NOVA Lite™ ANCA Anti-neutrophil Cytoplasmic

NOVA Lite® ANCA
Anti-neutrophil Cytoplasmic Autoantibody Reagents
Para Diagnóstico In Vitro
Codice Prodotto: 708290, 708296, 708298, 708299
508290.10, 508296.20, 508298.20, 508299.10
Complejidad de CLIA: Alto
Aplicación
®
NOVA Lite ANCA es un ensayo por inmunofluorescencia indirecta para el screening y la determinación
semicuantitativa de de anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) en suero humano. La detección de ANCA,
cuando se utiliza juntamente con otros resultados clínicos y de laboratorio, ayuda a evaluar varios tipos de vasculitis
sistémica.
Sumario y Explicación de la prueba
Los ensayos de anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) han revolucionado la diagnosis y el tratamiento de
1-4
varios tipos de vasculitis autoinmune mediada. Los autoanticuerpos perinucleares, o pANCA, y citoplasmáticos, o
cANCA, han demostrado ser útiles para detectar enfermedades como la granulomatosis de Wegener y glomerulonefritis
con semilunas. Se han identificado al menos seis tipos de antígenos de los ANCA, pero todavía quedan muchos por
1,5
identificar. La mayoría de estos antígenos son enzimas que residen en los gránulos primarios del neutrófilo. Entre
estas enzimas se incluyen la mieloperoxidasa (MPO), la serinproteasa 3 (PR3), la elastasa, la lactoferrina, la catepsina
G y la proteína catiónica 57 (CAP-57). Se han desarrollado tests ELISA para la detección de muchos de los anticuerpos
antineutrófilo más importantes, pero la mayoría de los expertos en el terreno de la vasculitis autoinmune siguen
recomendando la utilización del método de ensayo por inmunofluorescencia (IFA) para el screening inicial. Con el
procedimiento estándar IFA para ANCA se pueden detectar dos patrones de ANCA. El clásico patrón de ANCA consiste
en una fluorescencia granular citoplasmática. Este patrón, que sugiere la presencia de la granulomatosis de Wegener y,
6
en menor medida, la poliarteritis microscópica, se ha denominado cANCA. También se ha descrito un segundo patrón
7,8
de ANCA que tiñe la región perinuclear de los neutrófilos fijados con alcohol. Este patrón se denomina pANCA. El
patrón pANCA se ha asociado con una vasculitis más limitada a los órganos, en particular, glomerulonefritis con
9
semilunas o rápidamente progresiva. Se ha conseguido establecer una buena correlación entre el patrón cANCA y la
3,10
granulomatosis de Wegener. La granulomatosis de Wegener se caracteriza por un proceso inflamatorio necrotizante
con formación de granulomas y vasculitis que afecta, principalmente, a la región superior e inferior de los tractos
respiratorios y los riñones. Esta tríada de interrelaciones clínicas se considera la marca distintiva de la granulomatosis
de Wegener. El patrón cANCA está presente en hasta un 96% de los pacientes con granulomatosis de Wegener en una
fase activa generalizada de la enfermedad, pero disminuye hasta el 65% en los pacientes en una fase activa más
limitada, y aparece en un 30-40% de los pacientes en fase de remisión. La valoración de cANCA también sigue la
4,12
evolución de la enfermedad, con valoraciones más bajas en las fases de remisión y más altas en las recaídas.
Al
contrario que ocurre con el patrón cANCA y su asociación a una enfermedad predominantemente sistémica como la
granulomatosis de Wegener, el patrón pANCA se ha asociado en muchas ocasiones con la glomerulonefritis
necrotizante. El patrón pANCA no se suele observar en los síndromes sistémicos. El antígeno objetivo más común
asociado con los pANCA es la mieloperoxidasa, aunque también se detecta una reactividad frente a la elastasa y la
lactoferrina. Casi el 90% de las muestras de suero pANCA positivas de pacientes con glomerulonefritis reaccionan con
la mieloperoxidasa; sin embargo, los pacientes con enfermedades distintas a la glomerulonefritis que también tienen
11,13
pANCA reaccionan con la mieloperoxidasa en un porcentaje mucho menor.
