cuerpo memoria2 - Repositorio Académico

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
DINÁMICA DE LA BIODIVERSIDAD EN PROCESOS DE
BIOLIXIVIACIÓN
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL QUÍMICO
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN
BIOTECNOLOGÍA
PAULINA BRUSADELLI ACUÑA
PROFESOR GUÍA
BLANCA ESCOBAR MIGUEL
MIEMBROS DE LA COMISIÓN
ORIANA SALAZAR AGUIRRE
TOMÁS VARGAS VALERO
SANTIAGO DE CHILE
OCTUBRE 2007
RESUMEN DE LA MEMORIA PARA OPTAR AL
TÍTULO DE INGENIERO CIVIL QUÍMICO E
INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA
POR: PAULINA BRUSADELLI ACUÑA
FECHA: 23/10/2007
PROF.GUÍA: Sra. BLANCA ESCOBAR M.
“DINÁMICA DE LA BIODIVERSIDAD EN PROCESOS DE BIOLIXIVIACIÓN”
El presente trabajo de título tiene por objetivo estudiar la dinámica de la biodiversidad en procesos de
biolixiviación, es decir, busca establecer alguna relación entre la variación de los parámetros fisicoquímicos
presentes en el ambiente en estudio y las bacterias identificadas para cada condición. Su importancia en estos
procesos, radica en determinar los parámetros fisicoquímicos que estimulan o inhiben la actividad de los
microorganismos involucrados, para optimizar la recuperación de cobre, importante en nuestro país.
Para esto, se utilizó la técnica de determinación de los polimorfismos de los largos de los fragmentos
terminales de restricción (T-RFLP) en soluciones obtenidas de una mini columna de biolixiviación, con lo que
se logró identificar las poblaciones bacterianas presentes.
Para corroborar la información obtenida con el protocolo propuesto por Gabriela Morales, se buscó una
enzima de restricción adicional para el método de T-RFLP. La segunda enzima seleccionada correspondió a
MspI, la cual mostró ser capaz de distinguir entre dos de las especies bacterianas encontradas en los procesos
de biolixiviación, L.ferrooxidans y Sb.thermosulfidooxidans, pero no proporciona ningún aporte frente al otorgado
por RsaI, que es capaz de distinguir entre A. ferrooxidans y A.thiooxidans.
Se determinó que es válido considerar como bacterias presentes en la solución, aquellas cuyos TRFs se
encuentren presentes en la muestra analizada al digerir con cada enzima de restricción por separado., sin poder
descartar plenamente las que se encuentren sólo con una enzima por poder asociarse a errores del método de
T-RFLP.
En la mayoría de las muestras se encontraron α proteobacterias y A.ferrooxidans. Además, en las soluciones
estudiadas se determinó la presencia de A.thiooxidans, Sb.thermosulfidooxidans, Sb.acidophilus Desulfosporosinus spp.,
Shewanella spp. Arthrobacter spp., o Ferrimicrobium acidiphilium, Acidomonas methanolica, Acidocella spp., Acidiphilum spp.
o Acidimicrobium ferrooxidans.
Al analizar lo parámetros fisicoquímicos de las muestras estudiadas, se destaca la disminución de la
diversidad bacteriana a medida que aumentan los iones metálicos en solución y la mayor cantidad de bacterias
generadas en las muestras con aireación.
Los parámetros fisicoquímicos de la muestra 4 mostraron ser los más favorables para la diversidad
bacteriana: Eh de 597 mV, pH inicial de 1,6, pH final de 1,4, concentración inicial de FeSO4 de 6 g/l y aire.
A través del índice de diversidad de especies, no se logró observar, en ninguno de los casos, una
correspondencia entre el aumento de las condiciones inhibitorias y la disminución del índice. En el caso del
índice de Shannon-Wiener, se observó una cierta tendencia a disminuir en algunas muestras a medida que
aumentaron los iones metálicos en solución, pese a que ambos índices pueden verse afectados por los errores
asociados al T-RFLP.
Se observó concordancia entre los dendrogramas elaborados a partir de la aparición de las bacterias en
cada muestra, según los resultados de la digestión con RsaI o MspI, debido a que los TRFs asociados a las
mismas bacterias fueron agrupados de igual forma. Además se observó que las agrupaciones realizadas eran
congruentes con las características de las bacterias encontradas en el sistema estudiado.
El análisis de componentes principales mostró no ser concluyente a la hora de agrupar los TRFs asociados
a bacterias biolixiviantes según su aparición en las soluciones, principalmente debido a que su elaboración
toma en cuenta las abundancias relativas de los fragmentos considerados.
Finalmente, no se encontró una relación entre las soluciones, a partir de las bacterias encontradas en cada
una, que fuera congruente con los parámetros fisicoquímicos analizados.
A mis padres, Mario y Mª Alicia,
mis hermanos, Cristóbal,
Italo y Romina, y Marco.
Agradecimientos
En el momento en que termino una etapa más de mi vida, miro hacia atrás y doy las gracias a
todos los que en algún momento influyeron en la persona en que me he convertido.
En primer lugar, a mi familia le agradezco su apoyo incondicional. Agradezco a mi papá por
darme la oportunidad de estudiar la carrera que quise, en donde quise. A mi mamá, por brindarme
siempre su apoyo y por tratar de hacerme la vida más sencilla, para poder así enfocarme en mis
estudios. A mis hermanos, Cristóbal e Italo simplemente por estar ahí sin importar nada, y a Romina
por su alegría de niña que siempre me ha hecho recordar lo lindo que es jugar sin preocupaciones y
por su cariño incondicional.
No puedo dejar de agradecer a la “mamma”, mi abuelita Alicia, por su constante apoyo y sus
rezos de ayuda en los momentos complicados, ni a la “nonna”, Sonia, por su preocupación
constante.
A Marco le agradezco su apoyo constante, su ayuda y su paciencia desde el primer momento,
porque simplemente es mi amigo y compañero, con el que me siento feliz.
Agradezco la preocupación y el apoyo incondicional de mi amiga de la vida, Andrea, además
de la buena disposición a pasar un momento agradable siempre que fuera requerido.
A Karla e Ivana, les agradezco su comprensión y apoyo en este último tiempo, y, por
supuesto, su grata compañía.
A Germán le agradezco su compañía, su alegría, sus locuras, sus tonteras y su amistad, por
sacarme una sonrisa y hacerme olvidar las preocupaciones aunque fuera por un momento.
A todos aquellos que me han acompañado, y, cómo olvidarlos, a los que compartieron
conmigo en la “salita” les agradezco esos gratos momentos de estudio, ocio y divagaciones.
Finalmente, agradezco a mi profesora guía, Sra. Blanca Escobar, por su apoyo y ayuda en el
transcurso de la memoria.
..y a todos los que se me hayan quedado en el tintero, gracias…
Amigos míos, nos vemos en la vida…
ii
Índice
Capítulo 1. Introducción....................................................................................................................................2
1. 1. Aspectos Generales ..............................................................................................................................2
1. 2. Antecedentes Bibliográficos ................................................................................................................3
1. 2. 1. Microorganismos lixiviantes ........................................................................................................4
1. 2. 2. Factores que influyen en la rapidez de la biolixiviación ..........................................................6
1. 2. 3. Inhibición de la actividad enzimática de los microorganismos biolixiviantes......................7
1. 2. 4. Técnica de T-RFLP.......................................................................................................................7
1. 2. 5. Comparación de poblaciones microbianas a través de análisis estadísticos .........................8
1. 3. Descripción del Proyecto.....................................................................................................................9
1. 4. Objetivos..............................................................................................................................................10
1. 4. 1. Objetivo General........................................................................................................................ 10
1. 4. 2. Objetivos específicos................................................................................................................. 10
1. 5. Alcances................................................................................................................................................10
Capítulo 2. Metodología.................................................................................................................................. 11
2. 1. Materiales .............................................................................................................................................11
2. 2. Métodos................................................................................................................................................11
2. 2. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar ............................................................................... 11
2. 2. 2. Obtención de muestras de bacterias desde una mini-columna de biolixiviación ............. 12
2. 2. 3. Extracción de DNA desde soluciones de procesos de biolixiviación ................................ 14
2. 2. 4. T-RFLP........................................................................................................................................ 15
2. 2. 4. 1. Amplificación de un fragmento del rDNA 16S............................................................ 15
2. 2. 4. 2. Purificación y cuantificación del DNA .......................................................................... 15
2. 2. 4. 3. Digestión de los productos de PCR y electroforesis capilar ....................................... 16
2. 2. 4. 4. Procesamiento de los resultados de la electroforesis capilar....................................... 16
2. 2. 5. Análisis utilizados para comparar las especies bacterianas encontradas ............................ 17
2. 2. 5. 1. Determinación de la abundancia relativa de los TRFs................................................. 17
2. 2. 5. 2. Índices de biodiversidad................................................................................................... 17
2. 2. 5. 3. Análisis de cluster.............................................................................................................. 18
2. 2. 5. 4. Análisis de componentes principales.............................................................................. 19
Capítulo 3. Resultados..................................................................................................................................... 20
3. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar en los análisis de T-RFLP ..........................................20
3. 2. Variación de los parámetros fisicoquímicos en las muestras estudiadas.....................................21
3. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y producto amplificado...............................25
3. 4. Determinación de las poblaciones bacterianas en solución y su comparación mediante
diversos análisis............................................................................................................................................28
3. 4. 1. Determinación de la abundancia Relativa de los TRFs ........................................................ 28
3. 4. 2. Comparación de los índices de biodiversidad........................................................................ 32
3. 4. 3. Comparaciones de las muestras estudiadas ............................................................................ 33
3. 4. 3. 1. Comparación entre los TRF asociados a bacterias según su aparición en las
muestras ............................................................................................................................................... 33
3. 4. 3. 2. Comparación entre las soluciones según la aparición de bacterias en solución....... 35
iii
3. 4. 3. 3. Comparación de los TRFs mediante el análisis de componentes principales .......... 37
Capítulo 4. Discusión ...................................................................................................................................... 39
4. 1. Selección de la segunda enzima de restricción a utilizar ...............................................................39
4. 2. Análisis de los parámetros fisicoquímicos de las muestras estudiadas........................................40
4. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y fragmentos amplificados del rDNA 16S41
4. 4. Análisis de los TRFs encontrados y su relación con las condiciones de la mini-columna.......42
4. 5. Análisis de la diversidad biológica en la mini-columna .................................................................46
4. 5. 1. Análisis de los índices diversidad de especies y de Shannon-Wiener ................................. 46
4. 5. 2. Comparación entre las distintas muestras obtenidas de la mini-columna ......................... 47
4. 5. 2. 1. Comparación entre las bacterias encontradas en solución.......................................... 47
4. 5. 2. 2. Comparación entre las soluciones según las bacterias encontradas........................... 49
4. 6. Efectos de los errores asociados a la metodología de T-RFLP....................................................50
4. 6. 1. Asociados a la extracción de DNA.......................................................................................... 50
4. 6. 2. Asociados a la reacción de PCR............................................................................................... 50
4. 6. 3. Asociados a la digestión enzimática ........................................................................................ 50
Capítulo 5. Conclusiones ................................................................................................................................ 52
Bibliografía ........................................................................................................................................................ 54
Anexos............................................................................................................................................................... 57
Anexo A. Partidores utilizados..................................................................................................................57
Anexo B. Soluciones utilizadas..................................................................................................................57
Anexo C. Protocolos...................................................................................................................................59
(a) Protocolo de electroforesis en gel de agarosa al X%. .................................................................. 59
(b) Protocolo de determinación de Fe+2 y fierro total. ...................................................................... 59
Anexo D. Tablas de las enzimas de restricción, su sitio de restricción y el largo de los fragmentos
que se forman...............................................................................................................................................60
(a) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Acidithiobacillus caldus. (776 pb) .............................................................................................................. 60
(b) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Acidithiobacillus ferooxidans. (776 pb) ...................................................................................................... 65
(c) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Acidithiobacillus thiooxidans. (776 pb) ...................................................................................................... 70
(d) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Leptospirillum ferrooxidans. (778 pb) ........................................................................................................ 74
(e) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Sulfobacillus thermosulfidooxidans. (766 pb) .............................................................................................. 78
Anexo E. Digestión virtual ........................................................................................................................82
iv
Índice de Tablas
Tabla 1. Máxima concentración de iones metálicos (en [g/l]) en la cual se observa crecimiento o
actividad enzimática............................................................................................................................................7
Tabla 2. Condiciones y concentraciones iniciales de los iones de cada muestra en la columna de
biolixiviación..................................................................................................................................................... 13
Tabla 3. Concentraciones necesarias de los reactivos para la reacción de PCR. .................................... 15
Tabla 4. Programa de PCR utilizado............................................................................................................. 15
Tabla 5. Concentración de los reactivos en la digestión de los productos de PCR ............................... 16
Tabla 6. Tamaño en pb de los TRF obtenidos con el programa Virtual Diegest a través de la
digestión con las enzimas de restricción RsaI y MspI, de forma independiente y de forma combinada
(RsaI+MspI). .................................................................................................................................................... 20
Tabla 7. Valores de los parámetros estudiados para cada muestra a la que fue sometida la minicolumna. ............................................................................................................................................................ 22
Tabla 8. Abundancias relativas de los TRFs más significativos obtenidos en todas las muestras
digeridas con RsaI............................................................................................................................................ 28
Tabla 9. Abundancias relativas (en porcentaje) de los TRFs más significativos obtenidos en todas las
muestras para la digestión con MspI............................................................................................................. 29
Tabla 10. Bacterias presentes en las soluciones a partir del análisis de T-RFLP con RsaI y MspI de
forma independiente........................................................................................................................................ 30
Tabla 11. Índice de diversidad de especies (S) de cada muestra según la enzima de restricción
utilizada (RsaI o MspI). ................................................................................................................................... 32
Tabla 12. Índice de Shannon-Wiener (H) de cada muestra según la enzima de restricción utilizada
(RsaI o MspI).................................................................................................................................................... 32
Tabla 13. Composición de medio MC. ......................................................................................................... 57
Tabla 14. Composición del Buffer A2X. ........................................................................................................ 57
Tabla 15. Composición del Buffer de lavado................................................................................................. 57
Tabla 16. Composición del Buffer TE............................................................................................................ 58
Tabla 17.Composición del Buffer de carga 6X.............................................................................................. 58
Tabla 18. Composición del Buffer TAE 50X. ............................................................................................... 58
Tabla 19. Composición del Buffer de almacenamiento................................................................................ 58
Tabla 20. Composición del estándar de peso molecular, 1 Kb. ................................................................ 58
Tabla 21. Composición de la solución de la RNasa.................................................................................... 58
Tabla 22. Tamaños de los TRFs obtenidos de la digestión virtual de las bacterias asociadas a procesos
de biolixiviación................................................................................................................................................ 82
v
Índice de Figuras
Figura 1. Esquema de los distintos tipos de lixiviación de un sulfuro según Tributsh (obtenida de
Ballester 2005). ....................................................................................................................................................4
Figura 2. Esquema del método de t-RFLP......................................................................................................8
Figura 3. Esquema del proceso de selección de la segunda enzima a utilizar. ........................................ 12
Figura 4. Mini columna de biolixiviación. (a) Foto lateral de la mini columna de biolixiviación; (b)
foto del mineral a procesar; (c) esquema de la mini columna de biolixiviación. ................................... 13
Figura 5. Evolución del potencial redox en las muestras 4, 5, 6, 7, 8 y 9 de la mini-columna de
biolixiviación operada bajo diferentes condiciones (Tabla 7). La simbología utilizada para cada
muestra se encuentra en la parte inferior del gráfico. ................................................................................. 21
Figura 6. Evolución de la cantidad de cobre lixiviado (en [Kg])............................................................... 23
Figura 7. Evolución de la cantidad de ión férrico en generado (en [Kg])................................................ 23
Figura 8. Evolución de la cantidad de sulfato generado (en [g])............................................................... 24
Figura 9. Evolución de la cantidad de células generadas a partir de la muestra 2. ................................. 25
Figura 10. Gel de agarosa al 0,8% del DNA genómico de las muestras 3 y 5 . Carril 1: muestra 5 ;
carril 2: muestra 5 tratada con RNasa; carril 3: muestra 3; carril 4: muestra 3 tratada con RNasa; PM:
Estándar de tamaño molecular 1Kb.............................................................................................................. 26
Figura 11. Gel de 1,4% de agarosa de los productos de PCR de la muestra 4 para distintas diluciones.
Carriles 1y 2: amplificado de la muestra 4 sin diluir; carriles 3 y 4: amplificado de la dilución 1:10 de la
muestra 4; carriles 5 y 6: amplificado de la dilución 1:100 de la muestra 4; PM: estándar de tamaño
molecular 1Kb. ................................................................................................................................................. 26
Figura 12. Variación de la abundancia relativa de A.ferrooxidans según el análisis con la enzima RsaI.
............................................................................................................................................................................ 29
Figura 13. Relación de los TRFs significativos (a) obtenidos de la digestión con RsaI, (b) obtenidos
de la digestión con MspI................................................................................................................................. 33
Figura 14. Relación de las bacterias encontradas en solución a partir de la Tabla 10............................ 34
Figura 15. Dendrogramas que muestran la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones
desarrolladas en ellas (a) según la digestión con RsaI, (b) según la digestión con MspI. ...................... 35
Figura 16. Dendrograma de la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones desarrolladas
en ellas, según los datos obtenidos en la Tabla 10. ..................................................................................... 36
Figura 17. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión
con RsaI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF. ........................................................... 37
Figura 18. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión
con MspI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF........................................................... 38
Figura 19. (a) Modelo esquemático de la formación de pseudo-TRF, plegamiento parcial de la hebra
simple podría o no formar pseudo-TRF. (b) Ejemplo de las estructuras secundarias formadas. (Egert
y Friedrich 2003) .............................................................................................................................................. 51
vi
Capítulo 1. Introducción
1. 1. Aspectos Generales
La importancia económica de la producción de cobre en Chile, impulsa el óptimo
aprovechamiento de los recursos minerales explotados. El cobre se presenta fundamentalmente en
dos formas: como minerales oxidados y como minerales sulfurados. Los primeros son fácilmente
solubles por lo que son tratados por medio de lixiviación ácida, mientras que los minerales
sulfurados, principalmente calcopirita (CuFeS2), calcosina (Cu2S) y covelina (CuS) en Chile, son
insolubles incluso en ácidos concentrados.
Es en este contexto que la biolixiviación o lixiviación bacteriana se presenta como una opción
para recuperar metales de interés a través de su solubilización bajo la acción directa o indirecta de
microorganismos desde, por ejemplo, botaderos y pilas.
Dependiendo de la composición del mineral sulfurado, la biolixiviación es una alternativa
ventajosa a las tecnologías pirometalúrgicas, si bien es más lenta en cuanto a la obtención del mineral,
ya que demanda menores inversiones de capital y menores costos de operación. Además se presenta
como una tecnología más limpia que las practicadas comúnmente, debido a que no se emite SO2 al
ambiente en su periodo de operación (Ballester 2005).
Es así, como la búsqueda de las condiciones óptimas de crecimiento y actividad de los
microorganismos envueltos en estos procesos, es decir los parámetros que estimulan o inhiben su
accionar, se vuelve de vital importancia para la industria.
Para lograr esto, se deben identificar las poblaciones bacterianas envueltas en el proceso en
estudio y cómo éstas se ven influenciadas por las características fisicoquímicas que las rodean, lo que
contribuiría a mejorar el entendimiento de los procesos de biolixiviación.
Sin embargo, dado que no todos los microorganismos presentes en estos procesos serán
cultivables, las técnicas de cultivo tradicionales no logran detectar la realidad del ecosistema
estudiado. Por esta razón, las técnicas moleculares independientes de cultivo se presentan como la
alternativa indicada para determinar los microorganismos involucrados en un proceso en un tiempo
dado.
En este contexto, el presente trabajo pretende identificar las poblaciones bacterianas asociadas a
un ambiente de lixiviación específico, a partir de una técnica molecular, y buscar alguna relación entre
éstas y las variaciones de los parámetros fisicoquímicos relevantes del sistema.
2
1. 2. Antecedentes Bibliográficos
Los microorganismos presentes en los procesos de biolixiviación tienen un rol catalítico en la
oxidación del ión ferroso (Fe+2) y del azufre elemental producidos durante la lixiviación química, a
ión férrico (Fe+3) e ión sulfato, respectivamente (Ecuación 1 y Ecuación 2). Los iones férricos
corresponden a los agentes químicos oxidantes que disolverán el sulfuro metálico (Ballester 2005;
Watling 2006).
Ecuación 1. Oxidación biológica del ión ferroso a ión férrico (Watling H.R., 2006).
2 Fe +2 + 2 H + + 0,5O2 bacteria
 → 2 Fe +3 + H 2 O
Ecuación 2. Oxidación biológica de azufre a sulfato (Watling H.R., 2006).
2 S + 3O2 + 2 H 2 O bacteria
 → 2 H 2 SO4
Los fundamentos bioquímicos de las reacciones de lixiviación han sido ampliamente estudiados
en los últimos años, habiéndose propuesto 2 mecanismos para estos procesos.
El primero consiste en la llamada “lixiviación indirecta” o “mecanismo indirecto”, en la que la
oxidación del sulfuro metálico se realiza a través de los iones férricos sin mediar contacto entre los
microorganismos y la superficie o alguna reacción enzimática, combinada con la oxidación biológica
de los iones ferrosos en solución obtenidos de la reacción anterior, como se muestra en la Ecuación
1 (Figura 1) (Watling 2006).
La “lixiviación por contacto” o “mecanismo por contacto” supone que la mayoría de las células
se adhieren a la superficie de los minerales sulfurados, lo que se traduce en la disolución del mineral
producto de los procesos electroquímicos que tienen lugar en la interfaz entre la pared del
microorganismo y la superficie del sulfuro (Figura 1) (Watling 2006).
Se añade a éstos mecanismos la “lixiviación cooperativa”, que no es más que la presencia
simultánea de los mecanismos anteriores, lo que podría traducirse en un suministro óptimo de
energía química a partir de una superficie limitada de sulfuros favoreciendo la supervivencia de las
bacterias (Figura 1) (Ballester 2005).
3
Figura 1. Esquema de los distintos tipos de lixiviación de un sulfuro según Tributsh (obtenida de Ballester
2005).
