5. estructura, propiedades y función de ácidos nucleicos
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0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO I: CONJUGACIÓN Objetivos − Identificar al DNA como portador de la información genética − Conocer los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plásmido. − Reconocer a la conjugación bacteriana como un fenómeno de transferencia horizontal de material genético. − Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugación bacteriana. Introducción Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, covalentemente cerrados y generalmente, de tamaño pequeño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la sobrevivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales, etcétera. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y su purificación. Una bacteria sólo puede adquirir un plásmido a partir de otra bacteria que lo contenga, ya sea por transmisión vertical o por cualquiera de los tres mecanismos conocidos de transferencia horizontal de material genético. Estos son: la transformación, la transducción y la conjugación. En la transformación, el DNA liberado de una célula bacteriana entra a otra célula, generalmente de la misma especie. En la transducción, un virus bacteriano accidentalmente toma DNA del cromosoma o de un plásmido de la bacteria a la que ha infectado y lo inyecta a otras bacterias. La conjugación bacteriana es un proceso de transferencia de material genético, en el que la información genética de un plásmido con o sin parte del cromosoma bacteriano es transferido a otra célula (Figura 5.1). Este proceso, a diferencia de la transducción, tiene como condición esencial el contacto celular. A la célula que aporta el material genético se le llama donadora y aquella que lo recibe, receptora. No todos los plásmidos pueden llevar a cabo la conjugación, es decir ser conjugativos, solamente aquellos que poseen un grupo de genes denominados genes tra. Dentro de este grupo de plámidos se encuentra el factor de fertilidad o plásmido F de E. coli. El plásmido F confiere a la célula bacteriana la capacidad de conjugarse con otra célula que no lo posea. El plásmido F se presenta en una sola copia por cromosoma bacteriano. Cuando se integra al cromosoma bacteriano, suprime su sistema de replicación y se replica como parte del cromosoma bacteriano. El plásmido F contiene más de 40 genes tra, la mayoría de los cuales son necesarios para la construcción de un organelo llamado pili sexual o pili F constituido por una proteína, la pilina, codificada por uno de los genes tra. El Pili F es necesario para promover el contacto entre las bacterias donadora y receptora y para la formación de un puente citoplasmático por donde pasará el material genético. La transferencia se inicia a partir de un sitio determinado en el plásmido y que forma parte de los genes tra, denominado oriT 1 Figura 5.1. Conjugación bacteriana. Paso del plásmido F de una célula donadora a una receptora a través del conducto proteico denominado pili. Al centro se muestra como sólo una de las hebras del DNA del plásmido se inserta en la célula hospedera, por lo que la DNA polimerasa de cada una de las bacterias se encarga de sintetizar la hebra faltante. Al final ambas células presentan al plásmido F. Algunos plásmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugación por sí mismos, pero pueden ser transferidos (plásmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plásmidos con genes tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes mob, los cuales incluyen un sitio oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugación, incluyendo los que codifican para la formación del pili. En relación al plásmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas: - Cepa F . Célula bacteriana que no posee un plásmido F, y que actúa como célula receptora en la conjugación. Cepa F+. Célula bacteriana que posee un plásmido F independiente del cromosoma bacteriano, actúa como célula donadora en la conjugación y transfiere al plásmido F a la célula receptora transformándola en célula F+. Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plásmido F integrado a su cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (célula donadora) y por ello confieren alta frecuencia de recombinación. No transfieren el plásmido F, por lo que al término de la conjugación de las células receptora permanece como F. Cepa F’. Célula bacteriana que posee un plásmido F extracromasómico, pero que antes estuvo integrado al cromosoma y que se encidió llevando consigo genes bacterianos. Actúa como célula donadora en la conjugación y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a la célula receptora en una célula F′, la cual será un diploide parcial o merocigoto. Es decir, tendrá dos copias de los genes bacterianos que están presentes en el plásmido F′. A ese tipo de transferencia se le conoce como sex-ducción. Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una célula F- en un tiempo constante. Se calcula en aproximadamente 100 minutos la transferencia total del cromosoma de Escherichia coli. Esta característica ha sido utilizada en el mapeo genético localizando un determinado marcador genético en un tiempo dado. 2 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS En esta práctica se comprobará la conjugación bacteriana mediante la transferencia de un marcador genético, la resistencia a la kanamicina. El marcador genético de selección que se utilizará para la cepa receptora será la resistencia a la estreptomicina. 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS estreptomicina. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrás de las 4 cajas (ver Figura). 8. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar y analizar los resultados. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes. Refrigerar las cajas. Material biológico Un cultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC. Un cultivo de E. coli W3110/F´KmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC. Materiales y equipo 1 tubo 13 X 100 mm con 1 mL de caldo Luria estéril 5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 µg/ml) 2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 µg/ml) 3 pipetas de 1 mL estériles 100 palillos de madera estériles 1 asa bacteriológica 1 propipeta 1 mechero Incubadora a 37°C Baño María a 37°C Refrigerador a 4°C Por grupo para controles de las cepas − 1 cajas Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 µg/ml) − 1 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 µg/ml) Desarrollo de la práctica 1. En condiciones estériles tomar el tubo de 13X100 con 1 mL de caldo Luria estéril y hacer la siguiente mezcla de conjugación: 0.5 mL del cultivo de E. coli JM1452Str más 0.2 mL del cultivo E. coli W3110/F´KmTn3 (Figura 5.2). 2. Incubar el tubo a 37ºC SIN AGITACIÓN durante 30 min. 3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes. Marcar la zona 1 como “bacteria receptora”, la zona 2” como conjugación” y la zona 3 como “bacteria donadora”. Colocar una gota pequeña de cada cultivo en el sitio correspondiente y dejar que se absorba. 4. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona de conjugación. 5. Testigo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina y una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estría las cepas donadora y receptora en cada mitad respectivamente. Incubar a 37°C durante 24 h. Al observar crecimiento refrigerar las cajas. 6. Después del tiempo de incubación trabajar con la caja del paso 3. Tomar una asada de las zonas ”receptora y de “conjugación” y sembrar por estría en una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina, cada una en una caja diferente. Incubar a 37ºC durante 24 h. 7. De las colonias aisladas, parchar colonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luria-agar 2%-estreptomicina y después la replica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Parchar consiste en tomar bacterias de una colonia aislada al picar con un palillo la colonia y luego picar una caja de medio de cultivo para así transferir la bacteria. En la práctica una colonia se transferirá con el palillo del cultivo de bacterias aisladas a dos diferentes cajas Petri, empezando por la que contiene el antibiótico 3 4 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 0.5 mL E. coli JM1452Str cepa receptora 0.2 mL E. coli W3110/F´KmTn3 cepa donadora Mezcla de conjugación Incubar 30 min a 37°C sin agitación Luria-Estreptomicina Incubar 24 h, 37°C Sembrar por estría las cepas receptora y transconjugante en Agar Luria-estreptomicina (se necesitan colonias aisladas para el siguiente paso) Incubar 24 a 37°C Cepa receptora Cepa transconjugante Referencias • Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp 467. • Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272. • Genética General, Manual de prácticas de laboratorio. Regulación genética en el operón lac. Facultad de Química, UNAM. Ciudad Universitaria. México, 2002. Marcar las cajas Parchar 50 colonias Luria- Kanamicina Luria-Estreptomicina 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2. ¿Cuáles son los mecanismos de transferencia horizontal de material genético en bacterias? 3. ¿Qué es la conjugación? 4. ¿Qué diferencia existe entre la conjugación y los otros mecanismos de transferencia horizontal de material genético? 5. ¿Cuáles son las principales características del plásmido F y qué genes contiene? 6. ¿Cuáles son los genes del plásmido F necesarios para la transferencia de material genético por conjugación y para qué codifican? 7. ¿De acuerdo al plásmido F cuántos tipos de cepas bacterianas se conocen? y ¿qué diferencia existe entre ellas? 8. Señale que tipo de transconjugantes se obtiene en cada una de las siguientes “cruzas”: a) F+ X Fb) F’ X Fc) Hfr X F9. ¿Qué características tiene las cepas empleadas en la práctica? 10. ¿Por qué tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de resistencia? 11. ¿Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la práctica en las cajas controles con antibióticos? ¿Por qué son importantes estas cajas control? 12. ¿Por qué se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio con estreptomicina como kanamicina? ¿Qué resultados se obtuvieron en esas cajas? 13. ¿Cómo se comprobó la conjugación en la práctica? ¿Qué porcentaje de bacterias transconjugantes se obtuvo? 14. ¿Cuál es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la práctica? 15. ¿Qué diferencias existen entre que un plásmido sea conjugativo o sea movilizable? 16. ¿La conjugación puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o solo se da en las bacterias Gram negativas? 17. ¿Con qué frecuencia y dónde se realiza la conjugación en forma natural? 18. ¿Cuál es la importancia biológica de la conjugación? 19. Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los antibióticos utilizados en la práctica. 20. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos adquiridos al realizar esta práctica? Luria-Estreptomicina Luria-Kanamicina Figura 5.2. Esquema experimental de conjugación bacteriana. Producción de una cepa transconjugante, a partir de una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la información genética para la resistencia a kanamicina. No olvidar realizar hacer los testigos. Cuestionario 1. ¿Qué es un plásmido? 5 6 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: TRANSFORMACIÓN 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS transcripcional del organismo receptor. Asimismo, se debe añadir una secuencia de poli A en la porción 3’ del gen para que el RNAm pueda ser traducido. Objetivos − Conocer el fundamento para transformar células bacterianas. − Realizar la técnica de transformación bacteriana. − Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo. − Conocer la definición de organismo transgénico. − Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos. Introducción Desde épocas antiguas, el hombre ha seleccionado animales y plantas con características fenotípicas deseables. La domesticación ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando la producción de insumos para consumo humano, por ejemplo, hace 100 años una vaca producía en promedio 2000 a 3000 litros de leche al año. Actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al año, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100 años producía en promedio 70 huevos al año, en este siglo las mejores razas producen cerca de 250 al año. Las técnicas convencionales de reproducción han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin embargo, la recombinación cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro, llevó a producir a la mula, organismo estéril. Así, el número de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse sólo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados. Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de técnicas de manipulación y de selección del material genético, la ingeniería genética. Debido a que el DNA contiene un código genético esencialmente similar para todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos totalmente no relacionados y producir organismos con características útiles y particulares, que de otra manera sería imposible de obtener, los denominados organismos transgénicos. Un número amplio de genes ha sido identificado y caracterizado, conocimiento que abre la posibilidad de buscar métodos para introducir o modificar un gene para adquirir una característica deseable, como por ejemplo, para curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes no propios al huésped, se pueden ocasionar efectos no deseados, como que la característica introducida lleve a una respuesta general alterada y, por tanto, modifique la fisiología y sobrevivencia del individuo, o bien que se “escape” la nueva información de manera indiscriminada a otros organismos. Requisitos para construir un vector de clonación Aún cuando el código genético es básicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos del control genético difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es introducido en una célula eucarionte. Para la producción de un organismo genéticamente modificado se tienen que hacer algunas consideraciones, producir o construir un transgene, es decir el gene de interés más una parte extra de DNA que controle correctamente la función del gene en el nuevo huésped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte se le debe agregar una región promotora en el extremo 5’ del gen para que sea reconocido por el aparato 7 Figura 5.3. Vector de clonación pET-24. Se muestran algunas características del vector, como el sitio origen de la transcripción (ori), el sitio de clonación múltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; fl ori, origen de replicación fl y el sitio que servirá para controlar la expresión del transgene una vez que sea insertado en el sitio de clonación múltiple, el sitio de unión al represor lacI. Los plásmidos poseen un interés singular en la Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener múltiples copias); en esta célula hospedera el vector se replica y se expresa. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (inserto) se denomina molécula vector recombinante. Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres características (Figura 5.3): 1) Debe tener su propio origen de replicación y, por tanto, la capacidad de replicación autónoma e independiente del genoma del hospedero. 2) Debe tener un sitio de clonación múltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restricción (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera específica) y hace posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación deseada. 3) Debe poseer marcadores genéticos seleccionables que permitan aislar a las células hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibiótico. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales. La presencia en el 8 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS plásmido del gen de resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibiótico. 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan sólo bajo ciertas circunstancias metabólicas y/o en tejidos específicos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresión, denominados promotores fuertes, que también pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento. Transformación Existen varias técnicas para la introducción del transgene en la célula u organismo, como son la microinyección, la infección de una célula huésped con virus que contenga al vector o bacterias. En este último caso Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar a plantas y producir tumores, el factor Ti ocasiona los síntomas. Sin embargo, al removerlos e incluir en ese sitio el transgene, se conduce a la expresión del transgene en la planta. En el caso de la transformación de bacterias, generalmente se introduce el DNA extraño por microelectroporación o por choque térmico. En el caso del choque térmico, las bacterias que serán las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal como son un aumento en la temperatura, así como de iones que se encargan de cambiar la carga eléctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lípidos (por ejemplo con iones Ca2+), lo que disminuye la repulsión de cargas eléctricas entre los fosfatos de los nucleótidos y la membrana y además facilita la entrada del plásmido al interior celular. A las células que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción de material genético se denominan células competentes. Posteriormente a la introducción del material genético a las células competentes, se disminuye la temperatura y se diluye el calcio, con lo que se permite que se restaure la permeabilidad membranal. Al colocarlas en una condición óptima de crecimiento se obtienen las células transformantes. En la práctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 5.4, en donde se encuentra insertado el gen de la β-lactamasa. Se realizará la transformación mediante la técnica de choque térmico y la resistencia a kanamicina se utilizará como indicador de que las células son transformantes. Figura 5.4. Vector recombinante pET-TEM-1. El vector pET24 (Figura 5.3) fue utilizado para la construcción del vector pETTEM-1. Se inserto el gen que codifica para la β-lactamasa en el sitio de clonación múltiple del vector pET24. El transgene, ompA-βlac, contiene la secuencia completa de la proteína TEM-1 β-lactamasa. Adicionalmente se colocó hacia la