Esto indicaría que se pueden detectar
múltiples antígenos como una tinción perinuclear de neutrófilos fijados con etanol, incluyendo el suero que contiene
anticuerpos antinucleares. Es imposible confirmar los patrones perinuclear detectados con neutrófilos fijados con etanol
como pANCA realizando el IFA en neutrófilos fijados con formalina. El antígeno objetivo primario de los pANCA, la
mieloperoxidasa, permanece en el citoplasma de las células fijadas con formalina, mientras que en las células fijadas
con etanol, el antígeno migra hacia el núcleo, dando lugar al patrón perinuclear.
Procedimiento de trabajo
En la técnica de inmunofluorescencia indirecta, las muestras se incuban con un substrato de antígenos y
posteriormente se lavan para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado. El substrato se incuba con un conjugado
específico marcado con fluoresceína y posteriormente se lava para eliminar el reactivo que no se ha enlazado. Cuando
se observan a través de un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas para autoanticuerpos mostrarán una
fluorescencia de color verde manzana en las áreas de la célula o del núcleo donde se ha enlazado el autoanticuerpo.
Reactivos
1.
Portaobjetos de ANCA, portaobjetos con substrato de neutrófilos humanos fijados con etanol, 6 o 12
pocillos/portaobjetos, con desecante
Sólo kits
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Conjugado de anticuerpos anti-IgG humana (Cabra) marcados con fluoresceína en tampón con Azul de Evans
y 0.09% de azida sódica
cANCA positivo, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y suero humano con anticuerpos anti-cANCA,
prediluido
pANCA positivo, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y suero humano con anticuerpos anti-pANCA,
prediluido
Control Negativo para Sistemas IFA, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y sin suero humano con
anticuerpos ANCA, prediluido
Concentrado de PBS II (40x)
Medio de Montaje, 0.09% de azida sódica
Cubreobjetos
1
Advertencias
1.
2.
3.
4.
Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado
resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún
método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén
ausentes. Por lo tanto, los cANCA positivo, pANCA positivo y Control Negativo para Sistemas IFA deben
14
manejarse como si fueran material potencialmente contagioso.
Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a
través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar
azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se
recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas.
Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit.
Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga los normas aplicables en su laboratorio
acerca de la eliminación de residuos.
Precauciones
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro.
La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados
inconsistentes.
Un lavado incompleto o ineficiente de los pocillos puede dar lugar a un fondo elevado.
La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros aparatos de manipulación de
líquidos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados de la prueba respecto a los
obtenidos con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio el validar que su procedimiento
automático produzca resultados dentro de unos límites aceptables.
Una gran variedad de factores puede afectar al rendimiento del ensayo. Entre estos factores pueden incluirse la
temperatura de los reactivos al inicio del proceso, la potencia de la lámpara del microscopio, la fiabilidad y
reproducibilidad de la técnica de pipeteo usada, las condiciones de lavado y la duración de los tiempos de
incubación. Se requiere trabajar de una manera consistente para obtener resultados precisos y reproducibles.
El conjugado anti Humano IgG puede experimentar cambios de color con el tiempo debido a la exposición a la
luz, estos cambios, sin embargo, no afectan a su rendimiento.
Se recomienda seguir estrictamente el protocolo.
Condiciones de Almacenaje
1.
2.
Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8°C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha
de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente.
La solución de lavado diluida es estable 4 semana a 2-8°C.
Recolección de Muestras
Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar
adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan
partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras
de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento CLSI (antes NCCLS) H18-A3 recomienda las
siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8
horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8°C. 3) Si el ensayo no se va completar
entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20°C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las
muestras deben agitarse bien antes de utilizarse.