1. 2. 1. Microorganismos lixiviantes
La mayor parte de los microorganismos involucrados en los procesos de biolixiviación, se
caracterizan por crecer quimiolitotróficamente en ambientes ácidos, con pH menor a 3, con alta
concentración de iones metálicos y por ser capaces de utilizar el ión ferroso o los compuestos de
azufre reducido como fuente de energía (Rawling 1998; Watling 2006).
Sin embargo también se pueden encontrar microorganismos heterotróficos cuyo trabajo consiste
en eliminar del ambiente los compuestos de carbono presentes producto de la muerte celular o de
desechos metabólicos de los microorganismos quimiolitotrofos (Brierley 2000).
Los microorganismos asociados a estos procesos se clasifican según la temperatura a la que se
desarrollan de forma óptima, encontrándose los mesófilos (temperaturas menores a 40°C),
termófilos moderados (temperaturas entre los 30°C y 55°C) e hipertermófilos (temperaturas entre los
50° y 85°C) (Brierley 2000).
Entre las bacterias más estudiadas y presentes en la mayoría de los procesos de biolixiviación se
destacan: (Rawlings 2002)
•
Acidithiobacillus ferrooxidans: filogenéticamente situadas entre el nodo que une las β y γ
proteobacterias, son preferentemente aeróbicas, capaces de utilizar ión ferroso o
compuestos de azufre reducidos como donadores de electrones, pero también pueden
crecer utilizando el ión férrico como aceptor de electrones. Han sido encontradas como
4
•
•
•
•
•
el microorganismo dominante en procesos de lixiviación de sulfuros de cobre,
especialmente cuando existen altas concentraciones de ferroso. Son mesófilas y el rango
de pH en el que se desarrollarían estaría entre 1,8 y 2,0.
Acidithiobacillus thiooxidans: al pertenecer también al género de las Acidithiobacillus, se
encuentran filogenéticamente situadas entre el nodo que une las β y γ proteobacterias, sin
embargo están restringidas al uso de compuestos de azufre reducido como donador de
electrones. Son mesófilas, probablemente encontrándose hasta los 35°C, y son más ácido
tolerantes en comparación con A. ferrooxidans, con un rango de pH entre 0,5 y 5,5.
Acidithiobacillus caldus: al pertenecer también al género de las Acidithiobacillus, poseen las
características filogenéticas antes mencionadas. Sólo puede oxidar compuestos de azufre
reducido y crecer a pH bajos. Son consideradas termófilas moderadas, siendo su
temperatura óptima de crecimiento de 45°C aproximadamente.
Leptospirillum: filogenéticamente perteneciente a la división de las Nitrospira, es una
bacteria quimiolitoautotrófica ácido tolerante (pH óptimo entre 1,5 y 1,8), capaz de
utilizar el ión ferroso como donador de electrones. Tienen una alta afinidad por el ión
ferroso y alta tolerancia frente a la presencia de ión férrico. Entre ellas se encuentran las
L. ferrooxidans, L. ferriphilium y L. thermoferrooxidans, las primeras mesófilas y la última
termófila moderada.
Sulfobacillus: perteneciente a la familia de las Alicyclobacillaceae (Taxonomy, NCBI), se
destacan Sb. thermosulfidooxidans y Sb. acidophilus. Son termófilas moderadas, capaces de
crecer autotróficamente utilizando ión ferroso o compuestos de azufre reducidos como
donadores de electrones. También son capaces de crecer en ausencia de oxígeno
utilizando el ión férrico como aceptor de electrones y compuestos de azufre como
donadores de electrones. Se ha encontrado que su crecimiento se encontraría asociado al
de Acidimicrobium ferrooxidans, bacteria heterotrófica, capaz de oxidar hierro.
Acidiphilium: perteneciente a las α proteobacterias (Taxonomy, NCBI), son bacterias
heterótrofas que son encontradas frecuentemente creciendo en las cercanías de las A.
ferrooxidans, presumiblemente alimentándose de los compuestos orgánicos producidos por
éstas durante su metabolismo. Entre ellas, Acidiphilium acidophilum es la única capaz de
crecer autotróficamente usando compuestos de azufre reducidos, heterotróficamente
usando distintas fuentes de carbono, o mixotróficamente usando carbón orgánico o
inorgánico.
5
1. 2. 2. Factores que influyen en la rapidez de la biolixiviación
Existen diversos factores asociados a los procesos de biolixiviación que condicionan el
crecimiento de los microorganismos en estos ambientes, y éstos varían durante estos procesos
provocando variaciones en las poblaciones microbianas (Brandl 2001).
Entre los parámetros fisicoquímicos importantes en el proceso estudiado se encuentran el pH,
potencial redox, acidez, concentración de hierro total, de ión ferroso y de cobre, temperatura
contenido de oxígeno y viabilidad, y presencia de inhibidores entre otros.
La concentración de hierro total, de ión ferroso y de cobre además del potencial redox, permiten
monitorear la disolución del mineral mediada por férrico y observar el comportamiento de las
bacterias hierrooxidantes.
La presencia de inhibidores del crecimiento o la actividad de los microorganismos es importante
a la hora de utilizar este proceso a escala industrial, debido a que estos influirán en el tiempo de
obtención del mineral lixiviado.
En cuanto a los parámetros a tener en cuenta relacionados con los microorganismos, se tienen la
diversidad microbiana, la densidad de la población, la actividad microbiana, la tolerancia a los metales
y las capacidades de adaptación de los microorganismos. Todos ellos estarán directamente
relacionados con la rapidez de la lixiviación del mineral.
Finalmente, las propiedades del mineral a lixiviar también son determinantes en estos procesos,
ya que de ellas dependerá la factibilidad de la disolución del mineral tratado. Entre éstas se
encuentran, por ejemplo, el tipo de mineral, su composición, el tamaño de partícula, el área
superficial y la porosidad.
6
1. 2. 3. Inhibición de la actividad enzimática de los microorganismos biolixiviantes
Los microorganismos requieren de la presencia de diversos metales que juegan un rol bioquímico
esencial como catalizadores, co-factores de enzimas o estabilizadores de las estructuras de las
proteínas (Dopson et al. 2003).
No obstante, la acumulación de estos metales podría llegar a ser tóxica para los microorganismos,
afectando los procesos en los que se encuentran envueltos, por lo cual es importante conocer cómo
éstos los afectan.
La Tabla 1 presenta algunos ejemplos de la resistencia de bacterias acidófilas a algunos metales
encontrados en procesos de biolixiviación.
Tabla 1. Máxima concentración de iones metálicos (en [g/l]) en la cual se observa crecimiento o actividad
enzimática.
Acidiphilium cryptum
Acidiphilium angustum
Acidocella aminolytica
Acidocella facilis
Acidithiobacillus ferrooxidans
Leptospirrilllum ferrooxidans
Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Cu(II)
0,95a
0,32a
1,91a
0,064a
15b –50,83a
0,32a
0,38a
Fe(III)
16,76a
< 20 a,b
27,93a
-
Al(III)
5,4c
5,4c
5,4c
6b
-
Zn(II)
8,17a
0,52a
32,69a
6,54 a
15b -70,02a
2,8a
Datos obtenidos de las siguientes referencias: (a) Dopson et al. (2003); (b) Acevedo y Gentina (2005); (c) Wakao et al.
(2002).
1. 2. 4. Técnica de T-RFLP
La cantidad de bacterias, y microorganismos en general, conocidos en estos procesos, es
consecuencia del uso de métodos de cultivo con medios enriquecidos y de aislamiento que provocan
la selección de sólo algunas de las poblaciones existentes. Esto ha ido cambiando debido al desarrollo
de técnicas moleculares que involucran la extracción y procesamiento del DNA sin que se utilicen
etapas intermedias de cultivo (Watling 2006).
Entre estas últimas se destaca la técnica de reconocimiento de los polimorfismos de los largos de
los fragmentos terminales de restricción (T-RFLP), la cual permite obtener fragmentos terminales de
restricción (TRF) de tamaño característico para determinadas especies, con lo cual podrían ser
identificados.
La técnica de T-RFLP se divide en diversos pasos consecutivos como se presenta a continuación
(Figura 2):
•
•
Extracción del DNA directamente desde la muestra en estudio;
Amplificación del rDNA 16S bacteriano mediante partidores universales, que sean
específicos para la mayor cantidad posible de especies presentes en la muestra, marcados
en el extremo 5’ con un fluorósforo;
7
•
•
•
Digestión mediante una enzima de restricción para generar fragmentos terminales de
restricción (TRF) de distinto largo marcados en un extremo;
Separación de los fragmentos mediante electroforesis capilar de alta resolución para
poder determinar el largo de cada TRF mediante la excitación de los fluorósforos,
además de obtener una intensidad asociada a cada largo de TRF;
Obtención de los resultados en forma de un electroferograma y/o tablas.
Extracción del
DNA bacteriano
Amplificación a
través de PCR
Purificación del
producto amplificado
Electroferograma obtenido
de la electroforesis capilar
Digestión del producto amplificado
con una enzima de restricción
Figura 2. Esquema del método de t-RFLP.1
1. 2. 5. Comparación de poblaciones microbianas a través de análisis estadísticos
Finalmente, los análisis estadísticos permiten, entre otras cosas, obtener una estimación de la
diversidad asociada al ambiente en estudio o agrupar los microorganismos de acuerdo a alguna
característica.
En particular, se usan índices de diversidad de especies, de Shannon-Wiener o de Simpson para
calcular la diversidad de las especies presentes en las muestras en estudio. Los dos últimos dan cuenta
del orden asociado al ambiente estudiado.
Para agrupar especies según alguna característica se utilizan dendrogramas o análisis de
componentes principales, que también darán cuenta del comportamiento de los microorganismos en
las distintas muestras.
1
Imágenes obtenidas de la sección Books, de la página web de la NCBI (30 Mayo 2007).
8
1. 3. Descripción del Proyecto
El proyecto consiste en el estudio de la dinámica de la biodiversidad en procesos de
biolixiviación, es decir, se busca establecer alguna relación entre la variación de los parámetros
fisicoquímicos presentes en el ambiente en estudio y las bacterias identificadas para cada condición.
Para esto, se realizará el análisis mediante T-RFLP de las soluciones obtenidas de una minicolumna de biolixiviación montada en el laboratorio, para así identificar las poblaciones bacterianas
presentes, debido a que, al ser una técnica independiente de cultivos, permite obtener una
aproximación de los microorganismos presentes en solución.
La técnica de T-RFLP consiste en realizar la concentración de las células presentes en la solución,
la extracción del DNA de las células, su digestión con enzimas de restricción y la separación de los
fragmentos terminales de restricción (TRF) obtenidos a través de electroforesis capilar.
Para corroborar la información obtenida con el protocolo propuesto por Morales (2006), se
busca una enzima de restricción adicional que sea capaz de distinguir entre dos de las especies
bacterianas usualmente encontradas en los procesos de biolixiviación (A. ferrooxidans y A. thiooxidans),
y que permita comparar las informaciones obtenidas en ambos electroferogramas para corroborar la
presencia de un determinado microorganismo.
La información obtenida de los electroferogramas se analiza por comparación y de forma
estadística para buscar alguna relación entre las distintas bacterias identificadas y los parámetros
fisicoquímicos medidos.
Es importante destacar que sólo se estudiarán las bacterias presentes en las soluciones de
biolixiviación, debido al uso de partidores universales específicos para bacterias, determinados por
Morales (2006), y que éstas serán consideradas mesófilas, dado que no se le añadió ningún tipo de
calefacción a la columna.
Este trabajo se centra en la necesidad de determinar las condiciones óptimas de crecimiento y
actividad de los microorganismos envueltos en los procesos de biolixiviación, es decir los parámetros
que estimulan o inhiben su accionar, a la hora de su evaluación económica, debido a su incidencia
directa en la rapidez y capacidad de lixiviación biológica de un determinado metal.
9
1. 4. Objetivos
1. 4. 1. Objetivo General
A través del presente trabajo se busca identificar las poblaciones bacterianas presentes en
soluciones de biolixiviación y relacionarlas con las características fisicoquímicas más relevantes de la
solución en estudio en distintos tiempos.
1. 4. 2. Objetivos específicos
Entre los objetivos específicos se encuentran:
•
•
•
•
Seleccionar una segunda enzima de restricción para ser utilizada en la metodología
de T-RFLP;
Identificar mediante el método de T-RFLP las poblaciones bacterianas presentes
en soluciones de biolixiviación;
Relacionar las variaciones de las poblaciones bacterianas con las características
fisicoquímicas más relevantes de la solución en un tiempo dado;
Realizar un análisis estadístico de las poblaciones encontradas, correspondiente a
la determinación de índices de diversidad, análisis de cluster y análisis de
componentes principales.
1. 5. Alcances
Este proyecto pretende establecer alguna relación entre la variación de algunos parámetros
fisicoquímicos presentes en ambientes de biolixiviación y las bacterias identificadas para cada
condición.
Para esto, se identificarán mediante la técnica de T-RFLP, las poblaciones bacterianas presentes
en 8 muestras obtenidas de una solución proveniente de una mini columna de biolixiviación de
sulfuros de cobre montada en el laboratorio de Biohidrometalurgia.
Mediante técnicas químicas se determinaran los parámetros fisicoquímicos de las soluciones,
como pH, Eh y la concentración de los iones presentes: Cu(II), Fe(II), fierro total, Al(III), Zn(II) y
sulfato.
Paralelamente se buscará una enzima de restricción alternativa a la propuesta por Morales (2006),
que permita distinguir entre dos de las especies bacterianas usualmente encontradas en los procesos
de biolixiviación, y que además permita comparar las informaciones obtenidas en ambas enzimas por
separado para corroborar la presencia de un determinado microorganismo.
Cabe destacar que sólo se estudiarán las bacterias presentes en las soluciones de biolixiviación,
debido al uso de partidores universales específicos para bacterias, determinados por Morales (2006), y
que éstas serán consideradas mesófilas, dado que no se le añadió ningún tipo de calefacción a la
columna.
10
Capítulo 2. Metodología
En el presente capítulo se presentan los materiales y métodos utilizados en el estudio de la
dinámica de las poblaciones bacterianas, producidas al variar las condiciones de una mini-columna de
biolixiviación.
2. 1. Materiales
Los materiales utilizados para el estudio de la dinámica de las poblaciones bacterianas, se
encuentran enumerados en la metodología según corresponda.
Asimismo, la composición de las soluciones requeridas en los métodos se encuentra en el Anexo
B.
2. 2. Métodos
A continuación se presentan los métodos utilizados para determinar la dinámica de las
poblaciones bacterianas en ambientes de biolixiviación.
En primer lugar, se determinó una segunda enzima de restricción a utilizar respecto de la
metodología de T-RFLP implementada por Gabriela Morales (Morales 2006) en el laboratorio de
Biohidrometalurgia de la Escuela de Ingeniería, Universidad de Chile, con el fin de poder corroborar
los resultados obtenidos en la electroforesis capilar con la primera enzima (RsaI).
Paralelamente, se puso en marcha una mini columna de biolixiviación en el laboratorio
Biohidrometalurgia de la Escuela de Ingeniería, para así obtener bacterias asociadas a un proceso de
biolixiviación de cobre realizado en distintas condiciones, como Eh, pH y concentración de iones en
solución.
Luego se extrajo el DNA de las bacterias obtenidas en solución, con el cual se realizó el método
de T-RFLP, luego de lo cual fueron analizadas para conocer las especies bacterianas presentes y
realizar pruebas estadísticas.
2. 2. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar
Para comenzar desde el sitio web del Nacional Center of Biotechnology Information (NCBI) se
obtuvo la secuencia del rDNA 16S de las bacterias más conocidas y comúnmente encontradas en los
procesos de biolixiviación: Acidithiobacillus ferrooxidans (locus: AF329205.1), Acidithiobacillus thiooxidans
(locus: AY830898.1), Acidithiobacillus caldus (locus: Z29975.1), Leptospirillum ferrooxidans (locus:
AF356834.1), Sulfobacillus thermosulfidooxidans (locus: AY140233.1).
Luego se realizó la alineación virtual de los partidores universales (Anexo A) a utilizar en el
método de T-RFLP experimental usando el programa de libre acceso Kalign (EBI). Para esto se
utilizó el partidor 341f y la secuencia complementaria del partidor reverse 1100r. Con esto se obtiene
la secuencia que se amplifica teóricamente en la reacción de PCR para una bacteria dada.
El siguiente paso fue obtener el mapa de restricción de cada secuencia amplificada. Esto se logró
utilizando el programa de libre acceso Webcutter 2.0, el cual permite ingresar la secuencia a analizar,
lineal o circular, y elegir entre mostrar los sitios de restricción de una, algunas o todas las enzimas que
11
tiene asociadas el programa. El resultado del procesamiento de los datos se obtiene en forma de
tablas, en las cuales aparece un listado de las enzimas de restricción que pueden cortar la secuencia, el
sitio de restricción que dicha enzima reconoce, el número de cortes posibles y la posición en la cual
se lleva a cabo dicho corte.
Posteriormente se compararon las 5 tablas de enzimas de restricción y sitios de corte obtenidas,
buscando una enzima que permita diferenciar las bacterias en estudio a través del TRF obtenido en
teoría, al igual como lo hace la RsaI propuesta por Gabriela Morales (Morales 2006), o que permita
diferenciar distintos géneros.
Obtención de la
secuencia de la
bacteria
(NCBI)
Alineación de los
partidores
universales
(Kalign, EBI|)
Obtención de la
secuencia
amplificada
Análisis de los mapas
de restricción
Figura 3. Esquema del proceso de selección de la segunda enzima a utilizar.2
Finalmente, se obtuvieron los tamaños virtuales de los TRFs asociados a bacterias biolixiviantes a
partir del programa Virtual Diegest, de MICA, con lo que se pudo probar la segunda enzima
seleccionada y determinar si era la más idónea para el análisis posterior.
2. 2. 2. Obtención de muestras de bacterias desde una mini-columna de biolixiviación
Para la obtención de muestras frescas, se montó una mini columna de lixiviación en el
Laboratorio de Biohidrometalurgia, rellenándola con mineral seco proveniente de la mina Quebrada
Blanca (Figura 4 (a) y (b)).
Para su puesta en marcha, se preparó medio MC pH 1,6 (Anexo B) con 3 [g/l] de Fe+2, el que se
puso a circular en la columna como muestra el esquema (Figura 4 (c)) sin añadírsele aireación. Esta
primera muestra fue retirada al cabo de 21 días, debido al lento aumento del Eh, y cambiada por una
muestra fresca de MC pH 1,6 (Anexo B) con 6 [g/l] de Fe+2.
2
Imágenes obtenidas de la sección Books, de la página web de la NCBI (30 Mayo 2007).
12
Aireación
Bomba
Solución ácida
Figura 4. Mini columna de biolixiviación. (a) Foto lateral de la mini columna de biolixiviación; (b) foto del
mineral a procesar; (c) esquema de la mini columna de biolixiviación.
En algunas de las condiciones estudiadas, se añadió aire al sistema a través de una bomba de
pecera (Tabla 2) para considerar otro parámetro involucrado en el crecimiento de las bacterias.
Las siguientes soluciones fueron cambiadas al alcanzar un Eh superior a 590 mV, excepto en los
casos 2 y 3 que fueron retiradas a Eh menores para considerar estos casos en el análisis (Tabla 7).
Un resumen de las condiciones iniciales se presenta en la Tabla 2. En las muestras el Fe+2 se
agregó como FeSO4, en las muestras 6 y 7 se agregó sulfato como K2SO4, en las soluciones 8 y 9 se
agregó aluminio en forma de Al2(SO4)3 y el zinc fue agregado en la muestra 9 como ZnSO4 (reactivos
pro análisis, de Merck). El pH se ajustó con H2SO4 concentrado.
El Eh y pH de la columna fue medido periódicamente, y según esta medición se ajustó el pH.
Tabla 2. Condiciones y concentraciones iniciales de los iones de cada muestra en la columna de
biolixiviación.
Características
Fe(II)
Sulfato
Al(III)
Zn(II)
pH
Aireación
Unidades
g/l
g/l
g/l
g/l
-
1
3
1,6
no
2
6
1,6
no
3
6
1,6
si
13
Número de muestra
4
5
6
7
6
6
6
6
30 30
1,6 1,6 1,6 1,3
si
no
si
si
8
6
60
8,43
1,6
si
9
6
71,75
8,43
8
1,6
si
2. 2. 3. Extracción de DNA desde soluciones de procesos de biolixiviación
Antes de llevar a cabo la extracción del DNA, midió el pH y el Eh de la solución con bacterias
mediante el uso de los electrodos correspondientes. Además se realizó el recuento directo de la
cantidad de células por ml presentes en la solución.
Se llevó a cabo la extracción del DNA desde una solución proveniente de un proceso de
biolixiviación, debiendo usarse guantes y llevar a cabo las siguientes etapas: (Morales 2006)
• Filtrar el volumen de la solución a tratar (aproximadamente 1 L) con una membrana de 0,22
µm. Una vez concluida la filtración, recuperar la membrana y depositarla al interior de un tubo de 40
ml para centrífuga. El líquido filtrado se utiliza para realizar los análisis de fierro total, ión ferroso,
cobre, sulfato y, cuando corresponda, de aluminio y zinc en solución.
• Lavar con 20 ml de PBS 1X pH 1,2 agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 RPM por 15
minutos. Descartar sobrenadante.
• Lavar con 10 ml de buffer de lavado agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 RPM por 15
minutos. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado.
• Resuspender en 3 ml de buffer A2X. Adicionar lisozima a una concentración final de 3
mg/ml (243 µl de lisozima de concentración inicial de 40 mg/ml) e incubar por 1 hora a 37°C.
• Agregar SDS a una concentración final de 4% p/v (3,706 ml de SDS 7,5% p/v).
• Agregar 1,131 ml de NaCl 5M para llegar a una concentración final de 0,7M, y luego 898 µl
de CTAB 10% p/v para tener una concentración final de 1% de CTAB. Incubar a 65°C por 1 hora.
• Realizar 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento de 3 minutos cada uno, a -20°C y 70°C
respectivamente.
• Centrifugar a 1.000 RPM por 2 minutos. Recuperar el sobrenadante repartiéndolo en tubos
eppendorf de 1,6 ml con 0,7 ml aproximadamente.
• Agregar un volumen de la fase inferior de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1).
