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Universidad Simón Bolívar
Profra.: Mtra.Martha Flores
Materia: Microbiología de Alimentos
Alumno: Ana Anaya y Jorge A. Noguez
Practica 2
Recuento de Coliformes
Objetivo:
•
Describir la presencia Coliformes en muestras de alimentos.
Introducción: Coliformes
Definición
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•
Bacterias aerobias o facultativamente anaerobias, Gram negativas, no esporuladas, que fermentan la
lactosa con producción de gas dentro de las 48 hrs de incubación, produciendo ácido láctico y gas.
Coliforme significa con forma de coli, refiriéndose a la bacteria principal del grupo, la Escherichia Coli.
("bacteria del intestino", del griego κολον, kolon, "intestino").
Conformación del grupo
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Enterobacteriaceae (fermentan fácilmente la lactosa):
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter.
Aeromonas (Forman pigmentos generalmente amarillos.)
E. Coli
Cultivo y desarrollo
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Proliferan abundantemente en los medios de cultivo simples, no necesitan compuestos especialmente
complejos.
Temperatura óptima: Igual a los mesófilos (32 y 36). Limite superior: cercano a 45- 46.
La capacidad para desarrollar una temperatura superior a 40 la exhibe un grupo especial dentro de los
coliformes: fecales.
pH óptimo: próximo a la neutralidad.
Desarrollo limitado: Concentración salina arriba de la isotonicidad propia de los tejidos animales, y con
la actividad de agua baja. (debajo de 0.945 - 0.935 inhibitorias).
Crecen bien en aerobiosis y con potenciales de oxido-reducción bajos.
Hay inhibición de S. Aureus por organismos coliformes, resultado de un efecto combinado de
sustancias antibióticas y competencia por nutrientes. La represión se acentúa a temperaturas inferiores
a la del medio ambiente.
Resistencia
•
•
En congelación el número de coliformes disminuye progresivamente hasta alcanzar una cifra reducida
que casi ya no se modifica. Los que sobreviven pueden reiniciar su multiplicación cuando las
condiciones del medio lo permiten.
Un pH por debajo de 4.6 en algunos alimentos hay caída en el número de coliformes.
o Tiene su importancia en el control bacteriológico de ciertos productos ácidos, debido a que la
positividad de los resultados va a quedar condicionada por el tiempo transcurrido desde la
preparación del producto hasta el momento del muestreo y ejecución del análisis.
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o
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•
En la mayonesa, salsa francesa, salsa tártara y otros productos similares no hay coliformes, pues
el pH está entre 3 y 4.5
La pasteurización destruye los organismos coliformes, pues no son termodiúricas. Pero la
susceptibilidad al calor se encuentra condiciona a diversos factores como la concentración de células
presentes. Es esta incapacidad de los coliformes a no sobrevivir a los tratamientos de pasteurización lo
que constituye una de las bases para su empleo como indicador de prácticas no higiénicas en el manejo
de algunos alimentos.
Las radiaciones ionizantes reducen el contenido de coliformes en la carne molida pero no totalmente.
La luz ultravioleta es germicida sobre los coliformes pero la E Coli muestra una resistencia ligeramente
mayor que las otras bacterias Gram negativas intestinales.
Sobreviven en el medio ambiente y por periodos que están determinados por varios factores.
Ecología
•
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Se aíslan en materia fecal humana y de animales de sangre caliente (cifras de
o
)
o Fuera del intestino a partir de individuos sanos y limpios pueden aislarse varios géneros:
axila, ingle, espacios interdigitales de manos y pies.
Pueden colonizar el suelo, la tierra virgen, plantas, agua polvo y cualquier material que entre en
contacto con estos.
Incidencia en los alimentos
•
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En la leche cruda aparecen con regularidad en ausencia de altos niveles de higiene durante la ordeña.
La pasteurización las destruye, de manera que un tratamiento adecuado seguido de envase sanitario
y refrigeración de 6 o menos grados conduce a una leche con escasas o 9 col/ml
Efectos en los alimentos
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•
•
Pueden dar lugar a algunas alteraciones, esta acción proviene de la intensa facultad heterofermentativa de todos los miembros, una importante capacidad putrefactiva y el carácter
psicotrópico de muchas cepas.
En alimentos con bajo contenido de carbohidratos como las carnes no suelen causar serios
problemas.