Procedimiento
Materiales Suministrados (kits)
708290
10
1
1
1
1
1
1
1
6- pocillos con substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con etanol
4mL Conjugado de anticuerpos anti-IgG
0.5mL cANCA positivo
0.5mL pANCA positivo
0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA
25mL Concentrado de PBS II (40x)
7mL Medio de fijación
10 Cubreobjetos
708296
20
1
1
1
1
2
1
1
12- pocillos con substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con etanol
15mL Conjugado de anticuerpos anti-IgG
0.5mL cANCA positivo
0.5mL pANCA positivo
0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA
25mL Concentrado de PBS II (40x)
7mL Medio de fijación
20 Cubreobjetos
2
708298
20
1
1
1
1
2
1
1
12- pocillos con substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con etanol
15mL Conjugado de anticuerpos anti-IgG
0.5mL cANCA positivo
0.5mL pANCA positivo
0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA
25mL Concentrado de PBS II (40x)
7mL Medio de fijación
10 Cubreobjetos
708299
10
1
1
1
1
1
1
1
6- pocillos con substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con etanol
4mL Conjugado de anticuerpos anti-IgG
0.5mL cANCA positivo
0.5mL pANCA positivo
0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA
25mL Concentrado de PBS II (40x)
7mL Medio de fijación
10 Cubreobjetos
Material suministrado (portaobjetos)
508290.10
508296.20
508298.20
508299.10
10 x Portaobjetos substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con
etanol, 6 pocillos
20 x Portaobjetos substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con
etanol, 12 pocillos
20 x Portaobjetos substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con
etanol, 12 pocillos
10 x Portaobjetos substrato ANCA de neutrófilos humanos fijados con
etanol, 6 pocillos
Material necesario no incluido
Micropipetas con capacidad para pipetear de 15 a 1000µL
Agua destilada o desionizada
Frascos lavadores o pipetas Pasteur
Cámara húmeda
Recipiente de 1L de capacidad (para diluir PBS II)
Cubeta de Coplin
Microscopio de fluorescencia con una emisión de fluorescencia de 495nm y un filtro de barrera de 515nm
Material adicional disponible por separado
ANCA (Neutrófilos fijados con formalina), portaobjetos-6 pocillos Catálogo INOVA #508295
ANCA (Neutrófilos humanos fijados con formalina), portaobjetos-12 pocillos Catálogo INOVA #508297
Metodología
Antes de empezar
1.
2.
3.
Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26°C) y agitar.
Diluya el concentrado de PBS II: IMPORTANTE: Diluya el concentrado de PBS II a 1:40 añadiendo el
contenido de la botella de concentrado de PBS II a 975mL de agua destilada o desionizada y mezcle
completamente. El tampón de PBS II se utiliza para diluir las muestras de pacientes y como tampón de lavado.
El tampón diluido puede almacenarse un máximo de 4 semanas a una temperatura de 2-8°C.
Diluya las Muestras de los Pacientes:
a.
Screening Inicial: Diluya las muestras de los pacientes a 1:20 con un tampón de PBS II diluido (esto es,
añada 50µL de suero a 950µL del tampón de PBS II).
b.
Titulación: Realice series de diluciones dobles a partir de la dilución inicial de screening para todas las
muestras positivas con el tampón de PBS II diluido (p. ej. 1:40, 1:80,... 1:1280).
Procedimiento de Ensayo
1.
2.
3.
4.
Preparación de los portaobjetos con substrato: Espere a que el portaobjetos con substrato alcance la
temperatura ambiente antes de extraerlo de su funda. Etiquételo y colóquelo en una cámara húmeda
adecuada. Añada 1 gota (20-25µL) de control positivo y negativo sin diluir en los pocillos 1 y 2 respectivamente.
Añada 1 gota (20-25µL) de la muestra del paciente diluida a los pocillos restantes.
Incubación del portaobjetos: Incube el portaobjetos durante 30 + 5 minutos en una cámara húmeda (una
servilleta de papel humedecida colocada plana en el fondo de un recipiente cerrado de plástico o cristal le
permitirá mantener las condiciones de humedad adecuadas). No permita que el substrato se seque durante
el procedimiento de ensayo.
Lavado de los portaobjetos: Tras la incubación, utilice un frasco de lavado o una pipeta para lavar
suavemente el suero con el tampón de PBS II diluido. Oriente el portaobjetos y el chorro del tampón PBS II de
forma que le permita evitar, en la medida de lo posible, que la solución pase por encima de varios pocillos a la
vez. Evite dirigir el chorro directamente sobre los pocillos para que no se dañe el substrato. Si está
deseado, ponga los portaobjetos en un tarro de Coplin del almacenador intermediario diluido de PBS II por
hasta 5 minutos.
Adición de conjugado fluorescente: Expulse el exceso de tampón PBS II. Sitúe el portaobjetos de nuevo en
la cámara húmeda y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado fluorescente. Incube los
portaobjetos durante otros 30 + 5 minutos.
3
5.
6.
Lavado de los portaobjetos: Repita el paso 3.
Cubreobjetos: Los procedimientos para los cubreobjetos varían de un laboratorio a otro; sin embargo,
recomendamos el siguiente procedimiento:
a.
Sitúe un cubreobjetos en una toallita de papel.
b.