Vortex hasta homogeneizar. Centrifugar a 12.000 RPM durante 5 minutos. Recuperar la fase superior
y traspasar a tubos eppendorf de 1,6 ml limpios, colocando 0,7 ml por tubo aproximadamente.
• Agregar un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Vortex hasta homogeneizar.
Centrifugar a 12.000 RPM durante 5 minutos. Recuperar la fase superior y traspasar a tubos
eppendorf de 1,6 ml limpios, colocando 0,6 ml por tubo aproximadamente.
• Agregar un volumen de isopropanol absoluto frío y acetato de sodio 3M pH 5,2 a una
concentración final de 10% v/v. Incubar en hielo por toda la noche.
• Centrifugar a 14.000 RPM por 25 minutos. Descartar sobrenadante.
• Lavar con 500 µl de etanol al 70% agitando suavemente. Centrifugar a 14.000 RPM por 10
minutos. Repetir el lavado con etanol. Descartar sobrenadante y secar el pellet a 37°C.
• Resuspender el DNA en 50 µl de buffer TE a un solo tubo en dos tandas, cada una con 25 µl
de buffer TE. Almacenar en tubos eppendorf de 0,2 ml con 5 µl aproximadamente de DNA a -20°C.
Para confirmar la obtención de DNA al final de la extracción, se debió realizar una electroforesis
en un gel de agarosa al 0,8%.
Para comprobar la presencia de RNA en las muestras luego de la extracción, se añadió 1 µl de
RNasa (Ribonucleasa A from bovine pancreas, SIGMA) cuya concentración era de 1,2 mg/ml a uno
de los tubos con 5 µl de muestra de DNA, para tener una concentración final de 0,2 mg/ml de
RNasa, y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos. La RNasa fue diluida en la
solución de RNasa mostrada en la Tabla 21, Anexo B.
14
2. 2. 4. T-RFLP
El protocolo de T-RFLP usado correspondió al implementado por Gabriela Morales (Morales
2006) en el laboratorio de Biohidrometalurgia de la Escuela de Ingeniería, Universidad de Chile.
2. 2. 4. 1. Amplificación de un fragmento del rDNA 16S
Se realizó la amplificación de un fragmento del DNA extraído mediante la reacción de PCR con
los primers forward 341f marcado con fluorósforo FAM y reverse 1100r (Anexo A), usando dos
diluciones del DNA (1:10 y 1:100) y la muestra sin diluir, en duplicado.
En todos los tubos se tuvo un volumen final de 25 µl, correspondiente a la mezcla de reacción,
según las condiciones que se presentan en la Tabla 3, 1 µl de la muestra de DNA a amplificar
(muestra sin diluir o diluida) y agua desionizada estéril para completar el volumen de reacción.
(Morales 2006)
Tabla 3. Concentraciones necesarias de los reactivos para la reacción de PCR.
Reactivos
Partidor forward
Partidor reverse
Nucleótidos
Buffer Taq
MgCl2
Taq Polimerasa
Concentración final
0,5 µM
0,5 µM
200 µM
1X
2 mM
2,5 U
El programa de PCR utilizado se presenta en la Tabla 4. (Morales 2006)
Tabla 4. Programa de PCR utilizado.
N° de ciclos
1
30
1
Tiempo
3 min.
45 seg.
45 seg.
45 seg.
7 min.
-
Temperatura [ºC]
95
94
56
72
72
4
Finalmente, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,2% para visualizar la obtención de
una banda de aproximadamente 780 pb. A partir de éste se eligió la dilución a purificar y digerir, la
cual correspondió a la primera dilución, ordenadas de menor a mayor, en la cual se observa sólo la
banda de interés en cada uno de los duplicados.
2. 2. 4. 2. Purificación y cuantificación del DNA
La purificación de los productos de la reacción de PCR se llevó a cabo utilizando el kit de
purificación UltraClean PCR Clean-up DNA purification kit, de MoBio Laboratories, siguiendo el
protocolo descrito por el fabricante.
15
La cuantificación del DNA obtenido se realizó mediante la determinación de la absorbancia a
una longitud de onda de 260 nm de una dilución 1:60 de la muestra a analizar (1 µl de muestra en 59
µl de agua desionizada estéril) (Morales G. 2006).
La concentración de DNA en [ng/µl] se calculó según la siguiente fórmula:
Concentración de DNA ng  = Absorbancia × Factor de dilución × Factor de conversión
 µl 
donde el factor de conversión para DNA de doble hebra es de 50 [ng/µl] de DNA por unidad de
absorbancia y el factor de dilución corresponde a 60, con lo que se obtiene que la concentración de
DNA es igual a:
Concentración de DNA ng  = Absorbancia × 3000
 µl 
2. 2. 4. 3. Digestión de los productos de PCR y electroforesis capilar
Para cada muestra, la digestión de los productos de PCR purificados se realizó de forma
independiente con las enzimas RsaI (Morales G. 2006) y MspI, en un volumen final de reacción de
20 µl, según las concentraciones mostradas en la Tabla 5 y completado con agua desionizada estéril.
La reacción se realizó durante 3 horas a 37ºC para asegurar la completa digestión de los fragmentos.
Tabla 5. Concentración de los reactivos en la digestión de los productos de PCR
Reactivos
Producto de PCR purificado
Enzima de restricción
Buffer de la enzima de restricción
Concentración final
18 [ng/µl]
15 U
1X
Posteriormente los fragmentos digeridos fueron enviados a una empresa externa para realizar la
electroforesis capilar. La concentración mínima de DNA a enviar recomendada es de 10 [ng/µl] y el
volumen mínimo de 5 µl, debido a que este es el volumen necesario para cargar el equipo.
2. 2. 4. 4. Procesamiento de los resultados de la electroforesis capilar
Los datos obtenidos del elecroferograma, en forma de tablas, debieron ser procesados para el
análisis posterior.
En primer lugar fue necesario redondear el tamaño de los TRF, debido a que los largos que se
obtienen del electroferograma corresponden a números decimales, producto del tiempo de migración
de los distintos TRFs obtenidos, y su tamaño real debe corresponder a un número entero dado por la
cantidad de pb que lo componen, por lo tanto se deben redondear dichos valores al número entero
más cercano. (Morales 2006)
Luego se debieron eliminar los fragmentos cuyo largo fuera menor que 35 pb o mayor que 490
pb, dado que el estándar de tamaño molecular (1Kb) discrimina entre 35 y 500 pb, con mayor error
en los extremos. (Morales 2006)
16
Por último, los fragmentos que diferían entre si en 2 pb fueron agrupados, debido a que el error
del equipo corresponde a ± 2 pb. Esto se traduce en que la altura y el área asociado al largo de un
TRF será la suma de aquellos fragmentos que pueden ser agrupados (Wang. et al. 2004; Li et al.
2007).
Una vez realizado este procedimiento, se pudieron comparar los TRFs obtenidos con los largos
de los TRFs que se obtuvieron virtualmente a partir del programa Virtual Diegest, de MICA, con lo
cual fue posible asociar una especie bacteriana a cada fragmento.
2. 2. 5. Análisis utilizados para comparar las especies bacterianas encontradas
Los análisis utilizados para comparar las especies hacterianas encontradas en las muestras
estudiadas correspondieron a la determinación de la abundancia relativa de cada TRF obtenido; el
cálculo de los índices de diversidad y de Shannon- Wiener; el análisis de cluster y el análisis de
componentes principales, cuya determinación se muestra a continuación.
2. 2. 5. 1. Determinación de la abundancia relativa de los TRFs
La abundancia relativa (Pi) de cada TRF (i) se calculó como se muestra en la siguiente ecuación
(Wang et al. 2004; Jernberg et al. 2005; Li et al. 2007).
Abundancia relativa i = Pi =
área peak i
n
∑ área
peak i
i
Donde i corresponde al largo del TRF y n al total de TRFs obtenidos en una muestra.
Se presentan los valores de la abundancia relativa en forma de porcentajes y se consideraron
como significativos aquellos TRFs cuya abundancia relativa fuera mayor o igual al 1% (Jernberg et al.
2005; Li et al. 2007), para poder así eliminar o minimizar los TRFs que pudieran ser asociados a
ruidos en el electroferograma.
2. 2. 5. 2. Índices de biodiversidad
A continuación se presentan las ecuaciones de los índices comúnmente usados para análisis de
biodiversidad.
2.2.5.2.1. Índice de diversidad de especies
La diversidad de especies (S) corresponde a la cantidad de TRFs únicos, es decir diferentes,
encontrados en el perfil correspondiente a cada muestra analizada (Li et al. 2007). Para su cálculo se
tomaron en cuenta sólo aquellos TRF cuya abundancia relativa fuera mayor o igual al 1%.
2.2.5.2.2. Índice de Shannon-Wiener
El índice de Shannon-Wiener (H) toma en cuenta la diversidad de especies y la proporción de
cada una de ellas en la comunidad estudiada, y se calcula para cada condición en estudio como se
muestra a continuación (Dunbar et al. 2000; Keylock 2005):
17
n
H = −∑ Pi ⋅ ln( Pi )
i
Donde i corresponde al largo del TRF, n al total de TRFs obtenidos en una muestra y Pi a la
abundancia relativa de cada TRF
Se debe destacar que el mínimo valor de este índice es 0, mientras que el máximo corresponde a
ln(1/S), donde S es el índice de diversidad de especies (www.mdsg.umd.edu).
2. 2. 5. 3. Análisis de cluster
El análisis de cluster consiste en elaborar dendrogramas, gráficos, que muestren la relación
existente entre las diversas bacterias asociadas a un TRF o entre las soluciones a partir de una
característica.
En el estudio de la dinámica de las poblaciones microbianas, la característica analizada
corresponde a la presencia o ausencia de un determinado TRF en las soluciones en estudio, cuya
abundancia relativa fuera mayor o igual al 1%. Con esto se creó una matriz binaria por cada enzima
de restricción utilizada, llamada matriz de caracteres, en la cual se colocó un 1 si el TRF se encuentra
en la muestra y 0 si no (Vingron et al. 2002/2003; Meyer et al. 2004).
Es importante notar que si se deseaba comparar el comportamiento de las bacterias según su
aparición en las soluciones en estudio, las filas correspondían a los distintos TRFs y las columnas a
las soluciones, mientras que si se deseaba comparar las distintas soluciones según las bacterias
encontradas en ellas, las filas corresponderían a las soluciones y las columnas a los TRFs.
A partir de la matriz de caracteres se utilizaron las herramientas estadísticas de Matlab para
obtener la figura del dendrograma.
En primer lugar se calculó el coeficiente de similitud de Jaccard (sij) entre los distintos TRFs, para
luego calcular la distancia genética (dij), la que representa la diferencia entre los distintos fragmentos
estudiados, como se muestra a continuación.
d ij = 1 − s ij = 1 −
nij
ni + n j − nij
Donde nij corresponde al número de TRFs compartidos entre dos soluciones comparadas, es
decir la cantidad de 1 presentes en la matriz de caracteres, y ni y nj corresponden al número de TRFs
en la solución i y la j, respectivamente (Ma y Zeng 2004).
Luego se determinó la proximidad entre los TRFs a partir de las distancias calculadas utilizando
algún método. En este caso se utilizó el método de los “promedios” (average) que provee Matlab,
para intentar emular el método de UPGMA (Unweighted pair-group mean aritmetic method).
Finalmente, el programa desplegó la figura obtenida para el dendrograma.
18
2. 2. 5. 4. Análisis de componentes principales
Para realizar el análisis de componentes principales, se utilizaron las herramientas estadísticas de
Matlab.
Como datos de entrada para Matlab necesarios para crear el gráfico de componentes principales,
se debió fabricar una matriz en la cual se encontrara la abundancia relativa de cada TRF (filas) en
cada solución (columnas) (Jernberg et al. 2005).
19
Capítulo 3. Resultados
3. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar en los análisis de T-RFLP
Siguiendo la metodología expuesta para determinar la segunda enzima de restricción a utilizar
(Métodos 2. 2. 1.), se obtuvieron las tablas de las enzimas de restricción y sus sitios de corte de cada
fragmento del rDNA 16S amplificado virtualmente para las especies bacterianas consideradas, las que
se encuentran en el Anexo D.
Al comparar los mapas de restricción obtenidos para las cinco especies bacterianas consideradas,
se pudo constatar que, no hay una enzima que permita diferenciar entre A. ferrooxidans y A.
thiooxidans exceptuando la RsaI, como propuso Morales (2006), dado el par de partidores universales
utilizados y el producto amplificado obtenido. Este resultado se ve restringido a las enzimas
consideradas en el programa Webcutter 2.0, las que representan a la gran mayoría de las enzimas de
restricción existentes,
Basado en lo anterior, se buscó una enzima que, a pesar de no permitir diferenciar entre las
distintas especies de Acidithiobacillus, permitiera distinguir otras especies, representando un aporte a la
técnica de T-RFLP propuesta para el análisis de ambientes biolixiviantes. Es por esta razón que se
escogió MspI como la segunda enzima de restricción a utilizar, con la que se pudo diferenciar de
manera clara L. ferrooxidans de Sb. thermosulfidooxidans.
A continuación se presenta una tabla resumen con los tamaños de los TRFs de las bacterias
comúnmente encontradas en ambientes de biolixiviación, obtenidos con el programa Virtual Diegest,
de MICA, para la digestión virtual con las enzimas escogidas, por separado y con ambas al mismo
tiempo.
Tabla 6. Tamaño en pb de los TRF obtenidos con el programa Virtual Diegest a través de la digestión con
las enzimas de restricción RsaI y MspI, de forma independiente y de forma combinada (RsaI+MspI).
Enzimas de restricción
RsaI
MspI
RsaI + MspI
121
138
121
121
138
121
551
163
163
249
163
163
309
163
163
146
379
146
146
103
103
141
143
141
141
115
115
Bacterias biolixiviantes
Acidimicrobium ferrooxidans
Acidiphilium acidophilum
Acidithiobacillus caldus
Acidithiobacillus ferrooxidans
Acidithiobacillus thiooxidans
Leptospirillum ferrooxidans
Leptospirillum ferriphilium
Sulfobacillus acidophilus
Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Para el análisis se consideraron las bacterias comúnmente encontradas en ambientes de biolixiviación y
consideradas como las más importantes, y el TRF analizado corresponde a aquel que se alineó con el partidor
forward.
20
3. 2. Variación de los parámetros fisicoquímicos en las muestras estudiadas
Durante la utilización de la columna como sistema en estudio, se monitoreó la evolución del
potencial redox de la solución para cada una de las condiciones de operación propuestas, el cual
puede ser relacionado con el crecimiento de microorganismos hierrooxidantes. La Figura 5 presenta
los cambios en el potencial en las muestras 4, 5, 6, 7, 8 y 9, las cuales representan diferentes
condiciones posibles en ambientes de lixiviación, como concentración de iones metálicos, pH y aire
añadido al sistema, que provocan tanto la inhibición de algunas especies bacterianas como la
estimulación del crecimiento de otras.
650
Eh [mV]
600
550
500
450
400
350
300
0
3
6
9
12
15
Tiempo [días]
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 9
Figura 5. Evolución del potencial redox en las muestras 4, 5, 6, 7, 8 y 9 de la mini-columna de
biolixiviación operada bajo diferentes condiciones (Tabla 7). La simbología utilizada para cada muestra se
encuentra en la parte inferior del gráfico.
El valor de los parámetros fisicoquímicos estudiados para cada muestra, se encuentran en la
Tabla 7. En las muestras el Fe+2 inicial se agregó como FeSO4, en las muestras 6 y 7 se agregó sulfato
como K2SO4, en las soluciones 8 y 9 se agregó aluminio en forma de Al2(SO4)3 y el zinc fue agregado
en la muestra 9 como ZnSO4.
21
Tabla 7. Valores de los parámetros estudiados para cada muestra a la que fue sometida la mini-columna.
Parámetros Unidades
1
Eh final
mV
443
pH inicial
1,6
pHfinal
1,77
Fe+2 inicial
ppm
3000
Fe total
ppm
3000
inicial
Fe+2 final
ppm
1421
+3
Fe final
ppm
2290,3
Fe total final
ppm
3711,3
Cu final
ppm
2600
Cu disuelto
mg
1820
-2
SO4 inicial
g/l
5,2
SO4-2 final
g/l
14,8
SO4-2
g/l
9,6
generado
Al final
ppm
Zn final
ppm
Recuento
bact/ml 4,5 * 105
directo
Células
cél
3,15 * 108
generadas
Volumen
ml
700
final
Aireación
no
2
425
1,6
1,82
6000
3
515
1,6
2,3
6000
4
597
1,6
1,45
6000
Muestras
5
592
1,6
1,76
6000
6000
6000
6000
6000
6000
6000
6000
6000
2349,75
3682
6031,75
560
532
10,3
15,8
79,13
5564,42
5643,55
160
156,8
10,3
13,3
5,82
6505,03
6510,85
163,5
155,3
10,3
19,46
6,99
7454,76
7461,75
181,3
166,8
10,3
14,4
10,3
7359,6
7369,9
128,8
122,4
25,3
29,31
33,64
7966,11
7999,75
146,3
139,0
25,3
32,7
39,43
6536,37
6575,8
85
80,8
55,3
59,88
72,96
6902,64
6975,6
61,3
57,0
67,1
73
5,5
3,0
9,1
4,1
4,0
7,4
4,6
5,9
-
-
-
26,9
0,53
27,1
0,78
45,5
0,61
7450
0,47
7530
7410
5,75 * 106
1,58 * 108
4,26 * 107
1,35 * 107
8,25 * 107
5,0 * 107
7,88 * 107
3,78 * 107
5,46 * 109
1,55 * 1011
4,05 * 1010
1,24 * 1010
7,84 * 1010 4,75 * 1010 7,49 * 1010
3,52 * 1010
950
980
950
920
950
950
950
930
no
Si
si
no
si
si
si
si
22
6
608
1,6
1,79
6000
7
583
1,3
1,45
6000
8
614
1,6
1,64
6000
9
604
1,6
1,62
6000
La Figura 6 y la Figura 7 muestran la evolución de la cantidad de cobre lixiviado y la cantidad de
ión férrico generado, respectivamente, en función del tiempo.
Cobre disuelto [Kg]
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98
Tiempo [días]
Fe(III) generado [Kg]
Figura 6. Evolución de la cantidad de cobre lixiviado (en [Kg]).
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98
Tiempo [días]
Figura 7. Evolución de la cantidad de ión férrico en generado (en [Kg]).
La Figura 8 muestra la evolución de la cantidad de sulfato generado en función del tiempo.
23
Sulfato generado [g]
50,0
45,0
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
0
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98
Tiempo [días]
Figura 8. Evolución de la cantidad de sulfato generado (en [g]).
Cabe destacar que en el transcurso del experimento no se midió la temperatura de la solución o la
que había al interior de la columna. Al no haber colocado ningún tipo de calefacción a la columna, se
considera que ésta se encontraba a temperatura ambiente, aproximadamente, por lo que se podría
asociar el crecimiento de microorganismos mesófilos y moderadamente termófilos que se pudieran
haber adecuado a las condiciones del medio.
24
3. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y producto amplificado
Se efectuó un recuento directo de la cantidad de células presentes en la solución en todas las
muestras, luego de lo cual se procedió con la etapa de extracción de DNA.
En la muestra 1 no se pudo obtener DNA genómico, debido a que correspondía a la condición
en la cuál se tenía la menor cantidad de células, aproximadamente 4,5 * 105 cél/ml, por lo que no se
siguió utilizando esta muestra para los posteriores estudios.
La Figura 9 muestra el aumento de la cantidad de células generadas durante el proceso de
biolixiviación ocurrido en la columna a partir de la muestra 2.
Número de células en solución
1,0E+12
1,0E+11
1,0E+10
1,0E+09
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98
Tiempo [días]
Figura 9. Evolución de la cantidad de células generadas a partir de la muestra 2.
Otro análisis realizado correspondió a intentar explicar el barrido obtenido en los geles de
agarosa luego de la extracción, correspondiente a fragmentos pequeños de DNA según el estándar de
tamaño 1 Kb. Para esto se incubaron dos de las muestras, las muestras 3 y 5, con RNasa según se
muestra en la metodología, con lo cual se determinó que el barrido correspondía a RNA. (Figura 10).
25
PM
verificar
si se2 trataría
de RNA 3
1
PM
4
12.216 pb
1.018 pb
506 pb
Figura 10. Gel de agarosa al 0,8% del DNA genómico de las muestras 3 y 5 . Carril 1: muestra 5 ; carril 2:
muestra 5 tratada con RNasa; carril 3: muestra 3; carril 4: muestra 3 tratada con RNasa; PM: Estándar de
tamaño molecular 1Kb.
Luego se llevó a cabo la etapa de PCR de manera exitosa para las muestras estudiadas,
obteniéndose el fragmento amplificado del tamaño esperado para todas las diluciones. A través de un
gel de agarosa 1,4% (por ejemplo la Figura 11) se observaron los fragmentos amplificados de cada
una de las muestras y se procedió a elegir la dilución con la se harían los análisis posteriores.
PM
1
2
3
4
5
6
1.018 pb
± 780 pb
506 pb
Figura 11. Gel de 1,4% de agarosa de los productos de PCR de la muestra 4 para distintas diluciones.
Carriles 1y 2: amplificado de la muestra 4 sin diluir; carriles 3 y 4: amplificado de la dilución 1:10 de la
muestra 4; carriles 5 y 6: amplificado de la dilución 1:100 de la muestra 4; PM: estándar de tamaño
molecular 1Kb.
26
Luego se realizó la etapa de purificación y la digestión enzimática con la enzima de restricción
RsaI o MspI.
En la etapa de purificación se estudiaron dos posibles métodos: purificar la banda del amplificado
directamente desde el gel con el kit correspondiente o purificar la solución obtenida luego del PCR
con un kit de purificación de productos de PCR. En ambos casos, al hacer un gel de agarosa al 1,4%,
se obtuvo la banda esperada purificada, por lo que se esperaba que no hubiera diferencias en la
digestión enzimática y en el electroferograma.
Es importante destacar que la digestión al utilizar cada enzima fue completa, debido a que al
hacer una electroforesis en gel de agarosa al 1,4% de algunas de las muestras digeridas, los
fragmentos observados no correspondieron al fragmento entero amplificado con el método de PCR,
sino que a fragmentos de menor tamaño.
27
3. 4. Determinación de las poblaciones bacterianas en solución y su comparación
mediante diversos análisis.