En la leche y sus derivados en futas no muy ácidas llegan a provocar cambios diversos. Favorecen el
proceso de fermentación de las bacterias lácticas, la producción de malos olores y alguna especies de
Enterobacter han señalado como la causa de la leche filante.
La actividad de coliformes cuando están en gran cantidad o cuando los cultivos lácticos no funcionan
conduce a productos de deficiente calidad e incluso alterados con sabor amargo (por su acción
proteolítica).
El deterioro gaseoso de las aceitunas que consiste en la formación de vesículas llenas de gas o fisuras
superficiales es debida a la actividad de coliformes principalmente de Aerobacter.
Significado del agua
•
El empleo de los organismos coliformes como indicadores de contaminación fecal en el agua se
fundamente para fines de control sanitario:
o Existen de manera constante en la materia fecal
o Solo una proporción discreta de las bacterias que satisfacen la definición de organismo
coliforme no son huéspedes normales del intestino
o No se multiplican en aguas limpias o relativamente limpias.
o En el agua expuesta a contaminación fecal existen siempre una proporción miles de veces
superior a la de las bacterias patógenas que eventualmente pudieran estar presentes
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o
o
Tienden a morir en el agua a un ritmo semejante al de las bacterias patógenas intestinales
Su recuento en el laboratorio es de fácil ejecución y no requiere de equipo y material
sofisticado.
Significado en los alimentos
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•
•
La presencia de los organismos coliformes no guarda relación cualitativa ni cuantitativa con la
contaminación fecal.
La presencia y recuento de los organismos coliformes en los alimentos adquiere cierto significado
dependiendo de cada caso particular:
o Indicativos de prácticas sanitarias en el manejo o fabricación de un alimento
o Expresan la calidad microbiológica de un producto
o Revelan la eficiencia de un proceso descontaminante o germicida
o Su presencia y número es algo fortuito.
En los ostiones han hecho interesantes hallazgos. A temperaturas de 5°C el animal cesa su actividad
alimenticia y a 0°C Mantiene continuamente cerradas sus válvulas en inactividad, el contenido en
glucógeno no se reduce apreciablemente. En mayor temperatura, aumenta el número de coliformes,
cuando llega a 0, esta es la cifra de coliformes. La hibernación conduce a la auto-purificación.
Tabla 1. Indicadores de coliformes en ciertos alimentos
Producto
Lácteos
Hortalizas congeladas
blanqueadas
Aves de corral
Indica
Estado higiénico del establo y de la planta industrial. No es indicador de
contaminación fecal.
La presencia de E Coli puede ser indicativo de que en el proceso existe algún
problema. Los coliformes están habitualmente asociados con la vegetación
No son indicadores higiénicos apropiados, las aves pueden tener salmonella
antes del sacrificio.
Recuento en el laboratorio
•
•
•
•
Se emplean como indicadores de calidad sanitaria (fecal en el agua, de malas prácticas higiénicas en
alimentos). No basta descubrir su presencia. El número es lo que adquiere significado.
El recuento puede efectuarse en medios líquidos o sólidos. Por número más probable y se desarrolla
en etapas: prueba presuntiva, confirmatoria y completa. Según el tipo de material examinado y la
especificidad requerida el estudio se extenderá a una, dos o las tres pruebas.
El empleo de medios sólidos o NMP está determinado por la concentración de microorganismos que
se esperan en el producto y por su composición química microbiana.
Se recurre a un caldo lactosado para la prueba presuntiva y un caldo lactosado pero con sustancias
inhibitorias para la confirmatoria.
o El caldo lauril sulfato triptosa es uno de los más utilizados durante la investigación de
coliformes fecales y coliformes en los alimentos. Reduce en forma importante el número de
tubos positivos que requieren confirmación durante la prueba. La necesidad de confirmar los
tubos presuntivos resulta de la frecuencia con la cual puede generarse gas en estos últimos
en ausencia de coliformes.
o El medio de confirmación más común es el caldo lactosa bilis verde brillante. Se utiliza con
frecuencia como agente selectivo en la recuperación de organismos coliformes y otras
bacterias Gram negativas intestinales por su efecto bacteriostático contra las bacterias Gram
positivas.
o El agar bilis rojo violeta para el recuento de coliformes proporciona información completa
por sí solo desde un punto de vista práctico, cuando se aplica a la leche, excepto en aquellos
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que han sido adicionados (helados de crema) de sacarosa, ya que la fermenación puede dar
lugar a colonias con características de coliformes sin serlo en realidad.