región 5’ del gen, a la secuencia que codifica para la secuencia señal o de tránsito de una proteína que se encuentra en la membrana externa de bacterias, en este caso la ompA. A diferencia de la proteína OmpA, la β-lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia señal permitirá que la bacteria transformante secrete a la enzima. Material biológico − 1 tubo de microcentrifuga con 100 µL células competentes de E. coli por grupo mantenerlas congeladas hasta su uso. − 1 tubo de microcentrifuga con 100 µL células competentes de E. coli por equipo mantenerlas congeladas hasta su uso. − Plásmido PET-TEM-1. Materiales y equipo 2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 µg/mL) Tubos de microfuga de 1.5 mL Varilla de vidrio en forma de L Recipiente para hielo Mechero Bunsen Micropipeta de 100-1000µL Micropipeta de 10-100 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL estériles Material por grupo Baño de incubación a 42°C Incubadora con agitación a 37°C 9 10 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Reactivos − Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. 5 mL por grupo. Desarrollo experimental Las células competentes se proporcionarán congeladas. En el apéndice se encuentra el protocolo de preparación de las células competentes. Preparativos 1. Revisar y/o equilibrar el baño de incubación a 42°C. 2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente. 3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37°C por 30 min antes del plaqueo. Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque térmico. 1. Tomar un tubo de células competentes del congelador y colocarlas directamente en el hielo. Descongelar las células competentes en el hielo (las células competentes son muy sensibles a los cambios de temperatura). 2. Añadir 1 a 5 µL (1 a 50 ηg) del plásmido a un microtubo que contiene 100 µL de células competentes. 3. Mezclar invirtiendo el tubo. 4. Dejar en hielo por 30 minutos. 5. Dar choque térmico a 42°C durante 45 segundos NO AGITAR. 6. Agregar 450 µL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37°C con agitación (225 a 250 rpm). 7. Si es necesario, concentrar las células por centrifugación a 14,000 rpm por 1 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 µL de medio SOC. 8. Esparcir los 100 µL de las bacterias transformadas, en las cajas con el medio de selección (AgarLB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio. 9. Incubar a 37°C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4°C. 10. Como control negativo incubar 100 µL de células competentes en una caja con LB-Kanamicina por 24 h a 37°C. 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS • Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localización QP514.2 • Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd edition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442. • Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-317. QH345 L43 • Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein science. A.4D.1-A.4D.2. • Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45. • Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Reverté, pp.745-773. • • • http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/ http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html Cuestionario 1. ¿Qué es un organismo transgénico? 2. ¿Cuáles son las principales diferencias entre los métodos de reproducción asistida y la de producción de organismos transgénicos para la producción de organismos mejorados? 3. ¿Cuáles son las consideraciones éticas que consideras se deben de tomar en cuenta para producir los organismos transgénicos? 4. ¿Qué es un vector de clonación? 5. ¿Cuáles son los requisitos que debe cumplir un vector de clonación para ser utilizado para transformar a un organismo? 6. ¿Cuál es el método de transformación que se utilizará en la práctica? 7. Describe al menos otros dos métodos para transformar células ya sea de animales, hongos o plantas. 8. ¿Cuál fue el marcador de selección de cepas transformantes que se utilizó en la práctica? 9. Después de obtener un organismo transgénico, ¿cuáles son los cuidados que se deben tener para su manipulación o almacenamiento? Referencias 11 12 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS Objetivos − Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA genómico. − Realizar el aislamiento del DNA plasmídico. Introducción Desde finales de la década de los años 70 del siglo pasado, se desarrolló un gran número de métodos de aislamiento de plásmidos. La mayoría tomando en cuenta las diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, así como el tamaño de ambos. Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA del plásmido circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución, la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas. La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas. Mientras que, las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación. El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido. Material biológico Células de E. coli transformante obtenidas en la práctica anterior. Materiales y equipo Tubos para microfuga Recipiente para hielo Microcentrifuga Micropipeta de 100-1000 µL Micropipeta de 20-200 µL Micropipeta de 0.5-10 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS − Para preparar 500 µL de solución de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 µL de 10 N NaOH y 50 µL 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo deberá hacerla justo antes de usarla. Desarrollo experimental (Figura 5.5) Trabajo previo 1. Inocular una colonia de las células transformadas en 5 mL de medio Luria que contenga kanamicina a una concentración de 30 µg/mL, e incubar a 37°C por 12 h con agitación horizontal constante. Colocar los tubos de preferencia en forma diagonal para que se agiten bien las células y haya buen crecimiento. Obtención de plásmido por el método de lisis alcalina 2. Tomar la mitad del cultivo y colocarlo en 1 tubo de microfuga de 1.5 mL y centrifugar a 10,000 rpm por 1 min a 4°C. Descartar el sobrenadante eliminando totalmente el medio Luria. Repetir este paso en el mismo tubo dos veces más. 3. Eliminar el sobrenadante por decantación. 