3. 4. 1. Determinación de la abundancia Relativa de los TRFs
Luego del tratamiento de los TRFs obtenidos en el electroferograma para cada muestra,
mencionado en Métodos, 2. 2. 5. 1. , se calcularon las abundancias relativas que se muestran en las
tablas a continuación. La Tabla 8 y la Tabla 9, presentan los resultados de la digestión con RsaI y
MspI respectivamente. Para este análisis sólo se consideraron los TRFs cuya abundancia relativa
fuera mayor al 1%, para eliminar o minimizar los errores asociados a ruidos en el electroferograma
(Jernberg et al. 2005; Li et al. 2007), o aquellos que pudieran ser relacionados a alguna especie
bacteriana asociada a procesos de biolixiviación. En ambas tablas, las muestras corresponden a las
distintas condiciones de operación a las que fue sometida la mini-columna de biolixiviación, que se
presentan en la Tabla 7.
Tabla 8. Abundancias relativas de los TRFs más significativos obtenidos en todas las muestras digeridas
con RsaI.
Tamaño
del
TRF(pb)
70
77
85
94
121
126
141
146
213
238
249
267
309
2
3
4
5
6
7
8
9
4,04
2,71
1,08
0,70
1,06
0,19
66,75
12,24
-
7,03
3,47
0,95
2,15
0,39
62,88
5,0
0,57
7,90
10,13
7,67
0,82
1,31
1,44
1,67
0,68
44,57
3,33
6,54
1,33
1,34
0,36
10,83
0,99
0,42
63,72
1,92
4,65
2,38
0,27
2,34
0,30
1,08
88,30
1,61
-
2,12
3,46
0,84
82,47
1,41
5,06
0,21
0,11
1,52
1,14
80,20
2,44
0,28
0,32
0,46
0,78
84,52
2,48
-
Total
88,77
82,44
87,39
86,88
93,63
95,57
85,69
88,56
Abundancia relativa (%) en cada muestra
28
Tabla 9. Abundancias relativas (en porcentaje) de los TRFs más significativos obtenidos en todas las
muestras para la digestión con MspI.
Tamaño
del
TRF(pb)
70
103
115
130
138
143
148
163
203
325
2
3
4
5
6
7
8
9
7,00
9,66
1,15
1,64
50,27
9,06
2,50
-
1,08
1,09
2,74
70,49
3,31
7,72
2,26
2,06
6,33
48,11
6,18
14,44
2,02
1,71
12,38
3,11
62,76
4,90
7,53
-
84,74
2,65
6,10
-
3,69
1,16
82,20
1,06
4,22
-
2,62
1,59
1,86
80,73
2,38
1,16
1,27
-
1,25
85,55
1,62
1,54
2,09
-
Total
81,28
88,69
80,85
90,68
93,49
92,33
91,61
92,05
Abundancia relativa (%) en cada muestra
Cada TRF puede ser asociado a una especie bacteriana particular presente en procesos de
biolixiviación. Por ejemplo, la Figura 12 muestra la variación de la abundancia relativa de A.
ferrooxidans en las muestras estudiadas, basado en los resultados obtenidos con la enzima de
restricción RsaI. Por otra parte, hay TRFs que corresponden a más de una especie bacteriana. Al
tener dos digestiones independientes con enzimas distintas, es posible descartar algunas bacterias que
estarían presentes en el proceso usando el análisis con una sola enzima, pero que no están presentes
al analizar los resultados obtenidos por la digestión con otra enzima. De esta manera, se tiene que las
bacterias que con mayor probabilidad estarían formando parte de las soluciones estudiadas,
corresponden a las que se encuentran en ambos análisis presentadas en la Tabla 10.
Abundancia relativa [%]
7
6
5
4
3
2
1
0
2
3
4
5
6
7
8
9
Muestras
Figura 12. Variación de la abundancia relativa de A.ferrooxidans según el análisis con la enzima RsaI.
29
Tabla 10. Bacterias presentes en las soluciones a partir del análisis de T-RFLP con RsaI y MspI de forma independiente.
Bacterias
α proteobacteria
Acidimicrobium ferrooxidans
Acidiphilum spp.
Acidocella spp.
Acidomonas methanolica
Ferrimicrobium acidiphilium
A. ferrooxidans
A. thiooxidans
Arthrobacter spp.
Desulfosporosinus spp.
Shewanella spp.
Sb. acidophilus
Sb. thermosulfidooxidans
4
si
Muestras
5
6
si
si
7
si
8
si
9
si
-
si
si
-
si
si
-
si
si
-
si
si
si
si
si
si
si
si
-
si
si
-
si
si
-
si
si
-
si
-
TRF (pb)
RsaI MspI
213
138
2
si
3
si
121
138
-
249
309
126
94
238
141
141
163
163
143
164
163
143
115
si
si
-
30
A continuación se presentan algunas características generales de las bacterias encontradas en
solución:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Acidithiobacillus ferrooxidans: son preferentemente aeróbicas, quimiolitótrofas, capaces de
oxidar Fe+2 y compuestos de azufre, en condiciones anaeróbicas son capaces de reducir
Fe+3. Han sido encontradas como el microorganismo dominante en procesos de
lixiviación de sulfuros de cobre, especialmente cuando existen altas concentraciones de
ferroso. Son mesófilas y el rango de pH en el que se desarrollarían estaría entre 1,8 y 2,0.
(Rawlings 1998, Malki et al. 2006, Watling 2006, Ghauri et al. 2007)
Acidithiobacillus thiooxidans: aeróbicas, quimilitótrofas, son capaces de oxidar compuestos
de azufre reducido. Son mesófilas, probablemente encontrándose hasta los 35°C, y
toleran ambiente más ácidos en comparación con A. ferrooxidans, con un rango de pH
entre 0,5 y 5,5. (Malki et al. 2006, Watling 2006, Ghauri et al. 2007)
Acidiphilium: bacterias heterótrofas, ácido tolerantes, son capaces de oxidar compuestos
de azufre de manera autotrófica y de reducir Fe+3 en condiciones aeróbicas o anaeróbicas.
Entre ellas, Acidiphilium acidophilum es la única capaz de crecer autotróficamente usando
compuestos de azufre reducidos, heterotróficamente usando distintas fuentes de carbono,
o mixotróficamente usando carbón orgánico o inorgánico. (Küsel et al. 1999, Rawlings
2002, Malki et al. 2006, Watling 2006)
Acidimicrobium ferrooxidans: termófila moderada, con un pH óptimo de 2. Es mixotrófica,
hierrooxidante y reductora de Fe+3, y su presencia se encuentra asociada al crecimiento
de Sulfobacillus. (Rawlings 1998, Rawlings 2002, Watling 2006, Rawlings y Jonson 2007)
Acidocella: bacteria acidófila, heterotrófica, es capaz de crecer a pH inferiores a a 3,5 y
tolerar altas concentraciones de aluminio. Esta bacteria ha sido encontrada asociada al
crecimiento de A. ferrooxidans y se adhiere fuertemente a los precipitados de ión férrico.
(Wakao et al. 2002, Ghauri et al. 2007, página web:
www.learner.org/channel/courses/biology/textbook/microb/microb_14.html)
Acidomonas methanolica: bacteria heterotrófica reductora de Fe+3 (Rawlings y Jonson 2007).
Arthrobacter: bacteria aeróbica, heterótrofa. Es capaz de utilizar una gran variedad de
compuestos orgánicos, incluyendo compuestos aromáticos, razón por la cual se
encuentra presente en diferentes ambientes, especialmente en muestras de suelo.
(Crocker et al. 2000)
Desulfosporosinus: bacteria mesofílica, anaeróbica, reductora de sulfato. Es capaz de crecer
de manera autotrófica usando hidrógeno, dióxido de carbono y sulfato. (Robertson et al.
2001, Malki et al. 2006)
Ferrimicrobium acidiphilium: es mesófila, heterotrófica, capaz de oxidar Fe+2 y reducir Fe+3.
Su pH óptimo se encuentra entre pH 1,7 y 1,8.( Watling 2006, Rawlings y Jonson 2007)
Shewanella: anaeróbica, heterótrofa, reduce Fe(III) y Mn(IV), y oxida H2., compuestos
aromáticos o cadenas cortas de ácidos orgánicos. (Arnold et al. 1990, Roden y Lovley
1993, Küsel et al. 1999, Gadd 2001)
Sulfobacillus: Son termófilas moderadas, capaces de crecer autotróficamente, oxidando le
ión ferroso o compuestos de azufre reducidos. También son capaces de crecer en
ausencia de oxígeno reduciendo el ión férrico y oxidando compuestos de azufre reducido.
Su pH óptimo se encuentra entre 1 y 2,5 Se ha encontrado que su crecimiento se
encontraría asociado al de Acidimicrobium ferrooxidans. En particular, Sb.thermosulfidooxidans
en más activa en la oxidación de Fe+2 y Sb.acidophilus oxida más rápidamente los
compuestos de azufre. (Rawlings 2002, Watling 2006, Rawlings y Jonson 2007)
31
3. 4. 2. Comparación de los índices de biodiversidad
La Tabla 11 presenta los valores obtenidos para el índice de diversidad de especies por cada
enzima de restricción, el que corresponde a la cantidad de TRFs únicos, es decir diferentes,
encontrados en cada muestra.
Tabla 11. Índice de diversidad de especies (S) de cada muestra según la enzima de restricción utilizada
(RsaI o MspI).
S
Muestra
2
3
4
5
6
7
8
9
RsaI
3
3
7
4
3
4
4
2
MspI
6
5
6
5
3
5
6
5
En la Tabla 12 se muestran los valores obtenidos para el índice de Shannon-Wiener (H) con cada
enzima, el que toma en cuenta la diversidad de especies y la proporción de cada una de ellas en la
comunidad estudiada, correspondiente a la abundancia relativa.
Tabla 12. Índice de Shannon-Wiener (H) de cada muestra según la enzima de restricción utilizada (RsaI o
MspI).
H
Muestra
2
3
4
5
6
7
8
9
RsaI
0,37
0,52
0,90
0,75
0,23
0,49
0,38
0,23
32
MspI
1,00
0,70
1,14
1,00
0,41
0,52
0,51
0,40
3. 4. 3. Comparaciones de las muestras estudiadas
3. 4. 3. 1. Comparación entre los TRF asociados a bacterias según su aparición en las
muestras
La Figura 13 muestra los dendrogramas obtenidos utilizando los TRFs cuya abundancia relativa
sea mayor o igual al 1% y asociados a alguna bacteria de los ambientes ácidos de biolixiviación.
(a)
(b)
Figura 13. Relación de los TRFs significativos (a) obtenidos de la digestión con RsaI, (b) obtenidos de la
digestión con MspI.
33
La Figura 14 muestra la comparación entre las bacterias resultantes de la comparación de los
resultados de los electroferogramas en cada muestra, a partir de los cuales se determinó que las
bacterias realmente presentes en solución corresponden a las de la Tabla 10.
Desulfosporosinus spp.
Shewanella spp.
Acidimirobium ferrooxidans
Acidiphilum spp; Acidocella spp
Acidomonas methanolica
Ferrimicrobium acidiphilium
Arthrobacter spp.
A.ferrooxidans.
α proteobacteria
Sb.acidophilus
Sb.thermosulfidooxidans
A.thiooxidans
Distancia
Figura 14. Relación de las bacterias encontradas en solución a partir de la Tabla 10.
34
3. 4. 3. 2. Comparación entre las soluciones según la aparición de bacterias en solución
La Figura 15 presenta la comparación de las muestras según las bacterias en solución,
determinadas con el método de T-RFLP, para cada digestión enzimática.
(a)
(b)
Figura 15. Dendrogramas que muestran la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones
desarrolladas en ellas (a) según la digestión con RsaI, (b) según la digestión con MspI.
La Figura 16 muestra la comparación de las soluciones a partir de la aparición de las bacterias
presentadas en la Tabla 10 en la solución.
35
Distancia
Figura 16. Dendrograma de la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones desarrolladas en
ellas, según los datos obtenidos en la Tabla 10.
36
3. 4. 3. 3. Comparación de los TRFs mediante el análisis de componentes principales
El resultado del análisis de componentes principales para las muestras estudiadas, se muestra en
la Figura 17, correspondiente a los TRFs obtenidos con RsaI, y la Figura 18, correspondiente a los
TRFs obtenidos con MspI. Cada punto en las figuras se relaciona con un tamaño de TRF, el cual se
muestra al lado de cada uno de los puntos, y representa a las bacterias encontradas en solución.
Figura 17. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión con
RsaI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF.
37
Figura 18. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión con
MspI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF.
38
Capítulo 4. Discusión
4. 1. Selección de la segunda enzima de restricción a utilizar
En diversas fuentes se propone que las enzimas de restricción adecuadas para llevar a cabo la
técnica de T-RFLP, son aquellas que reconocen un sitio de restricción de 4 pb. (Liu et al. 1997; Bryan
et al. 2005). Esto eventualmente permitiría obtener una mayor cantidad de TRFs distintos, debido a
que la probabilidad de que cada enzima encuentre más de un sitio de restricción aumentaría, respecto
a aquellas que reconocen sitios de 5, 6 o 7 pb. Esta situación dependerá del grado de conservación de
los sitios de restricción en los fragmentos analizados (Liu et al. 1997).
Al estudiar los TRFs teóricos obtenidos con distintas enzimas de restricción, a partir de los
fragmentos del rDNA 16S amplificados teóricamente, se comprobó que aquellas enzimas que
reconocían sitios de restricción de un largo mayor a 4 pb producían TRFs de igual tamaño para la
mayoría de las bacterias consideradas, o simplemente no cortaban la secuencia, según mostró el
programa Virtual Diegest, de MICA. Por otro lado, enzimas que reconocían sitios de restricción de 4
pb también presentaron TRFs teóricos de igual tamaño, lo que sugiere que ese sitio de restricción en
particular es altamente conservado en los genes del rDNA 16S de estos microorganismos.
Se escogió MspI (C/CGG) como segunda enzima de restricción, teniendo que permite distinguir
a L. ferrooxidans y Sb. thermosulfidooxidans de otras bacterias consideradas en procesos de biolixiviación.
El uso de esta enzima permite, además, diferenciar L. ferrooxidans de L. ferriphilium y Sb.
thermosulfidooxidans de Sb. Acidophilus (Tabla 6). Sin embargo, L. ferriphilium y Sb. Acidophilus no podrían
ser completamente diferenciadas del resto de las bacterias, debido a que existe por lo menos una
bacteria más cuyo TRF es del mismo tamaño (Tabla 22, Anexo E).
De la misma forma, al digerir con RsaI y MspI no es posible distinguir entre algunas especies
bacterianas, como se muestra en la Tabla 6. Debido a que su TRF es el mismo, no se sabría con
certeza cual o cuales bacterias están presentes en la solución.
Cabe destacar que al usar la enzima de restricción RsaI, más de algún TRF asociado a las
bacterias en estudio tendría un largo mayor que 490 pb, por lo tanto están fuera del rango del
estándar de tamaño de la electroforesis capilar y no serán encontrados en la solución. Al usar MspI
las bacterias descartadas con la enzima anterior podrían ser encontradas en solución,
complementando la información entregada por el análisis con RsaI.
Se ha encontrado en la literatura que el uso dos enzimas de forma simultánea para realizar la
digestión de los fragmentos amplificados, aumenta la resolución de la técnica de T-RFLP, lo que se
traduce en un aumento de la cantidad de TRF únicos (Liu et al, 1997). En el caso particular de las
enzimas utilizadas en este trabajo, su aplicación en conjunto no resulta un gran aporte respecto a la
digestión con las dos enzimas de forma separada, debido a que no se lograría la diferenciación entre
A. ferrooxiands y A. thiooxidans (Tabla 6). En estas condiciones sigue siendo mejor el uso de RsaI de
forma independiente para los ambientes de biolixiviación.
Cabe destacar que la base de datos a través de la cual se efectuó la determinación de los TRF en
la implementación inicial de la técnica (Morales 2006) y que dio como resultado el uso de la enzima
RsaI, fue actualizada en Julio del 2007. Con esta nueva información, se tiene que los TRFs de
A.thiooxidans y de A.albertensis (Tabla 22, Anexo E) son del mismo tamaño al digerir con RsaI. Por lo
tanto no se cumpliría la premisa inicial de que esta enzima permite distinguir sin lugar a dudas entre
A.ferrooxiands y A. thiooxidans.
39
4. 2. Análisis de los parámetros fisicoquímicos de las muestras estudiadas
Una primera aproximación para estudiar la dinámica de las distintas poblaciones bacterianas
presentes en procesos de biolixiviación, la constituye la Figura 5. En ella se ve cómo afectan las
diferentes condiciones del medio en la oxidación de ión ferroso a ión férrico.
A medida que aumenta la concentración de sulfato (muestras 6 y 7), de aluminio (muestras 8 y 9)
o de zinc (muestra 9), las curvas de Eh muestran una tendencia a retardar su llegada a valores
cercanos a los 600 mV, siendo la muestra 9 la que tarda mayor cantidad de tiempo. Esto se explica
por la toxicidad del zinc y los niveles de aluminio y sulfato presentes en la columna y la solución, que
se traducen en un grado de inhibición de la oxidación de Fe+2 (Tabla 7) y del crecimiento bacteriano
(Figura 9) (Dopson et al. 2003).
Las muestras 4 y 5, en que la concentración de sulfato inicial es similar y a las cuales no se añadió
ningún compuesto en particular al medio (Tabla 7), muestran una marcada diferencia en su potencial
redox a partir del tercer día, siendo la muestra 4 la que menos tarda en llegar a 600 mV. La
explicación de este fenómeno puede estar relacionada con los valores de pH y la aireación presente
en la columna. En la muestra 4 se suministró aire y el pH final fue de aproximadamente 1,4, mientras
que en la muestra 5 no se suministró aire y el pH final fue de alrededor de 1,7, a pesar de que las
condiciones iniciales eran similares. De esta forma la muestra 4 se considera más favorable, respecto
a la muestra 5, para el crecimiento de una mayor cantidad de organismos biolixiviantes (Figura 9 y
Tabla 7), en particular de los hierrooxidantes, entre los que se incluyen los Acidithiobacillus y los
Leptospirillum (Yahya y Johnson 2002; Rohwerder et al. 2003), lo que explicaría la mayor rapidez y
mayor cantidad de oxidación de Fe+2 (Tabla 7).
En el caso de las muestras 6 y 7, el párrafo anterior se contradice con lo sucedido. Si bien en
ambas muestras fue suministrado aire, el pH de la muestra 6 se mantuvo entre 1,6 y 1,7,
aproximadamente, mientras que en la muestra 7 se mantuvo entre 1,3 y 1,4, por lo cual se esperaría
que en la muestra 7 hubiese una mayor actividad oxidativa, como se comentó anteriormente. Sin
embargo en este caso se tiene mayor concentración de sulfato, respecto de las muestras 4 y 5, la que
aumentó aproximadamente el doble para simular una mayor generación de ácido sulfúrico (Tabla 7),
lo que junto con el bajo pH pudo haber inhibido a algún tipo de microorganismo tanto en
crecimiento como en actividad oxidativa. La muestra 6 representaría la situación más favorable para
el crecimiento de A. ferrooxidans y otras especies hierooxidantes, lo que podría traducirse en que este
caso presente la más rápida actividad oxidativa (Figura 5).
En la muestra 8 (Figura 5) se observa que durante los primeros días los valores del Eh fueron
inferiores a los de todas las muestras estudiadas, exceptuando la muestra 9. No obstante, alrededor
del día 8 se observa claramente como el Eh es mayor que en las muestras 5, 7 y 9. La explicación de
fenómeno podría ser que durante los primeros días se tiene una etapa de ambientación de los
microorganismos a los niveles de aluminio adicionados a la solución, pero luego algunos de ellos ven
estimulado su crecimiento, dependiendo de la concentración de aluminio en el medio, y otros
simplemente toleran la concentración de aluminio presente (Wakao et al 2002).
Las muestras 2 y 3 no son presentadas en la Figura 5 debido a que no se realizó un seguimiento
significativo de la variación de los valores del Eh. Por otro lado, en la muestra 1 a pesar de poseer
dichos valores, estos presentan una pendiente creciente suave debido a corresponder a la etapa de
ambientación de la columna, por lo tanto no se alcanzaron valores de Eh superiores a 450 mV en un
tiempo considerable para el estudio y fue cambiada, no siendo significativa para este análisis.
40
La gran concentración de cobre obtenida en la solución 1 (Figura 6), en comparación con las
otras muestras, se explica debido a que el mineral usado en la columna provenía de un proceso de
lixiviación y se encontraba seco. Luego, al hacer circular el medio de cultivo MC, se provocó un
lavado del mineral con lo que se recuperó el cobre disuelto que no se había recuperado antes de que
se guardara el mineral.
En el resto de las muestras la cantidad de cobre disuelto (Figura 6) está estrictamente relacionado
con la actividad de las bacterias (su estimulación o su inhibición). En particular se observa que la
cantidad de cobre disuelto tiende a disminuir a medida que se añaden iones de aluminio y zinc a las
muestras.
En la Figura 7 se observa cómo la generación de ión férrico es siempre creciente, asociado a la
actividad oxidativa de las bacterias en solución y/o adheridas al mineral de la columna. De la misma
forma, la cantidad de sulfato generado es creciente (Figura 8), lo que se asocia a oxidación química o
a la actividad de bacterias azufre oxidantes presentes en solución y/o adheridas al mineral.
4. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y fragmentos amplificados
del rDNA 16S
En la Figura 9 se observa el aumento de la cantidad de células generadas en el tiempo. En
particular, en la muestra 9 la cantidad de células generadas disminuye posiblemente debido a los iones
de zinc añadidos al sistema (Tabla 7). Por otra parte, en las muestras en las que no hubo aireación se
obtuvo la menor cantidad de células generadas (muestras 2, 3 y 5, Tabla 7), sin que hubiese algún ión
adicional en solución. Esto muestra la necesidad de la adición de aire para la obtención de una gran
cantidad de microorganismos relacionados con estos ambientes.