Aplique el medio de montaje siguiendo una línea continua en el borde inferior del cubreobjetos.
c.
Elimine el exceso de tampón PBS II y ponga en contacto del borde inferior del portaobjetos con el
borde del cubreobjetos. Deje caer suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de forma que el
medio de montaje fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin que se formen burbujas de aire ni
se queden atrapadas.
Control de Calidad
El cANCA positivo y el Control Negativo para Sistemas IFA deberían ensayarse para cada portaobjetos con el fin de
asegurar que todos los reactivos y los procedimientos se han llevado a cabo de la forma adecuada. Los controles
adicionales de suero adecuados deberán prepararse alicuotando las mezclas de suero humano y almacenándolo a
o
< -70 C. Para que los resultados se consideren válidos, deben cumplirse todos y cada uno de los siguientes criterios. Si
alguno de ellos no se cumple, el resultado del test se considerará inválido y el ensayo deberá repetirse.
1.
El cANCA positivo sin diluir debe ser > 3+.
2.
El Control Negativo para Sistemas IFA debe ser negativo.
Interpretación de los Resultados
Reacción Negativa. Se considerará una muestra como negativa si la tinción nuclear o citoplasmática específica es
igual o inferior al Control Negativo para Sistemas IFA. Las muestras pueden mostrar diversos grados de tinción de
fondo debido a los anticuerpos heterófilos o a niveles inferiores de autoanticuerpos contra algunos constituyentes del
citoplasma, como las proteínas contráctiles.
Reacción Positiva. Una muestra se considera positiva si se observa una tinción nuclear o citoplasmática específica
mayor que la del control negativo y la intensidad de la tinción es 1+ o mayor, tal y como se describe a continuación.
Determine el patrón de tinción de cada muestra y pondere su intensidad de acuerdo con los siguientes criterios:
4+
3+
2+
1+
Fluorescencia verde manzana brillante
Fluorescencia verde manzana claro
Fluorescencia positiva claramente visible
La menor fluorescencia específica que permite diferenciar claramente una estructura celular de la
fluorescencia de fondo
Interpretación de los patrones. Pueden presentarse diversos patrones de tinción nuclear y citoplasmática
dependiendo de los tipos y de las cantidades relativas de autoanticuerpos presentes en la muestra. Pueden presentarse
los siguientes patrones de tinción:
cANCA o tinción citoplasmática: Este patrón generalmente presenta una fluorescencia citoplasmática gruesa y
moteada, a menudo con fluorescencia acentuada en los lóbulos nucleares y alrededor de ellos. Por lo general, se
descubre que este patrón es producido por anticuerpos que reaccionan con la enzima granular primaria serin-proteasa
3 (PR3).
pANCA o tinción perinuclear: Este patrón aparece, generalmente, como una tinción homogénea de los lóbulos
nucleares, por lo general con una acentuación perinuclear. Dado que algunos anticuerpos antinucleares (ANA) también
pueden reaccionar con los núcleos de neutrófilos humanos fijados con etanol, se recomienda que estas muestras
también sean analizadas para ANA. Además, se pueden realizar pruebas a estas muestras en neutrófilos humanos
fijados con formalina en vez de etanol. Debido a que la formalina es un fijador de reticulación, destruye la mayor parte
de los antígenos nucleares y cambia el patrón de tinción de perinuclear a citoplasmático si la muestra contiene pANCA.
Con estos fines se encuentran por separado portaobjetos fijados con formalina.
Limitaciones del Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Las muestras inactivas por calor, hemolizadas, contaminadas por microorganismos o desfibrinadas de manera
incompleta pueden causar unos niveles elevados de tinción de fondo y dificultar la interpretación. Obtenga una
muestra fresca y realice el test de nuevo. Añadiendo un 2% de albúmina o suero bovino al tampón de PBS II
utilizado para diluir las muestras, puede reducir la tinción de fondo de las muestras problemáticas.
Las muestras ANA positivas pueden reaccionar con los neutrófilos fijados con etanol. Las muestras positivas
para el núcleo deben ensayarse de nuevo para determinar la presencia de ANA y/o ensayarse en portaobjetos
de neutrófilos fijados con formalina.
Debido a que neutrófilos humanos fijados con etanol contienen múltiples antígenos en los gránulos primarios,
como la elastasa, lactoferrina, catepsina G, proteína catiónica 57 y posiblemente otros como antígenos
indefinidos de los neutrófilos, puede que las muestras que parecen p o cANCA positivas no siempre den
resultados positivos para anticuerpos específicos antimieloperoxidasa (MPO) o antiserín proteasa 3 (PR3) .
