecular
Transiluminación
Transiluminación yy fotografía
fotografía
geles
geles de
de agarosa
agarosa
Laboratorio Biología Molecular
Baño 37°C digestiones
Laboratorio
Biología Molecular
refrigeración
Neveras
Neveras -20ºC
-20ºC
Enzimas,
Enzimas, ADNs
ADNs
Congeladores
Congeladores -80ºC
-80ºC
Vectores
Vectores yy virus
virus
Laboratorio Biología Molecular
Fregadero
Oficina
Escritorios, computadoras
¿Podremos hacerlo?
…??