Al analizar las variaciones de pH en la Tabla 7, se observa que la mayor cantidad de células
generadas se tiene en la muestra 3, en la que se tiene el pH más alto analizado (pH 2,3). Sin embargo
en esta muestra el potencial redox alcanzó los 515 mV, por lo que los niveles de Fe+3 no habrían
alcanzado a afectar a los microorganismos presentes y no se puede asociar una alta actividad de
bacterias hierrooxidantes que expliquen la cantidad de células. Por otra parte, las muestras en las que
se tiene el menor pH final estudiado (muestras 4 y 7 con un pH final de 1,45), no se obtuvo un
cambio sustancial respecto a las otras muestras en la cantidad de células presentes. Es por esto que
no se pueden asociar las variaciones de pH al comportamiento general de las muestras en cuanto a la
cantidad de células generadas.
Como ya se comentó en los resultados, la muestra 1 fue la que presentó la menor concentración
de células al realizar el recuento directo al final de cada etapa (Tabla 7) y no se logró extraer su DNA.
Debido a esto se especula que se requiere una cantidad de células totales del orden de 1010, por lo que
se debería tener 1 litro de solución con una concentración de 107 células/ml para lograr una
extracción de DNA exitosa.
Por otra parte, la Figura 10 demuestra que se logró la extracción de DNA genómico, y que
eventualmente sería necesario añadir al protocolo de extracción una etapa en la que se adicionará
RNasa, para así eliminar el RNA obtenido (señal al final de los carriles 1 y 3), permitiendo ver de
forma clara en la electroforesis la calidad del DNA extraído, aunque la presencia de DNA no afectó
las reacciones de PCR (Figura 11).
41
En la comparación de los métodos de purificación del producto de PCR, en ambos casos se
encontró un fragmento, dependiente de la enzima de restricción utilizada, que poseía la mayor
abundancia relativa, superior al 40% en todas las muestras. Por otra parte, los electroferogramas
resultantes de la purificación desde el gel no presentaban todos los posibles TRFs obtenidos de la
digestión enzimática, porque el mayor TRF en ocasiones no superaba los 170 pb, por lo que fueron
considerados como resultados no significativos. Fue por estas razones que se decidió llevar a cabo el
protocolo de T-RFLP utilizando el kit de purificación de productos de PCR.
4. 4. Análisis de los TRFs encontrados y su relación con las condiciones de la minicolumna
Se puede observar en la Tabla 8 y la Tabla 9 que al hacer la digestión con RsaI se tiene una mayor
cantidad de TRFs respecto de los obtenidos con MspI (13 con RsaI versus 10 con MspI), lo que
proviene, en el caso de RsaI, de contabilizar TRFs que si bien no son significativos (abundancia
relativa menor al 1%) pueden ser asociados a alguna bacteria biolixiviante que se esperaría encontrar.
Por otra parte, con ambas enzimas de restricción se obtuvo un TRF con la mayor abundancia
relativa, sobre el 40%, que se encuentra presente en todas las muestras en estudio. En el caso de RsaI
su tamaño es de 213 pb y en el caso de MspI es de 138 pb, los cuales pueden ser asociados a α
proteobacterias genéricas. Por otra parte, el TRF de largo 138 con MspI es también asociado a
Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp., Acidocellas spp., y Acidomonas methanolica, todas α
proteobacterias heterótrofas (Taxonomy, NCBI), mientras que éstas corresponden al TRF de 121 pb
para la digestión con RsaI. Con esta información no parece extraña la posibilidad de que el TRF de
213 pb obtenido con RsaI, corresponda efectivamente alguna α proteobacteria que se desarrolle en
ambientes ácidos como el estudiado.
En la Tabla 8 se observa la presencia de TRFs de largo 70, 77 y 85 pb al hacer la digestión con
RsaI, los cuales pueden ser asociados a alguna bacteria no cultivable, según los resultados arrojados
por la digestión virtual. Para estas bacterias no cultivables, su TRF con MspI correspondería a 138
pb, por lo cual no se podría descartar la posibilidad de que efectivamente se hayan desarrollado en el
sistema estudiado. Sin embargo, como no se conoce cuales fueron las condiciones en las que fueron
obtenidas las bacterias no cultivables que aparecen en la base de datos, es decir el ambiente en el cual
se encontraban, es difícil determinar si realmente estos fragmentos corresponden a alguna bacteria o
simplemente a errores asociados a la técnica, razón por la cual estos fragmentos no fueron incluidos
en los siguientes análisis estadísticos. El mismo argumento es válido en el caso del TRF de largo 325
pb obtenido con la enzima MspI en la Tabla 9, el que corresponde también a alguna bacteria no
cultivable. En este caso, su correspondiente TRF con RsaI es de 127 pb, el que puede ser asociado al
de tamaño 126 pb. Ambos fragmentos son significativos en las mismas soluciones (en la muestra 3 y
la 4) por lo que no se podría descartar del todo su presencia.
Contraria a la anterior es la situación de los fragmentos de largo 267 pb con RsaI y 70 pb con
MspI. El primero, si bien puede ser relacionado con una bacteria no cultivable, en la digestión virtual
no hay más de una bacteria no cultivable asociada a dicho fragmento, por lo que no se confirma su
existencia, pudiendo ser resultado de un error de la técnica o debido a que no ha sido detectado por
otras investigaciones. El segundo, por otra parte, no corresponde a ninguna bacteria, cultivable o no,
según los resultados de la digestión virtual. Tomando en cuenta el error del método de ±2 pb, no
existían TRFs de tamaño 70 ±2 pb, por lo que probablemente éste correspondería a algún tipo de
error.
42
El análisis de cada situación estudiada debe hacerse de manera individual, comparando la Tabla 8
con la Tabla 9, y viendo en cada caso a qué bacteria correspondería cada TRF según la Tabla 22
(Anexo E). Para este análisis se descartaron los TRFs asociados a bacterias no cultivables y los TRF
que no pueden ser asociados a bacterias, como se menciona en el párrafo anterior.
Como ya se explicó, los fragmentos de 213 y 138 pb corresponden a α proteobacterias. Sin embargo
no se puede descartar la presencia específica de Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp., Acidocellas
spp. o Acidomonas methanolica en las muestras 2, 3, 6 y 9, debido a que son también α proteobacterias y a
que su TRF de 121 pb con RsaI estaba presente en dichas muestras, pese a no ser significativo según
los criterios utilizados. En las otras condiciones (muestras 4, 5, 7 y 8), el TRF de 121 pb tuvo una
abundancia relativa mayor al 1%, por lo que confirmaría la presencia de, al menos una de las
bacterias heterotróficas antes mencionadas, importantes por disminuir los niveles de los compuestos
orgánicos en solución producidos durante el metabolismo de los microorganismos.
El fragmento de 249 pb, obtenido a través de la digestión con RsaI, corresponde a A. ferrooxidans
y se encuentra de manera significativa a partir de la muestra 3. Como su TRF con MspI es de 163 pb
y se encuentra presente en todas las muestras, permitiría confirmar la presencia a partir de la muestra
3 de esta bacteria considerada como la más común en procesos de biolixiviación. Asimismo, la
presencia de actividad oxidativa del ión ferroso a ión férrico de manera importante a partir de la
muestra 3, concuerda plenamente con la aparición de A. ferrooxidans en las soluciones.
En el caso de A. thiooxidans su TRF de 309 con RsaI sólo es significativo en la muestra 4, pero
aparece con una abundancia relativa menor al 1% en las muestras 3, 5, 7 y 8. Al igual que en el caso
de A. ferrooxidans, su TRF es de 163 pb, por lo que sólo se podría asegurar la presencia de A.
thiooxidans en la muestra 4 y podría especularse que estuviera presente en baja concentración en las
otras muestras.
El TRF de 126 pb con RsaI corresponde a Arthrobacter spp., cuyo tamaño es de 143 pb con MspI.
Como ambos fragmentos se encuentran en el análisis en las muestras 2, 3, 4 y 8, se puede establecer
que el microorganismo se encontraba presente en dichas soluciones, lo que concuerda con el
resultado obtenido por Gabriela Morales (2006) que encontró esta bacteria asociada a procesos de
biolixiviación.
El fragmento de largo 141 pb con RsaI puede ser asociado a Sb.acidophilus o a
Sb.thermosulfidooxidans, de 143 y 115 pb con MspI respectivamente. Estos tres TRFs se encuentran
presentes en el análisis de la solución 4, único en el cual el TRF de 141 pb es significativo, por lo que
su presencia se vería confirmada sólo en ese caso. No obstante, el fragmento de 115 pb con MspI se
encuentra presente significativamente en las muestras 2, 3, 4, 5, 7 y 8 y el 141 pb de forma no
significativa en las 2, 3 y 5, por lo que se puede pensar en la presencia de Sb. thermosulfidooxidans en
estas soluciones pero que, debido a errores asociados a la técnica de TRFLP, no haya sido posible
detectarlos al digerir RsaI.
La presencia de algún Sufobacilli en la muestra 4 concuerda con Rawlings (2002), que postula que
el crecimiento de Acidimicrobium ferrooxidans ocurriría en asociación con estas bacterias. Del mismo
modo, Yahya y Johnson (2002) comentan que se encuentra una mayor actividad de estas bacterias al
crecer en mezcla con otros microorganismos acidófilos, lo que concuerda con los casos en estudio.
Por otro lado, el TRF de 94 pb con RsaI se asocia con Desulfosporosinus spp. (bacteria sulfato
reductora (Malki et al. 2006)) y con Enterobacter cloacae (heterotrófica neutrófila (Brandl 2001)), ambas
asociadas a ambientes de biolixiviación. El tamaño de su TRF al digerir con MspI sería de 164 y 163
43
pb respectivamente, los que se consideran iguales debido al error asociado a la electroforesis capilar.
Como ambos TRF obtenidos al digerir con distintas enzimas se encuentran presentes en la muestra
2, la única que presentó el TRF de 94 pb, las dos bacterias podrían ser asociadas al sistema en
estudio, pero debido a que el pH es ácido, se descarta la presencia de Enterobacter cloacae dado que su
desarrollo es poco probable.
El TRF de largo 238 pb con RsaI en las muestras 4, 5 y 7 correspondería, según la digestión
virtual, a Shewanella spp., bacteria que reduce el ión férrico (Küsel et al. 1999), o a Pseudoalteromonas spp.,
bacteria acuática. Como ambas bacterias serían asociadas a un TRF de 163 pb con MspI, el cual se
encontró presente en las mismas muestras, se considera que efectivamente Shewanella spp. estaría
presente en el estudio, descartando a las Pseudoalteromonas spp. por no pertenecer a un ambiente ácido.
Es importante notar el caso de los TRF de 103, 130 y 148 pb obtenidos en la digestión con MspI.
El primero es asociado a L. ferriphilium y cuyo TRF con RsaI correspondería a 146 pb. Al no
encontrarse el fragmento de 146 pb de manera significativa en alguna de las muestras, sólo estaría
presente en la muestra 4 con abundancia relativa menor al 1%, se supondría que no había L.
ferriphilium en la solución. Confirmando lo anterior, tampoco se encontraron presentes TRFs que
puedan ser asociados a la familia de las Nitrospira, a la que pertenecen los Lesptospirilli (Rawlings
2002). Además, se realizó una reacción de PCR con partidores específicos para L. ferrooxidans, con lo
que no se encontró presencia de esta bacteria, reafirmando la suposición anterior. Pese a esto, el
hecho de que se pudiese encontrar L ferriphilium en las muestras estudiadas concuerda con algunos
trabajos que afirman que en realidad es esta bacteria y no L.ferrooxidans la que comúnmente se
encuentra en los procesos de biolixiviación (Rawlings 2002).
El TRF de 130 pb obtenido con MspI podría corresponder a Chromobacterium violaceum,
Stenotrophomonas maltophila o Psycrobacter glanícola, según los resultados de la digestión virtual, y su
fragmento al digerir con RsaI sería de 146 pb, en los dos primeros casos, y de 551 pb. Todas estas
bacterias son asociadas a procesos de biolixiviación según Brandl (2001), sin embargo no
corresponden a las bacterias más comunes. Las tres bacterias son heterotróficas, y en el caso de
Chromobacterium violaceum el principal agente lixiviante correspondería a cianuro (Brandl 2001), por lo
cual no correspondería encontrarla en el ambiente estudiado. Asimismo, el TRF de 146 pb no fue
significativo en el estudio y el de 551 pb no puede ser detectado dado el rango del electroferograma,
así que no se podría asegurar la presencia de alguna de estas bacterias.
El TRF de 148 pb obtenido de la digestión con MspI podría ser asociado a Alicyclobacillus
disulfidooxidans, mientras que el de 164 pb correspondería a Alicyclobacillus spp. Ambas bacterias
tendrían asociado un TRF de 146 pb al digerir con RsaI, por lo que, al igual que en el caso anterior,
no se puede asegurar la presencia de estas bacterias en el estudio.
A lo largo del análisis se observa que las poblaciones bacterianas no se mantienen de una
condición a otra, en los casos en que las soluciones son prácticamente iguales (soluciones 2 y 3 con
cada enzima). Además, aparecen como significativas bacterias que no son encontradas
frecuentemente en los ambientes de biolixiviación (Desulfosporosinus spp. y Shewanella spp.). Asimismo,
al tomar en cuenta el análisis de los TRFs obtenidos con cada enzima en forma separada, no se
encuentra una clara tendencia en la inhibición de las bacterias entre las distintas soluciones. Esto
concuerda con el hecho de que las comunidades bacterianas estudiadas a escala de laboratorio
tienden a presentar las características de sistemas caóticos, atribuibles a predación, competencia por
los sustratos y nuevas presiones selectivas impuestas por los cambios de los parámetros
fisicoquímicos de los sistemas estudiados (Saikaly et al. 2005).
44
Luego de este razonamiento se puede observar cómo el análisis a partir de cada enzima en forma
independiente, puede inducir a suponer la presencia de una u otra bacteria, lo que podría no
corresponder con la realidad. Es por esta razón que se considera más válida la información otorgada
al comparar la presencia de los TRFs al digerir con cada enzima por separado (Tabla 10). Esta
restricción permitiría disminuir los efectos caóticos del análisis de las digestiones independientes,
pero a la vez se debe tener en cuenta que el sistema quedaría virtualmente subestimado.
Se debe considerar además que este análisis por comparación se encuentra sujeto a los errores
asociados a la técnica de T-RFLP, mencionados más adelante, los cuales influirían directamente en el
tamaño, la presencia de los TRFs y en su abundancia relativa.
La más alta velocidad de oxidación de ión ferroso que se observa en la muestra 4 (Tabla 7 y
Figura 5), se ajusta al hecho de que sea en esta condición en la que se encuentre una mayor
diversidad de microorganismos de manera significativa.
En todos los casos estudiados es aceptable encontrar organismos heterótrofos asociados a estos
ambientes, como Acidiphilum y Ferrimicrobium acidiphilium, además de los hierrooxidantes, sulfato
reductores o azufre oxidantes, debido a que se encargarían de eliminar los compuestos orgánicos que
podrían llegar a ser tóxicos para las otras bacterias (Brierley 2000).
La concentración de cobre sólo parece presentar valores inhibitorios en las muestras 1 y 2 para
algunos de los microorganismos encontrados, como Sb. thermosulfidooxidans y Acidiphilium angustum
(Tabla 1), ninguno de los cuales se encuentra en la muestra 2, si se trabaja con los TRFs encontrados
con ambas enzimas (Tabla 10).
En la muestra 7, la posible presencia de Acidocella spp. y Acidiphilum spp. se explicaría por la acción
estimuladora que podrían provocar en ellas ciertas concentraciones de aluminio agregadas en forma
de sulfato de aluminio (Wakao et al. 2002).
Por otro lado, no se observa la presencia de especies de Leptospirillum a pesar de que algunas
soluciones presentaron las condiciones óptimas para su crecimiento: aire y pH óptimo (entre 1.0 y
1.7). Esta situación podría deberse, en la muestra 2 y 3, al bajo Eh al cual fue recolectada la solución;
a que éstas se encontraran adheridas al mineral de la columna en mayor proporción que el resto de
los microorganismos (Ghauri et al. 2007) o a que precipitaran junto con el hidróxido férrico,
dependiente de los valores de pH en la solución, como sucedería con A.ferrooxidans.
En la muestra 9, la concentración de zinc es inhibitoria para Sb. thermosulfidooxidans y Acidiphiliun
angustum, según la Tabla 1, lo que se refleja en las bacterias encontradas en esta solución: sólo
A.ferrooxidans y alguna α proteobacteria. Como Acidiphilium cryptum y Acidocella aminolytica corresponden a
α proteobacterias y no serían inhibidas, como muestra la Tabla 1, probablemente podrían ser éstas las
que se encuentren en la solución.
Además, en Rawlings (2002) se comenta como las distintas Acidiphilium (bacterias heterótrofas)
crecen frecuentemente cercanas a A. ferrooxidans, lo que explicaría su posible presencia en las
muestras y en particular en la solución 9.
La constante generación de sulfato hace suponer la presencia de bacterias azufre oxidantes o la
oxidación química del azufre por medio de Fe+3. Las bacterias contribuirían a la generación de ácido
sulfúrico y la mantención de pH bajos. Esto se ajustaría a la aparición de A.thiooxidans, A.ferrooxidans
45
y Sb.thermosulfidooxidans o Sb. acidophilus en la muestra 4, la posible presencia de A.thiooxidans en las
muestras 3, 5, 7 y 8, la posible presencia de alguna de las Sulfobacillus en las muestras 2, 3 y 5 (con
abundancia relativa menor al 1%) y a la presencia de A.ferrooxidans en todas las muestras excepto la 2.
Los bajos niveles de A.thiooxidans y el hecho de no haber detectado otras bacterias azufre oxidantes
en solución, pudo deberse a que estas bacterias se encontrasen adheridas al mineral y su
concentración en solución no permitiera detectarlas.
La Figura 12 presenta la variación de la abundancia relativa de A.ferrooxidans entre las distintas
muestras. A partir de ella no es posible establecer una relación entre la concentración de sulfato en
solución y la aparición de esta bacteria en las muestras. Sin embargo, se destaca la disminución de su
abundancia relativa en las muestras 8 y 9, las que corresponden a la mayor concentración de sulfato y
a la presencia de iones de aluminio y zinc, que en conjunto pudieron haber afectado la cantidad de
bacterias presentes.
Al analizar la Tabla 10 se observa que los parámetros de la muestra 4 (pH, Eh, iones y aireación)
favorecen la diversidad bacteriana, al encontrarse mayor cantidad de bacterias distintas en solución.
4. 5. Análisis de la diversidad biológica en la mini-columna
4. 5. 1. Análisis de los índices diversidad de especies y de Shannon-Wiener
Al comparar los índices de diversidad de especies obtenidos (Tabla 11), se observa que en la
muestra 4, que parece ser una de las que favorece el crecimiento de microorganismos asociados a
estos ambientes ácidos, se presenta la mayor cantidad de TRFs únicos y asociados a alguna especie
bacteriana para ambas enzimas (7 para RsaI y 6 para MspI). No obstante, se debe destacar que en el
caso de la digestión con MspI, las muestras 2 y 8 tienen el mismo número de TRFs únicos que la
muestra 4, es decir la máxima cantidad.
Por otra parte, al hacer el mismo ejercicio con la muestra 9 en la que hay mayores niveles de
inhibición, en la digestión con RsaI se tiene la menor cantidad de TRFs únicos respecto a las otras
condiciones estudiadas (2 TRFs), no así en el caso de la MspI (5 TRFs), cuya mínima cantidad de
TRFs únicos se obtiene en la muestra 6 (3 TRFs). Pese a esto, no se logra observar en ninguno de los
casos una correspondencia entre el aumento de las condiciones inhibitorias y la disminución del
índice de diversidad de especies, es decir de los TRF únicos encontrados.
El índice de Shannon-Wiener (Tabla 12) muestra, al igual que el índice de diversidad de especies,
que la mayor diversidad, es decir el mayor valor del índice, se encuentra en la muestra 4 para la
digestión con cada enzima, asociado a las mejores condiciones de crecimiento.
En el caso de los resultados obtenidos por la digestión de los fragmentos amplificados del rDNA
16S con RsaI y con MspI, entre las muestras 4 y 5 y 7, 8 y 9 el índice de Shannon-Wiener disminuye
su valor al igual que aumentan las condiciones no favorables, solución 5 sin aireación, o inhibitorias
en la solución.
Al analizar los índices de Shannon-Wiener de las muestras 6 y 9 se observa que su valor es
prácticamente igual con ambas enzimas, pero esto no es concluyente debido a que la muestra 9 es
aquella que presenta niveles de zinc inhibitorios y la muestra 6 teóricamente no debiera presentar
inhibiciones determinantes.
46
Las diferencias arrojadas por los índices de diversidad de especies y de Shannon-Wiener en el
análisis provienen directamente de la manera en que se calculan. El primero es un reflejo directo del
número de TRFs diferentes asociables a alguna bacteria, mientras que el índice de Shannon-Wiener
utiliza el valor de la abundancia relativa para su cálculo. Como la cantidad de TRFs y la abundancia
relativa están sujetas a etapas anteriores para su determinación, tendrán asociados los errores de
arrastre que se puedan haber generado durante el T-RFLP y el tratamiento de los datos obtenidos del
electroferograma.
4. 5. 2. Comparación entre las distintas muestras obtenidas de la mini-columna
4. 5. 2. 1. Comparación entre las bacterias encontradas en solución
Los dendrogramas de la Figura 13 y la Figura 14 presentan básicamente cómo se agrupan las
bacterias asociadas a cada TRF basados en su presencia en las muestras analizadas.
El dendrograma asociado a los TRFs encontrados al hacer la digestión con RsaI (Figura 13 (a)),
muestra como los TRFs de 309 y 141 pb, correspondientes a A.thiooxidans o A.albertensis y a
Sb.acidophilus o Sb.thermosulfidooxidans respectivamente, se encuentran presentes en las mismas
muestras (muestra 4), dada la forma en que fueron obtenidos los dendrogramas.
En el caso del dendrograma elaborado a partir de la digestión con MspI (Figura 13 (b)), los
fragmentos que presentan mayor cercanía y que se encuentran presentes en iguales condiciones,
tienen un tamaño de 138, 143 y 163 pb, y estarían relacionados con los otros fragmentos. Esto
concuerda con lo mostrado en el dendrograma a partir de RsaI (Figura 13 (a)), en donde los TRF de
249 y 213 pb, si bien corresponden al segundo par de fragmentos más cercanos en cuanto a su
aparición en el análisis de las soluciones, también estarían relacionados con todos los otros
fragmentos. Este fenómeno proviene del hecho que las bacterias asociadas a estos TRFs, A.
ferrooxidans en el caso del TRF de 249 pb, algún Acidithiobacillus para el de 163 pb, y α proteobacterias en
el caso de los fragmentos de 213 y 138 pb, se encuentran presentes en todas o casi todas las muestras
estudiadas, por lo que se deben estar relacionados con los microorganismos que van apareciendo en
las otras situaciones estudiadas.