4. Resuspender el paquete celular en 300 µL de solución GTE fría, agitando en el vórtex. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos, preparar la solución de lisis durante este tiempo de incubación. 5. Adicionar 300 µL de la solución de lisis. Mezclar suavemente por inversión del tubo. IMPORTANTE no agitar en el vórtex. Incubar en hielo por 5 min. 6. Agregar 300 µL de la solución fría de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar suavemente por inversión del tubo. Incubar en hielo por 5 min. 7. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min a 4°C. 8. Colocar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionarle un volumen igual de isopropanol frío. 9. Incubar por 20 min a -20°C. 10. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4°C. 11. Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA añadir 1 mL de etanol al 70% y centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min. 12. Remover el sobrenadante por decantación y eliminar el etanol residual por evaporación a temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min). 13. Resuspender el DNA en 30 µL de agua estéril, guardar a –20°C. 14. Se recomienda cuantificar el RNA por su absorbancia a 260 nm. Reactivos − Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 µg/mL) − Solución GTE. 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0. − 3 M Acetato de potasio pH 4.8 − 70% Etanol − Isopropanol − 10 N NaOH − 10% SDS 13 14 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Medio LB + Kanamicina Inocular Células transformantes Incubar a 37 0C / agitación durante 12- 16 h a. Tomar 1.5 mL del cultivo y centrifugar b. Eliminar el sobrenadante 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Cuestionario 1. ¿Cuáles son las propiedades del DNA plasmídico que nos permiten separarlos del DNA cromosomal o genómico? 2. Explica por qué se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la purificación de plasmidos. 3. ¿Cuáles son los principales contaminantes de una preparación de plásmidos? 4. ¿Cómo los eliminas? 5. ¿Cuáles son los usos que se le dan a los plásmidos una vez purificados? 6. ¿Cuáles son los métodos utilizados para cuantificar a los nucleótidos? 7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si el plásmido que obtuviste se encuentra puro? 8. ¿Porqué a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmídico? Repetir a. y b. en el mismo tubo con el resto del cultivo Eliminar el sobrenadante Resuspender el paquete celular con sol. GTE fría. Agitar e incubar por 1 a 5 min a Tamb Referencias • Tümmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. • Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.745-773. • Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edición, WH Freeman. Adicionar sol. de lisis Mezclar por inversión (no agitar). Incubar en hielo máximo 5 min. Adicionar sol. de acetato de potasio fría Mezclar por inversión (no agitar). Incubar en hielo máximo 5 min. Centrifugar y tomar el sobrenadante Adicionar isopropanol (v/v) Incubar en hielo por 20 min y centrifugar. Añadir etanol al 70%, agitar en vórtex Centrifugar Eliminar sobrenadante por decantación y eliminar el etanol residual por evaporación Resuspender el DNA en 30 µL de agua estéril. Figura 5.5. Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se obtuvieron en la práctica anterior. 15 16 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDO. Objetivos − Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa. − Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. − Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos separados en geles de agarosa. − Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la biotecnología. Introducción Las endonucleasas de restricción se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla específicamente en ambas cadenas de la molécula de DNA. Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en biología molecular, debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que han perdido su capacidad de ser metilasas de DNA. Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por bacteriofagos, es decir, restringen la invasión por el DNA viral. Las enzimas de restricción generalmente reconocen secuencias palindrómicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de restricción (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simétricas del centro del palíndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetría, produciendo extremos romos (Figura 5.6). 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS contaminación pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima añadida a la reacción, arriba de 10 a 20 U /µg DNA, incrementando el volumen de reacción, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duración de la incubación. La digestión del DNA genómico puede facilitarse por la adición de policationes como espermidina, la cual actúa uniendo contaminantes cargados negativamente. Cuando un plásmido está superenrollado es necesario añadir más enzima o bien desnaturalizarlo. El tratamiento de una molécula de DNA con enzimas de restricción permite producir fragmentos definidos que pueden ser separados mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los fosfatos de los nucleótidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo eléctrico, estas moléculas migran hacia el electrodo positivo o ánodo. Cuando la migración toma lugar en un gel, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su tamaño, en donde las moléculas pequeñas se mueven más rápidamente a través del poro del gel que las más grandes. Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restricción. Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restricción, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molécula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restricción se denomina mapa de restricción. El análisis de los mapas de restricción constituyen una importante herramienta para localizar secuencias de bases específicas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados. Existen varias aplicaciones de los mapas de restricción, como la obtención de los patrones de RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”) utilizados en las pruebas de paternidad, así como también en la identificación de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen, cabellos etc. En la práctica se utilizarán dos enzimas de restricción en una mezcla, debido a que el vector utilizado en la transformación no presenta dos sitios de restricción para la misma enzima (Figuras 5.3 y 5.4). De tal manera que sólo se podrá liberar el fragmento de DNA de interés al cortar por los extremos con dos enzimas distintas. EcoRI HindIII HaeIII Figura 5.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restricción en una secuencia de DNA. Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se muestra y en el último ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del género y especie de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli. Las enzimas de restricción son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las técnicas para el análisis y la manipulación de los ácidos nucleicos. Han sido utilizadas en la eliminación de secuencias genómicas desde un nucleótido hasta cientos de bases, así como en la introducción de secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la producción de proteínas recombinantes. Diferentes factores afectan la reacción de restricción por endonucleasas. Se inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras proteínas, el fenol, el cloroformo, el etanol, el EDTA, el SDS y la alta concentración de sales. Los efectos de la 17 Material biológico DNA plasmídico purificado de la práctica anterior. Materiales y equipo Recipiente para hielo Tubos para microfuga Gradilla para tubos de microfuga Recipientes para teñir el gel. Micropipeta de 100-1000 µL Micropipeta de 20-200 µL Micropipeta de 0.5-10 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL estériles Cámara de electroforesis horizontal Fuente de poder Vórtex Horno de microondas 18 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Microfuga Baño de incubación a 37°C Baño de incubación o bloque de calentamiento a 100°C Transiluminador Pantalla de acrílico Cámara fotográfica Reactivos − NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20°C. − BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20°C. NOTA. Las enzimas de restricción son muy sensibles a la temperatura mantenerlas en frío durante su manipulación. − Amortiguador TANGO de restricción. Reactivo que es proporcionado por el proveedor junto con la enzima NdeI. − TAE 1X. Ver preparación en el apéndice. − Agarosa − Amortiguador de muestra − Estándar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizará de acuerdo a las instrucciones del proveedor. − Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL) Desarrollo experimental Ensayo de restricción 1. Etiquetar dos tubos de microfuga. 2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 µL de Plásmido y 3 µL de Amortiguador Tango10X 3. Incubar a 100°C por 5 min. 4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min. 5. Pasado el tiempo de incubación añadir al tubo 1 solo una de las dos enzimas de restricción que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1 µL BamHI y otro par de equipos 1 µL NdeI. Mezclar suavemente después de añadir la enzima. 6. Al tubo 2 añadir 1 µL de BamHI y 1µL de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros golpes al tubo de microfuga. 7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el líquido se deposite en el fondo. 8. Incubar a 37°C por 1.5 h. 9. Se sugiere añadir 0,5 µl de una solución de RNasa (1 µg/ml) e incubar 30 min a 37°C. Este procedimiento eliminará el RNA y facilitará la visualización de los productos de la restricción en el gel. 10. Al término de la incubación colocar los tubos en hielo. 11. Tomar una alícuota de 6 µL de cada tubo para correr en un gel de agarosa. Preparación del gel Durante el tiempo de incubación del DNA con las enzimas de restricción, preparar el gel de agarosa, se sugiere utilizar 1 gel por cada 2 equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o carriles en el gel. Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja del gel, colocar el peine (Figura 5.7 A). Preparar un gel de agarosa al 1.2%. Pesar 0.42 g agarosa en un matraz Erlenmeyer, añadir 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodón o una servitoalla. Se calienta la mezcla en microondas por 1 a 3 min o hasta que la agarosa se disuelva bien. 19 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60°C, añadir entonces 2 µL bromuro de etidio (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGÉNICO) para obtener una concentración final de 0.5 µg/mL, agitar el matraz para mezclar. Depositar el gel en la bandeja de la cámara (Figura 5.7 B), evitando la formación de burbujas. Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min). Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja con el gel en la cámara de electroforesis. Añadir el amortiguador TAE en la cámara. La cámara de electroforesis se llena con aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos. B A Figura 5.7. Preparación de un gel de agarosa. A. Sellado de la bandeja que contendrá el gel y B. Adición de la agarosa disuelta en TBE. Preparación y cargado de las muestras. 1. Etiquetar 4 tubos de microfuga: E, P, R1, R2 2. Añadir los reactivos como se indica en la tabla 5.1. Usar una punta de micropipeta distinta para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación cruzada. Tabla 5.1. Preparación de muestras para aplicar en el gel de agarosa. Reactivos Estándar Plásmido sin Plásmido digerido Plásmido digerido (E) digerir con una enzima con dos enzimas (P) (R1) (R2) Muestra 6 µL 3 µL 6 µL 6 µL H2O 4 µL 7 µL 4 µL 4 µL Amortiguador de 3 µL 3 µL 3 µL 3 µL muestra 3. 4. 5. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el líquido en el fondo. Se retira el peine de la bandeja. Muy importante, los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el cátodo, generalmente el electrodo se presenta de color negro. Nota: Procurar colocar la cámara de electroforesis en hielo para evitar que la temperatura se incremente durante la corrida del gel. Se toman los 13 µL de cada una de las muestras y se colocan en los pozos como se muestra en la Figura. 