Además de los ANA, algunos otros autoanticuerpos pueden reaccionar también con neutrófilos humanos
fijados con etanol. Entre estos anticuerpos se incluyen los anticuerpos antitejido muscular liso (actina) y ciertos
15
aloanticuerpos como el Mart o NB1. Los anticuerpos antitejido muscular liso, o actina, reaccionan con el
citoplasma de los neutrófilos, pero con un patrón más bien homogéneo que con motas gruesas, igual que con
un cANCA típico. Los aloanticuerpos también aparecen como un patrón citoplasmático, pero con un patrón
moteado mucho más fino en comparación con los cANCA, y sólo un pequeño porcentaje de células
(normalmente un 40% o menos) presenta fluorescencia.
Algunas muestras pueden verse con más de un autoanticuerpo. Por ejemplo, c y p ANCA o ANCA más ANA.
Algunos pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal o colitis ulcerosa poseen anticuerpos que reaccionan
16
con los neutrófilos. Estas muestras presentan un patrón del tipo pANCA en neutrófilos fijados con etanol con
una tinción perinuclear muy marcada. Normalmente, estas muestras resultan negativas o con una débil
fluorescencia citoplasmática homogénea en portaobjetos con neutrófilos fijados con formalina.
Una incorrecta manipulación de los portaobjetos durante el proceso de tinción, sobre todo cuando se dejan
secar los portaobjetos entre un paso y otro, puede dar lugar a un patrón de apariencia "washed out" y una
fuerte tinción de fondo.
4
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
El uso de reactivos de otros tipos de kits de detección de anticuerpos por fluorescencia (sobre todo
conjugados) puede afectar negativamente a la sensibilidad y especificidad de los portaobjetos de substrato de
neutrófilos fijados con etanol.
Varios factores externos influyen en la sensibilidad del ensayo, como pueden ser el tipo de microscopio de
fluorescencia utilizado, la potencia y antigüedad de la lámpara, los aumentos utilizados, el sistema de filtros y la
subjetividad del técnico.
Si se utiliza un filtro paso banda en lugar de un filtro de barrera 515, puede observarse un aumento de la tinción
de los artefactos.
Para etiquetar los portaobjetos utilice solamente un lápiz. La utilización de cualquier otro instrumento de
escritura puede ocasionar una tinción de los artefactos.
Todas las cubetas de Coplin que se utilicen en el lavado de los portaobjetos deben estar limpias de residuos de
tintura. La utilización de cubetas de Coplin con residuos de tintura puede provocar la tinción de los artefactos.
Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas
serológicas.
La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.
Los portaobjetos comercializados por separado se clasifican como “reactivos específicos para los analitos”.
®
Salvo que se trate de componentes del kit NOVA Lite ANCA, las características analíticas y de rendimiento
no están establecidas.
Valores Esperados
®
Se ensayaron ciento quince muestras normales aleatorias con portaobjetos fijados con etanol NOVA Lite ANCA. Estas
muestras se tomaron como exámenes físicos a empleados o posibles candidatos a un puesto de trabajo y, como tales,
no es probable que incluyan personas mayores o pediátricas. Las muestras estaban formadas por una mezcla aleatoria
de hombres y mujeres. Todas las muestras dieron negativo con una dilución de screening de 1:20.
También se ensayaron muestras de 45 pacientes con Wegener, 39 con poliarteritis microscópica y 20 con
glomerulonefritis con semilunas, así como de otros pacientes con una serie de enfermedades del tejido conectivo. Los
resultados se resumen en la tabla siguiente.
Grupo de pacientes
Normales aleatorios
Wegener
Poliarteritis microscópica
Glomerulonefritis con semilunas
LES
Síndrome de Sjogrens
Escleroderma
Polimiositis
Número de pacientes
115
45
39
20
27
21
15
6
% Positivos
0
89
(todos cANCA)
100
(todos pANCA)
100
(todos pANCA)
7
(pANCA y cANCA)
0
0
0
®
Los portaobjetos NOVA Lite ANCA fueron comparados paralelamente con preparaciones de neutrófilos
citocentrifugadas que se usan rutinariamente en un centro universitario de referencia para ANCA. Se ensayaron
cincuenta y seis muestras de suero positivas (23 cANCA, 28 pANCA, 4 Atípicas) y 14 muestras ANCA negativas. De las
®
55 muestras positivas, 54 mostraron un patrón de tinción idéntico en los portaobjetos NOVA Lite ANCA. Una muestra
con una valoración baja de cANCA obtuvo un resultado negativo en el portaobjetos de INOVA. Las 14 muestras ANCA
®
negativas dieron negativos similares en los portaobjetos NOVA Lite ANCA. Las titulaciones de las 55 muestras
positivas en ambos substratos ofrecieron los mismos resultados o con una diferencia de una dilución doble en 53 de las
muestras ensayadas. Las otras 2 muestras diferían en 2 diluciones dobles.