El TRF de 126 pb para RsaI sería el siguiente en cercanía a los TRF de 249 y 213 pb,
coincidiendo con la cercanía del fragmento de 143 pb mostrado en el dendrograma elaborado a partir
de los resultados obtenidos con la enzima MspI, dado que ambos representan al Arthrobacter spp.. Sin
embargo, esta situación se contradice con el haber encontrado el fragmento de 141 pb alejado del
primer grupo (249 y 213 pb), ya que el TRF de 143 también podría corresponder a Sb.acidophilus.
Se destaca también el hecho de que el TRF de 121 pb para el análisis con RsaI se encuentre
alejado del fragmento de 213 pb (Figura 13 (a)), los que podrían estar relacionados por pertenecer
ambos a α proteobacterias.
En ambas figuras se muestra como los fragmentos de 94 pb obtenido al digerir con RsaI y de 203
pb al digerir con MspI, se encuentran en la rama más alejada de los microorganismos comúnmente
encontrados en biolixiviación, correspondientes a Desulfosporosinus spp. y Thermotrix thiopara
respectivamente.
En la Figura 14 se presenta el dendrograma resultante del análisis de las digestiones
independientes con cada enzima de restricción, el cual es similar al obtenido de la digestión con RsaI.
En ella se observa que las bacterias Sulfobacillus y A.thiooxidans se encontrarían estrechamente
47
relacionadas, como ya se ha comentado, debido a que ambas se encuentran presentes sólo en la
muestra 4. Esto se reafirma al notar que ambas corresponden a bacterias azufre oxidantes, lo que
daría cuenta de la mayor cantidad de sulfato generado.
En el caso de A.ferrooxidans y α proteobacterias, la gran relación existente entre ellas (Figura 14), se
explica debido a que sus respectivos fragmentos se encuentran presentes en la mayor parte de las
muestras analizadas. Estas bacterias también se encontrarían más relacionadas que las otras a
Arthrobacter spp. Estos hechos coinciden una vez más con la necesidad de tener bacterias heterótrofas
en solución acompañando a alguna bacteria quimiolitótrofa, con el fin de eliminar los compuestos
orgánicos presentes en solución.
La explicación anterior también se ajusta a la relación entre la aparición de Shewanella spp. y la
presencia de Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp.; Acidocella spp., Acidomonas methanolica o
Ferrimicrobium acidiphilium. Esto se debe a que todas serían heterótrofas y algunas de ellas son capaces
de reducir Fe+3, por lo que podrían crecer acompañando a las A.ferrooxidans.
La bacteria Desulfosporosinus spp. sería aquella menos relacionada al resto de las bacterias
encontradas en solución. Lo anterior podría deberse a que es la única bacteria anaeróbica estricta
sulfato reductora encontrada en el análisis, detectada en la muestra 2, en la que no hubo aireación y el
potencial redox indicaría que los niveles de Fe+3 en solución no llegarían a ser tóxicos.
En el análisis de componentes principales se observa que en el caso de la digestión con RsaI,
Figura 17, al igual que en el dendrograma, los fragmentos de 141 y 309 pb se encuentran juntos,
debido a su presencia sólo en la muestra 4 y que sus abundancias relativas son similares, 1,67% y
1,33% respectivamente. Además el fragmento de 94 pb, que se encuentra cercano a los antes
mencionados, podría ser asociado al mismo grupo, lo que no concuerda con los parámetros de las
soluciones en que cada uno fue encontrado ni con el resultado del dendrograma.
Contraria a esta situación es la de los TRF de 213 y 121 pb, los que se encuentran
comparativamente alejados del resto de los puntos observados, por lo que no podrían ser agrupados
con ninguno de ellos. Al igual que lo ocurrido en el dendrograma correspondiente, se podría haber
esperado que estos dos TRFs se hubiesen encontrado relacionados, ya que ambos son asociados
filogenéticamente a α proteobacterias, uno de forma específica (213 pb) y el otro a bacterias de la misma
familia (121 pb).
En la Figura 18, correspondiente al análisis de componentes principales de los TRF obtenidos de
la digestión con MspI, se observa, de manera similar a la de la Figura 17, que dos de los fragmentos
se encuentran relativamente alejados del resto, los TRFs de 138 y 163 pb. En particular, no se
hubiese esperado que el fragmento de 138 pb no formara un grupo unido al TRF de 143 pb, debido
a que se encontraron presentes bajo las mismas condiciones.
Como la abundancia relativa de los fragmentos de 213 pb con RsaI y 138 de la digestión con
MspI fue siempre mayor al 40%, mientras que la de los otros fue menor que 15% en la mayoría de
los casos, se entiende que en el análisis de componentes principales éstos TRFs no se encuentren
agrupados a los otros fragmentos.
Por otra parte, en la Figura 18 se observa que los puntos no formarían algún grupo definido en
comparación con la figura obtenida en el caso de la digestión con RsaI.
48
En ambos análisis de componentes principales, la primera componente principal,
correspondiente al eje de las absisas, explica casi por completo la variabilidad del sistema en estudio
(sobre un 98%). Según este análisis, en ambos casos todos los TRFs, exceptuando el de 138 y 213 pb
cuando corresponda, podrían ser asociados a un mismo grupo, pero esto no permitiría observar
cómo las variaciones de las condiciones en la columna afectan en las poblaciones encontradas en
solución.
Así, se puede establecer que no se observa una relación entre la agrupación efectuada a través de
los dendrogramas y del análisis de componentes principales, debido principalmente a que los
dendrogramas toman en cuenta la aparición de los microorganismos en cada solución, mientras que
el análisis de componentes principales toma en cuenta relaciones a partir de la abundancia relativa de
los TRF en cada solución. Es por esta razón que los dendrogramas pueden ser considerados como
más representativos en el estudio de la variación de las poblaciones bacterianas.
4. 5. 2. 2. Comparación entre las soluciones según las bacterias encontradas
La Figura 15, muestra el resultado del análisis de cluster al observar la presencia de cada TRF en
las soluciones estudiadas.
En la Figura 15 (a) se observa que las soluciones 5 y 7, y las 3 y 6, presentan las mismas bacterias
en solución al hacer la digestión con RsaI. En el caso del pH ningún par de soluciones tiene igual pH
final, por lo que se podría pensar que esto no provoca grandes cambios en las poblaciones presentes.
Por otra parte, el Eh final en las muestras 5 y 7 fue similar (592 y 583 mV respectivamente), lo
que no se cumple en las muestras 3 y 6, por lo que no se puede llegar a alguna relación.
Al analizar la Figura 15 (b) se tiene una estrecha relación entre las muestras 3, 5 y 7, que, como se
explicó anteriormente, no permiten llegar a alguna relación concluyente. En esta figura y en la Figura
15 (a), se observa que las soluciones 8 y 9 se encontrarían relacionadas, lo que podría explicarse dado
que ambas corresponden a las soluciones con mayores concentraciones de iones metálicos que
pudieron haber afectado el desarrollo bacteriano.
Al comparar ambos dendrogramas en forma general, se observa que no se mantienen las
relaciones entre las distintas soluciones al analizar los resultados obtenidos de las distintas digestiones
enzimáticas.
Al analizar el dendrograma de la Figura 16, obtenido del análisis de las bacterias presentes en
cada digestión, se obtiene prácticamente el dendrograma resultante de la digestión con la enzima
RsaI. De esta manera no se puede establecer una relación específica entre las soluciones estudiadas, y
se podría pensar que los distintos parámetros no influirían en la obtención de las mismas poblaciones
bacterianas en una solución, lo que concuerda con la posibilidad de encontrar comportamientos
caóticos en los sistemas de laboratorio. (Saikaly et al. 2005)
49
4. 6. Efectos de los errores asociados a la metodología de T-RFLP
4. 6. 1. Asociados a la extracción de DNA
En primer lugar, la extracción del DNA depende de la habilidad del experimentador, y es
inevitable que en el transcurso de ésta no se pierda DNA. Por esto, si bien no se puede asegurar que
el DNA obtenido corresponda al de todos los microorganismos presentes en la solución, éste debería
pertenecer al de las bacterias más representativas del ambiente estudiado.
4. 6. 2. Asociados a la reacción de PCR
Por otra parte, Egert y Friedrich (2003) postulan que durante la reacción de PCR se podrían
producir pseudo-TRF, en muestras de cultivos puros y de muestras extraídas directamente del
ambiente, debido a la posibilidad de que en algunos fragmentos amplificados el sitio de restricción
deseado se encuentre localizado en un sector que se encuentre como hebra simple. Como las
enzimas de restricción, al ser endonucleasas, no cortan hebras simples, éstas reconocerían el siguiente
sitio de restricción de doble hebra en la secuencia, el cual podría haberse formado si la hebra se
pliega sobre si misma en alguna sección, como se muestra en la Figura 19. Este hecho podría
incrementar virtualmente la abundancia relativa de algún fragmento que no se relaciona a alguna
bacteria, según los datos obtenidos “in sílico”. Además, el reconocimiento de estos pseudo-TRF
dependerá de la enzima de restricción utilizada, ya que se encuentra influido directamente por la
posición en la cual se encuentra el sitio de restricción.
4. 6. 3. Asociados a la digestión enzimática
En la etapa de digestión podría ocurrir que no hubiera digestión completa, independientemente
de la formación de pseudo-TRFs (Egert y Friedrich 2003; Li et al. 2007). La electroforesis de agarosa
al 1,4% realizada, en la cual se observó que los fragmentos digeridos fueron menores al tamaño del
fragmento amplificado, no permite descartar este hecho. Cabe la posibilidad de que aún hubiese
habido digestión parcial del amplificado, es decir que el DNA no hubiera sido cortado en todos los
sitios posibles para dar origen a los TRFs más pequeños y esperados teóricamente en el análisis
obtenido de la digestión virtual, de hasta 300 pb aproximadamente.
50
(a)
(b)
Figura 19. (a) Modelo esquemático de la formación de pseudo-TRF, plegamiento parcial de la hebra
simple podría o no formar pseudo-TRF. (b) Ejemplo de las estructuras secundarias formadas. (Egert y
Friedrich 2003)
Por último, en la etapa de electroforesis capilar, el equipo tiene asociado un error, derivado de los
posibles ruidos en el momento de la lectura, y ésta además puede depender de los compuestos
presentes en la muestra, derivados de la purificación y la digestión del DNA y que podrían
eventualmente influir en los resultados del análisis.
51
Capítulo 5. Conclusiones
En el trabajo presentado, se utilizó la técnica de T-RFLP para identificar las poblaciones
bacterianas presentes en soluciones de biolixiviación y observar si los cambios de los parámetros
fisicoquímicos de las soluciones influyen la diversidad bacteriana.
A partir del análisis de las tablas de enzimas de restricción y los sitios de corte para cinco de los
microorganismos característicos en procesos de biolixiviación, fue posible determinar que, aparte de
RsaI, no hay otra enzima de restricción que logre distinguir entre A. ferrooxidans y A. thiooxidans. De
esta manera se seleccionó como segunda enzima de restricción a utilizar la enzima MspI, la cual
permitiría distinguir entre L. ferrooxidans y Sb. thermosulfidooxidans.
En forma paralela, se logró obtener poblaciones microbianas creciendo en una mini-columna de
biolixiviación, la cual fue montada en el Laboratorio de Biohidrometalurgia de la Universidad de
Chile, con lo que se aseguró la obtención de muestras íntegras de DNA y poder variar las
condiciones de crecimiento.
En el análisis de los TRFs resultantes de la digestión enzimática con RsaI y MspI en forma
separada, se encontraron algunas diferencias a la hora de definir las bacterias presentes en forma
significativa, es decir con una abundancia relativa mayor o igual al 1%. Esto pudo deberse a
comportamientos caóticos del sistema o a errores en el método de T-RFLP.
A partir de lo anterior, se concluyó que es válido considerar como bacterias presentes en la
solución, aquellas cuyos TRFs se encuentren presentes en la muestra analizada al digerir con ambas
enzimas por separado. Sin embargo, no se puede descartar completamente la presencia de las
bacterias cuyo TRF no se encuentre al digerir con una de las enzimas o que tengan una abundancia
relativa menor que el 1%, debido a que los errores asociados al método de T-RFLP pueden derivar
en una sub o sobreestimación de la cantidad, de la presencia o de la abundancia relativa de cada TRF.
La cantidad de ión férrico y de sulfato generado presente en la solución mostró ser creciente en el
tiempo, lo que concuerda con la presencia de bacterias hierrooxidantes, como A.ferrooxidans, y con la
posibilidad de oxidación química del azufre o de la presencia de bacterias azufre oxidantes, como
A.thiooxidans y Sb.thermosulfidooxidans.
Al aumentar la concentración de Al(III) y Zn(II) en solución, se observó la disminución de la
abundancia relativa de A.ferrooxidans y una disminución de la diversidad bacteriana.
En la muestra 8, donde se agregó Al2(SO4)3, se encontraron los TRFs de bacterias que verían
estimulado su crecimiento en presencia de Al(III), como Acidocella spp. y Acidiphilum spp.
Las variaciones de pH no mostraron ser determinantes en la cantidad de células generadas en
solución. Asimismo, el aumento de la concentración de sulfato en las muestras 6 y 7, no muestra una
tendencia particular al analizar la abundancia relativa de A.ferrooxidans. Por otro lado, el aire añadido
al sistema favoreció la cantidad de microorganismos generados.
Los parámetros fisicoquímicos de la muestra 4 mostraron ser los más favorables para la
diversidad bacteriana: Eh de 597 mV, pH inicial de 1,6, pH final de 1,4, concentración inicial de
FeSO4 de 6 g/l y aire.
52
Se destaca el hecho de que no se detectara ninguna especie de Leptospirillum, bacteria
frecuentemente encontrada asociada a procesos de biolixiviación, al digerir con la enzima RsaI, por
lo que se supone que no estaría presente en las muestras estudiadas. Esto podría deberse a que estas
bacterias se encontrasen adheridas al mineral o a que hubiesen precipitado junto con los hidróxidos
de hierro, por lo tanto su presencia en solución no sería detectable.
Mediante el análisis del índice de diversidad de especies no se logra observar, en ninguno de los
casos, una correspondencia entre el aumento de las condiciones inhibitorias y la disminución del
índice, es decir de los TRFs únicos encontrados. En el caso del índice de Shannon-Wiener, se
observa una cierta tendencia a disminuir en ciertas soluciones a medida que aumenta la cantidad de
iones en solución. Sin embargo, como estos índices dependen de la presencia y la abundancia relativa
de los TRFs, se verán afectados por los errores asociados al T-RFLP.
A partir de los TRFs con presencia significativa en las muestras, se elaboraron dendrogramas
para cada enzima de restricción utilizada. Se pudo observar cierta concordancia entre los dos
dendrogramas. Los TRFs asociados a A. ferrooxidans y a α proteobacterias fueron agrupados juntos, y
luego estaría asociado a éstos el TRF correspondiente a Arthrobacter spp. para ambos casos. Las dos
últimas corresponderían a las bacterias heterótrofas que eliminarían los compuestos orgánicos
producidos por otros microorganismos.
Por otro lado, A.thiooxidans y las Sb.thermosulfidooxidans y Sb.acidophillus fueron agrupadas juntas,
correspondiendo a bacterias azufre oxidantes presentes sólo en la muestra 4.
La agrupación de Shewanella spp. y de Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp., Acidocella spp.,
Acidomonas methanolica o Ferrimicrobium acidiphilium, se debería a que todas son heterótrofas y algunas
de ellas son capaces de reducir Fe+3, por lo que podrían crecer acompañando a las A.ferrooxidans.
Las agrupaciones resultantes al analizar las bacterias presentes en cada solución, no permiten ser
concluyentes a la hora de establecer una relación entre los parámetros fisicoquímicos estudiados, lo
que concuerda con la posibilidad de encontrar comportamientos caóticos en los sistemas de
laboratorio.
Finalmente, el análisis de componentes principales mostró no ser concluyente
agrupar los TRFs asociados a bacterias biolixiviantes según su presencia frente a
parámetros fisicoquímicos. Esto se debe principalmente a que su elaboración toma
abundancias relativas de los fragmentos considerados, los cuales presentan valores
sobre el 40% y el resto menor al 13% en todos los casos.
53
a la hora de
determinados
en cuenta las
dispares, uno
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56
Anexos
Anexo A. Partidores utilizados
Los partidores universales utilizados fueron tomados de Morales G. (2006), los cuales
corresponden a:
•
Partidor forward marcado con el fluorósforo FAM:
341f
•
5’- CCTACGGGAGGCAGCAG -3’
Partidor reverse:
1100r 5’- GGGTTGCGCTCGTTG -3’
Anexo B. Soluciones utilizadas
A continuación se presenta la composición de las soluciones utilizadas en los métodos
mencionados. Todas ellas fueron preparadas en agua destilada, excepto el buffer TAE y la solución
para la RNasa, preparado en agua desionizada.
Tabla 13. Composición de medio MC.
Reactivo
(NH4)2SO4
MgSO4 * 7H2O
K2HPO4 * 3H2O
Concentración [g/l]
0,4
0,4
0,056
Tabla 14. Composición del Buffer A2X.
Reactivo
Tris HCl pH 8,0
EDTA
NaCl
Citrato de Na
CaCl2
Concentración [mM]
200
50
200
2
10
Tabla 15. Composición del Buffer de lavado.
Reactivo
Buffer A2X
Glicerol
Agua Destilada
Concentración (v/v)
50%
25%
25%
57
Tabla 16. Composición del Buffer TE.
Reactivo
Tris HCl pH 8,0
EDTA
Concentración [mM]
10
1
Tabla 17.Composición del Buffer de carga 6X.
Reactivo
Glicerol
Azul de bromofenol
Agua destilada
Concentración
30% v/v
0,25% p/v
-
Tabla 18. Composición del Buffer TAE 50X.
Reactivo
Tris HCl pH 8,0
Ácido acético glacial
EDTA 0,5 M
Agua desionizada
Concentración
24,2% p/v
5,71% v/v
10% v/v
-
Tabla 19. Composición del Buffer de almacenamiento.
Reactivo
Tris HCl pH 7,5
NaCl
Concentración [mM]
100
200
Tabla 20. Composición del estándar de peso molecular, 1 Kb.
Reactivo
Buffer de almacenamiento
Estándar de peso molecular 1 Kb
Buffer de carga
Agua destilada
Concentración (v/v)
10%
10%
16,5%
-
Tabla 21. Composición de la solución de la RNasa.
Reactivo
Tris HCl (pH 7,5)
NaCl
Agua desionizada estéril
58
Concentración (mM)
10
15
-
Anexo C. Protocolos
(a) Protocolo de electroforesis en gel de agarosa al X%.
•
Pesar X gramos de agarosa, dado el porcentaje de agarosa que se desee en el gel. Disolver en 100
ml de Buffer TAE 1X, en horno microondas por aproximadamente 1 minuto, agitando cada 20
segundos hasta disolver completamente.
•
Una vez tibia la mezcla, adicionar 10 µl de bromuro de etidio.
•
Colocar la(s) peineta(s) en la cámara de electroforesis, y luego agregar la cantidad de agarosa
necesaria para la formación de los pocillos.
•
Cuando la agarosa haya gelificado, retirar la(s) peineta(s) y cubrir con Buffer TAE 1X.
•
Cargar la(s) muestra(s) en el gel. Para cargar, mezclar 5µl de una muestra de DNA + 3µl de Buffer
de carga 6X, y el volumen total colocarlo en uno de los pocillos formados por la peineta.
•
Cargar 5 µl de estándar de peso molecular.
•
Correr el gel por 40 minutos a 100 Volts (Programa 8).
•
Retirar el gel de la cámara y colocar en el transiluminador UV para visualizar la migración de las
bandas.
(b) Protocolo de determinación de Fe+2 y fierro total.
Determinación de ferroso en precencia de férrico:
•
•
•
•
•
Tomar 0,1 ml de muestra diluída hasta una concentración de 100 ppm de ferroso,
Agregar 1 ml de solución NaF 0,5 M y agitar;
Agregar 0,4 ml de solución de fenantrolina y agitar;
Agregar 1 ml de agua destilada y agitar;
Leer absorbancia a 510 nm contra blanco.
Determinación de fierro total:
•
•
•
•
•
Tomar 0,1 ml de muestra diluída hasta una concentración de 100 ppm de ferroso,
Agregar 0,1 ml de solución de hidroxilamina y agitar;
Agregar 0,4 ml de solución de fenantrolina y agitar;
Agregar 1,9 ml de agua destilada y agitar;
Leer absorbancia a 510 nm contra blanco.