20 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Figura 5.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa. 6. 7. 8. 9. Una vez depositadas las muestras, se coloca la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro con negro) y se conecta a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras migren hacia el lado positivo de la cámara. Al concluir la electroforesis se desconecta el equipo y se retira la bandeja para la observación de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lámpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiación ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrílico entre el observador y la fuente de luz UV. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese propósito, los geles serán incinerados, junto con los guantes y puntas que estuvieron en contacto con el bromuro de etidio. Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de DNA detectadas. Estimar el tamaño aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA así como del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estándar de peso molecular que se proporcionaran durante la práctica. Llenar la siguiente tabla. 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 6. ¿Qué tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la práctica, romos o cohesivos? 7. ¿Cuántos fragmentos de DNA o restricción se obtuvieron al utilizar las dos enzimas NdeI y BamH1? 8. ¿Cuántos fragmentos se obtuvieron al utilizar sólo una de las enzimas de restricción? ¿Por qué? 9. ¿Cuál fue el peso molecular del DNA liberado y del plásmido o vector? 10. ¿Cuáles son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restricción? Referencias • Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2 • Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in Protein Science (1998) A.4I.1-A.4I.3. • Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences © 2001, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. • Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442 • Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-317. Localización QH345 L43 • Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. • Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914. Tabla 5.2. Valores estimados de peso molecular de las bandas de DNA que se detectaron en las muestras analizadas. Estándar de DNA Plásmido sin restringir Plásmido restringido Plásmido restringido Banda con 2 enzimas de con 1 enzima de s restricción restricción Distancia Pares Distancia Pares de Distancia Pares de Distancia Pares de en mm de en mm bases en mm bases en mm bases bases estimado estimado estimado 1 2 3 4 5 6 7 10. Analizar los resultados. Cuestionario 1. 2. 3. 4. 5. ¿Qué parte de la molécula de DNA le confiere la carga negativa? ¿Cuál es el papel de cada componente del amortiguador de carga? ¿A que se le denomina topoisomeros? ¿En la práctica se pudieron observar topoisomeros? ¿Qué peso molecular tienen los topoisomeros? 21 22 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE. Objetivos − − − − − Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli. Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa) Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante. Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes Introducción La necesidad de producir proteínas heterólogas o recombinantes para varias aplicaciones científicas como comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular proteínas. Los sistemas bacterianos han sido los sistemas más utilizados para este fin, debido a que son fácilmente manipulables genéticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son económicos y se requiere sólo un entrenamiento mínimo para su manejo. Además, muchas de las características inherentes a los sistemas bacterianos permiten que los sistemas se automaticen en proyectos de producción a gran escala, donde se requiere la producción y muestreo de cientos de clonas. A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes, las proteínas de eucariotes o las proteínas de membrana, generalmente no se expresan o no son funcionales. El carácter químico del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas, así como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-transduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariotes. Por ejemplo, los sistemas de expresión de bacterias no glicosilan a las proteínas. Otros sistemas de expresión como los sistemas de células de mamífero o de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las proteínas eucariotes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las proteínas es crítica, aunque el costo de éstos sistemas es considerablemente más alto y la tecnología que se necesita es más complicada. Adicionalmente, la producción de grandes cantidades de proteínas como algunos productos terapéuticos, se pueden lograr tanto en plantas como en sistemas animales. Muchas compañías ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresión muy variadas, con o sin proteínas de fusión que funcionan como etiquetas para la detección y/o purificación de la proteína deseada. La presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y con promotores distintos. Los vectores de expresión como el pET son usados comúnmente para la expresión de proteínas heterólogas. En los sistemas pET, los plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del bacteriofago T7, la expresión de la proteína es inducida cuando la célula hospedera provee una cantidad de RNA polimerasa T7. En unas pocas horas de inducción, la formación del producto puede llegar a ser más del 50% de la proteína total en la célula. Otro beneficio importante es que en ausencia del inductor la transcripción del transgene no se lleva a cabo. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiará con más detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora, que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresión de nuestra proteína de interés, se tiene que introducir lactosa o un análogo de ésta, el más utilizado es el Isopropil β-D tiogalactosido (IPTG), análogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial o gratuito del operón de la lactosa. 