La técnica del filtro de membrana con las limitaciones que presenta en el caso de algunos alimentos
también ofrece un recurso valioso para el recuento de los coliformes. Funciona satisfactoriamente
con las aguas naturales transparentes, aguas potabilizadas, hielo de mar, líquidos o lavados de quipo
para evaluar la eficiencia de su aseo y desinfección y bebidas embotelladas.
Acción del cloro
• Afecta en la síntesis de proteínas
• Descarboxilación oxidativa de los aminoácidos con formación de nitritos y aldehídos,
• Inactivación del DNA
• Inhibición de la fosforilación oxidativa
• Afectación de la permeabilidad celular con salida de macromoléculas.
Número más probable (NMP)
La técnica del número más probable es un método muy utilizado de cuantificación. Es un estimado de las
respuestas donde los resultados se reportan como positivos o negativos en una o más diluciones decimales
de la muestra. Nos da una medida indirecta de la cuenta bacteriana. Frecuentemente la composición de
muchos productos de alimentos hace que los procedimientos estándares de placa, particularmente cuando
la concentración microbiana de la muestra es menor a 10 CFU/g no sean precisos. A estas concentraciones la
técnica NMP da una cuenta más parecida que la cuenta de placa para la población bacteriana.
Prueba presuntiva para coliformes, coliformes fecales, y E. Coli
Cincuenta gramos o milímetros de la muestra se mezclan con 450 ml de agua tampón de fosfatos de
Butterfield para hacer diluciones de 1:10. Una solución 0.5% PW se recomienda para mariscos. Las muestras
de agua no se deben diluir. Después de esperar por dos minutos, se realizan las diluciones decimales de la
muestra y se transfieren alícuotas de 1 ml de cada dilución a cada uno delos tubos de Lauril triptosa (LST).
Se recomienda un quinto tubo para el análisis de mariscos. Por lo menos se deben realizar tres diluciones
consecutivas. Se incuban los tubos LST a 35°C por 24 horas y luego se examina la formación de gas, que
puede presentarse como una burbuja en el medio o una efervescencia. Los tubos que fueron Gas negativos,
se deberán volver a incubar (excepto para mariscos) otras 24 horas. Luego se procederá a confirmar para
coliformes, coliformes fecales y E. Coli. La ausencia en todos los tubos después de 48 horas (24 horas para
mariscos) se puede considerar como una prueba negativa.
Prueba confirmativa NMP para coliformes
Un asa de cultivo de cada tubo LST positivo se transfiere en un tubo con BGLB (Verde brillante bilis
lactosado). Evite transferir la película. Incube los tubos a 35°C y examine la producción de gas a 48°C. Calcule
el NMP de coliforme en base a la proporción de los tubos gas positivo de las tres diluciones consecutivas.
Prueba confirmativa NMP para coliformes fecales y para E. Coli
Una asa de medio de cada gas LST positivo de la prueba presuntiva se transfiere a un tubo con caldo de E
coli (EC) con o sin 4 methylmbellifery-b-D-glucorinide (MUG) incubar por 24 horas a 45°C y examine la
producción de gas. El análisis de mariscos y agua deberá incubarse por 48 horas. Si es negativo volver a
incubar y examinar nuevamente. Los resultados de esta prueba son similares a los NMP para coliformes
fecales.
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MUG
Se basa en la actividad enzimática de la b-glucorinidasa (GUD) que rompe el substrato MUG para liberar 4
metilumbelliferona (MU) Cuando se expone a luz ultravioleta (365 nm). El MU exhibe fluorescencia azulada.
Los tubos que contienen EC-MUG deberán analizarse con luz UV (366nm) para la actividad de la
glucoronidasa, donde la fluorescencia verde-azul indica prueba presuntiva para E. Coli.
Prueba confirmativa para E. Coli.
Gentilmente agite cada tubo positivo EC o EC-MUG y transfiera con un asa en un medio Endoagar o L-EMG.
Incubar a 35°C por 18 a 24 horas. Colonias no mucoides, nucleadas, centro oscuro, con o sin brillo metálico
son indicativos de E Coli. Un aislado Gram negativo con fermentación de lactosa y producción de gas con
48 horas a 35°C con IMViC (indol, rojo de metilo, Vog-Proskauer, citrato) en un patrón de + + - - para el
biotipo 1 o - + - - para el biotipo 2, se considera que es E. Coli.