59
Anexo D. Tablas de las enzimas de restricción, su sitio de restricción y el largo de los
fragmentos que se forman
(a) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Acidithiobacillus caldus. (776 pb)
Enzyme
name
AatI
AccB1I
AccII
AccIII
AciI
Recognition
sequence
agg/cct
g/gyrcc
Cg/cg
t/ccgga
ccgc
No.
cuts
1
2
6
1
12
AclWI
AcsI
AcyI
AfaI
AflIII
AluI
AlwI
AlwNI
Ama87I
AocI
ApaI
ApoI
Asp700I
AspLEI
AspS9I
AsuI
AvaI
BamHI
BanI
BanII
BbeI
BbiII
BbvI
BcgI
BcnI
BcoI
BglII
BmyI
BpmI
BsaBI
BsaHI
BsaJI
BsaOI
BsaWI
ggatc
r/aatty
Gr/cgyc
Gt/ac
a/crygt
Ag/ct
ggatc
cagnnn/ctg
c/ycgrg
Cc/tnagg
gggcc/c
r/aatty
gaann/nnttc
gcg/c
g/gncc
g/gncc
c/ycgrg
g/gatcc
g/gyrcc
grgcy/c
ggcgc/c
Gr/cgyc
gcagc
cgannnnnntgc
Cc/sgg
c/ycgrg
a/gatct
gdgch/c
ctggag
gatnn/nnatc
Gr/cgyc
c/cnngg
cgry/cg
w/ccggw
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
1
4
2
2
1
1
2
2
1
1
2
1
1
1
1
3
2
1
1
6
1
1
Positions
of sites
77
496 683
62 187 239 423 527 631
659
63 119 188 248 296 351 394 542
559 594 602 762
122
22 334
497
551
654
521 730
122
712
272
501
591
22 334
77
239 423 499 770
401 587
401 587
272
118
496 683
279 591
500
497
15 716
726
273
272
364
279 591 688
316 373
533
497
185 271 283 455 542 644
556
659
60
Enzyme
name
Bsc4I
Bse118I
Bse1I
Bse21I
Bse8I
BseAI
BseDI
BseNI
Bsh1236I
Bsh1285I
Bsh1365I
BshNI
BsiEI
BsiI
BsiMI
BsiSI
BsiYI
BslI
BsmFI
BsoBI
BsoFI
Bsp120I
Bsp1286I
Bsp13I
Bsp143I
Bsp143II
BspEI
BspLU11I
BsrBRI
BsrDI
BsrFI
BsrI
BsrSI
BssAI
BssSI
Bst2UI
Bst71I
BstDEI
BstDSI
BstEII
BstF5I
BstH2I
BstI
BstMCI
BstNI
Recognition
sequence
ccnnnn/nnngg
r/ccggy
actgg
Cc/tnagg
gatnn/nnatc
t/ccgga
c/cnngg
actgg
Cg/cg
cgry/cg
gatnn/nnatc
g/gyrcc
cgry/cg
ctcgtg
t/ccgga
c/cgg
ccnnnnn/nngg
ccnnnnn/nngg
gggac
c/ycgrg
Gc/ngc
g/ggccc
gdgch/c
t/ccgga
/gatc
rgcgc/y
t/ccgga
a/catgt
gatnn/nnatc
gcaatg
r/ccggy
actgg
actgg
r/ccggy
ctcgtg
Cc/wgg
gcagc
c/tnag
c/crygg
g/gtnacc
ggatg
rgcgc/y
g/gatcc
cgry/cg
Cc/wgg
No.
cuts
4
1
4
1
1
1
6
4
6
1
1
2
1
1
1
3
4
4
2
1
3
1
3
1
2
1
1
1
1
2
1
4
4
1
1
6
2
2
1
1
2
1
1
1
6
Positions
of sites
6 100 288 644
162
227 314 383 489
501
533
659
185 271 283 455 542 644
227 314 383 489
62 187 239 423 527 631
556
533
496 683
556
736
659
163 273 660
7 101 289 645
7 101 289 645
109 760
272
12 60 713
587
279 591 688
659
118 364
500
659
654
533
36 59
162
227 314 383 489
227 314 383 489
162
736
284 340 399 457 543 645
15 716
501 509
185
393
70 492
500
118
556
284 340 399 457 543 645
61
Enzyme
name
BstOI
BstPI
BstSFI
BstUI
BstX2I
BstYI
Bsu36I
BsuRI
Cac8I
CfoI
Cfr10I
Cfr13I
Cfr42I
Cfr9I
Csp6I
CviJI
CvnI
DdeI
DpnI
DpnII
DraII
DsaI
Eco147I
Eco24I
Eco64I
Eco81I
Eco88I
Eco91I
EcoNI
EcoO109I
EcoO65I
EcoRI
EcoRII
EheI
FauI
FokI
FriOI
Fsp4HI
GsuI
HaeII
HaeIII
HapII
HgaI
HhaI
Hin1I
Recognition
sequence
Cc/wgg
g/gtnacc
c/tryag
cg/cg
r/gatcy
r/gatcy
cc/tnagg
gg/cc
gcn/ngc
gcg/c
r/ccggy
g/gncc
ccgc/gg
c/ccggg
g/tac
rg/cy
cc/tnagg
c/tnag
ga/tc
/gatc
rg/gnccy
c/crygg
agg/cct
grgcy/c
g/gyrcc
cc/tnagg
c/ycgrg
g/gtnacc
cctnn/nnnagg
rg/gnccy
g/gtnacc
g/aattc
/ccwgg
ggc/gcc
cccgc
ggatg
grgcy/c
gc/ngc
ctggag
rgcgc/y
gg/cc
c/cgg
gacgc
gcg/c
gr/cgyc
No.
cuts
6
1
1
6
2
2
1
3
3
4
1
2
1
1
1
10
1
2
2
2
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
6
1
3
2
2
3
2
1
3
3
1
4
1
Positions
of sites
284 340 399 457 543 645
393
668
62 187 239 423 527 631
118 364
118 364
501
77 402 589
179 206 591
239 423 499 770
162
401 587
188
272
550
77 166 277 306 402 521 589 649 720 730
501
501 509
120 366
118 364
587
185
77
279 591
496 683
501
272
393
5
587
393
334
282 338 397 455 541 643
498
542 594 762
70 492
279 591
12 60 713
316 373
500
77 402 589
163 273 660
416
239 423 499 770
497
62
Enzyme
name
Hin6I
HinP1I
HinfI
HpaII
HphI
Hsp92I
Hsp92II
HspAI
ItaI
KasI
Kpn2I
KspI
Kzo9I
MaeII
MaeIII
MamI
MboI
MboII
MflI
MnlI
MroI
MseI
Msp17I
MspA1I
MspI
MspR9I
MvaI
MvnI
MwoI
NarI
NciI
NdeII
NlaIII
NlaIV
NspBII
NspI
PalI
Pme55I
PspAI
PspALI
PspEI
PspN4I
PspOMI
PstI
RsaI
Recognition
sequence
g/cgc
g/cgc
g/antc
c/cgg
ggtga
gr/cgyc
catg/
g/cgc
gc/ngc
g/gcgcc
t/ccgga
ccgc/gg
/gatc
a/cgt
/gtnac
gatnn/nnatc
/gatc
gaaga
r/gatcy
cctc
t/ccgga
t/taa
gr/cgyc
cmg/ckg
c/cgg
cc/ngg
cc/wgg
cg/cg
gcnnnnn/nngc
gg/cgcc
cc/sgg
/gatc
catg/
ggn/ncc
cmg/ckg
rcatg/y
gg/cc
agg/cct
c/ccggg
ccc/ggg
g/gtnacc
ggn/ncc
g/ggccc
ctgca/g
gt/ac
No.
cuts
4
4
1
3
3
1
3
4
3
1
1
1
2
2
2
1
2
3
2
4
1
4
1
1
3
7
6
6
5
1
1
2
3
5
1
2
3
1
1
1
1
5
1
1
1
Positions
of sites
237 421 497 768
237 421 497 768
696
163 273 660
331 354 399
497
611 658 719
237 421 497 768
12 60 713
496
659
188
118 364
142 255
251 393
533
118 364
74 158 637
118 364
11 201 327 374
659
211 564 616 752
497
187
163 273 660
273 284 340 399 457 543 645
284 340 399 457 543 645
62 187 239 423 527 631
37 234 435 505 767
497
273
118 364
611 658 719
120 498 588 664 685
187
611 658
77 402 589
77
272
274
393
120 498 588 664 685
587
672
551
63
Enzyme
name
SacII
Sau3AI
Sau96I
ScrFI
SduI
SfaNI
SfcI
Sfr303I
SmaI
Sse9I
SseBI
SstII
StuI
TaqI
TfiI
ThaI
Tru1I
Tru9I
Tsp45I
Tsp509I
TspEI
TspRI
TthHB8I
XhoII
XmaI
XmnI
Recognition
sequence
ccgc/gg
/gatc
g/gncc
cc/ngg
gdgch/c
gcatc
c/tryag
ccgc/gg
ccc/ggg
/aatt
agg/cct
ccgc/gg
agg/cct
t/cga
g/awtc
cg/cg
t/taa
t/taa
/gtsac
/aatt
/aatt
cagtg
t/cga
r/gatcy
c/ccggg
gaann/nnttc
No.
cuts
1
2
2
7
3
1
1
1
1
5
1
1
1
1
1
6
4
4
1
5
5
2
1
2
1
1
Positions
of sites
188
118 364
401 587
273 284 340 399 457 543 645
279 591 688
627
668
188
274
22 218 334 577 617
77
188
77
621
696
62 187 239 423 527 631
211 564 616 752
211 564 616 752
393
22 218 334 577 617
22 218 334 577 617
19 384
621
118 364
272
77
64
(b) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Acidithiobacillus ferooxidans. (776 pb)
Enzyme
name
AatI
AccB1I
AccII
AccIII
AciI
Recognition
sequence
agg/cct
g/gyrcc
cg/cg
t/ccgga
ccgc
No.
cuts
1
1
4
1
12
AcsI
AfaI
AflIII
AgeI
AluI
Alw21I
AlwNI
Ama87I
ApaI
ApoI
Asp700I
AspHI
AspLEI
AspS9I
AsuI
AvaI
BanI
BanII
Bbv12I
BbvI
BcgI
BcnI
BcoI
BfaI
BglII
BlpI
BmyI
BpmI
Bpu1102I
BsaJI
BsaOI
BsaWI
Bsc4I
Bse118I
Bse1I
BseAI
r/aatty
gt/ac
a/crygt
a/ccggt
ag/ct
gwgcw/c
cagnnn/ctg
c/ycgrg
gggcc/c
r/aatty
gaann/nnttc
gwgcw/c
gcg/c
g/gncc
g/gncc
c/ycgrg
g/gyrcc
grgcy/c
gwgcw/c
gcagc
cgannnnnntgc
cc/sgg
c/ycgrg
c/tag
a/gatct
gc/tnagc
gdgch/c
ctggag
gc/tnagc
c/cnngg
cgry/cg
w/ccggw
ccnnnn/nnngg
r/ccggy
actgg
t/ccgga
3
4
1
1
2
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
2
1
3
1
1
1
3
1
1
3
1
1
6
1
2
3
2
1
1
Positions
of sites
77
494
62 187 525 631
660
63 188 248 296 351 394 540 557
593 601 682 762
22 334 664
249 309 505 549
655
302
519 730
421
712
272
589
22 334 664
77
421
770
585
585
272
494
279 589
421
15 185 716
726
273
272
311 484 499
364
415
279 421 589
373
415
185 271 283 453 540 639
554
302 660
6 288 644
162 302
227
660
65
Enzyme
name
BseDI
BseNI
Bsh1236I
Bsh1285I
BshNI
BsiEI
BsiHKAI
BsiI
BsiMI
BsiSI
BsiYI
BslI
BsmFI
BsoBI
BsoFI
Bsp120I
Bsp1286I
Bsp13I
Bsp143I
Bsp1720I
BspEI
BspLU11I
BspMI
BsrDI
BsrFI
BsrI
BsrSI
BssAI
BssSI
Bst2UI
Bst71I
BstDEI
BstDSI
BstF5I
BstMCI
BstNI
BstOI
BstSFI
BstUI
BstX2I
BstYI
BstZI
BsuRI
Cac8I
CelII
Recognition
sequence
c/cnngg
actgg
cg/cg
cgry/cg
g/gyrcc
cgry/cg
gwgcw/c
ctcgtg
t/ccgga
c/cgg
ccnnnnn/nngg
ccnnnnn/nngg
gggac
c/ycgrg
gc/ngc
g/ggccc
gdgch/c
t/ccgga
/gatc
gc/tnagc
t/ccgga
a/catgt
acctgc
gcaatg
r/ccggy
actgg
actgg
r/ccggy
ctcgtg
cc/wgg
gcagc
c/tnag
c/crygg
ggatg
cgry/cg
cc/wgg
cc/wgg
c/tryag
cg/cg
r/gatcy
r/gatcy
c/ggccg
gg/cc
gcn/ngc
gc/tnagc
No.
cuts
6
1
4
1
1
1
1
1
1
4
3
3
1
1
6
1
3
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
2
1
5
3
2
1
1
1
5
5
1
4
1
1
1
4
2
1
Positions
of sites
185 271 283 453 540 639
227
62 187 525 631
554
494
554
421
736
660
163 273 303 661
7 289 645
7 289 645
760
272
12 60 182 392 554 713
585
279 421 589
660
364
415
660
655
402
36 59
162 302
227
227
162 302
736
284 340 455 541 640
15 185 716
415 507
185
70
554
284 340 455 541 640
284 340 455 541 640
669
62 187 525 631
364
364
551
77 394 553 587
179 206
415
66
Enzyme
name
CfoI
Cfr10I
Cfr13I
Cfr42I
Cfr9I
CfrI
Csp6I
CviJI
Recognition
sequence
gcg/c
r/ccggy
g/gncc
ccgc/gg
c/ccggg
y/ggccr
g/tac
rg/cy
No.
cuts
1
2
1
1
1
2
4
12
DdeI
DpnI
DpnII
DraII
DsaI
EaeI
EagI
EclXI
Eco147I
Eco24I
Eco52I
Eco64I
Eco88I
EcoNI
EcoO109I
EcoRI
EcoRII
FauI
FokI
FriOI
Fsp4HI
GsuI
HaeIII
HapII
HgaI
HhaI
Hin6I
HinP1I
HinfI
HpaII
HphI
Hsp92II
HspAI
ItaI
Kpn2I
KspI
c/tnag
ga/tc
/gatc
rg/gnccy
c/crygg
y/ggccr
c/ggccg
c/ggccg
agg/cct
grgcy/c
c/ggccg
g/gyrcc
c/ycgrg
cctnn/nnnagg
rg/gnccy
g/aattc
/ccwgg
cccgc
ggatg
grgcy/c
gc/ngc
ctggag
gg/cc
c/cgg
gacgc
gcg/c
g/cgc
g/cgc
g/antc
c/cgg
ggtga
catg/
g/cgc
gc/ngc
t/ccgga
ccgc/gg
2
1
1
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
5
2
1
2
6
1
4
4
1
1
1
1
3
4
1
3
1
6
1
1
Positions
of sites
770
162 302
585
188
272
392 551
248 308 504 548
77 166 184 277 394 519 553 587
645 650 720 730
415 507
366
364
585
185
392 551
551
551
77
279 589
551
494
272
5
585
334 664
282 338 453 539 638
593 762
70
279 589
12 60 182 392 554 713
373
77 394 553 587
163 273 303 661
415
770
768
768
146 218 696
163 273 303 661
354
610 659 719
768
12 60 182 392 554 713
660
188
67
Enzyme
name
Kzo9I
MaeI
MaeII
MboI
MboII
MflI
MnlI
MroI
MseI
MspA1I
MspI
MspR9I
MvaI
MvnI
MwoI
NciI
NdeII
NlaIII
NlaIV
NspBII
NspI
PalI
PinAI
Pme55I
PspAI
PspALI
PspN4I
PspOMI
PstI
RsaI
SacII
Sau3AI
Sau96I
ScrFI
SduI
SfaNI
SfcI
Sfr303I
SmaI
Sse9I
SseBI
SstII
StuI
TfiI
ThaI
Recognition
sequence
/gatc
c/tag
a/cgt
/gatc
gaaga
r/gatcy
cctc
t/ccgga
t/taa
cmg/ckg
c/cgg
cc/ngg
cc/wgg
cg/cg
gcnnnnn/nngc
cc/sgg
/gatc
catg/
ggn/ncc
cmg/ckg
rcatg/y
gg/cc
a/ccggt
agg/cct
c/ccggg
ccc/ggg
ggn/ncc
g/ggccc
ctgca/g
gt/ac
ccgc/gg
/gatc
g/gncc
cc/ngg
gdgch/c
gcatc
c/tryag
ccgc/gg
ccc/ggg
/aatt
agg/cct
ccgc/gg
agg/cct
g/awtc
cg/cg
No.
cuts
1
3
2
1
3
1
4
1
4
1
4
6
5
4
4
1
1
3
2
1
2
4
1
1
1
1
2
1
1
4
1
1
1
6
3
2
1
1
1
5
1
1
1
3
4
Positions
of sites
364
311 484 499
142 250
364
74 158 637
364
11 107 327 374
660
211 562 615 752
187
163 273 303 661
273 284 340 455 541 640
284 340 455 541 640
62 187 525 631
37 391 433 767
273
364
610 659 719
496 586
187
610 659
77 394 553 587
302
77
272
274
496 586
585
673
249 309 505 549
188
364
585
273 284 340 455 541 640
279 421 589
627 680
669
188
274
22 334 575 616 664
77
188
77
146 218 696
62 187 525 631
68
Enzyme
name
Tru1I
Tru9I
Tsp509I
TspEI
TspRI
XhoII
XmaI
XmaIII
XmnI
Recognition
sequence
t/taa
t/taa
/aatt
/aatt
cagtg
r/gatcy
c/ccggg
c/ggccg
gaann/nnttc
No.
cuts
4
4
5
5
3
1
1
1
1
Positions
of sites
211 562 615 752
211 562 615 752
22 334 575 616 664
22 334 575 616 664
19 226 384
364
272
551
77
69
(c) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Acidithiobacillus thiooxidans. (776 pb)
Enzyme
Name
AatI
AccB1I
AccII
AciI
Recognition
sequence
agg/cct
g/gyrcc
cg/cg
ccgc
No.
cuts
1
1
4
13
AcsI
AfaI
AflIII
AgeI
AluI
AlwNI
Ama87I
ApaI
ApoI
Asp700I
AspLEI
AspS9I
AsuI
AvaI
BanI
BanII
BbvI
BcgI
BcnI
BcoI
BfaI
BglII
BmyI
BpmI
BsaJI
BsaOI
BsaWI
Bsc4I
Bse118I
Bse1I
BseDI
BseNI
Bsh1236I
Bsh1285I
BshNI
BsiEI
BsiI
r/aatty
gt/ac
a/crygt
a/ccggt
ag/ct
cagnnn/ctg
c/ycgrg
gggcc/c
r/aatty
gaann/nnttc
gcg/c
g/gncc
g/gncc
c/ycgrg
g/gyrcc
grgcy/c
gcagc
cgannnnnntgc
cc/sgg
c/ycgrg
c/tag
a/gatct
gdgch/c
ctggag
c/cnngg
cgry/cg
w/ccggw
ccnnnn/nnngg
r/ccggy
actgg
c/cnngg
actgg
cg/cg
cgry/cg
g/gyrcc
cgry/cg
ctcgtg
2
3
1
1
2
1
1
1
2
1
1
2
2
1
1
2
3
1
1
1
2
1
3
1
6
1
1
3
2
1
6
1
4
1
1
1
1
Positions
of sites
77
496
62 187 527 631
63 132 188 248 296 351 394 542
559 594 602 681 762
22 334
309 507 551
654
302
521 730
712
272
591
22 334
77
770
401 587
401 587
272
496
279 591
15 185 716
726
273
272
311 486
364
279 591 688
373
185 271 283 455 542 644
556
302
6 288 644
162 302
227
185 271 283 455 542 644
227
62 187 527 631
556
496
556
736
70
Enzyme
Name
BsiSI
BsiYI
BslI
BsmFI
BsoBI
BsoFI
Bsp120I
Bsp1286I
Bsp143I
BspLU11I
BsrDI
BsrFI
BsrI
BsrSI
BssAI
BssSI
Bst2UI
Bst71I
BstDEI
BstDSI
BstMCI
BstNI
BstOI
BstSFI
BstUI
BstX2I
BstYI
BstZI
BsuRI
Cac8I
CfoI
Cfr10I
Cfr13I
Cfr42I
Cfr9I
CfrI
Csp6I
CviJI
Recognition
sequence
c/cgg
ccnnnnn/nngg
ccnnnnn/nngg
gggac
c/ycgrg
gc/ngc
g/ggccc
gdgch/c
/gatc
a/catgt
gcaatg
r/ccggy
actgg
actgg
r/ccggy
ctcgtg
cc/wgg
gcagc
c/tnag
c/crygg
cgry/cg
cc/wgg
cc/wgg
c/tryag
cg/cg
r/gatcy
r/gatcy
c/ggccg
gg/cc
gcn/ngc
gcg/c
r/ccggy
g/gncc
ccgc/gg
c/ccggg
y/ggccr
g/tac
rg/cy
No.
cuts
3
3
3
1
1
6
1
3
1
1
2
2
1
1
2
1
7
3
2
1
1
7
7
1
4
1
1
1
5
4
1
2
2
1
1
2
3
12
DdeI
DpnI
DpnII
DraII
DsaI
EaeI
c/tnag
ga/tc
/gatc
rg/gnccy
c/crygg
y/ggccr
2
1
1
1
1
2
Positions
of sites
163 273 303
7 289 645
7 289 645
760
272
12 60 182 392 556 713
587
279 591 688
364
654
36 59
162 302
227
227
162 302
736
284 340 399 443 457 543 645
15 185 716
416 509
185
556
284 340 399 443 457 543 645
284 340 399 443 457 543 645
668
62 187 527 631
364
364
553
77 394 402 555 589
133 179 206 591
770
162 302
401 587
188
272
392 553
308 506 550
77 166 184 277 394 402 521 555
589 649 720 730
416 509
366
364
587
185
392 553
71
Enzyme
Name
EagI
EclXI
Eco147I
Eco24I
Eco52I
Eco64I
Eco88I
EcoNI
EcoO109I
EcoRI
EcoRII
FauI
FriOI
Fsp4HI
GsuI
HaeIII
HapII
HgaI
HhaI
Hin6I
HinP1I
HincII
HindII
HinfI
HpaII
HphI
Hsp92II
HspAI
ItaI
KspI
Kzo9I
MaeI
MaeII
MboI
MboII
MflI
MnlI
MseI
MspA1I
MspI
MspR9I
MvaI
MvnI
MwoI
NciI
Recognition
sequence
c/ggccg
c/ggccg
agg/cct
grgcy/c
c/ggccg
g/gyrcc
c/ycgrg
cctnn/nnnagg
rg/gnccy
g/aattc
/ccwgg
cccgc
grgcy/c
gc/ngc
ctggag
gg/cc
c/cgg
gacgc
gcg/c
g/cgc
g/cgc
gty/rac
gty/rac
g/antc
c/cgg
ggtga
catg/
g/cgc
gc/ngc
ccgc/gg
/gatc
c/tag
a/cgt
/gatc
gaaga
r/gatcy
cctc
t/taa
cmg/ckg
c/cgg
cc/ngg
cc/wgg
cg/cg
gcnnnnn/nngc
cc/sgg
No.