23 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La producción de la proteína recombinante en una organismo no relacionado, como se mencionó anteriormente, puede llevar a que la proteína no sea funcional, ya sea porque no presenta las modificaciones postraduccionales necesarias o bien porque adquirió un plegamiento inadecuado. Cuando las proteínas se aglomeran formando agregados que sólo pueden solubilizarse a través del uso de soluciones de detergentes, se dice que están formando cuerpos de inclusión. Una proteína que no se encuentra soluble aumenta los costos en su producción y/o recuperación. En la práctica se llevará a cabo el monitoreo de la inducción de la β-lactamasa, en células completas de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1 (Figura 5.4), vector que fue producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostró en la Figura 5.3. Material biológico por grupo 1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo líquido saturado de células transformadas de E. coli (crecidas por 12 a 16 horas con agitación vigorosa). Material y equipo 1 mechero 1 recipiente para hielo Tubos para microfuga de 0.5 mL 2 vasos de precipitados 25 mL 1 Pipeta Pasteur con bulbo Recipiente de plástico para la tinción. Micropipeta de 2 a 10 µL Micropipeta de 20 a 200 µL Micropipeta de 200 a 1000 µL 1 caja de puntas de 10 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta Placas de vidrio Peine Separadores Pinzas para sujetar las placas Cámara para electroforesis Fuente de poder Vórtex Incubadora a 37°C con agitación Cámara fotográfica Reactivos − 1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 µg/mL) − 100 mM IPTG − Estándar de peso molecular de proteínas − 8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotómetro. Desarrollo experimental Inducción de proteína recombinante, β-lactamasa (Figura 5.8). 1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de células de E. coli transformadas con el vector PET-TEM1 y añadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina e incubarlos con agitación vigorosa a 37°C 24 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (colocarlos en posición diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe llegar a una absorbancia entre 0.6 a 0.8 en aproximadamente 2 h. 2. Para verificar que se llegó a la absorbancia indicada, tomar una alíquota de 1 mL y leerla en el espectrofotómetro a 600 ηm contra un blanco de medio Luria. Si aún no llega volver a incubar el matraz con agitación vigorosa. 3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alícuota a la que llamaremos tiempo 0 (mantener en hielo el tubo de microfuga). 4. Después agregar el IPTG para tener una concentración final en el tubo de 0.5 mM. El volumen del medio con células puede variar, dependiendo del número de alícuotas que se hayan tomado para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el cálculo tomando en cuenta el volumen final de medio con células. 5. Incubar nuevamente a 37°C con agitación horizontal y tomar alícuotas de 1 mL cada 30 min por 1.5 o 2 h. 6. Guardar todas las alícuotas en tubos de microfuga y a 4°C. Preparación de un gel de poliacrilamida-SDS Durante el tiempo de incubación e inducción de la proteína recombinante, preparar un gel de poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las instrucciones de elaboración se encuentran en la sección II, parte III del manual. Preparación de las muestras y separación en un gel de poliacrilamida-SDS 1. Directamente de cada una de las alícuotas que fueron recolectadas se toman 15 µL y se mezclan con 10 µL de amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. También hacer una mezcla apropiada de estándares de peso molecular, se sugiere 7.5 µL de los estándares de peso molecular más 17.5 µL de amortiguador de muestra. 2. Ensamblar el gel en la cámara de electroforesis. 3. Aplicar las muestras en el gel. 4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del colorante haya entrado en el gel separador. Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel. 5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel. 6. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tinción depositando el gel en una charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante. 7. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución desteñidora. Poner a agitar suavemente. 8. Tomar la foto del gel. 9. Analizar los resultados. La proteína tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa. 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1.5 ml Medio LB-kanamicina Incubar a 370C / agitación vigorosa durante 2 h élulas del cultivo saturado Leer a 600 ηm. hasta obtener 0.6-0.8 Abs. Agregar__________µL 100mM IPTG (concentración final 0.5 mM) 1 mL t=0 Incubar a 37 0C / agitación. Tomar una alícuota cada 30 min t=0 1 mL t = 30 min 1 mL t = 60 min 1 mL t = 90 min 1 mL t = 120 min Aplicar 4 de las fracciones a un gel de poliacrilamida-SDS. Figura 5.8. Proceso de inducción de proteína recombinante en E. coli. 25 26 Elegir entre incubar hasta 90 o 120 min, ya que sólo hay 5 pozos disponibles/equipo. RECORDAR QUE uno de los pozos contendrá al estándar de peso molecular. 0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Cuestionario 1. ¿Qué es una proteína recombinante? 2. ¿Por qué el cultivo de células debe de llegar a una densidad óptica de 0.6 a 0.8 antes de comenzar el proceso de inducción de la proteína recombinante? 3. ¿Cuál es la función del IPTG? 4. ¿Cuál fue el tiempo en el que produjo la máxima cantidad de proteína recombinante? 5. ¿Qué otros parámetros se podrían modificar para obtener el mayor rendimiento de la proteína? 6. ¿Qué son los cuerpos de inclusión? 7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si la proteína se encuentra en forma soluble o en forma agregada? 8. ¿Qué método propondría para purificar a la proteína recombinante obtenida? 9. Describe tres ejemplos de proteínas recombinantes que se producen actualmente de manera comercial, explicando sus usos. Referencias • Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning vectors in Escherichia coli. 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