Cuarenta y ocho muestras de suero aleatorias de un importante laboratorio de referencia estadounidense para ANCA
®
fueron ensayadas simultáneamente para determinar la presencia de ANCA, utilizando portaobjetos NOVA Lite ANCA,
así como la presencia de anticuerpos anti-MPO y PR-3 específicos utilizando kits QUANTA Lite® ELISA de INOVA. Los
resultados se resumen en la tabla siguiente.
Resultado IFA
negativo
pANCA
cANCA
c y pANCA
Atípico
Núm. de muestras
8
13
21
5
1
% ELISA Positivos
MPO
PR3
0
0
84
0
0
95
80
0
0
0
Ocho muestras dieron negativo para ANCA por inmunofluorescencia. Estas ocho muestras también dieron negativo
tanto para MPO como para PR-3 con el método ELISA. Los resultados de MPO y PR-3 variaban de 1 a 5 unidades,
bastante por debajo del umbral de 20 unidades. Quince muestras fueron valoradas como pANCA positivas por
inmunofluorescencia indirecta. Once de éstas dieron positivo para MPO y ninguna para PR-3. Veintiuna muestras
dieron positivo para cANCA por inmunofluorescencia. Ninguna de estas muestras dio positivo para MPO, mientras que
20 de las 21 dieron positivo para PR-3. Cinco muestras presentaron patrones de tipo p y c ANCA por IFA. Cuatro de
éstas dieron positivo para MPO y ninguna para PR-3. Una muestra fue valorada como pANCA atípica. Esta muestra
atípica de pANCA dio negativo tanto con el kit de MPO como con el de PR3.
Concordancia clínica de los resultados de ANCA - ELISA vs. IFA
Mientras que la MPO y la PR3 son importantes antígenos que comprenden lo que puede identificarse como p y c
ANCA, el usuario debe ser consciente de que los anticuerpos contra varias enzimas de gránulos primarios del neutrófilo
también pueden producir patrones de c y p ANCA por inmunofluorescencia en neutrófilos fijados con etanol. Esto es
especialmente cierto en el caso de los anticuerpos pANCA, en que al menos otros 3 autoanticuerpos de antígenos
distintos a la MPO pueden producir un patrón de tipo pANCA por IFA. Para ilustrar este punto, se agruparon las
muestras de los mencionados pacientes con granulomatosis de Wegener, poliarteritis microscópica y glomerulonefritis
con semilunas, así como 48 muestras enviadas para la realización de tests serológicos rutinarios de vasculitis. A
continuación se muestran los resultados de los ensayos de neutrófilos humanos fijados con etanol por
inmunofluorescencia y los ELISA.
5
+
QUANTA Lite® PR-3 IgG
+
60
6
cANCA IFA
-
+
1
85
QUANTA Lite® MPO IgG
+
47
30
pANCA IFA
-
0
75
Sensibilidad relativa
Especificidad relativa
Concordancia clínica
90.9%
98.8%
95.4%
Sensibilidad relativa
Especificidad relativa
Concordancia clínica
61.0%
100%
80.3%
De las 66 muestras positivas para cANCA por IFA, 6 dieron negativo para PR3 y 1 positivo con el método ELISA
aunque negativa por IFA. De las 77 muestras positivas para pANCA por IFA, 30 dieron negativo con el método ELISA
para MPO específico. Ninguna muestra negativa para pANCA por IFA dio positivo mediante el método ELISA de MPO.
6
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
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Immunol 11:161-174, 1991.
Specks U, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow-up of Wegener’s
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marker of disease activity in Wegener’s granulomatosis. Lancet 423-429, 1985.
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anticytoplasmic antibodies. Arch Intern Med 149:2461-2465, 1989.
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