Material
 1 matraz Erlenmeyer
 1 frasco con tapa
 Agua peptonada
 9 tubos
 1 gradilla




2 pipetas 10ml
2 probetas de 100ml
Caldo verde bilis
Caldo lactosado
Tabla 2. Especificaciones microbiológicas de Coliformes en NMP/g establecidas para diversos alimentos.
Producto
Ensaladas verdes, crudas o de frutas *
Límite max. permisible
Salsas y purés cocidos *
Alimentos cocinados a base de carne de mamíferos, aves, pescados *
Aguas preparadas *
Zumos, néctares, bebidas a base de frutas y verduras no pasteurizadas **
Queso fresco **
100
Moluscos bivalvos frescos y refrigerados y congelados***
Leche pasteurizada de vaca **** (en planta y punto de venta)
Helados y sorbetes*****
*NOM-093-SSA1-1994 ; ** Límites microbiológicos de la ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods).
***NOM-031-SSA1-1993; ****NOM-091-SSA1-1994; *****NOM-243-SSA1-2010
Resultados:
Tabla 3. Resultado de las cuenta de Mesófilos aerobios realizado a diferentes muestras de alimento (UFC/ml).
Equipo
1
2
3
4
Muestra
Helado
Ostiones
Agua (Planta piloto)
Salsa de la cafetería
NMP/g
25
Coliformes Fecales
Negativo, posible Klebsiela
Positivo
Positivo
Positivo E. Coli
Análisis de resultados:
Utilizando los datos de las tablas 2 y 3 podemos compararlos y generar una discusión si cumplen los
parámetros que marca la ley.
Ilustración 1. Análisis de la cuenta de Coliformes en muestras de ostiones
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Como podemos constatar en la Ilustración 1, podemos observar que los ostiones no cumplen con la Norma
Oficial, ya que la cuenta de coliformes totales toma un número muy elevado. El hecho que tengamos
positivos los coliformes fecales nos hace afirmar que el producto no ha tenido un manejo higiénico o sanitario
adecuado ni una buena conservación.
Ilustración 2. Análisis de la cuenta de Coliformes en muestras de helado.
Una vez realizadas las pruebas pertinentes, podemos asegurar que se trata de un alimento seguro, ya que no
alcanza ni el nivel medio del máximo permitido por la norma oficial.
Ilustración 3. Análisis de la cuenta de Coliformes en muestras de agua de la Planta Piloto
No existe la mayor duda que el agua de la Planta Piloto de la Universidad no cumple con los máximos índices
de Coliformes permitidos. Tras esta presuntiva se confirmó que se trataba de coliformes fecales
sugiriéndonos que hay una fuente de contaminación en las instalaciones, tuberías. , etc.
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Ilustración 4. Análisis de la cuenta de Coliformes en muestras de la salsa de la cafetería
El equipo esperaba que la cuenta por NMP del análisis que se le hizo a la salsa nos ofreciera valores mucho
mayores que el máximo permitido, más no fue así. Podemos afirmar que la salsa es segura y que cumple con
el máximo permitido.
Conclusiones




Los resultados del presente estudio dan una idea del alto riesgo para los consumidores de contraer
alguna enfermedad transmitida por los alimentos, y de su deficiente control sanitario.
Los alimentos que cumple con la cuenta máxima permisible por NMP de Coliformes fue la muestra de
helado, y la salsa de la cafetería.
Fue sospechoso el notar que el agua de la Planta Piloto de la Universidad contara con índices muy altos
de coliformes fecales, sugiriéndonos que hay una contaminación no deseada que podría alterar el
desarrollo de los productos que se llevan ahí acabo.
Debido a que no se realizaron las pruebas por duplicado y debido a que estos estudios lo realizaron
estudiantes de la carrera de Ingeniería en Alimentos, no son del todo concluyentes los resultados. Si se
volviera a realizar las pruebas descritas, y dieran nuevamente los resultados presentados, será necesaria
la participación de autoridades sanitarias, preparadores de alimentos y consumidores, además de
mejorar la educación sanitaria en el manejo de alimentos, así como la implementación de programas y
procedimientos de aseguramiento de la calidad.
Bibliografía
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