cuts
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
7
3
2
6
1
5
3
1
1
1
1
1
1
4
3
1
3
1
6
1
1
2
1
1
3
1
5
4
1
3
8
7
4
5
1
Positions
of sites
553
553
77
279 591
553
496
272
5
587
334
282 338 397 441 455 541 643
594 682 762
279 591
12 60 182 392 556 713
373
77 394 402 555 589
163 273 303
416
770
768
768
140
140
146 218 663 696
163 273 303
354
611 658 719
768
12 60 182 392 556 713
188
364
311 486
142
364
74 158 637
364
11 107 327 374 421
211 564 616 752
187
163 273 303
273 284 340 399 443 457 543 645
284 340 399 443 457 543 645
62 187 527 631
37 128 391 435 767
273
72
Enzyme
Name
NdeII
NlaIII
NlaIV
NspBII
NspI
PalI
PinAI
Pme55I
PspAI
PspALI
PspN4I
PspOMI
PstI
RsaI
SacII
Sau3AI
Sau96I
ScrFI
SduI
SfaNI
SfcI
Sfr303I
SmaI
Sse9I
SseBI
SstII
StuI
TaqI
TfiI
ThaI
Tru1I
Tru9I
Tsp509I
TspEI
TspRI
TthHB8I
XhoII
XmaI
XmaIII
XmnI
Recognition
sequence
/gatc
catg/
ggn/ncc
cmg/ckg
rcatg/y
gg/cc
a/ccggt
agg/cct
c/ccggg
ccc/ggg
ggn/ncc
g/ggccc
ctgca/g
gt/ac
ccgc/gg
/gatc
g/gncc
cc/ngg
gdgch/c
gcatc
c/tryag
ccgc/gg
ccc/ggg
/aatt
agg/cct
ccgc/gg
agg/cct
t/cga
g/awtc
cg/cg
t/taa
t/taa
/aatt
/aatt
cagtg
t/cga
r/gatcy
c/ccggg
c/ggccg
gaann/nnttc
No.
cuts
1
3
2
1
2
5
1
1
1
1
2
1
1
3
1
1
2
8
3
2
1
1
1
4
1
1
1
1
4
4
4
4
4
4
3
1
1
1
1
1
Positions
of sites
364
611 658 719
498 588
187
611 658
77 394 402 555 589
302
77
272
274
498 588
587
672
309 507 551
188
364
401 587
273 284 340 399 443 457 543 645
279 591 688
627 679
668
188
274
22 334 577 617
77
188
77
621
146 218 663 696
62 187 527 631
211 564 616 752
211 564 616 752
22 334 577 617
22 334 577 617
19 226 384
621
364
272
553
77
73
(d) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de
Leptospirillum ferrooxidans. (778 pb)
Enzyme
name
AatI
Acc16I
Acc65I
AccB1I
AccII
AciI
No.
cuts
1
1
1
1
3
11
AcsI
AfaI
AflIII
AhdI
AluI
Alw26I
AlwNI
Ama87I
ApaI
ApoI
Asp700I
Asp718I
AspEI
AspLEI
AspS9I
AsuI
AvaI
AviII
AvrII
BanI
BanII
BbvI
BcgI
BcoI
BfaI
BlnI
BmyI
BpmI
BsaJI
BsaMI
BsaOI
Bsc4I
Bse118I
Bse1I
BseDI
BseNI
Bsh1236I
Bsh1285I
BshNI
BsiEI
BsiI
1
4
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
5
1
1
1
1
1
1
5
1
1
5
1
2
5
2
3
1
1
1
1
Positions
of sites
77
30
144
144
62 187 630
63 188 334 351 394 518 541 558
593 601 764
334
146 484 534 550
653
657
277 732
303 424
714
102
590
334
77
144
657
31 772
586
586
102
30
643
144
590
15 55 185 521 718
728
102
644
643
590
316
161 185 455 541 643
294
555
6 65 140 541 643
378
227 306
161 185 455 541 643
227 306
62 187 630
555
144
555
738
Recognition
sequence
agg/cct
tgc/gca
g/gtacc
g/gyrcc
cg/cg
ccgc
r/aatty
gt/ac
a/crygt
gacnnn/nngtc
ag/ct
gtctc
cagnnn/ctg
c/ycgrg
gggcc/c
r/aatty
gaann/nnttc
g/gtacc
gacnnn/nngtc
gcg/c
g/gncc
g/gncc
c/ycgrg
tgc/gca
c/ctagg
g/gyrcc
grgcy/c
gcagc
cgannnnnntgc
c/ycgrg
c/tag
c/ctagg
gdgch/c
ctggag
c/cnngg
gaatgc
cgry/cg
ccnnnn/nnngg
r/ccggy
actgg
c/cnngg
actgg
cg/cg
cgry/cg
g/gyrcc
cgry/cg
ctcgtg
74
Enzyme
name
BsiSI
BsiYI
BslI
BsmAI
BsmBI
BsmFI
BsmI
BsoBI
BsoFI
Bsp120I
Bsp1286I
BspLU11I
BsrDI
BsrFI
BsrI
BsrSI
BssAI
BssSI
BssT1I
Bst2UI
Bst71I
BstDEI
BstDSI
BstMCI
BstNI
BstOI
BstSFI
BstUI
BstZI
BsuRI
Cac8I
CfoI
Cfr10I
Cfr13I
Cfr42I
CfrI
Csp6I
CviJI
No.
cuts
1
5
5
2
1
2
1
1
8
1
1
1
1
1
2
2
1
1
1
3
5
2
2
1
3
3
1
3
1
5
4
2
1
1
1
1
4
15
DdeI
DraII
DsaI
EaeI
EagI
Eam1105I
EclHKI
EclXI
Eco130I
Eco147I
Eco24I
Eco32I
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
2
Positions
of sites
379
7 66 141 542 644
7 66 141 542 644
303 424
425
109 762
294
102
12 52 60 182 392 515 555 715
586
590
653
36
378
227 306
227 306
378
738
643
399 457 542
15 55 185 521 718
416 486
161 185
555
399 457 542
399 457 542
239
62 187 630
552
77 271 378 554 588
179 206 308 590
31 772
378
586
188
552
145 483 533 549
77 160 166 184 271 277 310 317
378 394 554 588 648 722 732
416 486
586
161 185
552
552
657
657
552
643
77
590
120 365
Recognition
sequence
c/cgg
ccnnnnn/nngg
ccnnnnn/nngg
gtctc
cgtctc
gggac
gaatgc
c/ycgrg
gc/ngc
g/ggccc
gdgch/c
a/catgt
gcaatg
r/ccggy
actgg
actgg
r/ccggy
ctcgtg
c/cwwgg
cc/wgg
gcagc
c/tnag
c/crygg
cgry/cg
cc/wgg
cc/wgg
c/tryag
cg/cg
c/ggccg
gg/cc
gcn/ngc
gcg/c
r/ccggy
g/gncc
ccgc/gg
y/ggccr
g/tac
rg/cy
c/tnag
rg/gnccy
c/crygg
y/ggccr
c/ggccg
gacnnn/nngtc
gacnnn/nngtc
c/ggccg
c/cwwgg
agg/cct
grgcy/c
gat/atc
75
Enzyme
name
Eco52I
Eco64I
Eco88I
EcoNI
EcoO109I
EcoRII
EcoRV
EcoT14I
ErhI
Esp3I
FauI
FriOI
Fsp4HI
FspI
GsuI
HaeIII
HapII
HgaI
HhaI
Hin6I
HinP1I
HinfI
HpaII
HphI
Hsp92II
HspAI
ItaI
KpnI
KspI
MaeI
MboII
MnlI
No.
cuts
1
1
1
2
1
3
2
1
1
1
3
1
8
1
1
5
1
2
2
2
2
1
1
2
3
2
8
1
1
1
1
9
MseI
MslI
MspA1I
MspI
MspR9I
Mva1269I
MvaI
MvnI
MwoI
NlaIII
NlaIV
NspBII
NspI
PalI
PleI
Pme55I
PspN4I
PspOMI
3
1
1
1
3
1
3
3
4
3
3
1
2
5
1
1
3
1
Positions
of sites
552
144
102
5 642
586
397 455 540
120 365
643
643
425
541 593 764
590
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30
316
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379
52 626
31 772
29 770
29 770
235
379
267 354
610 657 721
29 770
12 52 60 182 392 515 555 715
148
188
644
74
11 22 201 317 327 498 510 635
746
279 501 615
709
187
379
399 457 542
294
399 457 542
62 187 630
391 435 523 769
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146 587 636
187
610 657
77 271 378 554 588
239
77
146 587 636
586
Recognition
sequence
c/ggccg
g/gyrcc
c/ycgrg
cctnn/nnnagg
rg/gnccy
/ccwgg
gat/atc
c/cwwgg
c/cwwgg
cgtctc
cccgc
grgcy/c
gc/ngc
tgc/gca
ctggag
gg/cc
c/cgg
gacgc
gcg/c
g/cgc
g/cgc
g/antc
c/cgg
ggtga
catg/
g/cgc
gc/ngc
ggtac/c
ccgc/gg
c/tag
gaaga
cctc
t/taa
caynn/nnrtg
cmg/ckg
c/cgg
cc/ngg
gaatgc
cc/wgg
cg/cg
gcnnnnn/nngc
catg/
ggn/ncc
cmg/ckg
rcatg/y
gg/cc
gagtc
agg/cct
ggn/ncc
g/ggccc
76
Enzyme
name
RsaI
SacII
Sau96I
ScrFI
SduI
SfcI
Sfr303I
Sse9I
SseBI
SspI
SstII
StuI
StyI
TaqI
ThaI
Tru1I
Tru9I
Tsp509I
TspEI
TspRI
TthHB8I
XmaIII
XmnI
No.
cuts
4
1
1
3
1
1
1
4
1
1
1
1
1
1
3
3
3
4
4
2
1
1
1
Positions
of sites
146 484 534 550
188
586
399 457 542
590
239
188
218 334 576 616
77
25
188
77
643
620
62 187 630
279 501 615
279 501 615
218 334 576 616
218 334 576 616
19 418
620
552
77
Recognition
sequence
gt/ac
ccgc/gg
g/gncc
cc/ngg
gdgch/c
c/tryag
ccgc/gg
/aatt
agg/cct
aat/att
ccgc/gg
agg/cct
c/cwwgg
t/cga
cg/cg
t/taa
t/taa
/aatt
/aatt
cagtg
t/cga
c/ggccg
gaann/nnttc
77
(e) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S
amplificado de Sulfobacillus thermosulfidooxidans. (766 pb)
Enzyme
name
Acc65I
AccB1I
AccBSI
AccII
AccIII
AciI
No.
cuts
1
2
1
6
1
14
AcsI
AfaI
AluI
AlwNI
Ama87I
ApaI
ApoI
Asp718I
AspLEI
AspS9I
AsuI
AvaI
AvaII
BanI
BanII
BbsI
Bbv16II
BbvI
BcgI
BcnI
BcoI
BfaI
Bme18I
BmyI
BpiI
BpuAI
BsaAI
BsaJI
BsaOI
BsaWI
Bsc4I
Bse118I
Bse1I
BseAI
BseDI
BseNI
BseRI
Bsh1236I
Bsh1285I
BshNI
1
4
3
1
1
2
1
1
8
6
6
1
1
2
2
2
2
3
1
6
1
2
1
2
2
2
2
6
2
1
4
2
3
1
6
3
1
6
2
2
Positions
of sites
139
139 506
345
62 182 302 417 625 665
209
63 183 243 258 291 345 388 507
536 553 588 666 674 752
328
141 478 529 545
93 515 720
702
490
585 680
328
139
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117 126 400 494 581 676
117 126 400 494 581 676
490
494
139 506
585 680
75 115
75 115
15 180 706
716
120 130 278 451 491 501
490
305 480
494
585 680
75 115
75 115
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300 550
209
6 282 502 536
114 136
222 396 647
209
129 180 374 449 490 536
222 396 647
286
62 182 302 417 625 665
300 550
139 506
78
Recognition
sequence
g/gtacc
g/gyrcc
gagcgg
cg/cg
t/ccgga
ccgc
r/aatty
gt/ac
ag/ct
cagnnn/ctg
c/ycgrg
gggcc/c
r/aatty
g/gtacc
gcg/c
g/gncc
g/gncc
c/ycgrg
g/gwcc
g/gyrcc
grgcy/c
gaagac
gaagac
gcagc
cgannnnnntgc
cc/sgg
c/ycgrg
c/tag
g/gwcc
gdgch/c
gaagac
gaagac
yac/gtr
c/cnngg
cgry/cg
w/ccggw
ccnnnn/nnngg
r/ccggy
actgg
t/ccgga
c/cnngg
actgg
gaggag
cg/cg
cgry/cg
g/gyrcc
Enzyme
name
BsiEI
BsiI
BsiMI
BsiSI
No.
cuts
2
2
1
11
BsiYI
BslI
BsmFI
BsoBI
BsoFI
4
4
2
1
9
Bsp120I
Bsp1286I
Bsp13I
Bsp143I
Bsp143II
BspEI
BspMI
BsrBI
BsrFI
BsrI
BsrSI
BssAI
BssSI
Bst2UI
Bst71I
BstD102I
BstDEI
BstDSI
BstH2I
BstMCI
BstNI
BstOI
BstSNI
BstUI
BstZI
BsuRI
Cac8I
CfoI
Cfr10I
Cfr13I
Cfr42I
Cfr9I
CfrI
Csp6I
CviJI
2
2
1
1
1
1
1
1
2
3
3
2
2
4
3
1
2
2
1
2
4
4
1
6
1
8
6
8
2
6
1
1
1
4
18
DdeI
DpnI
DpnII
2
1
1
Positions
of sites
300 550
658 726
209
115 120 129 137 210 269 278 451
491 500 510
7 283 503 537
7 283 503 537
109 750
490
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703
581 676
585 680
209
358
663
209
701
345
114 136
222 396 647
222 396 647
114 136
658 726
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15 180 706
345
410 524
180 374
663
300 550
334 398 537 639
334 398 537 639
251
62 182 302 417 625 665
547
77 118 128 396 401 549 583 678
42 174 201 585 676 692
40 304 390 417 627 662 696 760
114 136
117 126 400 494 581 676
183
490
547
140 477 528 544
44 77 93 118 128 136 155 179 265
272 291 396 401 515 549 583 678
720
410 524
360
358
79
Recognition
sequence
cgry/cg
ctcgtg
t/ccgga
c/cgg
ccnnnnn/nngg
ccnnnnn/nngg
gggac
c/ycgrg
gc/ngc
g/ggccc
gdgch/c
t/ccgga
/gatc
rgcgc/y
t/ccgga
acctgc
gagcgg
r/ccggy
actgg
actgg
r/ccggy
ctcgtg
cc/wgg
gcagc
gagcgg
c/tnag
c/crygg
rgcgc/y
cgry/cg
cc/wgg
cc/wgg
tac/gta
cg/cg
c/ggccg
gg/cc
gcn/ngc
gcg/c
r/ccggy
g/gncc
ccgc/gg
c/ccggg
y/ggccr
g/tac
rg/cy
c/tnag
ga/tc
/gatc
Enzyme
name
DraII
DsaI
EaeI
EagI
EclXI
Eco105I
Eco24I
Eco47I
Eco52I
Eco64I
Eco88I
EcoNI
EcoO109I
EcoRI
EcoRII
FauI
FriOI
Fsp4HI
No.
cuts
2
2
1
1
1
1
2
1
1
2
1
1
2
1
4
4
2
9
HaeII
HaeIII
HapII
1
8
11
HgaI
HgiEI
HhaI
Hin6I
HinP1I
HinfI
HpaII
2
1
8
8
8
1
11
HphI
Hsp92II
HspAI
ItaI
2
2
8
9
Kpn2I
KpnI
KspI
Kzo9I
MaeI
MaeII
MboI
MboII
MnlI
MroI
MseI
MslI
MspA1I
MspI
1
1
1
1
2
3
1
4
7
1
3
1
1
11
Positions
of sites
581 677
180 374
547
547
547
251
585 680
494
547
139 506
490
5
581 677
328
332 396 535 637
536 588 678 752
585 680
12 60 177 289 386 550 663 672
703
663
77 118 128 396 401 549 583 678
115 120 129 137 210 269 278 451
491 500 510
410 621
494
40 304 390 417 627 662 696 760
38 302 388 415 625 660 694 758
38 302 388 415 625 660 694 758
22
115 120 129 137 210 269 278 451
491 500 510
278 348
605 709
38 302 388 415 625 660 694 758
12 60 177 289 386 550 663 672
703
209
143
183
358
305 480
168 190 250
358
29 74 114 369
11 152 269 284 311 321 415
209
261 610 742
653
182
115 120 129 137 210 269 278 451
491 500 510
80
Recognition
sequence
rg/gnccy
c/crygg
y/ggccr
c/ggccg
c/ggccg
tac/gta
grgcy/c
g/gwcc
c/ggccg
g/gyrcc
c/ycgrg
cctnn/nnnagg
rg/gnccy
g/aattc
/ccwgg
cccgc
grgcy/c
gc/ngc
rgcgc/y
gg/cc
c/cgg
gacgc
g/gwcc
gcg/c
g/cgc
g/cgc
g/antc
c/cgg
ggtga
catg/
g/cgc
gc/ngc
t/ccgga
ggtac/c
ccgc/gg
/gatc
c/tag
a/cgt
/gatc
gaaga
cctc
t/ccgga
t/taa
caynn/nnrtg
cmg/ckg
c/cgg
Enzyme
name
MspR9I
No.
cuts
10
MvaI
MvnI
MwoI
NciI
NdeII
NlaIII
NlaIV
NspBII
NspI
PalI
PspAI
PspALI
PspN4I
PspOMI
RsaI
SacII
Sau3AI
Sau96I
ScrFI
4
6
6
6
1
2
6
1
1
8
1
1
6
2
4
1
1
6
10
SduI
Sfr303I
SinI
SmaI
SnaBI
Sse9I
SstII
TaqI
TfiI
ThaI
Tru1I
Tru9I
Tsp509I
TspEI
TspRI
TthHB8I
XmaI
XmaIII
2
1
1
1
1
4
1
1
1
6
3
3
4
4
2
1
1
1
Positions
of sites
120 130 278 334 398 451 491 501
537 639
334 398 537 639
62 182 302 417 625 665
229 385 429 668 702 757
120 130 278 451 491 501
358
605 709
135 141 495 508 582 678
182
605
77 118 128 396 401 549 583 678
490
492
135 141 495 508 582 678
581 676
141 478 529 545
183
358
117 126 400 494 581 676
120 130 278 334 398 451 491 501
537 639
585 680
183
494
492
251
213 328 571 611
183
615
22
62 182 302 417 625 665
261 610 742
261 610 742
213 328 571 611
213 328 571 611
395 598
615
490
547
81
Recognition
sequence
cc/ngg
cc/wgg
cg/cg
gcnnnnn/nngc
cc/sgg
/gatc
catg/
ggn/ncc
cmg/ckg
rcatg/y
gg/cc
c/ccggg
ccc/ggg
ggn/ncc
g/ggccc
gt/ac
ccgc/gg
/gatc
g/gncc
cc/ngg
gdgch/c
ccgc/gg
g/gwcc
ccc/ggg
tac/gta
/aatt
ccgc/gg
t/cga
g/awtc
cg/cg
t/taa
t/taa
/aatt
/aatt
cagtg
t/cga
c/ccggg
c/ggccg
Anexo E. Digestión virtual
A continuación se presenta una tabla con los tamaños de los TRFs obtenidos de la digestión
virtual.
Tabla 22. Tamaños de los TRFs obtenidos de la digestión virtual de las bacterias asociadas a procesos de
biolixiviación
Acetobacter methanolicus
Acetobacter spp.
Acidimicrobium ferrooxidans
Acidiphilium acidophilum
Acidiphilium angustum
Acidiphilium cryptum
Acidiphilium symbioticum
Acidithiobacillus caldus
Acidithiobacillus albertensis
Acidithiobacillus capsulatus
Acidithiobacillus concretivorus
Acidithiobacillus delicatus
Acidithiobacillus denitrificans
Acidithiobacillus ferrooxidans
Acidithiobacillus intermedius
Acidithiobacillus kabobis
Acidithiobacillus neapolitanus
Acidithiobacillus novelius
Acidithiobacillus organoparus
Acidithiobacillus perometabolis
Acidithiobacillus pumbophilus
Acidithiobacillus rubellus
Acidithiobacillus tepidarius
Acidithiobacillus thiooxidans
Acidithiobacillus thioparus
Acidithiobacillus versutus
Acidobacterium capsulatum
Acidocella spp.
Acidomonas methanolica
Alicyclobacillus spp.
Alicyclobacillus disulfidooxidans
Arthrobacter spp.
Aureobacterium liquifaciens
Bacillus coagulans
Bacillus licheniformis
Bacillus megaterium
Bacillus polymyxa
Chromobacterium violaceum
Comamonas testosteroni
Crenothrix spp.
Desulfosporosinus spp.
Enterobacter aglomerans
Enterobacter cloacae
RsaI
121
121
121
121
121
121
551
309
146
146
249
147
309
117
121
121
121
146
146
126
147
117
117
146
102
94
94
Msp I
138
138
138
138
138
138
163
163
163
163
163
163
163
148
123
138
138
164
148
143
102
216
215
130
132
164
163
82
Temperatura
Termófilo moderado
Mesófilo
Mesófilo
Mesófilo
Termófilo moderado
Mesófilo
Mesófilo
Mesófilo
Mesófilo
Mesófilo - Termófilo moderado
Mesófilo - Termófilo moderado
Ferrimicrobium acidiphilium
Gallionella spp.
Kingella kingae
Lactobacillus acidophilus
Leptospirillum ferrooxidans
Leptospirillum ferriphilium
Leptospirillum thermoferooxidans
Leptospirillum spp.
Leptotrix discophora
Metallogenium spp.
Ochrobacterium anthropi
Propionibacterium acnes
Pseudomonas cepacia
Pseudomonas putida
Psychrobacter glacincola
Serratia ficaria
Shewanella spp.
Siderocapsa spp.
Staphilococcus latis
Staphilococcus spp
Stenotrophomonas maltophila
Sulfobacillus acidophilus
Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Thermothrix thiopara
Thiobacillus prosperus
Thiomonas cuprinus
Thiomonas spp.
RsaI
121
146
146
552
146
146
Msp I
138
103
163
215
379
103
146
146
525
464
317
551
551
238
146
146
141
141
135
552
146
103
163
102
143
163
130
163
163
215
130
143
115
203
163
163
83
Temperatura
Mesófilo
Mesófilo
Mesófilo
Mesófilo
Termófilo moderado
Termófilo moderado
Mesófilo
Mesófilo
Mesófilo
84